CN103524602B - 抗菌肽在制药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗菌肽在制药中的新用途，具体涉及抗菌肽在制备抗蜜蜂病毒病的药物中的应用，所述抗菌肽的氨基酸序列为Arg-Arg-Trp-Trp-Cys-Arg；在囊状幼虫病病毒感染发病的蜂群中，该抗菌肽表现出了良好的治疗效果和保健作用；所述多肽不需要任何修饰、结构简单、活性高，可用于病毒病预防与治疗。

Description

抗菌肽在制药中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗菌肽在制药中的新用途，具体涉及抗菌肽在制备抗蜜蜂病毒病药物中的应用。

背景技术

蜜蜂囊状幼虫病（sacbrood disease）简称囊幼病，又叫尖头病、囊雏病，是由囊状幼虫病病毒（sacbrood bee virus，SBV）感染引起的蜜蜂幼虫肠道传染病，造成幼虫的大量死亡，影响蜂群繁殖。中华蜜蜂，又称中华蜂、中蜂、土蜂，是东方蜜蜂的一个亚种，是中国独有的蜜蜂当家品种，2003年，北京市在房山区建立中华蜜蜂自然保护区，2006年，中华蜜蜂被列入农业部国家级畜禽遗传资源保护品种。囊状幼虫病也是中蜂的主要病害之一，在养蜂生产上时有发生。发病轻时，出现近百只幼虫死亡，工蜂采集活动正常；发病严重时，蜂群只见幼虫增多却不见成蜂增加，造成大批幼虫死亡，工蜂表现不安，采集力明显下降，威胁幼虫发育和蜂群群势，甚至导致蜂群飞逃，给蜂农造成严重的损失。

中蜂囊状幼虫病最早于1972年发生于广东省，随后迅速蔓延到全国。在1972年至1976年的疾病流行期间，中国境内饲养中蜂损失超过百万群。后来疾病的损耗降低，但蜂群的发病率仍在50%-70%。该病主要采取综合防治措施防控，如：换王断子、严格消毒、加强管理，使用抗病毒药物配以抗生素预防继发感染。目前用于治疗中蜂囊状幼虫病的药物主要有抗病毒类的西药如病毒灵、病毒唑和金刚烷胺等，然而使用西药有可能引起病毒的加快变异，而且有污染商品蜂蜜的风险，因此已被国家农业部禁止在蜜蜂病害防治中使用。另外，也有使用一些中药配方来治疗中蜂囊状幼虫病，虽然具有一定的治疗效果，但是中药的治疗的效果仍未稳定，治疗效果不高。目前，该病由于缺乏安全高效的抗病毒药物，生产中存在滥用药物现象，这使我国当前蜂产品药物残留较高，蜂产品出口受限。因而，研发高效、安全、无残留的蜂药是当今养蜂业的迫切需求。

抗菌肽是一种小分子的多肽类物质，具有广泛的生物学活性，具有广谱杀菌、抗病毒、消炎、抑制肿瘤细胞生长及调节机体免疫反应等作用，对原核生物有作用，对真核生物无害。抗菌肽是生物防御系统中产生的一类对抗外源性病原体的肽类物质，是生物先天的、非特异性防御系统的重要组成部分。抗菌肽可与革兰阴性菌外膜的脂多糖或革兰阳性菌表面的肽聚糖结合，使其被破坏而形成穿膜通道，胞内离子大量流出，细胞因高渗破裂而死亡，不易产生耐药性。另外，它还具有免疫调节、促进损伤修复、中和内毒素及对抗脓毒性休克的作用。因此，抗菌肽具有极广泛的应用价值。

