JPS63502002A

JPS63502002A - 無性の血中段階におけるプラズモジウム・ファルシパルムの抗原

Info

Publication number: JPS63502002A
Application number: JP62500456A
Authority: JP
Inventors: ケンプ，デビッド・ジェイムス; アンダース，ロビン・フレドリック; コッペル，ロス・レオン; ブラウン，グラハム・バレンシイ
Original assignee: ザ・ワルタ−・アンド・エリザ・ホ−ル・インスティテュ−ト・オヴ・メディカル・リサ−チ
Priority date: 1985-12-24
Filing date: 1986-12-18
Publication date: 1988-08-11
Also published as: PT84018B; PT84018A; US5116755A; EP0252098A1; GR862941B; KR880700812A; DK441287A; DK441287D0; EP0252098A4; ZA869671B; ZW25286A1; IL81026A0; ES2006730A6; WO1987003882A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】無性の血中段階におけるプラズモジウム・ファルシパルムの抗原本発明ハ、プラズモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｓｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　Ｓ　熱帯熱マラリア原虫）感染に対する防御免疫を付与するのに好適な抗原性を有する合成ペプチド詔よび合成ポリペプチド、並びに、その製造方法に関するものである。

ヒト・マラリア原虫プラズモジウム・ファルシパルムは、ヒトにおける免疫応答を引き起こす様々なポリペプチドをコードしでいる。近年１分子クローニング技術によって、この複雑な混合物中に存在している個々のポリペプチド抗原の分析が容易になった（１）。ヒト抗体を用いて、クローンされた配列を発現する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）　コロニーをスゲリーニングす、ることにより、これらの抗原をコードしでいる多数のｃＤＮＡ　クローンが単離された。これらのクローンの生産およびスクリーニングは、国際特許出願Ｎｏ、ＰＣＴ／ＡＵ８４１０００１６　の明細書に詳細に記載されでいる。

本発明は、さらに、無性の、血中段階にあるＰ、ファルシパルムの抗原を同定し、特性化することに基づいてなされたものである。

本発明は、後に詳細に述べる、Ｐ、ファルシパルム抗原の１つをコードしている塩基配列の全て、または一部と実質上対応しているヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供するものである。更に詳しくは、本発明は、添付図面に示されている塩基配列の全てまたは一部を、少くともその一部として含有していることを特徴とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供するものである。その様なヌクレオチド配列は、少くともその一部としで、本明細書記載のＰ、ファルシパルム抗原のアミノ酸配列の一部と対応する部分を含んだポリペプチドをコードしている。

本発明はまた１本明細書記載のＰ、ファルシパルム抗原の全体または一部の抗原性を表わす合成ペプチドあるいは合成ポリペプチド、並びに、哺乳類においで、その様な抗原ｌこ対する免疫応答を刺激するための組成物であって、抗原全体または一部の抗原性を表わす少くとも１種の合成ポリペプチドと、薬学的に許容し得る担体とを含有する組成物を提供するものである。本発明のかかる合成ペプチドまたは合成ポリペプチドは。

広範囲にわたって上に述べたヌクレオチド配列を含有しでいる、発現コントロール配列と機能的に結合している組換えＤＮＡ分子、あるいはその様な組換えＤＮＡ分子を含有している組換えＤＮＡクローニングビヒグル、またはベグターを含む宿主細胞内で発現させることにより調製される。この様にしで発現した合成ペプチドまたは合成ポリペプチドは、抗原の全てまたは一部の抗原性を表わす部分と１組換えＤＮＡ分子のＤＮＡによってコードされている付加的なポリペプチドからなる融合ポリペプチドであっても良い。別法として、この合成ペプチドまたはポリペプチドは、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉ　ｆｉｅｌｄ　）固相合成法等の周知の化学的５手段により、製造することもできる。

ヒトにおけるこの重篤な原生虫感染症の病因および死因は、赤血球内の無性のＰ、ファルシパルム寄生虫にある。無性寄生虫の増殖は、成熟シゾントの破壊により、新らしい赤血球に侵入するメロゾイトが放出された時点で起きる。侵入は、メロゾイトが赤血球に接し、メ、ロゾイトの尖端が赤血球の膜に接触するように再配向すると開始される。ロブトリーと称される一対の尖端細胞器官（オルガネラ）の容積が赤血球膜の摂動に先立つで減少し、次いで、メロゾイトが侵入する。

ロブトリータンパク質は、いくつかの系Ｅこおいて、潜在的な防御免疫原であることが示されている（２．３）。Ｐ、ファルシパルムの、Ｍｒ　１０５．　ＯＯＯのロブトリータンパク質部分をコードしているｃＤＮＡ　クローンが同定され、特性化された。この分子量のロブトリータンパク質は、広範囲に及ぶ、異なった地方から採取された幾つかのＰ、ファルシパルム単離体中に存在こレマでに単離された幾つかの、Ｐ、ファルシパルム抗原を発現するｃ　ＤＮＡ　クローンは、直列（タンデム）に反復されるペプチドの領域を含有しでいる。既に、これらの反復領域は、しばしば高い抗原性を有し、また、自然感染においで認められる１分子内での免疫優勢領域であることが分つでいる。Ｍｒ１０７，０００　のレプトリータンパグ質を発現するクローンＡｇ４４　の部分は、天然の抗原決定基が非反復性配列によってコードされていることを示す一つの例である。この分子の他の部分に反復領域が含まれているか否かは知られでいない。このクローンを同定することで、該ロブトリータンバグ質の機能、並びに、その防御免疫原としての能力を試験することを可能ならしめる、ロブトリータンバグ質に対する単一特異的試薬を調製することができる。

