KR20210016446A - 내인성 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소를 이용한 b 림프구의 조작 - Google Patents

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카트린 데 라 로사
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Abstract

본 발명은 B 림프구의 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소를 이용하여 B 림프구를 조작하는 방법을 제공한다. 이를 통해, Cas 뉴클레아제와 같은 조작된 뉴클레아제의 사용을 피할 수 있다. 조작된 B 세포는 맞춤형 항체의 생산 및 B 세포 치료에 유용하다. 따라서, 본 발명은 조작된 B 세포 및 조작된 B 세포에 의해 생산되는 맞춤형 항체도 제공한다.

Description

내인성 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소를 이용한 B 림프구의 조작
본 발명은 특히 항체 생산을 위한 조작된 B 림프구(engineered B lymphocyte)의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 조작된 B 세포가 맞춤형 항체를 생산할 수 있도록 B 세포에서 면역글로불린 유전자를 편집(editing)하는 것에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 B 세포를 조작하는 방법 및 본 발명의 방법에 따라 조작된 B 세포를 제공한다. 이러한 조작된 B 세포 및 B 세포에 의해 생산되는 맞춤형 항체는 조작된 항체가 표적화하는 질병의 예방 및 치료뿐만 아니라 예를 들어 (분리된) 샘플에서 항원의 검출을 위한 진단 접근법을 포함하는 다양한 의료 용도로 유용하다.
치료용 단클론 항체의 사용은 면역 장애, 암 및 감염을 포함한 다양한 질병을 특이적으로 표적하는 획기적인 접근 방식으로 알려져 왔다. 현재 65 종의 단클론 항체(mAbs)가 FDA에 의해 임상 사용 승인을 받았으며, 350 종 이상의 mAb가 임상 시험 중에 있으므로, 이러한 치료적 접근방법 및 재조합 항체 공학의 파워가 입증된다.
특히 Kohler 및 Milstein이 특히 1975 년에 mAb 생산 절차를 개발한 이후로 수많은 질병을 치료하기 위한 강력한 도구로서 치료용 항체의 잠재력이 알려져 왔다(Kohler G, Milstein C: Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975 Aug 7; 256(5517):495-7). 최초의 mAb는 마우스에서 생산되었고, 환자에게 투여되었을 때 이러한 마우스 항체는 외부 분자로 인식되어 심각한 문제에 직면했다. 이는 인간 면역 체계에 의한 제거및 가벼운 발진에서 신부전에 이르는 알레르기 반응을 초래했다. 더욱이, 이러한 뮤린 항체는 인간 면역 체계의 구성 요소와 적절하게 상호 작용할 수 없었고 그의 생물학적 효능이 심각하게 제한되었다(검토를 위해서는 다음문헌[Chames P, Van Regenmortel M, Weiss E, Baty D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 2009;157(2):220-233. doi:10.1111/j.1476-5381.2009.00190.x.]을 참조한다).
이러한 문제를 피하기 위해, 뮤린 항체를 보다 "인간화"하는 전략이 개발되었다. 한 가지 접근법은 뮤린 가변 도메인이 인간 불변 도메인에 융합되어서 약 70%가 인간화이고 완전한 인간 Fc 부위를 갖는 키메라 항체의 개발이었다(Neuberger MS, Williams GT, Mitchell EB, Jouhal SS, Flanagan JG, Rabbitts TH: A hapten-specific chimaeric IgE antibody with human physiological effector function. Nature. 1985 Mar 21-27; 314(6008):268-70). mAb의 뮤린 부분을 추가로 감소시키기 위해, "인간화" 항체가 개발되었으며, 이러한 항체에서는 완전 인간 항체의 초가변 루프가 "상보성 결정 영역(CDR) 이식"에 의해 목적 뮤린 항체의 초가변 루프로 치환되었다. 인간화 항체는 85 내지 90%의 인간 서열을 포함하며 키메라 항체보다 면역원성이 상당히 적다. 승인된 대부분의 mAb는 키메라 또는 인간화 항체이다(검토를 위하여는 다음문헌[Chames P, Van Regenmortel M, Weiss E, Baty D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 2009;157(2):220-233. doi:10.1111/j.1476-5381.2009.00190.x.]을 참조한다). 그러나, 인간화하는 것은 기술적으로 까다롭고 항체 활성의 상실(즉, 기능 상실)을 초래할 수 있다.
치료용 항체 개발을 위한 또 다른 접근법은 파지 디스플레이와 같은 시험관내 디스플레이 기술과 관련이 있다(McCafferty J, Griffiths AD, Winter G, Chiswell DJ: Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 1990 Dec 6; 348(6301):552-4). 따라서, 인간 항체 또는 항체 단편은 스크리닝을 위해 파지, 박테리아 또는 효모와 같은 단순한 유기체의 표면에 발현된다. 그러나, 이러한 라이브러리 시스템은 전장 항체를 포함하지 않으며 항체는 인간 세포에 의해서가 아니라 박테리아 또는 효모에 의해 발현된다. 이러한 발현 시스템은 인간의 번역후 변형을 반영할 수 없다. 특히, 시험관 내에서 생산된 항체는 종종 천연의 인간 항체 글리코실화 패턴과 유사하지 않지만, 이러한 패턴은 이펙터 기능과 면역계의 다운스트림 활성화에 영향을 미치기 때문에 항체 효과에 중요하다.
또한, 형질전환 "인간화된" 마우스를 사용하여 인간 유전자로부터 항체를 생산할 수 있다(Lonberg N. Human monoclonal antibodies from transgenic mice. In: Chernajovsky Y, Nissim A, editors. Therapeutic Antibodies. Handbook of Experimental Pharmacology, Volume 181. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag; 2008. pp. 69-97. Eds.). 그러나, 이러한 기술은 항원을 이용한 마우스의 면역화에 의존하기 때문에, 마우스의 면역 체계가 인식할 수 있는 항원에 대한 항체의 생산으로 제한된다.
따라서, 치료용 항체 생산을 위한 "골드 표준"은 분리된 인간 B 림프구를 사용하는 것이며, 이는 인간 항체 생산의 "자연적인" 방식을 이용한다(Traggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 2004 Aug;10(8):871-5. Epub 2004 Jul 11; Lanzavecchia A, Bernasconi N, Traggiai E, Ruprecht CR, Corti D, Sallusto F. Understanding and making use of human memory B cells. Immunol Rev. 2006 Jun;211:303-9). 따라서, B 세포는 천연 B 세포 게놈을 기반으로 천연 인간 항체 및 인간 항체 라이브러리를 얻기 위해 전통적으로 사용되었다(Duvall MR, Fiorini RN. Different approaches for obtaining antibodies from human B cells. Curr Drug Discov Technol. 2014 Mar;11(1):41-7). 최근에야, CRISPR/Cas9, 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease) 및 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(Transcription Activator-Like Effector Nucleases; TALENs)와 같은 게놈 편집 도구의 개발에 따라, 인간 B 세포도 면역글로불린 유전자 편집을 위한 표적으로 알려져서, 맞춤형 재조합 항체도 분리된 인간 B 세포에 의해 생산될 수 있었다.
예를 들어, Cheong과 동료들은 CRISPR/Cas9 기술을 적용하여 레트로바이러스 또는 렌티바이러스와 함께 Cas9 및 가이드-RNA를 B 세포에 전달하여 면역글로불린 유전자를 편집함으로써 면역글로불린 클래스-스위치 재조합을 유도하는 것을 보고했다(Cheong TC, Compagno M, Chiarle R. Editing of mouse and human immunoglobulin genes by CRISPR-Cas9 system. Nat Commun. 2016 Mar 9; 7:10934. doi: 10.1038/ncomms10934).
또한, WO 2016/161446호는 인간 B 세포를 조작하기 위한 CRISPR/Cas9 기술의 사용을 기재하고 있다. 또한, WO 2016/161446호는 B 세포를 유전적으로 변형하기 위해 징크 핑거 뉴클레아제 및 TALENS와 같은 다른 조작된 뉴클레아제의 사용을 제안하고 있다.
일반적으로, CRISPR/Cas9, 징크 핑거 뉴클레아제 및 TALEN과 같은 조작된 뉴클레아제를 사용하는 게놈 편집 접근법은 유망한 치료 잠재력을 가진 생명공학의 강력한 도구로서 최근에 알려졌다. 그러나 조작된 뉴클레아제의 작용 기작과 이의 전달 요건으로 인해, 임상 응용에서 조작된 뉴클레아제에 의한 게놈 편집의 사용의 경우 주요한 안전성 문제가 발생한다.
따라서, 주요한 관심사는 원치않는 비표적 절단 및 돌연변이와 관련이 있다. 조작된 뉴클레아제에 의한 특이적 표적화에도 불구하고 조작된 뉴클레아제의 의도하지 않은 상호작용 및 이에 따른 비표적 부위의 절단이 보고되었다(Zhang XH, Tee LY, Wang XG, Huang QS, Yang SH. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 2015 Nov 17;4:e264. doi: 10.1038/mtna.2015.37; Shim G, Kim D, Park GT, Jin H, Suh SK, Oh YK. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacol Sin. 2017 Jun;38(6):738-753. doi: 10.1038/aps.2017.2). 예를 들어, CRISPR/Cas9 시스템에서 sgRNA는 부분적 상동성을 갖는 불일치 서열(mismatched sequence)에 결합할 수 있다.
또한, 외인성 유전자 편집 도구의 종양원성은 또 다른 중요한 안전성 문제를 나타냄으로써, 특히 비표적(off-target) 돌연변이(예를 들어, 원종양 유전자 근처)가 암 발생을 초래할 수 있다. 즉, 비표적 돌연변이의 생성은 기능적 이상 및 암 발병의 위험이 있다.
CRISPR/Cas9, 징크 핑거 뉴클레아제 및 TALEN은 모두 인체에 대해 외인성이고 이질적이기 때문에 또 다른 중요한 안전성 문제는 조작된 뉴클레아제의 면역원 성과 관련이 있다. 따라서, 조작된 뉴클레아제는 면역 반응을 유발할 수 있다(Dai WJ, Zhu LY, Yan ZY, Xu Y, Wang QL, Lu XJ. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Mol Ther Nucleic Acids. 2016;5:e349. doi: 10.1038/mtna.2016.58). 또한, 조작된 뉴클레아제의 전달에 사용되는 바이러스 벡터는 면역원성일 수 있으며 동일한 바이러스 벡터의 반복 사용을 제한하는 항체 및 T 세포 면역 반응을 생성할 수 있다(Zaiss AK, Muruve DA. Immune responses to adeno-associated virus vectors. Curr Gene Ther. 2005 Jun;5(3):323-31). 또한, 바이러스 벡터는 염색체 통합 및 생식선 전이의 위험이 있다.
따라서, 보다 안전한 B 세포 게놈 편집 도구의 개발이 필요하다.
이를 고려하여, 본 발명의 목적은 전술한 종래 기술의 결점을 극복하는 새로운 B 세포 조작 방법을 제공함에 있다. 특히, 본 발명의 목적은 보다 안전한 B 세포 조작 방법을 제공함에 있다. 예를 들어, 본 발명의 목적은 원치 않는 비타겟(off-target) 돌연변이의 위험을 낮추는 B 세포 조작 방법을 제공함에 있다. 이러한 목적은 아래 및 첨부된 청구범위에 명시된 요지를 통해 달성된다.
본 발명이 아래에 상세하게 설명되지만, 본원에 설명된 특정 방법, 프로토콜 및 시약은 다양할 수 있으므로 본 발명이 이에 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해하여야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
이하에서, 본 발명의 구성요소가 설명될 것이다. 이들 구성요소는 특정 실시 예와 함께 나열되지만, 이들 구성요소는 추가의 구체예를 생성하기 위해 임의의 방식 및 임의의 수로 조합될 수 있음을 이해하여야 한다. 다양하게 설명된 실시예 및 바람직한 구체예는 본 발명을 명시적으로 설명된 구현예로만 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이러한 설명은 명시적으로 설명된 구체예를 임의의 개수의 개시되고/되거나 바람직한 구성요소와 결합시키는 구체예를 지지 및 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 출원에서 설명된 모든 구성요소의 임의의 순열 및 조합은 문맥이 달리 지시하지 않는 한 본 출원의 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서 및 첨부되는 청구범위 전반에 걸쳐서, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 용어 "포함한다(comprise)" 및 "포함한다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 구성원, 정수 또는 단계의 포함을 의미하지만 임의의 다른 명시되지 않은 구성원, 정수 또는 단계의 제외를 의미하지 않는 것으로 이해된다. 용어 "구성된다(consist of)"는 용어 "포함한다"의 특정 구체예이며, 이 경우 언급되지 않은 임의의 다른 구성원, 정수 또는 단계는 제외된다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "포함한다"는 용어 "구성된다"을 포함한다. 따라서, 용어 "포함하는"는 "포함하는"뿐만 아니라 "구성되는"을 포함하는데, 예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 X로 배타적으로 구성될 수 있거나, 예를 들어 X + Y와 같은 추가적인 것을 포함 할 수 있다.
본 발명을 설명하는 맥락(특히 청구범위의 맥락)에서 사용되는 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 참조는 본 명세서에서 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한 단수 및 복수 형태를 모두 커버하는 것으로 해석되어야한다. 본 명세서에서 값의 범위를 열거하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로 사용되도록 의도된다. 본원에서 달리 지시하지 않는 한, 각각의 개별 값은 마치 본원에서 개별적으로 언급된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 본 명세서 내의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 비청구(non-claimed) 구성요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
"실질적으로"라는 단어는 "완전히"를 배제하지 않는데, 예를 들어, Y가 "실질적으로 없는"조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우, "실질적으로"라는 단어는 본 발명의 정의에서 생략될 수 있다.
수치 x와 관련된 용어 "약"은 x ± 10%를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "펩티드", "폴리펩티드", "단백질"은 각각, 바람직하게는 정상 펩티드 결합에 의해 또는 그렇지 않으면 예를 들어 이소스테릭 펩티드의 경우 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드, 올리고 펩티드 또는 융합 단백질을 포함하는 단백질을 의미한다. 용어 "(폴리)펩티드"는 펩티드 및/또는 폴리펩티드를 의미한다. 특히, 용어 "펩티드", "폴리펩티드", "단백질"은 또한, 비펩티드성 구조적 요소를 포함하는 펩티드 유사체로 정의되는 "펩티도미메틱(peptidomimetics)"을 포함하며, 펩티드는 천연 모체 펩티드의 생물학적 작용(들)을 모방하거나 길항할 수 있다. 펩티도미메틱은 효소적으로 자를 수 있는 펩티드 결합과 같은 고전적인 펩티드 특성이 결여되어 있다. 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 유전 암호(genetic code)에 의해 정의된 20개의 아미노산 중 하나로 구성될 수 있다. 또한, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 이들 아미노산 외에도 유전 암호에 의해 정의된 20개의 아미노산 이외의 아미노산을 포함 할 수도 있거나, 유전 암호에 의해 정의된 20개의 아미노산 이외의 아미노산으로 구성될 수 있다. 특히, 본 발명의 맥락에서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 당업자에게 잘 알려져 있는 번역후 성숙 과정과 같은 자연적 과정에 의해 또는 화학적 과정에 의해 변형된 아미노산으로 동일하게 구성될 수 있다. 이러한 변형은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 이러한 변형은 폴리펩티드, 펩티드 골격, 아미노산 사슬 또는 심지어는 카르복시 또는 아미노 말단에서 어느 곳에서나 나타날 수 있다. 특히, 펩티드 또는 폴리펩티드는 유비퀴틴화 후에 분지될 수 있거나 분지(branching)가 있거나 없는 사이클릭일 수 있다. 이러한 유형의 변형은 당업자에게 잘 알려진 자연적 또는 합성적 번역후 과정의 결과일 수 있다. 특히 본 발명의 맥락에서 용어 "펩티드", "폴리펩티드", "단백질"은 변형된 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질도 포함한다. 예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유결합 고정(covalent fixation), 지질 또는 지질 유도체의 공유결합 고정, 포스파티딜이노시톨의 공유결합 고정, 공유 또는 비공유 결합 가교, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 페길화를 포함한 글리코실화, 수산화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 분해 과정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일(seneloylation), 황산화(sulfatation), 아르기닐화 또는 유비퀴틴화와 같은 아미노산 첨가를 포함할 수 있다. 이러한 수정은 문헌에 상세히 기재되어 있다(Proteins Structure and Molecular Properties (1993) 2nd Ed., T. E. Creighton, New York ; Post-translational Covalent Modifications of Proteins (1983) B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York ; Seifter et al. (1990) Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182: 626-646 and Rattan et al., (1992) Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci, 663: 48-62). 따라서, 용어 "펩티드", "폴리펩티드", "단백질"은 바람직하게는 예를 들어 리포펩티드, 지단백질, 글리코펩티드, 당단백질 등을 포함한다.
