CN101509004B - 7、8-脱氢酶基因的克隆与表达 - Google Patents

Abstract

本发明是针对一种7、8-脱氢酶基因的克隆与表达，该编码7、8-脱氢酶的基因是从已构建的果蝇cDNA文库中获得，该酶可以转化胆固醇为7-脱氢胆固醇，为生物法合成7-脱氢胆固醇提供一种新方法，得到的可以缩短维生素D3的工艺路线，降低生产成本，减少环境污染。

Description

7、8-脱氢酶基因的克隆与表达

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及7、8-脱氢酶基因的克隆与表达。

背景技术

维生素D₃是人与动物生长、发育、繁殖、维持生命和保持健康必不可少的一种脂溶性维生素。它的主要作用是调节钙磷代谢，促进肠内钙磷吸收和骨质钙化，维持血钙和血磷的平衡，可用作药物制剂、食品和饲料添加剂等，在临床上还可用于治疗佝偻病、老年骨质疏松、甲状腺机能减退症等。目前维生素D₃是采用光化学法生产，即以7-脱氢胆固醇(7一DHC)为原料，经紫外照射后转变为维生素D₃前体(PreD₃)，再热异构化而得。作为主生产原料的7-脱氢胆固醇，可采用多种不同的原料和工艺路线，通过化学合成法制备。如可从羊毛脂提取胆固醇，再进行酯化、氧化生成7-酮胆固醇酯，后者可还原成7α和7β-羟基胆固醇酯，再通过消除反应生成7-脱氢胆固醇。我国中科院感光化学所(现为理化所)张建成等人的工艺路线，则以胆固醇为基本原料，经氧化、加成等一系列反应得到7-脱氢胆固醇。

随着世界人口的不断增加和各国国民经济的发展，以及人们生活水平的提高，市场对维生素D₃的需求量也呈上升趋势。但迄今，无论采用何种化学合成法制备原料7-脱氢胆固醇，都有反应步骤长，总产率不高，副反应多，条件难控制，效率偏低，成本高等缺点，从而影响维生素D₃的生产成本、销售价格、市场推广。因此，目前研究开发工艺路线短、成本低的7-脱氢胆固醇生产方法变得十分迫切和必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够克服现有技术中的不足之处，采用生物工程方法，研究开发工艺路线短、成本低的7-脱氢胆固醇生产路线。

本发明是从果蝇cDNA文库中克隆一种编码7、8-脱氢酶的基因，其目的是提供一种克隆与表达7、8-脱氢酶的方法，该发明可以获得有酶活的7、8-脱氢酶。

目前有关蜕皮激素合成机理的研究发现，某些昆虫的幼虫，在蜕皮激素生物合成的第一步，其体内有种脱氢酶，先将胆固醇7、8号位上的氢原子脱除，得到中间产物7-脱氢胆固醇，进而在P450酶系其它酶的作用下，经多步酶促反应合成蜕皮激素。基于这种理论，我们从果蝇cDNA文库中克隆一种编码7、8-脱氢酶的基因，并成功表达。通过控制合适的酶反应条件，发现该7、8-脱氢酶能将胆固醇转化为7-脱氢胆固醇。这样的结果，十分有利于下一步研究高酶活、低成本的脱氢酶制造方法，从而开发一种全新的、生物法合成7-脱氢胆固醇工艺路线，并最终实现大幅度降低7-脱氢胆固醇和维生素D₃生产成本的目的。

本发明的技术方案如下：

1、从果蝇中获取cDNA文库和pSE380质粒，保存于实验室中。

2、基因的克隆与测序，自行设计的引物进行PCR扩增，PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收后与pGM-T vector连接，得到重组质粒，用连接液转化感受态E.coli DH5α，在含Amp、IPTG、X-gal的LB平板上挑取白色菌落，接种于含Amp的LB培养基中，抽提质粒进行PCR和酶切验证、测序。

