CN103484444B - 定点突变获得的谷氨酸脱羧酶突变体基因及其编码蛋白质和应用 - Google Patents

定点突变获得的谷氨酸脱羧酶突变体基因及其编码蛋白质和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶突变体，酶活性中心附近的酸性氨基酸谷氨酸突变为中性氨基酸，其DNA序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，该突变体蛋白的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。本发明利用DNA定点突变技术，对野生型谷氨酸脱羧酶GadB1编码基因进行分子改造，得到了两种突变体酶GadB1E312S和GadB1E91Q，相对野生酶其有效pH作用范围得到一定的扩展，尤其在偏中性pH条件下仍具有较好的活性。随着有效pH作用范围的拓宽，突变酶在pH5.5～6.5条件下，仍然具有较高的催化活性，因此解决了谷氨酸脱羧酶催化GABA生物合成时，在pH5.5～6.5时，催化能力低的问题，为利用该酶及其编码基因来生物合成GABA创造好的条件。

Description

定点突变获得的谷氨酸脱羧酶突变体基因及其编码蛋白质和应用
技术领域
本发明涉及两种谷氨酸脱羧酶突变体基因及其应用，属于分子生物学的技术领域。
背景技术
定点突变（site-directed mutagenesis）属于理性设计，是指在目的DNA片段的指定位点引入特定的碱基对，从而改变其编码的氨基酸序列的技术（图2）。它是研究蛋白质结构与功能之间的复杂关系的强有力的工具，也是实验室常用的基因改造的手段。对某个已知的基因的特定碱基进行定点改造、缺失、或者插入，可以改变对应氨基酸序列和蛋白质的结构和功能特征，有助于了解蛋白质结构和功能的关系。
谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，简称GAD；EC4.1.1.15）以PLP作为辅酶，催化谷氨酸发生不可逆的α-脱酸反应，过程中消耗一个质子，生成γ-氨基丁酸（γ-aminbutyric，简称GABA)。GAD广泛存在于动物、植物、微生物中，但是在它们的机体里面的功能各不相同。其中在动物中主要是产生GABA，一种中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，因此具有重要的生理功能；在植物中，GAD系统可以抵抗多种压力，如骤然高温、缺氧、钙离子骤增等；在微生物中，特别是一些肠道细菌，如大肠杆菌、乳酸菌等，主要与机体耐酸机制有关，它们的最适pH一般在4～5，在此范围之外酶活力会大幅降低，尤其是当pH大于6时基本失去活性，这使得利用该酶生物合成GABA受到体系pH值的严重限制，因此需要拓宽GAD酶的pH作用范围，使其在偏中性条件下，仍具有较好的活性，解决谷氨酸脱羧酶催化GABA生物合成时，在pH5.5～6.5时，催化能力低的问题，为利用该酶及其编码基因来生物合成GABA创造好的条件。
发明内容
本发明提供了一种谷氨酸脱羧酶突变体，其酶活性中心附近的酸性氨基酸谷氨酸突变为中性氨基酸。
所述谷氨酸脱羧酶突变体为第312位谷氨酸突变为丝氨酸，核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2。
所述谷氨酸脱羧酶突变体为第91位谷氨酸突变为谷氨酰胺，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4。
本发明还提供了一种获得所述谷氨酸脱羧酶突变体的方法，其特征在于：在中国专利CN201110020606.8中公布的gadB1基因序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点分别为第312位的谷氨酸和第91位的谷氨酸。
上述任一突变体基因及其所编码的酶在生物合成GABA的应用均属于本发明要求保护的范围。
本发明还提供一种生产上述谷氨酸脱羧酶突变体的方法，将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列以pET28a或能表达该酶的质粒为表达载体，以大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)或能表达该酶的菌株为表达宿主，实现突变体基因gadB1E312S和gadB1E91Q的高效表达。
本发明中表达单元的启动子为常用的T7启动子，在T7启动子的作用下，突变体酶可以直接在宿主细胞E.coli BL21(DE3)中，完成胞内的可溶性表达。
本发明所用的谷氨酸脱羧酶的基因gadB1来自产γ-氨基丁酸的短乳杆菌，该菌株已于2010年12月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2010367，分类学命名短乳杆菌Lb85（Lactobacillus brevis Lb85），gadB1的测序结果在中国专利CN201110020606.8中已经公布，序列见SEQ ID NO.5。
本发明提供的突变体酶在偏中性条件下，酶活有明显的提高，解决了野生型的谷氨酸脱羧酶在偏中性pH条件下催化活性低的问题，为利用该酶催化GABA生物合成创造好的条件。
本发明通过比较野生酶GadB1和突变酶GadB1E312S、GadB1E91Q的有效作用pH范围和体外的催化能力，结果发现在pH6.5下，突变体酶GadB1E91Q将L-谷氨酸转变成GABA的转化率为野生型的5.7倍；突变体酶GadB1E312S将L-谷氨酸转变成GABA的转化率为野生型的3.6倍。
附图说明
图1为重组质粒pET28a(+)-gadB1的构建图谱：
图2为定点突变的原理示意图：
图3为野生型和突变型酶纯化后的SDS-PAGE图谱：
图4为野生和突变酶的最适pH变化图：
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。材料和试剂：
所用的限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR试剂等均购于TaKaRa宝生物公司；质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒、琼脂糖纯化试剂盒、大肠杆菌JM109、BL21(DE3)菌株购于天跟生物公司；引物购于上海捷锐公司；SDS-PAGE试剂盒购于碧云天生物公司；其他试剂均为国内或者国外购买的分析纯试剂。