그러나 바람직하게는, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 "고전적인" 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이고, 따라서 "고전적인" 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 일반적으로 정상 펩티드 결합에 의해 서로 연결된, 유전 암호에 의해 정의된 20개의 아미노산으로부터 선택된 아미노산으로 구성된다.
본원에서 사용되는 용어 "중쇄"(항체 또는 항체 단편의)는 또 다른 폴리펩티드( "경쇄")와 결합될 폴리펩티드를 의미한다. 특히, 중쇄 및 경쇄는 이황화 결합을 통해 결합된다. 중쇄는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 항체 중쇄 불변 도메인을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 중쇄는 3개의 항체 중쇄 불변 도메인인 CH1, CH2 및 CH3, 및 CH1과 CH2 사이의 힌지 영역을 포함한다. 상기 중쇄 불변 도메인은 뮤린, 키메라, 합성, 인간화 또는 인간, 및 단클론 또는 다클론인 항체로 부터 유래될 수 있다. 중쇄는 하나 이상의 가변 도메인, 바람직하게는 항체 중쇄(VH)의 가변 도메인을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "경쇄"(항체 또는 항체 단편의)는 또 다른 폴리펩티드("중쇄")와 결합될 폴리펩티드를 의미한다. 특히 중쇄 및 경쇄는 이황화 결합을 통해 결합된다. 경쇄는 항체 경쇄 불변 영역 CL을 포함할 수 있다. 상기 경쇄 불변 영역은 뮤린, 키메라, 합성, 인간화 또는 인간, 및 단클론 또는 다클론인 항체로부터 유래될 수 있다. 제2 폴리펩티드 사슬은 하나 이상의 가변 도메인, 바람직하게는 항체 경쇄(VL)의 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일반적으로 "항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 단백질이다. 일반적으로, 항체는 해당 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 고유한 구조를 포함하지만, 일반적으로 항체는 유사한 구조를 가지며 특히 면역글로불린(Ig)으로도 알려져 있다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 본 발명에 따른 특징적인 특성이 유지되는 한, 전체 항체, 항체 단편, 특히 항원 결합 단편, 인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 재조합 항체 및 유전적으로 조작된 항체(변이 또는 돌연변이 항체)를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 형태의 항체를 포함한다. 청구범위를 포함하는 명세서가 몇몇의 장소에서 항체의 항원 결합 단편(들), 항체 단편(들), 변이체(들) 및/또는 유도체(들)를 명시적으로 언급할 수 있지만, 용어는 "항체"는 모든 범주의 항체, 즉 항원 결합 단편(들), 항체 단편(들), 항체의 변이체(들) 및 유도체(들)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 단편", "단편" 및 "항체 단편"은 상호교환적으로 사용되며 항체의 임의의 단편을 의미한다. 특히, 본원에서 용어 "항원 결합 단편", "단편" 및 "항체 단편"은 (i) 항체의 항원 결합 활성 및 / 또는 (ii) 본원에 기재된 항체의 (추가의) 기능적 도메인에 의해 제공된 추가의 기능, 예를 들어 (독립적인) 결합 부위에 의해 제공되는 결합 활성을 보유하는 항체의 임의의 단편을 의미한다. 본 발명에 따른 항체 단편에서는 본 발명에 따른 특징적인 특성이 유지된다. 일반적으로, 항체 단편의 예는 단일 사슬 항체, Fab, Fab' 또는 F (ab')2를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항체의 단편은 펩신 또는 파파인과 같은 효소에 의한 절단을 포함하는 방법 및/또는 화학적 환원에 의한 이황화 결합의 절단을 포함하는 방법에 의해 항체로부터 얻어질 수 있다. 대안적으로, 항체의 단편은 중쇄 또는 경쇄 서열의 일부의 클로닝 및 발현을 통해 얻어질 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 항체 및 항체 단편 둘 모두를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 인간 항체는 현재의 기술에서 잘 알려져 있다(van Dijk, M. A., and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 또한, 인간 항체는 면역화 시 내인성 면역글로불린 생산의 부재하에 완전한 레퍼토리 또는 선택된 인간 항체를 생산할 수 있는 형질전환 동물(예를 들어, 마우스)에서 생산될 수 있다. 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 이러한 생식계열 돌연변이 마우스에 전달하면 항원 공격시 인간 항체가 생성된다(예를 들어, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 3340 참조). 또한, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리에서도 생산될 수 있다(Hoogenboom, H. R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Cole 등 및 Boerner 등의 기법은 인간 단클론 항체의 제조에도 사용될 수 있다(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); and Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). 그러나 가장 바람직하게는, 인간 단클론 항체는 본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 방법에 의해 제조되고, 이러한 방법은 다음문헌[Traggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. (2004): An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10(8):871-5]에 기재된 바와 같은 개선된 EBV-B 세포 불멸화(immortalization)와 조합될 수 있다. 또한, 본원에 사용되는 용어 "인간 항체"는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 특성을 생성하도록 변형되는 항체를 포함한다.
본 발명에 따른 항체는 정제된 형태로 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 항체 또는 항체 단편은 정제된 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 일반적으로, 항체는 다른 폴리펩티드가 실질적으로없는 조성물에 존재할 것이다. 예를 들어, 이 경우, 조성물의 90 (중량)% 미만, 일반적으로 60% 미만, 보다 일반적으로 50% 미만이 다른 폴리펩티드로 구성된다.
본원에서 사용되는 용어 "가변 도메인"("가변 영역"; 경쇄의 가변 도메인(VL), 중쇄의 가변 도메인(VH)이라고도 함)은 고전적인 자연 발생 항체의 N-말단 도메인인 항체 또는 항체 단편의 도메인을 의미하고, 그 도메인은 일반적으로 고전적인 자연 발생 항체에서 가장 높은 가변성을 제공하고 항원에의 항체의 결합에 직접 관여한다. 일반적으로 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 도메인은 동일한 일반 구조를 가지며, 각각의 도메인은 그의 서열이 광범위하게 보존된 프레임워크(FR) 영역(특히 4개의 프레임워크(FR) 영역) 및 3개의 "초가변 영역" 또는 상보성 결정 영역CDR(특히 3개의 "초가변 영역"/CDR)을 포함한다. 프레임워크 영역은 일반적으로 β-시트 구조를 채택하고 CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각각의 사슬의 CDR은 일반적으로 프레임워크 영역에 의해 3차원 구조로 유지되고 다른 사슬의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"을 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR"영역은 본원에 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. CDR 및 FR 영역은 다음문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 기재된 표준 정의에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로, 특히 천연의 단일 특이적 IgG 항체에서, 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)은 가변 도메인에서 비연속적으로 배열된다. 즉, 중쇄 및/또는 경쇄상의 CDR은 예를 들어 프레임워크 영역에 의해 분리될 수 있고, 이에 의해 프레임워크 영역(FR)은 CDR보다 덜 "가변"적인 가변 도메인의 영역이다. 예를 들어, 항체에서 가변 도메인(또는 각각의 가변 도메인)은 바람직하게는 3개의 CDR에 의해 분리된 4개의 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 특히, 항체의 가변 도메인(경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 VH 또는 VL)은 N- 내지 C- 말단으로부터 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 사슬 상의 CDR은 이러한 프레임워크 아미노산에 의해 분리된다. 일반적으로, 중쇄의 3개의 CDR 및 연결된 경쇄의 3 개의 CDR은 함께 항원 결합 부위 파라토프)를 형성한다. 즉, 특히 천연 단일 특이적 IgG 항체에서 항원 결합 부위는 일반적으로 2개의 가변 도메인으로 구성되기 때문에, 각 항원 결합 부위 마다 6개의 CDR이 존재한다(중쇄: CDRH1, CDRH2 및 CDRH3; 경쇄: CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3). 단일 항체, 특히 단일의 천연 단일특이적 IgG 항체는 일반적으로 2 개의 (동일한) 항원 결합 부위를 가지며 따라서 12 개의 CDR(즉, 2 x 6 개의 CDR)을 포함한다.
그의 "다중특이성", 즉 상이한 항원 결합 부위로 인해, 다중특이적 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 또는 그의 항원 결합 단편은 (각각) 3 개 초과의 CDR, 특히 3 개 초과의 상이한 CDR을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2개 이상의 상이한 가변 도메인을 포함할 수 있고, 이때 상기 2 개 이상의 상이한 가변 도메인 각각은 예를 들어, IgG 유형의 상이한 단일특이적 항체로부터 유래된다. 이러한 단일특이적 항체는 일반적으로 항원 결합 부위를 형성하는 중쇄에서 3개의 CDR 및 경쇄에서 3개의 CDR을 포함하기 때문에, 다중특이 적 항체는 특히 제1 항체의 중쇄의 3개의 CDR 및 제1 항체의 경쇄의 3개의 CDR, 제2 항체의 중쇄의 3개의 CDR 및 제2 항체의 경쇄의 3개의 CDR, 선택적으로 제3 항체의 중쇄의 3개의 CDR 및 제3 항체의 경쇄의 3개의 CDR 등을 포함할 수 있다. 따라서, 다중특이적 항체의 중쇄 및/또는 경쇄에 포함되는 CDR의 수는 바람직하게는 3의 배수, 예를 들어 3, 6, 9, 12 등이다. 따라서, 다중특이적 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다에 포함된 CDR의 합은 6의 배수, 예를 들어 6, 12, 18 등인 것이 또한 바람직하다. "항원 결합 부위"는 일반적으로 CDR, 즉 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3뿐만 아니라 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3에 의해 특징지워지기 때문에, 항원 결합 부위를 보존하기 위해, 즉 항원의 특정 부위에 특이적으로 결합하는 능력을 보존하기 위해 순서(예를 들어, 동일한 단일특이적 항체로부터 유래된 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 및/또는 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3)가 유지되도록 단일특이적 항체의 CDR이 배열되는 것이 바람직하다. 이는 예를 들어, 아미노산 스트레치에서 제1 단일특이적 항체로 부터 유래된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 순서가 바람직하게는 제2 단일특이적 항체로부터 유래된 임의의 CDR에 의해 중단되지 않음을 의미한다. 중요하게, 다중특이적 항체가 적어도 2개의 상이한 단일특이적 항체로부터 유래된 항원 결합 부위를 포함하는 경우, CDR(또는 가변 영역)이 유래된 각각의 단일특이적 항체의 "항원 수용체"가 보존되도록, 즉 항원의 특정 부위에 특이 적으로 결합하는 그의 능력이 보존되도록 그러한 단일특이적 항체의 CDR 또는 가변도메인은 다중특이적 항체에 배열된다.
본 발명의 맥락에서, 가변 도메인은 자연 발생 항체의 임의의 가변 도메인(특히, VH 및/또는 VL)일 수 있거나, 가변 도메인은 변형/조작된 가변 도메인일 수 있다. 변형/조작된 가변 도메인은 당업계에 알려져 있다. 일반적으로, 가변 도메인은 하나 이상의 기능을 삭제 또는 추가하기 위해, 예를 들어, 체세포 돌연변이를 "생식계열화(germlining)"("제거")하거나 인간화함으로써 변형/조작된다.
본원에서 사용되는 용어 "불변 도메인"은 항원에의 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만 다양한 이펙터(effector) 기능을 나타내는 항체의 도메인을 의미한다. 일반적으로, 중쇄는 면역글로불린 부류에 따라 3개 또는 4개의 불변 도메인을 포함한다: CH1, CH2, CH3 및 선택적으로 CH4(N-C-말단 방향). 따라서, 중쇄의 불변 영역은 일반적으로 다음과 같이 형성된다(N- 에서 C-말단 방향으로): CH1-힌지(중쇄의 제1 및 제2 불변 도메인 사이의 아미노산을 포함하는 유연한 폴리펩티드)-CH2-CH3(-CH4). 경쇄는 일반적으로 경쇄의 불변 영역을 형성하는 CL로 지칭되는 오직 하나의 불변 도메인만을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 불변 도메인은 자연 발생 항체의 임의의 불변 도메인(특히, CL, CH1, CH2, CH3 및/또는 CH4)일 수 있거나, 불변 도메인은 변형/조작된 불변 도메인일 수 있다. 변형/조작된 불변 도메인은 당업계에 알려져 있다. 일반적으로, 불변 도메인은 예를 들어 Fc 영역의 기능의 맥락에서 하나 이상의 기능을 삭제하거나 추가하기 위해 변형/조작된다. 그의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 항체 또는 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 류로 나누어지고, 이들 중 몇몇은 아류, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱더 나누어질 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, ε, γ 및 μ로 불린다. 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 IgM 유형 또는 IgG 유형이다. IgG와 달리, IgM은 힌지 영역을 포함하지 않지만 추가의 불변 도메인 및 카르복시 말단에서 18개 아미노산 테일피스(tailpiece)를 포함하며, 이 테일피스는 시스테인을 포함하고 분자의 다량체화에 관여한다.
일반적으로, 항체는 임의의 동형(예를 들어, IgA, IgG, IgM, 즉, α, γ 또는 μ 중쇄)일 수 있지만, 바람직하게는 IgM 또는 IgG일 수 있다. IgG 동형내에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아류일 수 있으며, 따라서 IgG1이 바람직하다. 항체는 κ 또는 λ 경쇄를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 항체"는 자연에서 발생하지 않는 모든 항체, 예를 들어 본 발명의 방법에 따라 조작된 B 세포에 의해 생산된 항체를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 것으로, 항체 또는 항체 단편의 문맥에서 용어 "다중특이 적"은 항체 또는 항체 단편이 예를 들어 상이한 항원 또는 동일한 항원 상의 적어도 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 능력을 의미한다. 따라서, "이중특이적", 삼중특이적", "사중특이적"등과 같은 용어는 항체가 결합할 수 있는 서로 다른 에피토프의 수를 의미한다. 예를 들어, 통상적인 단일 특이적 IgG 유형 항체는 두 개의 동일한 항원 결합 부위(파라토프)를 가지며, 따라서 동일한 에피토프에만 결합할 수 있다(상이한 에피토프에는 결합하지 않는다). 대조적으로, 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 유형의 파라토프/결합 부위를 가지며, 따라서 적어도 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 본원에서 사용되는 "파라토프"는 항체의 항원 결합 부위를 의미한다. 또한, 단일 "특이성"은 단일 항체의 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 동일한 파라토프를 의미할 수 있다(하나의 단일 항체 분자에서 파라토프/결합 부위의 실제 수는 "가(valency")로 지칭된다). 예를 들어, 단일 천연 IgG 항체는 2개의 동일한 파라토프를 가지고 있기 때문에 단일특이적이고 2가이다. 따라서, 다중특이적 항체는 2개 이상의 (별개의) 파라토프/결합 부위를 포함한다. 따라서, 용어 "다중특이적 항체"는 하나 초과의 파라토프를 갖고 및 둘 이상의 상이한 에피토프에 결합하는 능력을 갖는 항체를 의미한다. 용어 "다중특이적 항체"는 특히 상기 정의된 바와 같은 이중특이적 항체를 포함할뿐만 아니라, 일반적으로 특히 3개 이상의 별개의 에피토프에 결합하는 단백질(예를 들어, 항체) 스캐폴드, 즉 3개 이상의 파라토프/결합 부위를 갖는 항체를 포함한다.
