BR112020024354A2 - manipulação de linfócitos b utilizando ctidina desaminase induzida por ativação endógena - Google Patents

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Abstract

“manipulação de linfócitos b utilizando ctidina desaminase induzida por ativação endógena” a presente invenção fornece um método para manipular linfócitos b utilizando citidina desaminase induzida por ativação do linfócito b. desse modo, o uso de nucleases modificadas, como nuclease cas, pode ser evitado. as células b modificadas são úteis para produzir anticorpos personalizados e para terapia com células b. consequentemente, a presente invenção também fornece células b manipuladas e anticorpos personalizados produzidos por células b manipuladas.

Description

“MANIPULAÇÃO DE LINFÓCITOS B UTILIZANDO CTIDINA DESAMINASE INDUZIDA POR ATIVAÇÃO ENDÓGENA”
[0001] A presente invenção se refere ao campo dos linfócitos B manipulados, em particular para a produção de anticorpos. Em particular, a presente invenção se refere à edição de genes de imunoglobulina em células B, de modo que as células B modificadas sejam capazes de produzir anticorpos personalizados. Consequentemente, a presente invenção fornece um método para modificar células B e células B modificadas de acordo com o método da presente invenção. Essas células B manipuladas e os anticorpos personalizados produzidos pelas células B são úteis em uma variedade de aplicações médicas, incluindo prevenção e terapia de doenças direcionadas pelo anticorpo modificado, bem como abordagens de diagnóstico, por exemplo, para detecção de um antígeno em um (isolado) amostra.
[0002] O uso de anticorpos monoclonais terapêuticos surgiu como uma abordagem inovadora para atingir especificamente uma ampla variedade de doenças, incluindo distúrbios imunológicos, cânceres e infecções. Atualmente, 65 anticorpos monoclonais (mAbs) estão aprovados pelo FDA para uso clínico e mais de 350 mAbs estão em ensaios clínicos, o que demonstra o poder desta abordagem terapêutica e da engenharia de anticorpos recombinantes.
[0003] O potencial dos anticorpos terapêuticos como ferramentas poderosas para o tratamento de inúmeras doenças surgiu em particular desde 1975, quando Köhler e Milstein desenvolveram um procedimento para a produção de mAbs (Köhler G, Milstein C: Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975 Aug 7; 256(5517):495-7). Os primeiros mAbs foram produzidos em camundongos e, quando administrados a pacientes, esses anticorpos murinos enfrentaram sérios problemas por serem reconhecidos como moléculas estranhas. Isso resultou na eliminação pelo sistema imunológico humano e em respostas alérgicas que variam a partir de uma erupção cutânea leve a insuficiência renal.
Além disso, esses anticorpos murinos não foram capazes de interagir adequadamente com componentes do sistema imunológico humano e sua eficácia biológica foi severamente restrita (para revisão, consulte Chames P, Van Regenmortel M, Weiss E, Baty D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 2009;157(2):220-233. doi:10.1111/j.1476-5381.2009.00190.x.).
[0004] Para evitar esses problemas, estratégias foram desenvolvidas para tornar os anticorpos murinos mais “humanos”. Uma abordagem foi o desenvolvimento de anticorpos quiméricos, nos quais domínios variáveis murinos foram fundidos a domínios constantes humanos, resultando em um anticorpo, que tem aprox. 70% humano e que tem uma porção Fc totalmente humana (Neuberger MS, Williams GT, Mitchell EB, Jouhal SS, Flanagan JG, Rabbitts TH: A hapten-specific chimaeric IgE antibody with human physiological effector function. Nature. 1985 Mar 21-27; 314(6008):268- 70). Para diminuir ainda mais a parte murina de mAbs, anticorpos "humanizados" foram desenvolvidos, nos quais as alças hipervariáveis de um anticorpo totalmente humano foram substituídas pelas alças hipervariáveis do anticorpo murino de interesse por "enxerto de região determinante de complementaridade (CDR)". Os anticorpos humanizados contêm 85 a 90% das sequências humanas e são ainda menos imunogênicos do que os anticorpos quiméricos. A maioria dos mAbs aprovados são quiméricos ou humanizados (para revisão, consulte Chames P, Van Regenmortel M, Weiss E, Baty D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 2009;157(2):220-233. doi:10.1111/j.1476-
5381.2009.00190.x.). No entanto, humanizar é tecnicamente exigente e pode resultar na perda da atividade do anticorpo (ou seja, na perda da função).
[0005] Outra abordagem para o desenvolvimento de anticorpos terapêuticos se refere a tecnologias de exibição in vitro, como exibição de fago (McCafferty J, Griffiths AD, Winter G, Chiswell DJ: Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 1990 Dec 6;
348(6301):552-4). Desse modo, anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos são exibidos na superfície de um organismo simples, como fago, bactéria ou levedura para varredura. No entanto, tais sistemas de biblioteca não contêm anticorpos de comprimento total e os anticorpos são expressos por bactérias ou leveduras em vez de por células humanas. Tais sistemas de expressão não podem refletir modificações pós-tradução humanas. Em particular, os anticorpos produzidos in vitro muitas vezes não se assemelham aos padrões de glicosilação de anticorpos humanos naturais, que são, no entanto, cruciais para a eficácia do anticorpo, pois influenciam as funções efetoras e a ativação a jusante do sistema imunológico.
[0006] Além disso, camundongos "humanizados" transgênicos podem ser usados para produzir anticorpos a partir de genes humanos (Lonberg N. Human monoclonal antibodies from transgenic mice In: Chernajovsky Y, Nissim A, editors. Therapeutic Antibodies. Handbook of Experimental Pharmacology, Volume 181. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag;
2008. pp. 69–97. Eds.). Porém, como essa tecnologia depende da imunização de camundongos com um antígeno, ela se limita à produção de anticorpos para antígenos, que podem ser reconhecidos pelo sistema imunológico de um camundongo.
[0007] Assim, o "padrão ouro" para a produção de anticorpos terapêuticos é o uso de linfócitos B humanos isolados, que utilizam a forma "natural" de produção de anticorpos humanos (Traggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 2004 Aug;10(8):871-5. Epub 2004 Jul 11; Lanzavecchia A, Bernasconi N, Traggiai E, Ruprecht CR, Corti D, Sallusto F. Understanding and making use of human memory B cells. Immunol Rev. 2006 Jun; 211: 303-9). Consequentemente, as células B foram tradicionalmente usadas para obter anticorpos humanos naturais e bibliotecas de anticorpos humanos com base no genoma de células
B naturais (Duvall MR, Fiorini RN. Different approaches for obtaining antibodies from human B cells. Curr Drug Discov Technol. 2014 Mar;11(1):41- 7). Apenas recentemente, com o desenvolvimento de ferramentas de edição de genoma como CRISPR/Cas9, nuclease de dedo de zinco e TALENs (nucleases efetoras tipo ativador de transcrição), células B humanas também surgiram como alvo para edição de genes de imunoglobulina, de modo que também anticorpos recombinantes personalizados puderam ser produzidos por células B humanas isoladas.
[0008] Por exemplo, Cheong e colegas relataram a aplicação da tecnologia CRISPR/Cas9 para editar genes de imunoglobulina ao entregar Cas9 e RNA-guia com retro ou lentivírus às células B, induzindo assim a recombinação de troca de classe de imunoglobulina (Cheong TC, Compagno M, Chiarle R. Editing of mouse and human immunoglobulin genes by CRISPR- Cas9 system. Nat Commun. 2016 Mar 9; 7:10934. doi:
10.1038/ncomms10934).
[0009] Além disso, o documento WO 2016/161446 também descreve o uso da tecnologia CRISPR/Cas9 para a manipulação de células B humanas. Além disso, o documento WO 2016/161446 também sugere o uso de outras nucleases manipuladas, como nucleases de dedo de zinco e TALENS para modificar geneticamente células B.
[0010] Em geral, as abordagens de edição de genoma usando nucleases manipuladas, como CRISPR/Cas9, nuclease de dedo de zinco e TALENs, surgiram recentemente como uma ferramenta poderosa em biotecnologia com potencial terapêutico promissor. No entanto, devido ao mecanismo de trabalho das nucleases manipuladas e seus requisitos de administração, também surgem grandes preocupações de segurança para o uso da edição do genoma por nucleases manipuladas em aplicações clínicas.
[0011] Assim, a principal preocupação refere-se à clivagem fora do alvo indesejada e mutações. As interações não intencionais de nucleases manipuladas e a consequente clivagem de sítios não-alvo foram relatadas,
apesar da segmentação específica pelas nucleases manipuladas (Zhang XH, Tee LY, Wang XG, Huang QS, Yang SH. Off-target Effects in CRISPR/Cas9- mediated Genome Engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 2015 Nov 17;4:e264. doi: 10.1038/mtna.2015.37; Shim G, Kim D, Park GT, Jin H, Suh SK, Oh YK. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacol Sin. 2017 Jun;38(6):738-753. doi: 10.1038/aps.2017.2). Por exemplo, no sistema CRISPR/Cas9, o sgRNA pode se ligar a uma sequência incompatível com homologia parcial.
[0012] Além disso, a tumorigenicidade de ferramentas de edição de genes exógenos representa outra questão de segurança importante, em que, em particular, mutações fora do alvo (por exemplo, perto de proto- oncogenes) podem resultar no desenvolvimento de câncer. Em outras palavras, a geração de mutações fora do alvo acarreta o risco de anormalidades funcionais e início do câncer.
[0013] Outra preocupação importante de segurança diz respeito à imunogenicidade das nucleases manipuladas, uma vez que CRISPR/Cas9, nuclease de dedo de zinco e TALENs são todos exógenos e estranhos ao corpo humano. Consequentemente, as nucleases manipuladas podem induzir uma resposta imunológica (Dai WJ, Zhu LY, Yan ZY, Xu Y, Wang QL, Lu XJ. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Mol Ther Nucleic Acids. 2016;5:e349. doi: 10.1038/mtna.2016.58). Além disso, também os vetores virais usados para a administração de nucleases manipuladas podem ser imunogênicos e resultar na produção de anticorpos e respostas imunológicas de células T, limitando o uso repetido dos mesmos vetores virais (Zaiss AK, Muruve DA. Immune responses to adeno-associated virus vectors. Curr Gene Ther. 2005 Jun;5(3):323-31). Além disso, os vetores virais apresentam o risco de integração cromossômica e transmissão da linha germinativa.
[0014] Consequentemente, há uma necessidade para o desenvolvimento de ferramentas de edição de genoma de células B mais seguras.
[0015] Em vista disso, é o objetivo da presente invenção fornecer um novo método para a manipulação de células B, que supera as desvantagens do estado da técnica descritas acima. Em particular, é um objetivo da presente invenção fornecer um método para manipular células B mais seguro. Por exemplo, é um objetivo da presente invenção fornecer um método para manipular células B, que reduza o risco de mutações indesejadas fora do alvo. Esses objetivos são alcançados por meio do objeto definido abaixo e nas reivindicações anexas.
[0016] Embora a presente invenção seja descrita em detalhes abaixo, deve ser entendido que esta invenção não está limitada às metodologias, protocolos e reagentes específicos descritos neste documento, pois estes podem variar. Deve também ser entendido que a terminologia usada neste documento não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm os mesmos significados como comumente entendidos por alguém versado no estado da técnica.
[0017] A seguir, os elementos da presente invenção serão descritos. Esses elementos são listados com modalidades específicas, no entanto, deve ser entendido que eles podem ser combinados de qualquer maneira e em qualquer número para criar modalidades adicionais. Os exemplos descritos de várias maneiras e as modalidades preferenciais não devem ser interpretadas como limitando a presente invenção apenas às modalidades explicitamente descritas. Esta descrição deve ser entendida para apoiar e englobar modalidades que combinam as modalidades explicitamente descritas com qualquer número dos elementos divulgados e/ou preferenciais. Além disso, quaisquer permutações e combinações de todos os elementos descritos neste pedido devem ser consideradas divulgadas pela descrição do presente pedido, a menos que o contexto indique o contrário.
[0018] Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija de outra maneira, o termo "compreende", e variações como "compreende" e "compreendendo", serão entendidas como implicando a inclusão de um membro declarado, inteiro ou etapa, mas não a exclusão de qualquer outro membro não declarado, inteiro ou etapa. O termo "consistir em" é uma modalidade particular do termo "compreender", em que qualquer outro membro não declarado, número inteiro ou etapa é excluído. No contexto da presente invenção, o termo "compreender" abrange o termo "consistir em". O termo "compreendendo", portanto, abrange "incluindo", bem como "consistindo", por exemplo, uma composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.
[0019] Os termos "um" e "uma" e "o/a" e referências similares usadas no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações) devem ser interpretados para cobrir tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outra forma neste documento ou claramente contradito pelo contexto. A citação de faixas de valores neste documento tem a intenção apenas de servir como um método abreviado de referência individual a cada valor separado dentro da faixa. A menos que indicado de outra maneira neste documento, cada valor individual é incorporado no relatório descritivo como se fosse individualmente citado neste documento. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial para a prática da invenção.
[0020] A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Quando necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção.
[0021] O termo “cerca de” em relação a um valor numérico x significa x ± 10%.
[0022] Conforme usado neste documento, os termos "peptídeo", "polipeptídeo", "proteína" referem-se a peptídeos, oligopeptídeos ou proteínas incluindo proteínas de fusão, respectivamente, compreendendo pelo menos dois aminoácidos unidos um ao outro, preferencialmente por uma ligação de peptídeos normal, ou, alternativamente, por uma ligação de peptídeos modificada, como por exemplo nos casos de peptídeos isostéricos. O termo "(poli) peptídeo" refere-se a um peptídeo e/ou polipeptídeo. Em particular, os termos "peptídeo", "polipeptídeo", "proteína" também incluem " peptidomiméticos" que são definidos como análogos de peptídeos contendo elementos estruturais não peptídicos, cujos peptídeos são capazes de imitar ou antagonizar a (s) ação (ões) biológica (s) de um peptídeo parental natural. Um peptidomimético não possui características de peptídeo clássicas, como ligações de peptídeo cindíveis enzimaticamente. Um peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode ser composto por qualquer um dos 20 aminoácidos definidos pelo código genético. Além disso, um peptídeo, polipeptídeo ou proteína também pode compreender aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos definidos pelo código genético, além desses aminoácidos, ou pode ser composto por aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos definidos pelo código genético. Em particular, um peptídeo, polipeptídeo ou proteína no contexto da presente invenção pode igualmente ser composto de aminoácidos modificados por processos naturais, tais como processos de maturação pós- tradução ou por processos químicos, que são bem conhecidos por um versado no estado da técnica. Essas modificações são totalmente detalhadas na literatura. Essas modificações podem aparecer em qualquer parte do polipeptídeo: no esqueleto do peptídeo, na cadeia de aminoácidos ou mesmo nas extremidades do terminal carbóxi ou amino. Em particular, um peptídeo ou polipeptídeo pode ser ramificado após uma ubiquitinação ou ser cíclico com ou sem ramificação. Este tipo de modificação pode ser o resultado de processos de pós-tradução naturais ou sintéticos que são bem conhecidos por um versado no estado da técnica. Os termos "peptídeo", "polipeptídeo", "proteína" no contexto da presente invenção, em particular, também incluem peptídeos, polipeptídeos e proteínas modificados. Por exemplo, modificações de peptídeo, polipeptídeo ou proteína podem incluir acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, fixação covalente de um nucleotídeo ou de um derivado de nucleotídeo, fixação covalente de um lipídeo ou de um derivado de lipídeo, a fixação covalente de um fosfatidilinositol, reticulação covalente ou não covalente, ciclização, formação de ligação de dissulfeto, desmetilação, glicosilação incluindo peguilação, hidroxilação, iodização, metilação, miristoilação, oxidação, processos proteolíticos, fosforilação, prenilação, racemização, seneloilação, sulfatação, adição de aminoácidos, como arginilação ou ubiquitinação. Tais modificações são totalmente detalhadas na literatura (Proteins Structure and Molecular Properties (1993) 2a Ed., TE Creighton, New York; Post-translational Covalent Modifications of Proteins (1983) BC Johnson, Ed., Academic Press, New York; Seifter et al. (1990) Analysis for protein changes and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182: 626-646 e Rattan et al., (1992) Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci, 663: 48-62). Por conseguinte, os termos "peptídeo", "polipeptídeo", "proteína" incluem preferencialmente, por exemplo, lipopeptídeos, lipoproteínas, glicopeptídeos, glicoproteínas e similares.
[0023] Preferencialmente, no entanto, uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo é um peptídeo, polipeptídeo ou proteína "clássico", em que um peptídeo, polipeptídeo ou proteína "clássico" é tipicamente composto de aminoácidos selecionados a partir dos 20 aminoácidos definidos pelo código genético, ligado entre si por uma ligação de peptídeos normal.
[0024] O termo "cadeia pesada" (de um anticorpo ou fragmento de anticorpo), conforme usado neste documento, refere-se a um polipeptídeo que deve ser associado a outro polipeptídeo (a "cadeia leve"). Em particular, a cadeia pesada e a cadeia leve estão associadas por meio de uma ligação de dissulfeto. A cadeia pesada pode compreender um, dois, três ou quatro domínios constantes pesados de anticorpos. Em uma modalidade preferencial, compreende três domínios constantes pesados de anticorpos: CH1, CH2 e CH3, e uma região de dobradiça entre CH1 e CH2. Os referidos domínios constantes de cadeia pesada podem ser derivados de um anticorpo que é murino, quimérico, sintético, humanizado ou humano e monoclonal ou policlonal. A cadeia pesada pode compreender um ou mais domínios variáveis, preferencialmente domínios variáveis de uma cadeia pesada de anticorpo (VH).
[0025] O termo "cadeia leve" (de um anticorpo ou fragmento de anticorpo), conforme usado neste documento, refere-se a um polipeptídeo que deve ser associado a outro polipeptídeo (a "cadeia pesada"). Em particular, a cadeia pesada e a cadeia leve estão associadas por meio de uma ligação de dissulfeto. A cadeia leve pode compreender uma região constante da cadeia leve do anticorpo CL. As referidas regiões constantes de cadeia leve podem ser derivadas de um anticorpo que é murino, quimérico, sintético, humanizado ou humano e monoclonal ou policlonal. A segunda cadeia de polipeptídeos pode compreender um ou mais domínios variáveis, preferencialmente domínios variáveis de uma cadeia leve de anticorpo (VL).
[0026] Em geral, um “anticorpo” é uma proteína que se liga especificamente a um antígeno. Normalmente, um anticorpo compreende uma estrutura única que permite que ele se ligue especificamente ao seu antígeno correspondente, mas - em geral - os anticorpos têm uma estrutura similar e são, em particular, também conhecidos como imunoglobulinas (Ig). Conforme usado neste documento, o termo "anticorpo" abrange várias formas de anticorpos, incluindo, sem estar limitado a, anticorpos inteiros, fragmentos de anticorpos, em particular fragmentos de ligação ao antígeno, anticorpos humanos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos recombinantes e anticorpos geneticamente modificados (variante ou anticorpos mutantes) desde que as propriedades características de acordo com a invenção sejam mantidas. Embora o relatório descritivo, incluindo as reivindicações, possa, em alguns lugares, referir-se explicitamente a fragmento (s) de ligação a antígeno, fragmento (s) de anticorpo, variante (s) e/ou derivado (s) de anticorpos, entende-se que o termo “ anticorpo” inclui todas as categorias de anticorpos, a saber, fragmento (s) de ligação ao antígeno, fragmento (s) de anticorpo, variante (s) e derivado (s) de anticorpos.
[0027] Conforme usado neste documento, os termos "fragmento de ligação ao antígeno", "fragmento" e "fragmento de anticorpo" são usados indistintamente e referem-se a qualquer fragmento de um anticorpo. Em particular, os termos "fragmento de ligação ao antígeno", "fragmento" e "fragmento de anticorpo" referem-se neste documento a qualquer fragmento de um anticorpo que retém (i) a atividade de ligação ao antígeno do anticorpo e/ou (ii) uma funcionalidade adicional fornecida por um domínio funcional (adicional) do anticorpo como descrito neste documento, por exemplo, uma atividade de ligação fornecida por um sítio de ligação (independente). Em fragmentos de anticorpo de acordo com a presente invenção, as propriedades características de acordo com a invenção são mantidas. Em geral, exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, um anticorpo de cadeia única, Fab, Fab’ or F(ab')2. Fragmentos dos anticorpos podem ser obtidos a partir de anticorpos por métodos que incluem digestão com enzimas, tais como pepsina ou papaína, e/ou por clivagem de ligações de dissulfeto por redução química. Alternativamente, os fragmentos dos anticorpos podem ser obtidos por clonagem e expressão de parte das sequências das cadeias pesadas ou leves. Além disso, o termo "anticorpo", conforme usado neste documento, inclui anticorpos e fragmentos de anticorpos.
[0028] O termo "anticorpo humano", conforme usado neste documento, destina-se a incluir anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina humana. Os anticorpos humanos são bem conhecidos no estado da técnica (van Dijk, MA e van de Winkel, JG, Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Os anticorpos humanos também podem ser produzidos em animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo ou uma seleção de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. A transferência do arranjo de genes de imunoglobulina da linha germinativa humana em tais camundongos mutantes da linha germinativa resultará na produção de anticorpos humanos após desafio com antígeno (ver, por exemplo, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551- 2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 3340). Os anticorpos humanos também podem ser produzidos em bibliotecas de exibição de fago (Hoogenboom, HR e Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et ai., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); e Boerner, P., et ai., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Mais preferencialmente, no entanto, os anticorpos monoclonais humanos são preparados pelo método de acordo com a presente invenção como descrito neste documento, que podem ser combinados com a imortalização de células EBV-B melhorada, como descrito em TTraggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. (2004): Um método eficiente para fazer anticorpos monoclonais humanos a partir de células B de memória: neutralização potente do coronavírus SARS. Nat Med. 10 (8): 871-5. O termo "anticorpo humano", conforme usado neste documento, também compreende anticorpos que são modificados para gerar as propriedades de acordo com a invenção, conforme descrito neste documento.
[0029] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser fornecidos na forma purificada. Consequentemente, o anticorpo de acordo com a presente invenção, ou o fragmento de anticorpo, pode ser um anticorpo purificado ou fragmento de anticorpo. Normalmente, o anticorpo estará presente em uma composição que é substancialmente livre de outros polipeptídeos, por exemplo, onde menos de 90% (em peso), geralmente menos de 60% e mais geralmente menos de 50% da composição é feita de outros polipeptídeos.
[0030] Conforme usado neste documento, o termo "domínio variável" (também referido como "região variável"; domínio variável de uma cadeia leve (VL), domínio variável de uma cadeia pesada (VH)) refere-se ao domínio de um anticorpo, ou fragmento de anticorpo, que é o domínio N- terminal em anticorpos clássicos de ocorrência natural, tipicamente o domínio que fornece a maior variabilidade em anticorpos clássicos de ocorrência natural, e que está envolvido diretamente na ligação do anticorpo ao antígeno. Normalmente, os domínios de cadeias leves e pesadas humanas variáveis têm a mesma estrutura geral e cada domínio que compreende regiões estruturais (FR) cujas sequências são amplamente conservadas (em particular quatro regiões estruturais (FR)) e três "regiões hipervariáveis" ou regiões determinantes de complementaridade, CDRs (em particular três “regiões hipervariáveis”/CDRs). As regiões de estrutura normalmente adotam uma conformação de folha β e os CDRs podem formar alças conectando a estrutura de folha β. As CDRs em cada cadeia são geralmente mantidas em sua estrutura tridimensional pelas regiões de estrutura e formam, juntamente com os CDRs da outra cadeia, o sítio de ligação ao antígeno.
[0031] Conforme usado neste documento, o termo "região hipervariável" refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável compreende as “regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs”. As regiões de "estrutura" ou "FR" são aquelas regiões de domínio variável, diferentes dos resíduos da região hipervariável, conforme definido neste documento. As regiões de CDR e de FR podem ser determinadas de acordo com a definição padrão de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Normalmente, em particular em anticorpos IgG monoespecíficos nativos, os três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) são organizados de forma não consecutiva no domínio variável. Em outras palavras, as CDRs na cadeia pesada e/ou leve podem ser separadas, por exemplo, por regiões estruturais, em que uma região estrutural (FR) é uma região no domínio variável que é menos "variável" do que a CDR. Por exemplo, em um anticorpo, um domínio variável (ou cada domínio variável, respectivamente) pode compreender preferencialmente quatro regiões estruturais, separadas por três CDRs. Em particular, um domínio variável de um anticorpo (domínio variável de cadeia leve ou pesada VH ou VL) compreende do terminal N ao C os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As CDRs em cada cadeia são separadas por tais aminoácidos estruturais. Normalmente, as três CDRs de uma cadeia pesada e as três CDRs da cadeia leve conectadas formam juntas o sítio de ligação ao antígeno (paratopo). Em outras palavras, uma vez que, em particular, em sítios de ligação ao antígeno de anticorpos IgG monoespecíficos nativos, são tipicamente compostos de dois domínios variáveis, existem seis CDRs para cada sítio de ligação ao antígeno (cadeia pesada: CDRH1, CDRH2 e CDRH3; cadeia leve: CDRL1, CDRL2 e CDRL3). Um único anticorpo, em particular um único anticorpo IgG monoespecífico nativo, geralmente tem dois sítios de ligação ao antígeno (idênticos) e, portanto, contém doze CDRs (ou seja, 2 x seis CDRs).
[0032] Devido à sua "multiespecificidade", ou seja, os diferentes sítios de ligação ao antígeno, a cadeia pesada e/ou a cadeia leve de anticorpos multiespecíficos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, podem (cada) compreender mais de três CDRs, em particular mais de três CDRs diferentes. Por exemplo, um anticorpo multiespecífico, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, pode compreender pelo menos dois domínios variáveis diferentes, em que cada um dos referidos pelo menos dois domínios variáveis diferentes é derivado de um anticorpo monoespecífico diferente, por exemplo, do tipo IgG. Uma vez que tal anticorpo monoespecífico compreende tipicamente três CDRs na cadeia pesada e três CDRs na cadeia leve formando o sítio de ligação ao antígeno, um anticorpo multiespecífico pode compreender, em particular, três CDRs de uma cadeia pesada de um primeiro anticorpo e três CDRs de uma cadeia leve de um primeiro anticorpo, três CDRs de uma cadeia pesada de um segundo anticorpo e três CDRs de uma cadeia leve de um segundo anticorpo, opcionalmente três CDRs de uma cadeia pesada de um terceiro anticorpo e três CDRs de uma cadeia leve de um terceiro anticorpo etc.
Assim, o número de CDRs compreendidas por uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve de um anticorpo multiespecífico é preferencialmente um múltiplo de três, por exemplo três, seis, nove, doze, etc.
É, portanto, também preferencial que a soma das CDRs compreendidas por ambas cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo multiespecífico seja um múltiplo de seis, por exemplo seis, doze, dezoito, etc.
Uma vez que um "sítio de ligação ao antígeno" é tipicamente caracterizado pelos CDRs, ou seja, CDRH1, CDRH2 e CDRH3, bem como CDRL1, CDRL2 e CDRL3, é preferencial em anticorpos multiespecíficos que as CDRs sejam organizadas de tal forma, que a ordem (por exemplo, CDRH1, CDRH2 e CDRH3 e/ou CDRL1, CDRL2 e CDRL3 derivados do mesmo anticorpo monoespecífico) é mantida para preservar o sítio de ligação do antígeno, ou seja, para preservar a capacidade de se ligar especificamente a um determinado sítio no antígeno.
Isso significa que, por exemplo, a ordem de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 derivada de um primeiro anticorpo monoespecífico em um trecho de aminoácido é preferencialmente não interrompida por qualquer CDR derivada de um segundo anticorpo monoespecífico.
É importante ressaltar que se o anticorpo multipecífico compreende sítios de ligação ao antígeno derivados de pelo menos dois anticorpos monoespecíficos diferentes, as CDRs ou domínios variáveis desses anticorpos monoespecíficos são dispostos no anticorpo multipecífico de modo que o "receptor de antígeno" de cada anticorpo monoespecífico a partir do qual as CDRs (ou regiões variáveis) são derivadas, é preservada, ou seja, sua capacidade de se ligar especificamente a um determinado sítio no antígeno é preservada.
[0033] No contexto da presente invenção, um domínio variável pode ser qualquer domínio variável (em particular, VH e/ou VL) de um anticorpo de ocorrência natural ou um domínio variável pode ser um domínio variável modificado/projetado. Domínios variáveis modificados/projetados são conhecidos no estado da técnica. Normalmente, os domínios variáveis são modificados/projetados para excluir ou adicionar uma ou mais funções, por exemplo, "germinando" mutações somáticas ("removendo" mutações somáticas) ou humanizando.
[0034] Conforme usado neste documento, o termo "domínios constantes" refere-se a domínios de um anticorpo que não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras. Normalmente, uma cadeia pesada compreende três ou quatro domínios constantes, dependendo da classe de imunoglobulina: CH1, CH2, CH3 e, opcionalmente, CH4 (na direção do terminal N-C). Portanto, a região constante de uma cadeia pesada é tipicamente formada (na direção do terminal N para C) por: CH1 - dobradiça (polipeptídeo flexível que compreende os aminoácidos entre o primeiro e o segundo domínios constantes da cadeia pesada) - CH2 - CH3 (- CH4). Uma cadeia leve normalmente compreende apenas um único domínio constante, referido como CL, que normalmente também forma a região constante da cadeia leve. No contexto da presente invenção, um domínio constante pode ser qualquer domínio constante (em particular, CL, CH1, CH2, CH3 e/ou CH4) de um anticorpo de ocorrência natural ou um domínio constante pode ser um domínio constante modificado/projetado. Domínios constantes modificados/projetados são conhecidos no estado da técnica. Normalmente, os domínios constantes são modificados/projetados para excluir ou adicionar uma ou mais funções, por exemplo, no contexto da funcionalidade da região Fc. Dependendo da sequência de aminoácidos da região constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos ou imunoglobulinas são divididos nas classes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e vários deles podem ser divididos em subclasses, por exemplo, IgG1,
IgG2, IgG3 e IgG4, IgA1 e IgA2. As regiões constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamadas α, ε, γ e μ, respectivamente. Os anticorpos de acordo com a invenção são preferencialmente do tipo IgM ou IgG. Ao contrário da IgG, a IgM não contém uma região de dobradiça, mas contém um domínio constante adicional e um arremate de 18 aminoácidos no terminal carboxi, que contém uma cisteína e está envolvida na multimerização da molécula.
[0035] Em geral, os anticorpos podem ser de qualquer isotipo (por exemplo, IgA, IgG, IgM, ou seja, uma cadeia pesada α, γ ou µ), mas serão preferencialmente IgM ou IgG. Dentro do isotipo IgG, os anticorpos podem ser da subclasse IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, em que IgG1 é o preferencial. Os anticorpos podem ter uma cadeia leve κ ou λ.
[0036] Conforme usado neste documento, o termo "anticorpo recombinante" pretende incluir todos os anticorpos, que não ocorrem na natureza, por exemplo, anticorpos produzidos por células B manipuladas de acordo com o método da presente invenção.
[0037] Conforme usado neste documento, o termo "multiespecífico" no contexto de um anticorpo, ou fragmento de anticorpo, refere-se à capacidade do anticorpo ou fragmento de anticorpo de se ligar a pelo menos dois epítopos diferentes, por exemplo, em antígenos diferentes ou no mesmo antígeno. Assim, termos como "biespecífico", “triespecífico","tetrasspecífico” etc. referem-se ao número de epítopos diferentes aos quais o anticorpo pode se ligar. Por exemplo, os anticorpos tipo IgG monoespecíficos convencionais têm dois sítios de ligação ao antígeno idênticos (paratopos) e podem, portanto, ligar-se apenas a epítopos idênticos (mas não a epítopos diferentes). Um anticorpo multiespecífico, em contraste, tem pelo menos dois tipos diferentes de paratopos/sítios de ligação e pode, assim, ligar-se a pelo menos dois epítopos diferentes. Conforme usado neste documento, "paratopo" refere-se a um sítio de ligação ao antígeno do anticorpo. Além disso, uma única "especificidade" pode se referir a um, dois,
três ou mais paratopos idênticos em um único anticorpo (o número real de paratopos/sítios de ligação em uma única molécula de anticorpo é referido como "valência"). Por exemplo, um único anticorpo IgG nativo é monoespecífico e bivalente, uma vez que possui dois paratopos idênticos. Consequentemente, um anticorpo multiespecífico compreende pelo menos dois paratopos/sítios de ligação (distintos). Assim, o termo "anticorpos multiespecíficos" refere-se a anticorpos com mais de um paratopo e a capacidade de se ligar a dois ou mais epítopos diferentes. O termo "anticorpos multiespecíficos" compreende, em particular, anticorpos biespecíficos conforme definido acima, mas tipicamente também proteína, por exemplo, anticorpo, estruturas, que se ligam em particular a três ou mais epítopos distintos, ou seja, anticorpos com três ou mais paratopos/sítios de ligação.
[0038] Em particular, o anticorpo multiespecífico, ou o fragmento de anticorpo, pode compreender dois ou mais paratopos/sítios de ligação, em que alguns paratopos/sítios de ligação podem ser idênticos de modo que todos os paratopos/sítios de ligação do anticorpo pertençam a pelo menos dois tipos diferentes de paratopos/sítios de ligação e, portanto, o anticorpo tem pelo menos duas especificidades. Por exemplo, o anticorpo multiespecífico ou fragmento de anticorpo pode compreender quatro paratopos/sítios de ligação, em que cada dois paratopos/sítios de ligação são idênticos (ou seja, têm a mesma especificidade) e, assim, o anticorpo ou fragmento do mesmo é biespecífico e tetravalente (dois paratopos idênticos/sítios de ligação para cada uma das duas especificidades). Assim, "uma especificidade" refere-se em particular a um ou mais paratopos/sítios de ligação exibindo a mesma especificidade (o que normalmente significa que um ou mais paratopos/sítios de ligação são idênticos) e, assim, "duas especificidades" podem ser realizadas por dois, três, quatro, cinco, seis ou mais paratopos/sítios de ligação, desde que se refiram a apenas duas especificidades. Alternativamente, um anticorpo multiespecífico pode compreender um único paratopo/sítio de ligação para cada (de pelo menos duas) especificidade, isto é, o anticorpo multiespecífico compreende no total pelo menos dois paratopos/sítios de ligação. Por exemplo, um anticorpo biespecífico compreende um único paratopo/sítio de ligação para cada uma das duas especificidades, isto é, o anticorpo compreende no total dois paratopos/sítios de ligação. É também preferencial que o anticorpo compreenda dois paratopos/sítios de ligação (idênticos) para cada uma das duas especificidades, isto é, o anticorpo compreende no total quatro paratopos/sítios de ligação. Preferencialmente, o anticorpo compreende três paratopos/sítios de ligação (idênticos) para cada uma das duas especificidades, isto é, o anticorpo compreende no total seis paratopos/sítios de ligação.
[0039] Conforme usado neste documento, o termo "antígeno" se refere a qualquer substância estrutural que serve como um alvo para os receptores de uma resposta imunológica adaptativa, em particular como um alvo para anticorpos, receptores de células T e/ou receptores de células B. Um “epítopo”, também conhecido como “ determinante antigênico”, é a parte (ou fragmento) de um antígeno que é reconhecido pelo sistema imunológico, em particular por anticorpos, receptores de células T e/ou receptores de células B. Assim, um antígeno possui pelo menos um epítopo, ou seja, um único antígeno possui um ou mais epítopos. Um antígeno pode ser (i) um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína, (ii) um polissacarídeo, (iii) um lipídeo, (iv) uma lipoproteína ou um lipopeptídeo, (v) um glicolipídeo, (vi) um ácido nucleico, ou (vii) um fármaco de molécula pequena ou uma toxina. Assim, um antígeno pode ser um peptídeo, uma proteína, um polissacarídeo, um lipídeo, uma combinação dos mesmos incluindo lipoproteínas e glicolipídeos, um ácido nucleico (por exemplo, DNA, siRNA, shRNA, oligonucleotídeos antisense, DNA decoy, plasmídeo) ou um fármaco de molécula pequena (por exemplo, ciclosporina A, paclitaxel, doxorrubicina, metotrexato, ácido 5-aminolevulínico) ou qualquer combinação dos mesmos. Preferencialmente, o antígeno é selecionado a partir de (i) um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína, (ii) um polissacarídeo, (iii) um lipídeo, (iv) uma lipoproteína ou um lipopeptídeo e
(v) um glicolipídeo; mais preferencialmente, o antígeno é um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína.
[0040] O termo "sítio de ligação ao antígeno", conforme usado neste documento, refere-se à parte do anticorpo que compreende a área que se liga especificamente a e é complementar a parte ou a totalidade de um antígeno. Quando um antígeno é grande, um anticorpo pode se ligar apenas a uma parte específica do antígeno, parte essa que é denominada "epítopo". Normalmente, dois domínios variáveis, em particular um domínio variável de cadeia pesada VH e um domínio variável de cadeia leve VL, se associam para formar um sítio de ligação ao antígeno. Em particular, o sítio de ligação ao antígeno é formado pelas três CDRs do domínio variável da cadeia pesada e pelas três CDRs do domínio variável da cadeia leve juntas, isto é, por seis CDRs, como descrito acima.
[0041] O termo "ligação específica" e referência similar não abrange colagem não específica.
[0042] O termo "ligante" (também denominado "espaçador"), conforme usado neste documento, refere-se a um peptídeo adaptado para conectar domínios distintos de um polipeptídeo ou proteína, como um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Os ligantes são conhecidos no estado da técnica e descritos em detalhes, por exemplo, em Reddy Chichili VP, Kumar V, Sivaraman J. Linkers in the structural biology of protein–protein interactions. Protein Science : A Publication of the Protein Society. 2013;22(2):153-167). Normalmente, os ligantes são projetados de forma que não afetem a funcionalidade. Em particular, um ligante não se liga especificamente a um alvo. Um ligante pode conter quaisquer aminoácidos, os aminoácidos glicina (G) e serina (S) podem ser preferenciais. Preferencialmente, o ligante é composto pelos aminoácidos glicina (G) e serina (S) ("GS-ligante"). Se dois ou mais ligantes ocorrerem em um polipeptídeo ou proteína, os ligantes podem ser iguais ou diferentes uns dos outros. Além disso, o ligante pode ter um comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos.
[0043] Conforme usado neste documento, o termo "ácido nucleico ou molécula de ácido nucleico" destina-se a incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de fita simples (ss) ou de fita dupla (ds).
[0044] Conforme usado neste documento, os termos "célula", "linhagem de células" e "cultura de células" são usados indistintamente e todas essas designações incluem progênie. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula do indivíduo primário e culturas derivadas dela, independentemente do número de transferências. Também se entende que toda a progênie pode não ser precisamente idêntica no conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. A progênie variante que tem a mesma função ou atividade biológica como rastreada na célula originalmente transformada está incluída. Onde designações distintas são pretendidas, será claro a partir do contexto.
