JP4752054B2 - バベシア・ギブソニ(Babesiagibsoni)の分泌抗原1タンパク質及びこのタンパク質をコードするDNA、並びにそれらの利用 - Google Patents
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Description
Fukumoto, S., Xuan, X., Nishikawa, Y., Inoue, N., Igarashi, I., Nagasawa, H., Fujisaki, K., and Mikami, T.: Identification and expression of a 50-kilodalton surface antigen of Babesia gibsoni and evaluation of its diagnostic potential in an enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 39:2603-2609, 2001.
[1]
以下の(A)または(B)に示すバベシア・ギブソニ(Babesia gibsoni)の分泌抗原1(BgSA1)タンパク質のシグナルペプチド及び成熟タンパク質をコードするDNA。
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の1〜544番を有するタンパク質
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の1〜544番において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質
[2]
以下の(C)または(D)に示すバベシア・ギブソニ(Babesia gibsoni)の分泌抗原1(BgSA1)タンパク質の成熟タンパク質をコードするDNA。
(C)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の24〜544番を有するタンパク質
(D)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の24〜544番において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質
[3]
以下の(a)または(b)に示すバベシア・ギブソニ(Babesia gibsoni)の分泌抗原1(BgSA1)タンパク質のシグナルペプチド及び成熟タンパク質をコードするDNA。
(a)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の52〜1686番であるDNA
(b)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の52〜1686番からなる塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質をコードするDNA
[4]
以下の(c)または(d)に示すバベシア・ギブソニ(Babesia gibsoni)の分泌抗原1(BgSA1)タンパク質の成熟タンパク質をコードするDNA。
(c)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の121〜1686番であるDNA
(d)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の121〜1686番からなる塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質をコードするDNA
[5]
[1]〜[4]のいずれか1項に記載のDNA及びプラスミドDNAを含む組換え体DNA。
[6]
[1]〜[4]のいずれか1項に記載のDNAを含む組換えウイルス。
[7]
[5]に記載の組換え体DNAまたは[6]に記載の組換え体ウイルスを含む宿主。
[8]
宿主が細菌である[7]に記載の宿主。
[9]
以下の(A)または(B)に示す、シグナルペプチド及び成熟タンパク質を含むバベシア・ギブソニ(Babesia gibsoni)の分泌抗原1(BgSA1)タンパク質。
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の1〜544番を有するタンパク質
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の1〜544番において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質
[10]
以下の(C)または(D)に示す、成熟タンパク質であるバベシア・ギブソニ(Babesia gibsoni)の分泌抗原1(BgSA1)タンパク質。
(C)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の24〜544番を有するタンパク質
(D)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の24〜544番において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質
[11]
[9]に記載のBgSA1タンパク質のシグナルペプチド及び成熟タンパク質または[10]に記載のBgSA1タンパク質の成熟タンパク質とグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)リーダータンパク質とからなる融合タンパク質。
[12]
[9]に記載のBgSA1タンパク質のシグナルペプチド及び成熟タンパク質、[10]に記載のBgSA1タンパク質の成熟タンパク質、または[11]に記載の融合タンパク質を用いた犬の原虫感染症の診断方法。
[13]
[9]に記載のBgSA1タンパク質のシグナルペプチド及び成熟タンパク質、[10]に記載のBgSA1タンパク質の成熟タンパク質、または[11]に記載の融合タンパク質に対する抗血清あるいは抗体を用いる犬の原虫感染症の診断方法。
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の1〜544番を有するタンパク質
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の1〜544番において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質
(C)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の24〜544番を有するタンパク質
(D)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の24〜544番において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質
(a)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の52〜1686番であるDNA