특히, 다중특이적 항체 또는 항체 단편은 2개 이상의 파라토프/결합 부위를 포함할 수 있으며, 이때 몇몇의 파라토프/결합 부위는 동일할 수 있어서 항체의 모든 파라토프/결합 부위는 적어도 2개의 상이한 유형의 파라토프/결합 부위에 속하므로 항체는 적어도 2개의 특이성을 갖는다. 예를 들어, 다중특이적 항체 또는 항체 단편은 4개의 파라토프/결합 부위를 포함할 수 있으며, 이때 각각의 2개의 파라토프/결합 부위는 동일하고(즉, 동일한 특이성을 가짐), 따라서 항체 또는 이의 단편은 이중특이적이고 4가(두 개의 특이성 각각 마다 2개의 동일한 파라토프/결합 부위)이다. 따라서, "하나의 특이성"은 특히 동일한 특이성을 나타내는 하나 이상의 파라토프/결합 부위를 의미하므로(일반적으로 이러한 하나 이상의 파라토프/결합 부위가 동일함을 의미함), 2개의 특이성"은 단지 2개의 특이성을 의미하는 한 2개, 3개, 4개의 5 개, 6개 또는 그 이상의 파라토프/결합 부위에 의해 실현될 수 있다. 대안적으로, 다중특이적 항체는 각각의(적어도 2개의) 특이성 마다 하나의 단일 파라토프/결합 부위를 포함할 수 있다. 즉 다중특이적 항체는 적어도 총 2개의 파라토프/결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 2개의 특이성 각각마다 하나의 단일 파라토프/결합 부위를 포함한다. 즉, 그 항체는 총2 개의 파라토프/결합 부위를 포함한다. 또한, 항체는 2개의 특이성 각각 마다 2개의 (동일한) 파라토프/결합 부위를 포함하는 것이 바람직하다. 즉, 항체는 총 4개의 파라 토프/결합 부위를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 항체는 2개의 특이성 각각 마다 3개의 (동일한) 파라토프/결합 부위를 포함한다. 즉, 항체는 총 6개의 파라토프/결합 부위를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항원"은 적응성 면역 반응의 수용체에 대한 표적, 특히 항체, T 세포 수용체 및/또는 B 세포 수용체에 대한 표적으로서 작용하는 임의의 구조적 물질을 의미한다. "항원 결정 인자"라고도 알려진 "에피토프"는 면역계, 특히 항체, T 세포 수용체 및/또는 B 세포 수용체에 의해 인식되는 항원의 일부(또는 단편)이다. 따라서, 하나의 항원에는 하나 이상의 에피토프가 있다. 즉, 단일 항원에는 하나 이상의 에피토프가 있다. 항원은 (i) 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, (ii) 다당류, (iii) 지질, (iv) 지질 단백질 또는 지질 펩티드, (v) 당지질, (vi) 핵산, 또는 (vii) 저분자 약물 또는 독소일 수 있다. 따라서, 항원은 펩티드, 단백질, 다당류, 지질, 지질 단백질 및 당지질을 포함한 이들의 조합, 핵산(예를 들어, DNA, siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 디코이 DNA, 플라스미드) 또는 소분자 약물(예를 들어, 사이클로스포린 A, 파클리탁셀, 독소루비신, 메토트렉세이트, 5-아미노레불린 산), 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직하게는, 항원은 (i) 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, (ii) 다당류, (iii) 지질, (iv) 지질 단백질 또는 지질 펩티드 및 (v) 당지질로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 항원은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 부위"는 항원의 일부 또는 전부에 특이 적으로 결합하고 이에 상보적인 영역을 포함하는 항체의 일부를 의미한다. 항원이 큰 경우, 항체는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있으며, 이 부분을 "에피토프"라고한다. 일반적으로, 2개의 가변 도메인, 특히 중쇄 가변 도메인 VH 및 경쇄 가변 도메인 VL이 결합하여 하나의 항원 결합 부위를 형성한다. 특히, 항원 결합 부위는 전술한 바와 같이 중쇄 가변 도메인의 3개의 CDR과 함께 경쇄 가변 도메인의 3개의 CDR에 의해, 즉 6개의 CDR에 의해 형성된다.
용어 "특이적 결합" 및 유사한 언급"은 비특이적 부착(sticking)을 포함하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "링커"("스페이서"라고도 함)는 항체 또는 항체 단편과 같은 폴리펩티드 또는 단백질의 별개의 도메인을 연결하도록 구성된 펩티드를 의미한다. 링커는 당업계에 알려져 있으며 예를 들어 다음문헌[Reddy Chichili VP, Kumar V, Sivaraman J. Linkers in the structural biology of protein-protein interactions. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 2013;22(2):153-167)]에 상세히 기재되어 있다. 일반적으로, 링커는 기능에 영향을 주지 않도록 설계된다. 특히, 링커는 표적에 특이적으로 결합하지 않는다. 링커는 임의의 아미노산을 포함할 수 있으며, 아미노산 글리신(G) 및 세린(S)이 바람직할 수 있다. 바람직하게는, 링커는 아미노산 글리신(G) 및 세린(S)( "GS- 링커")으로 구성된다. 두 개 이상의 링커가 하나의 폴리펩티드 또는 단백질에서 발생하는 경우, 그 링커는 서로 같거나 다를 수 있다. 또한, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산의 길이를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산 또는 핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일 가닥(ss) 또는 이중 가닥(ds)일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며 이러한 모든 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"라는 단어는 1차 대상 세포 및 전달 횟수에 관계없이 그 대상 세포로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 모든 자손은 고의적이거나 우연한 돌연변이로 인해 DNA 함량이 정확히 동일하지 않을수 있는 것으로 이해된다. 본래의 형질전환된 세포에서 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이 자손이 포함된다. 별개의 용어가 의도되는 경우, 그 문맥으로부터 명확할 것이다.
본원에서 사용되는 "서열 변이체"("변이체"라고도 함)는 참조 서열의 임의의 변경을 의미하며, 참조 서열은 "서열 및 서열 번호 표"(서열 목록)에 나열된 서열, 즉 서열번호 1 내지 서열번호 115 중 임의의 하나이다. 따라서, 용어 "서열 변이체"는 뉴클레오티드 서열 변이체 및 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 주목할 점은, 본원에서 언급되는 서열 변이체는 특히 기능적 서열 변이체, 즉 참조 서열의 생물학적 기능을 유지하는 서열 변이체이다. 예를 들어, 관심있는 (폴리)펩티드(예를 들어, 결합 기능을 가짐)의 인트론 서열(예를 들어, 스플라이싱 부위 기능 및/또는 스플라이싱 인핸서 기능을 가짐)의 기능이 유지될 수 있다. 따라서, 바람직한 서열 변이체는 참조 서열에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 88% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열 변이체이다. 본원에서 사용되는 구문 "70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 88% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 적98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 서열 변이체"은 서열 동일성 %가 높을수록 서열 변이체가 더욱 바람직하다는 것을 의미한다. 즉, 구문 "70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 88% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 적98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 서열 변이체"은 특히, 서열 변이체가 각각의 참조 서열에 대하여 적어도 70% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 75% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 80% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 88% 서열 동일성, 더욱더 바람직하게는 적어도 적어도 90% 서열 동일성, 더욱더 바람직하게는 적어도 92% 서열 동일성, 더욱더 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성, 더욱더 바람직하게는 적어도 96% 서열 동일성, 특히 바람직하게는 적어도 97% 서열 동일성, 특히 바람직하게는 적어도 98% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 것을 의미한다.
서열 동일성은 일반적으로 참조 서열의 전체 길이(즉, 출원서에 언급된 서열)와 관련하여 계산된다. 본원에서 언급되는 백분율 동일성은 예를 들어 NCBI(National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 의해 지정된 기본 매개변수(default parameter)를 이용한 BLAST를 사용하여 결정될 수 있다[Blosum 62 매트릭스; 갭 오픈 페널티 = 11 및 갭 연장 페널티 = 1].
본원에서 사용되는 "뉴클레오티드 서열 변이체"는 참조 서열 내의 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실 또는 치환되거나, 하나 이상의 뉴클레오티드가 참조 뉴클레오티드 서열의 서열에 삽입되어 있는 변경된 서열을 갖는다. 뉴클레오티드는 본원에서 표준의 한 문자 명칭(A, C, G 또는 T)으로 나타낸다. 유전 암호의 축퇴성으로 인해, "뉴클레오티드 서열 변이체"는 각각의 참조 아미노산 서열의 변화, 즉 "아미노산 서열 변이체"를 초래할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 바람직한 서열 변이는 아미노산 서열 변이(침묵 돌연변이)를 일으키지 않는 뉴클레오티드 서열 변이이지만, 다른 비-침묵 돌연변이, 특히 참조 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일할 수 있는 아미노산 서열을 초래하는 돌연변이 뉴클레오티드 서열도 그 범위 내에 있다.
"아미노산 서열 변이체"는 참조 서열의 하나 이상의 아미노산이 결실 또는 치환되거나, 하나 이상의 아미노산이 참조 아미노산 서열의 서열에 삽입되어 있는 변경된 서열을 갖는다. 변경의 결과로, 아미노산 서열 변이체는 참조 서열과 80% 이상 동일하고, 바람직하게는 90% 이상 동일하고, 더 바람직하게는 95% 이상 동일하고, 가장 바람직하게는 99% 이상 동린한 아미노산 서열을 갖는다. 90% 이상 동일한 변이체 서열은 참조 서열의 100개 아미노산 당 10개 이하의 변경, 즉 결실, 삽입 또는 치환의 임의의 조합을 갖는다.
비보존적 아미노산 치환을 갖는 것이 가능하지만, 치환은 보존적 아미노산 치환인 것이 바람직하며, 여기서 치환된 아미노산은 참조 서열의 상응하는 아미노산과 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 하나의 지방족 또는 소수성 아미노산, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신의 또 다른 것으로의 치환; 하나의 히독록시 함유 아미노산, 예를 들어, 세린 및 트레오닌의 또 다른 것으로의 치환; 하나의 산성 잔기, 예를 들어, 글루탐산 또는 아스파르트 산의 또 다른 것으로의 치환; 하나의 아미드 함유 잔기, 예를 들어, 아스파라긴및 글루타민의 또 다른 것으로의 치환; 하나의 방향족 잔기, 예를 들어, 페닐알라닌 및 티로신의 또 다른 것으로의 치환; 하나의 염기성 잔기, 예를 들어, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘의 또 다른 것으로의 치환; 및 하나의 작은 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌 및 글리신의 또 다른 것으로의 치환을 포함한다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 하나의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드의 범위인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합 뿐만 아니라, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 리포터 분자 또는 효소에 대한 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에의 융합이 있다.
중요하게도, 서열 변이체의 변경은 각각의 참조 서열의 기능을 폐지하지 않으며, 본 발명의 경우에는 예를 들어, 항체 또는 항체 단편의 서열이 이의 항원에 결합하는 기능 및/또는 예를 들어 (독립적인) 결합 부위의 표적에 결합하는, 기능적 도메인에 의해 제공되는 추가의 기능을 폐지하지 않는다. 이러한 기능을 폐지하지 않고 각각 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는 뉴클레오티드 및 아미노산 잔기를 결정하는 지침은 당업계에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 확인된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 지정된 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 "유래된" 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 그 핵산 서열, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 기원을 의미한다. 바람직하게는, 특정 서열로부터 유래되는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 그 서열 또는 이의 일부와 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지며, 이때 "본질적으로 동일한"은 위에서 정의된 서열 변이체를 포함한다. 바람직하게는, 특정 펩티드 또는 단백질로부터 유래되는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 그 특정 펩티드 또는 단백질의 해당하는 도메인으로부터 유래된다. 여기서, "해당하는"은 특히 동일한 기능을 의미한다. 예를 들어, "세포외 도메인"은 또 다른 "세포외 도메인"(또 다른 단백질의)에 해당하거나, "막관통 도메인"은 또 다른 "막관통 도메인"(또 다른 단백질의)에 해당한다. 따라서, 펩티드, 단백질 및 핵산의 "해당하는" 부분은 당업자에게 쉽게 확인될 수 있다. 마찬가지로, 다른 서열로부터 "유래된" 서열은 일반적으로 그 서열에서 그의 기원을 갖는 것으로 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다.
바람직하게는, 또 다른 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유래 된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 그 출발 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질(그것이 유래되는)과 동일할 수 있다. 그러나, 또 다른 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유래된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 또한, 그 출발 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질(그것이 유래되는)에 대해 하나 이상의 돌연변이를 가질 수도 있다. 특히, 또 다른 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유래된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 그 출발 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질(그것이 유래되는)의 상기 기재된 바와 같은 기능적 서열 변이체일 수 있다. 예를 들어, 펩티드/단백질에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있거나 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입 또는 결실될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "돌연변이"는 참조 서열, 예를 들어, 해당하는 게놈 서열과 비교하여 핵산 서열 및/또는 아미노산 서열의 변화와 관련이 있다. 돌연변이(예를 들어, 게놈 서열과 비교하여)는 예를 들어 (자연 발생) 체세포 돌연변이, 자발적 돌연변이, 유도된 돌연변이(예를 들어. 효소, 화학 물질 또는 방사선에 의해 유도됨), 또는 부위 지정 돌연변이유발(핵산 서열 및/또는 아미노산 서열에서 특정적이고 의도적인 변화를 만드는 분자 생물학 방법)에 의해 얻은 돌연변이일 수 있다. 따라서, 용어 "돌연변이" 또는 "변이"는 예를 들어 핵산 서열 또는 아미노산 서열에서 물리적으로 돌연변이를 만드는 것도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이는 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 치환, 결실 및 삽입뿐만 아니라 여러 (2개 이상의) 연속적인 뉴클레오티드 또는 아미노산의 역위를 포함한다.