[0045] Conforme usado neste documento, "variante de sequência" (também referida como "variante") refere-se a qualquer alteração em uma sequência de referência, em que uma sequência de referência é qualquer uma das sequências listadas nas "Tabelas de Sequências e Números de SEQ ID" (listagem de sequência), ou seja, SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 115 Assim, o termo "variante de sequência" inclui variantes de sequência de nucleotídeos e variantes de sequência de aminoácidos. De notar, as variantes de sequência referidas neste documento são, em particular, variantes de sequência funcional, isto é, variantes de sequência que mantêm a função biológica da sequência de referência. Por exemplo, a funcionalidade do (poli) peptídeo de interesse (tendo, por exemplo, uma funcionalidade de ligação) a sequência intrônica (por exemplo, tendo uma funcionalidade de sítio de emenda e/ou uma funcionalidade de intensificador de emenda) pode ser mantida. As variantes de sequência preferenciais são, portanto, variantes de sequência (funcionais) com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com uma sequência de referência. A frase "variante de sequência desta tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 96 %, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência ”, conforme usado neste documento, significa que quanto maior a % de identidade de sequência, mais preferencial é a variante de sequência. Em outras palavras, a frase "variante de sequência desta tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência ”, significa em particular que a variante de sequência tem pelo menos 70% de identidade de sequência, preferencialmente pelo menos 75% de identidade de sequência, preferencialmente pelo menos 80% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 85% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 88% de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 90% de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 92% de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 95% identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 96% de identidade de sequência, particularmente preferencialmente pelo menos 97% de identidade de sequência, particularmente preferencialmente pelo menos 98% de identidade de sequência e mais preferencialmente pelo menos 99% de identidade de sequência com a respectiva sequência de referência.
[0046] A identidade da sequência é geralmente calculada em relação ao comprimento total da sequência de referência (ou seja, a sequência citada na aplicação). A porcentagem de identidade, conforme usado neste documento, pode ser determinada, por exemplo, usando BLAST usando os parâmetros padrão especificados pelo NCBI (o Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matriz; penalidade de intervalo aberto = 11 e penalidade de extensão de intervalo = 1].
[0047] Conforme usado neste documento, uma "variante de sequência de nucleotídeos" tem uma sequência alterada na qual um ou mais dos nucleotídeos na sequência de referência são deletados, ou substituídos, ou um ou mais nucleotídeos são inseridos na sequência da sequência de nucleotídeos de referência. Os nucleotídeos são referidos neste documento pela designação padrão de uma letra (A, C, G ou T). Devido à degenerescência do código genético, uma "variante da sequência de nucleotídeos" pode resultar em uma alteração na respectiva sequência de aminoácidos de referência, ou seja, em uma "variante da sequência de aminoácidos" ou não. As variantes de sequência preferenciais são essas variantes de sequência de nucleotídeos, que não resultam em variantes de sequência de aminoácidos (mutações silenciosas), mas outras mutações não silenciosas também estão dentro do escopo, em particular sequências de nucleotídeos mutantes, que resultam em uma sequência de aminoácidos, que pode ser pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% de sequência idêntica à sequência de referência.
[0048] Uma "variante de sequência de aminoácidos" tem uma sequência alterada na qual um ou mais dos aminoácidos na sequência de referência são excluídos ou substituídos, ou um ou mais aminoácidos são inseridos na sequência da sequência de aminoácidos de referência. Como resultado das alterações, a variante de sequência de aminoácidos tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à sequência de referência, preferencialmente, pelo menos 90% idêntica, mais preferencialmente pelo menos 95% idêntica, mais preferencialmente pelo menos 99 % idêntica à sequência de referência. As sequências variantes que são pelo menos 90% idênticas não têm mais do que 10 alterações, isto é,
qualquer combinação de deleções, inserções ou substituições, por 100 aminoácidos da sequência de referência.
[0049] Embora seja possível ter substituições de aminoácidos não conservativas, é preferencial que as substituições sejam substituições de aminoácidos conservativas, nas quais o aminoácido substituído tem propriedades estruturais ou químicas similares com o aminoácido correspondente na sequência de referência. A título de exemplo, as substituições de aminoácidos conservativas envolvem a substituição de um aminoácido alifático ou hidrofóbico, por exemplo, alanina, valina, leucina e isoleucina, por outro; substituição de um aminoácido contendo hidroxila, por exemplo, serina e treonina, por outro; substituição de um resíduo ácido, por exemplo, ácido glutâmico ou ácido aspártico, por outro; substituição de um resíduo contendo amida, por exemplo, asparagina e glutamina, por outro; substituição de um resíduo aromático, por exemplo, fenilalanina e tirosina, por outro; substituição de um resíduo básico, por exemplo, lisina, arginina e histidina, por outro; e substituição de um pequeno aminoácido, por exemplo, alanina, serina, treonina, metionina e glicina, por outro.
[0050] As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões de terminal amino e/ou carboxila variando em comprimento de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intra-sequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem a fusão ao terminal N ou C de uma sequência de aminoácidos a uma molécula repórter ou uma enzima.
[0051] É importante ressaltar que as alterações nas variantes de sequência não abolem a funcionalidade da respectiva sequência de referência, no presente caso, por exemplo, a funcionalidade de uma sequência de um anticorpo, ou fragmento de anticorpo, para se ligar a seus antígenos e/ou a funcionalidade adicional fornecido pelo domínio funcional, por exemplo, para se ligar a um alvo de um sítio de ligação (independente). A orientação na determinação de quais nucleotídeos e resíduos de aminoácidos,
respectivamente, podem ser substituídos, inseridos ou deletados sem abolir tal funcionalidade são encontradas usando programas de computador bem conhecidos no estado da técnica.
[0052] Conforme usado neste documento, uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência de aminoácidos "derivada de" um ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína designada refere-se à origem do ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Preferencialmente, a sequência de ácido nucleico ou sequência de aminoácidos que é derivada de uma sequência particular tem uma sequência de aminoácidos que é essencialmente idêntica àquela sequência ou uma porção dela, a partir da qual é derivada, em que "essencialmente idêntica" inclui variantes de sequência, conforme definido acima. Preferencialmente, a sequência de ácido nucleico ou sequência de aminoácidos que é derivada de um peptídeo ou proteína particular, é derivada do domínio correspondente no peptídeo ou proteína particular. Desse modo, "correspondente" refere-se em particular à mesma funcionalidade. Por exemplo, um "domínio extra de células" corresponde a outro "domínio extra de células" (de outra proteína), ou um "domínio transmembrana" corresponde a outro "domínio transmembrana" (de outra proteína). As partes "correspondentes" de peptídeos, proteínas e ácidos nucleicos são, portanto, facilmente identificáveis para um versado no estado da técnica. Da mesma maneira, as sequências "derivadas de" outra sequência são geralmente facilmente identificáveis para um versado no estado da técnica como tendo sua origem na sequência.
[0053] Preferencialmente, uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência de aminoácidos derivada de outro ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode ser idêntica ao ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína de partida (da qual é derivada). No entanto, uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência de aminoácidos derivada de outro ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína também pode ter uma ou mais mutações em relação ao ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína de partida (da qual é derivado), em em particular, uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência de aminoácido derivada de outro ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode ser uma variante de sequência funcional como descrito acima do ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína de partida (da qual é derivado). Por exemplo, em um peptídeo/proteína, um ou mais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos ou um ou mais resíduos de aminoácidos podem ser inseridos ou deletados.
[0054] Conforme usado neste documento, o termo "mutação" se refere a uma alteração na sequência de ácido nucleico e/ou na sequência de aminoácidos em comparação com uma sequência de referência, por exemplo, uma sequência genômica correspondente Uma mutação (por exemplo, em comparação com uma sequência genômica) pode ser, por exemplo, uma mutação somática (de ocorrência natural), uma mutação espontânea, uma mutação induzida, por exemplo, induzida por enzimas, produtos químicos ou radiação, ou uma mutação obtida por mutagênese direcionada ao sítio (métodos de biologia molecular para fazer alterações específicas e intencionais na sequência de ácido nucleico e/ou na sequência de aminoácidos). Assim, os termos "mutação" ou "mutante" devem ser entendidos como também incluindo fisicamente fazer uma mutação, por exemplo, em uma sequência de ácido nucleico ou em uma sequência de aminoácidos. Uma mutação inclui substituição, deleção e inserção de um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, bem como inversão de vários (dois ou mais) nucleotídeos ou aminoácidos sucessivos. Para conseguir uma mutação em uma sequência de aminoácidos, preferencialmente, uma mutação pode ser introduzida na sequência de nucleotídeos que codifica a referida sequência de aminoácidos para expressar um polipeptídeo mutado (recombinante). Uma mutação pode ser conseguida, por exemplo, alterando, por exemplo, mutagênese direcionada ao sítio, um códon de uma molécula de ácido nucleico que codifica um aminoácido para resultar em um códon que codifica um aminoácido diferente ou sintetizando uma variante de sequência, por exemplo, conhecendo a sequência de nucleotídeos de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo e designando a síntese de uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma variante do polipeptídeo sem a necessidade de mutação de um ou mais nucleotídeos de uma molécula de ácido nucleico.
[0055] Conforme usado neste documento, os termos "a montante" e "a jusante" referem-se a posições relativas no DNA ou RNA. Cada fita de DNA ou RNA tem uma extremidade 5’ e uma extremidade 3' (nomeada para a posição do carbono no anel de desoxirribose ou ribose). Por convenção, a montante e a jusante referem-se à direção 5‘ para 3' em que ocorre a transcrição do RNA. A montante está em direção à extremidade 5’ da molécula de RNA e a jusante está em direção à extremidade 3'. No DNA de fita dupla, a montante está em direção à extremidade 5‘ da fita de codificação para o éxon de interesse e a jusante está em direção à extremidade 3'. Devido à natureza anti-paralela do DNA, isso significa que a extremidade 3’ da fita molde está a montante do gene e a extremidade 5' está a jusante.
[0056] O termo "doença", como usado no contexto da presente invenção, destina-se a ser geralmente sinônimo e é usado alternadamente com os termos "distúrbio" e "condição"(como na condição médica), na medida em que todos refletem uma condição anormal do corpo humano ou animal ou de uma de suas partes que prejudica o funcionamento normal, é tipicamente manifestada distinguindo sinais e sintomas distintos e faz com que o ser humano ou animal tenham uma duração ou qualidade de vida reduzida.
[0057] Vários documentos são citados ao longo do texto deste relatório descritivo. Cada um dos documentos citados neste documento (incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, especificações do fabricante, instruções, etc.), sejam supra ou infra, são incorporados neste documento por referência em sua totalidade. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem o direito de anteceder tal divulgação em virtude da invenção anterior.
[0058] Deve ser entendido que esta invenção não está limitada às metodologias, protocolos e reagentes específicos descritos neste documento, pois estes podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste documento tem o propósito de descrever modalidades particulares apenas, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm os mesmos significados como comumente entendidos por alguém versado na técnica. Método para editar o genoma de um linfócito B
[0059] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um método para editar o genoma de um linfócito B isolado, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (i) ativa da citidina desaminase induzida por ativação endógena do linfócito B; e (ii) introduzir uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse no linfócito B.
[0060] "Editar o genoma" destina-se a inserir, deletar ou alterar um gene (de ocorrência natural) ou lócus de gene de interesse, em particular para produzir uma célula B com especificidade e/ou função alterada. Consequentemente, pelo método da presente invenção, um linfócito B projetado pode ser obtido, em que o genoma do linfócito B compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse. Preferencialmente, o lócus de gene de interesse, que é editado de acordo com a presente invenção, é um lócus de gene de imunoglobulina, isto é, um lócus de gene que codifica uma cadeia de polipeptídeos de imunoglobulina (anticorpo). Preferencialmente, o método da invenção fornece células B manipuladas (nas quais um lócus do gene de imunoglobulina foi editado) para produzir (e segregar) anticorpos recombinantes (customizados). Consequentemente, a presente invenção fornece preferencialmente um método para editar um lócus do gene de imunoglobulina no genoma de uma célula B isolada compreendendo as etapas conforme descrito neste documento.
[0061] Os termos "linfócito B" e "célula B" são usados indistintamente. Em geral, um “linfócito B” é um tipo de glóbulos brancos do subtipo de linfócito. A principal função de um linfócito B é secretar anticorpos. Consequentemente, os linfócitos B pertencem ao componente humoral do sistema imunológico adaptativo. Além disso, os linfócitos B podem apresentar antígenos e secretar citocinas. Em contraste com as outras duas classes de linfócitos, células T e células exterminadoras naturais, os linfócitos B expressam receptores de células B (BCRs) em sua membrana de células. Os BCRs permitem que a célula B se ligue a um antígeno específico, contra o qual iniciará uma resposta de anticorpo.
[0062] Em geral, o linfócito B pode ser de qualquer espécie. Em algumas modalidades, o linfócito B é um linfócito B de mamífero. Preferencialmente, o linfócito B é um linfócito B humano. Portanto, em algumas modalidades, o linfócito B não é um linfócito B de galinha ou um linfócito B de murino. Em particular, o lócus de IgL do linfócito B é preferencialmente não deletado.
[0063] Em geral, o termo linfócito B "isolado" refere-se a um linfócito B, que não faz parte do corpo humano ou animal. Em particular, o linfócito B isolado pode ser um linfócito B primário ou (um linfócito B de) uma linhagem de células B.
[0064] Uma linhagem de células é tipicamente contínua (ou seja, pode proliferar indefinidamente), em particular devido ao tumor ou imortalização artificial, por exemplo, vírus de Epstein-Barr (EBV) -imortalização. As linhagens de células B estão disponíveis comercialmente, por exemplo Ramos (ATCC®-CRL-1596) ou SKW 6.4 (ATCC®TIB-125). Em particular, um linfócito B da linhagens de células B tem a capacidade de ativar sua citidina desaminase induzida por ativação endógena (AID). Alternativamente, um linfócito B da linhagens de células B pode ter atividade constitutiva de sua citidina desaminase induzida por ativação endógena (AID), como a linhagens de células RAMOS B (por exemplo, Ramos RA1 (ATCC®-CRL-1596)).
[0065] Mais preferencialmente, o linfócito B isolado é um linfócito B primário. Linfócitos B “primários” são isolados de tecido vivo e estabelecidos para cultura in vitro. Em contraste com as linhagens de células contínuas (tumorais ou imortalizadas artificialmente), as células “primárias” são isoladas “recentemente”, ou seja, sofreram apenas muito poucas divisões de células in vitro. Normalmente, as células primárias têm uma vida útil finita, ou seja, não são “imortalizadas” como as linhagens de células. Em particular, as células primárias não foram modificadas de nenhuma forma (exceto para dissociação enzimática e/ou física necessária para extrair as células de seu tecido de origem).
[0066] As células B primárias podem ser isoladas do sangue ou do tecido linfóide, como medula óssea, timo, baço e/ou nódulos linfáticos. Normalmente, as células B são isoladas de uma amostra (isolada) de um indivíduo. A amostra é, por exemplo, sangue ou tecido linfóide, como medula óssea, timo, baço e/ou nódulos linfáticos. Por exemplo, a célula B é isolada de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), medula óssea ou baço.
[0067] Métodos para isolar linfócitos B primários são conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, as células B podem ser isoladas por citometria de fluxo, isolamento magnético de células e separação de células (MACS), RosetteSep ou seleção de anticorpos. Uma ou mais técnicas de isolamento podem ser utilizadas a fim de fornecer linfócitos B isolados com pureza, viabilidade e rendimento suficientes. Preferencialmente, as células B primárias são isoladas por MACS ou RosetteSep. Por exemplo, as células B podem ser isoladas, em particular a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), por seleção magnética de células. Para este fim, por exemplo, microesferas anti-CD19 podem ser usadas, por exemplo, como disponíveis em Miltenyi Biotec.
[0068] Preferencialmente, a pureza dos linfócitos B isolados (primários) é de pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% ou mais. Além disso, é preferencial que as células B isoladas (primárias) sejam pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais viáveis. Opcionalmente, após o isolamento, os linfócitos B primários podem ser expandidos em cultura.
[0069] Em uma modalidade preferencial, os linfócitos B primários são isolados de um (amostra isolada de um) paciente. Após a manipulação, as células B podem ser administradas ao mesmo paciente (do qual elas ou suas células progenitoras foram isoladas). Essas células B podem ser referidas como células B "autólogas". Desta maneira, um paciente pode produzir anticorpos personalizados in vivo (“por si mesmo”). Alternativamente, as células B manipuladas podem ser usadas para estabelecer uma linhagem de célulasm B (imortalizada), por exemplo, para a produção in vitro de anticorpos personalizados.
[0070] Em uma primeira etapa da edição do genoma do linfócito B isolado, uma citidina desaminase induzida por ativação endógena do linfócito B é ativada. Várias maneiras de ativar a citidina desaminase induzida por ativação de um linfócito B são conhecidas no estado da técnica e descritas neste documento abaixo em mais detalhes. Desse modo, rupturas de fita dupla (DSBs) no DNA genômico são induzidas, em particular na região de troca de um lócus do gene de imunoglobulina. Em geral, a citidina desaminase induzida por ativação (também conhecida como "AID" ou "AICDA") é uma enzima que cria mutações no DNA por desaminação de uma base de citosina, transformando assim a citosina em uracila. AID é reconhecida como “regulador mestre” da diversificação de anticorpos secundários, uma vez que medeia hipermutação somática (SHM), recombinação de troca de classe (CSR) e conversão de gene (GC). Em particular, AID medeia a clivagem de DNA da região de troca (também referida como "região S") em um lócus do gene de imunoglobulina em CSR. Uma região de troca é uma região de sequências de DNA repetitivas em um lócus do gene de imunoglobulina, em particular localizado a montante de uma porção do gene CH.
[0071] CSR ocorre entre duas regiões de troca, localizadas a montante de cada porção do gene CH, excisando o DNA interveniente ("círculo de troca") e justapondo a região variável com a porção do gene CH a jusante. A AID afeta a desaminação da citosina, resultando em dU, que é então removido pela ação combinada da uracila-N-glicosilase (UNG) e da apirimidínica endonuclease (APE1), causando uma quebra de DNA de fita simples (SSB). Quando SSBs estão próximos em fitas de DNA opostas, rupturas de fita dupla (DSBs) são formadas. Os DSBs também podem ser formados por meio da ação da via de reparo de incompatibilidade (MMR) por “processamento de extramidade”. Após a formação de DSBs em duas regiões de troca, as “extremidades” restantes do DNA são unidas e a recombinação ocorre através das vias clássicas de junção de extremidade não homóloga (C-NHEJ) ou de junção de extremidade alternativa (A-EJ).
[0072] O termo "endógeno" significa que a citidina desaminase induzida por ativação se origina de dentro do linfócito B. Em particular, a citidina desaminase induzida por ativação é expressa com base no gene endógeno que codifica a citidina desaminase induzida por ativação (isto é, não por meio de uma construção introduzida na célula B). Consequentemente, a citidina desaminase induzida por ativação é expressa pelo linfócito B. Assim, não há necessidade de introduzir uma nuclease (exógena) (ou um ácido nucleico, vetor ou vírus que codifica ou expressa tal nuclease) na célula B. Em vez disso, as rupturas no DNA genômico são realizadas pela própria maquinaria da célula B, que só é ativada de acordo com a presente invenção. Em particular, o método da invenção normalmente não envolve a introdução de uma nuclease (ou um ácido nucleico que codifica uma nuclease ou outro meio exógeno para codificação e/ou expressão de uma nuclease) na célula B.
[0073] Após a ativação da citidina desaminase induzida por ativação do linfócito B, uma molécula de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse é introduzida na célula B em uma etapa adicional (etapa (ii)) do método de acordo com o presente invenção. Consequentemente, a etapa (ii) do método de acordo com a presente invenção é tipicamente realizada após a etapa (i). Em particular, a citidina desaminase induzida por ativação endógena da célula B é ativada antes de uma molécula de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse ser introduzida na célula B.
[0074] Consequentemente, o linfócito B é transfectado com uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse. Em geral, o termo "transfecção" refere-se à introdução de moléculas de ácido nucleico, como moléculas de DNA ou RNA, em células, preferencialmente em células eucarióticas. No contexto da presente invenção, o termo "transfecção" abrange qualquer método conhecido pelo versado na técnica para a introdução de uma molécula de DNA em um linfócito B. Tais métodos abrangem, por exemplo, métodos virais e não virais de transfecção. Os vírus que podem ser usados para a transferência de genes incluem retrovírus (incluindo lentivírus), vírus herpes simplex, adenovírus e vírus adeno-associados (AAV). No entanto, em algumas modalidades, o linfócito B não é transduzido com um retrovírus. Além disso, as nanopartículas também podem ser usadas para transfecção. Outros métodos de transfecção não viral incluem muitos métodos químicos e físicos. Métodos de transfecção química incluem lipofecção, por exemplo, com base em lipídeos catiônicos e/ou lipossomas, precipitação de fosfato de cálcio ou transfecção com base em polímeros catiônicos, tais como DEAE-dextrano ou polietilenimina (PEI) etc. Os métodos de transfecção física incluem eletroporação, transferência de genes balística (introduz partículas revestidas com DNA nas células), microinjeção (transferência de DNA através de microcapilares para as células) e nucleofecção. Preferencialmente, a introdução da molécula de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse no linfócito B é não viral. Mais preferencialmente, o DNA é introduzido por nucleofecção.
[0075] Um (poli) peptídeo de interesse pode ser qualquer (poli) peptídeo, que é considerado para ser expresso como uma (parte de) um anticorpo customizado. Os (poli) peptídeos de interesse preferenciais são descritos a seguir com mais detalhes.
[0076] O método para editar o genoma de um linfócito B isolado de acordo com a presente invenção é mostrado esquematicamente na Figura
1. Sem estar vinculado a qualquer teoria, os presentes inventores acreditam que a integração da molécula de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse no genoma da célula B, em particular na região de troca de um lócus do gene de imunoglobulina do linfócito B, ocorre por mecanismos naturais, como a recombinação homóloga (HR), as vias de junção de extremidades não homólogas (c-NHEJ) ou de junção de extremidades alternativas (A-EJ). Em outras palavras, após a introdução (transfecção) da molécula de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse no linfócito B, os mecanismos de reparo endógeno do linfócito B reparam subsequentemente a (s) ruptura (s) induzida (s) por processos naturais, como recombinação homóloga (HR), junção de extremidade não homóloga (NHEJ) e/ou junção de extremidade alternativa (A-EJ), integrando assim a molécula de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse no genoma do B linfócito. Nas vias de c-NHEJ e A-EJ, rupturas de DNA são detectadas pelos complexos Mre11/Rad50/Nbs1 (MRN) e ataxia telangiectasia mutada (ATM). Em c-NHEJ Ku, os heterodímeros da proteína Ku70 e Ku80 e a proteína quinase dependente do DNA (DNAPKs) formam uma estrutura que mantém as extremidades do DNA não homólogas juntas, modificando as extremidades do DNA e recrutando a DNA ligase IV para reunir as extremidades do DNA. A-EJ, em contraste, ocorre independentemente de Ku e DNA ligase IV e possivelmente utiliza PARP e/ou CtIP como estrutura para fatores adicionais necessários para o processamento da extremidade do DNA e ligação por meio de DNA ligase I ou III.
[0077] Em sumário, em comparação com os métodos da técnica anterior para células B manipuladas, que dependem da administração de uma nuclease exógena (manipulada), o método para editar o genoma de um linfócito B de acordo com a presente invenção reduz o risco de indesejáveis mutações fora do alvo. Em particular, no método de acordo com a presente invenção, a edição do genoma de um linfócito B i) pode ser realizada logo em 1 dia após o isolamento e estimulação de células B, e ii) funciona sem adição de uma nuclease manipulada, como Cas9.
[0078] Em particular, o método de acordo com a presente invenção não envolve uma nuclease exógena. Em outras palavras, no método de acordo com a presente invenção, em particular a presença de uma nuclease exógena não é necessária. Consequentemente, é preferencial no contexto da presente invenção que nem uma nuclease exógena em si nem um ácido nucleico que codifica uma nuclease exógena seja introduzido no linfócito B. Em geral, uma nuclease é uma enzima capaz de clivar as ligações fosfodiéster entre monômeros de ácidos nucleicos. Uma nuclease exógena é uma nuclease, que não se origina no linfócito B, em particular uma nuclease, que não é expressa pela célula B. Mais preferencialmente, o método de acordo com a presente invenção não envolve/utiliza uma nuclease CRISPR, uma nuclease de dedo de zinco, uma nuclease do tipo ativador de transcrição ou uma meganuclease.
[0079] Consequentemente, é preferencial que o método de acordo com a presente invenção não envolva uma nuclease manipulada artificialmente. Essas nucleases manipuladas são muitas vezes referidas como "tesouras moleculares" e incluem meganucleases manipuladas (por exemplo, endoncucleases homing meganuclease manipuladas remanipuladas),
nucleases tipo ativador de transcrição (TALENs), nucleases de dedo de zinco (ZFNs) e nucleases guiadas por RNA, tais como nucleases CRISPR (agrupadas regularmente entre as repetições palindrômicas curtas), como uma nuclease Cas (por exemplo, Cas9), uma nuclease Cpf1, uma nuclease Cmr, uma nuclease Csf, uma nuclease Csm, uma nuclease Csn, uma nuclease Csy, uma nuclease C2cl, uma nuclease C2c3 ou uma nuclease C2c3. Mais preferencialmente, o método de acordo com a presente invenção não envolve/utiliza nuclease manipulada, como uma nuclease CRISPR, uma nuclease de dedo de zinco, uma nuclease do tipo ativador de transcrição ou uma meganuclease.
[0080] As meganucleases são endonucleases caracterizadas por um grande sítio de reconhecimento de 12 a 40 pares de bases. As meganucleases manipuladas são frequentemente derivadas de endonucleases de homing. As nucleases de dedo de zinco (ZFNs) são enzimas de restrição artificiais geradas pela fusão de um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco a um domínio de clivagem de DNA, em que os domínios de dedo de zinco podem ser modificados para direcionar sequências de DNA desejadas específicas que permitem que as nucleases de dedo de zinco alvejem sequências únicas em genomas complexos. Nucleases tipo ativador de transcrição (TALEN) são enzimas de restrição feitas por fusão de um domínio de ligação de DNA efetor de TAL a um domínio de clivagem de DNA, que pode ser projetado para cortar sequências específicas de DNA. CRISPR é uma família de sequências de DNA em bactérias e arquéias contendo fragmentos de DNA de vírus que atacaram o procarioto, que são usados pelo procarioto para detectar e destruir DNA de vírus similares durante ataques subsequentes. O RNA que abriga a sequência espaçadora na sequência CRISPR ajuda as nucleases CRISPR a reconhecer e cortar o DNA exógeno. Para edição de genes, geralmente uma nuclease CRISPR, como uma nuclease Cas (por exemplo, Cas9), uma nuclease Cpf1, uma nuclease Cmr, uma nuclease Csf, uma nuclease Csm, uma nuclease Csn, uma nuclease Csy, uma nuclease
C2cl, uma C2c3 nuclease, ou uma nuclease C2c3, é introduzida em uma célula juntamente com o RNA guia para curar o genoma da célula em um sítio desejado.
[0081] Além disso, o presente método preferencialmente não envolve a introdução de qualquer ácido nucleico guia (RNA guia ou DNA guia) no linfócito B. Além do sistema CRISPR/Cas mencionado acima, que usa RNA guia também outros métodos de edição de genoma usando ácidos nucleicos guia são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, um método baseado na nuclease de argonauta (Ago), que usa 5’ curta única fosforilada ácidos nucléicos de fita (RNA ou DNA) como guia para clivar um alvo. No entanto, o método de acordo com a presente invenção utiliza citidina desaminase induzida por ativação (AID), que visa naturalmente a região de troca e, portanto, nenhum ácido nucleico guia é necessário e, em particular, nenhum ácido nucleico guia está envolvido.
[0082] Opcionalmente, o método de acordo com a presente invenção pode compreender ainda uma etapa: (iii) confirmar a integração da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse no genoma do linfócito B.
[0083] Em particular, esta etapa (iii) é realizada após as etapas (i) e (ii) conforme descrito acima. A etapa (iii) pode ser realizada, por exemplo, por sequenciamento (ácidos nucleicos, como DNA genômico, do linfócito B) e/ou verificando se o receptor de células B ou anticorpos produzidos pelo linfócito B projetado contêm o (poli) peptídeo de interesse. Por exemplo, se o (poli) peptídeo de interesse for um sítio de ligação específico, a ligação de anticorpos produzidos pelo linfócito B modificado ao parceiro de ligação específico pode ser avaliada. A integração bem-sucedida do (poli) peptídeo de interesse no anticorpo também pode ser avaliada por coloração da superfície de células com anticorpos marcados com fluorescência e análise de citometria de fluxo, por exemplo, se o (poli) peptídeo de interesse integrado não fizer parte de uma molécula de superfície, que é endogenamente expresso por células B. Além disso, a integração da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse no genoma do linfócito B pode ser validada por amplificação por PCR e/ou sequenciamento (subsequente) da região de troca de imunoglobulina incluindo troca-µ e, opcionalmente, as regiões correspondentes de todos os isotipos alfa e gama. Molécula de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse
[0084] A molécula de DNA introduzida no linfócito B na etapa (ii) pode ser de qualquer forma, por exemplo, uma circular (como um plasmídeo) ou uma molécula de DNA linear. Por exemplo, se uma molécula de DNA circular (plasmídeo) for introduzida na etapa (ii), ela pode conter pelo menos um sítio de restrição para a DNase endógena, de modo que o plasmídeo possa ser clivado para integração no genoma. Preferencialmente, a molécula de DNA introduzida no linfócito B no passo (ii) do método de acordo com a invenção é uma molécula de DNA linear ou linearizada. Por exemplo, a molécula de DNA pode ser preparada como plasmídeo (ou como componente de um plasmídeo), que é clivado (de modo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse) antes de ser introduzido no linfócito B (molécula de DNA linearizada).
[0085] Além disso, a molécula de DNA introduzida no linfócito B na etapa (ii) pode ser uma molécula de DNA de fita simples (ssDNA) ou uma molécula de DNA de fita dupla (dsDNA). Como mostrado no Exemplo 1, ambos, ssDNA e dsDNA podem ser usados no método de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, a molécula de DNA é uma molécula de dsDNA.
[0086] Além disso, uma molécula de DNA de fita dupla introduzida no linfócito B na etapa (ii) pode ter uma extremidade cega, uma saliência 5’ e/ou 3', ou uma extremidade desgastada. Uma "extremidade cega" é a extremidade mais simples de uma molécula de DNA de fita dupla, em que ambas as fitas da molécula de DNA terminam em um par de bases complementares (adenina: timidina (A: T) e citosina: guanina (C: G), respectivamente). Em outras palavras, em uma extremidade cega, cada nucleotídeo da primeira fita é emparelhado com um nucleotídeo complementar da outra fita (formando um par de bases). Em contraste, uma "saliência" é um trecho de nucleotídeos desemparelhados na extremidade de uma molécula de dsDNA. Esses nucleotídeos desemparelhados podem estar em qualquer uma das fitas, criando saliências 3’ ou 5'. Saliências de pelo menos dois nucleotídeos desemparelhados também são referidas como "extremidades aderente" ou "extremidades coesivas". Consequentemente, uma extremidade aderente ou coesa tem uma fita única protuberante com nucleotídeos desemparelhados (chamados de saliência) - enquanto as extremidades cegas não têm fitas salientes. Finalmente, uma "extremidade desgastada" se refere a uma região de uma molécula de dsDNA perto da extremidade com uma razão significativa de sequências não complementares (em "pares de bases" não complementares). No entanto, os nucleotídeos combinados incorretamente tendem a evitar a ligação, parecendo, portanto, similares às fitas de um pedaço de desgastado que se desfia.
[0087] Preferencialmente, a molécula de DNA tem extremidades aderentes ou extremidades cegas. Mais preferencialmente, a molécula de DNA tem extremidades cegas.
[0088] Também é preferencial que a molécula de DNA, ou pelo menos a sequência de nucleotídeos da molécula de DNA, que codifica o (poli) peptídeo de interesse, seja otimizada em códons. Em particular, as sequências de nucleotídeos que codificam um (poli) peptídeo de interesse, em que o (poli) peptídeo de interesse não é de origem humana, são preferencialmente otimizadas por códons. Em geral, a otimização por códons pode melhorar a tradução e a expressão de uma proteína recombinante em células humanas
[0089] Vários métodos para otimização por códons são conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, ferramentas computacionais, como JCat (Grote A, Hiller K, Scheer M, Münch R, Nörtemann B, Hempel DC,
Jahn D.
JCat: a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host.
Nucleic Acids Res. 2005 Jul 1;33(Web Server issue):W526- 31), Synthetic Gene Designer (Wu G, Bashir-Bello N, Freeland SJ.
The Synthetic Gene Designer: a flexible web platform to explore sequence manipulation for heterologous expression.
Protein Expr Purif. 2006 Jun;47(2):441-5) and OPTIMIZER (Puigbò P, Guzmán E, Romeu A, Garcia- Vallvé S.
OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences.
Nucleic Acids Res. 2007 Jul; 35 (Web Server issue): W126-31) podem ser usados, que foram desenvolvidos para quantificar e otimizar a frequência de uso de códons da sequência de codificação em termos de índice de adaptação de códons (CAI) do hospedeiro ou uso de códons individuais (ICU) Além disso, a otimização por pareamento de códons, também conhecido como contexto de códons (CC), pode ser usada, por exemplo, para melhorar a expressão de genes heterólogos (por exemplo, conforme descrito em: Chung BK, Yusufi FN, Mariati, Yang Y, Lee DY.
Enhanced expression of codon optimized interferon gamma in CHO cells.
J Biotechnol. 2013 Sep 10;167(3):326-33; Hatfield GW, Roth DA.
Optimizing scaleup yield for protein production: Montagem de DNA otimizada computacionalmente (CODA) e Engenharia de Tradução.
Biotechnol Annu Rev. 2007;13:27-42; and/or Moura GR, Pinheiro M, Freitas A, Oliveira JL, Frommlet JC, Carreto L, Soares AR, Bezerra AR, Santos MA.
Species-specific codon context rules unveil non- neutrality effects of synonymous mutations.
PLoS One. 2011; 6 (10): e26817). Além disso, a contagem de códons de parada ocultos (HSC) pode ser maximizada para aumentar a expressão do gene, uma vez que a presença de códons de parada ocultos (HSC) também impede a leitura fora da estrutura.
Ferramentas particularmente preferenciais para otimização de códon incluem COOL (URL: http://cool.syncti.org/; Ju Xin Chin, Bevan Kai-Sheng Chung, Dong-Yup Lee; Otimização de códon OnLine (COOL): um multi baseado na web - plataforma de otimização de objetivo para projeto de gene sintético, Bioinformática, Volume 30, Edição 15, 1 de agosto de 2014, Páginas 2210–
2212); “OptimumGene TM -Codon Optimization” (GenScript; conforme descrito em US 2011/0081708 A1) e a “Codon Optimization Tool” (IDT® Integrated DNA Technologies; URL: http://eu.idtdna.com/CodonOpt).
[0090] Alternativamente, também é preferencial que a molécula de DNA, ou pelo menos a sequência de nucleotídeos da molécula de DNA, que codifica o (poli) peptídeo de interesse, seja otimizada em códons. Em particular, é preferencial que a molécula de DNA ou a referida sequência de nucleotídeos não seja otimizada por códons, se o (poli) peptídeo de interesse for um (poli) peptídeo humano ou for derivado de um (poli) peptídeo humano.
[0091] Preferencialmente, a molécula de DNA, que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse, compreende ainda (além da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse) uma sequência intrônica a montante e/ou a jusante da sequência de nucleotídeos codificando o (poli) peptídeo de interesse. Mais preferencialmente, a molécula de DNA que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse compreende ainda (além da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse) (i) uma sequência intrônica a montante da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse e (ii) uma sequência intrônica a jusante da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse. Em particular, o termo "sequência intrônica" refere-se a uma sequência de nucleotídeos não codificantes.
[0092] Preferencialmente, a sequência intrônica tem um comprimento de pelo menos 5 nucleotídeos (em dsDNA: pares de bases; bp), preferencialmente pelo menos 10 nucleotídeos (em dsDNA: pares de bases; bp), mais preferencialmente pelo menos 15 nucleotídeos (em dsDNA: pares de bases ; bp), ainda mais preferencialmente pelo menos 20 nucleotídeos (em dsDNA: pares de bases; bp) e mais preferencialmente pelo menos 25 nucleotídeos (em dsDNA: pares de bases; bp). É também preferencial que a sequência intrônica tenha um comprimento de pelo menos 50 nucleotídeos (em dsDNA: pares de bases; bp), preferencialmente pelo menos 75 ou 100 nucleotídeos (em dsDNA: pares de bases; bp), mais preferencialmente pelo menos 150 ou 200 nucleotídeos (em dsDNA: pares de bases; bp), ainda mais preferencialmente pelo menos 300 ou 400 nucleotídeos (em dsDNA: pares de bases; bp), ainda mais preferencialmente pelo menos 500 nucleotídeos (em dsDNA: pares de bases; bp) e mais preferencialmente em pelo menos 600 nucleotídeos (em dsDNA: pares de bases; bp).
[0093] É também preferencial que a sequência intrônica tenha um comprimento de não mais do que 3000 nucleotídeos, preferencialmente não mais do que 2500 nucleotídeos (em dsDNA: pares de bases; bp), mais preferencialmente não mais do que 2000 nucleotídeos (em dsDNA: pares de bases; bp), ainda mais preferencialmente (em particular se a molécula de DNA compreender duas sequências intrônicas) não mais do que 1500 nucleotídeos (em dsDNA: pares de bases; bp), ainda mais preferencialmente (em particular se a molécula de DNA compreender duas sequências intrônicas) não mais do que 1250 nucleotídeos (em dsDNA: pares de bases; bp), e mais preferencialmente (em particular se a molécula de DNA compreender duas sequências intrônicas) não mais do que 1000 nucleotídeos (em dsDNA: pares de bases; bp).
[0094] Preferencialmente, a sequência intrônica compreende um sítio de reconhecimento de emenda. Um "sítio de reconhecimento de emenda" (também conhecido como "sítio de emenda") é uma sequência de nucleotídeos, que é especificamente reconhecida pelo emendaossomo e emendada. Portanto, o sítio de emenda (reconhecimento) é uma sequência de nucleotídeos intrônica na "fronteira" entre o íntron e o éxon.
[0095] Mais preferencialmente, a molécula de DNA que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse compreende:
(i) uma sequência intrônica compreendendo um (único) sítio de reconhecimento de emenda a montante da sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse (por exemplo, um sítio de emenda 5'); e (i) uma sequência intrônica compreendendo um (único) sítio de reconhecimento de emenda a jusante da sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse (por exemplo, um sítio de emenda 3'). e
[0096] Mais preferencialmente, o sítio de reconhecimento de emenda está localizado diretamente adjacente (diretamente a montante ou a jusante) da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse.
[0097] Conforme usado neste documento, o termo "sítio de emenda 5’ " refere-se a um sítio de emenda, que está localizado na extremidade a jusante de um íntron e, portanto, diretamente a montante de um éxon (na extremidade 5' do éxon). Por exemplo, um "sítio de emenda 5‘ " normalmente compreende os nucleotídeos "AG" (nesta ordem) em sua extremidade 3'. Em outras palavras, um "sítio de emenda 5’" pode terminar com os nucleotídeos "AG" como os dois últimos nucleotídeos (depois disso, o éxon/sequência de codificação começa).
[0098] Conforme usado neste documento, o termo "sítio de emenda 3’" refere-se a um sítio de emenda, que está localizado na extremidade a montante de um íntron e, portanto, diretamente a jusante de um éxon (na extremidade 3' do éxon). Por exemplo, um "sítio de emenda 3‘ " normalmente compreende os nucleotídeos "GT" (nesta ordem) em sua extremidade 5'. Em outras palavras, um "sítio de emenda 3 '" pode começar com os nucleotídeos "GT" como os dois primeiros nucleotídeos (apenas (diretamente) após o final do éxon/sequência de codificação).
