CN114886927B - 一种五谷虫活性成分组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种五谷虫活性成分组合物及其制备方法和应用，五谷虫活性成分组合物以五谷虫的主要活性成分壳聚糖、多肽和脂肪酸为主要组分，添加凝胶剂等必需基质材料制备而成。本发明能够有效促进皮肤创面愈合，减轻皮肤炎症反应，提高皮肤生长因子表达水平，促进烫伤、糖尿病溃疡和机械性皮肤创伤等创面迅速愈合，减少并发感染概率，缩短创面愈合周期。同时，还可以减轻痤疮症状，减少皮损程度，具有明确的祛痘效果。本发明各主要组分之间配伍合理，不仅能充分发挥各成分的药效，确保用药安全，同时具有显著的协同作用；没有毒副作用，长期使用无不良反应。对于西医无法解决的烫伤、糖尿病溃疡、机械性皮肤创伤和痤疮，有明确的治疗效果。

Description

一种五谷虫活性成分组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种五谷虫活性成分组合物及其制备方法和应用。
背景技术
五谷虫，为丽蝇科丝光绿蝇、大头金蝇或其它近缘昆虫的幼虫。根据《本草求原》、《本草便读》等中医药典籍记载，五谷虫性寒、无毒，入脾、胃经。我国发现五谷虫的药用价值已500多年，在外科治疗方面，经干燥研磨后，供搽敷外用，能治疗臁疮、唇疔和痈疽等感染性外科疾病。《本草求真》记载“治臁烂”。《中药志》、《中国动物药》、《东北动物药》均以“五谷虫”之名收载入药。数世纪前，澳大利亚的土著人、印第安人、玛雅人利用五谷虫治疗外伤感染，上个世纪二三十年代，美国外科医生应用五谷虫成功治疗脊髓炎，五谷虫疗法逐渐得到推广和应用。近年来，中西方学者在应用五谷虫活体和干粉治疗创伤面感染取得很好效果。对其成分研究发现，五谷虫中蛋白成分62％、脂肪质量分数达到11％、几丁聚糖16％、氨基酸18％、抗菌肽质量分数0.264％。
国内外五谷虫相关研究大多集中于创面修复领域，其研究对象范围主要涵盖五谷虫多肽、溶菌酶、脂肪酸等组分。虽然各成分具有较好的促进普通急性创面和感染创面愈合的作用，但始终无法达到很好的抑菌、促愈合效果。古法采用全虫研磨成粉的形式外敷在创面，这种方式虽然包含了五谷虫的所有成分，但该方法无法标准化，不能控制药物的质量，且研磨过程中可能受到污染，从而加重感染。此外，大众对五谷虫的接受度较低，易产生排斥心理，依从性较差。
目前，临床治疗糖尿病足溃疡、压疮、下肢动静脉溃疡等慢性创面采用抗生素联合表皮生长因子等药物联合作用以求达到抗感染和促愈合的双重效果。但慢性创面常出现多药耐药，导致治疗失败，最终截肢甚至威胁生命。遗憾的是，并没有药物可同时达到很好的抗感染和促愈合效果。开发毒副作用小、不良反应少、适用范围广的抗感染和促愈合药物是临床迫切需要解决的现实问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种五谷虫活性成分组合物，克服现有技术中存在的上述技术问题。
本发明的目的在于提供一种五谷虫活性成分组合物的制备方法，以干燥的五谷虫虫体为原料，经过乙酸乙酯、混合酶液和葡聚糖凝胶柱G75层析依次提取分别得到取活性组分A、取活性组分B和取活性组分D。
本发明的目的在于提供一种五谷虫活性成分组合物在制备治疗烫伤、糖尿病溃疡、机械性皮肤创伤和痤疮药物中的应用，与凝胶基质混合，具有吸湿、保湿、抑菌、止血等优势和促进伤口愈合有利肉芽组织生长、加速伤口愈合、缓解疼痛的作用。
为此，本发明提供的技术方案如下：