아미노산 서열의 돌연변이를 달성하기 위해, 바람직하게는 (재조합) 돌연변이된 폴리펩티드를 발현하기 위해 상기 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 돌연변이가 도입될 수 있다. 돌연변이는 예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발에 의해, 하나의 아미노산을 암호화하는 핵산 분자의 코돈을 변경하여 다른 아미노산을 암호화하는 코돈을 생성함으로써 달성될 수 있거나, 예를 들어 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 확인하고 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오티드를 돌연변이시킬 필요없이 폴리펩티드의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 합성을 설계하여 서열 변이체를 합성함으로써 달성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "상류" 및 "하류"는 둘 모두 DNA 또는 RNA에서의 상대적 위치를 의미한다. DNA 또는 RNA의 각각의 가닥은 5 '말단 및 3'말단(데옥시리보스 또는 리보스 고리 상의 탄소 위치에 대하여 명명됨)을 갖는다. 관례상, 상류 및 하류는 RNA 전사가 일어나는 5' 에서 3' 방향과 관련이 있다. 상류는 RNA 분자의 5' 말단을 향하고 하류는 3' 말단을 향한다. 이중 가닥 DNA에서, 상류는 관심있는 엑손에 대한 코딩 가닥의 5' 말단을 향하고 하류는 3'말단을 향한다. DNA의 역병렬 특성으로 인해, 이는 주형 가닥의 3' 말단이 유전자의 상류에 있고 5' 말단이 하류에 있음을 의미한다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 용어 "질병"은 용어 "장애" 및 "상태"(의학적 상태)와 일반적으로 동의어인 것으로 의도되고 그와 상호교환적으로 사용되는데, 그 용어들은 모두, 일반적으로 정상적인 기능을 손상시키고, 일반적으로 징후와 증상을 구별하여 나타나며 일반적으로 인간 또는 동물의 삶의 질이 감소되도록 하는 상태로서, 인간 또는 동물 신체 또는 이의 부분 중 하나의 비정상/병리적 상태를 반영하기 때문이다.
본 명세서의 텍스트 전체에서 여러 문헌이 인용된다. 본원의 위 및 아래에서 인용된 문헌(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체의 사양, 지침 등을 포함)은 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본 명세서의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명으로 인해 그러한 개시를 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약이 다양할 수 있으므로 이에 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 것이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해하여야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
림프구의 게놈 편집 방법
제1 측면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 분리된 B 림프구의 게놈을 편집하는 방법을 제공한다:
(i) B 림프구의 내인성 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소를 활성화하는 단계; 및
(ii) 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 B 림프구에 도입하는 단계.
"게놈 편집"은 관심있는 (자연 발생) 유전자 또는 유전자좌(gene locus)를 삽입, 결실 또는 변경하는 것을 의미하며, 특히 특이성 및/또는 기능이 변경된 B 세포를 생성하는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해, 조작된 B 림프구가 얻어질 수 있으며, 여기서 B 림프구의 게놈은 관심있는 (폴리)펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 편집되는 관심있는 유전자 좌는 면역글로불린 유전자 좌, 즉 면역글로불린 (항체) 폴리펩티드 사슬을 암호화하는 유전자 좌이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 재조합 (맞춤형) 항체를 생산 (및 분비)하기 위해 조작된 B 세포(면역글로불린 유전자 좌가 편집되어 있는)를 제공한다. 따라서, 본 발명은 바람직하게는 본원에 기재된 단계를 포함하는 분리된 B 세포의 게놈에서 면역글로불린 유전자 좌를 편집하는 방법을 제공한다.
용어 "B 림프구" 및 "B 세포"는 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로 "B 림프구"는 림프구 아형의 백혈구의 유형이다. B 림프구의 주요 기능은 항체를 분비하는 것이다. 따라서, B 림프구는 적응 면역 체계의 체액 성분에 속한다. 또한, B 림프구는 항원을 제시하고 사이토카인을 분비할 수 있다. 다른 두 부류의 림프구인 T 세포 및 자연 살해 세포와 달리, B 림프구는 이의 세포막에서 B 세포 수용체(BCR)를 발현한다. BCR은 B 세포가 특정 항원에 결합하도록 하여 그 항원에 대한 항체 반응을 개시한다.
일반적으로, B 림프구는 임의의 종일 수 있다. 몇몇 구체예에서, B 림프구는 포유류 B 림프구이다. 바람직하게는, B 림프구는 인간 B 림프구이다. 따라서, 몇몇 구체예에서, B 림프구는 닭 B 림프구 또는 뮤린 B 림프구가 아니다. 특히, B 림프구의 IgL 유전자 좌는 결실되지 않는 것이 바람직하다.
일반적으로, 용어 "분리된" B 림프구는 인체 또는 동물 신체의 일부가 아닌 B 림프구를 의미한다. 특히, 분리된 B 림프구는 일차 B 림프구 또는 B 세포주의 (B 림프구)일 수 있다
세포주는 일반적으로, 특히 종양 또는 인공 불멸화, 예를 들어, Epstein-Barr 바이러스(EBV)-불멸화로 인해 연속적이다(즉, 무한 증식할 수 있다). B 세포주는 예를 들어 Ramos(ATCC®-CRL-1596) 또는 SKW 6.4(ATCC®TIB-125)로서 상업적으로 입수가능하다. 특히, B 세포주의 B 림프구는 이의 내인성 활성화 유도 시티딘 탈아미노효소(AID)가 활성화 될 수 있는 능력을 갖는다. 대안적으로, B 세포주의 B 림프구는 RAMOS B 세포주(예를 들어, Ramos RA1(ATCC®-CRL-1596))와 같은 내인성 활성화 유도 시티딘 탈아미노효소(AID)의 구성적 활성을 가질 수 있다.
가장 바람직하게는 분리된 B 림프구는 일차 B 림프구이다. "일차" B 림프구는 살아있는 조직에서 분리되고 시험관 내 배양을 위해 확립된다. 연속적인(종양 또는 인위적으로 불멸화된) 세포주와 달리, "일차" 세포는 "신선하게" 분리된다. 즉, 시험관 내에서 세포 분열을 거의 받지 않는다. 일반적으로, 일차 세포는 수명이 한정되어 있다. 즉, 세포주처럼 "불멸화"되지 않는다. 특히, 일차 세포는 어떠한 방식으로도 변형되지 않았다(그의 기원 조직에서 세포를 추출하는데 필요한 효소 및/또는 물리적 해리 제외).
일차 B 세포는 혈액 또는 골수, 흉선, 비장 및/또는 림프절과 같은 림프 조직에서 분리될 수 있다. 일반적으로, B 세포는 대상체의 (분리된) 샘플에서 분리된다. 샘플은 예를 들어 골수, 흉선, 비장 및/또는 림프절과 같은 혈액 또는 림프 조직이다. 예를 들어, B 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 골수 또는 비장에서 분리된다.
일차 B 림프구를 분리하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, B 세포는 유세포 분석, 자기 세포 분리 및 세포 분리(MACS), RosetteSep 또는 항체 패닝에 의해 분리될 수 있다. 충분한 순도, 생존률 및 수율을 갖는 분리된 B 림프구를 제공하기 위해 하나 이상의 분리 기법이 이용될 수 있다. 바람직하게는, 일차 B 세포는 MACS 또는 RosetteSep에 의해 분리된다. 예를 들어, B 세포는 특히 자기 세포 분류(magnetic cell sorting)에 의해 말초 혈액 단핵세포(PBMC)로부터 분리될 수 있다. 이를 위해, 예를 들어 Miltenyi Biotec사로부터 입수할 수 있는 항-CD19 마이크로 비드가 사용될 수 있다.
바람직하게는, 분리된 (일차) B 림프구의 순도는 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상이다. 또한, 분리된 (일차) B 세포는 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 생존률을 갖는 것이 바람직하다. 선택적으로, 분리 후, 일차 B 림프구는 배양시에 확장될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 일차 B 림프구는 환자(a의 분리된 샘플)로부터 분리된다. 조작 후, B 세포는 동일한 환자(이로부터 그 세포 또는 그의 전구 세포가 분리된)에게 투여 될 수 있다. 이러한 B 세포는 "자가(autologous)" B 세포로 지칭될 수 있다. 이러한 방식으로, 환자는 생체내에서(자신에 의해) 맞춤형 항체를 생산할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 맞춤형 항체의 시험관내 생산을 위해 (불멸화된) B 세포주를 제작하기 위해 조작된 B 세포를 사용할 수 있다.
분리된 B 림프구의 게놈 편집의 첫 번째 단계에서, B 림프구의 내인성 활성화 유도 시티딘 탈아미노효소가 활성화된다. B 림프구의 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소를 활성화하는 다양한 방법이 당업계에 알려져 있고 본원에서 보다 상세히 설명된다. 이에 따라, 게놈 DNA, 특히 면역글로불린 유전자 좌의 스위치 영역에서 이중 가닥 절단(DSB)이 유도된다. 일반적으로, 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소( "AID"또는 "AICDA"라고도 함)는 시토신 염기의 탈아미노화에 의해 DNA의 돌연변이를 생성하여 시토신을 우라실로 바꾸는 효소이다. AID는 체세포 초돌연변이(SHM), 클래스 스위치 재조합(CSR) 및 유전자 전환(GC)을 매개하기 때문에 2차 항체 다양 화의 "마스터 조절인자"로 간주된다. 특히, AID는 CSR의 면역글로불린 유전자 좌에서 스위치 영역("S 영역"이라고도 함)의 DNA 절단을 매개한다. 스위치 영역은 특히 CH 유전자 부분의 상류에 위치한 면역글로불린 유전자 좌 내의 반복적인 DNA 서열의 영역이다.
CSR은 각각의 CH 유전자 부분의 상류에 위치한 두 개의 스위치 영역 사이에서 발생하여 중간 DNA("스위치 서클")를 절단하고 가변 영역을 하류 CH 유전자 부분과 나란히 배치한다. AID는 시토신의 탈아미노화에 영향을 미쳐서 dU를 생성하고, 이 dU는 우라실-N-글리코실라아제(UNG) 및 아피리미디닉 엔도뉴클레아제(APE1)의 결합 작용에 의해 제거되어 단일 가닥 DNA 절단(SSB)을 유발한다. SSB가 대향한 DNA 가닥에서 가까이 있으면, 이중 가닥 절단(DSB)이 형성된다. 또한, DSB는 "말단 처리(end processing)"에 의한 불일치 복구(MMR) 경로의 작용을 통해 형성될 수 있다. 두 스위치 영역에서 DSB가 형성된 후. DNA의 나머지 "말단"이 결합되고 고전적인 비상동 말단 결합(C-NHEJ) 또는 대체 말단 결합(A-EJ) 경로를 통해 재조합이 발생한다.
용어 "내인성"은 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소가 B 림프구 내로부터 유래함을 의미한다. 특히, 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소는 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소를 암호화하는 내인성 유전자를 기반으로 발현된다(즉, B 세포에 도입 된 작제물에 의해 발현되지 않음). 따라서, 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소는 B 림프구에 의해 발현된다. 따라서, (외인성) 뉴클레아제(또는 이러한 뉴클레아제를 암호화하거나 발현하는 핵산, 벡터 또는 바이러스)를 B 세포에 도입할 필요가 없다. 오히려, 게놈 DNA의 절단은 본 발명에 따라서만 활성화되는 B 세포 자체의 기작에 의해 수행된다. 특히, 본 발명의 방법은 일반적으로, 뉴클레아제(또는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 또는 뉴클레아제의 암호화 및/또는 발현을 위한 다른 외인성 수단)를 B 세포에 도입하는 것을 포함하지 않는다.
B 림프구의 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소의 활성화 후, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자가 본 발명에 따른 방법의 추가 단계(단계 (ii))에서 B 세포에 도입된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법의 단계 (ii)는 일반적으로 단계 (i) 이후에 수행된다. 특히, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자가 B 세포에 도입되기 전에 B 세포의 내인성 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소가 활성화된다.
따라서, B 림프구는 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자로 형질감염된다. 일반적으로, 용어 "형질감염"은 DNA 또는 RNA 분자와 같은 핵산 분자를 세포, 바람직하게는 진핵 세포에 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "형질감염"은 DNA 분자를 B 림프구에 도입하기 위한 당업자에게 알려진 임의의 방법을 포함한다. 이러한 방법은 예를 들어 바이러스 및 비바이러스 형질감염 방법을 포함한다. 유전자 전달에 사용될 수 있는 바이러스에는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 단순 포진 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-부속 바이러스(AAV)가 포함된다. 그러나, 몇몇의 구체예에서, B 림프구는 레트로바이러스로서 형질도입되지 않는다. 또한, 형질감염을 위해 나노입자가 사용될 수도 있다. 추가의 비바이러스 형질감염 방법에는 많은 화학적 및 물리적 방법이 포함된다. 화학적 형질감염 방법에는, 예를 들어 양이온성 지질 및/또는 리포솜에 기반한 리포펙션, 칼슘 포스페이트 침전, 또는 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민(PEI) 등과 같은 양이온성 중합체에 기반한 형질감염이 있다. 물리적 형질감염 방법에는 전기천공, 탄도 유전자 전달(DNA가 코팅된 입자를 세포에 도입), 미세 주입(미세모세관을 통해 세포내에 DNA를 전달) 및 뉴클레오펙션(nucleofection)이 포함된다. 바람직하게는, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 B 림프구에 도입하는 것은 비바이러스성이다. 가장 바람직하게는 DNA는 뉴클레오펙션에 의해 도입된다.
관심있는 (폴리) 펩티드는 맞춤형 항체(의 일부)로 발현되는 것으로 예상되는 임의의 (폴리)펩티드 일 수 있다. 관심있는 바람직한 (폴리)펩티드는 본 명세서에서 아래에 보다 상세하게 설명된다.
본 발명에 따른 분리된 B 림프구의 게놈을 편집하는 방법은 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 본 발명자들은 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자의 B 세포 게놈, 특히 B 림프구의 면역글로불린 유전자 좌의 스위치 영역에의 통합은 상동성 재조합(HR), 비상동성 말단 결합(c-NHEJ) 또는 대체 말단 결합(A-EJ) 경로와 같은 자연적인 기작에 의해 발생하는 것으로 판단한다. 즉, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 B 림프구에 도입(형질감염)된 후, B 림프구의 내인성 복구 기작은 상동성 재조합(HR), 비상동성 말단 결합(NHEJ) 및/또는 대체 말단 결합(A-EJ)과 같은 자연적 과정에 의해, 유도된 절단(들)을 후속 적으로 복구함으로써, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 B 림프구의 게놈에 통합한다. c-NHEJ 및 A-EJ 경로에서, DNA 절단은 Mre11/ Rad50/Nbs1(MRN) 및 모세혈관확장성 운동실조 돌연변이(ATM) 복합체에 의해 검출된다. c-NHEJ Ku 단백질에서, Ku70 및 Ku80 이종이량체 및 DNA-의존성 단백질 키나아제(DNAPK)는 비상동성 DNA 말단을 함께 유지하는 스캐폴드를 형성하여, DNA 말단을 수정하고 DNA 리가아제 IV를 동원하여 DNA 말단에 다시 결합시킨다. 이와 대조적으로, A-EJ는 Ku 및 DNA 리가제 IV와 독립적으로 발생하고, 아마도 DNA 리가제 I 또는 III를 통한 DNA 말단 처리 및 결찰에 필요한 추가 인자에 대한 스캐폴드로서 PARP 및/또는 CtIP를 이용한다.
요약하면, 외인성 (조작된) 뉴클레아제의 투여에 의존하는, B 세포를 조작하기 위한 종래 기술의 방법과 비교하여, 본 발명에 따른 B 림프구의 게놈을 편집하는 방법은 원하지 않는 비표적 돌연변이의 위험을 저하시킨다. 특히, 본 발명에 따른 방법에서, B 림프구의 게놈 편집은 i) 분리 및 B 세포 자극 후 1 일 이내에 수행될 수 있고, ii) Cas9와 같은 조작된 뉴클레아제의 추가없이 수행된다.