[0099] Os sítios de emenda podem ser previstos in silico por várias ferramentas de bioinformática, incluindo, por exemplo: ⎯ Berkeley Drosophila Genome Project (Drosophily and human prediction; URL: http://www.fruitfly.org/seq_tools/emenda.html; Reese MG,
Eeckman, FH, Kulp, D, Haussler, D, 1997. ``Improved Emenda Site Detection in Genie''. J Comp Biol 4(3), 311-23); ⎯ Human Emenda Finder (URL: http://www.umd.be/HSF/; FO Desmet, Hamroun D, Lalande M, Collod-Beroud G, Claustres M, Beroud C.
Human Emenda Finder: an online bioinformatics tool to predict emenda signals.
Nucleic Acid Research, 2009, April); ⎯ GeneEmendar (URL: http://ccb.jhu.edu/software/geneemendar/; M.
Pertea, X.
Lin, S.
L.
Salzberg.
GeneEmendar : a new computational method for emenda site prediction.
Nucleic Acids Res. 2001 Mar 1;29(5):1185-90); ⎯ NetGene2 Server (URL: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/; S.M.
Hebsgaard, PG Korning, N.
Tolstrup, J.
Engelbrecht, P.
Rouze, S.
Brunak: Emenda site prediction in Arabidopsis thaliana DNA by combining sítio and global sequence information, Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, No. 17, 3439-3452. Brunak, S., Engelbrecht, J., and Knudsen, S.: Prediction of Human mRNA Donor and Acceptor Sites from the DNA Sequence, Journal of Molecular Biology, 1991, 220, 49-65); ⎯ EmendaPort: Uma ferramenta de análise de sítio de emenda interativo (URL: http://emendaport.cbcb.umd.edu/; Dogan RI, Getoor L, Wilbur WJ, Mount SM.
EmendaPort—An interactive emenda-site analysis tool.
Nucleic Acids Research. 2007;35(Web Server issue):W285-W291. doi:10.1093/nar/gkm407); and ⎯ MaxEntScan (URL: http://genes.mit.edu/burgelab/maxent/Xmaxentscan_scoreseq.html; Yeo G, Burge CB.
Maximum entropy modeling of short sequence motifs with applications to RNA emenda signals.
J Comput Biol. 2004; 11 (2-3): 377-94.
[00100] Preferencialmente, o sítio de emenda 3’ compreende uma sequência de nucleotídeos de acordo com SEQ ID NO: 1 ou uma sequência variante da mesma:
AGGTAAGT [SEQ ID NO: 1].
[00101] É também preferencial que o sítio de emenda 5’ compreenda um trato de polipirimidina (10 U ou C, seguido por qualquer base e C) e um AG terminal.
[00102] Em uma modalidade particularmente preferencial, a molécula de DNA compreendendo a sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse compreende ainda: (i) a montante da sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse (na extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse): uma sequência intrônica, em particular uma extremidade 3' de um (naturalmente ocorrer) íntron, compreendendo um (único) sítio de reconhecimento de emenda, em particular um sítio de emenda 5’; e (ii) a jusante da sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse (na extremidade 3’ da sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse): uma sequência intrônica, em particular uma extremidade 5' de um íntron, compreendendo um (único) sítio de reconhecimento de emenda, em particular um sítio de emenda 3’. e
[00103] Mais preferencialmente, a molécula de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse compreende (na seguinte ordem):
1. uma primeira sequência intrônica compreendendo um primeiro sítio de reconhecimento de emenda (por exemplo, uma extremidade 3’ de um íntron (de ocorrência natural) compreendendo o sítio de emenda 5');
2. a sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse; e
3. uma segunda sequência intrônica compreendendo um segundo sítio de reconhecimento de emenda (por exemplo, uma extremidade 5’ de um íntron (de ocorrência natural) compreendendo o sítio de emenda 3').
[00104] Um exemplo esquemático de tal molécula de DNA (por exemplo, integrado na região de troca do cromossomo 14 do genoma do linfócito B) é mostrado na Figura 11, em particular na parte superior para o conceito geral (a parte do meio e a parte inferior da Figura 11 mostram exemplos dos mesmos, incluindo características adicionais conforme descrito abaixo).
[00105] Um exemplo particularmente preferencial de uma sequência intrônica compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs 112-115 ou uma sequência variante da mesma como definido neste documento. Por exemplo, uma sequência intrônica localizada (diretamente) a montante da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse (na extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse) preferencialmente compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 112 ou SEQ ID NO: 114, ou uma sequência variante da mesma como definido neste documento. Por exemplo, uma sequência intrônica localizada (diretamente) a jusante da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse (na extremidade 3’ da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse) preferencialmente compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 113 ou SEQ ID NO: 115, ou uma sequência variante da mesma como definido neste documento.
[00106] Preferencialmente, a sequência intrônica contém uma sequência intrônica do lócus de Ig. O termo "sequência intrônica de lócus de Ig" refere-se a uma sequência intrônica de um lócus de imunoglobulina (Ig) (em particular uma sequência intrônica que ocorre naturalmente em um lócus de Ig, como uma extremidade 5’ e/ou uma extremidade 3' de um íntron que ocorre naturalmente em um lócus de Ig). Consequentemente, é preferencial que a sequência intrônica seja um fragmento de um íntron (de ocorrência natural) de um lócus de Ig ou um íntron completo de um lócus de Ig.
[00107] Mais preferencialmente, a sequência intrônica compreende uma sequência intrônica de um íntron a jusante de segmento J e/ou uma sequência intrônica de um íntron a montante de CH, por exemplo, um íntron a montante de CH1. O termo "íntron a jusante do segmento J" refere-se ao íntron diretamente a jusante do éxon que codifica o segmento J. O termo "íntron a montante de CH" refere-se ao íntron diretamente a montante de um éxon que codifica um domínio constante de cadeia pesada (CH). Portanto, uma sequência intrônica de um íntron a jusante de segmento J e/ou uma sequência intrônica de um íntron a montante de CH pode ser um íntron a jusante de segmento J completo/íntron a montante CH completo ou um fragmento destes como descrito acima. Preferencialmente, o íntron a montante de CH inclui uma sequência de ramificação (também conhecida como "sequência de ramificação" ou "sítio de ramificação"). Particularmente preferencial, a molécula de DNA compreende uma sequência intrônica de um íntron a montante de CH (por exemplo, um íntron a montante de CH1) a montante da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse (ou seja, a sequência intrônica do íntron a montante de CH está localizada (diretamente) "antes"/a montante da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse) e/ou uma sequência intrônica de um íntron a jusante do segmento J da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse (ou seja, sequência intrônica do íntron a jusante do segmento J está localizada (diretamente) "antes"/a jusante da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse).
[00108] Mais preferencialmente, a molécula de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse compreende (na seguinte ordem):
1. uma sequência intrônica de um íntron a montante de CH (por exemplo, um fragmento de extremidade 3’ de um íntron a montante de CH) compreendendo em sua extremidade 3' um primeiro sítio de reconhecimento de emenda (por exemplo, um sítio de emenda 5'), a sequência intrônica do íntron a montante de CH, preferencialmente compreendendo ainda uma sequência de ramificação e/ou um intensificador de emenda intrônico);
2. a sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse; e
3. uma sequência intrônica de um íntron a jusante do segmento J (por exemplo, um fragmento da extremidade 5’ de um íntron a jusante do segmento J) compreendendo na sua extremidade 5' de um segundo sítio de reconhecimento de emenda (por exemplo, um sítio de emenda 3'), a sequência intrônica do íntron a jusante do segmento J, preferencialmente compreendendo ainda um intensificador de emenda intrônico).
[00109] Tal modalidade preferencial é esquematicamente mostrada na Figura 11 (meio).
[00110] Portanto, é preferencial que uma sequência intrônica a montante da sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse compreenda uma sequência de ramificação (também conhecida como "sequência de ramificação" ou "sítio de ramificação"). Um "sítio de ramificação" é um elemento de sequência fracamente conservado, como YNCTGAC (em que Y pode ser C ou T e N pode ser qualquer nucleotídeo selecionado de A, G, C e T; SEQ ID NO: 2), localizado a uma distância conservada de cerca de 18-50 nucleotídeos do sítio de emenda 5'. Consequentemente, é preferencial que o sítio de ramificação esteja localizado na sequência intrônica a cerca de 18-50 nucleotídeos (preferencialmente 20-40 nucleotídeos) a montante de um sítio de emenda 5’ compreendido na sequência intrônica.
[00111] A sequência intrônica também pode compreender um elemento regulador de emenda (SRE), que é uma sequência de ação cis, que aumenta ou silencia (suprime) o emenda. Consequentemente, “intensificadores de emenda” e “silenciadores de emenda” podem ser distinguidos. SREs recrutam fatores de emenda trans-atuantes para ativar ou suprimir o reconhecimento do sítio de emenda ou montagem de emendaossomo.
[00112] Preferencialmente, a sequência intrônica compreende um intensificador de emenda (intrônico). É também preferencial que a sequência intrônica não compreenda um silenciador de emenda (intrônico). Em geral, intensificadores/silenciadores de emenda presentes em uma sequência intrônica (por exemplo, em (um fragmento de) um íntron) são referidos como intensificadores/silenciadores de emenda "intrônicos", enquanto intensificadores/silenciadores de emenda presentes em uma sequência exônica/de codificação (por exemplo, em a sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse) são referidos como intensificadores/silenciadores de emenda "exônicos". A presença de intensificadores de emenda naturais ou modificados e/ou ausência de silenciadores de emenda na molécula de DNA é preferencial e pode melhorar o emenda e a integração da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse.
[00113] É também preferencial que a molécula de DNA compreenda uma sequência intrônica compreendendo um intensificador de emenda intrônico a montante e/ou a jusante da sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse. Os intensificadores de emenda intrônicos preferencials são descritos em Wang Y, Ma M, Xiao X, Wang Z. Intronic Emenda Enhancers, Cognate Emenda Factors e Context Dependent Regulation Rules. Nature structural & molecular biology. 2012; 19 (10): 1044-
1052. doi: 10.1038/nsmb.2377.
[00114] Mais preferencialmente, o intensificador de emenda intrônico tem uma sequência de nucleotídeos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs 3-26, ou uma sequência variante da mesma: GTAGTGAGGG (SEQ ID NO: 3)
GTTGGTGGTT (SEQ ID NO: 4) AGTTGTGGTT (SEQ ID NO: 5) GTATTGGGTC (SEQ ID NO: 6) AGTGTGAGGG (SEQ ID NO: 7) GGGTAATGGG (SEQ ID NO: 8) TCATTGGGGT (SEQ ID NO: 9) GGTGGGGGTC (SEQ ID NO: 10) GGTTTTGTTG (SEQ ID NO: 11) TATACTCCCG (SEQ ID NO: 12) GTATTCGATC (SEQ ID NO: 13) GGGGGTAGG (SEQ ID NO: 14) GTAGTTCCCT (SEQ ID NO: 15) GTTAATAGTA (SEQ ID NO: 16) TGCTGGTTAG (SEQ ID NO: 17) ATAGGTAACG (SEQ ID NO: 18) TCTGAATTGC (SEQ ID NO: 19) TCTGGGTTTG (SEQ ID NO: 20) CATTCTCTTT (SEQ ID NO: 21) GTATTGGTGT (SEQ ID NO: 22) GGAGGGTTT (SEQ ID NO: 23) TTTAGATTTG (SEQ ID NO: 24) ATAAGTACTG (SEQ ID NO: 25) TAGTCTATTA (SEQ ID NO: 26)
[00115] Mais preferencialmente, a sequência intrônica tem uma sequência de nucleotídeos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs 27- 53, ou uma sequência variante desta. SEQ ID NOs 27-45 mostram exemplos preferenciais de (sequências intrônicas/fragmentos de) íntrons a montante de CH e SEQ ID NOs 46-51 mostram exemplos preferenciais de (sequências intrônicas/fragmentos de) íntrons a jusante de segmento J. 5`IgM-CH1
CGAGGAGGCAGCTCCTCACCCTCCCTTTCTCTTTTGTCCTGCGG
GTCCTCAG [SEQ ID NO: 27] 5`IgM-CH2
CGAAGGGGGCGGGAGTGGCGGGCACCGGGCTGACACGTGTC
CCTCACTGCAG [SEQ ID NO: 28] 5`IgM-CH3
TCCGCCCACATCCACACCTGCCCCACCTCTGACTCCCTTCTCTT
GACTCCAG [SEQ ID NO: 29] 5`IgM-CH4
CCACAGGCTGGTCCCCCCACTGCCCCGCCCTCACCACCATCTC
TGTTCACAG [SEQ ID NO: 30] 5`IgG1-CH1
TGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCT
CTCTTGCAG [SEQ ID NO: 31] 5`ÌgG1-dobradiça
GGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCT
CTCTGCAG [SEQ ID NO: 32] 5`IgG1-CH2
AGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCT
CTTCCTCAG [SEQ ID NO: 33] 5ʻIgG1-CH3
GGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTG TCCCTACAG
[SEQ ID NO: 34] 5ʻIgG3-CH1
TGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCAGTCACATGGCGCCATCT
CTCTTGCAG [SEQ ID NO: 35] 5ʻIgG3-dobradiça
AGATACCTTCTCTCTTCCCAGATCTGAGTAACTCCCAATCTTCTC
TCTGCAG [SEQ ID NO: 36] 5ʻIgG3-dobradiça2
ACGCATCCACCTCCATCCCAGATCCCCGTAACTCCCAATCTTCT
CTCTGCAG [SEQ ID NO: 37] 5ʻIgG3-dobradiça3
ACGCGTCCACCTCCATCCCAGATCCCCGTAACTCCCAATCTTCT
CTCTGCAG [SEQ ID NO: 38] 5`IgG3-dobradiça
ACGCATCCACCTCCATCCCAGATCCCCGTAACTCCCAATCTTCT
CTCTGCAG [SEQ ID NO: 39] 5ʻIgG3-CH2
ACGCATCCACCTCCATCCCAGATCCCCGTAACTCCCAATCTTCT
CTCTGCAG [SEQ ID NO: 40] 5ʻIgG3-CH3
GACCCACCCTCTGCCCTGGGAGTGACCGCTGTGCCAACCTCTG
TCCCTACAG [SEQ ID NO: 41] 5ʻIgG4-CH1
TGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCT
CTCTTGCAG [SEQ ID NO: 42] 5ʻIgG4-dobradiça
AGACACCTTCTCTCCTCCCAGATCTGAGTAACTCCCAATCTTCT
CTCTGCAG [SEQ ID NO: 43] 5ʻIgG4-CH2
AGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACGCATCCACCTCCATCT
CTTCCTCAG [SEQ ID NO: 44] 5`IgG4-CH3
GGCCCACCCTCTGCCCTGGGAGTGACCGCTGTGCCAACCTCTG
TCCCTACAG [SEQ ID NO: 45]
[00116] Os exemplos acima mostram fragmentos (extremidades 3’ de íntrons de ocorrência natural no respectivo lócus de Ig (por exemplo, IgM- CH1) de IgM e várias subclasses de IgG. É também preferencial que sequências intrônicas correspondentes (de ocorrência natural) de outros isotipos de imunoglobulina, tais como IgA1, IgA2 e IgE, possam ser usadas. 3`J1
GTGAGTCTGCTGTCTGGGGATAGCGGGGAGCCAGGTGTACTG
GGCCAGGCAA [SEQ ID NO: 46] 3`J2
GTGAGTCCCACTGCAGCCCCCTCCCAGTCTTCTCTGTCCAGGC
ACCAGGCCA [SEQ ID NO: 47] 3`J3
GTAAGATGGCTTTCCTTCTGCCTCCTTTCTCTGGGCCCAGCGTC
CTCTGTCC [SEQ ID NO: 48] 3`J4
GTGAGTCCTCACAACCTCTCTCCTGCTTTAACTCTGAAGGGTTT
TGCTGCAT [SEQ ID NO: 49] 3`J5
GTGAGTCCTCACCACCCCCTCTCTGAGTCCACTTAGGGAGACT
CAGCTTGCC [SEQ ID NO: 50] 3`J6
GTAAGAATGGCCACTCTAGGGCCTTTGTTTTCTGCTACTGCCTG
TGGGGTTT [SEQ ID NO: 51]
[00117] Outros exemplos preferenciais incluem: 5`LAIR1
CATGGTGACTTCCTACAGTGGACGCTGAGATCCTGCTCTGCTTC
CCTCCTAG [SEQ ID NO: 52] 3`LAIR1
GTGAGGACGTCACCTGGGCCCTGCCCCAGTCTCAGCTCGACCC
TCGAGCTTG [SEQ ID NO: 53]
[00118] Em geral, é preferencial que a molécula de DNA compreenda um intensificador de emenda. O intensificador de emenda pode ser intrônico (ou seja, localizado em uma sequência intrônica da molécula de DNA) ou exônico (ou seja, localizado em uma sequência de codificação da molécula de DNA, por exemplo, na sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse). Como a sequência de nucleotídeos que codifica o
(poli) peptídeo de interesse é em geral muito mais predeterminada (devido à sua funcionalidade de codificação do (poli) peptídeo de interesse) do que uma sequência intrônica, um intensificador de emenda intrônico é geralmente preferencial. Em outras palavras, é geralmente preferencial que o intensificador de emenda esteja localizado em uma sequência intrônica compreendida na molécula de DNA. Mais preferencialmente, a molécula de DNA compreende uma sequência intrônica a montante da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse e uma sequência intrônica a jusante da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse, e cada uma das sequências intrônicas compreende um intensificador de emenda Essa modalidade preferencial é esquematicamente mostrada na Figura 11 (parte inferior).
[00119] No entanto, também é preferencial que a molécula de DNA compreenda um intensificador de emenda exônico, por exemplo, na sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse. Por exemplo, o (poli) peptídeo de interesse pode ser selecionado de modo que a sequência de nucleotídeos que o codifica "naturalmente" compreende um intensificador de emenda exônico. Além disso, a degenerescência do código genético pode ser usada para introduzir um intensificador de emenda exônico. Ou seja, mutações silenciosas (que não alteram o aminoácido codificado) podem ser usadas para introduzir um intensificador de emenda exônico na sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse.
[00120] Preferencialmente, a molécula de DNA não compreende um silenciador de emenda exônico.
[00121] Os intensificadores de emenda exônicos (ESEs) são sequências discretas dentro dos éxons, que promovem o emenda constitutivo e regulado. As sequências de intensificador de emenda exônicas (ESE) são ligadas por proteínas ricas em serina e arginina (SR), que por sua vez aumentam o recrutamento de fatores de emenda. Preferencialmente, um intensificador de emenda exônico é um motivo de sequência que consiste em seis bases.
[00122] Os intensificadores de emenda exônicos são conhecidos no estado da técnica (Liu HX, Zhang M, Krainer AR. Identification of functional éxonic emenda enhancer motifs recognized by individual SR proteins. Genes & Development. 1998; 12 (13): 1998-2012; Blencowe BJ. Intensificadores de emenda exônicos: mecanismo de ação, diversidade e papel nas doenças genéticas humanas. Trends Biochem Sci. 2000 Mar;25(3):106-10). Os intensificadores de emenda podem ser previstos in silico por várias ferramentas de bioinformática, incluindo, por exemplo, por RESCUE-ESE Web Server (URL: http://genes.mit.edu/burgelab/rescue-ese/; Fairbrother WG, Yeh RF, Sharp PA, Burge CB. Predictive identification of éxonic emenda enhancers in human genes. Science. 2002 Aug 9;297(5583):1007-13) and/or by ESEfinder (URL: http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi?process=home; Smith, P. J., Zhang, C., Wang, J. Chew, S. L., Zhang, M. Q. and Krainer, A. R. 2006. Uma matriz de pontuação de especificidade aumentada para a previsão de intensificadores de emenda exônicos específicos de SF2/ASF. Hum. Mol. Genet. 15 (16): 2490-2508; Cartegni L., Wang J., Zhu Z., Zhang MQ, Krainer AR; 2003 ESEfinder: a web resource to identify éxonic emenda enhancers. Nucleic Acid Research, 2003, 31 (13): 3568-3571).
[00123] Mais preferencialmente, o intensificador de emenda (intrônico ou exônico) é selecionado para mostrar eficiência em células B humanas isoladas, em particular em células B humanas primárias. Consequentemente, o intensificador de emenda é preferencialmente derivado de células B humanas isoladas, em particular de uma célula B humana primária (por exemplo, analisando sequências de células B com ferramentas de bioinformática apropriadas para a previsão de intensificadores de emenda como descrito neste documento.
[00124] Preferencialmente, no método de acordo com a presente invenção, o genoma do linfócito B é editado para expressar uma cadeia de imunoglobulina modificada que compreende na direção da extremidade N para C: um domínio variável, o (poli) peptídeo de interesse (codificado pelo DNA molécula introduzida na etapa (ii) do método de acordo com a presente invenção) e um domínio constante. Em outras palavras, o genoma do linfócito B é preferencialmente editado para expressar uma cadeia de imunoglobulina modificada compreendendo o (poli) peptídeo de interesse organizado entre um domínio variável e um domínio constante da cadeia de imunoglobulina. Consequentemente, é preferencial que o genoma do linfócito B seja editado para expressar um anticorpo modificado compreendendo o (poli) peptídeo de interesse na região do cotovelo do anticorpo. Além disso, é preferencial que o genoma do linfócito B seja editado para expressar um receptor de células B modificado compreendendo o (poli) peptídeo de interesse na região do cotovelo do anticorpo.
[00125] A região do cotovelo é a junção entre os domínios variáveis e os domínios constantes nas cadeias pesada e leve do anticorpo. Normalmente, o terminal C do domínio variável (VH ou VL) está diretamente ligado ao terminal N do domínio constante mais terminal N (normalmente CH1 ou CL), e a junção entre o terminal C do domínio variável (VH ou VL) e o terminal N do domínio constante mais terminal N (normalmente CH1 ou CL) é referido como "cotovelo" ou "região do cotovelo". A região do cotovelo permite a flexão e rotação dos domínios variáveis em relação aos domínios constantes. Consequentemente, juntamente com a região de dobradiça, a região do cotovelo fornece flexibilidade ao anticorpo para ligação ao antígeno. A região do cotovelo também é conhecida como “junção bola-e-encaixe molecular” com base na amplitude de movimento fornecida pela região do cotovelo (Lesk AM, Chothia C. Elbow motion in the immunoglobulins involves a molecular ball-and- socket joint. Nature. 1988 Sep 8;335(6186):188-90).
[00126] No genoma dos linfócitos B, a região de troca está localizada entre o domínio variável e o domínio constante (mais terminal N) de um anticorpo. Conforme descrito acima, por ação de AID, a molécula de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse é integrada na região de troca do genoma da célula B. Consequentemente, a molécula de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse é integrada entre os domínios variáveis e os domínios constantes de um anticorpo. Em particular, as sequências intrônicas são removidas durante a emenda, de modo que uma cadeia de imunoglobulina expressa por um genoma de células B editado de acordo com a presente invenção, conforme descrito neste documento, compreende na direção do terminal N para C: um domínio variável, o (poli) peptídeo de interesse (codificado pela molécula de DNA introduzida na etapa (ii) do método de acordo com a presente invenção) e um domínio constante. Consequentemente, na cadeia de imunoglobulina expressa, o (poli) peptídeo de interesse está localizado na região do cotovelo do anticorpo, isto é, entre a variável e o domínio constante terminal mais N.
[00127] Exemplos preferenciais de anticorpos compreendendo um (poli) peptídeo de interesse na região do cotovelo e os arranjos genômicos correspondentes são mostrados na Figura 2A. A parte superior da Figura 2A mostra um anticorpo (do tipo IgG clássico) com um único domínio de receptor como (poli) peptídeo de interesse na região do cotovelo. A parte do meio da Figura 2A mostra um anticorpo (do tipo IgG clássico) com dois domínios de receptor como (poli) peptídeo de interesse na região do cotovelo. A parte inferior da Figura 2A mostra um anticorpo (do tipo IgG clássico) com um domínio VH e um domínio VL como (poli) peptídeo de interesse na região do cotovelo.
[00128] Em geral, os anticorpos com "inserções de cotovelo" (IEI), que podem ser obtidos com o método de acordo com a presente invenção, conforme descrito neste documento, são descritos em detalhes no WO 2019/025391 A1 e no WO 2019/024979 A1 (PCT/EP2017/069357), que são aqui incorporados por referência. Em particular, o genoma de um linfócito B pode ser editado com o método de acordo com a presente invenção para expressar um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma cadeia pesada, em que a referida cadeia pesada compreende na direção terminal de C (i) um domínio variável, em particular um domínio variável de cadeia pesada (VH); (ii) o (poli) peptídeo de interesse; e (iii) um ou mais domínios constantes, em particular domínios constantes de cadeia pesada (CH), preferencialmente compreendendo pelo menos um domínio constante CH1.
[00129] Preferencialmente, o (poli) peptídeo de interesse (ii) da cadeia pesada não compreende, preferencialmente, um fragmento da cadeia leve.
[00130] Tais anticorpos projetados na região do cotovelo para conter um (poli) peptídeo de interesse podem, por exemplo, ligar simultaneamente (1) ao antígeno direcionado por seus domínios variáveis e (2) a um alvo adicional direcionado por um sítio de ligação introduzido na região do cotovelo do anticorpo - conforme descrito em detalhes em WO 2019/025391 A1 e em WO 2019/024979 A1 (PCT/EP2017/069357).
[00131] Em particular, uma variedade de anticorpos "Inserção em Cotovelo" (IEI) podem ser obtidos com o método de acordo com a presente invenção, conforme descrito neste documento. Anticorpos "Inserção em Cotovelo" (IEI) são descritos em detalhes em WO 2019/025391 A1 e em WO 2019/024979 A1 (PCT/EP2017/069357). Anticorpos preferenciaiss "In-Elbow- Inserts" (IEI), que podem ser obtidos com o método de acordo com a presente invenção, correspondem a modalidades preferenciais dos anticorpos "Inserção em Cotovelo" (IEI) descritos em WO 2019/025391 A1 e em WO 2019/024979 A1 (PCT/EP2017/069357).
[00132] No entanto, com o método de acordo com a presente invenção também podem ser obtidos outros anticorpos recombinantes. Em particular, é também preferencial que o genoma do linfócito B é editado para expressar uma cadeia de imunoglobulina modificada, em que um domínio variável endógeno é substituído pelo (poli) peptídeo de interesse. Consequentemente, é também preferencial que o genoma do linfócito B seja editado para expressar um receptor de células B modificado, em que um domínio variável endógeno é substituído pelo (poli) peptídeo de interesse. Consequentemente, é preferencial que o genoma do linfócito B seja editado para expressar um anticorpo modificado compreendendo o (poli) peptídeo de interesse "em vez" de um domínio variável endógeno.
[00133] Exemplos preferenciais de anticorpos compreendendo cadeias de imunoglobulina compreendendo um (poli) peptídeo de interesse em vez da região variável endógena e os arranjos genômicos correspondentes são mostrados na Figura 2B. A parte superior da Figura 2B mostra um anticorpo (do tipo igG clássico), em que a região variável endógena (V H) foi substituída por outra região variável (heteróloga) (VH). Na construção seguinte, a região variável endógena (VH) foi substituída por um domínio de receptor e outra região variável (heteróloga) (VH). No próximo construto, a região variável endógena (VH) foi substituída por três regiões variáveis (heterólogas) (VH –VL- VH). Na parte inferior da Figura 2B, a região variável endógena (V H) foi substituída por duas regiões variáveis (heterólogas) e uma região constante (heteróloga) (VL –CL-VH). O termo "heterólogo" refere-se a uma sequência, que é distinta da sequência endógena, ou seja, a sequência, que estava originalmente neste sítio genômico.
[00134] É também preferencial que o genoma do linfócito B seja editado para expressar uma cadeia de imunoglobulina modificada, em que os domínios constantes endógenos são substituídos pelo (poli) peptídeo de interesse. Consequentemente, é também preferencial que o genoma do linfócito B seja editado para expressar um receptor de células B projetado, em que os domínios constantes endógenos são substituídos pelo (poli) peptídeo de interesse. Consequentemente, é preferencial que o genoma do linfócito B seja editado para expressar um anticorpo modificado compreendendo o (poli)
peptídeo de interesse "em vez" de um domínio constante endógeno. Consequentemente, tal cadeia de imunoglobulina modificada compreende um domínio variável (endógeno), o (poli) peptídeo de interesse, mas nenhum domínio constante (endógeno).
[00135] As modificações, em que o (poli) peptídeo de interesse substitui o domínio variável endógeno, podem ser obtidas por introdução de uma sequência de nucleotídeos que codifica um sítio de clivagem, como um sítio de clivagem T2A, entre o éxon VDJ endógeno e a sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse. Modificações, em que o (poli) peptídeo de interesse substitui os domínios constantes endógenos, podem ser obtidas pela introdução de uma sequência de nucleotídeos que codifica um sítio de clivagem, tal como um sítio de clivagem T2A, entre a sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse e a sequência de nucleotídeos que codifica as regiões constantes.
[00136] Consequentemente, é preferencial que a molécula de DNA compreenda uma sequência de nucleotídeos que codifica um sítio de clivagem a montante e/ou a jusante da sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse. Preferencialmente, o sítio de clivagem é um sítio de clivagem T2A.
[00137] Conforme usado neste documento, o termo "sítio de clivagem" inclui clivagem enzimática (por exemplo, por proteases), bem como a "autoclivagem", por exemplo, por salto ribossomal. Os sítios para clivagem enzimática são conhecidos no estado da técnica. Os exemplos preferenciais incluem o marcador de clivagem 3C ("PreScission") para a protease 3C de rinovírus humano (HRV) (Sequência: LEVLFQGP; SEQ ID NO: 54); marcador de clivagem EKT (Enteroquinase) para Enteroquinase (Sequência: DDDDK; SEQ ID NO: 55); marcador de clivagem FXa (Fator Xa) para o Fator Xa (Sequência: IEGR; SEQ ID NO: 56); marcador de clivagem de TEV (vírus de gravação de tabaco) para protease de vírus de gravação de tabaco (Sequência: ENLYFQG; SEQ ID NO: 57); e marcador de clivagem de trombina para trombina (Sequência: LVPRGS; SEQ ID NO: 58). Em geral, os locais de clivagem por proteases ou peptidases permitem - pós-tradução - clivar a proteína traduzida do gene da imunoglobulina projetado. Por tal clivagem de proteína, por exemplo, por uma peptidase ou proteinase, os componentes de imunoglobulina covalentemente ligados compreendidos no produto do gene traduzido (uma única cadeia) são processados em fragmentos, alcançando assim os anticorpos modificados ou fragmentos de anticorpo como descrito acima.
[00138] Além disso, os locais de clivagem podem ser previstos in silico por várias ferramentas de bioinformática, incluindo, por exemplo: ⎯ PeptideCutter (URL: https://web.expasy.org/peptide_cutter/ ; Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins MR, Appel RD, Bairoch A.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005)); ⎯ PROSPER (URL: https://prosper.erc.monash.edu.au/webserver.html ; Song J, Tan H, Perry AJ, Akutsu T, Webb GI, Whisstock JC e Pike RN. PROSPER: an integrated feature- based tool for predicting protease substrate cleavage sites. PLoS ONE, 2012, 7 (11): e50300); ⎯ MEROPS (URL: https://www.ebi.ac.uk/merops/ ; Rawlings, ND, Barrett, AJ, Thomas, PD, Huang, X., Bateman, A. & Finn, RD (2018) The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Res 46, D624-D632); ⎯ TopFIND (URL: http://clipserve.clip.ubc.ca/topfind ; Nikolaus Fortelny, Sharon Yang, Paul Pavlidis, Philipp F. Lange *, Christopher M. Overall *, Nucleic Acids Research 43 (D1), D290-D297 (2014)); e
⎯ CutDB (URL: http://cutdb.burnham.org/ ; Igarashi Y, Eroshkin A, Gramatikova S, Gramatikoff K, Zhang Y, Smith JW, Osterman AL, Godzik A. CutDB: um banco de dados de eventos proteolíticos. Nucleic Acids Res. 2007 Jan;35(Database issue):D546-9).
[00139] Preferencialmente, o sítio de clivagem é um sítio de "autoclivagem" (também referido como sítio de "autoprocessamento"), como um sítio de salto ribossomal. Conforme usado neste documento, o termo "autoclivagem" ("autoprocessamento") refere-se a "clivagem" sem proteases, por exemplo, por salto ribossomal. Preferencialmente, uma sequência de nucleotídeos que codifica um sítio de autoprocessamento é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn- Pro-Gly - Pro, em que X pode ser qualquer aminoácido (DX1EX2NPGP, em que X1 é Val ou Ile e X2 pode ser qualquer aminoácido (de ocorrência natural); SEQ ID NO: 59). O salto ribossomal leva ao fornecimento de entidades separadas no curso da tradução do mRNA. O mecanismo subjacente é baseado na não formação de uma ligação covalente entre dois aminoácidos, ou seja, G (Gly) e P (Pro) durante a tradução do mRNA. Consequentemente, a tradução do mRNA não é interrompida pela não formação de uma ligação covalente entre Gly/Pro, mas sim prossegue sem parar a atividade ribossomal no mRNA. Em particular, os ribossomos não formam uma ligação de peptídeos entre estes aminoácidos, se um padrão de sequência Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly ≠ Pro ocorre em uma sequência de peptídeos. A não formação de uma ligação covalente ocorre entre a posição Gly-Pro do terminal C do trecho de aminoácido acima. Os sítios de autoprocessamento preferencials são os sítios 2A, como T2A (Sequência: EGRGSLLTCGDVEENPGP; SEQ ID NO: 60); F2A (Sequência: VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP; SEQ ID NO: 61); ou sequência P2A: ATNFSLLKQAGDVEENPGP; SEQ ID NO: 62); ou variantes de sequência das mesmas conforme descrito neste documento, em particular as variantes de sequência de acordo com a SEQ ID NO: 63 (GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP) ou SEQ ID NO: 64 (RKRRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP).
[00140] Mais preferencialmente, a molécula de DNA compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um sítio T2A (por exemplo SEQ ID NO: 60) ou uma sequência variante da mesma, conforme descrito neste documento.
[00141] Em algumas modalidades, a molécula de DNA não compreende uma fita de DNA de comprimento total de um cromossomo.
[00142] Em algumas modalidades, a molécula de DNA compreende um promotor. Mais especificamente, em algumas modalidades, a molécula de DNA pode compreender uma unidade de transcrição. O termo "unidade de transcrição" refere-se a uma sequência de nucleotídeos no DNA que codifica para uma única molécula de RNA, juntamente com as sequências necessárias para sua transcrição. Normalmente, uma unidade de transcrição compreende um promotor, uma sequência de codificação de RNA e um terminador. Exemplos de promotores e terminadores são bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, o promotor e o terminador podem ser iguais aos do gene de ocorrência natural em relação ao (poli) peptídeo codificado. Em algumas modalidades, o promotor (e/ou o terminador) é heterólogo (no que diz respeito ao (poli) peptídeo codificado; isto é, não ocorre no gene do (poli) peptídeo codificado na natureza). Em particular, a sequência de codificação de RNA (e a sequência de DNA correspondente na molécula de DNA) codifica tipicamente um (poli) peptídeo de interesse, por exemplo, como descrito neste documento. (Poli) peptídeo de interesse
[00143] O (poli) peptídeo de interesse pode ser heterólogo (isto é, não expresso pelo linfócito B na natureza) e/ou pode ser incluído em um polipeptídeo (ou proteína), que é heterólogo (isto é, não expresso pelo linfócito B na natureza; tal como um anticorpo modificado).
[00144] Tal como descrito acima, um (poli) peptídeo de interesse pode ser qualquer (poli) peptídeo, em particular que se pretende expressar como (parte de) um anticorpo personalizado ou fragmento de anticorpo. Em particular, o (poli) peptídeo de interesse compreende ou consiste em um (único) ou mais domínios funcionais. Em geral, o termo "domínio funcional" refere-se a uma unidade funcional, por exemplo, do anticorpo ou fragmento de anticorpo. Normalmente, um domínio funcional fornece a proteína, por exemplo, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo, com uma funcionalidade (adicional). Consequentemente, o domínio funcional (adicional) geralmente contém todos os aminoácidos/sequências necessárias para fornecer a função (adicional).
[00145] Preferencialmente, o domínio funcional (compreendido no (poli) peptídeo de interesse) tem um comprimento de até 1000 aminoácidos, mais preferencialmente de até 750 aminoácidos, ainda mais preferencialmente de até 500 aminoácidos, ainda mais preferencialmente de até até 400 aminoácidos, particularmente preferencialmente até 300 aminoácidos e mais preferencialmente até 275 ou 250 aminoácidos. Além disso, é preferencial que o domínio funcional tenha um comprimento de 5 a 1000 aminoácidos, mais preferencialmente de 10 a 750 aminoácidos, ainda mais preferencialmente de 20 a 500 aminoácidos, ainda mais preferencialmente de 50 a 400 aminoácidos, particularmente preferencialmente de 70 a 300 aminoácidos e mais preferencialmente de 75 a 275 ou de 100 a 250 aminoácidos.
[00146] É também preferencial que o domínio funcional (compreendido no (poli) peptídeo de interesse) tenha um tamanho de até 150 kDa, mais preferencialmente de até 100 kDa, ainda mais preferencialmente de até 80 kDa, ainda mais preferencialmente de até a 70 kDa, com particular preferência de até 50 kDa e mais preferencialmente de até 30 ou 25 kDa. Além disso, é preferencial que o domínio funcional tenha um tamanho de 0,5 kDa a 150 kDa, mais preferencialmente de 1 kDa a 100 kDa, ainda mais preferencialmente de 2,5 kDa a 80 kDa, ainda mais preferencialmente de 5 kDa a 70 kDa, particularmente preferencialmente de 7,5 kDa a 50 kDa e mais preferencialmente de 10 kDa a 30 ou 25 kDa.
[00147] O (poli) peptídeo de interesse pode compreender um domínio monomérico ou domínios multiméricos. Um domínio monomérico é um domínio que medeia sua funcionalidade sem o envolvimento de qualquer outro domínio (adicional). Os domínios multiméricos, por exemplo dois domínios formando um dímero ou três domínios formando um trímero, medeiam a sua funcionalidade em conjunto, em particular como multímero, por exemplo, como dímero ou trímero. No caso de domínios multiméricos, o (poli) peptídeo de interesse pode compreender ligantes como descrito neste documento para fornecer flexibilidade suficiente para formar o multímero, em particular, um ligante pode estar localizado (diretamente) adjacente a um ou mais domínios multiméricos, por exemplo entre dois domínios multiméricos ou em cada lado de todos os domínios multiméricos. Preferencialmente, o (poli) peptídeo de interesse compreende ou consiste em um ou mais domínios monoméricos.
[00148] Em geral, o (poli) peptídeo de interesse pode compreender ou consistir em um único domínio de proteína ou em mais de um domínio de proteína. “Mais de um domínio de proteína” podem ser domínios multiméricos conforme descrito acima e/ou um ou mais domínios monoméricos conforme descrito acima. Por exemplo, o (poli) peptídeo de interesse pode compreender ou consistir em dois ou três domínios monoméricos, que podem mediar a mesma funcionalidade ou funcionalidade distinta e/ou que podem ser opcionalmente conectados por um ligante. Por exemplo, o (poli) peptídeo de interesse pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 domínios de proteína (distintos).
[00149] Preferencialmente, o domínio funcional compreendido no (poli) peptídeo de interesse (mais preferencialmente o (poli) peptídeo completo de interesse) é uma proteína, peptídeo ou polipeptídeo humano ou um fragmento (em particular um domínio) ou um derivado deste.
[00150] O (poli) peptídeo de interesse também pode compreender um ligante, por exemplo, um ligante GS.
