CN112574958A - 一株h9亚型禽流感病毒分离株及其应用 - Google Patents

一株h9亚型禽流感病毒分离株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了H9亚型禽流感HF株以及其灭活抗原制备的疫苗组合物物，该株具有良好的免疫原性，在低含量条件下即能对现有的H9亚型禽流感完全保护，且能与多种其他抗原制备联苗和复合疫苗。

Description

一株H9亚型禽流感病毒分离株及其应用
技术领域
本发明涉及动物病毒学领域，具体涉及一株H9N2禽流感病毒毒株的分离鉴定和纯化方法，以及用该毒株制备的预防禽流感的灭活疫苗。
背景技术
禽流感(Avian influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的一种急性、热性、高度接触性禽类传染病，AIV是一种单股负链分节段RNA病毒，属于正黏病毒科，A型流感病毒属。根据病毒致病性和毒力不同，在临床上可分为高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒，而根据其表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的差异，可将A型流感病毒分为不同的亚型，目前在禽类中分离的流感病毒HA亚型有16种和NA亚型有10种。
低致病性禽流感病毒种类繁多，但主要以H9亚型为主，其中在我国广泛流行的为H9N2亚型禽流感病毒。该亚型病毒单纯感染鸡时发病率高，死亡率低，仅出现轻微的呼吸道症状，引起产蛋率和孵化率下降，但由于易与其他致病微生物发生协同作用，造成继发感染，从而引起了禽群的高致死率，所以对养禽业危害巨大。
目前疫苗接种是防控H9N2亚型禽流感的主要手段之一，但由于病毒可以通过抗原漂移和抗原转变两种途径产生变异株，导致HA和NA抗原性发生变化，引起免疫失败。特别是近年来禽群感染H9N2亚型禽流感的情况不断发生，甚至出现在免疫群体，这种现象出现的原因是现用疫苗株与目前流行野毒株之间存在较大的遗传距离及抗原性差异，导致疫苗株的免疫保护效力下降。因此，目前存在的问题是需要研究开发一种可以对流行野毒株提供有效交叉保护的，用于预防H9亚型禽流感的疫苗。
发明内容
为解决现有的技术问题，本发明提供一种H9亚型禽流感病毒分离株以及利用该毒株制备的灭活疫苗。该禽流感病毒分离株属于H9亚型，具有良好的交叉免疫原性，以该分离株制得的灭活疫苗可以对新型H9亚型禽流感流行野毒株提供有效的交叉保护。
为达到上述目的，本发明自国内某发病鸡场分离一株H9亚型禽流感HF株，保藏号为CCTCC NO：V201941。
HF株具备下述特点：
(1)所述毒株为禽流感病毒H9N2亚型毒株。
(2)所述毒株可在鸡胚中高滴度生长，血凝素效价稳定在1∶512。
(3)所述毒株对鸡胚的半数感染量(EID50)可达109.17/0.1ml，测定静脉接种致病指数(IVPI)为0，证明该毒株为低致病力毒株。
(4)交叉血凝抑制实验证明所述毒株与新型H9亚型禽流感流行野毒株的抗原相关性良好。
禽流感病毒(H9亚型)HF株(Avian Influenza Virus(Subtype H9)，Strain HF)，保藏号为CCTCC NO：V201941，保藏日期为2019年06月19日，保藏地址为中国武汉·武汉大学。
本发明中所用术语H9亚型禽流感病毒也称为禽流感病毒H9亚型。
类似的，本发明中所用术语禽流感病毒H9亚型HF株也称为H9亚型禽流感病毒HF株。
本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的所述的H9亚型禽流感HF株或其培养物灭活抗原和药学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述H9亚型禽流感HF株或其培养物灭活抗原含量为灭活前≥106.5EID50/0.1ml。
本发明的H9亚型禽流感HF株或其培养物灭活抗原免疫原性良好，含量仅为106.5EID50/0.1ml也能产生完全免疫保护。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述H9亚型禽流感HF株或其培养物灭活抗原含量为灭活前106.5～108.5EID50/0.1ml。
作为本发明的一种更优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述H9亚型禽流感HF株或其培养物灭活抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述药学上可接受的载体为佐剂，所述佐剂所述包括：(1)白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；
所述佐剂含量为5％-70％V/V。
优选地，所述佐剂为白油佐剂，其用于制备油包水乳剂；
所述佐剂的浓度范围是从5％到70％V/V，优选从30％到70％，更优选66％V/V。
本发明的疫苗组合物进一步包含其它病原体或抗原组合使用以制备抵抗包括H9亚型禽流感病毒感染的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述疫苗组合物还包括以下抗原的一种或多种：鸡新城疫病毒抗原、禽减蛋综合征病毒抗原、鸡传染性支气管炎病毒抗原、鸡传染性法氏囊病病毒抗原、禽腺病毒抗原、禽呼肠孤病毒抗原、大肠杆菌抗原、副鸡禽杆菌抗原、滑液囊支原体抗原、鸡毒支原体抗原、多杀性巴氏杆菌抗原、马立克氏病毒抗原、禽脑脊髓炎病毒抗原、鸡传染性喉气管炎病毒抗原。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述疫苗组合物还包括由以下抗原组成的组中的一种或多种：鸡新城疫病毒灭活抗原、禽减蛋综合征病毒灭活抗原、鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原、鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原、禽腺病毒灭活抗原。
作为本发明的一种更优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述疫苗组合物还包括由以下抗原组成的组中的一种或多种：所述鸡新城疫病毒N7a株灭活抗原、所述禽减蛋综合征病毒HX株灭活抗原、所述鸡传染性支气管炎病毒M41株灭活抗原、所述鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位抗原、所述禽腺病毒FAV-HN株灭活抗原。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述H9亚型禽流感病毒HF株或其培养物灭活抗原含量为灭活前106.5～108.5EID50/0.1ml，所述鸡新城疫病毒灭活抗原含量为灭活前108.0～109.0EID50/0.1ml，所述鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原含量为灭活前106.0～107.0EID50/0.1ml，所述禽减蛋综合征病毒灭活抗原含量为灭活前107.0～108.0EID50/0.1ml，所述鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白含量为AGP效价1:16～1:128，所述禽腺病毒灭活抗原含量为灭活前105.0～108.0EID50/0.1ml。