一种五谷虫活性成分组合物，包括由五谷虫虫粉中提取的活性组分A、活性组分B和活性组分D，所述活性组分A中脂肪酸的质量百分比为90-100％，所述活性组分B中壳聚糖的质量百分比不少于60％，所述活性组分D中蛋白的质量百分比为60-70％。
包括以下重量份数的物质：0.1-2份活性组分A、0.1-2份活性组分B、10-20份活性组分D和86份凝胶基质。
所述活性组分A中的脂肪酸由饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸组成，质量百分比分别为20-30％、40-60％和20-30％。
所述凝胶基质包括以下重量份数的原料：水75份、丁二醇3份、甘油5份、卡波姆1.3份、三乙醇胺1.5份、乙基已基甘油0.1份和甲基异噻唑啉酮0.1份。
所述壳聚糖分子量分布为8万-20万道尔顿，所述活性组分D中蛋白分子量在6.5-7.5万道尔顿。
一种五谷虫活性成分组合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)制备五谷虫粗粉：取干燥的五谷虫虫体粉碎后过筛，分取50目的五谷虫粉；
步骤2)提取活性组分A：取10-15g五谷虫粉，与150-200ml 98％乙酸乙酯混合，置于超声清洗器中，时间2-3h，功率300W，过滤收集滤液和滤渣，滤液用旋转蒸发仪减压蒸馏至体积不再变化，即得；
步骤3)提取活性组分B：取步骤2)中的滤渣，水洗后过滤收集滤液C和滤渣，滤渣加入混合酶液酶解、脱钙、碱洗、中和后得到；
步骤4)提取活性组分D：滤液C经过离心后，收集上清液，上清液经葡聚糖凝胶柱G75层析分离纯化蛋白质，冷冻干燥得到；
步骤5)制备凝胶基质；
步骤6)将配方量的活性组分A、活性组分B、活性组分D和凝胶基质混合均匀即得。
步骤3)提取活性组分B的具体过程如下：
取步骤2)中的滤渣，挥干溶剂后，用十倍体积的去离子水溶解，置于超声清洗器中，时间2h，功率300W，过滤收集滤液C和滤渣，滤渣采用混合酶液进行持续搅拌水解，水解条件为温度50℃，pH7.0，酶用量700U/g，时间5h，采用10％柠檬酸进行脱钙，过滤收集滤渣，干燥后，采用50％氢氧化钠溶液，100℃处理1h，经中和后，冷冻干燥得活性组分B。
所述混合酶液由木瓜蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶和嗜酸乳杆菌组成，质量比为1:1:1。
五谷虫为丝光绿蝇、大头金蝇、红点蝇、罗仙子或其它与其近缘的昆虫的幼虫。
一种五谷虫活性成分组合物在制备治疗烫伤、糖尿病溃疡、机械性皮肤创伤和痤疮药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明提供的这种五谷虫活性成分组合物，以五谷虫的主要活性成分壳聚糖(活性组分A)、多肽(活性组分D)和脂肪酸(活性组分B)为主要组分，结合了三者的吸湿、保湿、抑菌、止血等优势，具有促进伤口愈合、有利肉芽组织生长、加速伤口愈合、缓解疼痛的作用，满足临床的迫切需求。
该五谷虫活性成分组合物可以通过改变活性组分A、活性组分B和活性组分D的配比，附加药学可接受的材料，制成乳膏剂、涂膜剂、软膏剂、贴剂等剂型。
本发明方法以干燥的五谷虫虫体为原料，经过乙酸乙酯、混合酶液和葡聚糖凝胶柱G75层析依次提取分别得到取活性组分A、取活性组分B和取活性组分D，实现对有效成分的分离、纯化，效果好，并通过凝胶基质将各有效成分组合到一起，共同发挥作用。