[00151] Um domínio funcional preferencial (compreendido no (poli) peptídeo de interesse) compreende ou consiste num domínio do tipo Ig; por exemplo, um domínio similar a Ig de uma proteína ou (poli) peptídeo, por exemplo, como exemplificado abaixo. A estrutura básica das moléculas de imunoglobulina (Ig) é um tetrâmero de duas cadeias leves e duas cadeias pesadas ligadas por ligações de dissulfeto. Existem dois tipos de cadeias leves: kappa e lambda, cada uma composta por um domínio constante (CL) e um domínio variável (VL). Existem cinco tipos de cadeias pesadas: alfa, delta, épsilon, gama e mu, todos consistindo em um domínio variável (VH) e três (em alfa, delta e gama) ou quatro (em épsilon e mu) domínios constantes (CH1 a CH4). As moléculas de Ig são proteínas altamente modulares, nas quais os domínios variável e constante têm padrões de sequência conservados e claros. Os domínios em Ig e moléculas similares a Ig são agrupados em quatro tipos: V-conjunto (variável), C1-conjunto (constante-1), C2-conjunto (constante-2) e I- conjunto (intermediário). Estudos estruturais mostraram que esses domínios compartilham uma estrutura de sanduíche beta de chave grega central comum, com os tipos diferindo no número de fitas nas folhas beta, bem como em seus padrões de sequência. Os domínios do tipo imunoglobulina que estão relacionados tanto na sequência como na estrutura podem ser encontrados em várias famílias de proteínas diversas. Domínios similares a Ig estão envolvidos em uma variedade de funções, incluindo reconhecimento de célula-célula, receptores de superfície de célula, estrutura muscular e sistema imunológico.
[00152] Os exemplos preferenciais de domínios similares a Ig incluem os domínios similares a Ig de qualquer uma ou das seguintes proteínas ou (poli) peptídeos: A1BG (glicoproteína alfa-1-B), ACAM, ADAMTSL1 (ADAMTS tipo 1), ADAMTSL3 (ADAMTS tipo 3), AGER (receptor específico de produto final de glicosilação avançada), ALCAM (molécula de adesão de células leucocitárias ativadas), ALPK3 (alfa quinase 3), AMIGO1 (molécula de adesão com domínio tipo Ig 1), AMIGO2 (molécula de adesão com domínio tipo Ig 2), AMIGO3 (molécula de adesão com domínio tipo Ig 3), AXL (receptor tirosina quinase AXL receptor), BCAM (molécula de adesão de célula basal (grupo de sangue luterano)), BOC (adesão de células BOC associada, oncogene regulada), BSG (basigina (grupo sanguíneo Ok)), BTLA (associado a linfócitos B e T), C10orf72, C20orf102, CADM1 (molécula de adesão de células 1), CADM3 (molécula de adesão de células 3), CADM4 (molécula de adesão de células 4), CCDC141 (domínio de bobina contendo 141), CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD22, CD33, CD47, CD48, CD80, CD84, CD86, CD96, CD101, CD160, CD200, CD244, CD276, CDON (adesão de células associada, regulada por oncogene), CEACAM1 (molécula de adesão de células relacionada ao antígeno carcinoembriônico 1), CEACAM5 (molécula de adesão de células relacionada ao antígeno carcinoembriônico 5), CEACAM6 (molécula de adesão de células relacionada ao antígeno carcinoembriônico 6), CEACAM7 (molécula de adesão de células relacionada ao antígeno carcinoembriônico 7), CEACAM8 (molécula de adesão de células relacionada ao antígeno carcinoembriônico 8), CEACAM16 (molécula de adesão de células relacionada ao antígeno carcinoembriônico 16), CEACAM18 (molécula de adesão de células relacionada ao antígeno carcinoembriônico 18), CEACAM20 (molécula de adesão de células relacionada ao antígeno carcinoembriônico 20), CEACAM21 (molécula de adesão de células relacionada ao antígeno carcinoembriônico 21), CHL1 (molécula de adesão de células tipo L1), CILP (proteína da camada intermediária da cartilagem), CILP2 (proteína 2 da camada intermediária da cartilagem), CLMP (proteína de membrana tipo CXADR), CNTFR (receptor do fator neurotrófico ciliar), CNTN1 (contactina 1), CNTN2 (contactina 2), CNTN3 (contactina 3), CNTN4 (contactina 4), CNTN5 (contactina 5), CNTN6 (contactina 6), CSF1R (receptor 1 do fator de estimulação de colônia), CXADR (CXADR, molécula de adesão de células tipo Ig), DSCAM (molécula de adesão de células DS), DSCAML1 (molécula de adesão de células DS tipo 1), EMB (embigina), ESAM (molécula de adesão de células endoteliais), F11R (receptor F11), FAIM3, FCMR (fragmento Fc do receptor IgM), HMCN1 (hemicentina 1), HMCN2 (hemicentina 2), FCAR
(fragmento Fc do receptor IgA), FCER1A (fragmento Fc do receptor IgE Ia), FCGR1A (fragmento Fc do receptor IgG Ia), FCGR1B (fragmento Fc do receptor IgG Ib), FCGR1CP (fragmento Fc do receptor IgG Ic, pseudogene), FCGR2A (fragmento Fc do receptor IgG IIa), FCGR2B (fragmento Fc do receptor IgG IIb), FCGR2C (fragmento Fc do receptor IgG IIc), FCGR3A (fragmento Fc do receptor IgG IIIa), FCGR3B (fragmento Fc do receptor IgG IIIb), FCRH1, FCRH3, FCRH4, FCRL1 (receptor Fc tipo 1), FCRL2 (receptor Fc tipo 2), FCRL3 (receptor Fc tipo 3), FCRL4 (receptor Fc tipo 4), FCRL5 (receptor Fc tipo 5), FCRL6 (receptor Fc tipo 6), FCRLA (receptor Fc tipo A), FCRLB (receptor Fc tipo B), FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FGFRL1, FLT1 (fms relacionado com tirosina quinase 1), FLT3 (fms relacionado com tirosina quinase 3), FLT4 (fms relacionado com tirosina quinase 4), FSTL4 (folistatina tipo 4), FSTL5 (folistatina tipo 5), GP6 (glicoproteína VI plaquetária), GPA33 (glicoproteína A33, GPR116, GPR125, ADGRF5 (receptor F5 acoplado à proteína G de adesão), ADGRA2 (receptor A2 acoplado à proteína G de adesão), hEMMPRIN, HEPACAM (molécula de adesão de células hepáticas e gliais), HEPACAM2 (membro da família HEPACAM 2), HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DQB, HLA-DQB1, HNT, HSPG2 (proteoglicano de sulfato de heparano 2), HYST2477, ICAM1 (molécula de adesão interde células 1), ICAM2 (molécula de adesão interde células 2), ICAM3 (molécula de adesão interde células 3), ICAM4 (molécula de adesão interde células 4 (grupo sanguíneo Landsteiner- Wiener)), ICAM5 (molécula de adesão interde células 5), DCC (netrina DCC 1 receptor), NEO1 (neogenina 1), IGHA1, IGHD, IGHE, IGDCC4 (membro da subclasse 4 da superfamília DCC da imunoglobulina), IGLON5 (membro da família 5 de IgLON), IGSF1 (membro da superfamília 1 de imunoglobulina), IGSF2 (membro da superfamília 2 da imunoglobulina), IGSF3 (membro da superfamília 3 de imunoglobulina), IGSF5 (membro da superfamília 5 de imunoglobulina), IGSF9 (membro da superfamília 9 de imunoglobulina), IGSF9B (membro da superfamília 9B de imunoglobulina), IGSF10 (membro da superfamília 10 de imunoglobulina), IGSF11 (membro da superfamília 11 de imunoglobulina), IGSF21 (membro da superfamília de imunoglobulina 21 superfamília), IGSF23 (membro da superfamília 23 de imunoglobulina), IL1R1 (receptor de interleucina 1 tipo 1), IL1R2 (receptor de interleucina 1 tipo 2), IL1RAP (proteína acessória de receptor de interleucina 1), IL1RAPL1 (proteína acessória de receptor de interleucina 1 tipo 1), IL1RAPL2 (proteína acessória do receptor de interleucina 1 tipo 2), IL1RL1 (receptor de interleucina 1 tipo 1), IL1RL2 (receptor de interleucina 1 tipo 2), IL6R (receptor de interleucina 6), IL11RA (subunidade alfa do receptor da interleucina 11), IL12B (interleucina 12B), IL18BP (proteína de ligação à interleucina 18), IL18R1 (receptor 1 da interleucina 18), IL18RAP (proteína acessória do receptor da interleucina 18), ISLR2 (superfamília de imunoglobulina contendo repetição rica em leucina 2), JAM2 (molécula de adesão juncional 2), JAM3 (molécula de adesão juncional 3), KDR (receptor de domínio de inserção de quinase), KIR-123FM, KIR2DL1 (receptor tipo imunoglobulina de célula exterminadora, dois domínios Ig e cauda citoplasmática longa 1), KIR2DL2 (receptor tipo imunoglobulina de células exterminadora, dois domínios de Ig e cauda citoplasmática longa 2), KIR2DL3 (receptor tipo imunoglobulina de células exterminadora, dois domínios de Ig e cauda citoplasmática longa 3), KIR2DL4 (receptor tipo imunoglobulina de células exterminadora, dois domínios de Ig e cauda citoplasmática longa 4), KIR2DL5A (receptor tipo imunoglobulina de célula exterminadora, dois domínios de Ig e cauda citoplasmática longa 5A), KIR2DL5B (receptor tipo imunoglobulina de células exterminadora, dois domínios de Ig e cauda citoplasmática longa 5B), KIR2DLX, KIR2DS1 (receptor tipo imunoglobulina de célula exterminadora, dois domínios de Ig e cauda citoplasmática curta 1), KIR2DS2 (receptor tipo imunoglobulina de célula exterminadora, dois domínios de Ig e cauda citoplasmática curta 2), KIR2DS3 (receptor tipo imunoglobulina de célula exterminadora, dois domínios de Ig e cauda citoplasmática curta 3), KIR2DS4 (receptor tipo imunoglobulina de célula exterminadora, dois domínios de Ig e cauda citoplasmática curta 4), KIR2DS5 (receptor tipo imunoglobulina de célula exterminadora, dois domínios de Ig e cauda citoplasmática curta 5),
kir3d, KIR3DL1 (receptor tipo imunoglobulina de célula exterminadora, três domínios de Ig e cauda citoplasmática longa 1), KIR3DL2 (receptor tipo imunoglobulina de célula exterminadora, três domínios de Ig e cauda citoplasmática longa 2), KIR3DL3 (receptor tipo imunoglobulina de célula exterminadora, três domínios de Ig e cauda citoplasmática longa 3), KIR3DP1 (receptor tipo imunoglobulina de célula exterminadora, três domínios Ig pseudogene 1, KIR3DS1 (receptor tipo imunoglobulina de célula exterminadora, três domínios de Ig e cauda citoplasmática curta 1), KIR3DX1 (receptor tipo imunoglobulina de célula exterminadora, três domínios de Ig X1), KIRREL1 (molécula de adesão da família da nefrina tipo kirre 1), KIRREL2 (molécula de adesão da família da nefrina tipo kirre 2), KIRREL3 (molécula de adesão da família da nefrina tipo kirre 3), KIT (receptor de proto-oncogene tirosina quinase), L1CAM, LAG3 (ativação de linfócitos 3), LAIR1 (receptor tipo imunoglobulina associada a leucócitos 1), LAIR2 (receptor tipo imunoglobulina associada a leucócitos 2), LEPR (receptor de leptina), LILRA1 (receptor tipo imunoglobulina leucocitária A1), LILRA2 (receptor tipo imunoglobulina leucocitária A2), LILRA3 (receptor tipo imunoglobulina leucocitária A3, LILRA4 (receptor tipo imunoglobulina leucocitária A4), LILRA5 (receptor tipo imunoglobulina leucocitária A5), LILRA6 (receptor tipo imunoglobulina leucocitária A6), LILRB1 (receptor tipo imunoglobulina leucocitária B1), LILRB2 receptor tipo imunoglobulina leucocitária B2), LILRB3 (receptor tipo imunoglobulina leucocitária B3), LILRB4 (receptor tipo imunoglobulina leucocitária B4), LILRB5 (receptor tipo imunoglobulina leucocitária B5), LILRP2, LRIG1, LRIG2, LRIG3, LRIT1, LRRC4, LSAMP, LSR (receptor de lipoproteína estimulado por lipólise), LY9 (antígeno linfocitário 9), MADCAM1 (molécula de adesão de células de endereçamento da mucosa vascular 1), MAG (glicoproteína associada à mielina), MALT1 (MALT1 paracaspase), MCAM (molécula de adesão de célula de melanoma), MDGA1 (domínio MAM contendo glicosilfosfatidilinositol âncora 1), MDGA2 (domínio MAM contendo glicosilfosfatidilinositol âncora 2), MERTK (proto-oncogene MER, tirosina quinase), MFAP3, MIR, MILR1 (imunoglobulina de mastócitos tipo receptor 1), MMP23A (matriz metalopeptidase 23A (pseudogene)), MMP23B (matriz metalopeptidase 23B), MUSK (receptor tirosina associado ao músculo quinase), MXRA5 (remodelação da matriz associada 5), MYBPC3, MYOM1 (miomasina 1), MYOM2 (mioomesina 2), MYOM3 (mioomesina 3), NCA, NCAM1, NCAM2, NCR1 (receptor 1 desencadeador de citotoxicidade natural), NEGR1, NEO1, NFASC, NOPE, NPHS1 (NPHS1, nefrina), NPTN (neuroplastina), NRCAM (molécula de adesão de células neuronal), NTRK1 (receptor neurotrófico tirosina quinase 1), NRG1, NT, NTRK3, OBSCN, OBSL1 (obscurina como 1), OPCML, OSCAR (osteoclasto associado a, receptor tipo imunoglobulina), PAPLN, PDCD1LG2 (morte de células programada 1 ligante 2), PDGFRA (receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas), PDGFRB (receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas), PDGFRL (receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas), PECAM1 (molécula de adesão de plaquetas e células endoteliais 1), PRODH2, PSG1 (beta-1-glicoproteína 1 específica da gravidez), PSG2 (beta-1-glicoproteína 2 específica da gravidez), PSG3 (beta-1-glicoproteína 3 específica da gravidez), PSG4 (beta-1-glicoproteína específica da gravidez 4), PSG5 (beta-1- glicoproteína 5 específica da gravidez), PSG6 (beta-1-glicoproteína 6 específica da gravidez), PSG7 (beta-1-glicoproteína 7 específica da gravidez (gene/pseudogene)), PSG8 (beta-1-glicoproteína 8 específica da gravidez), PSG9 (beta-1-glicoproteína 9 específica da gravidez), PSG10 (beta-1- glicoproteína 10 específica da gravidez), PSG11 (beta-1-glicoproteína 11 específica da gravidez), PSG11s '(beta-1-glicoproteína 11 específica da gravidez), PTGFRN (inibidor do receptor de prostaglandina F2), PTK7 (proteína tirosina quinase 7 (inativa)), PTPRD (proteína tirosina fosfatase, receptor tipo D), PTPRK (proteína tirosina fosfatase, receptor tipo K), PTPRM (proteína tirosina fosfatase, receptor tipo M), proteína tirosina fosfatase PTPRS, receptor tipo S), PTPRT (proteína tirosina fosfatase, receptor tipo T), PTPsigma, PUNC, PVR (receptor de poliovírus), PVRL1, PVRL2, PVRL4, NECTIN1 (molécula de adesão de células de nectina 1), NECTIN2 (molécula de adesão de células de nectina 2), NECTIN3 (molécula de adesão de células de nectina 3), RAGE, ROBO3 (receptor de orientação circular 3), SCN1B (subunidade beta 1 do canal controlado por voltagem de sódio), SDK1 (molécula de adesão de células auxiliar 1), SDK2 (molécula de adesão de células auxiliar 2), SEMA3A (semaforina 3A), SEMA3B (semaforina 3B), SEMA3E (semaforina 3E), SEMA3F (semaforina 3F), SEMA3G (semaforina 3G), SEMA4C (semaforina 3G) 4C), SEMA4D (semaforina 4D), SEMA4G (semaforina 4G), SEMA7A 8semaforina 7A (grupo sanguíneo John Milton Hagen)), SIGIRR (domínio contendo um único Ig e TIR), SIGLEC1 (ligação de ácido siálico Ig tipo lectina 1), SIGLEC5 (ligação de ácido siálico Ig tipo lectina 5), SIGLEC6 (ligação de ácido siálico Ig tipo lectina 6), SIGLEC7 (ligação de ácido siálico Ig tipo lectina 7), SIGLEC8 (ligação de ácido siálico Ig tipo lectina 8), SIGLEC9 (ligação de ácido siálico Ig tipo lectina 9), SIGLEC10 (ligação de ácido siálico Ig tipo lectina 10), SIGLEC11 (ligação de ácido siálico Ig tipo lectina 11), SIGLEC 12 (ligação de ácido siálico Ig tipo lectina 12 (gene/pseudogene)), SIGLEC14 (ligação de ácido siálico Ig tipo lectina 14), SIGLEC15 (ligação de ácido siálico Ig tipo lectina 15), SLAMF1 (membro da família de moléculas de ativação linfocítica de sinalização), SLAMF6 (membro da família SLAM 6), SLAMF8 (membro da família SLAM 8), SIRPG; TARM1 (receptor de ativação de células T interagindo em células mieloides 1), TEK (receptor de tirosina quinase TEK), antígeno de superfície de células THY1 Thy-1), TIE1 (tirosina quinase com domínios 1 do tipo imunoglobulina e EGF), TMEM81 (transmembranar proteína 81), TMIGD1 (domínio transmembrana e imunoglobulinar contendo 1), TMIGD2 (domínio transmembrana e imunoglobulinar contendo 2), TTN (titina), TYRO3 (proteína tirosina quinase TYRO3), UNC5D, VCAM1 (molécula de adesão de células vascular 1), VSIG1 (conjunto V e domínio de imunoglobulina contendo 1), VSIG2 (conjunto V e domínio de imunoglobulina contendo 2), VSIG4 (conjunto V e domínio de imunoglobulina contendo 4), VSIG10 (conjunto V e domínio de imunoglobulina contendo 10), VSIG10L (conjunto V e domínio de imunoglobulina contendo 10), VSTM1 (conjunto V e domínio transmembranar contendo 1), VTCN1 (domínio conjunto V contendo inibidor de ativação de células T 1), ZPBP (zona proteína de ligação à pelúcida) ou ZPBP2 (proteína 2 de ligação à zona pelúcida).
[00153] Mais preferencialmente, o domínio do tipo Ig é um domínio do tipo Ig de qualquer uma das seguintes proteínas: CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD22, CD33, CD80, CD86, em particular de CD4.
[00154] Além disso, também é preferencial que o (poli) peptídeo de interesse compreenda ou consista em um ou mais domínios de anticorpo, como um ou mais domínios variáveis (por exemplo, um domínio variável de cadeia leve (VL) ou um domínio variável de cadeia pesada (VH)) e/ou um ou mais domínios constantes (por exemplo, um domínio constante de cadeia leve (CL) ou um ou mais (dois ou três) domínios constantes de cadeia pesada (CH1, CH2, CH3)). Por exemplo, o (poli) peptídeo de interesse compreende ou consiste em um domínio VH (heterólogo). Em outro exemplo, o (poli) peptídeo de interesse compreende ou consiste em um domínio VH (heterólogo) e um domínio VL (heterólogo). Em outro exemplo, o (poli) peptídeo de interesse compreende ou consiste em dois VH (heterólogos) e um domínios VL (heterólogo) (por exemplo, VH-VL-VH). Em outro exemplo, o (poli) peptídeo de interesse compreende ou consiste em um domínio VH (heterólogo), um domínio CL (heterólogo) e um domínio VL (heterólogo) (por exemplo, VL-CL-VH). É também preferencial que o domínio do anticorpo possa ser combinado com outro domínio funcional como descrito neste documento, tal como um domínio do receptor (por exemplo, um domínio do receptor e um domínio VH).
[00155] Outros exemplos preferenciais de domínios do tipo Ig são descritos abaixo neste documento.
[00156] Outro domínio funcional preferencial (compreendido no (poli) peptídeo de interesse) compreende ou consiste em um domínio extra e/ou intrade células de uma proteína (conhecida). Além disso, o domínio funcional pode preferencialmente compreender ou consistir em um domínio de uma proteína globular solúvel (conhecida). Mais preferencialmente, o domínio funcional compreende ou consiste em um domínio extrade células de uma proteína (conhecida) ou um domínio de uma proteína globular solúvel (conhecida).
[00157] Preferencialmente, o domínio funcional (compreendido no (poli) peptídeo de interesse) compreende ou consiste em um domínio transportador, um domínio repórter, um marcador, um domínio de localização, um sítio de ligação (independente), uma enzima ou domínio enzimático, um receptor ou um fragmento funcional do mesmo, ou um ligando ou um fragmento funcional do mesmo.
[00158] Preferencialmente, o domínio funcional (compreendido no (poli) peptídeo de interesse) compreende ou consiste em uma enzima ou um domínio enzimático do mesmo. Uma “enzima” é um polipeptídeo ou catalisador de proteína, ou seja, uma enzima normalmente acelera uma reação química. As moléculas sobre as quais as enzimas podem atuar são chamadas de substratos e a enzima converte os substratos em diferentes moléculas conhecidas como produtos. Quase todos os processos metabólicos na célula precisam de enzimas para ocorrer em taxas rápidas o suficiente para manter a vida. As enzimas preferenciais incluem oxidorredutases, transferases, hidrolases, lisases, isomerases e ligases. Para enzimas, que formam um dímero, o (poli) peptídeo de interesse pode compreender dois domínios idênticos conectados por um ligante. Por exemplo, as enzimas podem ser úteis para ativar um pró-fármaco em um sítio específico, por exemplo, um tumor. Exemplos de enzimas preferenciais e usos de anticorpos compreendendo tais enzimas são descritos em Andrady C, Sharma SK, Chester KA; Antibody- enzyme fusion proteins for cancer therapy; Immunotherapy. 2011 Feb;3(2):193- 211 and in Boado RJ1, Zhang Y, Zhang Y, Xia CF, Wang Y, Pardridge WM; Genetic engineering of a lysosomal enzyme fusion protein for targeted delivery across the human blood-brain barrier; Biotechnol Bioeng. 2008 Feb 1;99(2):475-84.
[00159] As enzimas preferenciais são selecionadas a partir do grupo que consiste em desidrogenase, luciferase, DMSO redutase, Álcool desidrogenase (NAD), Álcool desidrogenase (NADP), Homosserina desidrogenase, Aminopropanol oxidoredutase, Diacetil redutase, Glicerol- fosfato desidrogenase, Glicerol-fosfato desidrogenase, propanerol-fosfato desidrogenase desidrogenase (NAD +), D-xilulose redutase, L-xilulose redutase, Lactato desidrogenase, Malato desidrogenase, Isocitrato desidrogenase, HMG-CoA redutase, Glucose oxidase, L-gulonolactona oxidase, Malato desidrogenase, Isocitrato desidrogenase, HMG-CoA redutase, Glucose oxidase, L-gulonolactona oxidase, Tiamina oxi-desidrogenase, Aceral desidrogenase, Tiamina oxida-desidrogeno-desidrogenase, Aceraldeído- oxidase desidrogenase, piruvato desidrogenase, oxoglutarato desidrogenase, biliverdina-redutase, inibidores da monoamina oxidase, di-hidrofolato-redutase, metilenotetrahidrofolato redutase, sarcosina-oxidase, Dihydrobenzophenanthridine oxidase, NADH desidrogenase, urato oxidase, nitrito redutase, nitrato-redutase, glutationa-redutase, tioredoxina redutase, sulfito oxidase, citocromo c oxidase, Coenzima Q - citocromo c redutase, catecol oxidase, lacase, citocromo c peroxidase, catalase, mieloperoxidase, tireoide peroxidase, glutationa peroxidase, 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase, Renilla-luciferina 2-monooxigenase, monoxigenase, cipridina-lucatasina- luciferina, cipridina-lucatasina-luciferina 2, cipridina-lucatasina-luciferina 2- monooxigenase, Oplophorus-luciferina 2-monooxigenase, Aromatase, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, Citocromo P450 oxidase, Óxido nítrico dioxigenase, Óxido nítrico sintase, Aromatase, Fenminilalanina-hidroxilase, Nitropinilodiose, Nitrinolutaminodissilase, Nitrinolutamida-desitromodase, Cerminodiolase, Cerinodiolase-desitromodase. transferase, transferase de catecol-O-metil, metiltransferase do ADN, Histona metiltransferase, ATCase, transcarbamilase de ornitina, sintetase de ácido aminolevulínico, colina acetiltransferase, o factor XIII, gama glutamil transpeptidase, transglutaminase, hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase, tiaminase, alanina transaminase,
aspartato transaminase, butirato quinase, Nuclease, Endonuclease, Éxonuclease, Hidrolase ácida, Fosfolipase A, Fosfolipase C, Acetilcolinesterase, Colinesterase, Lipoproteína lipase, Ubiquitina carboxi- terminal hidrolase L1, Fosfatase, Fosfatase alcalina, Frutose bisfosfatase, Enzima CGMP Fosfodiesterase de Restrição Tipo 2 específica, Fosfodiesterase de Restrição Tipo 2, Enzima de restrição Tipo 3, Enzima de restrição Tipo 4, Desoxirribonuclease I, RNase H, Ribonuclease, Amilase, Sucrase, Quitinase, Lisozima, Maltase, Lactase, Beta-galactosidase, Hialuronidase, Adenosilmetionina hidrolase hidrocerolase, S-adenosil-hidrocerolase-lincenil- homogase, Alquenilglicerofosfoetanolamina hidrolase, Colesterol-5,6-óxido hidrolase, Hepoxilina-epóxido hidrolase, Isochorismatase, Leucotrieno-A4 hidrolase, Limoneno-1,2-epóxido hidrolase, Enzima epóxido de microssoma hidrolase, hidrolase de conversão de epóxido de alanina, trans-epoxissucina hidrolase Serina protease, Quimotripsina, Tripsina, Trombina, Fator X, Plasmina, Acrosina, Facto r VII, Fator IX, Proliloligopeptidase, Fator XI, Elastase, Fator XII, Proteinase K, Ativador do plasminogênio tecidual, Proteína C, Separase, Pepsina, Rennet, Renina, Tripsinogênio, Plasmepsina, Matriz metaloproteinase, Metaloendopeptidase, Beta-lacse, Urease, Arginase, Adenosina desaminase, GTP ciclohidrolase I, Nitrilase, Helicase, DnaB helicase, RecQ helicase, ATPase, NaKATPase, ATP sintase, Quinureninase, Haloacetato desalogenase, Lyase, Ornitina descarboxilase-rubilase, Aminoácido-rubiscarboxilase, Uridina-CRO-aminofosfato, UridisCO - descarboxilase-aminofosfato de uridina., Anidrase carbônica, Triptofano sintase, Fenilalanina amônia-liase, Cistationina gama-liase, Cistationina beta- liase, Leucotrieno C4 sintase, Diclorometano desalogenase, Haloidrina desalogenase, Adenilato-ciclase, Guanilato ciclase: fenilalanina racemase, Serina racemase, mandelato racemase, UDP-glucose 4-epimerase, Metilmalonil CoA epimerase, FKBP: FKBP1A, FKBP1B, FKBP2, FKBP3, FKBP5, FKBP6, FKBP8, FKBP9, FKBP10, FKBP52, FKBPL, Ciclofilina, Parvulina, Prolil isomerase, 2-cloro-4-carboximetase beta-2-cloro-4-
carboximetase Caroteno isomerase, Farnesol 2-isomerase, Furilfuramida isomerase, Linoleato isomerase, Maleato isomerase, Maleato isomerase, Maleilacetoacetato isomerase, Maleilpiruvato isomerase, Parvulina, Fotoisomerase, Prolycopene isomerase, Prolil isomerase, Enulfato de isomerase, Proteinetol isomerase, Co-isomerase de isomerase, Retinetol isomerase, Coinetol isomerase, Retinol isomerase isomerase, Fosfoglucomutase, Muconato cicloisomerase, 3-carboxi-cis, cis-muconato cicloisomerase, Tetrahidroxipteridina cicloisomerase, Inositol-3-fosfato sintase, Carboxi-cis, cis-muconato ciclase, Calcona isomerase, Cloromuconato sinterase, Ciclo eucalenol cicloisomerase, Alfa-pineno-óxido deciclase, Dicloromuconato cicloisomerase, Copalil difosfato sintase, Ent-copalil difosfato sintase, Syn-copalil difosfato sintase, Terpen Tedienil-difosfato sintase, Halimadienil-difosfato sintase, (S) -beta-macrocarpeno sintase, Licopeno epsilon-ciclase, Licopeno beta-ciclase, Prosolanapirona-III cicloisomerase, D- ribose piranase, Esteróide Delta Isomerase, Tofoisomerase, 6-carboxinetra- tirease FARSB, Glutamina sintetase, CTP sintetase, Argininosuccinato sintetase, Piruvato carboxilase, Acetil-CoA carboxilase e DNA ligase.
[00160] Enzimas mais preferenciais podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em carboxipeptidase, β- lactamase, citosina desaminase, β- glucuronidase, fosforilase de nucleosídeo purina, granzima B, caspase e RNase, como HPR (RNase pancreática humana, barnase, RNase seminal bovina, onconase, RapLR1, angiogenina, dicer, éxonuclease 2 tipo DIS3, fosfodiesterase ELAC 2, RNase HIII, RNase T2 e ribonuclease de emenda de tRNA.
[00161] Um fragmento funcional de uma enzima pode ser qualquer fragmento de uma enzima, que tem a capacidade de mediar uma funcionalidade. Normalmente, esses fragmentos são chamados de “domínios”. Consequentemente, o fragmento funcional de uma enzima pode ser qualquer domínio da enzima. Os exemplos preferenciais incluem fragmentos funcionais (por exemplo, domínios) das enzimas (exemplificadas) descritas acima.
Preferencialmente, o fragmento funcional da enzima, que é compreendido pelo domínio funcional, é um domínio catalítico de uma enzima. O domínio catalítico de uma enzima é a região de uma enzima que interage com seu substrato para causar a reação enzimática. Por exemplo, o domínio funcional pode ser um domínio catalítico de qualquer uma das seguintes enzimas: carboxipeptidase, β- lactamase, citosina desaminase, β- glucuronidase, fosforilase de nucleosídeo purina, granzima B, caspase e RNase, como HPR (RNase pancreática humana, barnase, RNase seminal bovina, onconase, RapLR1, angiogenina, dicer, éxonuclease 2 tipo DIS3, fosfodiesterase ELAC 2, RNase HIII, RNase T2 e ribonuclease de emenda de tRNA.
[00162] Preferencialmente, o domínio funcional (compreendido no (poli) peptídeo de interesse) compreende ou consiste em um domínio de transportador. Conforme usado neste documento, um “domínio de transportador” refere-se a uma sequência de aminoácidos, que fornece a conjugação do anticorpo a outra molécula. Em um exemplo preferencial, o domínio de transportador fornece a conjugação do anticorpo, ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, a um fármaco, a um agente de imagem ou a uma nanopartícula. Em geral, exemplos preferenciais de conjugados, que podem ser úteis no contexto da presente invenção, são descritos em Wu, A. M., and Senter, P. D. (2005) Arming antibodies: Prospects and challenges for immunoconjugates. Nat. Biotechnol. 23, 1137–1146.
[00163] Por exemplo, os fármacos que podem ser conjugados com o anticorpo incluem os fármacos anticancerígenos, como os descritos em Thomas A, Teicher BA, Hassan R; Conjugados anticorpo-droga para terapia de câncer; Lancet Oncol. 2016 Jun;17(6):e254-62. doi: 10.1016/S1470-2045 (16) 30030-4. Por exemplo, os agentes de imagem, que podem ser conjugados ao anticorpo, são descritos em Steve Knutson, Erum Raja, Ryan Bomgarden, Marie Nlend, Aoshuang Chen, Ramaswamy Kalyanasundaram, and Surbhi Desai; Development and Evaluation of a Fluorescent Antibody-Drug Conjugate for Molecular Imaging and Targeted Therapy of Pancreatic Cancer; PLoS One
2016; 11(6): e0157762. Tais fármacos são preferencialmente agentes citotóxicos. Os exemplos preferenciais de fármacos, que podem ser conjugados com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção, incluem doxorrubicina, exotoxina A de Pseudomonas truncada, maitansinóide DM1.
[00164] Exemplos de agentes de imagem, que podem ser conjugados ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção, incluem radioisótopos, tais como aqueles descritos em Schubert M, Bergmann R, Förster C, Sihver W, Vonhoff S, Klussmann S, Bethge L, Walther M, Schlesinger J, Pietzsch J, Steinbach J, Pietzsch HJ; Novel Tumor Pretargeting System Based on Complementary l-Configured Oligonucleotides; Bioconjug Chem. 2017 Apr 19;28(4):1176-1188 and in Bhusari P, Vatsa R, Singh G, Parmar M, Bal A, Dhawan DK, Mittal BR, Shukla J; Development of Lu-177-trastuzumab for radioimmunotherapy of HER2 expressing breast cancer and its feasibility assessment in breast cancer patients; Int J Cancer. 2017 Feb 15;140(4):938-947. Os exemplos preferenciais de radioisótopos incluem 90Y, 131I, e 177Lu
[00165] Outros exemplos de agentes de imagem, que podem ser conjugados com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção, incluem corantes fluorescentes, pontos quânticos e óxido de ferro. Exemplos de corantes fluorescentes incluem aqueles descritos abaixo como domínios repórter. Um exemplo de nanopartículas de óxido de ferro é descrito em Hengyi Xu, Zoraida P. Aguilar, Lily Yang, Min Kuang, Hongwei Duan, Yonghua Xiong, Hua Wei, and Andrew Wang: Antibody Conjugated Magnetic Iron Oxide Nanoparticles for Cancer Cell Separation in Fresh Whole Blood. Biomateriais. 2011 Dec; 32(36): 9758–9765.
[00166] Os conjugados de anticorpos (isto é, anticorpos conjugados a outras moléculas) são conhecidos no estado da técnica. Em particular, a molécula conjugada ao anticorpo pode ser ligada ao anticorpo por um ligante clivável ou não clivável (por exemplo, conforme descrito em:
Thomas H. Pillow. Novel linkers and connections for antibody-drug conjugates to treat cancer and infectious disease. Pharmaceutical Patent Analyst Vol. 6, No. 1, 3 de fevereiro de 2017, https://doi.org/10.4155/ppa-2016-0032; ou em: Beck A, Goetsch L, Dumontet C, Corvaïa N. Strategies and challenges for the next generation of antibody-drug conjugates. Nat Rev Drug Discov. 2017 May;16(5):315-337). Exemplos de tais ligantes, que podem ser usados para ligar a molécula ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, são descritos, por exemplo, em EP 2927227 e em Thomas H. Pillow. Novel linkers and connections for antibody-drug conjugates to treat cancer and infectious disease. Pharmaceutical Patent Analyst Vol. 6, No. 1, 3 de fevereiro de 2017, https://doi.org/10.4155/ppa-2016-0032. No entanto, no estado da técnica, os ligantes são ligados diretamente aos domínios Ig do anticorpo (nomeadamente, aos domínios variáveis e/ou constantes do anticorpo), o que pode interferir com a funcionalidade dos domínios Ig do anticorpo. Em vista disso, o domínio funcional pode ser usado para ligação de um ligante ao anticorpo. Os ligantes preferenciais diferem dos ligantes "clássicos" porque eles são modificados para conter cisteínas ou lisinas adicionais. Preferencialmente, o domínio de transportador compreende um ou mais aminoácidos não canônicos úteis para conjugação específica de de sítio, por exemplo, como descrito em Link AJ, Mock ML, Tirrell DA. Non-canonical amino acids in protein engineering. Curr Opin Biotechnol. 2003 Dec;14(6):603-9. Além disso, o domínio transportador pode ser modificado de modo que seja reconhecido por enzimas específicas (tais como Enzima Geradora de Formilglicina, Sortase e/ou Transglutaminases), que modificam aminoácidos específicos que podem então ser usados para conjugação conforme descrito na seção 6 de Dennler P., Fischer E., Schibli R. Antibody conjugates: From heterogeneous populations to defined reagents. Antibodies. 2015; 4 : 197–224.
[00167] Outros domínios de transportadores preferenciais são domínios para conjugação, como material de reação cruzada geneticamente modificado (CRM) da toxina da difteria, toxóide do tétano (T), complexo de proteína da membrana externa meningocócica (OMPC), toxóide da difteria (D) e proteína H. influenzae D (HiD), por exemplo, conforme descrito em Pichichero ME: Protein carriers of conjugate vaccines: characteristics, development, and clinical trials, Hum Vaccin Immunother. 2013 Dec;9(12):2505-23.
[00168] Preferencialmente, o domínio funcional (compreendido no (poli) peptídeo de interesse) compreende ou consiste em um domínio repórter. Um domínio repórter é normalmente codificado por um gene repórter. Os domínios repórter são esses domínios, cuja presença (por exemplo, em uma célula, organismo) pode ser facilmente observada. Os domínios do repórter incluem, por exemplo, proteínas fluorescentes, como GFP/EGFP (proteína fluorescente verde/proteína fluorescente verde aprimorada), YFP (proteína fluorescente amarela), RFP (proteína fluorescente vermelha, como tdTomato ou DsRed) e CFP (proteína fluorescente ciano), luciferases e enzimas, como beta-galactosidase e peroxidase. Os domínios do repórter podem ser úteis para abordagens in vivo e ex vivo. Por exemplo, proteínas fluorescentes fazem com que uma célula fique fluorescente quando excitada com luz de um determinado comprimento de onda, as luciferases fazem com que uma célula catalise uma reação que produz luz e enzimas como a beta-galactosidase convertem um substrato em um produto colorido. Existem várias maneiras diferentes de medir ou quantificar um repórter, dependendo do repórter em particular e do tipo de dados de caracterização desejado. Em geral, a microscopia é útil para obter informações espaciais e temporais sobre a atividade do repórter, particularmente no nível de uma única célula. Os citômetros de fluxo são mais adequados para medir a distribuição da atividade do repórter em uma grande população de células. Leitores de placa são geralmente melhores para fazer medições da média da população de muitas amostras diferentes ao longo do tempo. Enzimas, tais como beta-galactosidase e peroxidase, que podem reagir a um determinado substrato, podem ser úteis, por exemplo, para colorações ex-vivo de amostras humanas, por exemplo, no diagnóstico de tumor. No entanto, em algumas modalidades, o (poli) peptídeo de interesse não compreende GFP (proteína fluorescente verde) ou RFP (proteína fluorescente vermelha, como tdTomato ou DsRed). Em mais geral, em algumas modalidades, o (poli) peptídeo de interesse não compreende uma proteína fluorescente (repórter). Portanto, em algumas modalidades, a molécula de DNA não compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica GFP ou RFP (ou, em mais geral, uma proteína fluorescente (repórter).
[00169] Preferencialmente, o domínio repórter compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que codifica para GFP/EGFP, YFP, RFP, CFP, luciferase, beta-galactosidase ou peroxidase. Além disso, os marcadores fluorescentes descritos abaixo também são úteis como domínios repórter.
[00170] Preferencialmente, o domínio funcional (compreendido no (poli) peptídeo de interesse) compreende ou consiste em um domínio de localização. Em geral, um domínio de localização direciona uma proteína para um determinado alvo, por exemplo, ao nível de um organismo ou de uma célula. Um domínio de localização pode direcionar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção para uma localização física particular na célula, tal como o núcleo, a membrana, o periplasma, secreção fora da célula, para uma parte específica do corpo, ou em outro lugar.