本発明の詳細は、以下の記載、並びに添付の図面により、さらに明らかとなるであろう。図中：第１図は、Ａｇ４４　に対するヒト抗体と反応させた、無性血中段階のＰ、ファルシパルム、ＦＣ２７単離体の間接免疫螢光法を示す図である。

第１図Ａのフルオレスセイン染色によると、トロホゾイト（Ｔ）および初期シゾン）　（Ｓ）の場合、核上に排除された弱い螢光がみられる：Ｂのフルオレスセイン染色には、優勢な小斑点状の螢光パターンを有する成熟シゾント（左）と、斑点状および格子状の両壁光パターンを示す多重感染赤血球がみられる；Ｃのフルオレスセイン染色には、細胞外メロゾイトに伴なった、斑点状の螢光がみられる。単一のメロゾイト内に、一対の螢光染色のスポットが生じている（矢印）。

差込図は、観察された範囲に隣接した部分の成熟シゾントを示す図である。

第２図は、Ａｇ４４　に対するヒト抗体と反応させたＰ、ファルシパルムのＦＣ２７単離体のシゾントのプロティンＡ金法による免疫電子顕微鏡像を示すものである。抗体と反応する、西洋なし形の、ロブトリー含有抗原が矢印で示されでいる（倍率Ｘ７９，０００）。

第３図は、クローンＡｇ４４　の融合タンパク質上でアフイニテイ精製されたヒト抗体を用いて得たイムノプロットを示すものである。第３図へは、ＦＣ２７の様々なライフサイクル（生活環）段階に対応する寄生虫抗原であって、非感染細胞（１）リング（環状体）（２）％　トロホゾイト（３）％シゾント（４）およびメロゾイト（５）の同定を示す図である。第３図Ｂは。

非同調培養によって増殖させた％　Ｐ、ファルシパルムの４種類の異なる単離体、ＮＦ７（１）、Ｋｌ（２）、ＦＣ２７（３）およびＶｌ（４）　中の、対応する寄生虫抗原の同定に関するものである。

第４図はＡｇ４４　のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。挿入体の５′末端の最初の２塩基はＰ、ファルシパルムから導かれ、これによって該配列はβ−ガラクトシダーゼと同一フレームに入ることになるが、Ｐ、ファルシパルム配列中に対応する／）イブリッドコドンが見出されないので、これは翻訳されない。

第５図はＡｇ４４　ｃＤＮＡとＰ、ファルシパルムＤＮＡの制限フラグメントとのハイブリダイゼーションを示す図である。Ｆｅ１２（１）、Ｋｌ　（２）およびＮＦ７（３）単離体に由来するＤＮＡをＥｃｏＲＩ　（Ａ）およびＨｉｎｄＩ［Ｉ（Ｂ）で消化して１％アガロースゲル電気泳動にかけて分画し、ニトロセルロース上にブロッティングし、３２Ｐ−Ａｇ４４　ｃＤ″ＮＡとハイブリダイズさせ、オートラジオグラフィーにかけた。

原料および方法（後の記載を参照）結果ロブトリータンバグ質をコードしでいるｃ　ＤＮＡ　の同定Ｐ、ファルシパルムのパプアニューギニア単離体。

ＦＣＱ２７／ＰＮＧ（Ｆｅ１２）　単離体から記載の如くにしでｃ　ＤＮＡ　を調製し、発現ベクターλｇｔ　１１−　Ａｍｐ３に挿入した（１）。ＦＣ２７単離体に対しでアフイニテ列を発現する多数のクローンをスクリーニングし、７８個の抗原陽性クローンを同定した（４）。　その様なりローンの１つであるＡｇ４４は、以下に示すように、ロブトリータンバグ質の一部をコードしていることが分った。λＡｇ４４　に溶原性の大腸菌を液体培地で増殖させ、熱誘導し、溶解してＣＮＢｒ活性化セファロースと結合（カップリング）させた。この吸着剤により％　Ａｇ４４融合ポリペプチドに特異的なヒト抗体をアフィニティー精製し、それを免疫螢光法およびイムノプロットアッセイによる。Ａｇ４４　に対応するＰ。

ファルシパルムタンパク質の同定に用いた。

ＦＣ２７単離体の非同調培養物をスライドガラスに固定し、直接螢光法で調べた。抗Ａｇ４４　と反応性のタンバグ質は成熟シゾント、メロゾイト内の一対のオルガホラ中に存在し、ロブトリータンバグ質に特徴的なパターンを示、した（第１ａ図）。リング形のものとの反応性は僅かであった。数個の異るＰ、ファルシパルム単離体、タイ起源のに１％　ガーナ起源のＮＦ７、およびベトナム起源のｖｌは、全て同様の螢光パターンを示した。

免疫電子顕微鏡により、抗Ａｇ４４によって認識される抗原であるロブトリーの所在を調べた。シゾントの切片を、最初、アフィニティー精製したヒト抗Ａｇ４４抗体１次いで、プロティンＡ−金とインキュベートすると、洋ナシ形のオルガネラが強く標識された（第２図）。

同調化Ｐ、ファルシパルム感染細胞リすイトのイムノプロット分析により、抗− Ａｇ４４抗体によって認識される３つの間隔の密接した％Ｍｒ　１０７，０００　。

ｉ　ｏ　ｓ、　ｏ　ｏ　ｏおよび１０３．　ＯＯＯのバンドが示された（第３ａ図）。未成熟な形のものでは、さらに高分子量の関係を示すのかもしれない。幾つか゛の異るＰ、ファルシパルム単離体を抗Ａｇ−４４抗体でプローブすると、同様の、バンド類が認められた（第３ｂ図）。