(b)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の52〜1686番からなる塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質をコードするDNA
(c)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の121〜1686番であるDNA
(d)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の121〜1686番からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質をコードするDNA
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の1〜544番を有するタンパク質
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の1〜544番において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質
(C)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の24〜544番を有するタンパク質
(D)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の24〜544番において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質
なお、発明にあたっては、各種分子生物学、原虫学、免疫学及び生化学的な技術を用いた。これらの技術は、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harber Laboratory Press やその他の関連書を参考にした。DNA解析ソフトはMacVector(Oxford Molecular社)を使用した。
本発明におけるB. gibsoni BgSA1遺伝子の同定・クローニング・塩基配列解読を記載する。
B. gibsoni NRCPD株[Fukumoto et al., J Parasitol 84: 954-959 (2000)] 感染犬赤血球よりAcid Guanidinium-Phenol-Chloroform 法[Chomczynski et al., Anal Biochem 162: 156-159 (1987)]にてTotal RNAを抽出した。Total RNA よりmRNA Isolation Kit (Oligotex-dT30, Takara社) を用い、メーカーの推奨する方法に従いpoly A+ RNAを精製した。以下に述べるcDNA libraryの構築とイムノスクリーニング及びcDNAクローンのプラスミド化(in vivo Excision)はすべてStratagen社の試薬Kitを用い、当社の推奨する方法に従い実施した。約5 μg のB. gibsoni mRNAを鋳型とし、ZAP-cDNA Synthesis Kit を用いてcDNAを合成した。得られたcDNAをSepharose CL-2Bゲルカラムにてサイズ分画した後にUni-ZAP XR Vector armsに挿入し、GigapackIII Gold packaging extractにてパッケージングを行った。パッケージング産物をE. coli XL1-Blue MRF'株に感染させ、約50万個のcDNA クローンを含むlibraryを得た。B. gibsoni感染犬血清(虫体由来の分泌抗原を含有していると考えられる)を正常犬に頻回投与(2週間間隔で5回投与、投与量5ml/回)して得られた血清を用いて、cDNA libraryをイムノスクリーニングし、約数十個のオーバラップする陽性クローンを得た。これらの陽性クローンをin vivo Excision法にてプラスミド化(pBluescriptへ変換)した。cDNA断片を含むプラスミドをプラスミド精製キット(Qiagen社)にて精製した後に、Dye Primer Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer社)を用い、メーカーの推奨する方法に従いPCRを行った。ABI PRISM 377 DNA sequencer (Perkin Elmer社)を用いてPCR産物を解析しcDNA断片の塩基配列を決定した。その結果、これら全てのクローンが同一遺伝子由来であることが判明した。その中で長い断片を持つクローンを以後の解析に供した。cDNAの全長は1880bpであり、1635bpのOpen Reading Frame (ORF)を有していることが確認された(配列番号1)。推測されるタンパク質は544残基のアミノ酸からなり、推定分子量は62約kDaであった(配列番号2)。推測されるアミノ酸配列についてシグナルペプチド検索(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)を行ったところ、N末端の23残基のアミノ酸がシグナルペプチドであることが想定された。以下、この遺伝子をBgSA1遺伝子と称する。BgSA1遺伝子より予想されるアミノ酸配列をNational Center for Biotechnology InformationのBLAST法にて相同性検索を行ったところ、これまでに報告されている原虫及び他の生物種の何れの遺伝子とも有意な相同性を示さなかった。
B. gibsoni BgSA1タンパク質を大腸菌で発現させるための組換えベクタープラスミドの構築を記載する。
B. gibsoni BgSA1cDNA断片(23残基のシグナルペプチドを取り除いた配列)が挿入されているpBluescriptプラスミドを制限酵素EcoRIとXhoIで消化することによりBgSA1cDNA断片を切り出し、大腸菌発現用ベクターpGEX-4T-3(Amersham Biosciences社)のEcoRIとXhoIサイトに挿入した。プラスミド精製キット(Qiagen社)にて組換えプラスミドpGEX/ BgSA1を精製した。
大腸菌におけるB. gibsoni BgSA1タンパク質の作出及び作出したタンパク質の性状を記載する。
実施例2で得た組換えプラスミドにて大腸菌DH5α株を形質転換させた後、37℃でアンピシリンを含んだLB培地で培養し、培養液のOD600nmが0.3-0.5に達した時点でIPTGを最終濃度0.5 mMになるように添加し、さらに37℃で4時間培養を続けた。組換えタンパク質の発現は10%SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動[Laemmli et al., Nature 227: 680-685 (1970)]を実施した後、クマーシー染色で確認した。その結果、約85kDaの組換えタンパク質の発現が認められ、GST リーダータンパク質(26kDa)とB. gibsoni BgSA1タンパク質 (59kDa)の融合タンパク質であることが確認された(図1)。
本発明における大腸菌からの組換えBgSA1タンパク質の精製、及び精製した組換えタンパク質に対する抗体生成を記載する。