특히, 본 발명에 따른 방법은 외인성 뉴클레아제를 포함하지 않는다. 즉, 본 발명에 따른 방법에서는 특히 외인성 뉴클레아제의 존재가 필요하지 않다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 외인성 뉴클레아제 자체나 외인성 뉴클레아제를 암호화하는 핵산이 B 림프구에 도입되지 않는 것이 바람직하다. 일반적으로, 뉴클레아제는 핵산 단량체 사이의 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 효소이다. 외인성 뉴 클레아제는 B 림프구내에서 유래하지 않는 뉴클레아제, 특히 B 세포에 의해 발현되지 않는 뉴클레아제이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 CRISPR 뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제를 포함/이용하지 않는다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 인공적으로 조작된 뉴클레아제를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 이러한 조작된 뉴클레아제는 종종 "분자 가위"라고 나타내어지고, 이에는 조작된 메가뉴클레아제(예를 들어, 조작된 메가뉴클레아제 재조작 호밍(homing) 엔도뉴클레아제), 전사 활성화제 유사 뉴클레아제(TALEN), 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN) 및 RNA-유도 뉴클레아제, 예컨대 CRISPR(규칙적으로 간격을 둔 짧은 회귀 반복체) 뉴클레아제, 예를 들어 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9), Cpf1 뉴클레아제, Cmr 뉴클레아제, Csf 뉴클레아제, Csm 뉴클레아제, Csn 뉴클레아제, Csy 뉴클레아제, C2cl 뉴클레아제, C2c3 뉴클레아제, 또는 C2c3 뉴클레아제가 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 CRISPR 뉴클레아제, 징크 핑거 뉴 클레아제, 전사 활성화제-유사 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제와 같은 조작된 뉴 클레아제를 포함/이용하지 않는다.
메가뉴클레아제는 12개 내지 40개 염기쌍의 큰 인식 부위를 특징으로 하는 엔도뉴클레아제이다. 조작된 메가뉴클레아제는 종종 호밍 엔도뉴클레아제에서 유대된다. 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN)는 징크 핑거 DNA-결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합하여 생성되는 인공 제한 효소이고, 여기서 징크 핑거 도메인은 특정의 원하는 DNA 서열을 표적하도록 조작되어 아연-핑거 뉴클레아제가 복잡한 게놈 내의 고유한 서열을 표적화할 수 있도록 한다. 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)는 TAL 이펙터 DNA-결합 도메인을, 특정 DNA 서열을 절단하도록 조작될 수 있는 DNA 절단 도메인에 융합하여 만든 제한 효소이다. CRISPR은 원핵 생물을 공격한 바이러스의 DNA 조각을 포함하는 박테리아 및 고세균의 DNA 서열 군으로, 후속 공격 동안에 유사한 바이러스의 DNA를 검출하고 파괴하기 위해 원핵 생물에 의해 사용된다. CRISPR 서열에서 스페이서 서열을 포함하는 RNA는 CRISPR 뉴클레아제가 외인성 DNA를 인식하고 절단하는데 도움을 준다. 유전자 편집을 위해, 일반적으로 CRISPR 뉴클레아제, 예를 들어 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9), Cpf1 뉴클레아제, Cmr 뉴클레아제, Csf 뉴클레아제, Csm 뉴클레아제, Csn 뉴클레아제, Csy 뉴클레아제, C2cl 뉴클레아제, C2c3 뉴클레아제 또는 C2c3 뉴클레아제가 가이드 RNA와 함께 세포에 도입되어 원하는 위치에서 세포의 게놈을 절단한다.
또한, 본 발명의 방법은 바람직하게는 B 림프구에 가이드 핵산(가이드 RNA 또는 가이드 DNA)을 도입하지 않는다. 가이드 RNA를 사용하는 상기 언급된 CRISPR/Cas 시스템 외에도, 가이드 핵산을 사용하는 다른 게놈 편집 방법, 예를 들어 5' 인산화된 짧은 단일 사슬 핵산(RNA 또는 DNA)를 표적을 절단하는 가이드로서 이용하는 아르고노트(argonaute; Ago) 뉴클레아제에 기반한 방법이 당업계에 알려져 있다. 그러나, 본 발명에 따른 방법은 스위치 영역을 자연적으로 표적하는 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소(AID)를 사용하므로, 가이드 핵산이 필요하지 않으며, 특히 가이드 핵산이 관여하지 않는다.
선택적으로, 본 발명에 따른 방법은
(iii) 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 B 림프구의 게놈내로의 통합을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
특히, 이러한 단계 (iii)는 위에서 설명한 단계 (i) 및 (ii) 이후에 수행된다. 단계 (iii)은, 예를 들어 서열분석(B 림프구로부터의 게놈 DNA와 같은 핵산)에 의해 수행될 수 있고/있거나 조작된 B 림프구에 의해 생성된 B 세포 수용체 또는 항체가 관심있는 (폴리펩티드)를 포함하는지 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 관심있는 (폴리) 펩티드가 특이적 결합 부위인 경우, 조작된 B 림프구에 의해 생성된 항체의 특이적 결합 파트너에의 결합이 평가될 수 있다. 예를 들어, 관심있는 통합된 (폴리)펩티드가 B 세포에 의해 내생적으로 발현되는 표면 분자의 일부가 아닌 경우, 항체에 관심있는 (폴리)펩티드의 성공적인 통합은 형광 표지된 항체를 이용한 세포 표면 염색 및 유세포 분석에 의해서 평가될 수도 있다. 또한, 관심의 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 B 림프구 게놈에의 통합은 PCR 증폭 및/또는 스위치-μ를 포함하는 면역글로불린 스위치 영역의 (후속) 서열분석, 및 선택적으로는 모든 알파 및 감마 동형의 해당 영역의 서열분석을 통해 확인될 수 있다.
관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자
단계 (ii)에서 B 림프구에 도입된 DNA 분자는 임의의 형태, 예를 들어, 원형(예를 들어, 플라스미드) 또는 선형 DNA 분자의 형태일 수 있다. 예를 들어, 원형 DNA 분자(플라스미드)가 단계 (ii)에서 도입되는 경우, 이는 내인성 DNase에 대한 하나 이상의 제한 부위를 포함할 수 있으므로, 플라스미드가 게놈에의 통합을 위해 절단될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법의 단계 (ii)에서 B 림프구에 도입된 DNA 분자는 선형 또는 선형화된 DNA 분자이다. 예를 들어, DNA 분자는 플라스미드(또는 플라스미드의 구성 요소)로 제조될 수 있으며, 이는 B 림프구(선형화된 DNA 분자)에 도입되기 전에 절단된다(관심있는 (폴리)펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록).
또한, 단계 (ii)에서 B 림프구에 도입된 DNA 분자는 단일 가닥 DNA 분자(ssDNA) 또는 이중 가닥 DNA 분자(dsDNA)일 수 있다. 실시예 1에 나타난 바와 같이, ssDNA와 dsDNA는 모두 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있다. 바람직하게는, DNA 분자는 dsDNA 분자이다.
또한, 단계 (ii)에서 B 림프구에 도입된 이중 가닥 DNA 분자는 블런트 말단(blunt end), 5' 및/또는 3' 오버행, 또는 풀린 말단(frayed end)을 가질 수 있다. "블런트 말단"은 이중 가닥 DNA 분자의 가장 단순한 말단으로, DNA 분자의 두 가닥 모두 상보적인 염기(각각 아데닌 : 티미딘(A : T) 및 사이토신 : 구아닌(C : G))의 염기쌍에서 종결된다. 즉, 블런트 말단에서 첫 번째 가닥의 각각의 뉴클레오티드는 다른 가닥의 상보적 뉴클레오티드와 쌍을 이룬다(염기 쌍을 형성). 이와 대조로, "오버행"은 dsDNA 분자의 말단에 있는 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 스트레치(stretch)이다. 이러한 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드는 3' 또는 5' 오버행을 생성하는 두 가닥 중 하나에 있을 수 있다. 적어도 2개의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 오버행은 "점착 말단(sticky end)"또는 "돌출 말단(cohesive end)"이라고도 한다. 따라서, 점착 또는 돌출 말단은 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드(오버행이라고 함)를 갖는 돌출된 단일 가닥을 갖는 반면, 블런트 말단에는 돌출 가닥이 없다. 마지막으로, "풀린 말단"은 (비상보적 "염기쌍"에서) 상당한 비율의 비상보적 서열을 갖는 말단 근처의 dsDNA 분자 영역을 의미한다. 그러나, 잘못 일치하는 뉴클레오티드는 결합을 피하는 경향이 있으므로, 풀린 로프(rope) 조각의 가닥과 유사하게 나타난다.
바람직하게는, DNA 분자는 점착 말단 또는 블런트 말단을 갖는다. 가장 바람직하게는, DNA 분자는 블런트 말단을 갖는다.
또한, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 DNA 분자 또는 그 DNA 분자의 적어도 뉴클레오티드 서열이 코돈-최적화되는 것이 바람직하다. 특히, 인간 기원이 아닌 관심의 (폴리)펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 바람직하게 코돈-최적화된다. 일반적으로, 코돈 최적화는 인간 세포에서 재조합 단백질의 번역 및 발현을 향상시킬 수 있다. 코돈 최적화를위한 다양한 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, JCat(Grote A, Hiller K, Scheer M, Munch R, Nortemann B, Hempel DC, Jahn D. JCat: a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host. Nucleic Acids Res. 2005 Jul 1;33(Web Server issue):W526-31), 합성 유전자 디자이너(Wu G, Bashir-Bello N, Freeland SJ. The Synthetic Gene Designer: a flexible web platform to explore sequence manipulation for heterologous expression. Protein Expr Purif. 2006 Jun;47(2):441-5) 및 OPTIMIZER(Puigbo P, Guzman E, Romeu A, Garcia-Vallve S. OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res. 2007 Jul;35(Web Server issue):W126-31)와 같은 계산 도구가 사용될 수 있는데, 이들 도구는 숙주의 코돈 적응 지수(CAI) 또는 개별 코돈 사용(ICU) 측면에서 코딩 서열의 코돈 사용 빈도를 정량화하고 최적화하기 위해 개발되었다. 또한, 예를 들어 다음문헌[Chung BK, Yusufi FN, Mariati, Yang Y, Lee DY. Enhanced expression of codon optimized interferon gamma in CHO cells. J Biotechnol. 2013 Sep 10;167(3):326-33; Hatfield GW, Roth DA. Optimizing scaleup yield for protein production: Computationally Optimized DNA Assembly (CODA) and Translation Engineering. Biotechnol Annu Rev. 2007;13:27-42; and/or Moura GR, Pinheiro M, Freitas A, Oliveira JL, Frommlet JC, Carreto L, Soares AR, Bezerra AR, Santos MA. Species-specific codon context rules unveil non-neutrality effects of synonymous mutations. PLoS One. 2011;6(10):e26817]에 기재된 바와 같이 예를 들어 이종 유전자 발현을 개선하기 위해 코돈 컨텍스트(CC)라고도 알려져 있는 코돈 페어링(codon pairing)의 최적화가 사용될 수 있다. 또한, 숨은 종결 코돈(HSC) 수를 최대화하여 유전자 발현을 증가시킬 수 있는데, 이는 숨은 종결 코돈의 존재가 오프-프레임 판독도 방지하기 때문이다. 코돈 최적화를 위한 특히 바람직한 도구로는 COOL(URL: http://cool.syncti.org/; Ju Xin Chin, Bevan Kai-Sheng Chung, Dong-Yup Lee; Codon Optimization OnLine (COOL): a web-based multi-objective optimization platform for synthetic gene design, Bioinformatics, Volume 30, Issue 15, 1 August 2014, Pages 2210-2212); "OptimumGeneTM-Codon Optimization"(GenScript; US 2011/0081708 A1에 기재되어 있음) 및 "Codon Optimization Tool"(IDT® Integrated DNA Technologies; URL: http://eu.idtdna.com/CodonOpt)이 있다.
대안적으로, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 DNA 분자 또는 DNA 분자의 적어도 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화되지 않는 것이 바람직하다. 특히, 관심있는 (폴리)펩티드가 인간 (폴리)펩티드이거나 인간 (폴리)펩티드로부터 유래되는 경우, DNA 분자 또는 상기 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화되지 않는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자는 (관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 외에도) 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 상류 및/또는 하류에서 인트론 서열을 추가로 포함한다. 더욱 바람직하게는, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자는 (관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 외에도) (i) 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 상류에서 인트론 서열 및 (ii) 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 하류에서 인트론 서열을 추가로 포함한다. 특히, 용어 "인트론 서열"은 비코딩(non-coding) 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
바람직하게는, 인트론 서열은 적어도 5개 뉴클레오티드(dsDNA: 염기쌍; bp), 바람직하게는 적어도 10개 뉴클레오티드 (dsDNA에서: 염기쌍; bp), 더 바람직하게는 적어도 15개 뉴클레오티드 (dsDNA에서: 염기쌍; bp), 더욱더 바람직하게는 적어도 20개 뉴클레오티드(dsDNA에서: 염기쌍; bp), 가장 바람직하게는 적어도 25개 뉴클레오티드(dsDNA에서: 염기쌍; bp)의 길이를 갖는다. 또한, 인트론 서열은 적어도 50개 뉴클레오티드(dsDNA에서: 염기쌍; bp), 바람직하게는 적어도 75 또는 100개 뉴클레오티드(dsDNA에서: 염기쌍; bp), 더 바람직하게는 적어도 150 또는 200개 뉴클레오티드(dsDNA에서: 염기쌍; bp), 더욱더 바람직하게는 적어도 300 또는 400개 뉴클레오티드(dsDNA에서: 염기쌍; bp), 더욱더 바람직하게는 적어도 500개 뉴클레오티드(dsDNA에서: 염기쌍; bp), 가장 바람직하게는 적어도 600개 뉴클레오티드(dsDNA에서: 염기쌍; bp)의 길이를 갖는 것이 바람직하다.
또한, 인트론 서열은 3000개 이하의 뉴클레오티드, 바람직하게는 2500개 이하의 뉴클레오티드(dsDNA에서: 염기쌍; bp), 더 바람직하게는 2000개 이하의 뉴클레오티드(dsDNA에서: 염기쌍; bp), 더욱더 바람직하게는(특히 DNA 분자가 2개의 인트론 서열을 포함하는 경우) 1500 개 이하의 뉴클레오티드(dsDNA에서: 염기쌍; bp), 더욱더 바람직하게는(특히 DNA 분자가 2개의 인트론 서열을 포함하는 경우) 1250개 이하의 뉴클레오티드(dsDNA에서: 염기쌍; bp), 가장 바람직하게는(특히 DNA 분자가 2개의 인트론 서열을 포함하는 경우) 1000개 이하의 뉴클레오티드(dsDNA에서: 염기 쌍; bp)를 갖는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 인트론 서열은 스플라이스 인식 부위를 포함한다. "스플 라이스 인식 부위"("스플라이스 부위"라고도 함)는 스플라이소솜에 의해 특이적으로 인식되고 스플라이싱되는 뉴클레오티드 서열이다. 따라서, 스플라이스 (인식) 부위는 인트론과 엑손 사이의 "경계"에 있는 인트론 뉴클레오티드 서열이다.