、Ａｇ４４　を発現するファージからＤＮＡを精製した。

挿入体は唯１個存在しており、これをｐＵＣベクター（！：Ｍ１３ベクターにサブクローニングした。４９４ｂｐのＲ１フラグメントのヌクレオチド配列をジデオキシ法で決定した（第４図）。ヌクレオチド４０４まで伸長し、β−ガラクトシダーゼと同一フレーム内にあり。

λＡｇ４４　によって生成された大きい融合ポリペプチドとみなされる長いオープン・リーディング・フレームが存在しでいた（４）。推定のアミノ酸配列を示した（第４図）。他のＰ、ファルシパルム抗原類に共通ンは、暗号領域の３′末端であると考えられる。このことは、ＤＮＡ配列の３′末端の一番端に、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テイルに対応するデオキシアデノシン塩基類が存在することと一致している。この場合、この配列は１分子全体の約１６％をコードしでいると推測される。

Ａｇ　４４のゲノムの関係３種類のＰ、ファルシパルム単ｆｉ体、ＦＣ２７，ＫｌおよびＮＦ７をＥｃｏＲＩまたはＡｈａＩ［で開裂し、サイズ分画し、ニトロセルロースにブロッティングした。

Ａｇ４４の、精製した５７０ｂｐ、Ｒ１フラグメントをニックトランスレートし、ニトロセルロースフィルターにハイブリダイズさせた。全ての単離体が、ＥｃｏＲ工消化物の場合、１８００ｂｐに、Ｈ４ｎｄ　Ｎ消化物の場合、５０００　ｂｐに共通のバンドを示した（第５図）。

（ｎ）ｐ、ファルシパルムの酸塩基反復抗原（ＡＢＲＡ）シゾントに優勢なＭｒ１０２，０００抗原を同定し、特性化した。この抗原を部分的にコードしている４個のｃＤＮＡクローンの配列決定研究によって親水性のジペプチドとトリペプチドの反復ブロックが判明したので、この抗原を酸塩基反復抗原（ＡＢＲＡ）と命名した。

この抗原の単離および特性化に関する詳細は、以後の記載、並びに添付図面から明らかになるであろう。

図中：第６図は、Ａｇ１９６に対するヒト抗体と反応させた、無性血中段階のＰ、ファルシパルムを間接免疫螢光法にかけて得たものである。単離体Ｖｌ　（パネルＡ、Ｂ）および単離体ＦＣ２７（パネルＣ，Ｄ）をフルオレスセイン（Ａ、Ｃ）およびプロピジウム（Ｂ　、　Ｄ　）　Ｒ：よる螢光法にかけた単一の視野においで、赤血球中にトロホゾイト（Ｔ）およびシゾント（Ｓ）が含有されでいることが分る。

第７図は、クローンＡｇ１９６　の融合タンパク質上でアフィニティー精製したヒト抗体を用いで得たイムノプロットを示すものである。Ａ、非同調培養法で増殖させた４種類の異る単離体中のＡＢＲＡの同定：（１）は非感染細胞、（２）はＮＦ７、（３）はに１、（４）はＦｅ１２、そして（５）はＶｌである。Ｂ、様々なライフサイグル段階にあるＦｅ１２中のＡＢＲＡの検出：（１）は非感染細胞、（２）はリング％（３）はトロホゾイト、（４）はシゾント、そして（５）はメロゾイトである。Ｃ，（Ｂ）と同様のライフサイグル段階のものの、トリトンｘ−ｉｏｏ抽出（１〜′５列）を示す。トリトン不溶性ペレットをＮａＤｏ　ｄｓＯ４に再溶解した：（６）は非感染細胞、（７）はリング、（８）はトロホゾイト、（９）はシゾント、そしで０■はメロゾイトである。分子量マーカーはミオシン（２００ｋＤ）、β−ガラクトシダーゼ（１１６ｋＤ）、ホスホリラーゼＤ（９２ｋＤ）、ウシ血清アルブミン（６６ｋＤ）およびオパルブミン（４５ｋＤ　）である。

第８図はＡｇ１８９　のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示すものである。Ａｇ１４４、Ａｇ１９６およびＡｇ１２６　の開始位置を、Ａｇ１８９　と関連させ、矢印と隣接するクローン番号によって示した。

第９図は、Ａｇ１２６　ｃＤＮＡ　とＰ、ファルシパルムＤＮＡの制限フラグメントとのハイブリダイゼーションを示すものである。図示した３種類のＰ、ファルシパルム単離体から得たＤＮＡをＥｃｏＲＩ（１）およびＡｈａｆｆｉ（２）　で消化し、ＩＸアガロースゲル電気泳動にかけで分画し、ニトロセルロース上にブロッテイングし、　Ｐ−Ａｇ　１２６　ｃＤＮＡ　とハイブリダイズさせ、オートラジオグラフした。Ｐ、ファルシパルム単離体は、パプアニューギニア起源のＦｅ１２．　ガーナ起源のＮＦ７％およびタイ起源のに１である。

原料および方法（後の記載参照）結果。

アセトンで固定した、無性血中段階の寄生虫に対する間接免疫螢光法を、Ａｇ　１９６　の免疫吸着物質上でアフィニティー精製したヒト抗体を用いて行った。

抗体は、シゾント含有赤血球と強く反応し、優勢な格子状の螢光を与えたが、これは、単離体Ｖ１においで最もよく解像されでいた（第６Ａ図）。発展中のメロゾイトの核の対比染色は、フルオレスセイン染色が排斥された領域で起った（第６Ｂ図）。リング段階およびトロホゾイト段階のｖｌは、殆んど反応しなかった。