[00171] Por exemplo, a fim de direcionar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção em uma célula, o domínio funcional pode compreender ou consistir em um peptídeo de penetração de células. O termo " peptídeos de penetração de células" ("CPPs", também referidos como "domínio de transdução de proteína"/"PTD") é geralmente usado para designar peptídeos curtos que são capazes de transportar diferentes tipos de moléculas de carga através da membrana plasmática e, assim, facilitam a captação de células de várias cargas moleculares (de partículas nanométricas a pequenas moléculas químicas e grandes fragmentos de DNA). Os peptídeos de penetração de células tipicamente têm uma composição de aminoácidos que contém uma abundância relativa elevada de aminoácidos carregados positivamente, como lisina ou arginina, ou têm uma sequência que contém um padrão alternado de aminoácidos polares/carregados e aminoácidos não polares hidrofóbicos.
Esses dois tipos de estruturas são denominados policatiônicos ou anfipáticos, respectivamente.
Normalmente, os peptídeos de penetração de células (CPPs) são peptídeos de 8 a 50 resíduos que têm a capacidade de atravessar a membrana de células e entrar na maioria dos tipos de células.
Alternativamente, eles também são chamados de domínio de transdução de proteína (PTDs) refletindo sua origem como ocorrendo em proteínas naturais.
Frankel e Pabo simultaneamente a Green e Lowenstein descreveram a capacidade do ativador transcricional transativador do vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-TAT) de penetrar nas células (Frankel, AD e CO Pabo, Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus.
Cell, 1988. 55 (6): p. 1189-93). Em 1991, a transdução em células neurais do homeodomínio de Antennapedia (domínio de ligação de DNA) de Drosophila melanogaster foi descrita (Joliot, A., et al., Antennapedia homeobox peptide regulates neural morphogenesis.
Proc Natl Acad Sci USA, 1991. 88 (5): p. 1864-8). Em 1994, o primeiro peptídeo CPP 16-mer chamado Penetratina foi caracterizado a partir da terceira hélice do homeodomínio da Antennapedia (Derossi, D., et al., The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.
J Biol Chem, 1994. 269 (14): p. 10444-50), seguido em 1998 pela identificação do domínio mínimo de TAT, necessário para a transdução de proteína (Vives, E., P.
Brodin, and B.
Lebleu, A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus.
J Biol Chem, 1997. 272 (25): p. 16010-7). Nas últimas duas décadas, dezenas de peptídeos foram descritos de diferentes origens, incluindo proteínas virais, por exemplo, VP22 (Elliott, G. and P.
O'Hare, Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein.
Cell, 1997. 88 (2): pág. 223-33), ou de venenos,
por exemplo, melitina (Dempsey, CE, The actions of melittin on membranes. Biochim Biophys Acta, 1990. 1031 (2): pág. 143-61), mastoporan (Konno, K., et al., Structure and biological activities of eumenine mastoparan-AF (EMP-AF), um novo peptídeo degranulação de mastócitos no veneno da vespa solitária (Anterhynchium flavomarginatum micado). Toxicon, 2000. 38 (11): p. 1505-15), maurocalcina (Esteve, E., et al., Transduction of the scorpion toxin maurocalcine into cells.. Evidence that the toxin crosses the plasma membrane. J Biol Chem, 2005. 280(13): p. 12833-9), crotamine (Nascimento, F.D., et al., Crotamine mediates gene delivery into cells through the binding to heparan sulfate proteoglycans. J Biol Chem, 2007. 282 (29): pág. 21349-60) ou buforin (Kobayashi, S., et al., Membrane translocation engine of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry, 2004. 43 (49): p. 15610-6). As CPPs sintéticas também foram modificadas incluindo a poli-arginina (R8, R9, R10 e R12) (Futaki, S., et al., Arginine-rich peptides. Uma fonte abundante de peptídeos permeáveis à membrana com potencial como transportadores para a entrega de proteínas intrade células. J Biol Chem, 2001. 276 (8): pág. 5836-40) ou transportan (Pooga, M., et al., Cell penetration by transportan. FASEB J, 1998. 12 (1): pág. 67-77). Qualquer uma das CPPs descritas acima pode ser usada como peptídeo de penetração de células no anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção. Várias CPPs, que podem ser usadas como peptídeo de penetração de células no anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção, também são divulgados na revisão: Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60, 2012.
[00172] Outro exemplo de um domínio de localização, que pode ser usado no anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção é um domínio para cruzar a barreira hematoencefálica, por exemplo, conforme descrito em Farrington GK, Caram-Salas N, Haqqani AS, Brunette E, Eldredge J, Pepinsky B, Antognetti G, Baumann E, Ding W, Garber E, Jiang S, Delaney C, Boileau E, Sisk WP, Stanimirovic DB. Uma nova plataforma para a manipular produtos biológicos biespecíficos que cruzam a barreira hematoencefálica. FASEB J. Nov 2014; 28 (11): 4764-78.
[00173] Um outro exemplo de um domínio de localização é um domínio de localização nuclear. Um domínio de localização nuclear direciona uma proteína, em particular o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção, para o núcleo da célula. Um domínio de localização nuclear pode ser útil para um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno para bloquear a atividade de um fator de transcrição e para modular a expressão do gene. Exemplos preferenciais de domínios de localização nuclear são descritos emKalderon D, Roberts BL, Richardson WD, Smith AE (1984) "A short amino acid sequence able to specify nuclear location" Cell 39 (3 Pt 2): 499–509 e em Lusk CP, Blobel G, King MC (maio de 2007) "Estrada para a membrana nuclear interna: regras para a estrada" Nature Reviews Molecular Cell Biology 8 (5): 414–20.
[00174] Preferencialmente, o domínio funcional (compreendido no (poli) peptídeo de interesse) compreende ou consiste em um marcador. Mais preferencialmente, o marcador é um marcador de afinidade, uma marcador de solubilização, uma marcador de cromatografia, uma marcador de epítopo ou uma marcador de fluorescência.
[00175] Uma marcador é uma sequência de peptídeo enxertada em uma proteína recombinante. Exemplos de marcadores incluem marcadores de afinidade, marcadores de solubilização, marcadores de cromatografia, marcadores de epítopo, marcadores de fluorescência e marcadores de proteína. Marcadores de afinidade podem ser usados para purificar proteínas de sua fonte biológica bruta usando uma técnica de afinidade. Exemplos de marcadores de afinidade incluem proteína de ligação à quitina (CBP), proteína de ligação à maltose (MBP) e glutationa-S-transferase (GST). Um outro exemplo é a marcador poli (His) que se liga a matrizes metálicas. Podem ser usados marcadores de solubilização, especialmente para proteínas recombinantes expressas em espécies deficientes em chaperonas, como E.
coli, para auxiliar da flexão adequada em proteínas e evitar que elas precipitem. Exemplos de marcadores de solubilização incluem tioredoxina (TRX) e poli (NANP). Marcadores de cromatografia podem ser usados para alterar as propriedades cromatográficas da proteína para fornece diferentes resoluções em uma técnica de separação particular. Os marcadores de cromatografia geralmente consistem em aminoácidos polianiônicos, como a marcador FLAG. Os marcadores de epítopo são sequências de peptídeos curtas que são escolhidas porque os anticorpos de alta afinidade pode ser produzidos de forma confiável em muitas espécies diferentes. Geralmente são derivados de genes virais, o que explica sua alta imunorreatividade. Os marcadores de epítopo incluem V5-tag, Myc-tag, HA-tag e NE-tag. Esses marcadores são particularmente úteis para experiências de western blotting, imunofluorescência e imunoprecipitação, embora também encontrem uso na purificação de anticorpos. Os marcadores de fluorescência podem ser usados para fornecer uma leitura visual de uma proteína. GFP e suas variantes são os marcadores de fluorescência mais comumente usadas. GFP pode ser usado como um repórter dobrável (fluorescente se dobrado, incolor se não). Os marcadores de proteína podem permitir a modificação enzimática específica (como biotinilação por biotina ligase) ou modificação química (como reação com FlAsH-EDT2 para imagens de fluorescência). Os marcadores podem ser combinados, por exemplo, a fim de conectar proteínas a vários outros componentes. Os marcadores podem ser removidos por agentes químicos ou por meios enzimáticos, como proteólise ou emenda de inteína.
[00176] Os exemplos preferenciais de marcadores incluem, mas não estão limitados a, o seguinte: marcador twin-Strep (SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK; SEQ ID NO: 65); AviTag, um peptídeo que permite a biotinilação pela enzima BirA e, portanto, a proteína pode ser isolada por estreptavidina (GLNDIFEAQKIEWHE; SEQ ID NO: 66); marcador de calmodulina, um peptídeo ligado pela proteína calmodulina (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL; SEQ ID NO: 67); marcador poliglutamato, um peptídeo que se liga de forma eficiente a uma resina de troca aniônica, tal como Mono-Q (EEEEEE; SEQ ID NO: 68); marcador E, um peptídeo reconhecido por um anticorpo (GAPVPYPDPLEPR; SEQ ID NO: 69); marcador FLAG, um peptídeo reconhecido por um anticorpo (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 70); marcador HA, um peptídeo de hemaglutinina reconhecido por um anticorpo (YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 71); marcador His, 5-10 histidinas ligadas por um quelato de níquel ou cobalto (HHHHHH; SEQ ID NO: 72); marcador Myc, um peptídeo derivado de c-myc reconhecido por um anticorpo (EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 73); marcador NE, um peptídeo sintético de 18 aminoácidos (TKENPRSNQEESYDDNES; SEQ ID NO: 74) reconhecido por um anticorpo IgG1 monoclonal, que é útil em um amplo espectro de aplicações, incluindo Western blotting, ELISA, citometria de fluxo, imunocitoquímica, imunoprecipitação e purificação por afinidade de proteínas recombinantes; marcador S, um peptídeo derivado de Ribonuclease A (KETAAAKFERQHMDS; SEQ ID NO: 75); marcador SBP, um peptídeo que se liga a estreptavidina (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP; SEQ ID NO: 76); marcador Sof 1, para expressão em mamíferos (SLAELLNAGLGGS; SEQ ID NO: 77); marcador Sof 3, para expressão procariótica (TQDPSRVG; SEQ ID NO: 78); marcador Strep, um peptídeo que se liga à estreptavidina ou à estreptavidina modificada chamada estreptactina (marcador Strep II: WSHPQFEK; SEQ ID NO: 79); marcador TC, um marcador de tetracisteína que é reconhecida pelos compostos biarsênicos FlAsH e ReAsH (CCPGCC; SEQ ID NO: 80); marcador V5, um peptídeo reconhecido por um anticorpo (GKPIPNPLLGLDST; SEQ ID NO: 81); marcador VSV, um peptídeo reconhecido por um anticorpo (YTDIEMNRLGK; SEQ ID NO: 82); marcador Xpress (DLYDDDDK; SEQ ID NO: 83); marcador Isopep, um peptídeo que se liga covalentemente à proteína pilin-C (TDKDMTITFTNKKDAE; SEQ ID NO: 84); marcador Spy, um peptídeo que se liga covalentemente à proteína SpyCatcher (AHIVMVDAYKPTK; SEQ ID NO: 85); marcador Snoop um peptídeo que se liga covalentemente à proteína SnoopCatcher
(KLGDIEFIKVNK; SEQ ID NO: 86); marcador Ty1 (EVHTNQDPLD; SEQ ID NO: 87); BCCP (Biotin Carboxyl Carrier Protein), um domínio de proteína biotinilado por BirA que permite o reconhecimento por estreptavidina; marcador glutationa-S-transferase (GST), uma proteína que se liga à glutationa imobilizada; marcador de proteína fluorescente verde, uma proteína que é espontaneamente fluorescente e pode ser ligada por nanocorpos; marcador Halo, um haloalcano deshalogenase bacteriana mutada que se liga covalentemente a um substrato haloalcano reativo, permite a fixação a uma ampla variedade de substratos; marcador (MBP) de proteína de ligação a maltose, uma proteína que se liga a amilose agarose; marcador Nus (substância de utilização N); marcador Tiorredoxina (Trx); marcador de Antígeno Fasciola hepatica de 8 kDa (Fh8) ; marcador modificada de ubiquitina pequena (SUMO); marcador de sequências de peptídeos intensificadoras de solubilidade (SET); marcador de Domínio IgG B1 da proteína G (GB1) ; marcador de Domínio de repetição de IgG ZZ da proteína A (ZZ); S olubilidade e N hancing U biquitous T ag (SNUT) -tag; Proteína de dezessete quilodaltons (Skp) -tag; Fago T7 proteína quinase (T7PK) -tag; marcador de proteína A (EspA) segregada por E. coli ; Proteína do bacteriófago monomérico T7 0.3 (proteína Orc)/marcador Mocr ; Inibidor de tripsina de E. coli (Ecotin) -tag; Proteína de ligação ao cálcio (CaBP) -tag; Arseniato-redutase responsiva ao estresse (ArsC) -tag; Fragmento N-terminal do fator de iniciação da tradução IF2 (IF2-domínio I) -tag; Marcador de expressividade (fragmento N-terminal do fator de iniciação da tradução IF2); Proteínas responsivas ao estresse RpoA, SlyD, Tsf, RpoS, PotD, Crr-tags ; Proteínas ácidas de E. coli msyB, yjgD, tags rpoD (ver por exemplo, Costa S, Almeida A, Castro A, Domingues L. Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system. Frontiers in Microbiology. 2014; 5: 63, em particular a Tabela 1 em Costa et al., 2014).
[00177] Consequentemente, é preferencial que o marcador compreenda ou consista em uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NO: 65-87 ou uma variante de sequência do mesmo. Mais preferencialmente, o marcador é um marcador Strep, em particular de acordo com a SEQ ID NO: 65 ou 79.
[00178] Preferencialmente, o domínio funcional (compreendido no (poli) peptídeo de interesse) compreende ou consiste em um receptor ou um fragmento funcional do mesmo (também referido como "domínio receptor"). Um "receptor" é um polipeptídeo ou proteína, que se liga a uma molécula (sinal) específica, seu ligante, e que pode iniciar uma resposta, por exemplo, em uma célula. Na natureza, os receptores estão em particular localizados na ou na membrana de células (receptores da superfície de células) ou intrade célulasmente (receptores intrade células). Receptores preferenciais incluem receptores ligados a canais iônicos (ionotrópicos), receptores de hormônios ligados à proteína G (metabotrópicos) e receptores de hormônios ligados a enzimas, receptores citoplasmáticos e receptores nucleares. Para receptores, que formam um dímero, o (poli) peptídeo de interesse pode compreender dois domínios idênticos conectados por um ligante.
[00179] Os receptores preferenciais são os receptores que compreendem um domínio do tipo Ig. Em particular, o receptor pode ser um receptor inibidor que compreende um domínio do tipo Ig ou um receptor de ativação que compreende um domínio do tipo Ig. Os exemplos preferenciais de receptores inibitórios compreendendo um domínio do tipo Ig incluem proteína de morte de células programada 1 (PD-1 ou PD1), proteína associada a linfócitos T citotóxicos 4 (CTLA4), atenuador de linfócitos B e T (BTLA), T- imunoglobulina de células e domínio de mucina contendo-3 (TIM-3; também conhecido como receptor de células 2 do vírus da hepatite A (HAVCR2)), imunorreceptor de células T com domínios Ig e ITIM (TIGIT), receptor CD200 de glicoproteína de superfície de células 1 (CD200R1), 2B4 (CD244; SLAMF4), transcrito similar ao transcrito 2 do tipo Trem (receptor de disparo expresso em células mielóides) (TLT2), receptor similar à imunoglobulina de leucócito membro 4 da subfamília B (LILRB4) e receptor similar à imunoglobulina de células assassinas, dois domínios de Ig e citoplasma longo Cauda 2 (KIR2DL2). Os exemplos preferenciais de receptores de ativação compreendendo um domínio do tipo Ig incluem estimulador COS de células T induzíveis (ICOS) e CD28. Particularmente preferencial, o receptor é a proteína 1 de morte de células programada (PD-1 ou PD1) ou molécula de ativação de linfócitos de sinalização (SLAM).
[00180] Outros receptores preferenciais são os receptores solúveis, por exemplo, conforme divulgado em Heaney ML, Golde DW. Soluble receptors in human disease. J Leukoc Biol. 1998 Aug;64(2):135-46. Exemplos destes incluem TNFR (receptor do fator de necrose tumoral), p55, p75, Fas (CD95), receptor do fator de crescimento de nervo, CD27, CD30, receptor do hormônio do crescimento, receptor GM-CSF, receptor da eritropoietina (EpoR), receptor da trombopoietina, receptor G-CSF, IL-1RI (receptor I de interleucina 1), IL-1RII (receptor II de interleucina 1), IL-2Rα (receptor αde interleucina 2, Tac, CD25), IL-4R (receptor de interleucina 4), IL-5R α (receptor α da interleucina 5), IL-7R (receptor da interleucina 7), IL-6R α (receptor α da interleucina 6), gp130, CNTFR (receptor do fator neurotrófico ciliar), LIFR (receptor do fator inibidor da leucemia), receptor da leptina, IL- 11R (receptor de interleucina 11), IL-12 p40 (receptor de interleucina 12 p40), receptor de fator de células-tronco (c-kit), receptor de interferon, receptor de lipopolissacarídeo (CD14), receptor de complemento tipo I (CD35), receptor de hialuronato (CD44), CD58, receptor de IgE (Fc RII, CD23), receptor de IgG (Fc RII), ICAM-1 (CD54), ICAM-3 (CD50), receptor III do fator de crescimento transformanteβ, receptor do fator de crescimento epidérmico (c-erb B), receptor do fator de crescimento endotelial vascular, receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento de fibroblastos, receptor de fator-1 estimulador de colônia (MCFR, c-fms), ARK (receptor adrenérgico quinase), Tie (receptor de angiopoietina), receptor de insulina,
receptor de fator de crescimento similar à insulina-II e receptor de manose 6- fosfato.
[00181] Mais preferencialmente, o receptor solúvel é um receptor de citocina solúvel, tal como um receptor da superfamília de receptores de citocinas de classe I, um receptor de superfamília de receptores de citocinas de classe II, um receptor de família IL-1/TLR, um receptor de família de receptores TGF- β, uma superfamília de TNFR receptor, ou IL-17R. Os receptores preferenciais da superfamília de receptores de citocinas de classe I incluem IL- 4Rα, IL-5Rα, IL-6Rα, IL-7Rα, IL-9Rα, EpoR, G-CSFR, GM-CSFRα, gp130, e LIFRα. Receptores preferenciais de superfamília do receptor de citoquina de classe II incluem a de tipo I IFNR, tais como IFNAR1 e IFNAR2α. Os receptores preferenciais da família IL-1/TLR incluem IL-1RII e IL-1RacP. Os receptores preferenciais da família de receptores TGF- β incluem TβR-I e cinase 7 similar a receptor de ativina. Os receptores preferenciais da superfamília TNFR incluem TNFRSF6/Fas/CD95 e TNFRSF9/4-1BB/CD137. Portanto, exemplos preferenciais de receptores de citocinas incluem IL-4Rα, IL-5Rα, IL-6Rα, IL- 7Rα, IL-9Rα, EpoR, G-CSFR, GM-CSFRα, gp130, LIFRα, IFNAR1, IFNAR2α, IL-1RII, IL-1RacP, TβR-I, receptor de activina de tipo cinase 7, TNFRSF6/Fas/CD95, TNFRSF9/4-1BB/CD137 e IL-17R. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo compreendendo um domínio funcional compreendendo tal receptor ou um fragmento funcional do mesmo pode modular a resposta inflamatória enquanto o anticorpo atinge seu alvo. Por exemplo, os receptores solúveis de IL-1 tipo II (sIL-1RII), que são gerados principalmente por clivagem proteolítica em resposta a uma variedade de estímulos, podem atenuar a bioatividade excessiva de IL-1 ligando-se preferencialmente a IL-1β. Por exemplo, IL-1RAcP solúvel, que é gerado por emenda alternativa em vez de por clivagem de ectodomínio. Por exemplo, os receptores solúveis de IL-6 ligam-se a IL-6 com uma afinidade similar ao IL-6R de membrana, prolongando assim a meia-vida de IL-6.
[00182] Um fragmento funcional de um receptor pode ser qualquer fragmento de um receptor, que tem a capacidade de mediar uma funcionalidade.
Normalmente, esses fragmentos são chamados de “domínios”. Consequentemente, o fragmento funcional de um receptor pode ser qualquer domínio do receptor.
Os exemplos preferenciais incluem fragmentos funcionais (por exemplo, domínios) dos receptores (exemplificados) descritos acima.
Preferencialmente, o fragmento funcional do receptor, que é constituído pelo domínio funcional, é um domínio extrade células de um receptor.
Por exemplo, o domínio funcional pode ser um domínio extrade células de qualquer um dos seguintes receptores IL-4Rα, IL-5Rα, IL-6Rα, IL-7Rα, IL-9Rα, EpoR, G-CSFR, GM-CSFRα, gp130, LIFRα, IFNAR1, IFNAR2α, IL-1RII, IL-1RacP, TβR-I, receptor de activina de tipo cinase 7, TNFRSF6/Fas/CD95, TNFRSF9/4- 1BB/CD137, IL-17R, p55, p75, receptor do fator de crescimento nervoso, CD27, CD30, receptor do hormônio do crescimento, receptor da trombopoietina, IL-1RI (receptor I da interleucina 1), IL-2R α (receptor α da interleucina 2, Tac, CD25), CNTFR (receptor de fator neurotrófico ciliar), receptor de leptina, IL-11R (receptor de interleucina 11), IL-12 p40 (receptor de interleucina 12 p40), receptor de fator de células-tronco (c-kit), receptor de interferon, receptor de lipopolissacarídeo (CD14), receptor de complemento tipo I (CD35), receptor de hialuronato (CD44), CD58, receptor de IgE (Fc RII, CD23), receptor de IgG (Fc RII), ICAM-1 (CD54), ICAM-3 (CD50), receptor III do fator de crescimento transformante β, receptor do fator de crescimento epidérmico (c-erb B), receptor do fator de crescimento endotelial vascular, receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas, receptor de fator de crescimento de fibroblastos, fator-1 estimulador de colônia (MCFR, c-fms), ARK (receptor adrenérgico quinase), Tie (receptor de angiopoietina), receptor de insulina, receptor de fator de crescimento similar à insulina-II e receptor de manose 6-fosfato.
[00183] Preferencialmente, o fragmento funcional do receptor, que é constituído pelo domínio funcional é um domínio do tipo Ig. Por exemplo, o domínio funcional pode ser um domínio do tipo Ig de qualquer um dos seguintes receptores PD1, SLAM, LAIR1, CTLA4, BTLA, TIM-3, TIGIT, CD200R1, 2B4 (CD244), TLT2, LILRB4, KIR2DL2, ICOS or CD28. Preferencialmente, o domínio funcional não compreende um domínio transmembranar. Mais preferencialmente, o receptor compreende ou consiste em (um fragmento de) PD1, SLAM ou LAIR1, tal como uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs 88-90 ou uma sequência variante desta.
[00184] Além disso, é particularmente preferencial que o domínio funcional compreenda ou consista em um fragmento do receptor 1 do tipo imunoglobulina associado a leucócitos mutado (LAIR1), conforme descrito em WO 2016/207402 A1. O fragmento LAIR1 mutado conforme estabelecido na SEQ ID NO: 88, ou uma sequência variante do mesmo tendo pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente 90%, particularmente preferencialmente 95%, e mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade de sequência é o mais preferencial.
[00185] Fragmento de LAIR1 mutado :
EDLPRPSISAEPGTVIPLGSHVTFVCRGPVGVQTFRLERERNYLYS
DTEDVSQTSPSESEARFRIDSVNAGNAGLFRCIYYKSRKWSEQSDYLELVVK [SEQ ID NO: 88]
[00186] Particularmente preferencial, o domínio funcional (compreendido no (poli) peptídeo de interesse) compreende ou consiste em um fragmento tipo a Ig de PD1 ou SLAM, tal como uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em SEQ ID NO: 89 ou em SEQ ID NO: 90, ou uma sequência variante do mesmo tendo pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente 90%,
particularmente preferencialmente 95%, e mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade de sequência.
[00187] Fragmento de PD-1:
DSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRM SPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTY
LCGAISLAPKAQIKESLRAELRVT [SEQ ID NO: 89]
[00188] Fragmento de SLAM:
EQVSTPEIKVLNKTQENGTCTLILGCTVEKGDHVAYSWSEKAGTHP
LNPANSSHLLSLTLGPQHADNIYICTVSNPISNNSQTFSPWPGCRTDPS [SEQ ID NO: 90]
[00189] Preferencialmente, o domínio funcional (compreendido no (poli) peptídeo de interesse) compreende ou consiste em um ligante ou um fragmento funcional do mesmo. Um "ligante" é uma molécula que se liga especificamente a um sítio específico em uma proteína ou qualquer outra molécula. No contexto da presente invenção, o ligante é um peptídeo, polipeptídeo ou proteína, uma vez que está compreendido no (poli) peptídeo de interesse. A ligação de um ligante ocorre em particular por forças intermoleculares, como ligações iônicas, ligações de hidrogênio e forças de Van der Waals. Os exemplos preferenciais de ligantes são citocinas e ligantes de qualquer um dos receptores descritos acima, em particular dos receptores PD1, SLAM, LAIR1, CTLA4, BTLA, TIM-3, TIGIT, CD200R1, 2B4 (CD244), TLT2, LILRB4, KIR2DL2, ICOS ou CD28, tal como PD-L1, PD-L2, B7-1, B7-2, B7-H4 (homólogo B7), galectina-9, receptor de poliovírus (PVR), glicoproteína de membrana OX-2, CD48, B7 -H3 (homólogo B7), MHCI e ICOS-L.
[00190] Preferencialmente, o ligante é uma citocina ou um fragmento funcional da mesma. As citocinas são geralmente pequenas proteínas (~ 5–20 kDa) que são importantes na sinalização da célula. Eles são liberados pelas células e afetam o comportamento de outras células e, às vezes, afetam o comportamento da própria célula de liberação. Uma citocina pode ser selecionada a partir de quimiocinas, como a família SIS de citocinas, a família SIG de citocinas, a família SCY de citocinas, a superfamília do fator 4 de plaquetas e intercrinas, ligantes de quimiocina CC (CCL) -1 a -28 (em particular CCL12), CXCL1 - CXCL17, XCL1 (linfotactina- α) e XCL2 (linfotactina- β), fractalcina (ou CX 3 CL1); interferons, como IFN tipo I, IFN tipo II e IFN tipo III, em particular IFN- α, IFN- β, IFN- γ, IFN- ε, IFN- κ, IFN- ω, IL10R2 (também denominado CRF2-4) e IFNLR1 (também denominado CRF2-12); interleucinas, como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL- 12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL- 34, IL-35 e IL-36; linfocinas, tais como IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, GM-CSF e Interferon-gama; fatores de necrose tumoral, como CD40LG (TNFSF5); CD70 (TNFSF7); EDA; FASLG (TNFSF6); LTA (TNFSF1); LTB (TNFSF3); TNF, TNFα, TNFSF4 (OX40L); TNFSF8 (CD153); TNFSF9; TNFSF10 (TRAIL); TNFSF11 (RANKL); TNFSF12 (TWEAK); TNFSF13; TNFSF13B; TNFSF14; TNFSF15; e TNFSF18; e fatores estimuladores de colônia, como CSF1 (também conhecido como "fator estimulador de colônia de macrófago"), CSF2 (também conhecido como "fator estimulador de colônia de macrófago granulócito"; GM-CSF e sargramostim), CSF3 (também conhecido como "colônia de granulócitos de fator estimulante”; G-CSF e filgrastim), bem como CSFs sintéticos, como a Promegapoietina.
Portanto, os exemplos preferenciais de citocinas incluem IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL -24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, IL- 36, CCL-1, CCL-2, CCL-3, CCL-4, CCL-5, CCL-6, CCL-7, CCL-8, CCL-9, CCL-10, CCL-11, CCL-12, CCL -13, CCL-14, CCL-15, CCL-16, CCL-17, CCL- 18, CCL-19, CCL-20, CCL-21, CCL-22, CCL-23, CCL-24, CCL-25, CCL-26, CCL-27, CCL-28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL2, CXCL15, CXCL14, CXCL15, CXCL14, CXCL15, CXCL9, fractalcina, IFN-α,
IFN-β, IFN-γ, IFN-ε, IFN-κ, IFN-ω, IL10R2, IFNLR1, CD40LG, CD70, EDA, FASLG (TNFSF6), LTA (TNFSF1), LTB (TNFSF3), TNFα, TNFSF4 (OX40L), TNFSF8 (CD153), TNFSF9, TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (RANKL), TNFSF12 (TWEAK), TNFSF13, TNFSF13B, TNFSF14, TNFSF15, TNFSF18, CSF1, CSF2 (GM-CSF) e CSF3 (G-CSF). Os exemplos mais preferenciais de citocinas incluem IL-2, IL6, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, interferons GM-CSF, e TNF. As citocinas são produzidas por uma ampla variedade de células, incluindo células imunológicas como macrófagos, linfócitos B, linfócitos T e mastócitos, bem como células endoteliais, fibroblastos e várias células do estroma, em que uma determinada citocina pode ser produzida por mais de um tipo da célula. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo compreendendo um domínio funcional compreendendo tal citocina ou um fragmento funcional desta pode desencadear uma resposta imunoestimulante pró-inflamatória ou uma resposta imunossupressora ou citotóxica anti-inflamatória, dependendo da citocina selecionada.
[00191] Outros ligantes preferenciais incluem, por exemplo, hormônios, que são peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Os hormônios são moléculas sinalizadoras transportadas pelo sistema circulatório para atingir órgãos distantes, em particular para regular a fisiologia e o comportamento. Os hormônios são normalmente produzidos por glândulas em organismos multide células. Um hormônio particularmente preferencial é o hormônio de crescimento (humano). Outros exemplos de hormônios incluem TRH, vasopressina, insulina, prolactina, ACTH, oxitocina, peptídeo natriurético atrial (ANP), glucagon, somatostatina, colecistocinina, gastrina, leptina, angiotensina II, fator de crescimento de fibroblastos básico-2 e proteína relacionada ao hormônio da paratireóide.
[00192] Um fragmento funcional de um ligante pode ser qualquer fragmento de um ligante, que tem a capacidade de mediar uma funcionalidade. Normalmente, esses fragmentos são chamados de “domínios”. Consequentemente, o fragmento funcional de um ligante pode ser qualquer domínio do ligante. Os exemplos preferenciais incluem fragmentos funcionais (por exemplo, domínios) dos ligantes (exemplificados) descritos acima. Preferencialmente, o fragmento funcional do ligante, que está compreendido no domínio funcional, é um domínio do tipo Ig.
[00193] Preferencialmente, o domínio funcional (compreendido no (poli) peptídeo de interesse) compreende ou consiste em um sítio de ligação (independente). Consequentemente, é preferencial que o (poli) peptídeo de interesse compreenda ou consista num sítio de ligação (independente).
[00194] Em geral, o " sítio de ligação (independente) " é uma região de uma cadeia de (poli) peptídeo à qual um alvo específico (por exemplo, uma molécula e/ou um íon) pode se ligar, em particular formando uma ligação química, para exemplo, uma ligação não covalente. Uma ligação não covalente é uma ligação química relativamente fraca que não envolve um compartilhamento íntimo de elétrons. Múltiplas ligações não covalentes frequentemente estabilizam a conformação de macromoléculas e medeiam interações altamente específicas entre as moléculas. Consequentemente, o sítio de ligação é um domínio funcional, que fornece funcionalidade de ligação. Em particular, o sítio de ligação não é um ligante, como um ligante GS. Um ligante normalmente não fornece uma funcionalidade de ligação. Mesmo que o sítio de ligação possa opcionalmente compreender um ligante (peptídeo), como um ligante GS, preferencialmente não consiste em um ligante (peptídeo), como um ligante GS. Por outras palavras, mesmo se o sítio de ligação compreender um ligante (peptídeo), tal como um ligante GS, compreende preferencialmente uma sequência de aminoácidos adicional que medeia uma função distinta de (puramente) ligar dois peptídeos um ao outro. Consequentemente, o sítio de ligação é preferencialmente distinto de um ligante (peptídeo), tal como um ligante GS.
[00195] Preferencialmente, o sítio de ligação (independente) é selecionado a partir do grupo que consiste em receptores e fragmentos funcionais dos mesmos, ligantes e fragmentos funcionais dos mesmos,
moléculas de CD e fragmentos funcionais dos mesmos, anticorpos de cadeia única e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, antígenos e fragmentos funcionais dos mesmos, e marcadores.
[00196] Mais preferencialmente, o sítio de ligação (independente) compreende ou consiste em um receptor ou um fragmento funcional do mesmo. Os receptores são tipicamente capazes de se ligar a um ligante (específico). Consequentemente, os receptores também podem ser referidos como sítios de ligação (independentes). Vários receptores são descritos acima e modalidades preferenciais e exemplos dos mesmos se aplicam em conformidade.
[00197] No contexto do sítio de ligação, um fragmento funcional de um receptor é esse fragmento do receptor, que retém a capacidade do receptor de se ligar ao seu ligante. Uma vez que o sítio de ligação pode compreender um receptor ou um fragmento funcional do mesmo, é a função de ligação do receptor, à qual o termo "funcional" se refere no contexto do sítio de ligação. Outros fragmentos/domínios do receptor podem ser preferencialmente não compreendidos pelo sítio de ligação (independente). Por exemplo, um receptor pode compreender um ou mais domínios transmembranares, que geralmente não estão envolvidos na função de ligação do receptor e que são, portanto, preferencialmente não incluídos no sítio de ligação (independente). Consequentemente, é mais preferencial que o fragmento do receptor, que é compreendido pelo sítio de ligação (independente), seja meramente o sítio de ligação do receptor (em particular sem quaisquer outros domínios do receptor).
[00198] É também mais preferencial que o sítio de ligação (independente) compreenda ou consista em um ligante ou um fragmento funcional do mesmo. Os ligantes são tipicamente capazes de se ligar a um receptor (específico). Consequentemente, os ligantes também podem ser referidos como sítios de ligação (independentes). Vários ligantes são descritos acima e modalidades preferenciais e exemplos dos mesmos se aplicam em conformidade.
[00199] No contexto do sítio de ligação, um fragmento funcional de um ligante é um tal fragmento do ligando, que retém a capacidade de ligação do ligante. Uma vez que o sítio de ligação pode compreender um ligante ou um fragmento funcional do mesmo, é a função de ligação do ligante, à qual o termo "funcional" se refere no contexto do sítio de ligação. Outros fragmentos/domínios do ligante podem ser preferencialmente não compreendidos pelo sítio de ligação (independente). Consequentemente, é mais preferencial que o fragmento do ligante, que é compreendido pelo sítio de ligação (independente), seja meramente o sítio de ligação do ligante (em particular sem quaisquer outros domínios do ligante).
[00200] Preferencialmente, o sítio de ligação (independente) é uma molécula de CD (cluster de diferenciação) ou um fragmento funcional da mesma. Uma molécula de CD (cluster de diferenciação) é um marcador de superfície de células. As moléculas de CD frequentemente atuam como receptores ou ligantes ou estão envolvidas na adesão de células. A nomenclatura do CD foi desenvolvida e é mantida através do workshop HLDA (Human Leukocyte Differentiation Antigens) iniciado em 1982. Exemplos de moléculas de CD, que podem servir como sítios de ligação no contexto da presente invenção, podem ser recuperados, por exemplo, de uma variedade de fontes conhecidas pelos versados no estado da técnica, tais como http: //www.ebioscience. com/resources/human-cd-chart.htm, “Human and Mouse CD Marker Handbook” da BD Bioscience (disponível em https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf) ou em www.hcdm.org. Consequentemente, o sítio de ligação (independente) pode ser um marcador de CD, ou um fragmento funcional do mesmo, por exemplo, um marcador de CD (humano) descrito no "Human and Mouse CD Marker Handbook" da BD Bioscience (recuperável em https: // www. bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf) ou em outras fontes de “gráficos de marcadores de CD”, que normalmente também indicam os parceiros de ligação, de modo que um sítio de ligação apropriado possa ser selecionado.
[00201] Um fragmento funcional de uma molécula de CD é esse fragmento da molécula de CD, que retém a capacidade de ligação da molécula de CD. No contexto da presente invenção, o sítio de ligação pode compreender uma molécula de CD ou um fragmento funcional da mesma e, consequentemente, é a função de ligação da molécula de CD a que o termo "funcional" se refere. Outros fragmentos/domínios da molécula de CD podem ser preferencialmente não compreendidos pelo sítio de ligação (independente). Consequentemente, é mais preferencial que o fragmento da molécula de CD, que é compreendido pelo sítio de ligação (independente), seja meramente o sítio de ligação da molécula de CD (em particular sem quaisquer outros domínios da molécula de CD). Preferencialmente, o fragmento funcional da molécula de CD, que é compreendido pelo sítio de ligação (independente) é um domínio do tipo Ig.
[00202] Preferencialmente, o sítio de ligação (independente) é um anticorpo de cadeia simples (como scFv ou VHH) ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Também é preferencial que o sítio de ligação (independente) seja um antígeno ou um fragmento funcional do mesmo, como um epítopo.
[00203] Preferencialmente, o sítio de ligação (independente) é um anticorpo de cadeia simples ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Um anticorpo de cadeia única é um anticorpo recombinante que consiste em apenas uma única cadeia de polipeptídeos. Os exemplos preferenciais de anticorpos de cadeia única incluem anticorpos de cadeia única sem domínios constantes, como anticorpos de domínio único, anticorpos de cadeia única com base em fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) e diacorpos de cadeia única (scDb) e anticorpos de cadeia única com domínios constantes, como fragmentos Fab de cadeia simples (scFab; Hust M, Jostock
T, Menzel C, Voedisch B, Mohr A, Brenneis M, Kirsch MI, Meier D, Dübel S. Fragmento Fab de cadeia simples (scFab). BMC Biotechnol. 2007 Mar 8;7:14).
[00204] Os exemplos preferenciais de anticorpos de cadeia única com base em fragmentos variáveis de cadeia única (scFv's) incluem scFv (um único VH e um único domínio VL) e scFv's em tandem, tais como tandem-di- scFv (BiTE), tandem-tri-scFv e tandem- tetra-scFv.
[00205] Um anticorpo de domínio único (também referido como "nanocorpo") é um fragmento de anticorpo que compreende/consiste em um único domínio variável (monomérico) apenas. Como um anticorpo inteiro, um anticorpo de domínio único é capaz de se ligar seletivamente a um antígeno específico. Os primeiros anticorpos de domínio único foram projetados a partir de anticorpos de cadeia pesada encontrados em camelídeos; estes são chamados de “ VHH” ou “fragmentos VHH”. Os peixes cartilaginosos também têm anticorpos de cadeia pesada (IgNAR, 'novo receptor de antígeno de imunoglobulina'), a partir dos quais anticorpos de domínio único, chamados “ VNAR” ou “ fragmentos VNAR”, podem ser obtidos. Uma abordagem alternativa é dividir os domínios variáveis diméricos da imunoglobulina G comum (IgG) de humanos ou camundongos em monômeros. Consequentemente, os anticorpos de domínio único podem ser derivados de domínios variáveis de cadeia pesada ou leve (VH ou VL). Os exemplos preferenciais de anticorpos de domínio único incluem VHH, VNAR, VH derivado de IgG e VL derivado de IgG.