本发明能够有效促进皮肤创面愈合，减轻皮肤炎症反应，提高皮肤生长因子表达水平，促进烫伤、糖尿病溃疡和机械性皮肤创伤等创面迅速愈合，减少并发感染概率，缩短创面愈合周期。同时，本发明可用于减轻痤疮症状，减少皮损程度，具有明确的祛痘效果。本发明凝胶剂各主要成分之间配伍合理，不仅能充分发挥各成分的药效，确保用药安全，同时，具有显著的协同作用；没有毒副作用，长期使用无不良反应。对于西医无法解决的烫伤、糖尿病溃疡、机械性皮肤创伤和痤疮，有明确的治疗效果。
下面将做进一步详细说明。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
现介绍本发明的示例性实施方式，然而，本发明可以用许多不同的形式来实施，并且不局限于此处描述的实施例，提供这些实施例是为了详尽地且完全地公开本发明，并且向所属技术领域的技术人员充分传达本发明的范围。对于示例性实施方式中的术语并不是对本发明的限定。
除非另有说明，此处使用的术语(包括科技术语)对所属技术领域的技术人员具有通常的理解含义。另外，可以理解的是，以通常使用的词典限定的术语，应当被理解为与其相关领域的语境具有一致的含义，而不应该被理解为理想化的或过于正式的意义。
实施例1：
本实施例提供了一种五谷虫活性成分组合物，包括由五谷虫虫粉中提取的活性组分A、活性组分B和活性组分D，所述活性组分A中脂肪酸的质量百分比为90-100％，所述活性组分B中壳聚糖(以氨基葡萄糖计)的质量百分比不少于60％，所述活性组分D中蛋白的质量百分比为60-70％。
本发明提供的这种五谷虫活性成分组合物，以五谷虫的主要活性成分壳聚糖(活性组分A)、多肽(活性组分D)和脂肪酸(活性组分B)为主要组分，结合了三者的吸湿、保湿、抑菌、止血等优势，具有促进伤口愈合、有利肉芽组织生长、加速伤口愈合、缓解疼痛的作用，满足临床的迫切需求。
实施例2：
在实施例1的基础上，本实施例提供了一种五谷虫活性成分组合物，包括以下重量份数的物质：0.1-2份活性组分A、0.1-2份活性组分B、10-20份活性组分D和86份凝胶基质。
活性组分A中的脂肪酸由饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸组成，质量百分比分别为20-30％、40-60％和20-30％。
凝胶基质包括以下重量份数的原料：水75份、丁二醇3份、甘油5份、卡波姆1.3份、三乙醇胺1.5份、乙基已基甘油0.1份和甲基异噻唑啉酮0.1份。
壳聚糖分子量分布为8万-20万道尔顿，活性组分D中蛋白分子量在6.5-7.5万道尔顿。
本实施例提供的五谷虫活性成分组合物为凝胶剂，该凝胶剂能够有效地保持伤口的湿润环境、促进肉芽组织生长、加速伤口愈合并缓解伤口疼痛。
实施例3：
在实施例1的基础上，本实施例提供了一种五谷虫活性成分组合物，包括以下重量份数的物质：2份活性组分A、2份活性组分B、10份活性组分D和86份凝胶基质。
制备方法步骤如下：
步骤1)制备五谷虫粗粉：取干燥的五谷虫虫体粉碎后过筛，分取50目的五谷虫粉；其中，五谷虫为丝光绿蝇、大头金蝇、红点蝇、罗仙子或其它与其近缘的昆虫的幼虫。
步骤2)提取活性组分A：取10g五谷虫粉，与150ml 98％乙酸乙酯混合，置于超声清洗器中，时间2h，功率300W，过滤收集滤液和滤渣，滤液用旋转蒸发仪减压蒸馏至体积不再变化，即得；
步骤3)提取活性组分B：取步骤2)中的滤渣，挥干溶剂后，用十倍体积的去离子水溶解，置于超声清洗器中，时间2h，功率300W，过滤收集滤液C和滤渣，滤渣采用混合酶液(木瓜蛋白酶：枯草杆菌中性蛋白酶：嗜酸乳杆菌＝1:1:1，质量比)进行持续搅拌水解，水解条件为温度50℃，pH7.0，酶用量700U/g，时间5h，采用10％柠檬酸进行脱钙，过滤收集滤渣，干燥后，采用50％氢氧化钠溶液，100℃处理1h，经中和后，冷冻干燥得活性组分B。