より強い螢光が、Ｆｅ２７単離体と特定の抗体希釈液に、認められた。染色はここでも、シゾント含有赤血球で優勢に起きたが、トロホゾイトにおいで、Ｖｌの場合より拡散した染色がみられた（第６Ｃ図）。非固定化細胞、あるいは、軽度にグルタルアルデヒドで固定化し、風乾した単一層を用いて分析した場合には、感染した赤血球の表面に螢光を認めなかった（５）。血清学上同族のクローン類、Ａｇ　１９６、Ａｇ１８９．Ａｇ１２６およびＡｇ２Ｏ３に対するマウス抗血清を用いでも。

Ｆｅ１２においでは同様の結果が得られた。

非同調性の寄生虫製品のイムノプロット法において。

アフィニティー精製された、クローンＡｇ１９６に対するヒト抗体により％３つの単離体ＮＦ７．ＦＣ２７およびＶｌの間で変らないＭｒ１０２，０００の優勢なバンドが検出された（第７Ａ図）。タイ起源の単離体に１において対応するタンパク質は、分子量が２．０００　程度小さかった（第７Ａ図）。

ライフサイクル段階のイムノプロットでは（第７Ｂ図）優勢ｑ　Ｍｒ　１０２．　ＯＯＯ’バンドがシゾントに存在しており、これは、他の段階では貧弱なものであるか、あるいは存在していなかった。シゾント製品にはＭｒ２３０．０００の弱いバンドも存在していた（第７Ｂ図）。

感染した赤血球のトリトンＸ抽出物から標的抗原が回収されたが、ペレットをＮａＤｏｄＳＯ４試料バツファ−に再溶解した場合、抗−Ａｇ１９６抗体によって他の物質は検出されなかった（第７Ｃ図）。

Ａｇ１９６　ファミリーの４種から、ｃＤＮＡ　挿入体を単離した。Ａｇ１８９　の挿入体をベクターＭ１３ｍｐ８にサブクローニングし、ジデオキシ法でそのヌクレオチド配列を決定した。Ａｇ１８９は、全ｃＤＮＡ　に伸びる単一のオープンリーディングフレームを持つ９６５・ｂｐ　の挿入体を含有している。このフレームを第８図に示す。他のフレーム類は全て、複数個の終止コドンによって妨害されでいた。Ａｇ１８９はβ−ガラクトシダーゼと同一のフレーム内になく、大きい融合ポリペプチドを産生じない。同じ発現ライブラリィに由来する多数の他のクローンは、β−ガラクトシダーゼの相の外部に存在しでいた（６）。

よびトリペプチドの反復１位から８３４位までのＡｇ１８９　の配列は主として親水性のアミノ酸をコードしでいる。第８３５位から始まる３′末端には、１０個のジペプチド反復（Ｇｌｕ−Ｌｙｓ　）　と６個の点在するトリペプチド反復（７１１、゛　′ Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ　）を含有する、電荷の高い領域が延びている。反復ブロックのいずれか一側はグルタミン酸と接しでいる。

６７８位から開始し、７１４位までの１２ヌクレオチドの３ブロツグは高度のホモロジイ（類似性）を示す。これらの「未解明」のドデカヌクレオチド反復は、アミノ酸レベルからみると僅かな程度の類似性を有するにすぎない。第１反復の３位と４位にみられるアスパラギンおよびインロイシンは第３反復の同一位置にも認められ、第２および第３の未解明の反復中、第１および第２位にグルタミンの反復がみられる。

Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ　 −・Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、のアミノ酸配列からなるドデカペプチドを合成し、このペプチドへの％ＰＮＧ起源のマラリア血清中の抗体の結合を、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって試験した。ＲＩＡにおいで、マラリア血清は何らのシグナルを与えなかった。このことは。

Ｐ、ファルシパルムの他の抗原においで決定された６個の他の反復配列に対応する合成ペプチドは全て陽性の結果を与えたので、驚くべき結果であった（７％８゜１５）。

配列決定における誤りを排除するためにＡｇ１８９の完全なヌクレオチド配列を再決定し、同一配列および同一リーディングフレームを得た。さらに、同じＰ。

ファルシパルムのセグメントをコードしでいる３つのクローンの挿入体、即ち、Ａｇ１２６、Ａｇ１４４およびＡ、ｇ１９６　の配列決定を行った。これら３グローンはいずれもβ−ｇａｌと同一フレーム内にあり、大きい融合ポリペプチドを産生じ、Ａｇ１８９と同じオープンリーディングフレームを示した。従って、リーディングフレームに関しては、確実である。３つのクローンの全てにおいて、Ａｇ１２６．１４４および１９６の配列は、ジペプチド反復およびトリペプチド配列のブロックを伴なった領域を有しでいる。しかしながら、４種のｃ　ＤＮＡ　クローン間には相違点も見出されでいる。

Ａｇ１８９　との関係でいうと、Ａｇ１４４　は３８７位から始まり、長さ５８１　ｂｐ　であって、９５０〜９５５位の６ｂｐを欠失しているが、ｃＤＮＡ　の３′末端にさらに２個のリジンをコードしている７個の付加的なＡを含有しでいる。Ａｇ１２６およびＡｇ１９６はそれぞれ長さが４５１　ｂｐ　および４５２　ｂｐであり、いずれも、Ａｇ１８９の４５８位から開始する。Ａｇ１２６　挿入体およびＡｇ１９６挿入体は、第８図に示す配列中の、９０１位から９５５位に至る欠失を含有している。これらの欠失ば、Ｍ１３へのクローニングの際の人為的なものと考えられる。Ｍ１３内でのｃ　ＤＮＡ挿入体の維持における同様の問題は、他のマラリア抗原に関しでも認められたαり。