実施例3で記述した方法により大腸菌で発現させた組換えBgSA1タンパク質をAmersham Biosciences社の推奨する方法に従い精製した。精製後の組換えBgSA1融合タンパク質の電気泳動像を図1に示した。100 μg 組換えBgSA1融合タンパク質を含む溶液200μlとFreund's complete adjuvant(Difco社)200 μlを混合した後にBALB/cマウス(8週齢、雌)に腹腔内接種した。2週間後と4週間後にそれぞれ100μgの組換えBgSA1融合タンパク質をFreund's incomplete adjuvant(Difco社)と混合し、追加接種を行った。最終接種後2週目に採血し、血清を-20℃に保存した。
イムノブロット法によるネイティブ(天然型)BgSA1タンパク質の同定を記載する。
実施例4で得た抗組換えBgSA1融合タンパク質マウス血清を用い、イムノブロット法[Towbin et al., Proc Natl Acad Sci USA 76: 4350-4354 (1979)]にて天然型BgSA1タンパク質の同定を行った。図2に示すように、B. gibsoni感染赤血球ライセートにおいて59kDaの特異的バンドが検出された。天然型BgSA1タンパク質の分子量は推定理論値(59kDa)と同様であった。
本発明における組換えBgSA1タンパク質に対する免疫血清の反応性を記載する。
イムノブロット法を用いて組換えBgSA1タンパク質に対するB. gibsoni感染犬血清の反応性を検討した。図3に示すように、組換えBgSA1タンパク質はB. gibsoni感染犬血清と強く反応することが確認された。このことから、組換えBgSA1タンパク質は犬B. gibsoni感染症の診断とワクチン候補分子の一つであることが示された。なお、正常犬血清と組換えBgSA1タンパク質との反応は認められなかった。
Claims (13)
- 以下の(A)または(B)に示すバベシア・ギブソニ(Babesia gibsoni)の分泌抗原1(BgSA1)タンパク質のシグナルペプチド及び成熟タンパク質をコードするDNA。
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の1〜544番を有するタンパク質
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の1〜544番において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質 - 以下の(C)または(D)に示すバベシア・ギブソニ(Babesia gibsoni)の分泌抗原1(BgSA1)タンパク質の成熟タンパク質をコードするDNA。
(C)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の24〜544番を有するタンパク質
(D)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の24〜544番において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質 - 以下の(a)または(b)に示すバベシア・ギブソニ(Babesia gibsoni)の分泌抗原1(BgSA1)タンパク質のシグナルペプチド及び成熟タンパク質をコードするDNA。
(a)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の52〜1686番であるDNA
(b)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の52〜1686番からなる塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質をコードするDNA - 以下の(c)または(d)に示すバベシア・ギブソニ(Babesia gibsoni)の分泌抗原1(BgSA1)タンパク質の成熟タンパク質をコードするDNA。
(c)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の121〜1686番であるDNA
(d)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の121〜1686番からなる塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質をコードするDNA - 請求項1〜4のいずれか1項に記載のDNA及びプラスミドDNAを含む組換え体DNA。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のDNAを含む組換えウイルス。
- 請求項5に記載の組換え体DNAまたは請求項6に記載の組換え体ウイルスを含む宿主。
- 宿主が細菌である請求項7に記載の宿主。
- 以下の(A)または(B)に示す、シグナルペプチド及び成熟タンパク質を含むバベシア・ギブソニ(Babesia gibsoni)の分泌抗原1(BgSA1)タンパク質。
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の1〜544番を有するタンパク質
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の1〜544番において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質 - 以下の(C)または(D)に示す、成熟タンパク質であるバベシア・ギブソニ(Babesia gibsoni)の分泌抗原1(BgSA1)タンパク質。
(C)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の24〜544番を有するタンパク質
(D)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列の24〜544番において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、抗BgSA1タンパク質抗体と反応しうるタンパク質 - 請求項9に記載のBgSA1タンパク質のシグナルペプチド及び成熟タンパク質または請求項10に記載のBgSA1タンパク質の成熟タンパク質とグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)リーダータンパク質とからなる融合タンパク質。
- 請求項9に記載のBgSA1タンパク質のシグナルペプチド及び成熟タンパク質、請求項10に記載のBgSA1タンパク質の成熟タンパク質、または請求項11に記載の融合タンパク質を用いた犬の原虫感染症の診断方法。
- 請求項9に記載のBgSA1タンパク質のシグナルペプチド及び成熟タンパク質、請求項10に記載のBgSA1タンパク質の成熟タンパク質、または請求項11に記載の融合タンパク質に対する抗血清あるいは抗体を用いる犬の原虫感染症の診断方法。
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