더욱 바람직하게는, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자는
(i) 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 상류에서 (단일) 스플라이스 인식 부위(예를 들어, 5' 스플라이스 부위)를 포함하는 인트론 서열; 및
(ii) 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 하류에서 (단일) 스플라이스 인식부위(예를 들어, 3' 스플라이스 부위)를 포함하는 인트론 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 스플라이스 인식 부위는 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 인접하여 직접(상류 또는 하류에 직접) 위치한다.
본원에서 사용되는 용어 "5' 스플라이스 부위"는, 인트론의 하류 말단에 위치하므로 엑손의 상류에 직접(엑손의 5' 말단)에 위치하는 스플라이스 부위를 의미한다. 예를 들어, "5' 스플라이스 부위"는 일반적으로 3' 말단에서 뉴클레오티드 "AG"(이 순서로)를 포함한다. 즉, "5' 스플라이스 부위"는 마지막 2개의 뉴클레오티드로서 뉴클레오티드 "AG"로 끝날 수 있다(이후 엑손/코딩 서열이 시작됨).
본원에서 사용되는 용어 "3' 스플라이스 부위"는, 인트론의 상류 말단에 위치하므로 엑손의 하류에 직접(엑손의 3' 말단)에 위치하는 스플라이스 부위를 의미한다. 예를 들어, "3' 스플라이스 부위"는 일반적으로 5' 말단에서 뉴클레오타이드 "GT"(이 순서로)를 포함한다. 즉, "3' 스플라이스 부위"는 처음 2개의 뉴클레오티드로서 뉴클레오티드 "GT"로 시작할 수 있다(엑손/코딩 서열의 말단의 바로(직접) 이후에).
스플라이스 부위는 예를 들어 하기의 것들을 포함하는 다양한 생물정보학 도구(bioinformatics tool)에 의해 인 실리코(in silico) 예측될 수 있다:
- 버클리 초파리 게놈프로젝트(Berkeley Drosophila Genome Project) (Drosophily and human prediction; URL: http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html; Reese MG, Eeckman, FH, Kulp, D, Haussler, D, 1997. "Improved Splice Site Detection in Genie". J Comp Biol 4(3), 311-23);
- Human Splicing Finder(URL: http://www.umd.be/HSF/; FO Desmet, Hamroun D, Lalande M, Collod-Beroud G, Claustres M, Beroud C. Human Splicing Finder: an online bioinformatics tool to predict splicing signals. Nucleic Acid Research, 2009, April);
- GeneSplicer(URL: http://ccb.jhu.edu/software/genesplicer/; M. Pertea, X. Lin, S. L. Salzberg. GeneSplicer : a new computational method for splice site prediction. Nucleic Acids Res . 2001 Mar 1;29(5):1185-90);
- NetGene2 Server(URL: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/; S.M. Hebsgaard, P.G. Korning, N. Tolstrup, J. Engelbrecht, P. Rouze, S. Brunak: Splice site prediction in Arabidopsis thaliana DNA by combining local and global sequence information, Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, No. 17, 3439-3452. Brunak, S., Engelbrecht, J., and Knudsen, S.: Prediction of Human mRNA Donor and Acceptor Sites from the DNA Sequence, Journal of Molecular Biology, 1991, 220, 49-65);
- SplicePort: 대화형 스플라이스 부위 분석 도구(URL: http://spliceport.cbcb.umd.edu/; Dogan RI, Getoor L, Wilbur WJ, Mount SM. SplicePort―An interactive splice-site analysis tool. Nucleic Acids Research. 2007;35(Web Server issue):W285-W291. doi:10.1093/nar/gkm407); 및
- MaxEntScan (URL: http://genes.mit.edu/burgelab/maxent/Xmaxentscan_scoreseq.html; Yeo G, Burge CB. Maximum entropy modeling of short sequence motifs with applications to RNA splicing signals. J Comput Biol. 2004;11(2-3):377-94.
바람직하게는, 3' 스플라이스 부위는 서열 번호 1에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 이의 서열 변이체를 포함한다:
AGGTAAGT
[서열번호 1].
또한, 5' 스플라이스 부위는 폴리피리미딘 트랙(10 U 또는 C, 이어서 임의의 염기 및 C) 및 말단 AG를 포함하는 것이 바람직하다.
특히 바람직한 구체예에서, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자는 하기의 것들을 추가로 포함한다:
(i) 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 상류(관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단)에서, (단일) 스플라이스 인식 부위, 특히 5'스플라이스 부위를 포함하는 인트론 서열, 특히 (자연 발생) 인트론의 3' 말단; 및
(ii) 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 하류(관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단)에서, (단일) 스플라이스 인식 부위, 특히 3' 스플라이스 부위를 포함하는 인트론 서열, 특히 인트론의 5' 말단.
가장 바람직하게는, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자는 하기의 것들을 포함한다(하기의 순서로):
1. 제1 스플라이스 인식 부위를 포함하는 제1 인트론 서열(예를 들어, 5' 스플라이스 부위를 포함하는 (자연 발생) 인트론의 3' 말단);
2. 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및
3. 제2 스플라이스 인식 부위를 포함하는 제2 인트론 서열(예를 들어, 3' 스플라이스 부위를 포함하는 (자연 발생) 인트론의 5' 말단).
이러한 DNA 분자(예를 들어 B 림프구 게놈의 14번 염색체의 스위치 영역에 통합됨)의 개략적인 예는 도 11, 특히 일반적인 개념의 상단 부분에 도시되어 있다(도 11의 중간 및 하단은 아래에 설명된 추가의 특징을 포함하는 예를 보여준다).
인트론 서열의 특히 바람직한 예는 서열번호 112 내지 115 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 본원에 정의된 그의 서열 변이체를 포함하거나 그로 구성된다. 예를 들어, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 상류(관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단)에 (직접) 위치한 인트론 서열은 바람직하게는 서열번호 112 또는 서열번호 114에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 본원에 정의된 그의 서열 변이체를 포함하거나 그로 구성된다.
바람직하게는, 인트론 서열은 Ig-유전자좌 인트론 서열을 포함한다. 용어 "Ig-유전자좌 인트론 서열"은 면역글로불린(Ig) 유전자좌의 인트론 서열(특히, Ig 유전자좌에서 자연적으로 발생하는 인트론 서열, 예컨대 Ig 유전자좌에서 자연적으로 발생하는 인트론의 5' 말단 및/또는 3' 말단)을 의미한다. 따라서, 인트론 서열은 Ig 유전자좌의 (자연 발생) 인트론의 단편 또는 Ig 유전자좌의 완전한 인트론인 것이 바람직하다.
가장 바람직하게는, 인트론 서열은 J-세그먼트 하류 인트론의 인트론 서열 및/또는 CH-상류 인트론의 인트론 서열, 예를 들어 CH1-상류 인트론을 포함한다. 용어 "J-세그먼트 하류 인트론"은 J 세그먼트를 암호화하는 엑손의 하류에 집접 위치한 인트론을 의미한다. 용어 "CH 상류 인트론"은 중쇄 불변 도메인(CH)을 암호화하는 엑손의 상류에 직접 위치한 인트론을 의미한다. 따라서, J-세그먼트 하류 인트론의 인트론 서열 및/또는 CH-상류 인트론의 인트론 서열은 전술한 바와 같이 완전한 J-세그먼트 하류 인트론/완전한 CH-상류 인트론 또는 이의 단편일 수 있다. 바람직하게는, CH-상류 인트론은 분기점(branchpoint) 서열("분기 서열" 또는 "분기 부위"로도 알려짐)을 포함한다. 특히 바람직하게는, DNA 분자는 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 상류에서 CH-상류 인트론(예를 들어, CH1-상류 인트론)의 인트론 서열(즉, CH-상류 인트론의 인트론 서열은 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 "이전"/상류에 (직접) 위치함) 및/또는 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 하류에서 J-세그먼트 하류 인트론의 인트론 서열(즉, J-세그먼트 하류 인트론의 인트론 서열은 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 "이전"/하류에 (직접) 위치함)을 포함한다.
가장 바람직하게는, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자는 하기의 것들을 포함한다(하기의 순서로):
1. 3' 말단에서 제1 스플라이스 인식 부위(예를 들어, 5' 슬라이스 부위)를 포함하는 CH-상류 인트론의 인트론 서열(예를 들어 CH-상류 인트론의 3' 말단 단편)(CH-상류 인트론의 인트론 서열은 바람직하게는 분기점 서열 및/또는 인트론 스플라이싱 인핸서를 추가로 포함한다);
2. 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
3. 5' 말단에서 제2 스플라이스 인식 부위(예를 들어, 3' 스플라이스 부위)를 포함하는 J-세그먼트 하류 인트론(예를 들어, J-세그먼트 하류 인트론의 5' 말단 단편)의 인트론 서열)(J-세그먼트 하류 인트론의 인트론 서열은 바람직하게는 인트론 스플라이싱 인핸서를 추가로 포함함).
이러한 바람직한 구체예는도 11(중간)에 개략적으로 도시되어 있다.
따라서, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 상류에 있는 인트론 서열은 분기점 서열("분기 서열"또는 "분기 부위"로도 알려짐)을 포함하는 것이 바람직하다. "분지 부위"는 5' 스플라이스 부위로부터 약 18 내지 50개 뉴클레오티드의 보존된 거리에 위치하는 YNCTGAC(여기서 Y는 C 또는 T일 수 있고 N은 A, G, C 및 T로부터 선택된 임의의 뉴클레오티드 일 수 있음; 서열번호 2)와 같은 약하게 보존된 서열 요소이다. 따라서, 분지 부위는 인트론 서열에 포함된 5' 스플라이스 부위의 상류에서 약 18 내지 50개 뉴클레오티드(바람직하게는 20 내지 40개 뉴클레오티드)의 인트론 서열에 위치하는 것이 바람직하다.
또한, 인트론 서열은 스플라이싱을 향상하거나 침묵(억제)하는 시스-작용 서열인 스플라이싱 조절 요소(SRE)를 포함할 수 있다. 따라서, "스플라이싱 인핸서"와 "스플라이싱 사일런서"는 구별될 수 있다. SRE는 스플라이스 부위 인식 또는 스플 라이소솜(spliceosome) 어셈블리를 활성화하거나 억제하기 위해 트랜스-작용 스플라이싱 인자를 동원한다.
바람직하게는, 인트론 서열은 (인트론) 스플라이싱 인핸서를 포함한다. 또한, 인트론 서열은 (인트론) 스플라이싱 사일런서를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 일반적으로, 인트론 서열(예를 들어, 인트론의 단편)에 존재하는 스플라이 싱 인핸서/사일런서는 "인트론" 스플라이싱 인핸서/사일런서로 지칭되는 반면, 엑손/코딩 서열(예를 들어, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열)에 존재하는 스플라이싱 인핸서/사일런서는 "엑손" 스플라이싱 인핸서/사일런서로 지칭된다. DNA 분자에서 천연 또는 디자인된 스플라이싱 인핸서가 존재하고/하거나 스플라이싱 사일런서가 존재하지 않는 것이 바람직하며 이는 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 스플라이싱 및 통합을 개선할 수 있다.
또한, DNA 분자는 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 상류 및/또는 하류에서 인트론 스플라이싱 인핸서를 포함하는 인트론 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 인트론 스플라이싱 인핸서는 다음문헌[Wang Y, Ma M, Xiao X, Wang Z. Intronic Splicing Enhancers, Cognate Splicing Factors and Context Dependent Regulation Rules. Nature structural & molecular biology. 2012;19(10):1044-1052. doi:10.1038/nsmb.2377]에 기재되어 있다.
가장 바람직하게는, 인트론 스플라이싱 인핸서는 서열번호 3 내지 26 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 이의 서열 변이체를 갖는다:
GTAGTGAGGG (서열번호 3)
GTTGGTGGTT (서열번호 4)
AGTTGTGGTT (서열번호 5)
GTATTGGGTC (서열번호 6)
AGTGTGAGGG (서열번호 7)
GGGTAATGGG (서열번호 8)
TCATTGGGGT (서열번호 9)
GGTGGGGGTC (서열번호 10)
GGTTTTGTTG (서열번호 11)
TATACTCCCG (서열번호 12)
GTATTCGATC (서열번호 13)
GGGGGTAGG (서열번호 14)
GTAGTTCCCT (서열번호 15)
GTTAATAGTA (서열번호 16)
TGCTGGTTAG (서열번호 17)
ATAGGTAACG (서열번호 18)
TCTGAATTGC (서열번호 19)
TCTGGGTTTG (서열번호 20)
CATTCTCTTT (서열번호 21)
GTATTGGTGT (서열번호 22)
GGAGGGTTT (서열번호 23)
TTTAGATTTG (서열번호 24)
ATAAGTACTG (서열번호 25)
TAGTCTATTA (서열번호 26)
가장 바람직하게는, 인트론 서열은 서열번호 27 내지 53 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 이의 서열 변이체를 갖는다. 서열번호 27 내지 45는 CH 상류 인트론의 (인트론 서열/단편)의 바람직한 예를 나타내고, 서열번호 46 내지 51은 J-세그먼트 하류 인트론의 (인트론 서열/단편)의 바람직한 예를 보여준다.
5`IgM-CH1
CGAGGAGGCAGCTCCTCACCCTCCCTTTCTCTTTTGTCCTGCGGGTCCTCAG
[서열번호 27]
5`IgM-CH2
CGAAGGGGGCGGGAGTGGCGGGCACCGGGCTGACACGTGTCCCTCACTGCAG
[서열번호 28]
5`IgM-CH3
TCCGCCCACATCCACACCTGCCCCACCTCTGACTCCCTTCTCTTGACTCCAG
[서열번호 29]
5`IgM-CH4
CCACAGGCTGGTCCCCCCACTGCCCCGCCCTCACCACCATCTCTGTTCACAG
[서열번호 30]
5`IgG1-CH1
TGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAG
[서열번호 31]
5`IG1-힌지
GGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG
[서열번호 32]
5`IgG1-CH2
AGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAG
[서열번호 33]
5`IgG1-CH3
GGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAG
[서열번호 34]
5`IgG3-CH1
TGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCAGTCACATGGCGCCATCTCTCTTGCAG
[서열번호 35]
5`IgG3-힌지
AGATACCTTCTCTCTTCCCAGATCTGAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG
[서열번호 36]
5`IgG3-힌지2
ACGCATCCACCTCCATCCCAGATCCCCGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG
[서열번호 37]
5`IgG3-힌지3
ACGCGTCCACCTCCATCCCAGATCCCCGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG
[서열번호 38]
5`IgG3-힌지4
ACGCATCCACCTCCATCCCAGATCCCCGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG
[서열번호 39]
5`IgG3-CH2
ACGCATCCACCTCCATCCCAGATCCCCGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG
[서열번호 40]
5`IgG3-CH3
GACCCACCCTCTGCCCTGGGAGTGACCGCTGTGCCAACCTCTGTCCCTACAG
[서열번호 41]
5`IgG4-CH1
TGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAG
[서열번호 42]
5`IgG4-힌지
AGACACCTTCTCTCCTCCCAGATCTGAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG
[서열번호 43]
5`IgG4-CH2
AGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACGCATCCACCTCCATCTCTTCCTCAG
[서열번호 44]
5`IgG4-CH3
GGCCCACCCTCTGCCCTGGGAGTGACCGCTGTGCCAACCTCTGTCCCTACAG
[서열번호 45]
위의 예는 IgM 및 다양한 IgG 아류의 각각의 Ig 유전자좌(예를 들어. IgM-CH1)에서의 자연 발생 인트론의 단편(3' 말단)을 보여준다. 또한, IgA1, IgA2 및 IgE와 같은 다른 면역글로불린 동형의 상응하는 (자연 발생) 인트론 서열이 사용되는 것이 바람직하다.