Ａｇ１２６およびＡｇ１９６　の両者の配列は、Ａｇ１８９およびＡｇ１４４と、２個のヌクレオチドが異っている。

Ａｇ１２６およびＡｇ１９６　は、４６１位（Ａｇ　１８９に関して）に、ｒＡＪの代りにｒＴＪを含有しており、チロシンがフェニルアラニンで置換され、８６位の「Ｃ」の代りにｒＴＪを含有しでいるが、これはアミノ酸レベルに何ら影響を及ぼすものでない。Ａｇ１２６および１９６は３′　末端に、それぞれ、３および４個の付加的なＡを含有しでおり、これは、それぞれ、ｌおよび２個のリジンをコードしている。

ＡＢＲＡのゲノム組織ＡＢＲＡのゲノム組織を研究するためにＡｇ１２６の挿入体をサザーン・プロット実験に用いた。地理上の３箇所から得たＰ、ファルシパルム単離体、ホモロ− ガスな株である、パプアニューギニア起源のＦｅ１２、ガーナ起源のＮＦ７およびタイ起源のに１をＥｃｏＲＩおよびＡｈａｆｆ　で制限酵素切断し、１％アガロースゲルでサイズ分画し、ニトロセルロース上にブロッティングし、ざらに、Ｐ　で標識したＡｇ１２６　の挿入体によってプローブした。第９図から分るように、それぞれの単離体の研究において、挿入体は単一の６．４ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントおよび１ｋｂＡｈａＩ［フラグメントとハイブリダイズした。また、パプアニューギニア起源の３つの単離体（ＩＭＲ１４３，１ＭＲ１４４およびＭＡＤ７１）のＤＮＡをＡｇ１４４　の５８１ｂｐ挿入体でプローブし、これら単離体中に同一サイズのフラヘグメントの存在することが分った（データーは示されＰ、ファルシパルムの他の数抗原、これらは天然のヒトにおける抗原である（従って、ワクチンの潜在的な候補である）、をλＡｍｐ　３　ベクターを用いて大腸菌内でクローニングしたｃ　ＤＮＡ　配列から発現されたＰ、ファルシパルム抗原に対して惹起させた抗体、あるいはそれによってアフィニティー精製した抗体を用いて同定した。クローン類、並びに対応する寄生虫抗原の見掛けの分子量および段階特異性（免疫螢光顕微鏡で決定）を表１に示す。

第１０図はクローンＡｇ１６９のヌクレオチド配列である。

第１１図はクローンＡｇ３０３のヌクレオチド配列である。

第１２図はクローンＡｇ３５８　のヌクレオチド配列である。

第１３図はクローンＡｇ３６１のヌクレオチド配列第１５図はクローンＡｇ３９４のヌクレオチド配列である。

第１５図は、細菌Ｔ（トロホゾイト、反応は最少）、Ｓ（シゾン））、Ｇ（ガメトサイト、生殖母細胞、反応を認めず）中でＡｇ５０１によって産生された抗原に対して惹起された抗体と反応させた、アセトン−メタノール固定化、血液段階Ｐ、ファルシパルムに関スル間接免疫螢光法の結果を示すものである。

表１対応スるＰ、ファルシパルム抗原Ａｇ１６９　Ｎ、Ａ、　Ｎ、Ａ。

Ａｇ３０３（Ａｇ３０３（Ａ　１２５，０００−１３０，０００　シゾント類Ａｇ３５８　優勢なバンドは、　全段階２１０．０００　；　１９０，０００および１４０，０００Ａｇ３６１　７０．０００　成熟段階Ａｇ３７２　１９５，０００：１４０，０００　成熟段階およびｇｏ、ｏｏ。

Ａｇ３９４　１４０，０００淵昧　ロブトリーの所在をも含む全段階Ａｇ５０１　〜１３０，０００　成熟段階？’ＬＡ、得ることができない。

米見掛けの分子量（Ｍｒ）は、ＥＣ２７Ｐ、ファルシパルム単離体由来の抗原を用い、７．５％ゲルからウェスタン・プロッティングを行うことにより測定された。

ある場合には、別の単離体内で、また、他のゲル条件を用いることで、Ｍｒはかなり変動し得る。またある場合Ｉこは、おそらく、分解産物または交差反応を反映する、移しい数の弱いバンドがみられる。

米’Ａｇ３０３およびＡｇ３３１は１つの暗号配列のフラグメントに対応しでいることが分った。

米米米　Ａｇ２３．そして１０５．０００および１０２．　ＯＯＯの両バンドとの交差反応も認められた。

原料および方法寄生虫Ｐ、ファルシパルム単離体ＥＣＱ２７／ＰＮＧ（Ｆｅ１２）、ＩＭＲ１４３，１ＭＲ１４４およびＭＡＤ７１　はパプアニューギニアの医学研究所（Ｐａｐｕａ　Ｎｅｗ　ＧｕｉｎｅａＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　から入手した。

ガーナ起源のＮＦ７、およびタイ起源のに１はウオリカー氏ＣＤ、　ｗａｌｌｉｋｅｒ　）　（ニシンバラ大学）から提供された。ベトナム起源のＶｌは、ミラー氏（Ｌ。

Ｍｉｌｌｅｒ）（アメリカ予防衛生研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　）、ベセスダ、ＵＳＡ）から提供された。寄生虫は、ドラッガー（Ｔｒａｇｅｒ　）　およびジエンセン（Ｊｅｎｓｅｎ　）　（９）　の方法に従い、０群ヒト赤血球中、インビトロの非同調培養中に保持した。段階特異的なライフサイクル形を得るために、寄生虫を、ンルビトールａ■を用いて、６時間以内に成熟拡散させ。