实施例一：重组质粒的构建
将L.brevis Lb85培养至指数生长中期，取3mL菌液12000rpm离心1min弃上清，溶菌酶处理0.5h，然后按照试剂盒说明提取基因组DNA。
设计如下的引物来用于gadB1的扩增：
gadB1-F：5’-GACCGCTCATATGGCTATGTTGTATGGAAAAC-3’
gadB1-R：5’-CGTGAATTCTTAGTGCGTGAACCCGTATT-3’
其中上游引物酶切位点为NdeI（gadB1-F中下划线部分），下游引物酶切位点为EcoRI（gadB1-R中下划线部分）。
PCR扩增条件：94℃变性5min，34个循环（95℃30s，55℃30s，72℃90s），最后72℃延伸10min。
扩增产物纯化后，用NdeI和EcoRI对PCR产物和载体pET28a进行双酶切，两者的回收产物，用T4连接酶22℃下连接4h，化学转化到JM109细胞中，待平板上长出转化子之后，挑取转化子液体培养，提取质粒，通过酶切和PCR验证获得重组质粒pET28a-gadB1（图1），然后将重组质粒转到BL21(DE3)细胞，得到BL21(DE3)/pET28a-gadB1工程菌。
实施例二：定点突变
定点突变原理：点突变质粒的构建采用Dpn I法（图2）。根据待突变的氨基酸位点来设计PCR点突变引物，以pET-28a-gadB1质粒为模板，以设计的相关的正向引物及其互补引物（反向引物），通过PCR扩增出产物。
E91Q-正向引物：CGCCATCGATAAATCCCAGTATCCTCGGACCGCT
E91Q-反向引物：GCGGTAGCTATTTAGGGTCA TAGGAGCCTGGCGA
E312S-正向引物：AGCTACTTGGGTGGTAGTCTACCTACGATGGCC
E312S-反向引物：GGCCATCGTAGGTAGACTACCACCCAAGTAGCT；
其中下划线部分分别代表突变体基因编码的91位谷氨酰胺和312位丝氨酸所对应的密码子。PCR扩增体系为：质粒DNA0.5μL，5×Primer star Buffer5μL，引物各0.5μL，dNTP2μL，Primer star0.25μL，ddH2O补至25μL，PCR扩增条件95℃变性1min，循环18次（95℃40s，50℃15s，68℃6min30s），72℃10min。
PCR产物用DpnⅠ酶在37℃处理3h，去除模板DNA，消化产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，得到相关突变株的转化子，提取质粒，经过EcoRI单酶切和突变基因PCR扩增、测序，得到正确突变株，将构建成功的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到待表达的突变株。
实施例三：野生酶和突变酶的表达纯化
表达：BL21(DE3)/pET28a-gadB1、BL21(DE3)/pET28a-gadB1E91Q、BL21(DE3)/pET28a-gadB1E312S接种于含有30mg/L卡拉霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD600至3.0～5.0，将其转接种到含有30mg/L卡拉霉素的装液量为500mL LB液体培养基的2L三角瓶中，控制初始OD600为0.02，在37℃、200rpm下培养至OD600在0.7～0.9范围内，加入1mM IPTG进行诱导，然后28℃、200rpm诱导表达培养8h。
提取：菌液在4000rpm、4℃的条件下，离心20min，弃上清液；然后加入40mL、pH8.0裂解缓冲液吹打混匀菌体，之后在4000rpm、4℃离心20min，倒掉上清液，重复2次。称量菌体的湿重，加入菌体湿重10倍体积的裂解缓冲液，超声破碎15min，向破碎液中加入1%Triton X-100（把膜上的目的蛋白分离下来）和1mM PMSF（防止目的蛋白分解），在冰上放置1h后，在4℃、12000rpm离心60min，收集上清即为粗酶液，最后用孔径0.22μm水系膜过滤，即得Ni柱上样样品。
纯化：采用Ni-NTA亲和层析柱对上一步所得的样品进行分离纯化。经过上样、漂洗和洗脱，收集含有目的蛋白的洗脱液，SDS-PAGE分析（图3），然后通过透析除去小分子即得到纯酶。测定纯酶的浓度。
所涉及缓冲液配制：
裂解缓冲液：50mM NaH2PO4·2H2O，300mM NaCl，1mM PMSF(溶解在无水乙醇中配成200mM的母液在-20℃中保存)，10mM咪唑，用NaOH调至pH8.0。
漂洗缓冲液：50mM NaH2PO4·2H2O，300mM NaCl，1mM PMSF，20mM咪唑，用NaOH调至pH8.0。
洗脱缓冲液：50mM NaH2PO4·2H2O，300mM NaCl，1mM PMSF，250mM咪唑，用NaOH调至pH8.0。
透析缓冲液：0.02M、pH4.6的HAC-NaAC缓冲液。
实施例四：野生酶和突变酶的最适pH测定
将上一步得到的纯酶液稀释至浓度为2.5mg/mL，然后分别进行酶促反应。酶促反应总体积为500μL，取490μL0.2M的不同pH(3.0～7.0)的缓冲液，其中含有0.01mM PLP、100mM L-谷氨酸钠，加入10μL酶液，在反应之前分别把缓冲液和酶液在40℃下预热5min，然后混匀，在40℃下反应30min，最后迅速煮沸终止反应，离心，用5%三氯乙酸（TCA）稀释5倍，在4℃冰箱沉淀蛋白3h左右，然后用HPLC检测。
得到的结果如附图4：相关的突变酶与野生酶相比，有效pH作用范围拓宽；因此能够更好的运用突变体酶，在pH5.5～6.5的条件下，催化GABA的生物合成。
实施例五：野生酶和突变酶体外的催化能力比较
为了测定突变体酶在偏中性条件下的生物催化能力，将纯化的野生型酶和突变体酶分别在pH6.5下催化L-谷氨酸钠发生脱羧反应2h，结果发现在pH6.5下，突变酶GadB1E91Q将L-谷氨酸转变成GABA的转化率为野生酶GadB1的5.7倍；突变酶GadB1E312S将L-谷氨酸转变成GABA的转化率为野生酶GadB1的3.6倍。