抗菌肽最初是在昆虫中发现。昆虫抗菌物质一直是昆虫免疫研究的热点。昆虫由于体内没有形成获得性免疫必须的淋巴细胞抗体和胸腺，天然免疫就成了相对重要的防线，抗菌肽就是一种先天免疫。蜜蜂抗菌肽是蜜蜂在受到病原物感染后，其脂肪体迅速合成的一些具有抗菌活性的肽类，然后释放到血淋巴中发挥抑制细菌、真菌、病毒的作用。蜜蜂抗菌肽属于先天免疫，在体液内有4个基因家族，不同抗菌肽基因家族存在协同作用，不同抗菌肽作用机理虽有不同，却各司其职，共同抵御着各种病原物的侵染。因此，抗菌肽在蜜蜂饲养病害防控中具有巨大的应用潜力。从技术经济效益角度考虑，低于50个氨基酸的多肽适合采用化学合成法生产。寻找更小分子、更高活性、更多活性抗菌肽对于降低生产成本至关重要。抗菌肽RRWWCR是在已知天然抗菌肽序列牛乳铁蛋白（Lactoferricin）B4-9RRWQWR的基础上人工改造的多肽（参见《Theantimicrobial activity of hexapeptides derived from synthetic combinatoriallibraries》，J Appl Bacteriol，1995年第78卷第1期，第39页至46页），该抗菌肽除了具有广谱抗菌作用之外，还有抗炎症、免疫调节作用，但该抗菌肽是否具有抗蜜蜂病毒病的作用还未进行研究。

发明内容

有鉴于此，本发明目的之一在于提供一种六肽抗菌肽，人工合成方法简单，成本低廉；本发明的目的之二在于提供一种利用该六肽抗菌肽制备的药物，该药物利于肽的保存，且使用方便；本发明的目的之三在于提供所述六肽抗菌肽在制备抗蜜蜂病毒病药物中的应用，利用所述六肽抗菌肽制备的药物治疗效果显著。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种抗菌肽，所述抗菌肽为SEQ ID No：1中的氨基酸序列所示。

本发明中，利用所述的抗菌肽制备的药物，所述药物为抗菌肽的可溶性粉剂。

优选的，所述药物还包括溶解所述可溶性粉剂的糖浆液，所述糖浆液与所述可溶性粉剂分开包装，所述糖浆液为白砂糖的水溶液，白砂糖与水的质量比为1-1.5:1。

优选的，所述的药物，所述糖浆液中白砂糖与水的质量比为1.2:1。

优选的，所述的药物，所述糖浆液中还含有防腐剂。

所述的药物的使用方法，将所述的抗菌肽可溶性粉剂溶于所述的糖浆液中，制备成含有抗菌肽的糖浆液即可。

本发明所述的抗菌肽在制备抗蜜蜂病毒病的药物中的应用，所制备的药物剂型可以为任意的，优选的，所述药物为抗菌肽的可溶性粉剂。粉剂利于多肽保存。

进一步，所述药物还包括溶解所述可溶性粉剂的糖浆液，所述糖浆液与所述可溶性粉剂分开包装，所述糖浆液为白砂糖的水溶液，白砂糖与水的质量比为1-1.5:1。在使用时，将可溶性粉剂溶于糖浆液即可，抗菌肽的用量优选为1-5mg抗菌肽/1000ml糖浆液进行配置。

进一步，所述糖浆液中白砂糖与水的质量比为1.2:1。

进一步，所述糖浆液中还含有防腐剂。

本发明所述的抗菌肽在制备抗蜜蜂病毒病的药物中的应用。

特别地，所述的抗菌肽在制备抗蜜蜂囊状幼虫病病毒的药物中的应用。

特别地，所述抗菌肽在制备抗中蜂囊状幼虫病的药物中的应用。中华蜜蜂是中国独有的蜜蜂当家品种，囊状幼虫病是中蜂的主要病害之一，在养蜂生产上常有发生，因此，制备治疗中蜂囊状幼虫病的药物对饲养中蜂具有重要的作用。

本发明的有益效果：1）本发明采用人工方法合成了一种六肽抗菌肽，其人工合成方法简单，成本低；2）本发明提供了所述的抗菌肽的用途，具体涉及抗菌肽在制备抗蜜蜂囊状幼虫病病毒的药物中的应用，利用本发明所述的抗菌肽制备治疗中蜂囊状幼虫病的药物，该抗菌肽表现出了良好的治疗效果和保健作用；3）所述抗菌肽不需要任何修饰、结构简单、活性高、人工合成方法简单、成本低廉；因此可望应用于蜜蜂病害的预防与治疗。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本发明所举实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明所举实施例中所用试剂及药品均通过商业途径获得。