２回同調培養して無性のサイクルの様々な時点で収穫した。自然に放出されたメロゾイトを、既述の如くにしで得たαυ。

血清血清は、パプア・ニューギニア、マダン（Ｍａｄａｎｇ　）の住民の同意の下に入手した。一般的な調査過程では、急性マラリア症状を示しで′いる人が残火かいる外は、無症候性の寄生虫血症であることが分った。寄生虫血症患者を、クロロキンで治療し、１〜２週間後に回復期の血清を採取した。子供から試料を採取する場合には、事前に親の承諾を得た。どの場合にも、血清を分離し、１２力月までは一２０℃で保存し、次いで、−７０℃で保存した。幾つかの部分集合ｌごついて牌腫の存在または非存在を証明し、全ての症例につき、濃厚な血液塗抹標本により寄生虫血症を評価した。

Ｐ、ファルシパルム抗原を発現するクローンＰ、ファルシパルムｃＤＭＡ　発現ライブラリーを組立て、ざらに、抗体スゲリーニングによりクローンを単離する方法は公開されている（１）。抗原陽性クローンのレプリカを３０℃で一夜増殖させ、３８℃で誘導し。

記載の如くにして系中で溶解させたθつ。個々のヒト血清を予備処理して抗大腸菌活性を除去し、３％ウシ血清アルブミン／トリス食塩水、ｐＨ９，６アルブミン中、最終希釈率１　：　５００でコロニーと反応させた後、コロニーを、スタフィロコッカス・アウレウス由来の１２５ニブロチインＡと反応させ、記載０２）の如くにしてオートラジオグラフした。

ハイブリダイゼーション実験挿入体を含有するＤＮＡをＣｓＣ／遠心し、　ＥｃｏＲＩ消化の後、ＤＮＡポリメラーゼエのブレノウフラグメントにより３２Ｐ−ｄ　ＡＴＰで末端を標識し、さらに１％低融点アガロースゲルでサイズ分画することで精製した。標識した挿入体を回収し、抗原陽性クローンのかたまりとハイブリダイズさせた。いくつかの例では。

まず、挿入体をゲル電気泳動によって精製したプラスミドｐＵＣ−９（１３）にサブクローニングし、次いで、ニラブトランスレートした。この方法でサブクローニングした挿入体を用いてサザーン・プロット実験を行った。サザーン・プロット法のために、寄生虫ＤＮＡ２μｇを、製造業者の指示に従ってエンドヌグレアーゼで制限消化し、１％アガロースゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロースフィルターにブロッティングし、これを次に、１１０６ｃｐ／ｍＱ　の様々なプローブとハイブリダイズさせた。

ヌグレオチド配列の決定配列決定には、ジデオキシ鎖ターミネーション法［１４）を用いた。様々な抗原発現クローンの挿入体および適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化によって生成したフラグメントをＭ１３ｍｐ８　および／またはＭ１３ｍｐ０３にクローニングした。

クローンされたマラリア抗原に対するヒト抗体のアフィニティー精製誘導された抗原陽性クローンの培養物５０ｍＱを既述の如くにして調製した口９゜ペレット化した細菌を音波処理し、可溶性タンパク質をＣＮＢ　ｒ　−活性化セファロース（ファルマシア、スエーデン）とコンジュゲートさせた。既述の如くにして、固定化抗原上で、ヒト血漿プールから抗体をアフィニティー精製した［１５１゜間接免疫螢光法Ｐ、ファルシパルムの非同調培養から得た、寄生虫感染赤血球の薄い血液塗抹標本を、９０Ｘアセトン／１０％メタノール中で固定し、アフィニティー精製したヒト抗体と反応させた。抗原陽性クローンの細菌リゼイトで免疫したマウスの血清をも検査した０６１０第二抗体として、フルオレスセインとコンジュゲートしたヒツジの抗−ヒトＩｇまたはヒツジの抗−マウスＩｇ抗血清を用いた。寄生虫の核をヨウ化プロピジウムで対比染色し、スライドに、ｐ−フェニレンジアミンを含んだ９０％グリセロール／１０％ＰＢＳをマウントし、ＵＶ照射下で観察した。

寄生虫感染赤血球をグルタルアルデヒドで固定し切片化した後、Ｌ、Ｒ，ホワイト樹脂で封埋し、公開された方法に従って、適当に希釈した抗体およびプロティンへ−金と一諸ｆこインキュベートしたαＤ０イムノブロツテイングメロゾイトおよび段階特異的または非同調性の寄生虫を含んだ感染赤血球を３％ＳＤＳ、６２．５ｍＭ）　’ＪスーＨＣ／、β−メルカプトエタノール、ｐＨ６，８を含んだ試料バッファーで希釈し、１００℃で２分間加熱した。１２，０００ｇ　で１０分間遠心した後、タンバグ質抽出物を７，５Ｘまたは１０％ボリアグリルアミド／ＳＤＳゲルで分画し、電気泳動的にニトロセルロース上Ｅこ移した。フィルターを、りん酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ　）　ｐＨ７，４中５％脱脂粉乳でブロックした後、アフィニティー精製したヒト抗体と反応させた。次いで、これらを　ニー標識プロティンＡ中でインキュベートした後、オートラジオグラフした。

別の実験では、寄生虫感染細胞とメロゾイトとをまず％０．５％トリトンＸ−１００，５ｍＭＰＭＳＦ。

１ｍＭＴＰＣＫ、２．５ｍＭＥＤＴＡおよび２ｍＭヨードーア七トアトアミンん６だＰＢＳ中、室温で３０分間インキュベートし、１２，０００ｇで１０分間遠心した。次いで、上清およびペレットをそれぞれ、試料バッファーで等量の最終容量に希釈し、上記の如くに処理した。