Claims (3)

1.一种谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于酶活性中心附近的酸性氨基酸谷氨酸突变为中性氨基酸；其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.4。
2.权利要求1所述突变体基因及其所编码的酶在生物合成GABA的应用。
3.一种生产权利要求1所述谷氨酸脱羧酶突变体的方法，其特征是将SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列以能表达该酶的质粒为表达载体，以能表达该酶的菌株为表达宿主，实现SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的突变体基因的高效表达。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108467860A (zh) * 2018-03-28 2018-08-31 江南大学 一种高产γ-氨基丁酸的方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105296456B (zh) * 2015-11-23 2018-08-07 江南大学 一种pH稳定性提高的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用
EP3562837A4 (en) 2016-12-30 2020-12-30 Cathay Biotech Inc. MODIFIED LYSIN DECARBOXYLASE ENZYMES
CN114752589B (zh) * 2022-06-16 2022-09-06 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 谷氨酸脱羧酶突变体及在生产γ-氨基丁酸中的应用
CN116478974B (zh) * 2023-03-23 2023-10-13 山东阳成生物科技有限公司 一种谷氨酸脱羧酶及其基因和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101914560A (zh) * 2010-09-01 2010-12-15 浙江大学 谷氨酸脱羧酶的变体基因及其用途
CN102911927A (zh) * 2012-11-02 2013-02-06 浙江大学宁波理工学院 一种谷氨酸脱羧酶及其编码基因和用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101914560A (zh) * 2010-09-01 2010-12-15 浙江大学 谷氨酸脱羧酶的变体基因及其用途
CN102911927A (zh) * 2012-11-02 2013-02-06 浙江大学宁波理工学院 一种谷氨酸脱羧酶及其编码基因和用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A point mutation in a Drosophila GABA receptor confers isecticide resistance;Richard H.F.,et al;《Nature》;19930603;第363卷;449-451 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108467860A (zh) * 2018-03-28 2018-08-31 江南大学 一种高产γ-氨基丁酸的方法

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