3`J1
GTGAGTCTGCTGTCTGGGGATAGCGGGGAGCCAGGTGTACTGGGCCAGGCAA
[서열번호 46]
3`J2
GTGAGTCCCACTGCAGCCCCCTCCCAGTCTTCTCTGTCCAGGCACCAGGCCA
[서열번호 47]
3`J3
GTAAGATGGCTTTCCTTCTGCCTCCTTTCTCTGGGCCCAGCGTCCTCTGTCC
[서열번호 48]
3`J4
GTGAGTCCTCACAACCTCTCTCCTGCTTTAACTCTGAAGGGTTTTGCTGCAT
[서열번호 49]
3`J5
GTGAGTCCTCACCACCCCCTCTCTGAGTCCACTTAGGGAGACTCAGCTTGCC
[서열번호 50]
3`J6
GTAAGAATGGCCACTCTAGGGCCTTTGTTTTCTGCTACTGCCTGTGGGGTTT
[서열번호 51]
추가의 바람직한 예로는 하기의 것들이 있다:
5`LAIR1
CATGGTGACTTCCTACAGTGGACGCTGAGATCCTGCTCTGCTTCCCTCCTAG
[서열번호 52]
3`LAIR1
GTGAGGACGTCACCTGGGCCCTGCCCCAGTCTCAGCTCGACCCTCGAGCTTG
[서열번호 53]
일반적으로, DNA 분자는 스플라이싱 인핸서를 포함하는 것이 바람직하다. 스 플라이싱 인핸서는 인트론(즉, DNA 분자의 인트론 서열에 위치함) 또는 엑손(즉, DNA 분자의 코딩 서열, 예를 들어 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 위치함)일 수 있다. 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 일반적으로 (관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 기능으로 인해) 인트론 서열보다 상당히 더 미리 결정되기 때문에, 인트론 스플라이싱 인핸서가 일반적으로 바람직하다. 즉, 스플라이싱 인핸서는 DNA 분자에 포함된 인트론 서열에 위치하는 것이 일반적으로 바람직하다. 보다 바람직하게는, DNA 분자는 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 상류에서 인트론 서열 및 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 하류에서 인트론 서열을 포함하고, 각각의 인트론 서열은 스플라이싱 인핸서를 포함한다. 이러한 바람직한 구체예는 도 11(하부)에 개략적으로 도시되어 있다.
그러나, DNA 분자는 예를 들어 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에서 엑손 스플라이싱 인핸서를 포함하는 것이 또한 바람직하다. 예를 들어, 관심있는 (폴리)펩티드는 이를 "자연적으로" 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 엑손 스플라이싱 인핸서를 포함하도록 선택될 수 있다. 더욱이, 유전자 암호의 퇴화가 엑손 스플라이싱 인핸서를 도입하는데 사용될 수 있다. 즉, (암호화된 아미노산을 변경하지 않는) 침묵 돌연변이는 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 엑손 스플라이싱 인핸서를 도입하기 위해 사용될 수 있다.
바람직하게는, DNA 분자는 엑손 스플라이싱 사일런서를 포함하지 않는다.
엑손 스플라이싱 인핸서(ESE)는 엑손 내의 분리된 서열로서, 구성적 스플라이싱 및 조절된 스플라이싱을 모두 촉진한다. 엑손 스플라이싱 인핸서(ESE) 서열은 세린 및 아르기닌이 풍부한 (SR) 단백질에 의해 결합되어, 스플라이싱 인자의 동원(recruitment)모집을 향상시킨다. 바람직하게는, 엑손 스플라이싱 인핸서는 6개의 염기로 구성된 서열 모티프이다.
엑손 스플라이싱 인핸서는 당업계에 알려져 있다(Liu H-X, Zhang M, Krainer AR. Identification of functional exonic splicing enhancer motifs recognized by individual SRproteins. Genes & Development. 1998;12(13):1998-2012; Blencowe BJ. Exonic splicing enhancers: mechanism of action, diversity and role in human genetic diseases. Trends Biochem Sci. 2000 Mar;25(3):106-10). 스플라이싱 인핸서는 예를 들어 RESCUE-ESE 웹 서버를 포함한 다양한 생물정보학 도구를 통해 인실리코(in silico) 예측될 수 있다(URL: http://genes.mit.edu/burgelab/rescue-ese/; Fairbrother WG, Yeh RF, Sharp PA, Burge CB. Predictive identification of exonic splicing enhancers in human genes. Science. 2002 Aug 9;297(5583):1007-13) and/or by ESEfinder (URL: http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi?process=home; Smith, P. J., Zhang, C., Wang, J. Chew, S. L., Zhang, M. Q. and Krainer, A. R. 2006. An increased specificity score matrix for the prediction of SF2/ASF-specific exonic splicing enhancers. Hum. Mol. Genet. 15(16): 2490-2508; Cartegni L., Wang J., Zhu Z., Zhang M. Q., Krainer A. R.; 2003. ESEfinder: a web resource to identify exonic splicing enhancers. Nucleic Acid Research, 2003, 31(13): 3568-3571).
가장 바람직하게는, 스플라이싱 인핸서(인트론 또는 엑손)는 분리된 인간 B 세포, 특히 일차 인간 B 세포에서 효율성을 나타내도록 선택된다. 따라서, 스플라이싱 인핸서는 바람직하게는 분리된 인간 B 세포, 특히 일차 인간 B 세포로부터 유래된다(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 스플라이싱 인핸서의 예측을 위한 적절한 생물정보학 도구를 이용하여 B 세포 서열을 분석함으로써).
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서 B 림프구의 게놈은 N- 에서 C-말단 방향으로 하기의 것들을 포함하는 변형된 면역글로불린 사슬을 발현하도록 편집된다: 가변 도메인, 관심있는 (폴리)펩티드(본 발명에 따른 방법의 단계 (ii)에서 도입된 DNA 분자에 의해 암호화 됨) 및 불변 도메인. 즉, B 림프구의 게놈은 바람직하게는 면역글로불린 사슬의 가변 도메인과 불변 도메인 사이에 배열된 관심의 (폴리)펩티드를 포함하는 변형된 면역글로불린 사슬을 발현하도록 편집된다. 따라서, 항체의 엘보우(elbow) 영역에서 관심의 (폴리)펩티드를 포함하는 변형된 항체를 발현하도록 B 림프구의 게놈을 편집하는 것이 바람직하다. 더욱이, 항체의 엘보우 영역에서 관심의 (폴리)펩티드를 포함하는 변형된 B-세포 수용체를 발현하도록 B 림프구의 게놈이 편집되는 것이 바람직하다.
엘보우 영역은 항체의 중쇄 및 경쇄에서 가변 도메인과 불변 도메인 사이의 접합부이다. 일반적으로, 가변 도메인(VH 또는 VL)의 C-말단은 가장 N-말단의 불변 도메인(일반적으로 CH1 또는 CL)의 N-말단에 직접 연결되고, 가변 도메인(VH 또는 VL)의 C-말단과 가장 N-말단 불변 도메인(일반적으로 CH1 또는 CL)의 N-말단 사이의 접합부를 "엘보우"또는 "엘보우 영역"으로 지칭된다. 엘보우 영역은 불변 영역에 대한 가변 영역의 굽힘 및 회전을 가능하게 한다. 따라서, 힌지 영역과 함께, 엘보우 영역은 항원 결합을 위해 항체에 유연성을 제공한다. 엘보우 영역은 엘보우 영역에 의해 제공되는 운동 범위에 따라 "분자 볼-소켓 조인트(molecular ball-and-socket joint)"라고도 한다(Lesk AM, Chothia C. Elbow motion in the immunoglobulins involves a molecular ball-and-socket joint. Nature. 1988 Sep 8;335(6186):188-90).
B 림프구의 게놈에서 스위치 영역은 항체의 가변 도메인과 (가장 N-말단) 불변 도메인 사이에 위치한다. 전술한 바와 같이, AID의 작용에 의해, 관심의 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자는 B 세포 게놈의 스위치 영역에 통합된다. 따라서, 관심의 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자는 항체의 가변 도메인과 불변 도메인 사이에 통합된다. 특히, 인트론 서열은 스플라이싱 동안 제거되어, 본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 따라 편집된 B 세포 게놈에 의해 발현되는 면역글로불린 사슬은 N- 에서 C-말단 방향으로 하기의 것들을 포함한다: 가변 도메인, 관심있는 (폴리)펩티드(본 발명에 따른 방법의 단계 (ii)에서 도입된 DNA 분자에 의해 암호화 됨) 및 불변 도메인. 따라서, 발현된 면역글로불린 사슬에서 관심의 (폴리)펩티드는 항체의 엘보우 영역, 즉 가변 도메인과 가장 N-말단 불변 도메인의 사이에 위치한다.
엘보우 영역에서 관심의 (폴리)펩티드를 포함하는 항체 및 해당하는 게놈 배열의 바람직한 예는 도 2A에 도시되어 있다. 그림 2A의 상단 부분은 엘보우 영역에서 관심의 (폴리)펩티드로서 단일 수용체 도메인을 갖는 (고전적인 IgG 유형의) 항체를 보여준다. 도 2A의 중간 부분은 엘보우 영역에서 관심의 (폴리)펩티드로서 2개의 수용체 도메인을 갖는 (고전적인 IgG 유형의) 항체를 보여준다. 도 2A의 하단 부분은 엘보우 영역에서 관심의 (폴리)펩티드로서 VH 도메인 및 VL 도메인을 갖는 (고전적인 IgG 유형의) 항체를 보여준다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 방법으로 얻을 수 있는 "엘보우내 삽입물(In-Elbow-Inserts)"(IEI)를 갖는 항체는 본원에 참조로 포함되는 WO 2019/025391 A1호 및 WO 2019/024979 A1(PCT/EP2017/069357)호에 상세히 기재되어 있다. 특히, B 림프구의 게놈은 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하도록 본 발명에 따른 방법으로 편집될 수 있는데, 상기 중쇄는 N- 에서 C-말단 방향으로 하기의 것들을 포함한다:
(i) 가변 도메인, 특히 중쇄 가변 도메인 (VH);
(ii) 관심있는 (폴리)펩티드; 및
(iii) 하나 이상의 불변 도메인, 특히 바람직하게는 적어도 CH1 불변 도메인을 포함 중쇄 불변 도메인(CH).
바람직하게는, 중쇄의 관심의 (폴리)펩티드 (ii)는 경쇄의 단편을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
관심있는 (폴리)펩티드를 함유하도록 엘보우 영역에서 조작된 이러한 항체는, WO 2019/025391 A1호 및 WO 2019/024979 A1 (PCT/EP2017/069357)호에 상세히 기재된 바와 같이, 예를 들어 (1) 그의 가변 도메인에 의해 표적화된 항원 및 (2) 항체의 엘보우 영역에 도입된 결합 부위에 의해 표적화된 추가의 표적에 동시에 결합할 수 있다.
특히, 다양한 "엘보우내 삽입물"(IEI) 항체는 본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 방법으로 얻어질 수 있다. "엘보우내 삽입물"(IEI) 항체는 WO 2019/025391 A1호 및 WO 2019/024979 A1 (PCT/EP2017/069357)호에 자세히 설명되어 있다. 본 발명에 따른 방법으로 얻을 수 있는 바람직한 "엘보우내 십입물"(IEI) 항체는 WO 2019/025391 A1호 및 WO 2019/024979 A1 (PCT/EP2017/069357)호에 설명된 "엘보우내 삽입물"(IEI) 항체의 바람직한 구체예에 해당한다.
그러나, 본 발명에 따른 방법으로 다른 재조합 항체도 얻을 수 있다. 특히, B 림프구의 게놈은 내인성 가변 도메인이 관심있는 (폴리)펩티드로 치환되어 있는 변형된 면역글로불린 사슬을 발현하도록 편집되는 것이 바람직하다. 따라서, B 림프구의 게놈은 내인성 가변 도메인이 관심있는 (폴리)펩티드로 치환되어 있는 변형된 B 세포 수용체를 발현하도록 편집되는 것이 바람직하다. 따라서, B 림프구의 게놈은 내인성 가변 도메인 "대신"에 관심있는 (폴리)펩티드를 포함하는 변형된 항체를 발현하도록 편집되는 것이 바람직하다.
내인성 가변 영역 대신에 관심있는 (폴리)펩티드를 포함하는 면역글로불린 사슬을 포함하는 항체 및 및 이에 해당하는 게놈 배열의 바람직한 예가 도 2B에 도시되어 있다. 도 2B의 상단 부분은 내인성 가변 영역(VH)이 다른(이종) 가변 영역(VH)으로 치환된 (고전적인 igG 유형의) 항체를 보여준다. 다음의 작제물에서, 내인성 가변 영역(VH)은 수용체 도메인 및 다른(이종) 가변 영역(VH)으로 치환되었다. 다음의 작제물에서, 내인성 가변 영역(VH)은 3개의 (이종) 가변 영역(VH-VL-VH)으로 치환되었다. 도 2B의 최하부에서, 내인성 가변 영역(VH)은 2개의 (이종) 가변 영역 및 (이종) 불변 영역(VL-CL-VH)으로 치환되었다. 용어 "이종(heterologous)"은 내인성 서열, 즉 이 게놈 위치에 본래 존재하였던 서열과 구별되는 서열을 의미한다.
또한, B 림프구의 게놈은 내인성 불변 도메인이 관심있는 (폴리)펩티드로 치환되어 있는 변형된 면역글로불린 사슬을 발현하도록 편집되는 것이 바람직하다. 따라서, B 림프구의 게놈은 내인성 불변 도메인이 관심있는 (폴리)펩티드로 치환되어 있는 변형된 B-세포 수용체를 발현하도록 편집되는 것이 바람직하다. 따라서, B 림프구의 게놈은 내인성 불변 도메인 "대신"에 관심의 (폴리)펩티드를 포함하는 변형된 항체를 발현하도록 편집되는 것이 바람직하다. 따라서, 이러한 변형된 면역글로불린 사슬은 (내인성) 가변 도메인, 관심있는 (폴리)펩티드를 포함하지만 (내인성) 불변 도메인은 포함하지 않는다.
관심있는 (폴리)펩티드가 내인성 가변 도메인을 치환하는 변형은 내인성 VDJ 엑손과 관심의 (폴리)펨티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 사이에 절단 부위, 예컨대 T2A 절단 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 도입함으로써 달성될 수 있다. 관심있는 (폴리)펩티드가 내인성 불변 도메인을 치환하는 변형은 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 사이에 T2A 절단 부위와 같은 절단 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 도입함으로써 달성될 수 있다.
따라서, DNA 분자는 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 상류 및/또는 하류에서 절단 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 절단 부위는 T2A 절단 부위이다.