作为本发明的一种更优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述H9亚型禽流感病毒HF株或其培养物灭活抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml，所述鸡新城疫病毒灭活抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml，所述鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原含量为灭活前106.0EID50/0.1ml，所述禽减蛋综合征病毒灭活抗原含量为灭活前107.0EID50/0.1ml，所述鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白含量为AGP效价1:16，所述禽腺病毒灭活抗原含量为灭活前106.5EID50/0.1ml。
本发明疫苗组合物还可以进一步将其它的试剂加入到本发明的组合物。
作为本发明的一种实施方式，所述的兽医学上可接受的载体包括药物，免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。
优选地，免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。
为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
本发明还涉及所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗H9亚型禽流感的药物中的应用。本发明所述的制备预防和/或治疗H9亚型禽流感病毒感染的药物的施用对象包括鸡。
本发明还提供了一种H9亚型禽流感灭活疫苗的制备方法，内容如下：
步骤(1)H9亚型禽流感病毒HF株病毒液的制备：用10日龄健康SPF鸡胚经尿囊腔接种AIV HF株病毒液，收获24小时-96小时的感染鸡胚液作为H9亚型禽流感病毒HF株病毒液；
步骤(2)H9亚型禽流感病毒HF株病毒液的灭活：取所述步骤(1)中制得的H9亚型禽流感病毒HF株病毒液，加入10倍稀释的分析纯甲醛溶液，使其终浓度为0.1％(V/V)，37℃灭活24小时，间隔4～6小时震摇1次；
步骤(3)油相的配制：取94容积份注射用白油和6容积份司本-80混合，加2份硬脂酸铝，边加热边搅拌至透明为止，高压灭菌冷却后为油相溶液；以及
步骤(4)水相的配制：取所述步骤(2)中灭活的H9亚型禽流感病毒HF株病毒液加无菌生理盐水稀释成108.5EID50/0.1ml的抗原浓度，将所述稀释抗原和灭菌的吐温-80按照体积比96:4混合均匀，即为水相；
步骤(5)疫苗乳化：取2容积份所述步骤(3)的油相和1容积份所述步骤(4)的水相混合乳化均匀，在乳化终止前加入1％(W/V)硫柳汞钠溶液，使硫柳汞钠终浓度为0.01％(W/V)，制成禽流感灭活疫苗。
本发明涉及的H9亚型禽流感病毒毒株、及其制备的灭活疫苗具有下述优点：
1.该H9亚型禽流感病毒HF株，具有良好的免疫原性，可用于制备H9亚型禽流感疫苗。
2.所制备的H9亚型禽流感灭活疫苗接种后，可产生高效价的抗体，对同源和非同源的H9亚型禽流感病毒流行野毒株均具有良好的免疫预防作用。
3.所采用的制备H9亚型禽流感灭活疫苗的方法，简单、安全、成本低。
根据本发明的禽流感病毒分离株属于H9亚型，其分离于安徽发病鸡场，可以在鸡胚上稳定的增殖，获得高血凝效价的病毒液。以具有上述特征的H9亚型禽流感病毒分离株制得的灭活疫苗可以防御新型H9亚型禽流感流行野毒株的攻击，具备良好的交叉免疫原性，效果优于现有技术毒株制得的疫苗，在预防和治疗禽免疫保护方面具有很好的应用前景。
本发明还涉及禽减蛋综合征病毒HX株，保藏号为CCTCC NO：V201942。
禽减蛋综合征病毒HX株具有良好的免疫原性，其制备的灭活疫苗能对现在的流行株进行完全保护。
本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的所述的禽减蛋综合征病毒HX株或其培养物灭活抗原和药学上可接受的载体；所述禽减蛋综合征病毒HX株或其培养物灭活抗原含量为107.0～108.0EID50/0.1ml，所述药学上可接受的载体为佐剂。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述佐剂所述包括：所述佐剂所述包括：(1)白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；
所述佐剂含量为5％-70％V/V；
优选地，所述佐剂为白油佐剂，其用于制备油包水乳剂；
所述佐剂的浓度范围是从5％到70％V/V，优选从30％到70％，更优选66％V/V。
本发明禽减蛋综合征病毒HX株灭活抗原，作为抗原制备的油乳剂疫苗可对鸡群提供完全保护。
本发明还涉及所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗禽减蛋综合征的药物中的应用。
附图说明
图1为HF株HA和NA基因RT-PCR扩增产物电泳图，其中泳道M为DNA Marker；泳道1为NA基因片段；泳道2为HA基因片段。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明所用术语“疫苗组合物”指含有H9亚型禽流感病毒免疫原性的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强鸡只针对H9亚型禽流感病毒的免疫反应。
术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。
术语“H9亚型禽流感病毒抗原”是指至少含有一种H9亚型禽流感病毒抗原形式的任何组合物，所述H9亚型禽流感病毒抗原可诱导、刺激或能抵抗H9亚型禽流感病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、减毒的或亚单位的抗原。
术语“兽医学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除H9亚型禽流感病毒抗原之外的其它所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。