[00206] Mais preferencialmente, o domínio funcional é um VHH ou um scFv. Um exemplo mais preferencial de um VHH é T3-VHH ou F4-VHH. Por exemplo, o anticorpo de domínio único preferencialmente compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 91 ou 93, ou uma sequência variante do mesmo tendo pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente 90%, particularmente preferencialmente 95%, e mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade de sequência. Um exemplo mais preferencial de um scFv é TT39.7-scFv ou MPE8-scFv. Por exemplo, o anticorpo de domínio único preferencialmente compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 92 ou 94, ou uma sequência variante do mesmo tendo pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente 90%, particularmente preferencialmente 95%, e mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade de sequência.
[00207] T3-VHH:
MAQVQLVESGGGLVQAGGSLTLSCAASGSTSRSYALGWFRQAPG KEREFVAHVGQTAEFAQGRFTISRDFAKNTVSLQMNDLKSDDTAIYYCVASNR
GWSPSRVSYWGQGTQVTVSS [SEQ ID NO: 91]
[00208] TT39.7-scFv:
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSRVGVGWIRQPPGKAL EWLSLIYWDDEKHYSPSLKNRVTISKDSSKNQVVLTLTDMDPVDTGTYYCAHR GVDTSGWGFDYWGQGALVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSG SPGQSITISCSGAGSDVGGHNFVSWYQQYPGKAPKLMIYDVKNRPSGVSYRF
SGSKSGYTASLTISGLQAEDEATYFCSSYSSSSTLIIFGGGTRLTVL [SEQ ID NO: 92]
[00209] F4-VHH:
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYYIGWFRQAPGKE REAVSCISGSSGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCA
TIRSSSWGGCVHYGMDYWGKGTQVTVSS [SEQ ID NO: 93]
[00210] MPE8-scFv:
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKG LEWVSSISASSSYSDYADSAKGRFTISRDNAKTSLFLQMNSLRAEDTAIYFCAR ARATGYSSITPYFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVVTQPPSV SGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYDNNNRPSGVPD RFSASKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDRNLSGVFGTGTKVTVL
[SEQ ID NO: 94]
[00211] Preferencialmente, o sítio de ligação (independente) é um antígeno ou um fragmento funcional do mesmo, em particular um epítopo. Um antígeno é uma molécula, ou uma porção de uma molécula capaz de ser ligada por um anticorpo. Como o antígeno, ou o fragmento funcional do mesmo, é compreendido pela cadeia de polipeptídeo, entende-se que, no contexto da presente invenção, se o sítio de ligação for um antígeno ou um fragmento funcional do mesmo, o referido antígeno ou fragmento funcional do mesmo é um peptídeo ou polipeptídeo. Um antígeno normalmente compreende um ou mais epítopos. O epítopo é a parte do antígeno que é ligada por um anticorpo (“reconhecida” por um anticorpo). Os exemplos preferenciais de antígenos incluem, mas não estão limitados a, proteínas séricas, por exemplo, citocinas como IL4, IL5, IL9 e IL13, peptídeos bioativos, moléculas de superfície de células, por exemplo, receptores, transportadores, canais de íons, proteínas virais e bacterianas, RAGE (Receptor para produtos finais de glicosilação avançada), GPVI e colágeno.
[00212] Um fragmento funcional de um antígeno é esse fragmento do antígeno, que retém a capacidade de ligação do antígeno. Consequentemente, o fragmento do antígeno é preferencialmente um epítopo ou compreende um ou mais epítopos. Outros fragmentos/domínios do antígeno podem ser preferencialmente não compreendidos pelo sítio de ligação (independente). Consequentemente, é mais preferencial que o fragmento do antígeno, que é compreendido pelo sítio de ligação (independente), seja um epítopo ou inclua mais de um epítopo (em particular sem quaisquer outros domínios do antígeno).
[00213] É também preferencial que o sítio de ligação (independente) seja uma etiqueta compreendendo um sítio de ligação. A maioria dos marcadores é capaz de se ligar, por exemplo, marcadores de afinidade. Consequentemente, esses marcadores, que têm a capacidade de se ligar a outra molécula, também podem ser referidos como sítios de ligação
(independentes). Vários marcadores, incluindo marcadores compreendendo um sítio de ligação, são descritos acima e modalidades preferenciais e exemplos se aplicam em conformidade.
[00214] Mais preferencialmente, o domínio funcional é um domínio do tipo Ig, um scFv, um VHH ou um marcador Strep. Em particular, o domínio funcional preferencialmente compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs 65, 79 e 88-94, ou uma sequência variante desta tendo pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95% e mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade de sequência.
[00215] Em uma modalidade particularmente preferencial, o (poli) peptídeo de interesse compreende ou consiste em um domínio V H ou um domínio VH - VL, como descrito acima. É também preferencial que o (poli) peptídeo de interesse compreenda ou consista num domínio de ligação do patógeno, isto é, um domínio que compreende ou consiste num sítio de ligação, que é capaz de se ligar especificamente a um patógeno. Em geral, o termo "patógeno" se refere a qualquer coisa que pode produzir doença, em particular um agente infeccioso derivado de um microrganismo ou o próprio microrganismo. O patógeno pode ser selecionado a partir de um patógeno bacteriano, um patógeno viral, um patógeno fúngico, um patógeno priônico, um patógeno protozoário, um patógeno de (outro) parasita (humano), por exemplo, helmintos ou um patógeno de algas.
[00216] É particularmente preferencial um (poli) peptídeo de interesse compreendendo ou consistindo em CD4, dipeptidil peptidase 4, CD9 ou enzima de conversão da angiotensina 2 ou um fragmento ou variante de sequência. Por exemplo, cluster de diferenciação (CD) 4 liga o vírus da imunodeficiência humana (HIV). Por exemplo, a dipeptidil peptidase 4 (DPP-4) e o CD9 são direcionados pelo Coronavírus da Síndrome Respiratória do Oriente Médio "(MERS-CoV). Por exemplo, a enzima de conversão de angiotensina 2 (ACE2) se liga à síndrome respiratória aguda grave (SARS- CoV).
[00217] Um exemplo particularmente preferencial da sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 111; ou uma sequência (funcional) variante do mesmo tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 88%, mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, ainda mais preferencialmente pelo menos 96%, ainda mais preferencialmente pelo menos 97%, e mais preferencialmente pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[00218] Consequentemente, exemplos particularmente preferenciais da molécula de DNA a ser introduzida na célula B isolada de acordo com a presente invenção incluem uma molécula de DNA compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 99 ou 110; ou uma sequência (funcional) variante do mesmo tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 88%, mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, ainda mais preferencialmente pelo menos 96%, ainda mais preferencialmente pelo menos 97%, e mais preferencialmente pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência. Cultura de linfócitos B e ativação de AID
[00219] Conforme descrito acima, a presente invenção fornece um método para editar o genoma de um linfócito B. Em particular, o genoma de linfócitos B pode ser editado de modo que o linfócito B não expresse seu receptor de célula B endógeno (isto é, recombinado naturalmente) (BCR),
como descrito acima. Por exemplo, o genoma do linfócito B pode ser editado para substituir os receptores de células B endógenos (BCRs) por sequências de anticorpos customizados (monoclonais).
[00220] Para editar o genoma de um linfócito B, o linfócito B isolado (preferencialmente primário) é fornecido em cultura em particular. Os métodos para a cultura de células B isoladas (preferencialmente primárias) são conhecidos no estado da técnica.
[00221] Em geral, as condições de cultura normalmente compreendem um "meio de cultura completo". O termo "meio de cultura" em geral, conforme usado neste documento, refere-se a um líquido ou gel modificado para suportar o crescimento de células. Um "meio de cultura completo" refere-se a um meio basal, preferencialmente um meio sintético basal, suplementado com pelo menos um componente adicional. Exemplos não limitativos de meios de cultura completos são descritos em WO 03/076601, WO 05/007840, EP 787180, US 6.114.168, US 5.340.740, US 6.656.479, US
5.830.510 e em Pain et al. (1996, Development 122: 2339-2348).
[00222] Conforme usado neste documento, "meio basal" refere-se a um meio que permite, por si só, pelo menos a sobrevivência de células e, preferencialmente, o crescimento de células. Em particular, um meio basal tem uma formulação de meio clássica. Exemplos não limitativos de meios basais incluem BME (Eagle's Basal Medium), MEM (mínimo Eagle Medium), meio 199, DMEM (Dulbecco's Eagle Medium), Knockout DMEM, GMEM (Glasgow modified Eagle medium), DMEM-HamF12, Ham- F12 e Ham-F10, meio de Iscove modificado Dulbecco (IMDM), meio MacCoy's 5A e RPMI 1640. Em particular, os meios basais compreendem um ou mais sais inorgânicos (por exemplo CaCl2, KCI, NaCl, NaHCO3, NaH2PO4, MgSO4, etc.), um ou mais aminoácidos, uma ou mais vitaminas (por exemplo tiamina, riboflavina, ácido fólico, pantotenato de D-Ca, etc.) e/ou um ou mais outros componentes, como por exemplo glicose, beta-mercapto-etanol e piruvato de sódio.
Preferencialmente, o meio basal é um meio sintético. Mais preferencialmente, o meio basal é IMDM e/ou RPMI.
[00223] Preferencialmente, o meio de cultura da invenção compreende ainda soro animal, em particular soro animal fetal. O soro animal preferencial é o soro fetal bovino (FBS). Um FBS particularmente preferencial é HyClone (GE Healthcare Life Sciences; por exemplo, HyClone 40 mm filtrado, SH30070.03). No entanto, o soro animal compreendendo soro de outras espécies animais também pode ser usado. A concentração final de soro animal no meio de cultura é preferencialmente de aproximadamente 0,01 - 10%, preferencialmente 0,05 - 5%, mais preferencialmente, 0,1 - 2,5%, ainda mais preferencialmente 0,5 - 1,5% e mais preferencialmente cerca de 1%.
[00224] O meio de cultura da invenção pode compreender, preferencialmente, antibióticos adicionais, como por exemplo penicilina e estreptomicina e/ou canamicina, em particular para prevenir a contaminação bacteriana. Desse modo, uma combinação de penicilina/estreptomicina é preferencial. Além disso, também a canamicina é preferencial. Por exemplo, o meio de cultura final pode compreender penicilina/estreptomicina e/ou canamicina. Preferencialmente, a concentração de antibiótico no meio de cultura é de 1 a 1000 U/mL, mais preferencialmente de 10 a 500 U/mL, ainda mais preferencialmente de 50 a 250 U/mL, e particularmente preferencialmente cerca de 100 U/mL. Por exemplo, uma combinação de penicilina/estreptomicina pode ser usada nas seguintes concentrações de antibiótico no meio de cultura final: de 1 a 1000 U/mL de penicilina e de 1 a 1000 µg/mL de estreptomicina, mais preferencialmente de 10 a 500 U/mL penicilina e de 10 a 500 µg/mL estreptomicina, ainda mais preferencialmente de 50 a 250 U/mL de penicilina e de 50 a 250 µg/mL de estreptomicina, e particularmente preferencialmente cerca de 100 U/mL de penicilina e cerca de 100 µg/mL de estreptomicina. É também preferencial que a concentração de penicilina/estreptomicina no meio de cultura final seja de 0,01 - 10%, preferencialmente 0,05 - 5%, mais preferencialmente, 0,1 - 2,5%, ainda mais preferencialmente 0,5 - 1,5% e mais preferencialmente cerca de 1%. É também preferencial que a concentração de canamicina no meio de cultura final seja de 0,01 - 10%, preferencialmente 0,05 - 5%, mais preferencialmente, 0,1 - 2,5%, ainda mais preferencialmente 0,5 - 1,5% e mais preferencialmente cerca de 1%.
[00225] Além disso, o meio de cultura da presente invenção pode compreender preferencialmente outros aditivos, por exemplo, um derivado de glutamina, preferencialmente GlutaMax, NEAA, um tampão biológico, preferencialmente HEPES, piruvato (por exemplo, piruvato de sódio), β - mercapto-etanol e/ou transferrina. Em geral, os aditivos acima e outros podem ser usados em concentrações de acordo com o fabricante.
[00226] O derivado de glutamina pode ser, por exemplo, L- glutamina ou GlutaMax, em que GlutaMax é preferencial. GlutaMax é um L- alanil-L-glutamina, dipeptídeo que está disponível, por exemplo, como L-alanil- L-glutamina dipeptídeo 200 mM em NaCl 0,85% (solução estoque 100x). O derivado de glutamina é preferencialmente usado no meio de cultura final em uma concentração de 0,1 a 100 mM, mais preferencialmente de 0,5 a 50 mM, ainda mais preferencialmente de 1 a 10 mM, particularmente preferencialmente cerca de 2 mM. É também preferencial que a concentração de GlutaMax no meio de cultura final seja de 0,01 - 10%, preferencialmente 0,05 - 5%, mais preferencialmente, 0,1 - 2,5%, ainda mais preferencialmente 0,5 - 1,5% e mais preferencialmente cerca de 1%.
[00227] NEAA, isto é, solução de aminoácidos não essenciais, é uma formulação líquida testada por cultura de células esterilizada e filtrada comercialmente com Earle's Salts Base, aminoácidos não essenciais, bicarbonato de sódio (NaHCO3) e vermelho de fenol como indicador de pH, mas sem L-Glutamina. A concentração de NEAA no meio de cultura final é geralmente de acordo com o fabricante, por exemplo, 1: 100 no caso de uma solução estoque 100x. É também preferencial que a concentração de NEAA no meio de cultura final seja de 0,01 - 10%, preferencialmente 0,05 - 5%, mais preferencialmente, 0,1 - 2,5%, ainda mais preferencialmente 0,5 - 1,5% e mais preferencialmente cerca de 1%.
[00228] O piruvato é um metabólito ácido orgânico intermediário na glicólise e o primeiro da via de Embden Myerhoff que pode passar facilmente para dentro ou para fora da célula. Assim, sua adição a um meio de cultura de células fornece uma fonte de energia e um esqueleto de carbono para processos anabólicos. Um piruvato preferencial é o piruvato de sódio, que também pode ajudar a reduzir a fototoxicidade induzida por luz fluorescente. O piruvato, preferencialmente piruvato de sódio, é preferencialmente usado no meio de cultura em uma concentração de 0,05 a 50 mM, mais preferencialmente de 0,1 a 10 mM, ainda mais preferencialmente de 0,5 a 5 mM, particularmente preferencialmente cerca de 1 mM. É também preferencial que a concentração de piruvato, preferencialmente piruvato de sódio, no meio de cultura final seja de 0,01 - 10%, preferencialmente 0,05 - 5%, mais preferencialmente, 0,1 - 2,5%, ainda mais preferencialmente 0,5 - 1,5% e mais preferencialmente cerca de 1%.
[00229] Presume-se que o beta-mercaptoetanol (também referido como 2- mercaptoetanol, β -ME ou 2-ME) atue como um eliminador de radicais livres. O beta-mercapto-etanol é preferencialmente usado no meio de cultura final em uma concentração de 0,005 a 5,0 mM, mais preferencialmente de 0,01 a 1,0 mM, ainda mais preferencialmente de 0,05 a 0,5 mM, particularmente preferencialmente cerca de 0,1 mM. É também preferencial que a concentração de beta-mercapto-etanol no meio de cultura final seja de 0,01 - 10%, preferencialmente 0,05 - 5%, mais preferencialmente, 0,1 - 2,5%, ainda mais preferencialmente 0,5 - 1,5% e mais preferencialmente cerca de 1%.
[00230] Além disso, é também preferencial que a concentração de transferrina no meio de cultura final seja de 0,01 - 10%, preferencialmente 0,05 - 5%, mais preferencialmente, 0,1 - 2,5%, ainda mais preferencialmente 0,5 - 1,5% e mais preferencialmente cerca de 1%.
[00231] Assim, um meio de cultura particularmente preferencial de acordo com a presente invenção compreende: ⎯ um meio basal, preferencialmente RPMI ou IMDM; ⎯ preferencialmente um soro animal, mais preferencialmente FBS; ⎯ preferencialmente um antibiótico, mais preferencialmente penicilina/estreptomicina e/ou canamicina; e ⎯ preferencialmente outros aditivos, incluindo por exemplo um derivado de glutamina (preferencialmente GlutaMax), NEAA, piruvato (por exemplo, piruvato de sódio), β -mercapto-etanol e/ou transferrina.
[00232] Mais preferencialmente, os linfócitos B são cultivados em RPMI ou IMDM com 10% de FBS, 1% de NEAA, 1% de piruvato de sódio, 1% de beta-mercaptoetanol, 1% de Glutamax, 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de canamicina e 1% de transferrina.
[00233] Em outro exemplo, os linfócitos B podem ser cultivados em RPMI (por exemplo, RPMI-1640) com 10% de FBS, 1% de P/S (penicilina/estreptomicina), 1% de HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1- piperazinoetanossulfônico) e 1% de L-glutamina.
[00234] Preferencialmente, os linfócitos B são cultivados a uma densidade de cerca de ou entre 0,5 x 10 5 a 10 x 106 células/mL, preferencialmente a 1 x 105 a 1 x 106 células/mL, mais preferencialmente a 1 x 105 a 5 x 105 células/mL, ainda mais preferencialmente de 1,5 x 105 a 2,5 x 105 células/mL, e mais preferivelmente em cerca de 2 x 10 5 células/mL.
[00235] Na etapa (i) do método de acordo com a presente invenção, o AID endógeno da célula B é ativado. Preferencialmente, a ativação da citidina desaminase induzida por ativação do linfócito B pode ser alcançada, por exemplo, por cultura de células B em um meio de cultura compreendendo um ativador da citidina desaminase induzida por ativação. Preferencialmente, ativador da citidina desaminase induzida por ativação é selecionado a partir do grupo que consiste em: uma citocina, um anticorpo receptor de células anti-B ou fragmentos dos mesmos, um agonista de TLR, um agonista de CpG-B, um composto de imidazoquinolina ou uma combinação de qualquer um dos referidos ativadores. Em outras palavras, é preferencial que o linfócito B seja cultivado em um meio de cultura compreendendo uma citocina, um anticorpo anti-receptor de células B ou seus fragmentos, um agonista de TLR, um agonista de CpG-B e/ou um composto de imidazoquinolina.
[00236] Para a ativação da AID endógena da célula B, o linfócito B é preferencialmente cultivado em um meio de cultura de células compreendendo um ativador de citidina desaminase induzida por ativação (tal como uma citocina, um anticorpo anti-receptor de células B ou fragmentos dos mesmos, um agonista de TLR, um Agonista CpG-B e/ou um composto de imidazoquinolina) de cerca de 3 horas a 10 dias, preferencialmente de cerca de 6 horas a 7 dias, mais preferencialmente de cerca de 12 horas a 5 dias, ainda mais preferencialmente de cerca de 18 horas a 3 dias, ainda mais preferencialmente de cerca de 21 horas a 2 dias. Mais preferencialmente, as células B são cultivadas em um meio de cultura de células compreendendo um ativador de citidina desaminase induzida por ativação (tal como uma citocina, um anticorpo receptor de células anti-B ou fragmentos dos mesmos, um agonista TLR, um agonista CpG-B e/ou um composto de imidazoquinolina) por cerca de 24 horas.
[00237] Consequentemente, é preferencial que o linfócito B seja cultivado em um meio de cultura de células compreendendo um ativador de citidina desaminase induzida por ativação (tal como uma citocina, um anticorpo receptor de células anti-B ou fragmentos dos mesmos, um agonista de TLR, um CpG-B agonista e/ou um composto de imidazoquinolina) por cerca de 3 horas a 10 dias antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii)), preferencialmente cerca de 6 horas a 7 dias antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii)), mais preferencialmente cerca de 12 horas a 5 dias antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii)), ainda mais preferencialmente cerca de 18 horas a 3 dias antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii)), ainda mais preferencialmente cerca de 21 horas a 2 dias antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii)), e mais preferencialmente por cerca de 24 horas antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii)).
[00238] Além disso, é preferencial que o linfócito B seja cultivado em um meio de cultura de células compreendendo um ativador de citidina desaminase induzida por ativação (tal como uma citocina, um anticorpo receptor de células anti-B ou fragmentos dos mesmos, um agonista de TLR, um CpG-B agonista e/ou um composto de imidazoquinolina) por pelo menos 3 horas antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii)), preferencialmente pelo menos 6 horas antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii)), mais preferencialmente pelo menos 12 horas antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii)), ainda mais preferencialmente pelo menos 18 horas antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii)), e mais preferencialmente pelo menos 21 horas antes da introdução do DNA molécula (etapa (ii)), tal como cerca de 24 horas antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii)).
[00239] Também é preferencial que o linfócito B seja cultivado em um meio de cultura de células compreendendo um ativador de citidina desaminase induzida por ativação (tal como uma citocina, um anticorpo receptor de células anti-B ou fragmentos dos mesmos, um agonista de TLR, um agonista de CpG-B e/ou um composto de imidazoquinolina) por não mais do que 10 dias antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii)), preferencialmente não mais do que 7 dias antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii)), mais preferencialmente não mais de 5 dias antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii)), ainda mais preferencialmente não mais de 3 dias antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii)), ainda mais preferencialmente não mais de 2 dias antes de introdução da molécula de DNA (etapa (ii)), e mais preferencialmente por não mais do que cerca de 36 horas antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii)), tal como cerca de 24 horas antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii)).
[00240] Em outras palavras, no método de acordo com a presente invenção, é preferencial que a introdução da molécula de DNA no linfócito B é realizada até 10 dias após a ativação da citidina desaminase induzida por ativação, preferencialmente até 7 dias após a ativação da citidina desaminase induzida por ativação, mais preferencialmente até 5 dias após a ativação da citidina desaminase induzida por ativação, ainda mais preferencialmente até 2 dias após a ativação da citidina desaminase induzida por ativação e mais preferencialmente cerca de 1 dia após a ativação da citidina desaminase induzida por ativação.
[00241] Conforme descrito acima, o ativador da citidina desaminase induzida por ativação é preferencialmente uma citocina, um anticorpo anti-receptor de células B ou seus fragmentos, um agonista de TLR, um agonista de CpG-B e/ou um composto de imidazoquinolina.
[00242] O agonista do receptor tipo Toll (TLR) preferencial é um agonista de TLR7 ou TLR9, como R848 ou CL264. Os exemplos preferenciais de anticorpo receptor de células anti-B ou seus fragmentos incluem fragmentos F(ab')2 do receptor de células B específicos para imunoglobulinas humanas. Um exemplo preferencial de um agonista CpG-B é ODN2006. Um exemplo preferencial de um composto de imidazoquinolina é Clo97.
[00243] Exemplos de citocinas incluem IL1, IL1a, IL 1β, IL1RA, IL18, CD132, IL2, IL4, IL7, IL9, IL13, IL15, CD131, IL3, IL5, GM-CSF, IL6, tipo IL6, IL11, G -CSF, IL12, LIF, OSM, tipo IL10, IL10, IL20, IL21, IL14, IL16, IL17, IFNα, IFNβ, IFNγ, CD154, LTβ, TNFα, TNFβ, 4-1BBL, APRIL, BAFF, CD70, CD153, CD178, CD30L, CD40L, GITRL, LIGHT, OX40L, TALL-1, TRAIL, TWEAK, TRANCE, TGFβΙ, TGFβ2, TGFβ3, c-Kit, FLT-3, Epo, Tpo, FU-3L, SCF, M-CSF, aCD40, ou qualquer combinação dos mesmos. Preferencialmente, a citocina é selecionada a partir do grupo que consiste em CD40L, IL4, IL2, IL21, BAFF, APRIL, CD30L, TGF-β1, 4-1BBL, IL6, IL7, IL10, IL13, c-Kit, FLT-3, IFNα ou qualquer combinação dos mesmos. Mais preferencialmente, o linfócito B é cultivado em um meio que compreende IL4 e/ou CD40L.
[00244] Por exemplo, as células B podem ser co-cultivadas com uma linhagem de células que expressa CD40L (por exemplo, células K562L ou 3T3) antes da introdução da molécula de DNA (etapa (ii); transfecção). As células B podem ser co-cultivadas por pelo menos 12, 24, 36, 48 ou 72 horas antes da transfecção.
[00245] Preferencialmente, a concentração da citocina (no meio de cultura) é 0,001 - 20 ng/mL, preferencialmente 0,001 - 1 ng/mL, mais preferencialmente 0,005 - 0,5 ng/mL, ainda mais preferencialmente 0,01 - 0,1 ng/mL, ainda mais preferencialmente 0,015 - 0,02 ng/mL e mais preferencialmente cerca de 0,16 ng/mL.
[00246] Além disso, é preferencial que o linfócito B seja cultivado em um meio de cultura de células compreendendo uma citocina a uma concentração de pelo menos 0,001 ng/mL, preferencialmente pelo menos 0,001 ng/mL, mais preferencialmente pelo menos 0,005 ng/mL, ainda mais preferencialmente pelo menos 0,01 ng/mL, ainda mais preferencialmente pelo menos 0,015 ng/mL e mais preferencialmente cerca de 0,16 ng/mL.
[00247] É também preferencial que o linfócito B seja cultivado em um meio de cultura de células compreendendo uma citocina a uma concentração de não mais do que 20 ng/mL, preferencialmente não mais do que 1 ng/mL, mais preferencialmente não mais do que 0,5 ng/mL, mesmo mais preferencialmente não mais do que 0,1 ng/mL, ainda mais preferencialmente não mais do que 0,02 ng/mL e mais preferencialmente cerca de 0,16 ng/mL.
[00248] Em uma modalidade preferencial, a ativação da citidina desaminase induzida por ativação é realizada por (cultivo do linfócito B na presença de) CD40L e/ou IL4. Em outras palavras, é preferencial que o linfócito B seja cultivado num meio de cultura de células compreendendo CD40L e/ou IL4. Mais preferencialmente, a ativação da citidina desaminase induzida por ativação é realizada por co-cultura com uma linhagem de células que expressa
CD40L (como descrito acima) e adição de IL-4 (ao meio de cultura como descrito acima). Mais preferencialmente, a linhagem de células que expressa CD40L é K562L.
[00249] Em geral, a concentração de IL4 no meio de cultura pode ser conforme descrito acima em geral para as citocinas. Em particular, a concentração de IL4 (no meio de cultura final) é preferencialmente 0,005 - 0,03 ng/mL, mais preferencialmente 0,01 - 0,025 ng/mL, ainda mais preferencialmente 0,015 - 0,02 ng/mL e mais preferencialmente 0,16 ng/mL.
[00250] Preferencialmente, os linfócitos B são reativados após a introdução da molécula de DNA no linfócito B (pós-transfecção). A reativação de células pós-transfecção melhora a viabilidade. Para reativação, os agentes estimuladores de células B, conforme descrito acima, podem ser usados, ou seja, uma citocina, um anticorpo receptor de células anti-B ou seus fragmentos, um agonista de TLR, um agonista de CpG-B e/ou um composto de imidazoquinolina como descrito acima. Em outras palavras, é preferencial que os agentes estimuladores de células B, por exemplo, conforme definido acima (uma citocina, um anticorpo receptor de células B ou seus fragmentos, um agonista de TLR, um agonista de CpG-B e/ou um composto de imidazoquinolina), são aplicados ao linfócito B após a introdução da molécula de DNA no linfócito B.
[00251] Em geral, o linfócito B pode ser reativado uma ou várias vezes após a introdução da molécula de DNA no linfócito B (pós-transfecção). Por exemplo, os linfócitos B podem ser reativados por cerca de 1, 2, 3, 4, 5 ou mais dias. Preferencialmente, as células B são reativadas (pela primeira vez após a transfecção) o mais tardar 24 horas após a transfecção, por exemplo cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas após a transfecção. Mais preferencialmente, as células B são reativadas no máximo 18 horas após a transfecção, ainda mais preferencialmente as células B são reativadas no máximo 12 horas após a transfecção e, mais preferencialmente, as células B são reativadas no máximo
6 horas após a transfecção, tal como 3-5 horas pós-transfecção, por exemplo cerca de 4 horas pós-transfecção. Tal reativação é mais preferencialmente realizada com IL4. Além disso, a reativação (por exemplo, com IL4) é preferencialmente repetida a cada 1 - 5 dias, preferencialmente a cada 2 - 4 dias, mais preferencialmente a cada 3 dias.
[00252] Além ou alternativamente, os linfócitos B são preferencialmente reativados por células que expressam CD40L, tais como células K562L, por exemplo, uma vez ou repetidamente, mais preferencialmente uma vez em 2 a 10 dias após a transfecção, preferencialmente 4 a 9 dias após a transfecção, mais preferencialmente 6 a 8 dias após a transfecção, tal como cerca de 7 dias após a transfecção.
[00253] Em uma modalidade particularmente preferencial, as células B são reativadas 4h após a transfecção e em intervalos consecutivos de 3 dias com IL4 e no dia 7 com células K562L.
[00254] Preferencialmente, o linfócito B é tratado com um inibidor de DNA capaz de bloquear a junção da extremidade alternativa antes de introduzir a molécula de DNA no linfócito B. Um exemplo preferencial de tal inibidor de DNA é o Olaparib. Tal pré-tratamento bloqueia a via de junção de extremidade alternativa (a-EJ), reforçando assim o uso da via de c-NHEJ e aumentando ainda mais as eficiências de manipulação.
[00255] É também preferencial que a molécula de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse é incubada com uma proteína Ku, tal como Ku70/Ku80, antes de introduzir a molécula de DNA no linfócito B. Consequentemente, em modalidade preferencial, um complexo de molécula de DNA/proteína Ku (formado durante a incubação) é introduzido no linfócito B. Desse modo, o número de integrações bem-sucedidas da molécula de DNA pode ser aumentado ainda mais.
[00256] É também preferencial que a molécula de DNA compreenda um sinal de localização nuclear, como o sinal de localização nuclear de SV40, por exemplo, a repetição em tandem de SV de acordo com a SEQ ID NO: 95, ou uma sequência variante da mesma:
[00257] Repetição tandem SV:
TGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCT GCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCTGGTTGCTGACTAATTGAGATG
CATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACC [SEQ ID NO: 95]
[00258] Desse modo, altas concentrações da molécula de DNA no núcleo do linfócito B podem ser alcançadas, o que, por sua vez, também aumenta a integração da molécula de DNA no genoma do linfócito B.
[00259] Além disso, é também preferencial tratar o linfócito B com um inibidor de nuclease, em particular pelo menos cerca de 24 horas após a ativação da citidina desaminase induzida por ativação do linfócito B. Um exemplo preferencial de um inibidor de nuclease é Mirin. Desse modo, a degradação da molécula de DNA introduzida na célula B pelas endo- e/ou éxonucleases da célula B pode ser evitada. Transfecção
[00260] Conforme descrito acima, os métodos para a introdução da molécula de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse (isto é, métodos de transfecção) abrangem, por exemplo, métodos virais e não virais de transfecção. Os vírus que podem ser usados para a transferência de genes incluem retrovírus (incluindo lentivírus), vírus herpes simplex, adenovírus e vírus adeno- associados (AAV). No entanto, em algumas modalidades, o linfócito B não é transduzido com um retrovírus. Além disso, as nanopartículas também podem ser usadas para transfecção. Outros métodos de transfecção não viral incluem muitos métodos químicos e físicos. Métodos de transfecção química incluem lipofecção, por exemplo, com base em lipídeos catiônicos e/ou lipossomas, precipitação de fosfato de cálcio ou transfecção com base em polímeros catiônicos, tais como DEAE-dextrano ou polietilenimina (PEI) etc. Os métodos de transfecção física incluem eletroporação, transferência de genes balística (introduz partículas revestidas com DNA nas células), microinjeção (transferência de DNA através de microcapilares para as células) e nucleofecção. Preferencialmente, a introdução da molécula de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse no linfócito B é não viral.
[00261] Mais preferencialmente, a molécula de DNA é introduzida no linfócito B por nucleofecção. A nucleofecção é um método de transfecção baseado em eletroporação que permite a transferência de ácidos nucléicos, como DNA e RNA, para as células aplicando uma voltagem específica. Com base no método físico de eletroporação, a nucleofecção usa uma combinação de parâmetros elétricos, gerados por um dispositivo de nucleofecção ("Nucleofector"), preferencialmente com reagentes específicos do tipo de células. A molécula de DNA (substrato) é transferida diretamente para o núcleo da célula e o citoplasma. Consequentemente, é preferencial que um dispositivo de nucleofecção seja usado para a nucleofecção. Em geral, qualquer dispositivo de nucleofecção pode ser usado, por exemplo Neon®, MaxCyte ou Amaxa®. Preferencialmente, é usado o Amaxa® ou Neon® Nucleofector.
[00262] Em geral, qualquer programa de nucleofecção fornecido pelo fabricante do dispositivo de nucleofecção pode ser usado. Preferencialmente, 2100 - 2500 V são usados com 1 ou 2 pulsos de 10 - 20 ms (ms). Mais preferencialmente, 2100 - 2400 V são usados com 1 ou 2 pulsos de 10 - 20 ms (ms). Por exemplo, um único pulso de 2150 V e 10 ms pode ser usado. Por exemplo, um único pulso de 2150 V e 15 ms pode ser usado. Por exemplo, um único pulso de 2150 V e 20 ms pode ser usado. Por exemplo, dois pulsos de 2150 V e 10 ms podem ser usados. Por exemplo, um único pulso de 2400V e 10 ms pode ser usado. Por exemplo, um único pulso de 2400V e 15 ms pode ser usado. Por exemplo, um único pulso de 2400V e 20 ms pode ser usado. Por exemplo, um único pulso de 2500V e 10 ms pode ser usado. Por exemplo, um único pulso de 2500V e 15 ms pode ser usado. Mais preferencialmente, (exatamente) dois pulsos de 2150 V e 10 ms são usados, em particular com o Nucleofector Neon®.
[00263] Preferencialmente, um kit de nucleofector para células B (por exemplo, kit de Nucleofector Lonza para células B humanas) é usado, em particular em combinação com o Nucleofector Amaxa®, por exemplo de acordo com as instruções do fabricante. Mais preferencialmente, o Nucleofector Amaxa® é usado em combinação com o kit de Nucleofector Lonza para células B humanas, conforme descrito nas instruções do fabricante com o programa U15, em que, preferencialmente o número de células é (alterado para) 2 milhões e/ou a quantidade de DNA é (alterada a) cerca de 2,5 µg por nucleofecção para o Nucleofector Amaxa®.
[00264] Preferencialmente, o DNA é transfectado em uma quantidade (quantidade por transfecção, em particular nucelofecção) de cerca de e entre 0,5 μg a 10 μg de DNA, por exemplo, a concentração de DNA pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 μg. Mais preferencialmente, a concentração de DNA é transfectada em uma quantidade (quantidade por transfecção, em particular nucelofecção) de cerca de e entre 1 μg a 5 µg de DNA, ainda mais preferencialmente de 1,5 µg a 3,5 µg de DNA, ainda mais preferencialmente de 1,0 a 3,0 µg de DNA, e mais preferencialmente a quantidade de DNA por transfecção é cerca de 2,5 µg de DNA.
[00265] Preferencialmente, as células B editadas pelo genoma são utilizadas diretamente após o processo de edição do genoma ou após um curto período de cultura. Para uso clínico, as células B editadas pelo genoma podem ser irradiadas antes do uso. A irradiação induz a expressão de citocinas, que promovem a atividade das células imunológicas efetoras. Linfócitos B projetados e usos dos mesmos
[00266] Em um aspecto adicional, a presente invenção também fornece um linfócito B projetado que pode ser obtido pelo método de acordo com a presente invenção, conforme descrito neste documento. Em outras palavras, a presente invenção também fornece um linfócito B projetado feito pelo método de acordo com a presente invenção como descrito neste documento.
[00267] Consequentemente, deve ser entendido que a descrição detalhada e as modalidades preferenciais do método para editar o genoma de um linfócito B de acordo com a presente invenção delineado acima se aplicam de acordo com o linfócito B projetado obtido por tal método. Por exemplo, a descrição detalhada das células B editadas descritas acima e, em particular, os (poli) peptídeos de interesse preferenciais aplicam-se de acordo com a célula B obtenível pelo método inventivo.
[00268] Em geral, as células B obtidas pelo método inventivo podem ser facilmente reconhecidas devido à inserção heteróloga na região de troca do genoma da célula B.
[00269] Consequentemente, a presente invenção também fornece um linfócito B modificado compreendendo um lócus de gene de imunoglobulina editado compreendendo uma inserção heteróloga compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse inserido em sua região de troca. O termo "heterólogo" refere-se a uma sequência, que é distinta da sequência endógena, ou seja, a sequência, que estava originalmente neste sítio genômico. Em geral, a molécula de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse descrito acima corresponde essencialmente à inserção heteróloga. Consequentemente, a descrição detalhada e modalidades preferenciais da molécula de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse descrito acima aplicam-se de acordo com a inserção heteróloga. Em particular, o (poli) peptídeo de interesse é igual ao descrito acima.
[00270] Em geral, a inserção heteróloga é inserida na região de troca do lócus do gene da imunoglobulina. Desse modo, o lócus de gene de imunoglobulina editado é editado. Em geral, também para o linfócito B modificado, a descrição detalhada e as modalidades preferenciais do método para editar o genoma de um linfócito B de acordo com a presente invenção delineada acima se aplicam em conformidade.
[00271] Em geral, os linfócitos B projetados da invenção podem ser de qualquer espécie. Em algumas modalidades, o linfócitos B projetados é um linfócito B de mamífero. Preferencialmente, os linfócitos B projetados de acordo com a presente invenção é humano. Portanto, em algumas modalidades, os linfócitos B projetados não é um linfócito B de frango ou murino. Em particular, o lócus de IgL do linfócito B é preferencialmente não deletado.
[00272] Em particular, na célula B manipulada de acordo com a presente invenção, o genoma da célula B é preferencialmente editado para expressar uma cadeia de imunoglobulina modificada compreendendo na direção do terminal N para C: um domínio variável, o (poli) peptídeo de interesse (codificado pela molécula de DNA introduzida na etapa (ii)) e um domínio constante. Em outras palavras, o genoma do linfócito B é preferencialmente editado para expressar uma cadeia de imunoglobulina modificada compreendendo o (poli) peptídeo de interesse organizado entre um domínio variável e um domínio constante da cadeia de imunoglobulina. Consequentemente, é preferencial que o genoma do linfócito B seja editado para expressar um anticorpo modificado compreendendo o (poli) peptídeo de interesse na região do cotovelo do anticorpo. Além disso, é preferencial que o genoma do linfócito B seja editado para expressar um receptor de células B modificado compreendendo o (poli) peptídeo de interesse na região do cotovelo do anticorpo. Neste contexto, a descrição detalhada delineada acima, no contexto do método de acordo com a presente invenção se aplica em conformidade.
[00273] É também preferencial que o genoma do linfócito B é editado para expressar uma cadeia de imunoglobulina modificada, em que um domínio variável endógeno é substituído pelo (poli) peptídeo de interesse. Consequentemente, é também preferencial que o genoma do linfócito B seja editado para expressar um receptor de células B modificado, em que um domínio variável endógeno é substituído pelo (poli) peptídeo de interesse. Consequentemente, é preferencial que o genoma do linfócito B seja editado para expressar um anticorpo modificado compreendendo o (poli) peptídeo de interesse "em vez" de um domínio variável endógeno. Novamente, a descrição detalhada delineada acima, no contexto do método de acordo com a presente invenção se aplica em conformidade.
[00274] É também preferencial que o genoma do linfócito B seja editado para expressar uma cadeia de imunoglobulina modificada, em que os domínios constantes endógenos são substituídos pelo (poli) peptídeo de interesse. Consequentemente, é também preferencial que o genoma do linfócito B seja editado para expressar um receptor de células B projetado, em que os domínios constantes endógenos são substituídos pelo (poli) peptídeo de interesse. Consequentemente, é preferencial que o genoma do linfócito B seja editado para expressar um anticorpo modificado compreendendo o (poli) peptídeo de interesse "em vez" de um domínio constante endógeno. Consequentemente, tal cadeia de imunoglobulina modificada compreende um domínio variável (endógeno), o (poli) peptídeo de interesse, mas nenhum domínio constante (endógeno). Novamente, a descrição detalhada delineada acima, no contexto do método de acordo com a presente invenção se aplica em conformidade.