实施例1抗菌肽

本发明的抗菌肽为SEQ ID No：1中的氨基酸序列，SEQ ID No：1的序列为：Arg-Arg-Trp-Trp-Cys-Arg。

(a)序列特征：

●长度：6

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：多肽

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人工合成

本实施例抗菌肽按照固相法合成，最终得到的抗菌肽经高效液相色谱（HPLC）分析，其纯度为98%。固相法合成的方法可以参见Schnlzer M，AlewoodP，Jones A，Alewood D，Kent SBH.In situneutralization in Boc-chemistry solidphase peptide synthesis.Int J Pept Res Ther.2007；13：31-44。

实施例2

取白砂糖1200g，溶于1100ml去离子水中，搅拌，加热煮沸5-10min，保持液体体积为1000ml，制成糖浆液，待冷却后，向所述的糖浆液中加入1mg实施例1所制备的抗菌肽，待完全溶解后得到含抗菌肽的糖浆液，其中抗菌肽浓度为1mg/1000ml糖浆液。

实施例3

取白砂糖1200g，溶于1100ml去离子水中，搅拌，加热煮沸5-10min，保持液体体积为1000ml，制成糖浆液，待冷却后，向所述的糖浆液中加入5mg实施例1所制备的抗菌肽，待完全溶解后得到含抗菌肽的糖浆液，其中抗菌肽浓度为5mg/1000ml糖浆液。

实施例4

取白砂糖1200g，溶于1100ml去离子水中，搅拌，加热煮沸5-10min，保持液体体积为1000ml，制成糖浆液，待冷却后，向所述的糖浆液中加入25mg实施例1所制备的抗菌肽，待完全溶解后得到含抗菌肽的糖浆液，其中抗菌肽浓度为25mg/1000ml糖浆液。

实施例5抗菌肽的应用

1病毒鉴定

1.1样本采集

采集中蜂场有典型囊状有虫病临床症状特征的病死幼虫，样本于-20℃保存，采用RT-PCR方法和序列测定与分析方法鉴定病原。

1.2RNA提取

RNA提取采用Trizol法，取样本于研钵中，加入液氮充分研磨后取0.1g于离心管中，加入800μL Trizol混匀，室温静置15min后，加入250μL氯仿充分振荡，4℃下静置10min后12000r/min离心15min。取上清加入等体积异丙醇，混匀，4℃下12000r/min离心10min。沉淀以70%乙醇洗一次，吸干上清，沉淀溶解于100μL经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的去离子水，以备反转录。

1.3RT-PCR

根据中蜂囊状幼虫病病毒（CSBV）广东株基因组序列（GenBank登录号：AF469603）设计CSB1F/CSB2R、CSB3F/CSB4R和CSB14F/CSB15R三对引物（见表1）。反转录反应体系：25μL体系中含有5×buffer5μL，2.5mM dNTPs2μL，10μM特异性下游引物1μL，RNA溶液15.5μL，40U/μL AMV逆转录酶（AMV ReverseTranscriptase）0.5μL，10U/μL RNase抑制剂（RNase Inhibitor）1μL。混合均匀，42℃水浴孵育1h合成cDNA，98℃灭活3min，置-20℃保存。PCR反应体系：10×PCR Buffer（含15mM Mg²⁺）2.5μL，2.5mM dNTPs0.5μL，5U/μL rTaq酶（rTaq）0.10μL，10μM上、下游引物各0.5μL，cDNA0.5μL，用去离子水补足25μL。PCR循环参数见表2，共进行30个循环。取PCR产物5μL用1%琼脂糖凝胶电泳。

表1CSBV RT-PCR引物

表2PCR循环参数

1.4序列测定及序列分析

回收目的条带，将其克隆到pMD18-T载体，插入片段用pMD18-T质粒上的通用引物M13进行序列测定，将测得序列在NCBI上作BLAST搜索以进行同源性分析。

2囊状幼虫病病毒的制备

将临床症状典型且经RT-PCR方法鉴定为中蜂囊状幼虫病病毒感染致死的的蜂幼虫放在研磨器中研磨10min得到混悬液，混悬液经12000r/m离心10min，吸取上清，将所得的上清经0.22μm微孔滤膜过滤，得滤液，将所得的滤液加入1000ml糖浆液（白砂糖与水质量比为1.2:1）中，即为病毒种子液。