3、根据上述扩增得到的片段，采用上述设计的引物进行片段的扩增。以重组克隆载体为模板进行降落PCR扩增，回收产物和pSE380分别经过EcoR I和BamH I进行双酶切，回收后连接，转化E.coli DH5α，Amp抗性筛选，抽提重组质粒进行PCR，酶切鉴定，将鉴定后的重组质粒测序，进一步验证。

4、E.coli BL21(DE3)plysS的转化和7、8-脱氢酶的诱导表达，将重组pSE380转化感受态的BL21，取160μL转化液涂布于LB平板上，35-38℃培养至出现单菌落，并用含有空白载体pSE380的菌株作为空白对照。从转化平板上挑取单菌落到5mL LB液体培养基中，35-38℃ 220r/min摇床培养至OD₆₀₀＝0.6左右，添加IPTG至终浓度为1mmol/L，同时将含有空白载体pSE380的菌株作为空白对照。通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现。

5、重组菌粗酶液提取，按照上述方法进行摇瓶培养，将培养诱导所得菌液8000r/min离心5min，取菌体沉淀悬浮于PBS缓冲液中，超声波破壁，离心取上清液即得粗酶液。取上清液300ml通过切向流膜过滤分离系统浓缩纯化分离蛋白酶，最终获得粗酶液20ml，用于酶学性质等方面的研究。

6、以胆固醇为底物进行酶学性质鉴定，将1g胆固醇溶解于含Tween 80、pH 7.4的磷酸缓冲溶液中，与10ml粗酶液混合，常温避光反应12h，反应液用有机溶剂萃取，萃取剂与反应液体积比为5∶1，萃取温度38-40℃，萃取时间50-80min，用反相高效液相色谱法检测反应结果，检测发现反应液中有7-脱氢胆固醇，其出峰时间与标品7-脱氢胆固醇一致；所述的萃取的有机溶剂是石油醚。所述的检测条件为：C18柱(5μm，250mm×4.6mm)，流动相乙腈-异丙醇(7∶3)，柱温30℃，流速1.0mL/min，检测波长280nm。

上述第2步中，从已构建的果蝇cDNA文库中获得一种编码7、8-脱氢酶的基因以及该基因编码的酶，该酶特征在于此酶由438个氨基酸组成，其分子量为51307.89 Da。此酶被命名为7、8-脱氢酶。且由下列氨基酸序列组成：

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上述编码7、8-脱氢酶的基因，其核苷酸序列如下：

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本发明的有益效果：

1、从果蝇中获取7、8-脱氢酶基因；

2、涉及到7、8-脱氢酶基因的cDNA序列及克隆、与之相对应的蛋白质序列及其在大肠杆菌中的表达，并且该酶可以转化胆固醇为7-脱氢胆固醇，为生物法合成7-脱氢胆固醇提供一种新方法。

3、该方法简单高效，实现7-脱氢胆固醇直接转化，即一步酶法转化胆固醇为7-脱氢胆固醇，既提高其转化效率、缩短维生素D₃的工艺路线、降低生产成本又减少环境污染。

附图说明

图1为重组质粒EcoR I、BamH I双酶切和降落PCR鉴定图。

图2为表达载体物理图谱。

图3为酶促反应液高效液相色谱图。

图4为标品7-脱氢胆固醇高效液相色谱图。

本发明是一种7、8-脱氢酶的基因克隆与表达，将结合附图简要说明：

图1为重组质粒EcoR I、BamH I双酶切和降落PCR鉴定图

以重组克隆载体为模板进行降落PCR扩增，回收产物和pSE380分别经过EcoR I和BamH I进行双酶切，其结果通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。

图2为表达载体物理图谱

将重组基因转化入E.coli(DE3)plysS所用的质粒载体是pSE380，该质粒具有如下特征：带有Amp选择标记；4476bp；被克隆的基因受控于TRC启动子；带有多克隆位点(ploylinker site)。