术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica PharmaceuticalsIncorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccinedesign,the Subunit and adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BFGoodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。
术语“联合疫苗”指本发明的H9亚型禽流感病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。术语“复合疫苗”指本发明的H9亚型禽流感病毒和细菌制备的疫苗。例如，本发明的H9亚型禽流感病毒可与鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽减蛋综合征病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽腺病毒、禽呼肠孤病毒和/或大肠杆菌、副鸡禽杆菌、滑液囊支原体、鸡毒支原体混合或组合。
术语“预防和/或治疗”在涉及H9亚型禽流感病毒感染时是指抑制H9亚型禽流感病毒的复制、抑制H9亚型禽流感病毒的传播或防止H9亚型禽流感病毒在其宿主体内定居，以及减轻H9亚型禽流感病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1病毒的分离和鉴定
低致病性H9N2亚型禽流感病毒在我国大范围传播，近几年来，许多地区出现免疫H9N2亚型禽流感疫苗的鸡依旧感染H9N2亚型禽流感发病或死亡，提示该病毒可能通过抗原漂移或抗原转变进化新的流行趋势，最终造成免疫失败，为此,针对病毒的变异情况开展大量的流行病学调查研究，最终成功从安徽省合肥市某鸡场发病鸡群中分离出一株H9亚型禽流感病毒。
1.1病毒的分离
选表现为咳嗽、打喷嚏等呼吸系统症状，剖检可见支气管栓塞，气管粘膜水肿，且有浆液性渗出物等病理变化的发病鸡，取其内脏器官(肝、肾、脾等)加入含双抗的PBS(0.01mol/L，pH值7.0～7.4，青霉素10000U/ml、链霉素2000U/ml)进行研磨处理，研磨后4℃3000r/min离心15分钟，弃去上层脂肪，吸取中间的液体，经0.22μm滤器过滤，经尿囊腔接种10日龄的SPF鸡胚，0.2ml/枚，置37℃孵育观察120小时，弃去24小时内死亡鸡胚，收获24～120小时死亡鸡胚及120小时存活鸡胚的尿囊液。
1.2病毒的鉴定
1.2.1血凝实验(HA)
制备1％浓度的鸡红细胞，以收集的尿囊液为检测样品，通过血凝试验(HA)检测尿囊液的HA效价，试验设PBS阴性对照。HA效价大于1∶16判定为阳性。结果显示，鸡胚尿囊液对1％鸡红细胞的凝集效价为1∶256。
1.2.2血凝抑制试验(HI)
根据HA试验的结果，用PBS(pH7.0～7.2)配制4个工作单位的病毒。以4单位病毒为待检抗原，与标准的鸡新城疫病毒血凝抑制试验阳性血清、鸡减蛋综合征病毒血凝抑制试验阳性血清、禽流感病毒H9亚型、H5亚型和H7亚型血凝抑制试验阳性血清进行血凝抑制试验(HI)，鉴定病毒的类型。结果显示，分离株仅与禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验阳性血清有交叉反应，与其他阳性血清均没有交叉反应，表明该尿囊液中只含有H9亚型禽流感病毒，没有新城疫病毒、鸡减蛋综合征病毒、H5亚型和H7亚型禽流感病毒。
1.3病毒的纯化
将步骤1.1收获的鸡胚尿囊液用无菌生理盐水10倍系列稀释至10-7～10-10稀释度，取各稀释度的尿囊液分别通过尿囊腔接种9～11日龄的SPF鸡胚，0.1ml/枚，鸡胚培养和尿囊液收获的方法按照步骤1.1进行。通过HA和HI实验检测收获尿囊液是否含有H9亚型AIV，取最高稀释度的尿囊液接种SPF鸡胚后收获的含毒尿囊液，按照上述方法连续传代纯化2次，最终获得纯化后的病毒命名为HF株E1代，测定HA效价为1:512。
1.4病毒分离株亚型的确定
1.4.1引物的设计和合成
参照Genbank上已发表的AIV序列资料，设计并合成了扩增HA和NA基因的RT-PCR引物，具体序列如下。
HA-F：5’-AGCRAAAGCAGGGGAATTTCACAAC-3’
HA-R：5’-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTGCCAA-3’
NA-F：5’-AGCRAAAGCAGGAGTAAAAATGAAT-3’
NA-R：5’-AGTAGAAACAAGGAGTTTTTTCTAAAA-3’
1.4.2纯化病毒RNA的提取
以含纯化病毒的鸡胚尿囊液为RNA提取的材料，参照病毒RNA提取试剂盒的说明书，提取纯化病毒的RNA。
1.4.3HA和NA基因片段的RT-PCR
利用全式金One-Step RT-PCR SuperMix试剂盒，以步骤1.4.2提取的RNA为原料，配制50μl RT-PCR反应体系：25μl 2×Reaction Mix，1μl Enzyme Mix，引物NA-F和NA-R(或HA-F和HA-R)各1μl，18μl RNase-free水，4μl步骤1.4.2提取的RNA。反应条件：45℃20分钟，94℃预变性4分钟；30个循环：94℃30秒，52℃30秒,72℃延伸100秒；最后72℃延伸10分钟，结果显示成功扩增大小为1400bp的NA基因片段和1600bp的HA基因片段，电泳结果见图1。
1.4.4序列的测定和分析
步骤1.4.3的RT-PCR产物送测序公司进行核苷酸序列测定，根据测序结果，对HA和NA基因的开放阅读框(ORF)使用在线比对工具BLAST进行比对。结果显示，HF株与我国2013～2015年分离的诸多H9N2亚型禽流感病毒株的HA和NA基因的核苷酸同源性可高达99％，表明本研究分离的HF株为H9N2亚型禽流感病毒，且能代表H9亚型禽流感的流行趋势。
实施例2对鸡胚和鸡致病性测定
2.1鸡胚半数感染量(EID50)的测定
将分离的病毒用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-1～10-9稀释度的病毒液，经尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚，0.1ml/枚，每个稀释度接种5枚鸡胚，弃24小时死亡胚，于接种后120小时4℃过夜冻死鸡胚，逐胚测定其HA效价，HA效价大于1∶16判定为阳性，参考Reed-Muench方法计算出病毒EID50为109.17/0.1ml。
2.2对SPF鸡胚的毒力