步骤4)提取活性组分D：滤液C经过离心(5000g，10min)后，收集上清液，上清液经葡聚糖凝胶柱G75层析分离纯化蛋白质，冷冻干燥得到；
步骤5)制备凝胶基质：水75份、丁二醇3份、甘油5份、卡波姆1.3份、三乙醇胺1.5份、乙基已基甘油0.1份和甲基异噻唑啉酮0.1份，混匀；
步骤6)将配方量的活性组分A、活性组分B、活性组分D和配方量的凝胶基质混合均匀即得。
本方法以干燥的五谷虫虫体为原料，经过乙酸乙酯、混合酶液和葡聚糖凝胶柱G75层析依次提取分别得到取活性组分A、取活性组分B和取活性组分D，实现对有效成分的分离、纯化，效果好，并通过凝胶基质将各有效成分组合到一起，共同发挥作用。
实施例4：
在实施例1的基础上，本实施例提供了一种五谷虫活性成分组合物，包括以下重量份数的物质：0.1份活性组分A、1份活性组分B、20份活性组分D和86份凝胶基质。
制备过程同实施例3。
实施例5：
在实施例1的基础上，本实施例提供了一种五谷虫活性成分组合物，包括以下重量份数的物质：1份活性组分A、0.1份活性组分B、15份活性组分D和86份凝胶基质。
制备过程同实施例3。
实施例6：
本实施例提供了一种五谷虫活性成分组合物在制备治疗烫伤、糖尿病溃疡、机械性皮肤创伤和痤疮药物中的应用。
以实施例3制备的五谷虫活性成分组合物(以下简称凝胶剂)为例，通过实验对本发明的效果做进一步说明。
一、凝胶剂对烫伤的治疗作用
1.实验方法：
1.1实验动物：
SD大鼠(180-200g，雄性)购自北京维通利华有限公司，随机分为正常对照组(Con，10只)和烫伤组(50只)，大鼠在购买后适应性喂养7天后进行实验。
1.2烫伤模型：
烫伤前24h，用电动刮胡刀将大鼠背部剪出5×6cm大小实验区域。实验前腹腔注射戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠，固定于木板上，充分暴露背部实验区。用50ml三角烧瓶装40ml橄榄油，置于沸水浴中，取出测温前，需擦干水渍，以免造成温度测定误差。油温在95-97℃接触实验区20s可造成III度烫伤模型。将烫伤大鼠随机分为模型组(model)和凝胶给药组、凝胶基质组、五谷虫粉组、阳性药组(康复新液)。
1.3给药方案：
烫伤后0.5h开始治疗，凝胶剂剂量为1.5g/kg/d，分三次涂抹，用棉签涂抹均匀后使用无菌纱布保护创面；凝胶基质使用同凝胶剂；五谷虫粉均匀洒在创面上，以覆盖均匀为宜，而后用无菌纱布保护创面；阳性药组给予10ml/kg/d康复新液，分三次涂抹，用棉签涂抹均匀后使用无菌纱布保护创面，疗程14d。
2.实验结果：
2.1凝胶剂对大鼠III度烫伤治愈率和愈合情况的影响
SD大鼠在烫伤后，实验区即刻出现血管痉挛，创面呈苍白色，随后血管扩张，创面红肿，24h后呈灰白色，随后出现伽皮，模型组和基质组最终形成焦痂。所有烫伤大鼠出现结痂时间一致；受试凝胶剂和阳性药组的症状改善比较明显，最终没有形成焦痂，阳性药康复新液由于是液体比较容易干，效果不如受试药物。凝胶基质组和模型组形成出现很厚的焦痂，不易脱落，且观察14d后，均未愈合，故延长观察时间，计算愈合时间。同时，我们还发现受试凝胶组的愈合速度和愈合效果明显优于五谷虫粉组。表1和表2分别是愈合率和愈合时间等结果。
表1凝胶剂对SD大鼠烫伤模型愈合率的影响
表2受试凝胶剂对烫伤创面的修复作用结果(n＝10，mean±SD)
##P<0.01vs正常组；**P<0.01vs模型组；&P<0.01vs受试凝胶组
2.2凝胶剂对大鼠III度烫伤创面皮肤生长因子的影响