图3为酶促反应液高效液相色谱图

将酶促反应液预处理后，用反相高效液相色谱法检测反应结果，检测条件为：C18柱(5μm，250mm×4.6mm)，流动相乙腈-异丙醇(7∶3)，柱温30℃，流速1.0mL/min，检测波长280nm。

图4为标品7-脱氢胆固醇高效液相色谱图

标品7-脱氢胆固醇的反相高效色谱法检测结果，检测条件为：C18柱(5μm，250mm×4.6mm)，流动相乙腈-异丙醇(7∶3)，柱温30℃，流速1.0mL/min，检测波长280nm。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的描述：

实施例1

1文库来源和质粒

果蝇cDNA文库和pSE380均由本实验室保存。

2主要试剂

pGM-T Simple连接试剂盒购自天根生化科技有限公司，BioSpin胶回收试剂盒、BioSpin PCR产物纯化试剂盒均购自杭州博日科技有限公司。EcoR I和BamH I酶均购自Fermentas公司。

3方法

3.1基因的克隆与测序

以自行设计的引物进行PCR扩增，上游引物：5-GGGGAATTCCCTACTAGAAAATGACTGGAAGC-3，下游引物为5-GGGGGATCCTTTTGCAACATAGGTTCGACC-3。采用25μL的反应体系：10×buffer 2.5μL，dTNP 0.5μL，正反向引物各0.5μL，cDNA模板0.5μL，rTaq酶0.25μL，补水至25μL。降落PCR条件为：95℃ 5min，94℃ 50s，59℃ 45s，72℃ 2min；先循环5次，每次下降一度；然后94℃ 50s，54℃ 45s，72℃ 2min循环25次。PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收后与pGM-T vector连接，得到重组质粒。连接体系为：pGM-T vector 1μL，PCR产物5μL，10×T4 ligase buffer 1μL，T4 DNA连接酶1μL，双蒸水2μL，16℃连接过夜。用连接液转化感受态E.coliDH5α，在含Amp、IPTG、X-gal的LB平板上挑取白色菌落，接种于含Amp的LB培养基中，抽提质粒进行PCR和酶切验证、测序。

3.2 pSE380表达载体的构建

根据上述扩增得到的片段，采用上述设计的引物进行片段的扩增。以重组克隆载体为模板进行降落PCR扩增，见附图1。回收产物和pSE380分别经过EcoR I和BamH I进行双酶切，回收后连接，转化E.coli DH 5α，Amp抗性筛选，抽提重组质粒进行PCR，酶切鉴定，将鉴定后的重组质粒测序，进一步验证。

3.3E.coli BL21(DE3)plysS的转化和7、8-脱氢酶的诱导表达

将重组pSE380转化感受态的BL21(DE3)plysS，取160μL转化液涂布于LB(含氨苄青霉素0.1g/ml)平板上，37℃培养至出现单菌落，并用含有空白载体pSE380的菌株作为空白对照。从转化平板上挑取单菌落到5mL LB(含Amp 100μg/mL)液体培养基中，37℃220r/min摇床培养至OD₆₀₀＝0.6左右，添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为1mmol/L进行诱导表达，同时将含有空白载体pSE380的菌株作为空白对照。通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现。

3.4重组菌粗酶液提取

按照上述方法进行摇瓶培养，将培养诱导所得菌液8000r/min离心5min，取菌体沉淀悬浮于PBS缓冲液中，超声波破壁，离心取上清液即得粗酶液。取上清液300ml通过切向流膜过滤分离系统浓缩纯化分离蛋白酶，最终获得粗酶液20ml，用于酶学性质等方面的研究。