将HF株E1代病毒液用灭菌生理盐水稀释105倍，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.1ml。观察接种后24～96小时鸡胚死亡9枚，1枚存活。死亡鸡胚胚体有出血、水肿等病变。
2.3对SPF鸡的毒力
为测定静脉接种致病指数(IVPI)，将HF株E1代病毒液10倍稀释后，静脉注射6周龄SPF鸡10只，每只0.1ml，攻毒后观察10日，未见任何异常反应，计算IVPI指数为0，确定该毒株为低致病力毒株。同时在攻毒后第5日时，采集所有攻毒鸡喉头及泄殖腔棉拭子放置含抗生素的无菌PBS中(含10000U/ml的青霉素和8000U/ml的链霉素)，同一只鸡的两种棉拭液等量混合后作为一个样品，经尿囊腔接种于10～11日龄SPF鸡胚分离病毒，结果10/10病毒分离阳性。
实施例3病毒抗原性分析
3.1H9单因子血清的制备
将10株H9N2亚型AIV分离毒株以及本发明涉及的HF株，分别制备油乳剂灭活苗。以上述疫苗分别免疫21日龄的SPF鸡，每种疫苗免疫3只，首免后14天进行二次免疫，每次经腿部肌肉免疫疫苗0.3ml，在禽用正压隔离器内饲养，二次免疫后21天无菌采血，分离血清制备单因子阳性血清，分装至小管，置于-20℃保存。
3.2不同毒株间的抗原交叉反应测定
用3.1制备疫苗的11株H9N2亚型AIV分别配置4单位抗原，然后与3.1中制备的单因子血清进行两两交叉的血凝抑制试验(HI)，实验重复三次，取三次实验的平均值用于抗原差异系数R值的分析，从而确定上述H9N2病毒之间的抗原相关性。R值计算方法参考《动物病毒学》第二版中的方法(殷震等，1997)。
r1＝甲血清对乙抗原的血凝抑制滴度÷甲血清对甲抗原的血凝抑制滴度
r2＝乙血清对甲抗原的血凝抑制滴度÷乙血清对乙抗原的血凝抑制滴度
Figure BDA0002219621880000141
判断标准：R＝1，表明两毒株抗原性相同；0.67≤R＜1，表明两毒株无明显差异；0.5≤R＜0.67，表明两毒株间抗原性有较小的差异；R＜0.5，表明两毒株抗原差异显著；R值越小，两毒株间抗原性差异越大。抗原交叉反应结果如下：
不同H9N2亚型AIV毒株间的HI交叉试验结果以及毒株抗原相关性分析结果分别见表1和表2。由表2可见，HF株与14年后分离的H9N2病毒的抗原相关性均大于0.85，表明该病毒与流行毒株的抗原相关性好，可作为H9N2亚型禽流感疫苗的候选毒株。提交保藏。
表1不同H9N2亚型AIV毒株间的HI交叉试验结果
Figure BDA0002219621880000142
表2不同H9N2 AIV毒株抗原相关性(R值)
Figure BDA0002219621880000151
实施例4灭活疫苗的制备
4.1病毒液的制备
取H9亚型禽流感病毒HF株E1代病毒液，用无菌生理盐水稀释至10-3(取病毒液0.1ml加入到0.9ml无菌生理盐水中，震荡混匀后依次再稀释2次)，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚(使用购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司的SPF种蛋自行孵化)，每胚0.1ml。接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。至96小时，取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。将冷却后的鸡胚收获胚液。所收获病毒液取样，按照《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录7中方法，测定病毒含量，为109.0EID50/0.1ml。
4.2抗原灭活
将分析纯甲醛溶液用纯化水10倍稀释后，加入步骤4.1的病毒液中，边加边摇，使其终浓度为0.1％(V/V)。充分摇震混匀后，转入另一无菌容器中，密封后37℃灭活24小时，间隔4～6小时震摇1次。
4.3乳化
取注射用白油94容积份和司本-80 6容积份混合后，加硬脂酸铝2质量份，随加随搅拌至透明为止，高压灭菌冷却后备用，即为油相。
取步骤4.2灭活的禽流感病毒液用无菌生理盐水配制成108.5EID50/0.1ml的抗原浓度，置于灭菌容器中，按病毒液体积的4％(V/V)加入灭菌的吐温-80，充分振摇，使吐温-80完全溶解为止，即为水相。
取油相2容积份置油相罐内，开动电机慢速搅拌，然后徐徐加入1容积份水相，加完后转入乳化罐中，再以2800转/分钟乳化40分钟，即在乳化终止前加入1％(W/V)硫柳汞钠溶液，使硫柳汞钠终浓度为0.01％(W/V)。具体配比见表3。
表3 H9亚型禽流感病毒灭活疫苗配比
组分 疫苗1 疫苗2 疫苗3
HF株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml) 10<sup>6.5</sup> 10<sup>8.0</sup> 10<sup>8.5</sup>
白油佐剂(V/V％) 66％ 66％ 66％
实施例5HF株的免疫保护试验
5.1血清学方法
用3周龄SPF鸡35只，每组10只，分3组，各皮下注射实施例4的H9亚型禽流感病毒HF株制作的灭活疫苗0.3ml，另5只不免疫作对照。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值为1:630(微量法)，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值均不高于1:2(微量法)，检测结果见表4。
表4免后21日血清AI HI抗体效价检测结果
Figure BDA0002219621880000171
注：“/”表示此项无内容，“GMT”表示几何平均值。
结果显示，本发明疫苗组合物HI抗体效价远高于6.0log2疫苗标准。
5.2免疫攻毒法
使用5.1中的35只鸡，在免疫21天后，每只鸡各静脉注射禽流感(H9亚型)病毒HF株病毒液，0.2ml/只(含107.0EID50)。攻毒后第5日，分别采集每只鸡的喉头及泄殖腔拭子，将同一只鸡的喉头及泄殖腔拭子混合后作为1个样品，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml，孵育观察120小时，逐胚测定鸡胚液的HA效价。每个拭子样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚液的HA效价不低于1∶16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再进行判定。结果详见表5。
表5攻毒后病毒分离结果
组别 病毒分离阳性率
疫苗1 0/10
疫苗2 0/10
疫苗3 0/10
对照组 5/5
结果显示，本发明疫苗组合物通过免疫攻毒法效力检验，病毒分离率为0，说明免疫本发明疫苗组合物后，鸡只不排毒，完全抵抗了H9亚型禽流感的感染，具有很好的免疫保护效果。