创面愈合的起始阶段，创面及其周边的成纤维细胞会迁移、增殖、分化，产生胶原蛋白。胶原蛋白是细胞骨架的重要组成部分，发挥保护细胞基质和修复损伤细胞的作用，在创面愈合过程中发挥重要作用。羟脯氨酸(Hydroxyproline，HYP)是胶原蛋白特征性成份之一，反应创面胶原蛋白形成情况。III度烫伤导致实验创面HYP水平大幅下降，与正常组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。而在五谷虫粉组、受试凝胶组和阳性对照组，创面HYP含量显著增加，与模型组比较，差异具有统计学意义。同时，受试凝胶组实验区HYP含量明显高于阳性对照组和五谷虫粉组(P<0.05)。
生长因子能促进细胞生长、增殖、合成，如EGF可加速细胞分裂增殖，促进蛋白质合成，刺激成纤维细胞增殖和迁移，促进伤口纤维化；bFGF可促进新生血管形成和肉芽组织生长，促进血管平滑肌细胞、内皮细胞增殖，改善局部微循环。与模型组比较，五谷虫粉组、受试凝胶组和阳性对照组实验区EGF和bFGF阳性率显著增加(P<0.05)，表明三者均能有效促进生长因子生成。如表3所示，与五谷虫粉组和阳性对照组比较，受试凝胶组实验区EGF和bFGF阳性率显著增加，表明受试凝胶组作用优于五谷虫粉组和阳性对照组。
表3受试凝胶剂对烫伤创面的生长因子的因子(n＝5，mean±SD)
##P<0.01vs正常组；**P<0.01vs模型组；&P<0.01vs受试凝胶组
综上所述，五谷虫粉、受试凝胶和阳性对照药均能有效的修复III度烧伤引起的大鼠皮肤创伤，且受试凝胶在多个指标上优于五谷虫粉和阳性对照药作用效果。
二、凝胶剂对糖尿病溃疡的治疗作用
1.实验方法：
1.1实验动物：
糖尿病小鼠及健康小鼠(20-23g，雄性)购自北京维通利华有限公司，随机分为正常对照组(Con，10只)和糖尿病溃疡组(50只)，小鼠在购买后适应性喂养7天后进行实验。
1.2糖尿病溃疡模型：
用电动刮胡刀将大鼠背部剪出直径为10mm的区域，用开孔器在背部制作一个直径为5mm的创面。正常对照组为无糖尿病的小鼠，创面不做处理，自然生长；糖尿病对照组为糖尿病小鼠，创面不做处理，自然生长；将糖尿病小鼠分为凝胶给药组、凝胶基质组、五谷虫粉组、阳性药组(康复新液)。
1.3给药方案：
0.5h开始治疗，凝胶剂剂量为1.5g/kg/d，分三次涂抹，用棉签涂抹均匀后使用无菌纱布保护创面；凝胶基质使用同凝胶剂；五谷虫粉均匀洒在创面上，以覆盖均匀为宜，而后用无菌纱布保护创面；阳性药组给予10ml/kg/d康复新液，分三次涂抹，用棉签涂抹均匀后使用无菌纱布保护创面。每隔12h换药一次，在第3、6、9、12、15、18、21天观察溃疡创面的颜色、肉芽生长情况、溃疡面积、溃疡深度等症状。计算溃疡面积和创面愈合率。
2.实验结果：
2.1凝胶剂对糖尿病溃疡的愈合率的影响
糖尿病小鼠创面溃疡后创面出现红、肿，小鼠情绪烦躁不安，饮食和饮水量比正常对照组有所减少。同时，糖尿病小鼠溃疡创面部分出现流脓、破溃，有2只小鼠到18d时，已不能自由活动，情绪萎靡、倦怠，需人工灌食。五谷虫粉组、受试凝胶组和阳性对照组溃疡创面较完整，未出现严重的流脓和破溃，且小鼠情绪整体比较平稳，表明三者对溃疡创面具有良好的治疗作用。其中，受试凝胶组小鼠状态最优，创面愈合迅速，且愈合后疤痕组织较少。表4为不同时间点糖尿病小鼠溃疡创面的愈合率。
表4凝胶剂对糖尿病溃疡创面愈合率的影响(n＝10，mean±SD)
##P<0.01vs正常组；**P<0.01vs模型组；&P<0.01vs受试凝胶组
2.2凝胶剂对溃疡创面组织中VEGF和EGF水平的影响