3攻毒

将所制备的病毒种子液在傍晚时分喷洒于未发病的健康蜂群中，每脾双面喷，最后喷巢门，连续喷洒病毒液3天，待检查发病后用于试验。

4给药试验

试验分成5组，每组15群，蜂群群势基本一致。第1组为高浓度给药组，抗菌肽浓度为25mg/1000ml糖浆液（如实施例4）；第2组为中浓度给药组，抗菌肽浓度为5mg/1000ml糖浆液（如实施例3）；第3组为低浓度给药组，抗菌肽浓度为1mg/1000ml糖浆液（如实施例2）；第4组为感染不给药组，饲喂不含抗菌肽的糖浆液；第5组为空白对照，即不感染不给药蜂群。所述糖浆液为白砂糖的水溶液，其中白砂糖与水的质量比例为1.2:1。

以上各组蜂群于傍晚进行饲喂，第1组每次每足脾饲喂高浓度抗菌肽糖浆液50ml，隔日饲喂1次，连续饲喂9天；第2组每次每足脾饲喂中浓度抗菌肽糖浆液50ml，隔日饲喂1次，连续饲喂9天；第3组每次每足脾饲喂低浓度抗菌肽糖浆液50ml，隔日饲喂1次，连续饲喂9天；第4组每次每足脾饲喂50ml不含抗菌肽的糖浆液，隔日饲喂1次，连续饲喂9天；第5组每次每足脾饲喂50ml不含抗菌肽的糖浆液，隔日饲喂1次，连续饲喂9天；每9天测定一次幼虫死亡率。

幼虫死亡率测定方法按照如下方法进行：开箱后先将子脾蜜蜂抖落在蜂箱中，用蜂扫扫掉残留在脾上的蜂，然后将脾平放在瓷盘中，用30×50cm的薄膜贴在脾上做好定位标记，在薄膜上标记未封盖的100只幼虫或卵巢房，计数为标记幼虫或卵A只。9天后用标记的薄膜贴在原来的仔脾上，对准位置，查看红色标记的巢房是否封盖，若未封盖，在薄膜上标记并计算未封盖或者穿孔的封盖子数，计数为未封盖幼虫或卵B只。未封盖的幼虫或穿孔封盖子一旦发病，必将死亡即假定认为该幼虫发病死亡，该群幼虫的发病率即为该群的幼虫死亡率。最后计算出幼虫死亡率=B/A×100%，同时，做好下一次的幼虫或卵标记，重复上述试验。

5试验结果

（1）病情指数计算方法

按幼虫发病死亡轻重程度分级。

0级：子脾上未发现病虫；1级：病害虫数占总幼虫数，﹤5％；2级：病害虫数占总幼虫数，5％～30％；3级：病害虫数占总幼虫数，﹥30％。病情指数越大，说明病害越严重。

（2）防治效果计算方法

利用各处理组蜂群的幼虫死亡率，计算本发明所述的抗菌肽对蜂群的防治效果，结果见表3和表4所示。

表3抗菌肽对中蜂囊状幼虫病幼虫死亡率的影响

注：*p<0.05，与第4组比较差异显著；

**p<0.01，与第4组比较差异极显著。

表4抗菌肽对中蜂囊状幼虫病的防治效果

攻毒蜂群发病，未攻毒的蜂群病情指数等级无改变。给药组蜂群幼虫死亡率相对于未给药组蜂群幼虫死亡率显著降低，中浓度（5mg/1000ml糖浆液）和低浓度（1mg/1000ml糖浆液）抗菌肽对中蜂囊状幼虫病的治疗效果相当，高于高浓度（25mg/1000ml糖浆液）抗菌肽治疗效果。0.1%抗菌肽制剂（即1mg抗菌肽/1000ml糖浆液）对中蜂囊状幼虫病防治效果为74.33%。该抗菌肽还具有很好的保健作用，次年蜂群群势旺盛，繁殖力、出勤率、采蜜量好于其他蜂群。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的抗菌肽在制备抗蜜蜂囊状幼虫病病毒的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为抗菌肽的可溶性粉剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物还包括溶解所述可溶性粉剂的糖浆液，所述糖浆液与所述可溶性粉剂分开包装，所述糖浆液为白砂糖的水溶液，白砂糖与水的质量比为1-1.5:1。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述糖浆液中白砂糖与水的质量比为1.2:1。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述糖浆液中还含有防腐剂。

6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，将所述的抗菌肽可溶性粉剂溶于所述的糖浆液中，制备成含有抗菌肽的糖浆液即可。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽在制备抗中蜂囊状幼虫病的药物中的应用。