实施例6HF株免疫攻毒交叉保护试验
取75只3周龄的SPF鸡，其中60只分为10只/组的1～6组，1～3组皮下或腿部肌肉免疫本发明实施例4的H9亚型禽流感病毒HF株制作的灭活疫苗2，0.3ml/只；4～6组按照说明书，肌肉接种0.3ml/羽的商品化疫苗鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(LaSota株+WD株)；另15只分为5只/组，作为对照组。免疫3周后，每只鸡分别采血，分离血清，进行HI抗体效价测定，1～3组用H9亚型禽流感病毒HF株制备的HI抗原检测，4～6组用哈尔滨维科生物技术开发公司的禽流感(H9亚型)HI抗原检测，结果显示，免疫组均达到较高抗体水平，然后分别用流行毒株A518-2015、A17089-2017、A182096-2018攻毒，分别采集每只鸡的喉头及泄殖腔拭子，将同一只鸡的喉头及泄殖腔拭子混合后作为1个样品，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml，孵育观察120小时，逐胚测定鸡胚液的HA效价。每个拭子样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚液的HA效价不低于1∶16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再进行判定。结果详见表6。
表6禽流感H9亚型流行毒株的攻毒试验
Figure BDA0002219621880000181
Figure BDA0002219621880000191
注：“/”表示此项无内容
预防H9亚型禽流感的商业疫苗鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(LaSota株+WD株)免疫SPF鸡后，使用2015～2018年分离到的H9亚型禽流感A518-2015、A17089-2017、A182096-2018毒株攻毒，攻毒5天后检测排毒，发现攻毒鸡的病毒检出率均在30％以上，即试验中早期的H9亚型禽流感商品化疫苗可以在免疫后产生高水平抗体，但不能抵御2015～2018年流行毒株的攻击。而本发明的灭活苗则能完全保护。
实施例7鸡新城疫抗原的制备
取新城疫病毒(基因Ⅶ型)，N7a株(Newcastle Disease Virus(genotypeⅦ),strain N7a)(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201545，保藏日期为2015年10月19日，保藏地址为中国武汉·武汉大学，公开于中国专利申请CN107281479A)，用灭菌生理盐水作适当稀释(10-4或10-5)接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后置37℃继续孵育。选接种后48～120小时死亡和存活鸡胚，收获尿囊液，测定病毒含量，为108.0EID50/0.1ml。加入终浓度为0.1％的甲醛溶液(v/v)，放37℃灭活，其间每隔4～6h搅拌一次，灭活16h，灭活完全后备用。
实施例8鸡传染性支气管炎抗原的制备
取鸡传染性支气管炎病毒M41株(购自中国兽医药品监察所)，用灭菌生理盐水作适当稀释(10-2或10-3)接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后置36～37℃继续孵育。选接种后24～48小时死亡和存活鸡胚，收获尿囊液，测定病毒含量，为106.0EID50/0.1ml。加入终浓度为0.1％的甲醛溶液(v/v)，放置于37℃灭活，其间每隔4～6h搅拌一次，灭活16h，灭活完全后备用。
实施例9禽减蛋综合征抗原的制备
将减蛋综合征病毒HX株(Egg Drop syndrome Virus,Strain HX,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201942，保藏日期为2019年06月19日，保藏地址为中国武汉·武汉大学)，用灭菌生理盐水比例稀释，尿囊腔接种10日龄易感鸭胚，每胚0.1ml，接种后置36～37℃继续孵育，24小时前死亡的鸭胚弃去，此后每6～8小时照蛋1次，死亡的鸭胚随时取出，直至120小时，取出全部鸭胚，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时；然后无菌收获鸭胚尿囊液，测定病毒含量，为108.5EID50/0.1ml。加入终浓度为0.2％的甲醛溶液(v/v)，放37℃灭活，其间每隔4～6h搅拌一次，灭活16h，灭活完全后备用。
实施例10法氏囊抗原的制备
1.VP2 cDNA制备
按病毒RNA提取试剂盒操作从感染鸡传染性法氏囊病病毒超强毒成都株的SPF鸡法氏囊中提取IBDV病毒RNA，并用随机引物进行逆转录。根据VP2基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，合成寡聚核苷酸引物序列见表7，并进行PCR扩增，并利用琼脂糖凝胶胶回收试剂盒回收，-20℃保存。
表7法氏囊病毒VP2基因扩增引物
VP2-EcoR1-F CCGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAAC
VP2-Sal1-R ACGCGTCGACTTACCTTAGGGCCCGGATTATGT
2.pColdⅢ-VP2/E.Coli BL21(DE3)菌株的构建
取上述制备的VP2 cDNA，进行双酶切，并将酶切后的片段连接到pColdⅢ载体上；连接产物直接转化大肠杆菌BL21(DE3)，并涂布在含有100μg氨苄青霉素LB固体培养基中培养过夜，长出的菌落即为为pColdⅢ-VP2/E.Coli BL21(DE3)菌株。
3.鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制备
用培养罐通气培养，按容积装入70％培养基及花生油消泡剂。灭菌后按培养基量的2％～4％接种pColdⅢ-VP2/E.Coli BL21(DE3)菌株种子液，37℃培养，待菌液的OD600值达到0.6～1.0，加入0.2mol/Lα-乳糖，使终浓度达到0.02mol/L，再继续培养5～8h。
培养结束后，离心收集菌体，重悬，超声波破碎，离心收集上清液。经硫酸铵沉淀后，收集VP2蛋白液。
实施例11禽腺病毒抗原的制备
取禽腺病毒FAV-HN株(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201609，保藏日期为2016年02月29日，保藏地址为中国武汉·武汉大学，公开于中国专利申请CN107523556A)，用灭菌生理盐水作适当稀释(10-4或10-5)接种5～7日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后置37℃继续孵育。选接种后24～144小时死亡和存活鸡胚，收获尿囊液，测定病毒含量，为108.5EID50/0.1ml。加入终浓度为0.1％的甲醛溶液(v/v)，放37℃灭活，其间每隔4～6h搅拌一次，灭活24h，灭活完全后备用。