VEGF被认为是最重要的血管生成因子，可以激活成纤维细胞的增殖，通过增加胶原蛋白的产生来促进伤口愈合。EGF是由血小板、巨噬细胞、成纤维细胞和骨髓间充质干细胞分泌，其可激活内皮细胞增殖、迁移及层粘连蛋白的沉积。糖尿病机体内高血糖状态可导致VEGF和EGF表达，抑制创面愈合。从表5结果可知，糖尿病小鼠创面组织中VEGF和EGF水平显著低于正常小鼠创面组织，这也是上述愈合率结果较低的重要原因。如表5所示，五谷虫粉组、受试凝胶组和阳性对照组创面组织中VEGF和EGF水平显著升高，与模型组比较，差异具有统计学意义。其中，受试凝胶组在三组中VEGF和EGF水平最高，也部分解释受试凝胶组创面愈合迅速的机制。
表5.受试凝胶剂对创面组织中VEGF和EGF水平的影响结果(n＝5，mean±SD)
##P<0.01vs正常组；**P<0.01vs模型组；&P<0.01vs受试凝胶组
2.3凝胶剂对溃疡创面组织中E-cadherin和bFGF水平的影响
细胞间黏附分子在调节皮肤再生性修复过程中起关键调节作用，E-cadherin可与其他信号分子共同影响细胞的黏附性调节，同时参与角化形成细胞的黏着和成熟化，提示其可能参与调控创伤愈合再上皮化过程。bFGF是一种有效的促分裂原，因其可诱导成纤维细胞的增殖能力而被命名，bFGF的一种糖蛋白可促进血管再生，下调胶原I和弹性蛋白表达，并上调皮肤成纤维细胞中的透明质酸合成来促进伤口愈合。从表6结果可知，糖尿病小鼠创面组织中的E-cadherin和bFGF水平明显低于正常对照组(P<0.05)，表明糖尿病状态可抑制E-cadherin和bFGF表达。而在五谷虫粉组、受试凝胶组和阳性对照组创面组织中E-cadherin和bFGF水平显著升高，且与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。此外，受试凝胶组创面中E-cadherin和bFGF水平显著高于五谷虫粉组和阳性对照组，表明受试凝胶组效果优于五谷虫粉组和阳性对照组。
表6.受试凝胶剂对创面组织中E-cadherin和bFGF水平的影响结果(n＝5，mean±SD)
##P<0.01vs正常组；**P<0.01vs模型组；&P<0.01vs受试凝胶组
三、凝胶剂对机械性损伤的治疗作用
1.实验方法：
1.1实验动物：
SD大鼠(180-200g，雄性)购自北京维通利华有限公司，随机分为正常对照组(Con，10只)和机械性损伤组(50只)，大鼠在购买后适应性喂养7天后进行实验。
1.2机械性损伤模型：
用电动剃须刀在大鼠背部剪出(4cm×5cm)的无毛区域，戊巴比妥钠麻醉，固定在木板上。皮肤经消毒后，距脊柱1.5cm处，在两侧分别压切处两个圆形创面，直径1.8cm，深至皮下，造成机械性损伤模型。暴露创面，单笼饲养，记录原始创面面积。将机械性损伤大鼠分为凝胶给药组、凝胶基质组、五谷虫粉组、阳性药组(云南白药)。
1.3给药方案：
0.5h开始治疗，凝胶剂剂量为1.5g/kg/d，分三次涂抹，用棉签涂抹均匀后使用无菌纱布保护创面；凝胶基质使用同凝胶剂；五谷虫粉均匀洒在创面上，以覆盖均匀为宜，而后用无菌纱布保护创面；阳性药组给予0.3g/kg/d云南白药，分三次涂抹，用棉签涂抹均匀后使用无菌纱布保护创面。每隔12h换药一次，连续给药16d。
2.实验结果：
2.1凝胶剂对大鼠创面愈合情况的影响