3.5以胆固醇为底物进行酶学性质鉴定

将1g胆固醇溶解于含Tween 80、pH 7.4的磷酸缓冲溶液中，与10ml粗酶液混合，常温避光反应12h。反应液用有机溶剂萃取，萃取剂(石油醚)与反应液体积比为5∶1，萃取温度38-40℃，萃取时间50-80min。为提高收率，可重复萃取2-3次。用反相高效液相色谱法检测反应结果，检测条件为：C 18柱(5μm，250mm×4.6mm)，流动相乙腈-异丙醇(7∶3)，柱温30℃，流速1.0mL/min，检测波长280nm。检测发现反应液中有7-脱氢胆固醇，其出峰时间与标品7-脱氢胆固醇一致，结果参见附图3，图4。

Claims (6)

1.一种编码7、8-脱氢酶的基因，是从已构建的果蝇cDNA文库中获得，其特征在于：该基因编码的酶由438个氨基酸组成，其分子量为51307.89Da，氨基酸序列组成如下：

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YGKLKYLAEVNLSHTFKLKGKFGCFRMEVSGKQIGPSIVCLEVNSYTFGKIKVFQYITRVEPMLQKVVRSFYG

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2.根据权利要求1所述的编码7、8-脱氢酶的基因，其特征在于：其核苷酸序列如下所示：

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ttttttgttc cactagaatg gaaaaaggat ttggacaacg aaaaatggtc atttttaagg

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3.一种重组质粒，其特征在于它含有权利要求1或2所述的基因。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于所述的基因连接在质粒pSE380上。

5.一种基因工程菌，其特征在于它被根据权利要求3或4所述重组质粒转化。

6.根据权利要求1所述的编码7、8-脱氢酶基因的克隆与表达的方法，其特征在于：

(1)从果蝇中获取cDNA文库，保存于实验室中；

(2)基因的克隆与测序，自行设计的引物进行PCR扩增，PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收后与pGM-T载体连接，得到重组质粒，用连接液转化感受态E.coli DH5α，在含Amp、IPTG、X-gal的LB平板上挑取白色菌落，接种于含Amp的LB培养基中，抽提质粒进行PCR和酶切验证、测序；

(3)根据上述扩增得到的片段，采用上述设计的引物进行片段的扩增，以重组克隆载体为模板进行降落PCR扩增，回收产物和表达载体pSE380分别经过EcoRI和BamH I进行双酶切，回收后连接，转化E.coli DH5α，Amp抗性筛选，获得提取重组质粒pSE380，抽提重组质粒后进行PCR、酶切鉴定，将鉴定后的重组质粒测序，进一步验证；

(4)E.coli BL21(DE3)plysS的转化和7、8-脱氢酶的诱导表达，将重组质粒pSE380转化感受态的BL21，取160μL转化液涂布于LB平板上，37℃培养至出现单菌落，并用含有空白载体pSE380的菌株作为空白对照；从转化平板上挑取单菌落到5mL LB液体培养基中，37℃220r/min摇床培养至OD₆₀₀＝0.6左右，添加IPTG至终浓度为1mmol/L，同时将含有空白载体pSE380的菌株作为空白对照，通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现；

(5)重组菌粗酶液提取，按照上述方法进行摇瓶培养，将培养诱导所得菌液8000r/min离心5min，取菌体沉淀悬浮于PBS缓冲液中，超声波破壁，离心取上清液即得粗酶液；取上清液300ml通过切向流膜过滤分离系统浓缩纯化分离蛋白酶，最终获得粗酶液20ml，用于酶学性质的研究；

(6)以胆固醇为底物进行酶学性质鉴定，将1g胆固醇溶解于含Tween 80、pH 7.4的磷酸缓冲溶液中，与10ml粗酶液混合，25℃避光反应12h，反应液用有机溶剂萃取，萃取剂与反应液体积比为5∶1，萃取温度40℃，萃取时间60min，用反相高效液相色谱法检测反应结果，检测发现反应液中有7-脱氢胆固醇，其出峰时间与标品7-脱氢胆固醇一致；所述的萃取的有机溶剂是石油醚；所述的检测条件为：C18柱：5μm，250mm×4.6mm，流动相乙腈-异丙醇为7∶3，柱温30℃，流速1.0mL/min，检测波长280nm。

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