实施例12H9亚型禽流感病毒联合疫苗的制备
将实施例4制备的H9亚型禽流感病毒抗原分别和实施例7制备的鸡新城疫抗原、实施例8制备的鸡传染性支气管炎抗原、实施例9制备的禽减蛋综合征抗原、实施例10制备的传染性法氏囊抗原、实施例11制备的禽腺病毒抗原按比例混合，加入到白油佐剂中，同时开动电机，17500r/min搅拌5min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。具体配比见表8、9、10、11。
表8 H9亚型禽流感病毒二联疫苗配比
组分 疫苗4 疫苗5 疫苗6 疫苗7 疫苗8
HF株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml) 10<sup>6.5</sup> 10<sup>7.0</sup> 10<sup>7.5</sup> 10<sup>8.0</sup> 10<sup>8.5</sup>
N7a株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml) 10<sup>8.0</sup> — — — —
M41株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml) — 10<sup>6.0</sup> — — —
HX株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml) — — 10<sup>7.0</sup> — —
VP2蛋白(AGP效价) — — — 1：16 —
FAV-HN株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml) — — — — 10<sup>6.5</sup>
白油佐剂(V/V％) 66％ 66％ 66％ 66％ 66％
表9 H9亚型禽流感病毒三联疫苗配比
组分 疫苗9 疫苗10 疫苗11 疫苗12
HF株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml) 10<sup>6.5</sup> 10<sup>7.0</sup> 10<sup>7.5</sup> 10<sup>8.0</sup>
N7a株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml) 10<sup>8.0</sup> 10<sup>8.0</sup> 10<sup>8.0</sup> 10<sup>8.0</sup>
M41株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml) 10<sup>6.0</sup> — — —
HX株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml) — 10<sup>7.0</sup> — —
VP2蛋白(AGP效价) — — 1：16 —
FAV-HN株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml) — — — 10<sup>6.5</sup>
白油佐剂(V/V％) 66％ 66％ 66％ 66％
表10 H9亚型禽流感病毒四联疫苗配比
Figure BDA0002219621880000221
表11 H9亚型禽流感病毒五联疫苗配比
组分 疫苗19 疫苗20
HF株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml) 10<sup>8.0</sup> 10<sup>8.0</sup>
N7a株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml) 10<sup>8.0</sup> 10<sup>8.0</sup>
M41株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml) 10<sup>6.0</sup> 10<sup>6.0</sup>
HX株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml) 10<sup>7.0</sup> —
VP2蛋白(AGP效价) — 1：16
FAV-HN株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml) 10<sup>6.5</sup> 10<sup>6.5</sup>
白油佐剂(V/V％) 66％ 66％
实施例13 H9亚型禽流感病毒联合疫苗免疫原性试验
1.禽流感部分免疫原性试验
取21日龄的SPF鸡180只，分成18组，每组10只，第10组～第26组分别经颈部皮下注射免疫实施例12制备的疫苗4～疫苗20，0.3ml/只；第27组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，将第10组～第26组免疫鸡，连同第27组对照鸡，采血并分离血清。检测H9亚型禽流感HI抗体效价，同时用HF株病毒液静脉注射攻击，每只0.2ml(含107.0EID50)。于攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5个，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的凝集价不低于1:16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。免疫组应至少9只鸡病毒分离为阴性；对照组应至少4只鸡病毒分离为阳性。结果见表12。
表12 H9亚型禽流感病毒联合疫苗禽流感部分免疫原性试验结果
Figure BDA0002219621880000241
注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数。
结果显示，疫苗4～疫苗20在免疫后21天均能产生较高的禽流感抗体，而且免疫组和对照相比，可以完全保护强毒的攻击。表明本发明提供的H9亚型禽流感病毒液，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。
2.新城疫部分免疫原性试验