[00275] Preferencialmente, a região de troca de um lócus de gene de imunoglobulina dos linfócitos B manipulados de acordo com a presente invenção compreende um sítio de clivagem, mais preferencialmente um sítio de autoprocessamento, tal como um sítio de clivagem T2A. Novamente, a descrição detalhada delineada acima, no contexto do método de acordo com a presente invenção, para sítios de clivagem se aplica em conformidade.
[00276] Preferencialmente, a região de troca de um lócus de gene de imunoglobulina do linfócito B modificado de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um domínio de ligação de patógeno, um domínio VH ou um domínio VH-VL. É também preferencial que a região de troca de um lócus do gene de imunoglobulina do linfócito B modificado de acordo com a presente invenção compreenda uma sequência de nucleotídeos que codifica um CD4, dipeptidil peptidase 4, CD9 ou enzima de conversão de angiotensina 2 ou um fragmento ou variante de sequência do mesmo. Novamente, a descrição detalhada delineada acima, no contexto do método de acordo com a presente invenção se aplica em conformidade.
[00277] Em algumas modalidades, o linfócito B projetado não expressa GFP (proteína fluorescente verde) ou RFP (proteína fluorescente vermelha, como tdTomato ou DsRed). Em mais geral, em algumas modalidades, o linfócito B projetado não expressa uma proteína repórter (fluorescente).
[00278] Em geral, as células B manipuladas podem ser usadas para qualquer aplicação em que seja desejado modular a expressão, especificidade e/ou funcionalidade do receptor de células B. Preferencialmente, os linfócitos B projetados são usados na medicina, isto é, para uso médico, por exemplo, em imunoterapia. Para este fim, o linfócito B é preferencialmente projetado (isto é, genoma editado) conforme descrito neste documento.
[00279] Em geral, as doenças a serem alvejadas pelos linfócitos B projetados de acordo com a presente invenção incluem quaisquer doenças que podem ser tratadas com anticorpos (monoclonais). Essas doenças incluem câncer, doenças infecciosas, distúrbios autoimunes, rejeição de transplantes, osteoporose, degeneração macular, esclerose múltipla e doenças cardiovasculares. O tratamento e/ou prevenção de câncer e/ou doenças infecciosas é preferencial.
[00280] Preferencialmente, a célula B manipulada de acordo com a presente invenção pode ser usada para (a preparação de um medicamento para) a profilaxia, tratamento e/ou melhoria de câncer ou doenças tumorais. Em geral, o termo "câncer" inclui tumores sólidos, em particular tumores sólidos malignos, como sarcomas, carcinomas e linfomas, e câncer de sangue, como leucemias. Os cânceres incluem carcinomas, sarcomas, linfomas, leucemias, tumores de células germinativas e blastomas.
[00281] Preferencialmente, as células B manipuladas de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para (a preparação de um medicamento para) a profilaxia, tratamento e/ou melhoria de uma doença infecciosa. As doenças infecciosas incluem doenças infecciosas virais, retrovirais, bacterianas e protozoológicas.
[00282] Além disso, a célula B manipulada de acordo com a presente invenção pode ser usada para (a preparação de um medicamento para) a profilaxia, tratamento e/ou melhoria de distúrbios autoimunes. Normalmente, as doenças autoimunes surgem de uma resposta imunológica anormal do corpo contra substâncias e tecidos normalmente presentes no corpo (autoimunidade). Isso pode ser restrito a certos órgãos ou pode envolver um determinado tecido em locais diferentes. As doenças autoimunes podem ser classificadas pelo tipo correspondente de hipersensibilidade: tipo I (ou seja, urticária induzida por soro autólogo), tipo II, tipo III ou tipo IV.
[00283] Para uso médico, o linfócito B projetado é preferencialmente administrado a um paciente. O linfócito B administrado a um paciente pode ser um linfócito B autólogo (ou seja, a célula B é administrada ao mesmo paciente do qual a célula B ou suas células progenitoras foram isoladas antes da engenharia) ou um linfócito B alogênico (de outro (humano) origem, ou seja, a célula B não é derivada do paciente a quem é administrada após a engenharia). Mais preferencialmente, a célula B é um linfócito B autólogo, isto é, o paciente que recebe o linfócito B projetado é o mesmo paciente de quem o linfócito B (ou suas células progenitoras) foi isolado antes da manipulação.
[00284] Consequentemente, a presente invenção também fornece um método para terapia com células B, compreendendo as seguintes etapas: (a) isolar um linfócito B (não projetado) de um indivíduo;
(b) manipular o linfócito B de acordo com a presente invenção como descrito neste documento; e (c) administrar o linfócito B prpjetado ao (mesmo) indivíduo.
[00285] Se um linfócito B projetado (autólogo ou alogênico) for administrado a um indivíduo/paciente, é preferencial que antes da administração ao indivíduo/paciente o linfócito B seja testado (por exemplo, in vitro) em relação às mutações conhecidas por estarem envolvidas no (desenvolvimento de) câncer (ou seja, se essas mutações ocorrem ou não na célula B). Exemplos de tais mutações causadoras de câncer incluem translocação cromossômica. Desse modo, os linfócitos B projetados, que foram identificados por transportar mutações conhecidas por estarem envolvidas no (desenvolvimento de) câncer, podem ser rejeitados, ou seja, os linfócitos B projetados, que foram identificados por transportar mutações conhecidas por estarem envolvidas no (desenvolvimento de) câncer são não administrado ao paciente. Desse modo, o risco de administrar uma célula B com uma mutação causadora de câncer é fortemente reduzido.
[00286] Métodos para testar mutações causadoras de câncer em células B são conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, a perda de imunoglobulina na superfície de uma célula B é um indicador de uma mutação que causa câncer. Consequentemente, as células B manipuladas podem ser selecionadas para expressão de superfície de BCR preservada antes de administrar a célula B ao paciente. Consequentemente, é preferencial que antes da administração das células B ao paciente, seja confirmado que a célula B expressa um receptor de imunoglobulina/célula B na sua superfície.
[00287] Alternativamente ou adicionalmente, a célula B manipulada também pode ser verificada quanto à presença de oncogenes específicos antes da administração ao paciente/indivíduo. Exemplos de tais oncogenes incluem BCL6, BCL2 (MCL1), BCL11 e MALT1. Portanto, é preferencial que antes da administração de células B ao paciente, seja confirmado que a célula B não mostra expressão desregulada (por exemplo,
superexpressão) de um oncogene, por exemplo, BCL6, BCL2 (MCL1), BCL11 e/ou MALT1.
[00288] Em um aspecto adicional, a presente invenção também fornece uma linhagem de células de linfócitos B manipulados como descrito neste documento. Em particular, o termo "linhagem de células" refere-se a uma linhagem de células imortalizada. Uma linhagem de células imortalizada é uma população de células de um organismo multide células que é imortalizado e pode, portanto, ser cultivada por períodos prolongados in vitro. Os métodos para a imortalização de células B são conhecidos no estado da técnica. Preferencialmente, é usada a imortalização por EBV (vírus de Epstein-Barr). Por exemplo, um método melhorado para a imortalização de células B com EBV é descrito em Traggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. (2004): Um método eficiente para fazer anticorpos monoclonais humanos a partir de células B de memória: neutralização potente do coronavírus SARS. Nat Med. 10 (8): 871-5.
[00289] Essas linhagens de células de células B imortalizadas são particularmente úteis para a produção de anticorpos humanos. Consequentemente, a presente invenção também fornece método para gerar um anticorpo ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende um (poli) peptídeo (heterólogo) de interesse, o método compreendendo as seguintes etapas: (1) fornecer um linfócito B manipulado ou uma linhagem de células B da presente invenção conforme descrita nesse documento, em que o linfócito B compreende um lócus de gene de imunoglobulina editado compreendendo uma inserção heteróloga compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse inserido em sua região de troca; (2) cultivar o linfócito B modificado ou a linha de células B; e (3) isolar o anticorpo ou o fragmento do mesmo compreendendo o (poli) peptídeo (heterólogo) de interesse da cultura de células B.
[00290] Como os anticorpos são secretados pelas células B, o isolamento de anticorpos é fácil de conseguir. Preferencialmente, os anticorpos isolados são purificados. Isso significa que o anticorpo estará tipicamente estará presente em uma composição que é substancialmente livre de outros polipeptídeos, por exemplo, onde menos de 90% (em peso), geralmente menos de 60% e mais geralmente menos de 50% da composição é feita de outros polipeptídeos.
[00291] Além disso, o método para gerar um anticorpo ou um fragmento do mesmo, de acordo com a presente invenção, preferencialmente compreende ainda a caracterização do anticorpo ou fragmento de anticorpo, em que a caracterização compreende ⎯ realizar ensaios funcionais para determinar a função do anticorpo ou fragmento de anticorpo; ⎯ realizar ensaios de ligação para determinar a especificidade de ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo e/ou o parceiro/epítopo de ligação reconhecido pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo; e/ou ⎯ realizar ensaios de neutralização para determinar a capacidade do anticorpo ou fragmento de anticorpo de neutralizar uma toxina ou um patógeno.
[00292] Os ensaios funcionais, ensaios de ligação e ensaios de neutralização são conhecidos no estado da técnica. O versado na técnica irá selecionar o ensaio apropriado dependendo da funcionalidade do anticorpo. Por exemplo, se o anticorpo compreende um sítio de ligação (por exemplo, se o (poli) peptídeo de interesse inserido compreende um sítio de ligação), o versado na técnica pode realizar um ensaio de ligação com o parceiro de ligação do referido sítio de ligação.
[00293] Em um aspecto adicional, a presente invenção também fornece um anticorpo que pode ser obtido pelo método de acordo com a geração de um anticorpo de acordo com a presente invenção como descrito neste documento. Em outras palavras, a presente invenção também fornece um anticorpo feito pelo método de acordo com a geração de um anticorpo de acordo com a presente invenção como descrito neste documento. Tal anticorpo compreende o (poli) peptídeo de interesse conforme descrito acima. Desse modo, o (poli) peptídeo de interesse pode estar localizado na região do cotovelo do anticorpo como descrito acima. Alternativamente, o (poli) peptídeo de interesse também pode substituir a região variável ou as regiões constantes (por exemplo, da cadeia pesada) do anticorpo como descrito neste documento.
[00294] Em um aspecto adicional, a presente invenção também fornece uma composição compreendendo o linfócito B projetado de acordo com a presente invenção ou o anticorpo de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, a composição compreende ainda um transportador farmaceuticamente aceitável, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Consequentemente, a composição é preferencialmente uma composição farmacêutica.
[00295] Embora o transportador ou excipiente possa facilitar a administração, ele não deve induzir a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que recebe a composição. Nem deve ser tóxico. Os transportadores adequados podem ser macromoléculas grandes e metabolizadas lentamente, tais como proteínas, polipeptídeos, lipossomas, polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e partículas virais inativas. Em geral, os transportadores farmaceuticamente aceitáveis em uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção podem ser componentes ativos ou componentes inativos.
[00296] Podem ser usados sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, sais de ácidos minerais, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos.
[00297] Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis em uma composição farmacêutica podem conter adicionalmente líquidos, tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes ou substâncias tamponantes de pH, podem estar presentes em tais composições. Esses transportadores permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas e suspensões, para ingestão pelo indivíduo.
[00298] As composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas em vários formatos. Por exemplo, as composições podem ser preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas. Os formatos sólidos adequados para solução ou suspensão em transportadores líquidos antes da injeção também podem ser preparadas (por exemplo, uma composição liofilizada, similar a Synagis™ e Herceptin™, para reconstituição com água estéril contendo um conservante). A composição pode ser preparada, por exemplo, como uma pomada, creme ou pó. A composição pode ser preparada por exemplo, como um comprimido ou cápsula, como um spray ou como um xarope (opcionalmente aromatizado). A composição pode ser preparada, por exemplo, como um inalador, usando um pó fino ou um spray. A composição pode ser preparada, por exemplo, como gotas. A composição pode estar no formato de kit, modificado de modo que uma composição combinada possa ser reconstituída, por exemplo, imediatamente antes da administração. Por exemplo, um anticorpo liofilizado pode ser fornecido na forma de kit com água estéril ou um tampão estéril.
[00299] É preferencial que o ingrediente ativo na composição seja uma célula B manipulada ou um anticorpo de acordo com a presente invenção. A composição pode conter agentes que protegem o anticorpo da degradação ou asseguram a viabilidade da célula B.
[00300] Uma discussão completa de transportadores farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª edição, ISBN: 0683306472
[00301] As composições farmacêuticas da invenção geralmente têm um pH entre 5,5 e 8,5, em algumas modalidades, isso pode ser entre 6 e 8, e em outras modalidades cerca de 7. O pH pode ser mantido pelo uso de um tampão. A composição pode ser estéril e/ou livre de pirogênio. A composição pode ser isotônica em relação a humanos. Em uma modalidade, as composições farmacêuticas da invenção são fornecidas em recipientes hermeticamente selados.
[00302] A composição pode assumir a forma de uma suspensão, solução ou emulsão num transportador oleoso ou aquoso e, em particular, pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, conservantes, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, a molécula de anticorpo pode estar na forma seca, para reconstituição antes do uso com um líquido estéril apropriado.
[00303] A composição pode compreender um transportador, como água ou solução salina. Um transportador é tipicamente entendido como um material que é adequado para armazenar, transportar e/ou administrar um composto, tal como um composto farmaceuticamente ativo, em particular os anticorpos de acordo com a presente invenção. Por exemplo, o transportador pode ser um líquido fisiologicamente aceitável, que é adequado para armazenar, transportar e/ou administrar um composto farmaceuticamente ativo, em particular os anticorpos de acordo com a presente invenção.
[00304] A composição pode ser uma solução aquosa que é livre de pirogênio e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os versado na técnicas relevantes no estado da técnica são bem capazes de preparar soluções adequadas usando, por exemplo, veículos isotônicos, tais como injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção de Ringer lactato. Podem ser incluídos conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos, conforme necessário. A composição de acordo com a presente invenção pode ser fornecida, por exemplo, em uma seringa preenchida.
[00305] A composição conforme definida acima também pode estar em uma forma de dosagem incluindo, mas não se limitando a, cápsulas, comprimidos, suspensões ou soluções aquosas. No caso dos comprimidos, os transportadores comumente usados incluem lactose e amido de milho. Os agentes lubrificantes, como o estearato de magnésio, também são tipicamente adicionados. Para a forma de cápsula, diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando são necessárias suspensões aquosas, o ingrediente ativo pode ser combinado com emulsionantes e agentes de suspensão. Se desejado, certos agentes adoçantes, aromatizantes ou corantes também podem ser adicionados.
[00306] Outros exemplos de transportadores compreendidos pela composição incluem, mas não estão limitados a óleo mineral, vaselina líquida, vaselina branca, propilenoglicol, polioxietileno, composto de polioxipropileno, cera emulsionante e água. Alternativamente, a composição pode ser formulada em uma loção ou creme adequado. No contexto da presente invenção, os transportadores adequados incluem, mas não estão limitados a, óleo mineral, monoestearato de sorbitano, polissorbato 60, cera de ésteres cetílicos, álcool cetearílico, 2-octildodecanol, álcool benzílico e água.
[00307] Em uma modalidade, uma composição da invenção pode incluir anticorpos da invenção, em que os anticorpos podem constituir pelo menos 50% em peso (por exemplo, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) da proteína total na composição. Em tal composição, os anticorpos estão preferencialmente na forma purificada.
[00308] As composições farmacêuticas podem incluir um antimicrobiano, particularmente se embalado em um formato de dose múltipla. Eles podem compreender detergente, por exemplo, um Tween (polissorbato), como Tween 80. Os detergentes estão geralmente presentes em níveis baixos, por exemplo, menos de 0,01%. As composições também podem incluir sais de sódio (por exemplo, cloreto de sódio) para dar tonicidade. Por exemplo, uma concentração de 10 ± 2 mg/mL NaCl é típica.
[00309] Além disso, as composições farmacêuticas podem compreender um álcool de açúcar (por exemplo, manitol) ou um dissacarídeo (por exemplo, sacarose ou trealose), por exemplo, em torno de 15-30 mg/mL (por exemplo, 25 mg/mL), particularmente se eles forem liofilizados ou se incluírem material que foi reconstituído a partir de material liofilizado. O pH de uma composição para liofilização pode ser ajustado entre 5 e 8, ou entre 5,5 e 7, ou cerca de 6,1 antes da liofilização.
[00310] As composições da invenção também podem compreender um ou mais agentes imunorreguladores. Em uma modalidade, um ou mais dos agentes imunorreguladores incluem um adjuvante.
[00311] A composição que compreende a célula B manipulada ou o anticorpo de acordo com a presente invenção é preferencialmente para uso em medicina, isto é, como medicação. Neste contexto, a descrição detalhada conforme descrito acima para o uso médico de uma célula B manipulada se aplica em conformidade, por exemplo, em relação a doenças a serem tratadas.
[00312] Consequentemente, a presente invenção também fornece um método para imunoterapia compreendendo a administração do anticorpo de acordo com a presente invenção, a célula B manipulada de acordo com a presente invenção ou a composição de acordo com a presente invenção a um indivíduo em necessidade.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00313] A seguir, uma breve descrição das figuras anexas será fornecida. As figuras pretendem ilustrar a presente invenção em mais detalhes. No entanto, eles não se destinam a limitar a matéria da invenção de forma alguma.
[00314] A Figura 1 mostra uma visão geral esquemática da engenharia de células B mediada por AID da região de troca de anticorpo no cromossomo 14 por integração de um elemento de éxon extra de ((poli)
peptídeo de interesse) gerando anticorpos compreendendo uma especificidade desejada de ((poli) peptídeo de interesse).
[00315] A Figura 2 mostra exemplos esquemáticos de genes projetados que codificam cadeias de anticorpos obtidas a partir de células B manipuladas de acordo com a presente invenção e desenhos esquemáticos dos respectivos anticorpos. (A) Exemplos incluindo inserções adicionais na região do cotovelo do anticorpo (entre as regiões variável e constante). (B) Exemplos incluindo um sítio de clivagem de protease T2A, por exemplo, para substituir a região variável original do anticorpo. V, D, J - genes V, D, J originais. Constante - domínio (s) constante (s) original (is). T2A - sítio de clivagem T2A introduzido. V H - região variável de cadeia pesada introduzida. V L - região variável de cadeia leve introduzida. Domínio do receptor - domínio do receptor introduzido.
[00316] A Figura 3 fornece uma visão geral esquemática dos Exemplos (exp) para detectar inserções LAIR1 genômicas (Exemplo 1; exp 1), LAIR1-Ab expressando a produção de células B primárias e seleção por classificação (Exemplo 2; exp 2) ou por varredura de alto rendimento (Exemplo 3; exp 3). O número de dias indica quantos dias após a estimulação da nucleofecção, as observações na coluna "nucleofecção" indicam características do ácido nucleico usado para a nucleofecção e as observações na coluna "varredura" indicam que tipo de varredura foi realizada.
[00317] A Figura 4 mostra para o Exemplo 1 (A) o projeto de PCR da região de troca e (B) os resultados da detecção de LAIR1 otimizado por códons (incluindo integrações parciais) em amplicons de PCR da região μ de troca longa por tecnologia de sequenciamento MinION após nucleofecção de fita dupla (dsDNA) Substratos LAIR1.
[00318] A Figura 5 mostra para o Exemplo 2 (A) LAIR1 e co- coloração de superfície de IgM de uma linhagens de células B gerada de acordo com a presente invenção, que expressa anticorpos contendo LAIR1, selecionados após a nucleofecção por classificação FACS em comparação com negativo (MME17) e positivo (MMJ5) controlam as linhagens de células B. (B) Bead pull down e análise FACS de anticorpos artificiais contendo LAIR1 secretados por linhagens de células B nucleofectdas com um tipo selvagem LAIR1 e um substrato otimizado para íntron CH1/J6 LAIR1.
[00319] A Figura 6 mostra para o Exemplo 2 (A) LAIR1 e manchas Western específicas de IgM de sobrenadantes de cultura. (B) amplificação por PCR usando iniciadores de troca-μ-adiante e LAIR1-reverso de DNA genômico isolado de linhagens de células B modificadas que expressam anticorpos contendo LAIR1 recombinante. (C) alinhamento da sequência do produto de PCR da região de troca e região de cobertura de inserção LAIR1 5’ destacando a região de troca em cinza, íntron LAIR1 cinza claro com sítio aceitador de emenda em negrito e éxon LAIR1 em preto.
[00320] A Figura 7 mostra, para o Exemplo 3 (A), a frequência de linhagens de células B manipuladas que expressam anticorpos contendo LAIR1 recombinantes detectados por varredura de alto rendimento de 60.000 e
35.000 células, respectivamente. As células foram nucleofectadas com substrato de tipo selvagem LAIR1 ou uma versão otimizada para íntron CH1/J6. As condições de varredura em II) foram otimizadas diminuindo os números de células plaqueadas enquanto aumentava o tempo de cultivo para atingir maiores concentrações de anticorpos nos sobrenadantes da cultura. (B) Exemplo de varredura de pérolas de duas placas de cultura de 384 cavidades medindo a proporção de IgM de MFI capturada por anti-LAIR1 em função de pérolas de controle. Os círculos abertos mostram controles positivos e o retângulo uma cultura que secreta anticorpos artificiais contendo LAIR1.
[00321] A Figura 8 mostra para o Exemplo 4 (A) coloração de H2AX indicando rupturas de fita dupla de DNA após irradiação de PBMCs (gráficos FACS) e (B) células B primárias após estimulação de CD40L/IL4 e indução de AID. MFI = intensidade de fluorescência média.
[00322] A Figura 9 mostra para o Exemplo 4 (A) % de células B primárias que expressam GFP e sobreviventes dois dias após a nucleofecção
NEON de um plasmídeo de controle pMAX-GFP. (B) Os gráficos de FACS mostram estratégias de bloqueio de nucleofectantes simulados e condição d) (2150V, 10ms, 2pulsos) que foi usado para experimentos de varredura adicionais.
[00323] A Figura 10 mostra o princípio e os resultados do Exemplo 5. (A) As inserções de troca in vitro são dependentes de c-NHEJ. (B) células B classificadas nativas foram estimuladas com CD40L e IL4 e cultivadas por 9 dias na presença de inibidores para c-NHEJ (SCR7), a-NHEJ (Olaparib) ou transcriptases reversas (ddI/AZT). As inserções de troca natural foram detectadas em 50.000 células B comutadas IgG + in vitro pela tecnologia de sequenciamento MinION.
[00324] A Figura 11 mostra uma representação esquemática de otimização de íntron para reconhecimento de sítio de emenda.
EXEMPLOS
[00325] A seguir, exemplos particulares que ilustram várias modalidades e aspectos da invenção são apresentados. No entanto, a presente invenção não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas descritas neste documento. As seguintes preparações e exemplos são dados para permitir aos versado na técnicas no estado da técnica compreender mais claramente e praticar a presente invenção. A presente invenção, no entanto, não é limitada em escopo pelas modalidades exemplificadas, que se destinam como ilustrações de aspectos únicos da invenção, e os métodos que são funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo da invenção. Na verdade, várias modificações da invenção, além daquelas descritas neste documento, serão prontamente evidentes para os versados no estado da técnica a partir da descrição anterior, das figuras anexas e dos exemplos abaixo. Todas essas modificações estão dentro do escopo das reivindicações anexas. Exemplo 1: Geração de células B manipuladas de acordo com a presente invenção e expressando anticorpos recombinantes.
[00326] O fundamento lógico subjacente dos Exemplos 1 a 3 foi demonstrar que a região de troca de imunoglobulina de células B humanas isoladas pode ser direcionada para modificação genética e subsequentemente resulta na produção de anticorpos recombinantes. Como exemplo, vários experimentos foram conduzidos com sucesso para gerar células B primárias humanas manipuladas produzindo um anticorpo com um domínio LAIR1 inserido (Exemplos 1 - 3). Métodos: Isolamento de células B, simulação e nucleofecção.
[00327] Células B humanas primárias foram isoladas de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) por classificação de células magnética com microesferas anti-CD19 de Miltenyi Biotec. As células B
100.000/mL foram plaqueadas em 12 cavidades. Células K562L irradiadas que expressam CD40L foram adicionadas às células B em uma razão de 1: 2. IL4 recombinante humano foi adicionado a 16 ng/mL. No dia seguinte, as células foram reestimuladas com 8 ng/mL de IL4. A nucleofecção foi realizada no dia 1 após p plaqueamento das células, 4h após a reestimulação de IL4 ou foram posteriormente cultivadas, reestimuladas a cada 3 dias com 8ng/mL de IL4 e nucleofetadas em pontos de tempo indicados. Para a nucleofecção, as células B foram coletadas e 2x106 células B foram nucleofetadas com 1 μg de DNA usando um dispositivo NEON® de acordo com as instruções do fabricante e 2150V, 10 ms e 2 pulsos. Produtos de nucleofecção de DNA.
[00328] O LAIR1 otimizado por códons foi solicitado pela síntese de genes do GenScript® usando a ferramenta de otimização por códons da própria empresa. Para a geração de ssDNA, o "Kit de preparação de DNA de fita única longa (LsODN)" (funakoshi) foi usado. LAIR1 com códon otimizado foi clonado no vetor pLSODN-1. A digestão da enzima de restrição do vetor foi realizada para gerar ssDNA ou dsDNA de extremidade cega/aderente de LAIR1 com códon otimizado.
Análise de sequência.
[00329] O gDNA foi isolado de células B nucleofectadas 7 dias após a nucleofecção usando um kit comercial (QIAGEN). PCRs de região de troca em gDNA foram realizados usando LongAmp Taq Polymerase (New England Biolabs) em volumes de reação de 50 µl com incubação por 3 min a 95°C, seguido por 30 ciclos de 95°C por 40 s, 60°C por 30 s, 65°C por 3 min e uma extensão final por 10 min a 65°C. O iniciador S-µ – FW para a frente de troca-µ a jusante (cacccttgaaagtagcccatgccttcc; SEQ ID NO: 96) foi combinado com S- –REV (cctgcctcccagtgtcctgcattacttctg; SEQ ID NO: 97). Em vez disso, a região de troca-µ do gDNA de células B nucleofetadas foi amplificada combinando o iniciadora S-µ-FW com S-µ-REV (ggaacgcagtgtagactcagctgagg; SEQ ID NO: 98). A reação de PCR foi realizada usando Herculase II Fusion DNA Polymerases (Agilent) com betaína 1 M e DMSO 3% em um volume de 50 µl a 98°C por 4 min seguido por 30 ciclos de 98 ° C por 40 s, 58 ° C por 30 se 72 ° C por 4 min, com extensão final por 10 min a 72 ° C. Uma visão geral do projeto de PCR da região de troca é fornecida na Figura 4 A. Os amplicons de troca purificados e selecionados por tamanho de culturas de células B oligoclonais foram sequenciados por MinION/Oxford Nanopore Technology (ONT). Os códigos de barras foram introduzidos pela adição de sequências BC recomendadas para S-µ e S- iniciadores e amplificação por PCR. A biblioteca de sequenciamento foi preparada usando o kit de sequenciamento Nanopore 2D SQK-LSK207, seguido pelo carregamento em células de fluxo Nanopore FLO-MIN106 e sequenciamento com o sequenciador MinION Mk1B por até 20 h.
[00330] Os substratos de DNA usados no primeiro experimento compreendiam uma versão de ssDNA e dsDNA com éxon LAIR1 otimizado por códons e sequências intrônicas flanqueadoras de tipo selvagem com a seguinte sequência de nucleotídeos:
TTGTGAGCAAGTCTCAGGGTCCTCACTGTCAACTGGGAAAAAAC TCTGCAGTGATGAGAATCACATGCACGTAGAAGGTGCAGGAGGCGTGGGA ATGTTCTAAGGTTGGGCTGTGGTCATGGCTGCATAACTCTATAAAATTGCT AAAATCCCTGAATTGTGATGCTAAAATGACGTGTGTGGCATGGTGACTTCC TACAGTGGACGCTGAGATCCTGCTCTGCTTCCCTCCT AG AAGATCTGCCCAGACCCTCCATCTCGGCTGAGCCAGGCACCGTGATCCCC CTGGGGAGCCATGTGACTTTCGTGTGCCGGGGCCCGGTTGGGGTTCAAA CATTCCGCCTGGAGAGGGACAGTAGATCCACATACAATGATACTGAAGAT GTGTCTCAAGCTAGTCCATCTGAGTCAGAGGCCAGATTCCGCATTGACTCA GTAAGAGAAGGAAATGCCGGGCTTTATCGCTGCATCTATTATAAGCCCCCT AAATGGTCTGAGCAGAGTGACTACCTGGAGCTGCTGGTGAAAG GT GAGGACGTCACCTGGGCCCTGCCCCAGTCTCAGCTCGACCCTCGAGCTT
GTCCCCAGGT [SEQ ID NO: 99] (a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de interesse é mostrada sublinhada; os sítios de reconhecimento de emenda 5’ e 3' são mostrados em negrito e itálico) Resultados
[00331] Em geral, a nucleofecção com ambos os substratos ssDNA e dsDNA resultou na integração bem-sucedida do substrato de ácido nucleico no genoma da célula B. Como exemplo, a Figura 4B mostra os resultados obtidos com dsDNA. Exemplo 2: Investigação adicional de linhagens de células B manipuladas de acordo com a presente invenção e expressando anticorpos recombinantes.
[00332] Para fornecer prova para a inserção produtiva e expressão de anticorpos contendo LAIR1, células B primárias foram nucleofectadas com um substrato de tipo selvagem de dsDNA LAIR1 e, foram rastreadas por classificação de células para LAIR1 e co-coloração de IgM. Como o receptor LAIR1 natural é regulado para baixo após a imortalização do vírus Epstein-Barr (EBV), neste cenário experimental linhagens de EBV foram geradas para distinguir o receptor natural de um receptor de célula B modificado.
[00333] Para preparar produtos de tipo selvagem LAIR1 (wt) para a nucleofecção de tipo selvagem humano, o LAIR1 foi amplificado por PCR a partir de DNA genômico humano (gDNA) usando os seguintes iniciadores (LAIR1_IN_FW ccacctccaaacggcaggcatcc (SEQ ID NO: 100); LAIR1_INTR_REV ccaaaggccgcatgaccatcacgc (SEQ ID NO: 101)). Produtos de DNA quimérico contendo um éxon LAIR1 e íntrons derivados do lócus da imunoglobulina humana foram gerados pela primeira amplificação de produtos únicos com os iniciadores IgM-CH1-IN-fw cctcagctgagtctacactgcgttcc (SEQ ID NO: 102), IgM-CH1-IN-rev ctgaggacccgcaggacaaaagagaaaggg (SEQ ID NO: 103), J6-IN-fw ggtcaccgtctcctcaggtaagaatggcc (SEQ ID NO: 104), J6_IN-REV gccttttcagtttcggtcagcctcgc (SEQ ID NO: 105) e, em seguida, fundindo-os por PCR com iniciadores sobrepostos a um amplicon LAIR1wt com LAIR1-CH1-FW gcgggtcctcagaagatctgcccagaccc (SEQ ID NO: 106) e LAIR1-J6-REV ggccattcttacctttcaccagcagctccagg (SEQ ID NO: 107). Versões otimizadas foram geradas usando iniciadores LAIR1-CH1-opt-FW gcgggtcctcaggggaagatctgcccagaccc (SEQ ID NO: 108), e LAIR1-J6-REV ggccattcttacctgaggagacggctttcaccagcagctccagg (SEQ ID NO: 109). Para minimizar as mutações introduzidas pela polimerase durante a amplificação, o Q5® High-Fidelity DNA Polymeras e (New England Biolabs) com alta atividade de revisão foi usado aplicando o programa de amplificação de PCR padrão.
[00334] As células B foram isoladas, estimuladas e nucleofetadas como descrito acima. Um dia após a nucleofecção, as células B foram imortalizadas com o vírus Epstein-Barr (EBV) por 4h de incubação do vírus girando a 37 ° C conforme descrito anteriormente (Traggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 2004
Aug;10(8):871-5. Epub 2004 Jul 11) As células B foram lavadas e plaqueadas em massa a 1x10 6/mL em culturas de 24 cavidades na presença de CpG-DNA (2,5 g/mL). Uma semana após a imortalização e regulação negativa da célula B do próprio receptor de tipo selvagem LAIR1, as células B foram selecionadas para a coexpressão de LAIR1 e IgM, primeiro marcando-as com anti-LAIR1 conjugado com PE monoclonal (clone DX26, BD Bioscience, 550811) e anti - Anticorpos conjugados a IgM APC (Jackson ImmunoResearch, 109-606-129) seguido por classificação FACS. As células que co-expressaram LAIR1 e IgM foram plaqueadas em cavidades de 96U, expandidas por duas semanas e, em seguida, selecionadas repetidamente por classificação FACS. Análise genômica de gDNA isolado da linha de células e troca a amplificação por PCR da região de troca foi realizada como descrito acima, seguido por sequenciação Sanger.
[00335] Para confirmar a secreção de anticorpos contendo LAIR1 por células B imortalizadas por EBV, os sobrenadantes da cultura foram analisados por análise de Western blot. Os sobrenadantes foram diluídos em água e incubados com tampão de carregamento de amostra 4x (Life Technologies) e agente redutor 10x (Life Technologies) por 10 min a 70 ° C. As amostras foram carregadas em um gel pré-moldado com gradiente de acrilamida de 4 a 12% (Invitrogen). As proteínas foram transferidas para membranas de PVDF pelo aparelho iBlot2 (Life Technologies) seguido por bloqueio por 1 h à temperatura ambiente com BSA a 3% em TBS. A membrana foi incubada com diferentes combinações de anticorpos primários e secundários diluídos em TBS/1% BSA por 1 h em temperatura ambiente com 2 incubações sequenciais de TBS para lavar a membrana entre as incubações. Os isotipos de IgM foram corados com 10 µg/mL de IgM anti-humano de cabra não marcado (Southern Biotech, 2020-01) e 8 ng/mL de HRP de anti-cabra de burro (Jackson ImmunoResearch, 705-036-147). Os anticorpos contendo LAIR1 foram detectados com um anticorpo LAIR1 anti-humano de cabra policlonal (R&D) em 2 g/mL foi combinado com HRP anti-cabra de burro secundário. As membranas foram desenvolvidas com substrato ECL em um gerador de imagens Las4000 (General Electric Company).
[00336] A Figura 5 mostra os resultados da análise FACS. A Figura 5A mostra que as células B foram geradas expressando LAIR1-IgM com sucesso em sua superfície. A integração do domínio LAIR1 em anticorpos secretados foi confirmada por um ensaio de captura de pérolas (Figura 5B) e análise de Western blot (Figura 6A) como descrito acima. Além disso, a integração bem-sucedida também foi alcançada usando um substrato em que um éxon de tipo selvagem LAIR1 foi flanqueado por regiões intrônicas do lócus de imunoglobulina, ou seja, o íntron a jusante do segmento J e o íntron a montante de CH1 (denominado LAIR1 CH1/J6) tendo a seguinte sequência:
CCTCAGCTGAGTCTACACTGCGTTCCCCATCACACTCACCCTCC CTATACTCACTCCCAGGCCTGGGTTGTCTGCCTGGGGAGACTTCAGGGTA GCTGGAGTGTGACTGAGCTGGGGGCAGCAGAAGCTGGGCTGGAGGGACT CTATTGGCTGCCTGCGGGGTGTGTGGCTCCAGGCTTCACATTCAGGTATG CAACCTGGGCCCTCCAGCTGCATGTGCTGGGAGCTGAGTGTGTGCAGCA CCTACGTGCTGATGCCTCGGGGGAAAGCAGGCCTGGTCCACCCAAACCT GAGCCCTCAGCCATTCTGAGCAGGGAGCCAGGGGCAGTCAGGCCTCAGA GTGCAGCAGGGCAGCCAGCTGAATGGTGGCAGGGATGGCTCAGCCTGCT CCAGGAGACCCCAGGTCTGTCCAGGTGTTCAGTGCTGGGCCCTGCAGCA GGATGGGCTGAGGCCTGCAGCCCCAGCAGCCTTGGACAAAGACCTGAGG CCTCACCACGGCCCCGCCACCCCTGATAGCCATGACAGTCTGGGCTTTGG AGGCCTGCAGGTGGGCTCGGCCTTGGTGGGGCAGCCACAGCGGGACGC AAGTAGTGAGGGCACTCAGAACGCCACTCAGCCCCGACAGGCAGGGCAC GAGGAGGCAGCTCCTCACCCTCCCTTTCTCTTTTGTCCTGCGGGTCCTCA GAAGATCTGCCCAGACCCTCCATCTCGGCTGAGCCAGGCACCGTGATCCC CCTGGGGAGCCATGTGACTTTCGTGTGCCGGGGCCCGGTTGGGGTTCAA ACATTCCGCCTGGAGAGGGACAGTAGATCCACATACAATGATACTGAAGAT GTGTCTCAAGCTAGTCCATCTGAGTCAGAGGCCAGATTCCGCATTGACTCA GTAAGAGAAGGAAATGCCGGGCTTTATCGCTGCATCTATTATAAGCCCCCT AAATGGTCTGAGCAGAGTGACTACCTGGAGCTGCTGGTGAAAGGTAAGAA TGGCCACTCTAGGGCCTTTGTTTTCTGCTACTGCCTGTGGGGTTTCCTGAG CATTGCAGGTTGGTCCTCGGGGCATGTTCCGAGGGGACCTGGGCGGACT GGCCAGGAGGGGATGGGCACTGGGGTGCCTTGAGGATCTGGGAGCCTCT GTGGATTTTCCGATGCCTTTGGAAAATGGGACTCAGGTTGGGTGCGTCTG ATGGAGTAACTGAGCCTGGGGGCTTGGGGAGCCACATTTGGACGAGATG CCTGAACAAACCAGGGGTCTTAGTGATGGCTGAGGAATGTGTCTCAGGAG CGGTGTCTGTAGGACTGCAAGATCGCTGCACAGCAGCGAATCGTGAAATA TTTTCTTTAGAATTATGAGGTGCGCTGTGTGTCAACCTGCATCTTAAATTCT TTATTGGCTGGAAAGAGAACTGTCGGAGTGGGTGAATCCAGCCAGGAGGG ACGCGTAGCCCCGGTCTTGATGAGAGCAGGGTTGGGGGCAGGGGTAGCC CAGAAACGGTGGCTGCCGTCCTGACAGGGGCTTAGGGAGGCTCCAGGAC CTCAGTGCCTTGAAGCTGGTTTCCATGAGAAAAGGATTGTTTATCTTAGGA GGCATGCTTACTGTTAAAAGACAGGATATGTTTGAAGTGGCTTCTGAGAAA AATGGTTAAGAAAATTATGACTTAAAAATGTGAGAGATTTTCAAGTATATTA ATTTTTTTAACTGTCCAAGTATTTGAAATTCTTATCATTTGATTAACACCCAT GAGTGATATGTGTCTGGAATTGAGGCCAAAGCAAGCTCAGCTAAGAAATAC TAGCACAGTGCTGTCGGCCCCGATGCGGGACTGCGTTTTGACCATCATAA ATCAAGTTTATTTTTTTAATTAATTGAGCGAAGCTGGAAGCAGATGATGAAT TAGAGTCAAGATGGCTGCATGGGGGTCTCCGGCACCCACAGCAGGTGGC
AGGAAGCAGGTCACCGCGAGAG [SEQ ID NO: 110] (a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de interesse é mostrada sublinhada; os sítios de reconhecimento de emenda 5’ e 3' são mostrados em negrito e itálico)
[00337] A inserção genômica da sequência de tipo selvagem LAIR1 na região de troca foi confirmada por uma reação de PCR específica e análise de sequência (Figura 6 B, C).