每天观察大鼠创面的红、肿、感染和结痂情况。造模后，模型组有3只大鼠出现创面化脓、红肿等现象，创面虽有愈合迹象，但创面新生组织较薄，容易再次损伤，个别大鼠创面出现撕裂伤。五谷虫粉组、受试凝胶组和阳性对照组大鼠在第4天时，肉芽组织生长明显，局部形成上皮样组织；第7天时，创面结痂，创面收缩明显；第10天时，个别大鼠创面脱痂，上皮组织形成面积扩大，向中心创面移动，覆盖整个创面，长出白色表皮；第14天时，五谷虫粉组创面完全愈合50％，阳性对照组创面完全愈合60％，受试凝胶组创面完全愈合80％，而模型组未见完全愈合大鼠。表7为创面愈合率结果，计算公式为“愈合率＝(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积×100％”。结果表明，五谷虫粉组、受试凝胶组和阳性对照组大鼠第4、7、10、14天的愈合率显著增加，与模型组比较，差异具有统计学意义。
表7.受试凝胶剂对创面组织愈合率的影响结果(n＝5，mean±SD)
##P<0.01vs正常组；**P<0.01vs模型组；&P<0.01vs受试凝胶组
2.2凝胶剂对创面组织中VEGF和EGF水平的影响
VEGF被认为是最重要的血管生成因子，可以激活成纤维细胞的增殖，通过增加胶原蛋白的产生来促进伤口愈合。EGF是由血小板、巨噬细胞、成纤维细胞和骨髓间充质干细胞分泌，其可激活内皮细胞增殖、迁移及层粘连蛋白的沉积。模型组与正常组比较，创面组织中VEGF和EGF的表达量有一定程度的增加，推测是因为机体自身应激性反应导致的自身愈合反应。如表8所示，与模型组比较，五谷虫粉组、受试凝胶组和阳性对照组大鼠创面组织中VEGF和EGF的表达量显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。同时，受试凝胶组创面组织中VEGF和EGF的表达量显著高于五谷虫粉组和阳性对照组(P<0.05)，表明受试凝胶效果最优(表8)。
表8.受试凝胶剂对创面组织中VEGF和EGF水平的影响结果(n＝5，mean±SD)
##P<0.01vs正常组；**P<0.01vs模型组；&P<0.01vs受试凝胶组
四、凝胶剂的祛痘效果评价
1.观察对象：
共纳入受试者20例，年龄18-45岁，男女各半；参照国际改良痤疮分级法及Pillsbury分类法属于面部I-III级寻常型痤疮；受试者在入组前半年没有经过任何治疗，能严格按照试验研究方案要求，配合研究进行；已签署知情同意书；近三个月未使用任何祛痘或者激素类产品。
2.观测方法：
VISIA面部图像分析仪拍摄初始面部，分析面部皮损、红斑情况。规范受试者按产品说明书用量和使用步骤使用本产品，将凝胶剂均匀涂布在皮损部位。在使用后，第3、6、9、18、36天回访并分析面部情况。
3.观测结果：
同一患者在使用凝胶剂前后对比发现，凝胶剂可显著减少面部皮损和红斑数量，有11名受试者达到痊愈，其他受试者脸部痤疮数量也明显较少，痤疮皮损部位症状显著减轻，祛痘效果非常明显。
综合以上实验，本凝胶剂能够显著促进烫伤、糖尿病溃疡和机械性损伤创面愈合，促进皮肤胶原蛋白和皮肤愈合因子表达，修复创面损伤，同时，受试凝胶剂的作用效果明显优于五谷虫粉和常用皮肤促愈合药物。此外，受试凝胶剂能够修复痤疮创面，表现出很好的祛痘效果。
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种五谷虫活性成分组合物，其特征在于：包括由五谷虫虫粉中提取的0.1-2份活性组分A、0.1-2份活性组分B、10-20份活性组分D和86份凝胶基质，所述活性组分A中脂肪酸的质量百分比为90-100％，所述活性组分B中壳聚糖的质量百分比不少于60％，所述活性组分D中蛋白的质量百分比为60-70％；