取21日龄的SPF鸡140只，分成14组，每组10只，第28组～第40组分别经颈部皮下注射免疫实施例12制备的疫苗4、疫苗9～疫苗20，20μl/只；第41组皮下注射20μl生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，将第28组～第40组免疫鸡，连同第41组对照鸡，采血并分离血清。检测新城疫病毒HI抗体，同时用新城疫强毒HN1101株病毒液通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表13。
表13 H9亚型禽流感病毒联合疫苗新城疫部分免疫原性试验结果
Figure BDA0002219621880000251
注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数。
结果显示，疫苗4、疫苗9～疫苗20免疫组在免疫后21天均能产生较高的新城疫抗体，而且免疫组和对照相比，可以完全保护强毒的攻击。表明以本发明提供的N7a株新城疫病毒液，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。
3.鸡传染性支气管炎部分免疫原性试验
取21日龄的SPF鸡80只，分成8组，每组10只，第42组～第48组各点眼、滴鼻接种鸡传染性支气管炎活疫苗(H120株)1羽份(0.05ml)。接种后21日，连同第49组对照鸡，采血并分离血清。同时，第42组～第48组各组经颈部皮下注射免疫实施例12制备的疫苗5、疫苗9、疫苗13、疫苗14、疫苗15、疫苗19、疫苗20，0.3ml/只。接种后28日，连同第49组对照鸡分别采血并分离血清；第42～第48组免疫鸡在活苗首免后21日、灭活苗免后28日两次采集的血清(第49组对照鸡同样时间采集血清)测HI抗体效价。免疫组二免血清HI抗体效价几何平均值不低于首免血清HI抗体效价几何平均值的4倍，未免疫对照组血清HI抗体效价的几何平均值不高于1:8(微量法)。同时用鸡传染性支气管炎M41强毒每羽滴鼻攻毒103.0EID50，作攻毒实验。结果见表14。
表14 H9亚型禽流感病毒联合疫苗鸡传支部分免疫原性试验结果
Figure BDA0002219621880000261
结果显示，疫苗5、疫苗9、疫苗13、疫苗14、疫苗15、疫苗19、疫苗20二免血清HI抗体效价几何平均值均不低于首免血清HI抗体效价几何平均值的4倍，攻毒后全部免疫鸡的气管内未分离出病毒，可以完全保护强毒的攻击。表明本发明提供的鸡传染性支气管炎病毒液，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。
4.禽减蛋综合征部分免疫原性试验
取21日龄的SPF鸡70只，分成7组，每组10只，第50组～第55组分别经颈部皮下注射免疫实施例12制备的疫苗6、疫苗10、疫苗13、疫苗16、疫苗17、疫苗19，0.3ml/只；第56组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，第50组～第56组采血，测定禽减蛋综合征HI抗体效价，免疫鸡HI抗体几何平均效价应≥7log2，对照鸡HI抗体效价应≤2log2。结果见表15。
表15 H9亚型禽流感病毒联合疫苗减蛋部分免疫原性试验结果
Figure BDA0002219621880000271
注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数。
结果显示，疫苗6、疫苗10、疫苗13、疫苗16、疫苗17、疫苗19在免疫后21天均能产生较高的减蛋综合征抗体，可有效保护鸡群产蛋综合征的发生。表明本发明提供的减蛋综合征病毒液，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。
5.法氏囊部分免疫原性试验
取21日龄的SPF鸡70只，分成7组，每组10只，第57组～第62组分别经颈部皮下注射免疫实施例12制备的疫苗7、疫苗11、疫苗14、疫苗16、疫苗18、疫苗20，0.3ml/只；第63组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，第57组～第63组，每只点眼途径接种100倍稀释的鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85((CVCC AV7株)购于中国兽医药品监察所)株病毒液0.1ml(实含毒量≥100个BID)。攻毒后，每天观察鸡只的临床表现，记录发病和死亡鸡数，至72～96小时，扑杀存活鸡，逐只解剖，观察法氏囊等病变。免疫鸡应至少8只正常，不出现法氏囊病变；对照鸡应至少4只鸡发病，出现明显的法氏囊病变(如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变)。结果见表16。
表16 H9亚型禽流感病毒联合疫苗法氏囊部分免疫原性试验结果
Figure BDA0002219621880000281
结果显示，疫苗7、疫苗11、疫苗14、疫苗16、疫苗18、疫苗20在免疫后21天，可以完全保护鸡传染性法氏囊病强毒的攻击。表明本发明提供的法氏囊VP2蛋白，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。
6.禽腺病毒部分免疫原性试验
取21日龄的SPF鸡80只，分成8组，每组10只，第64组～第70组分别经颈部皮下注射免疫实施例12制备的疫苗8、疫苗12、疫苗15、疫苗17～疫苗20，0.3ml/只；第71组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，用FAV-HN株病毒液通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表17。
表17 H9亚型禽流感病毒联合疫苗禽腺部分免疫原性试验结果
Figure BDA0002219621880000291
结果显示，疫苗8、疫苗12、疫苗15、疫苗17～疫苗20免疫组在免疫后21天均能产生较好的免疫保护。表明本发明提供的禽腺病毒液，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。
证明了本发明提供的H9亚型禽流感病毒联合疫苗能够抵抗相关病原的侵袭，显示出良好的免疫原性，可有效控制我国H9亚型禽流感病毒相关疾病的流行。
实施例14减蛋综合征病毒疫苗组合物的制备
将实施例9制备的减蛋综合征抗原，加入到白油佐剂中，同时开动电机，17500r/min搅拌5min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。具体配比见表18。
表18减蛋综合征病毒疫苗配比
组分 疫苗21 疫苗22 疫苗23
HX株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml) 10<sup>7.0</sup> 10<sup>7.5</sup> 10<sup>8.0</sup>
白油佐剂(V/V％) 66％ 66％ 66％