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ヴイルツ、ホッグマイヤー、サンダース、レディ、マロイ、ハイネス、シナイブ −、ロパーツ、ジッグス、およびミ’５−　（Ｄａｍｅ、　Ｊ、Ｂ、、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｊ、　Ｌ、　＋ＭｃＣｕｔｃｔｃｈａｎ＊　Ｔ、　Ｆ、、　ｗｅｂｅｒ、　Ｌｔ、、１　ｗｉｒｔｚ、　Ｒ，Ａ、。

Ｈｏｃｋｍｅｙｅｒ、　Ｗ、Ｔ、、　５ａｎｄｅｒｓ、　Ｇ、Ｓ、、　Ｒｅｄｄｙ、　Ｅ、Ｐ、。

Ｍａｌｏｙ、　Ｗ、Ｌ、、　Ｈａｙｎｅｓ、　Ｊ、Ｄ−ｔ　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ、　ＩｚＲｏｂｅｒｔｓ、　Ｄ、Ｉ　Ｄｉｇｇｓ、　Ｃ，Ｌ、　ａｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｌ、Ｈ，）（１９８４）サイエンス　２２５，５９３−５９９゜７、　コペル、カラマン、リンゲルバラ／へ、フラウン、セイント、サンダ、およびアンダース（Ｃｏｐｐｅｌ。

Ｒ，’Ｌ、、　Ｃｏｗｍａｎ、　Ａ、Ｆ、、　Ｌｉｎｇｅｌｂａｃｈ、　Ｋ、Ｒ，、Ｂｒｏｗｎ＋Ｇ、Ｖ−＊　５ａｉｎｔ、　Ｒ，Ｂ、−Ｋｅｍｐ、　Ｄ、Ｊ、　ａｎｄ　Ａｎｄ、ｅｒｓ。

Ｒ，Ｆ、）（１９８３）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　（ロンドン）３０６　、７５１−７５６゜８、　コペル、カウマン、アンダース、ビアンコ、セイント、リンゲルバッハ、サンダおよびブラウン（ＣｏｐｐｅＬ　Ｒ，Ｌ、ｅ　Ｃｏｗｍａｎ＋　Ａ、Ｆ、、Ａｎｄｅｒｓ、Ｒ，Ｆ、。

Ｂｉａｎｃｏ＋　Ａ、Ｅ、、５ａｉｎｔ、Ｒ，Ｂ、、Ｌｉｎｇｅｌｂａｃｈ、に、Ｒ，。

−（ロンドン）（印刷中）。

９、ドラッガーおよびジエンセン（Ｔｒａｇｅｒ、ｗ、　ａｎｄＪｅｎｓｅｎ＋　Ｊ−Ｂ−）　（１９７６）　サイエンス１９３゜６７３−６７６゜１０、ランプロスおよびヴアンデルバーグ（Ｌａｍｂｒｏｓ。

Ｃ，ａｎｄ　Ｖａｎｄ、、ｅｒｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｐ、　）　（１９７９）　ジャーナル１１、ブラウン１．カルベノール、クルユーサー、ビアンコ、コペル、セイント、スタール、ケンフオヨヒアンダース（Ｂｒｏｗｎ、　Ｇ、Ｖ、　、　Ｃｕ１ｖｅｎｏｒ、　Ｊ＋Ｇ、　。

Ｃｒｅｗｔｈｅｒ、　Ｐ、Ｅ、　＊　Ｂｉａｎｃｏ、　Ａ、Ｅ、、　Ｃｏｐｐｅｌ　＋　Ｒ，Ｌ−＋５ａｉｎｔ、　Ｒ，Ｂ、、　５ｔａｈｌ、　Ｈ−Ｄ、　Ｋｅｍｐ＋　Ｄ、Ｊ、　ａｎｄ　Ａｎｄｅｒｓ。

Ｒ，Ｆ、）　（１９８５）ジャーナル・オン・エキスペリメ１２、スタール、コペル、フラウン、セイント、リンゲルノくツバ、カラマン、アンダースおよびサンダ（５ｔａｈｌ。

Ｈ−Ｄ　、、　Ｃｏｐｐｅｌ、　Ｒ，Ｌ、　、　Ｂｒｏｗｎ、　Ｇ、Ｖ、ｓ　５ａｉｎｔ。

Ｒ，Ｂ、＊　Ｌｉｎｇｅｌｂａｃｈ、　Ｋ、ｓ’Ｃｏｗｍａｎ、Ａ、Ｆ、＋　Ａｎｄｅｒｓ。

Ｒ，Ｆ　ａｎｄ　Ｋｅｍｐ、　Ｄ−Ｊ−）　（１９８４）プロシーディンゲス・ナショナル・アカデイミイ・オン・サイエンス１３、メツシングおよびビエイラ（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　ａｎｄ１４、サンガー、ニツクレン、およびコールンン（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｒ，、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ＋　Ａ、　Ｒ，）（１９７７）　プロシーディンゲス・オン・ザ・ナショ１５、スタール、クリューサー、アンダース、ブラウン、コペル、ビアンコ、ミツチェルおよびサンガ（Ｓｔａｈｌ、　Ｈ−Ｄ　、、　Ｃｒｅｗｔｈｅｒ＋　Ｐ、　Ｅ、、　Ａｎｄｅｒｓ、　Ｒ，Ｆ、。

Ｂｒｏｗｎ、　Ｇ、ｖ、ｌ　Ｃｏｐｐｅｌ＋　Ｒ，Ｌ、、　Ｂｉａｎｃｏ＋　Ａ＋Ｅ、　＊Ｍｉｔｃｈｅ１１．　Ｆ、Ｇ、　ａｎｄ　Ｋｅｍｐ、　Ｄ、Ｊ、　）　（１９８５）プロシーディンゲス・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−、オン・サイエンスイズＵＳＡ　８２，５４３−５４７゜１６、コペル、ブラウン、ミツチェル、アンダースおよびサンガ（Ｃｏｐｐｅｌ、　Ｒ，ＬＩ　Ｂｒｏｗｎ、　Ｇ、Ｖ、　、　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ。