所述活性组分A通过以下过程得到：取10-15g五谷虫粉，与150-200ml 98％乙酸乙酯混合，置于超声清洗器中，时间2-3h，功率300W，过滤收集滤液和滤渣，滤液用旋转蒸发仪减压蒸馏至体积不再变化，即得；其中，五谷虫粉是将干燥的五谷虫虫体粉碎后过筛，分取50目得的；
所述活性组分B是将上述滤渣水洗后过滤收集滤液C和滤渣，滤渣加入混合酶液酶解、脱钙、碱洗、中和后得到；
所述活性组分D是将滤液C经过离心后，收集上清液，上清液经葡聚糖凝胶柱G75层析分离纯化蛋白质，冷冻干燥得到；
所述凝胶基质包括以下重量份数的原料：水75份、丁二醇3份、甘油5份、卡波姆1.3份、三乙醇胺1.5份、乙基已基甘油0.1份和甲基异噻唑啉酮0.1份；
所述活性组分A中的脂肪酸由饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸组成，质量百分比分别为20-30％、40-60％和20-30％；
所述壳聚糖分子量分布为8万-20万道尔顿，所述活性组分D中蛋白分子量在6.5-7.5万道尔顿；
提取活性组分B的具体过程如下：
取步骤2)中的滤渣，挥干溶剂后，用十倍体积的去离子水溶解，置于超声清洗器中，时间2h，功率300W，过滤收集滤液C和滤渣，滤渣采用混合酶液进行持续搅拌水解，水解条件为温度50℃，pH7.0，酶用量700U/g，时间5h，采用10％柠檬酸进行脱钙，过滤收集滤渣，干燥后，采用50％氢氧化钠溶液，100℃处理1h，经中和后，冷冻干燥得活性组分B；
所述混合酶液由木瓜蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶和嗜酸乳杆菌组成，质量比为1:1:1。
2.根据权利要求1所述的一种五谷虫活性成分组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)制备五谷虫粗粉：取干燥的五谷虫虫体粉碎后过筛，分取50目的五谷虫粉；
步骤2)提取活性组分A：取10-15g五谷虫粉，与150-200ml 98％乙酸乙酯混合，置于超声清洗器中，时间2-3h，功率300W，过滤收集滤液和滤渣，滤液用旋转蒸发仪减压蒸馏至体积不再变化，即得；
步骤3)提取活性组分B：取步骤2)中的滤渣，水洗后过滤收集滤液C和滤渣，滤渣加入混合酶液酶解、脱钙、碱洗、中和后得到；
步骤4)提取活性组分D：滤液C经过离心后，收集上清液，上清液经葡聚糖凝胶柱G75层析分离纯化蛋白质，冷冻干燥得到；
步骤5)制备凝胶基质；
步骤6)将配方量的活性组分A、活性组分B、活性组分D和凝胶基质混合均匀即得；
步骤3)提取活性组分B的具体过程如下：
取步骤2)中的滤渣，挥干溶剂后，用十倍体积的去离子水溶解，置于超声清洗器中，时间2h，功率300W，过滤收集滤液C和滤渣，滤渣采用混合酶液进行持续搅拌水解，水解条件为温度50℃，pH7.0，酶用量700U/g，时间5h，采用10％柠檬酸进行脱钙，过滤收集滤渣，干燥后，采用50％氢氧化钠溶液，100℃处理1h，经中和后，冷冻干燥得活性组分B；
所述混合酶液由木瓜蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶和嗜酸乳杆菌组成，质量比为1:1:1。
3.根据权利要求2所述的一种五谷虫活性成分组合物的制备方法，其特征在于：五谷虫为丝光绿蝇、大头金蝇的幼虫。
4.根据权利要求1所述的一种五谷虫活性成分组合物在制备治疗烫伤、糖尿病溃疡、机械性皮肤创伤和痤疮药物中的应用。
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