实施例15减蛋综合征病毒疫苗组合物的免疫原性试验
取21日龄的SPF鸡40只，分成4组，每组10只，第72组～第74组分别经颈部皮下注射免疫实施例14制备的疫苗21、疫苗22、疫苗23，0.3ml/只；第75组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，第72组～第75组采血，测定减蛋综合征HI抗体效价，免疫鸡HI抗体几何平均效价应≥7log2，对照鸡HI抗体效价应≤2log2。结果见表19。
表19减蛋综合征病毒疫苗组合物免疫原性试验结果
Figure BDA0002219621880000301
注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数。
结果显示，疫苗21、疫苗22、疫苗23在免疫后21天均能产生较高的减蛋综合征抗体，可有效保护鸡群产蛋综合征的发生。表明本发明提供的减蛋综合征病毒液，作为抗原制备的油乳剂疫苗可对鸡群提供完全保护。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.H9亚型禽流感HF株，保藏号为CCTCC NO：V201941。
2.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的权利要求1所述的H9亚型禽流感HF株或其培养物灭活抗原和药学上可接受的载体。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述H9亚型禽流感HF株或其培养物灭活抗原含量为灭活前≥106.5～108.5EID50/0.1ml；优选地，所述H9亚型禽流感HF株或其培养物灭活抗原含量为灭活前≥106.5～108.5EID50/0.1ml；更优选地，所述H9亚型禽流感HF株或其培养物灭活抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml。
4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述药学上可接受的载体为佐剂，所述佐剂所述包括：(1)白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为QuilA、QS-21、GPI-0100；
所述佐剂含量为5％-70％V/V；
优选地，所述佐剂为白油佐剂，其用于制备油包水乳剂；
所述佐剂的浓度范围是从5％到70％V/V，优选从30％到70％，更优选66％V/V。
5.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包括以下抗原的一种或多种：鸡新城疫病毒抗原、禽减蛋综合征病毒抗原、鸡传染性支气管炎病毒抗原、鸡传染性法氏囊病病毒抗原、禽腺病毒抗原、禽呼肠孤病毒抗原、大肠杆菌抗原、副鸡禽杆菌抗原、滑液囊支原体抗原、鸡毒支原体抗原、多杀性巴氏杆菌抗原、马立克氏病毒抗原、禽脑脊髓炎病毒抗原、鸡传染性喉气管炎病毒抗原；
优选地，所述疫苗组合物还包括由以下抗原组成的组中的一种或多种：鸡新城疫病毒灭活抗原、禽减蛋综合征病毒灭活抗原、鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原、鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原、禽腺病毒灭活抗原；
更优选地，所述疫苗组合物还包括由以下抗原组成的组中的一种或多种：所述鸡新城疫病毒N7a株灭活抗原、所述禽减蛋综合征病毒HX株灭活抗原、所述鸡传染性支气管炎病毒M41株灭活抗原、所述鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位抗原、所述禽腺病毒FAV-HN株灭活抗原。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述H9亚型禽流感病毒HF株或其培养物灭活抗原含量为灭活前106.5～108.5EID50/0.1ml，所述鸡新城疫病毒灭活抗原含量为灭活前108.0～109.0EID50/0.1ml，所述鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原含量为灭活前106.0～107.0EID50/0.1ml，所述禽减蛋综合征病毒灭活抗原含量为灭活前107.0～108.0EID50/0.1ml，所述鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白含量为AGP效价1:16～1:128，所述禽腺病毒灭活抗原含量为灭活前105.0～108.0EID50/0.1ml；
优选的，所述H9亚型禽流感病毒HF株或其培养物灭活抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml，所述鸡新城疫病毒灭活抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml，所述鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原含量为灭活前106.0EID50/0.1ml，所述禽减蛋综合征病毒灭活抗原含量为灭活前107.0EID50/0.1ml，所述鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白含量为AGP效价1:16，所述禽腺病毒灭活抗原含量为灭活前106.5EID50/0.1ml。
7.根据权利要求2～6任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗H9亚型禽流感的药物中的应用。
8.禽减蛋综合征病毒HX株，保藏号为CCTCC NO：V201942。
9.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的权利要求8所述的禽减蛋综合征病毒HX株或其培养物灭活抗原和药学上可接受的载体；所述禽减蛋综合征病毒HX株或其培养物灭活抗原含量为107.0～108.0EID50/0.1ml，所述药学上可接受的载体为佐剂；
所述佐剂所述包括：(1)白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；
所述佐剂含量为5％-70％V/V；
优选地，所述佐剂为白油佐剂，其用于制备油包水乳剂；
所述佐剂的浓度范围是从5％到70％V/V，优选从30％到70％，更优选66％V/V。
10.根据权利要求9所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗禽减蛋综合征的药物中的应用。
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