Ｇ、Ｆ、、Ａｎｄｅｒｓ、Ｒ，Ｆ、、ａｎｄ　Ｋｅｍｐ、Ｄ、Ｊ、）（１９８４）ＥＭＢＯＪ、３　、　４０３−４０７゜Ｆｔｃ、ＩＦｔｃ、２Ｆｔｃ、９Ｆｔｃ、１５゜ロヒ　０ヒ　０ヒ　ロ）−０２）；　貢Ｉ；！　２巳　只≦　父じ　ご　訃国際調査報告ｌｌＩＩＭ＠Ｉ−ｅ−＾−−−＋−−・　ＰＣＴ／ＡＵ　８６１００３８６ｂ＋、、１１．電−−−＋ａ−ｅ＋、ｃ、ｂ−−ｓ・ＰＣＴ／ＡＵ８６１０Ｑ３８６

Claims

【特許請求の範囲】

１．ロプトリー蛋白、酸塩基反復抗原（ＡＢＲＡ）、本明細書に示したクローンＡｇ１６９、Ａｇ３０３、Ａｇ３５８、Ａｇ３６１、Ａｇ３７２、Ａｇ３９４、またはＡｇ５０１いずれかの抗原、およびそれらと交差反応し得る他のプラズモジウム・フアルシパルムの抗原からなる群から選択されるプラズモジウム・フアルシパルムの抗原をコードしている塩基配列の全てまたは一部に実質的に対応するヌクレオチド配列を含有しているＤＮＡ分子。
２．該ヌクレオチド配列が、少なくともその一部に、実質上、第４図、第８図、または第１０図〜第１４図記載の塩基配列を含有していることを特徴とするものである第１項記載のＤＮＡ分子。
３．ロプトリー蛋白、酸塩基反復抗原（ＡＢＲＡ）、本明細書に示したグローンＡｇ１６９、Ａｇ３０３、Ａｇ３５８、Ａｇ３６１、Ａｇ３７２、Ａｇ３９４、またはＡｇ５０１いずれかの抗原、およびそれらと交差反応し得る他のプラズモジウム・フアルシパルム抗原からなる群から選択されるプラズモジウム・フアルシパルム抗原の抗原性を表わし得る少なくとも一つのポリペプチドとして発現され得るヌクレオチド配列を含有しているＤＮＡ分子。
４．発現コントロール配列と機能的に結合している第１項〜第３項のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含有している組換えＤＮＡ分子。
５．発現コントロール配列と機能的に結合している第１項〜第３項のいずれかに記載のヌクレオチド配列が挿入された組換えＤＮＡクローニングピヒクルまたはペグターであつて、少なくとも一個のプラスモジウムフアルシパルムのポリペプチドまたはタンパク質の全てまたは一部を発現し得るベクター。
６．該ヌクレオチド配列および該発現コントロール配列がバクテリオフアージに挿入されていることを特徴とする第５項記載の組換えＤＮＡクローニングビヒクルまたはベクター。
７．第４項記載の組換えＤＮＡ分子、または第５項記載の組換えＤＮＡクローニングピヒクルまたはベクターを含有している宿主細胞。
８．ロプトリー蛋白、酸塩基反復抗原（ＡＢＲＡ）、本明細書に示したクローンＡｇ１６９、Ａｇ３０３、Ａｇ３５８、Ａｇ３６１、Ａｇ３７２、Ａｇ３９４、またはＡｇ５０１いずれかの抗原、およびそれらと交差反応し得る他のプラスモジウム・フアルシパルム抗原からなる群から選択されるプラズモジウム・フアルシパルム抗原の全てまたは一部の抗原性を表わし得る合成ペプチドまたはポリペプチド。
９．ロプトリー蛋白、酸塩基反復抗原（ＡＢＲＡ）、本明細書に示したグローンＡｇ１６９、Ａｇ３０３、Ａｇ３５８、Ａｇ３６１、Ａｇ３７２、Ａｇ３９４、またはＡｇ５０１いずれかの抗原、およびそれらと交差反応し得る他のプラズモジウム・フアルシパルム抗原からなる群から選択されるプラズモジウム・フアルシパルム抗原の抗原性を表わし得るポリペプチド配列をＣ末端配列とし、それに、Ｎ末端配列として付加的なポリペプチド配列が融合してなる融合ポリペプチド。
１０．付加的なポリペプチドが組換えＤＮＡクローニングピヒクルまたはベクターのＤＮＡによつてコードされているポリペプチドである第９項記載の融合ポリペプチド。
１１．哺乳類においてプラズモジウム・フアルシパルム抗原に対する免疫応答を刺激するための組成物であつて、ロプトリー蛋白、酸塩基反復抗原（ＡＢＲＡ）、本明細書に示したクローンＡｇ１６９、Ａｇ３０３、Ａｇ３５８、Ａｇ３６１、Ａｇ３７２、Ａｇ３９４、またはＡｇ５０１いずれかの抗原、およびそれらと交差反応し得る他のプラスモジウム・フアルシパルム抗原からなる群から選択されるプラズモジウム・フアルシパルム抗原の抗原性を表わし得る少なくとも一個のポリペプチドを、薬学的に許容し得る担体と共に含有している組成物。
１２．哺乳類においてプラズモジウム・フアルシパルム抗原に対する免疫応答を刺激する方法であつて、第１１項記載の組生物を該哺乳類に投与することからなる方法。