Exemplo 3: Investigação adicional de linhagens de células B manipuladas de acordo com a presente invenção e expressando anticorpos recombinantes.
[00338] Para avaliar a frequência de células nucleofetadas com bem sucedidas que produzem anticorpos contendo LAIR1, culturas de 10-30 células por cavidade em formatos de 384 cavidades foram rastreadas por ensaio de pérolas de captura de LAIR1.
[00339] O isolamento de células B, estimulação, nucleofecção e imortalização de EBV foram realizados como descrito acima. Após a incubação do vírus, as células B foram plaqueadas a 10 ou 30 células/cavidade na presença de 25.000 PBMCs autólogos irradiados como células de alimentação e CpG-DNA (2,5 g/mL). Após 2 semanas de cultivo, os sobrenadantes das células foram analisados quanto à secreção de anticorpos contendo LAIR1 por um imunoensaio baseado em esferas de dois determinantes. Portanto, microesferas de IgG anti-cabra (Spherotech) foram revestidas com LAIR1 anti- humano de cabra (R&D Systems, AF2664) ou o anticorpo de controle EGF de cabra anti-humano (R&D Systems, AF-259-NA) por 20 min em temperatura ambiente. SYBR Green I (ThermoFisher Scientific) foi adicionado a 40x à solução de revestimento de anticorpo LAIR1 para distinguir pérolas revestidas com LAIR1 de pérolas de controle. As pérolas foram lavadas, misturadas e incubadas com o sobrenadante de células B imortalizadas por 30 min em temperatura ambiente. Pérola capturada, LAIR1 contendo anticorpos foram detectados usando 2,5 g/mL IgM anti-humano de burro conjugado com Alexa Fluor 647 (Jackson ImmunoResearch, 709-606-073).
[00340] Os resultados são mostrados na Figura 7. Os resultados confirmam uma frequência de uma inserção produtiva em cerca de 12.000 células B primárias (Figura 7 A, B). Exemplo 4: Otimização do ponto de tempo e condição da nucleofecção.
[00341] Neste exemplo, o ponto de tempo ideal e as condições de nucleofecção foram investigados.
[00342] As células B foram isoladas de PBMCs por classificação de células magnética com pérolas anti-CD19 e estimuladas com células K562L que expressam CD40L e IL4 como descrito acima. Para avaliar a indução de rupturas de fita dupla de DNA, as células foram coletadas nos pontos de tempo indicados, fixadas com formaldeído 3,7%, permabilizadas com metanol 90% e armazenadas a -20°C. No dia da análise, as células foram coradas com anti-γ- H2AX de coelho (Histona H3, clone D1H2, # 12167S, sinalização de células) a 0,25 g/mL e analisado por citometria de fluxo. Para controlar a especificidade da coloração de anticorpos, foi realizada uma coloração com PBMCS irradiados ou não tratados.
[00343] As células B foram nucleofetadas 1-10 dias após o início da cultura. Os resultados são mostrados na figura 8. Conforme mostrado pela coloração do marcador de histona H2AX na Fig. 8B, o máximo de rupturas de fita dupla de DNA é alcançado começando nos dias 2 - 3.
[00344] Em seguida, as células B foram nucleofectadas sob condições distintas com o Sistema de Transfecção Neon® (Thermo Fisher Scientific) a 2150V 10ms 1 pulso, 2150V 15ms 1pulso, 2150V 20ms 1pulso, 2150V 10ms 2pulso, 2400V 10ms 1pulso, 2400V 15ms 1pulso, 2150V 20ms 1pulso, 2150V 10ms 2pulso, 2400V 10ms 1pulso, 2400V 15ms 1pulso, 2150V 20ms 1pulso, 2150V 10ms 2pulso, 2400V 10ms 1pulso, 2400V 15ms 1pulso, 2150V 20ms 1pulsão 10ms 1pulso e 2500V 15ms 1pulso. Os resultados são mostrados na Figura 9. Sob todas as condições, a nucleofecção bem-sucedida foi alcançada. Os melhores resultados foram obtidos usando 2150 V, 10 ms, 2 pulsos. Exemplo 5: Influência de c-NHEJ e a-EJ na aquisição de inserções na região de troca.
[00345] Para aumentar a eficiência da manipulação, um sistema in vitro foi usado para estudar a influência de c-NHEJ e a-EJ na aquisição de inserções naturais.
[00346] Para este fim, as células B foram isoladas por pérolas magnéticas usando pérolas anti-CD19, seguido de classificação por FACS e seleção de células B virgens (IgM + IgD + CD27 - IgG - IgA -). As células foram plaqueadas em placas de 48 cavidades em concentrações de 50.000 células B/mL e estimuladas com 25.000 K562L/mL irradiados e IL4 8ng/mL. O inibidor de reparo de DNA Olaparip (4nM), SCR7 (100nM) ou DMSO (1: 100) como controle foram adicionados ao meio de cultura. No dia 3 e no dia 6, o meio de cultura foi substituído, meio fresco suplementado com IL4 e inibidores. As células foram coletadas no dia 10 e coradas com anticorpos anti-CD19 e anti- IgG marcados com fluorescência. As células B IgG trocadas foram classificadas por citometria de fluxo e o gDNA foi isolado usando um kit comercial. O DNA genômico de 50.000 células classificadas foi usado para - amplificação por PCR da região de troca e sequenciamento MINION conforme descrito acima. As frequências das inserções foram analisadas com um pipeline de bioinformática (Pieper K, Tan J, Piccoli L, Foglierini M, Barbieri S, Chen Y, Silacci-Fregni C, Wolf T, Jarrossay D, Anderle M, Abdi A, Ndungu FM, Doumbo OK, Traore B, Tran TM, Jongo S, Zenklusen I, Crompton PD, Daubenberger C, Bull PC, Sallusto F, Lanzavecchia A: Public antibodies to malaria antigens generated by two LAIR1 insertion modalities. Nature. 2017 Aug 31 ; 548(7669):597-601).
[00347] O princípio geral é mostrado na Fig. 10A e os resultados são mostrados na Figura 10B. Os resultados mostram que as inserções de troca naturais dependem da via de reparo do DNA c-NHEJ, pois as frequências de inserção na presença de SCR7 diminuem enquanto aumentam quando o Olaparib foi adicionado ao meio de cultura (Figura 10 A, B). Portanto, a engenharia de células B na presença do inibidor Olaparib pode aumentar a eficiência da manipulação. Da mesma maneira, a pré-incubação do substrato de DNA com as proteínas de ligação ao DNA Ku70/80, o primeiro evento no reparo mediado por c-NHEJ e a nucleofecção do complexo de proteína DNA- Ku70/80 pode aumentar o número de integrações bem-sucedidas (Figura 10 A) TABELA DE SEQUÊNCIAS E NÚMEROS DE SEQ ID (LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS): SEQ ID NO Sequência Observações SEQ ID NO: 1 AGGTAAGT sítio de emenda 3’ SEQ ID NO: 2 YNCTGAC Sítio de ramificação em que Y pode ser C ou T e N pode ser qualquer nucleotídeo selecionado a partir de A, G, C e T SEQ ID NO: 3 intensificador de
GTAGTGAGGG emenda intrônico SEQ ID NO: 4 intensificador de
GTTGGTGGTT emenda intrônico SEQ ID NO: 5 intensificador de
AGTTGTGGTT emenda intrônico SEQ ID NO: 6 intensificador de
GTATTGGGTC emenda intrônico SEQ ID NO: 7 intensificador de
AGTGTGAGGG emenda intrônico SEQ ID NO: 8 intensificador de
GGGTAATGGG emenda intrônico SEQ ID NO: 9 intensificador de
TCATTGGGGT emenda intrônico SEQ ID NO: 10 intensificador de
GGTGGGGGTC emenda intrônico
SEQ ID NO: 11 intensificador de
GGTTTTGTTG emenda intrônico SEQ ID NO: 12 intensificador de
TATACTCCCG emenda intrônico SEQ ID NO: 13 intensificador de
GTATTCGATC emenda intrônico SEQ ID NO: 14 intensificador de
GGGGGTAGG emenda intrônico SEQ ID NO: 15 intensificador de
GTAGTTCCCT emenda intrônico SEQ ID NO: 16 intensificador de
GTTAATAGTA emenda intrônico SEQ ID NO: 17 intensificador de
TGCTGGTTAG emenda intrônico SEQ ID NO: 18 intensificador de
ATAGGTAACG emenda intrônico SEQ ID NO: 19 intensificador de
TCTGAATTGC emenda intrônico SEQ ID NO: 20 intensificador de
TCTGGGTTTG emenda intrônico SEQ ID NO: 21 intensificador de
CATTCTCTTT emenda intrônico SEQ ID NO: 22 intensificador de
GTATTGGTGT emenda intrônico SEQ ID NO: 23 intensificador de
GGAGGGTTT emenda intrônico SEQ ID NO: 24 intensificador de
TTTAGATTTG emenda intrônico
SEQ ID NO: 25 intensificador de
ATAAGTACTG emenda intrônico SEQ ID NO: 26 intensificador de
TAGTCTATTA emenda intrônico SEQ ID NO: 27 CGAGGAGGCAGCTCCTCACCCTCCCTTTC sequência intrônica
TCTTTTGTCCTGCGGGTCCTCAG SEQ ID NO: 28 CGAAGGGGGCGGGAGTGGCGGGCACCG sequência intrônica
GGCTGACACGTGTCCCTCACTGCAG SEQ ID NO: 29 TCCGCCCACATCCACACCTGCCCCACCTC sequência intrônica
TGACTCCCTTCTCTTGACTCCAG SEQ ID NO: 30 CCACAGGCTGGTCCCCCCACTGCCCCGC sequência intrônica
CCTCACCACCATCTCTGTTCACAG SEQ ID NO: 31 TGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGT sequência intrônica
CACATGGCACCACCTCTCTTGCAG SEQ ID NO: 32 GGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGT sequência intrônica
AACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG SEQ ID NO: 33 AGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACA sequência intrônica
CGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAG SEQ ID NO: 34 GGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCG sequência intrônica
CTGTACCAACCTCTGTCCCTACAG SEQ ID NO: 35 TGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCAGTC sequência intrônica
ACATGGCGCCATCTCTCTTGCAG SEQ ID NO: 36 AGATACCTTCTCTCTTCCCAGATCTGAGTA sequência intrônica
ACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG
SEQ ID NO: 37 ACGCATCCACCTCCATCCCAGATCCCCGT sequência intrônica
AACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG SEQ ID NO: 38 ACGCGTCCACCTCCATCCCAGATCCCCGT sequência intrônica
AACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG SEQ ID NO: 39 ACGCATCCACCTCCATCCCAGATCCCCGT sequência intrônica
AACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG SEQ ID NO: 40 ACGCATCCACCTCCATCCCAGATCCCCGT sequência intrônica
AACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG SEQ ID NO: 41 GACCCACCCTCTGCCCTGGGAGTGACCG sequência intrônica
CTGTGCCAACCTCTGTCCCTACAG SEQ ID NO: 42 TGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGT sequência intrônica
CACATGGCACCACCTCTCTTGCAG SEQ ID NO: 43 AGACACCTTCTCTCCTCCCAGATCTGAGT sequência intrônica
AACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG SEQ ID NO: 44 AGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACG sequência intrônica
CATCCACCTCCATCTCTTCCTCAG SEQ ID NO: 45 GGCCCACCCTCTGCCCTGGGAGTGACCG sequência intrônica
CTGTGCCAACCTCTGTCCCTACAG SEQ ID NO: 46 GTGAGTCTGCTGTCTGGGGATAGCGGGG sequência intrônica
AGCCAGGTGTACTGGGCCAGGCAA SEQ ID NO: 47 GTGAGTCCCACTGCAGCCCCCTCCCAGTC sequência intrônica
TTCTCTGTCCAGGCACCAGGCCA SEQ ID NO: 48 GTAAGATGGCTTTCCTTCTGCCTCCTTTCT sequência intrônica
CTGGGCCCAGCGTCCTCTGTCC SEQ ID NO: 49 GTGAGTCCTCACAACCTCTCTCCTGCTTTA sequência intrônica
ACTCTGAAGGGTTTTGCTGCAT SEQ ID NO: 50 GTGAGTCCTCACCACCCCCTCTCTGAGTC sequência intrônica
CACTTAGGGAGACTCAGCTTGCC SEQ ID NO: 51 GTAAGAATGGCCACTCTAGGGCCTTTGTT sequência intrônica
TTCTGCTACTGCCTGTGGGGTTT SEQ ID NO: 52 CATGGTGACTTCCTACAGTGGACGCTGAG sequência intrônica
ATCCTGCTCTGCTTCCCTCCTAG SEQ ID NO: 53 GTGAGGACGTCACCTGGGCCCTGCCCCA sequência intrônica
GTCTCAGCTCGACCCTCGAGCTTG SEQ ID NO: 54 marcador de
LEVLFQGP clivagem SEQ ID NO: 55 marcador de
DDDDK clivagem SEQ ID NO: 56 marcador de
IEGR clivagem SEQ ID NO: 57 marcador de
ENLYFQG clivagem SEQ ID NO: 58 marcador de
LVPRGS clivagem SEQ ID NO: 59 DX1EX2NPGP sítio de autoprocessamento em que X1 é Val ou Ile, e X2 pode ser qualquer aminoácido (de ocorrência natural)
SEQ ID NO: 60 sítio de
EGRGSLLTCGDVEENPGP autoprocessamento SEQ ID NO: 61 sítio de
VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP autoprocessamento SEQ ID NO: 62 sítio de
ATNFSLLKQAGDVEENPGP autoprocessamento SEQ ID NO: 63 sítio de
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP autoprocessamento SEQ ID NO: 64 sítio de
RKRRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP autoprocessamento SEQ ID NO: 65 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQF Marcador Strep EK dupla aa SEQ ID NO: 66 GLNDIFEAQKIEWHE Marcador Avi SEQ ID NO: 67 KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL Marcador Calmodulina SEQ ID NO: 68 EEEEEE marcador poliglutamato SEQ ID NO: 69 GAPVPYPDPLEPR Marcador-E SEQ ID NO: 70 DYKDDDDK Marcador FLAG SEQ ID NO: 71 YPYDVPDYA Marcador-HA SEQ ID NO: 72 HHHHHH Marcador his SEQ ID NO: 73 EQKLISEEDL Marcador-Myc SEQ ID NO: 74 TKENPRSNQEESYDDNES Marcador-NE SEQ ID NO: 75 KETAAAKFERQHMDS Marcador-S SEQ ID NO: 76 MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLE Marcador SBP
HHPQGQREP SEQ ID NO: 77 SLAELLNAGLGGS Marcador Sof 1 SEQ ID NO: 78 TQDPSRVG Marcador Sof 3
SEQ ID NO: 79 WSHPQFEK Marcador-Strep SEQ ID NO: 80 CCPGCC Marcador TC SEQ ID NO: 81 GKPIPNPLLGLDST Marcador V5 SEQ ID NO: 82 YTDIEMNRLGK marcador VSV SEQ ID NO: 83 DLYDDDDK Marcador Xpress SEQ ID NO: 84 TDKDMTITFTNKKDAE Marcador Isopep SEQ ID NO: 85 AHIVMVDAYKPTK Marcador Spy SEQ ID NO: 86 KLGDIEFIKVNK Marcador Snoop SEQ ID NO: 87 EVHTNQDPLD Marcador Ty1 SEQ ID NO: 88 EDLPRPSISAEPGTVIPLGSHVTFVCRGPVG fragmento LAIR1 VQTFRLERERNYLYSDTEDVSQTSPSESEA mutado aa
RFRIDSVNAGNAGLFRCIYYKSRKWSEQSD
YLELVVK SEQ ID NO: 89 DSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCS Fragmento PD-1 aa
FSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPED RSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRAR
RNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVT SEQ ID NO: 90 EQVSTPEIKVLNKTQENGTCTLILGCTVEKG Fragmento SLAM aa
DHVAYSWSEKAGTHPLNPANSSHLLSLTLG PQHADNIYICTVSNPISNNSQTFSPWPGCRT
DPS SEQ ID NO: 91 MAQVQLVESGGGLVQAGGSLTLSCAASGS T3-VHH aa
TSRSYALGWFRQAPGKEREFVAHVGQTAE FAQGRFTISRDFAKNTVSLQMNDLKSDDTAI
YYCVASNRGWSPSRVSYWGQGTQVTVSS SEQ ID NO: 92 QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTS TT39.7-scFv aa
RVGVGWIRQPPGKALEWLSLIYWDDEKHYS PSLKNRVTISKDSSKNQVVLTLTDMDPVDT GTYYCAHRGVDTSGWGFDYWGQGALVTV SSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVS GSPGQSITISCSGAGSDVGGHNFVSWYQQ YPGKAPKLMIYDVKNRPSGVSYRFSGSKSG YTASLTISGLQAEDEATYFCSSYSSSSTLIIF
GGGTRLTVL SEQ ID NO: 93 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTL F4-VHH aa
DYYYIGWFRQAPGKEREAVSCISGSSGSTY YPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPE DTAVYYCATIRSSSWGGCVHYGMDYWGKG
TQVTVSS SEQ ID NO: 94 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS MPE8-scFv aa
SYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISASSSYSD YADSAKGRFTISRDNAKTSLFLQMNSLRAE DTAIYFCARARATGYSSITPYFDIWGQGTLV TVSS GGGGSGGGGSGGGGS QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIG AGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYDNNNRPSGV PDRFSASKSGTSASLAITGLQAEDEADYYC
QSYDRNLSGVFGTGTKVTVL SEQ ID NO: 95 TGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTT Sinal de localização GCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGG nuclear SV40
GGACTTTCCACACCTGGTTGCTGACTAATT GAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTG
CTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACC SEQ ID NO: 96 cacccttgaaagtagcccatgccttcc iniciador SEQ ID NO: 97 cctgcctcccagtgtcctgcattacttctg iniciador
SEQ ID NO: 98 ggaacgcagtgtagactcagctgagg iniciador SEQ ID NO: 99 TTGTGAGCAAGTCTCAGGGTCCTCACTGT Substrato de DNA
CAACTGGGAAAAAACTCTGCAGTGATGAG AATCACATGCACGTAGAAGGTGCAGGAGG CGTGGGAATGTTCTAAGGTTGGGCTGTGG TCATGGCTGCATAACTCTATAAAATTGCTA AAATCCCTGAATTGTGATGCTAAAATGACG TGTGTGGCATGGTGACTTCCTACAGTGGA CGCTGAGATCCTGCTCTGCTTCCCTCCTA GAAGATCTGCCCAGACCCTCCATCTCGGC TGAGCCAGGCACCGTGATCCCCCTGGGG AGCCATGTGACTTTCGTGTGCCGGGGCCC GGTTGGGGTTCAAACATTCCGCCTGGAGA GGGACAGTAGATCCACATACAATGATACT GAAGATGTGTCTCAAGCTAGTCCATCTGA GTCAGAGGCCAGATTCCGCATTGACTCAG TAAGAGAAGGAAATGCCGGGCTTTATCGC TGCATCTATTATAAGCCCCCTAAATGGTCT GAGCAGAGTGACTACCTGGAGCTGCTGGT GAAAGGTGAGGACGTCACCTGGGCCCTG CCCCAGTCTCAGCTCGACCCTCGAGCTTG
TCCCCAGGT SEQ ID NO: iniciador ccacctccaaacggcaggcatcc 100 SEQ ID NO: iniciador ccaaaggccgcatgaccatcacgc 101 SEQ ID NO: iniciador cctcagctgagtctacactgcgttcc 102
SEQ ID NO: iniciador ctgaggacccgcaggacaaaagagaaaggg 103 SEQ ID NO: iniciador ggtcaccgtctcctcaggtaagaatggcc 104 SEQ ID NO: iniciador gccttttcagtttcggtcagcctcgc 105 SEQ ID NO: iniciador gcgggtcctcagaagatctgcccagaccc 106 SEQ ID NO: iniciador ggccattcttacctttcaccagcagctccagg 107 SEQ ID NO: iniciador gcgggtcctcaggggaagatctgcccagaccc 108 SEQ ID NO: ggccattcttacctgaggagacggctttcaccagcagctcca iniciador 109 gg SEQ ID NO: CCTCAGCTGAGTCTACACTGCGTTCCCCA Substrato de DNA 110 TCACACTCACCCTCCCTATACTCACTCCCA
GGCCTGGGTTGTCTGCCTGGGGAGACTT CAGGGTAGCTGGAGTGTGACTGAGCTGG GGGCAGCAGAAGCTGGGCTGGAGGGACT CTATTGGCTGCCTGCGGGGTGTGTGGCTC CAGGCTTCACATTCAGGTATGCAACCTGG GCCCTCCAGCTGCATGTGCTGGGAGCTG AGTGTGTGCAGCACCTACGTGCTGATGCC TCGGGGGAAAGCAGGCCTGGTCCACCCA AACCTGAGCCCTCAGCCATTCTGAGCAGG GAGCCAGGGGCAGTCAGGCCTCAGAGTG CAGCAGGGCAGCCAGCTGAATGGTGGCA GGGATGGCTCAGCCTGCTCCAGGAGACC CCAGGTCTGTCCAGGTGTTCAGTGCTGGG CCCTGCAGCAGGATGGGCTGAGGCCTGC AGCCCCAGCAGCCTTGGACAAAGACCTGA GGCCTCACCACGGCCCCGCCACCCCTGA TAGCCATGACAGTCTGGGCTTTGGAGGCC TGCAGGTGGGCTCGGCCTTGGTGGGGCA GCCACAGCGGGACGCAAGTAGTGAGGGC ACTCAGAACGCCACTCAGCCCCGACAGG CAGGGCACGAGGAGGCAGCTCCTCACCC TCCCTTTCTCTTTTGTCCTGCGGGTCCTCA GAAGATCTGCCCAGACCCTCCATCTCGGC TGAGCCAGGCACCGTGATCCCCCTGGGG AGCCATGTGACTTTCGTGTGCCGGGGCCC GGTTGGGGTTCAAACATTCCGCCTGGAGA GGGACAGTAGATCCACATACAATGATACT GAAGATGTGTCTCAAGCTAGTCCATCTGA GTCAGAGGCCAGATTCCGCATTGACTCAG TAAGAGAAGGAAATGCCGGGCTTTATCGC TGCATCTATTATAAGCCCCCTAAATGGTCT GAGCAGAGTGACTACCTGGAGCTGCTGGT GAAAGGTAAGAATGGCCACTCTAGGGCCT TTGTTTTCTGCTACTGCCTGTGGGGTTTCC TGAGCATTGCAGGTTGGTCCTCGGGGCAT GTTCCGAGGGGACCTGGGCGGACTGGCC AGGAGGGGATGGGCACTGGGGTGCCTTG AGGATCTGGGAGCCTCTGTGGATTTTCCG ATGCCTTTGGAAAATGGGACTCAGGTTGG GTGCGTCTGATGGAGTAACTGAGCCTGGG GGCTTGGGGAGCCACATTTGGACGAGAT GCCTGAACAAACCAGGGGTCTTAGTGATG GCTGAGGAATGTGTCTCAGGAGCGGTGTC TGTAGGACTGCAAGATCGCTGCACAGCAG CGAATCGTGAAATATTTTCTTTAGAATTAT GAGGTGCGCTGTGTGTCAACCTGCATCTT AAATTCTTTATTGGCTGGAAAGAGAACTGT CGGAGTGGGTGAATCCAGCCAGGAGGGA CGCGTAGCCCCGGTCTTGATGAGAGCAG GGTTGGGGGCAGGGGTAGCCCAGAAACG GTGGCTGCCGTCCTGACAGGGGCTTAGG GAGGCTCCAGGACCTCAGTGCCTTGAAGC TGGTTTCCATGAGAAAAGGATTGTTTATCT TAGGAGGCATGCTTACTGTTAAAAGACAG GATATGTTTGAAGTGGCTTCTGAGAAAAAT GGTTAAGAAAATTATGACTTAAAAATGTGA GAGATTTTCAAGTATATTAATTTTTTTAACT GTCCAAGTATTTGAAATTCTTATCATTTGAT TAACACCCATGAGTGATATGTGTCTGGAAT TGAGGCCAAAGCAAGCTCAGCTAAGAAAT ACTAGCACAGTGCTGTCGGCCCCGATGC GGGACTGCGTTTTGACCATCATAAATCAA GTTTATTTTTTTAATTAATTGAGCGAAGCT GGAAGCAGATGATGAATTAGAGTCAAGAT GGCTGCATGGGGGTCTCCGGCACCCACA GCAGGTGGCAGGAAGCAGGTCACCGCGA
GAG SEQ ID NO: AAGATCTGCCCAGACCCTCCATCTCGGCT Sequência de 111 GAGCCAGGCACCGTGATCCCCCTGGGGA nucleotídeos que
GCCATGTGACTTTCGTGTGCCGGGGCCC codifica (poli) GGTTGGGGTTCAAACATTCCGCCTGGAGA peptídeo de GGGACAGTAGATCCACATACAATGATACT interesse
GAAGATGTGTCTCAAGCTAGTCCATCTGA GTCAGAGGCCAGATTCCGCATTGACTCAG TAAGAGAAGGAAATGCCGGGCTTTATCGC TGCATCTATTATAAGCCCCCTAAATGGTCT GAGCAGAGTGACTACCTGGAGCTGCTGGT
GAAAG SEQ ID NO: TTGTGAGCAAGTCTCAGGGTCCTCACTGT sequência intrônica 112 CAACTGGGAAAAAACTCTGCAGTGATGAG
AATCACATGCACGTAGAAGGTGCAGGAGG CGTGGGAATGTTCTAAGGTTGGGCTGTGG TCATGGCTGCATAACTCTATAAAATTGCTA AAATCCCTGAATTGTGATGCTAAAATGACG TGTGTGGCATGGTGACTTCCTACAGTGGA CGCTGAGATCCTGCTCTGCTTCCCTCCTA
G SEQ ID NO: GTGAGGACGTCACCTGGGCCCTGCCCCA sequência intrônica 113 GTCTCAGCTCGACCCTCGAGCTTGTCCCC
AGGT SEQ ID NO: CCTCAGCTGAGTCTACACTGCGTTCCCCA sequência intrônica 114 TCACACTCACCCTCCCTATACTCACTCCCA
GGCCTGGGTTGTCTGCCTGGGGAGACTT CAGGGTAGCTGGAGTGTGACTGAGCTGG GGGCAGCAGAAGCTGGGCTGGAGGGACT CTATTGGCTGCCTGCGGGGTGTGTGGCTC CAGGCTTCACATTCAGGTATGCAACCTGG GCCCTCCAGCTGCATGTGCTGGGAGCTG AGTGTGTGCAGCACCTACGTGCTGATGCC TCGGGGGAAAGCAGGCCTGGTCCACCCA AACCTGAGCCCTCAGCCATTCTGAGCAGG GAGCCAGGGGCAGTCAGGCCTCAGAGTG CAGCAGGGCAGCCAGCTGAATGGTGGCA GGGATGGCTCAGCCTGCTCCAGGAGACC CCAGGTCTGTCCAGGTGTTCAGTGCTGGG CCCTGCAGCAGGATGGGCTGAGGCCTGC AGCCCCAGCAGCCTTGGACAAAGACCTGA GGCCTCACCACGGCCCCGCCACCCCTGA TAGCCATGACAGTCTGGGCTTTGGAGGCC TGCAGGTGGGCTCGGCCTTGGTGGGGCA GCCACAGCGGGACGCAAGTAGTGAGGGC ACTCAGAACGCCACTCAGCCCCGACAGG CAGGGCACGAGGAGGCAGCTCCTCACCC TCCCTTTCTCTTTTGTCCTGCGGGTCCTCA
G SEQ ID NO: GTAAGAATGGCCACTCTAGGGCCTTTGTT sequência intrônica 115 TTCTGCTACTGCCTGTGGGGTTTCCTGAG
CATTGCAGGTTGGTCCTCGGGGCATGTTC CGAGGGGACCTGGGCGGACTGGCCAGGA GGGGATGGGCACTGGGGTGCCTTGAGGA TCTGGGAGCCTCTGTGGATTTTCCGATGC CTTTGGAAAATGGGACTCAGGTTGGGTGC GTCTGATGGAGTAACTGAGCCTGGGGGCT TGGGGAGCCACATTTGGACGAGATGCCTG AACAAACCAGGGGTCTTAGTGATGGCTGA GGAATGTGTCTCAGGAGCGGTGTCTGTAG GACTGCAAGATCGCTGCACAGCAGCGAAT CGTGAAATATTTTCTTTAGAATTATGAGGT GCGCTGTGTGTCAACCTGCATCTTAAATTC TTTATTGGCTGGAAAGAGAACTGTCGGAG TGGGTGAATCCAGCCAGGAGGGACGCGT AGCCCCGGTCTTGATGAGAGCAGGGTTG GGGGCAGGGGTAGCCCAGAAACGGTGGC TGCCGTCCTGACAGGGGCTTAGGGAGGC TCCAGGACCTCAGTGCCTTGAAGCTGGTT TCCATGAGAAAAGGATTGTTTATCTTAGGA GGCATGCTTACTGTTAAAAGACAGGATAT GTTTGAAGTGGCTTCTGAGAAAAATGGTTA AGAAAATTATGACTTAAAAATGTGAGAGAT TTTCAAGTATATTAATTTTTTTAACTGTCCA AGTATTTGAAATTCTTATCATTTGATTAACA CCCATGAGTGATATGTGTCTGGAATTGAG GCCAAAGCAAGCTCAGCTAAGAAATACTA GCACAGTGCTGTCGGCCCCGATGCGGGA CTGCGTTTTGACCATCATAAATCAAGTTTA TTTTTTTAATTAATTGAGCGAAGCTGGAAG CAGATGATGAATTAGAGTCAAGATGGCTG CATGGGGGTCTCCGGCACCCACAGCAGG TGGCAGGAAGCAGGTCACCGCGAGAG

Claims (65)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para editar o genoma de um linfócito B isolado, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (i) ativa da citidina desaminase induzida por ativação endógena do linfócito B; e (ii) introduzir uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse no linfócito B.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método não envolve uma nuclease exógena e/ou uma nuclease manipulada, como uma nuclease CRISPR, uma nuclease de dedo de zinco, uma nuclease tipo ativador de transcrição ou uma meganuclease.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a molécula de DNA é uma molécula de DNA linear ou linearizada.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a molécula de DNA é uma molécula de DNA de fita simples (ssDNA) ou uma molécula de DNA de fita dupla (dsDNA).
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a molécula de DNA é uma molécula de dsDNA.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a molécula de DNA tem extremidades cegas ou saliências.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos da molécula de DNA que codifica o (poli) peptídeo de interesse é otimizada por códons.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a molécula de DNA compreende uma sequência intrônica a montante e/ou a jusante da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a sequência intrônica compreende um sítio de reconhecimento de emenda.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a sequência intrônica contém sequências intrônicas do lócus de Ig.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a sequência intrônica compreende uma sequência intrônica de um íntron a jusante do segmento J e/ou uma sequência intrônica de um íntron a montante de CH.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a molécula de DNA compreende um intensificador de emenda.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o genoma do linfócito B é editado para expressar uma cadeia de imunoglobulina modificada compreendendo na direção N- para C-terminal: um domínio variável, o (poli) peptídeo de interesse e um domínio constante.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o genoma do linfócito B é editado para expressar uma cadeia de imunoglobulina modificada, em que um domínio variável endógeno é substituído pelo (poli) peptídeo de interesse.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a molécula de DNA compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um sítio de clivagem a montante e/ou a jusante da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o sítio de clivagem é um sítio de clivagem T2A.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o (poli) peptídeo de interesse compreende ou consiste em um domínio de ligação do patógeno, um domínio VH ou um domínio VH - VL.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o (poli) peptídeo de interesse compreende ou consiste em CD4, dipeptidil peptidase 4, CD9 ou enzima de conversão de angiotensina 2 ou um fragmento ou variante de sequência dos mesmos.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o linfócito B isolado é um linfócito B primário.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o método compreende obter um linfócito B modificado,
em que o genoma do linfócito B compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda uma etapa (iii) de confirmar a integração da sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse no genoma do linfócito B.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o linfócito B isolado é cultivado em RPMI ou IMDM com 10% de FBS, 1% de NEAA, 1% de piruvato de sódio, 1% de beta-mercaptoetanol, 1% de Glutamax, 1% de penicilina/estreptomicina , 1% de canamicina e 1% de transferrina.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o linfócito B isolado é cultivado a 1 x 105 a 1 x 106 células/mL, preferencialmente a 2 x 105 células/mL.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o linfócito B é cultivado em um meio de cultura que compreende um ativador de citidina desaminase induzida por ativação.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o ativador da citidina desaminase induzida por ativação é selecionado a partir do grupo que consiste em: uma citocina, um anticorpo receptor de células anti-B ou fragmentos dos mesmos, um agonista de TLR, um agonista de CpG-B, um composto de imidazoquinolina ou uma combinação de qualquer um dos referidos ativadores.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a citocina é selecionada a partir do grupo que consiste em CD40L, IL4, IL2, IL21, BAFF, APRIL, CD30L, TGF-β1, 4-1BBL, IL6, IL7, IL10, IL13, c-Kit, FLT-3, IFNα ou qualquer combinação dos mesmos.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que a citocina é administrada em concentrações de 0,01- 20ng/mL.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o linfócito B é cultivado em um meio que compreende IL4 e/ou CD40L.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a ativação da citidina desaminase induzida por ativação é realizada por co- cultura com uma linhagem de células que expressa CD40L e adição de IL-4.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a concentração de IL-4 (no meio de cultura final) é 0,005 - 0,03 ng/mL, preferencialmente 0,01 - 0,025 ng/mL, mais preferencialmente 0,015 - 0,02 ng/mL e mais preferencialmente 0,16 ng/mL.
31. Método, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que a linhagem de células que expressa CD40L é K562L.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a introdução da molécula de DNA no linfócito B é realizada até 10 dias após a ativação da citidina desaminase induzida por ativação, preferencialmente até 7 dias após a ativação da citidina desaminase induzida por ativação, mais preferencialmente até 5 dias após a ativação da citidina desaminase induzida por ativação, ainda mais preferencialmente até 2 dias após a ativação da citidina desaminase induzida por ativação e mais preferencialmente cerca de 1 dia após a ativação da citidina desaminase induzida por ativação.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o método não compreende a transdução do linfócito B com um retrovírus.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a molécula de DNA é introduzida por nucleofecção.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado pelo fato de que o linfócito B é reativado após a introduzir a molécula de DNA no linfócito B.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizado pelo fato de que os agentes estimuladores de células B, por exemplo, conforme definido nas reivindicações 25 a 31, são aplicados ao linfócito B após introduzir a molécula de DNA no linfócito B.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que o linfócito B é tratado com um inibidor de DNA capaz de bloquear a junção da extremidade alternativa antes de introduzir a molécula de DNA no linfócito B.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizado pelo fato de que a molécula de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse é incubada com uma proteína Ku, tal como Ku70/Ku80, antes de introduzir a molécula de DNA no linfócito B .
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que a molécula de DNA compreende um sinal de localização nuclear, tal como o sinal de localização nuclear SV40.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizado pelo fato de que a molécula de DNA não compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica GFP ou RFP.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizado pelo fato de que a molécula de DNA compreende um promotor.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que a molécula de DNA compreende uma unidade de transcrição.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizado pelo fato de que cerca de 24 horas após a ativação da citidina desaminase induzida por ativação do linfócito B, o linfócito B é tratado com um inibidor de nuclease, como Mirin.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que o linfócito B é um linfócito B humano.
45. Linfócito B modificado caracterizado pelo fato de que pode ser obtido pelo método definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44.
46. Linfócito B modificado caracterizado pelo fato de compreende um lócus de gene de imunoglobulina editado compreendendo uma inserção heteróloga compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um (poli) peptídeo de interesse inserido em sua região de troca.
47. Linfócitos B, de acordo com a reivindicação 45 ou 46, caracterizados pelo fato de que o linfócito B é humano.
48. Linfócito B, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, caracterizado pelo fato de que a região de troca de um lócus do gene de imunoglobulina do linfócito B compreende um sítio de clivagem, em particular um sítio de clivagem T2A.
49. Linfócito B, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 48, caracterizado pelo fato de que a região de troca de um lócus do gene de imunoglobulina do linfócito B compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um domínio de ligação do patógeno, um domínio VH ou um domínio VH-VL.
50. Linfócito B, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 49, caracterizado pelo fato de que a região de troca de um lócus do gene de imunoglobulina do linfócito B compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica CD4, dipeptidil peptidase 4, CD9 ou enzima de conversão de angiotensina 2 ou um fragmento ou sequência variante dos mesmos.
51. Linfócito B, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 50, caracterizado pelo fato de que o linfócito B não expressa uma proteína repórter fluorescente.
52. Linfócito B, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 51, caracterizado por ser para uso em medicina.
53. Linfócito B para uso de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o linfócito B é modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44.
54. Linfócito B para uso de acordo com a reivindicação 52 ou 53, caracterizado pelo fato de que o linfócito B manipulado é administrado a um paciente.
55. Linfócito B para uso de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o paciente que recebe o linfócito B manipulado é o mesmo paciente de quem o linfócito B foi isolado antes da manipulação.
56. Método para terapia com células B, caracterizado pelo fato de compreende as seguintes etapas: (a) isolar um linfócito B a partir de um paciente; (b) manipular o linfócito B de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44; e (c) administrar o linfócito B modificado ao paciente.
57. Linhagem de células de linfócitos B, caracterizado pelo fato de que é definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 51.
58. Método para gerar um anticorpo ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende um (poli) peptídeo (heterólogo) de interesse, o método compreendendo as seguintes etapas: (1) fornecer um linfócito B manipulado ou uma linhagem de células B de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 51 e 57, em que o linfócito B compreende um lócus de gene de imunoglobulina editado compreendendo uma inserção heteróloga compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o (poli) peptídeo de interesse inserido em sua região de troca; (2) cultivar o linfócito B modificado ou a linha de células B; e (3) isolar o anticorpo ou o fragmento do mesmo compreendendo o (poli) peptídeo (heterólogo) de interesse da cultura de células B.
59. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o linfócito B manipulado é obtido por um método definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44.
60. Método, de acordo com a reivindicação 58 ou 59, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a caracterização do anticorpo ou fragmento de anticorpo, em que a caracterização compreende ⎯ realizar ensaios funcionais para determinar a função do anticorpo ou fragmento de anticorpo; ⎯ realizar ensaios de ligação para determinar a especificidade de ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo e/ou o parceiro/epítopo de ligação reconhecido pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo; e/ou ⎯ realizar ensaios de neutralização para determinar a capacidade do anticorpo ou fragmento de anticorpo de neutralizar uma toxina ou um patógeno.
61. Anticorpo caracterizado pelo fato de que pode ser obtido pelo método de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 60.
62. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o linfócito B, definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 51, ou o anticorpo, definido de acordo com a reivindicação 61.
63. Composição, de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.
64. Composição, de acordo com a reivindicação 62 ou 63, caracterizado pelo fato de ser para uso em medicina.
65. Método para imunoterapia, caracterizado pelo fato de que compreende administrar d anticorpo definido de acordo com a reivindicação 61, a célula B manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 51 ou a composição de acordo com a reivindicação 62 ou 63 a um indivíduo em necessidade.
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