본원에서 사용되는 용어 "절단 부위"는 효소적 절단(예를 들어, 프로테아제에 의한)뿐만 아니라 예를 들어 리보솜 스키핑에 의한 "자가 절단"을 포함한다. 효소 절단 부위는 당업계에 알려져 있다. 바람직한 예로는 인간 라이노바이러스(HRV) 3C 프로테아제의 경우 3C ("PreScission") 절단 태그(서열: LEVLFQGP; 서열번호 54); 엔테로키나제의 경우 EKT(엔테로 키나제) 절단 태그(서열: DDDDK; 서열번호 55); 인자 Xa의 경우 FXa(인자 Xa) 절단 태그(서열: IEGR; 서열번호 56); 담배 에치 바이러스 프로테아제의 경우 TEV(담배 에치 바이러스) 절단 태그(서열: ENLYFQG; 서열번호 57); 및 트롬빈의 경우 트롬빈 절단 태그(서열: LVPRGS; 서열번호 58)이 있다. 일반적으로, 프로테아제 또는 펩티다아제에 의한 절단 부위는 변형된 면역글로불린 유전자로부터 번역된 단백질을 번역후 절단할 수 있다. 이러한 단백질 절단에 의해, 예를 들어. 펩티다제 또는 프로테이나제에 의해, 번역된 유전자 생성물(하나의 단일 사슬)에 포함된 공유 결합된 면역글로불린 성분은 단편으로 처리되어 상기 기재된 바와 같이 변형된 항체 또는 항체 단편을 달성한다.
또한, 절단 부위는 예를 들어 하기의 것들을 포함하는 다양한 생물정보학 도구에 의해 인실리코 예측될 수 있다:
- PeptideCutter (URL: https://web.expasy.org/peptide_cutter/; Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;
Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;
(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005));
- PROSPER (URL: https://prosper.erc.monash.edu.au/webserver.html; Song J, Tan H, Perry AJ, Akutsu T, Webb GI, Whisstock JC and Pike RN. PROSPER: an integrated feature-based tool for predicting protease substrate cleavage sites. PLoS ONE, 2012, 7(11): e50300);
- MEROPS (URL: https://www.ebi.ac.uk/merops/; Rawlings, N.D., Barrett, A.J., Thomas, P.D., Huang, X., Bateman, A. & Finn, R.D. (2018) The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Res 46, D624-D632);
- TopFIND (URL: http://clipserve.clip.ubc.ca/topfind; Nikolaus Fortelny, Sharon Yang, Paul Pavlidis, Philipp F. Lange*, Christopher M. Overall*, Nucleic Acids Research 43 (D1), D290-D297 (2014)); 및
- CutDB (URL: http://cutdb.burnham.org/; Igarashi Y, Eroshkin A, Gramatikova S, Gramatikoff K, Zhang Y, Smith JW, Osterman AL, Godzik A. CutDB: a proteolytic event database. Nucleic Acids Res. 2007 Jan;35(Database issue):D546-9).
바람직하게는, 절단 부위는 리보솜 스키핑 부위와 같은 "자가 절단" 부위( "자가 처리" 부위라고도 함)이다. 본원에 사용되는 용어 "자가 절단"("자가 처리")은 예를 들어 리보솜 스키핑에 의한 프로테아제가 없는 "절단"과 관련이 있다. 바람직하게는, 자가 처리 부위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 아미노산 서열 Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이며, 여기서 X는 임의의 아미노산(DX1EX2NPGP, 여기서 X1은 Val 또는 Ile이고 X2는 임의의 (천연 발생) 아미노산일 수 있음; 서열번호 59)이다. 리보솜 스키핑은 mRNA 번역 과정에서 별도의 개체를 제공한다. 기본 메커니즘은 mRNA 번역 동안 두 아미노산, 즉 G (Gly)과 P (Pro) 사이에 공유 결합을 형성하지 않는 것을 기반으로 한다. 따라서, mRNA 번역은 Gly/Pro 사이에 공유 결합이 형성되지 않기 때문에 중단되지 않고 오히려 mRNA에 대한 리보솜 활성을 중단하지 않고 진행된다. 특히, 펩티드 서열에서 서열 패턴 Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly≠Pro가 발생하면 리보솜은 이들 아미노산 사이에 펩티드 결합을 형성하지 않는다. 공유 결합의 비-형성은 상기 아미노산 스트레치의 C-말단 Gly-Pro 위치의 사이에서 발생한다. 바람직한 자가-처리 부위는 T2A(서열: EGRGSLLTCGDVEENPGP; 서열번호: 60); F2A(서열: VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP;서열번호 61); 또는 P2A (서열: ATNFSLLKQAGDVEENPGP; 서열번호 62); 또는 본원에 기재된 바와 같은 이의 서열 변이체, 특히 서열번호 63(GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP) 또는 서열번호 64(RKRRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP)에 따른 서열 변이체와 같은 2A-부위이다.
가장 바람직하게는, DNA 분자는 본원에 기재된 바와 같은 T2A 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열번호 60) 또는 이의 서열 변이체를 포함한다.
몇몇의 구체예에서, DNA 분자는 염색체의 전장 DNA 가닥을 포함하지 않는다.
몇몇 구체예에서, DNA 분자는 프로모터를 포함한다. 보다 구체적으로, 몇몇 구체예에서, DNA 분자는 전사 단위를 포함할 수 있다. 용어 "전사 단위"는 전사에 필요한 서열과 함께 단일 RNA 분자를 암호화하는 DNA의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 일반적으로, 전사 단위는 프로모터, RNA 암호화 서열 및 터미네이터를 포함한다. 프로모터 및 터미네이터의 예는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 프로모터 및 터미네이터는 암호화된 (폴리)펩티드에 관하여 자연 발생 유전자에서와 동일할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 프로모터 (및/또는 터미네이터)는 (암호화된 (폴리)펩티드와 관하여 이종성이다(즉, 이는 암호화된 (폴리)펩티드의 유전자에서 자연 발생하지 않는다). 특히, RNA-암호화 서열 (및 DNA 분자 내의 상응하는 DNA 서열)은 일반적으로 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 관심의 (폴리)펩티드를 암호화한다.
관심있는 폴리(펩티드)
관심있는 (폴리)펩티드는 이종유래(즉, B 림프구에 의해 자연적으로 발현되지 않음)일 수 있고/있거나 이는 이종유래(즉, 변형된 항체와 같은, B 림프구에 의해 자연적으로 발현되지 않는)인 폴리펩티드(또는 단백질)에 포함될 수 있다.
전술한 바와 같이, 관심있는 (폴리)펩티드는 특히 맞춤형 항체 또는 항체 단편(의 일부)으로 발현되는 것으로 예상되는 임의의 (폴리)펩티드일 수 있다. 특히, 관심있는 (폴리)펩티드는 하나 (단일) 이상의 기능적 도메인을 포함하거나 그로 구성된다. 일반적으로, 용어 "기능적 도메인"은 예를 들어 항체 또는 항체 단편의 기능적 단위를 의미한다. 일반적으로, 기능적 도메인은 단백질, 예를 들어 항체 또는 항체 단편에 (추가의) 기능을 제공한다. 따라서, (추가의) 기능적 도메인은 일반적으로 (추가의) 기능을 제공하는데 필요한 모든 아미노산/서열을 포함한다.
바람직하게는, 기능적 도메인(관심있는 (폴리)펩티드에 포함됨)은 최대 1000개 아미노산, 보다 바람직하게는 최대 750개 아미노산, 더욱더 바람직하게는 최대 500개 아미노산, 더욱더 바람직하게는 최대 400개 아미노산, 특히 바람직하게는 최대 300개 아미노산, 가장 바람직하게는 최대 275개 또는 250개의 아미노산의 길이를 갖는다. 또한, 기능적 도메인은 5개 내지 1000개 아미노산, 보다 바람직하게는 10개 내지 750개 아미노산, 더욱더 바람직하게는 20개 내지 500개 아미노산, 더욱더 바람직하게는 50개 내지 400개 아미노산, 특히 바람직하게는 70개 내지 300개 아미노산, 가장 바람직하게는 75개 내지 275개 또는 100개 내지 250개 아미노산의 길이를 갖는 것이 바람직하다.
또한, (관심있는 (폴리)펩티드에 포함되는) 기능적 도메인은 최대 150 kDa,보다 바람직하게는 최대 100 kDa, 더욱더 바람직하게는 최대 80 kDa, 더욱더 바람직하게는 70 kDa, 특히 바람직하게는 최대 50 kDa, 가장 바람직하게는 최대 30 또는 25 kDa의 크기를 갖는 것이 바람직하다. 더욱이, 기능적 도메인은 0.5 kDa 내지 150 kDa, 보다 바람직하게는 1 kDa 내지 100 kDa, 더욱더 바람직하게는 2.5 kDa 내지 80 kDa, 더욱더 바람직하게는 5 kDa 내지 70 kDa, 특히 바람직하게는 7.5 kDa 내지 50 kDa, 가장 바람직하게는 10 kDa 내지 30 또는 25 kDa의 크기를 갖는 것이 바람직하다.
관심있는 (폴리)펩티드는 단량체 도메인 또는 다량체 도메인을 포함할 수 있다. 단량체 도메인은 임의의 (추가의) 도메인의 개입 없이 기능을 그의 매개하는 도메인이다. 다량체 도메인, 예를 들어 이량체를 형성하는 2개의 도메인 또는 삼량 체를 형성하는 3개의 도메인은 이들의 기능을 함께, 특히 다량체로서, 예를 들어 이량체 또는 삼량체로서 매개한다. 다량체 도메인의 경우, 관심있는 (폴리)펩티드는 다량체를 형성하기에 충분한 유연성을 제공하도록 본원에 기재된 링커를 포함할 수 있으며, 특히 링커는 하나 이상의 다량체 도메인(들)에 인접하여, 예를 들어 두 개의 다량체 도메인의 사이 또는 모든 다량체 도메인의 각 측면에 (직접) 위치할 수 있다. 바람직하게는, 관심있는 (폴리)펩티드는 하나 이상의 단량체 도메인(들)을 포함하거나 그로 구성된다.
일반적으로, 관심있는 (폴리)펩티드는 하나의 단일 단백질 도메인 또는 하나 이상의 단백질 도메인을 포함하거나 그로 구성될 수 있다. "하나 이상의 단백질 도메인"은 상기 기재된 바와 같은 다량체 도메인 및/또는 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 단량체 도메인일 수 있다. 예를 들어, 관심있는 (폴리)펩티드는, 동일하거나 별개의 기능을 매개할 수 있고/있거나 선택적으로 링커에 의해 연결될 수 있는 2개 또는 3개의 단량체 도메인을 포함하거나 그로 구성될 수 있다. 예를 들어, 관심있는 (폴리)펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 (개별적인) 단백질 도메인을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 관심있는 (폴리)펩티드(더 바람직하게는 관심있는 완전한 (폴리)펩티드)에 포함된 기능적 도메인은 인간 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 이의 단편(특히 도메인) 또는 유도체이다.
또한, 관심있는 (폴리)펩티드는 링커, 예를 들어 GS-링커를 포함할 수 있다.
(관심있는 (폴리)펩티드에 포함된) 바람직한 기능적 도메인은 Ig-유사 도메인을 포함하거나 그로 구성되며; 예를 들어, 아래에 예시된 바와 같이 단백질 또는 (폴리)펩티드의 Ig-유사도메인을 포함하거나 그로 구성된다. 면역글로불린(Ig) 분자의 기본 구조는 이황화 결합으로 연결된 두 개의 경쇄와 두 개의 중쇄로 구성된 사량체이다. 경쇄에는 두 가지 유형이 있다: 각각 불변 도메인(CL) 및 가변 도메인(VL)으로 구성되는 카파(kappa) 및 람다(lambda). 중쇄에는 5 가지 유형이 있다: 모두 가변 도메인(VH)과 3개(알파, 델타 및 감마) 또는 4개(엡실론 및 뮤) 불변 도메인(CH1 내지 CH4)로 구성되는 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤(mu), Ig 분자는 가변 및 불변 도메인이 명확하고 보존된 서열 패턴을 갖고 있는 고도로 모듈화된 단백질이다. Ig 및 Ig 유사 분자의 도메인은 4 가지 유형으로 분류된다: V-세트(가변), C1-세트(불변-1), C2-세트(불변-2) 및 I-세트(중간체). 구조적 연구에 따르면 이러한 도메인은 공통 핵심 그리스-키 베타-샌드위치 구조(Greek-key beta-sandwich structure)를 공유하며, 그 유형들은 베타 시트의 가닥 수와 서열 패턴이 다르다. 서열 및 구조 모두에서 관련이 있는 면역글로불린 유사 도메인은 여러 다양한 단백질 패밀리에서 확인될 수 있다. Ig-유사 도메인은 세포-세포 인식, 세포-표면 수용체, 근육 구조 및 면역 체계를 포함한 다양한 기능에 관여한다.
Ig- 유사 도메인의 바람직한 예는 임의의 하나 또는 하기의 단백질 또는 (폴리)펩티드의 Ig-유사 도메인을 포함한다: A1BG(알파-1-B 당단백질), ACAM, ADAMTSL1(ADAMTS 유사 1), ADAMTSL3(ADAMTS 유사 3), AGER(최종 당화산물 수용체), ALCAM(활성화된 백혈구 세포 부착 분자), ALPK3 (알파 키나제 3), AMIGO1(Ig 유사 도메인 1을 갖는 부착 분자), AMIGO2(Ig 유사 도메인 2를 갖는 부착 분자), AMIGO3(Ig 유사 도메인 3을 갖는 부착 분자), AXL(AXL 수용체 티로신키나제), BCAM(기저 세포 부착 분자(루테란 혈액 그룹)), BOC(BOC 세포 부착 관련, 종양유전자 조절), BSG(basigin (Ok 혈액형)), BTLA(B 및 T 림프구 관련), C10orf72, C20orf102, CADM1(세포 부착 분자 1), CADM3(세포 부착 분자 3), CADM4(세포 부착 분자 4), CCDC141(코일링됨-141을 포함하는 코일 도메인), CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD22, CD33, CD47, CD48, CD80, CD84, CD86, CD96, CD101, CD160, CD200, CD244, CD276, CDON(세포부착 관련, 종양유전자 조절), CEACAM1(암배아 항원 관련 세포 부착 분자 1), CEACAM5(암배아 항원 관련 세포 부착 분자 5), CEACAM6(암배아 항원 관련 세포 부착 분자 6), CEACAM7(암배아 항원 관련 세포 부착 분자 7), CEACAM8(암배아 항원 관련 세포 부착 분자 8), CEACAM16(암배아 항원 관련 세포 부착 분자 16), CEACAM18(암배아 항원 관련 세포 부착 분자 18), CEACAM20(암배아 항원 관련 세포 부착 분자 20), CEACAM21(암배아 항원 관련 세포 부착 분자 21), CHL1(세포 부착 분자 L1 유사), CILP(연골 중간층 단백질), CILP2(연골 중간층 단백질 2), CLMP(CXADR 유사 막단백질), CNTFR(섬모 신경영양 인자 수용체), CNTN1(콘탁틴 1), CNTN2(콘탁틴 2), CNTN3(콘탁틴 3, CNTN4(콘탁틴 4), CNTN5(콘탁틴 5), CNTN6(콘탁틴 6), CSF1R(콜로니 자극 인자 1 수용체), CXADR(CXADR, Ig-유사 세포 부착 분자), DSCAM(DS 세포 부착 분자), DSCAML1(DS 세포 부착 분자 유사 1), EMB(엠비진), ESAM(내피 세포 부착 분자), F11R(F11 수용체), FAIM3, FCMR(IgM 수용체의 Fc 단편), HMCN1(헤미센틴 1), HMCN2(헤미센틴 2), FCAR(IgA 수용체의 Fc 단편), FCER1A(IgE 수용체 Ia의 Fc 단편), FCGR1A(IgG 수용체 Ia의 Fc 단편), FCGR1B(IgG 수용체 Ib의 Fc 단편), FCGR1CP(IgG 수용체의 Fc 단편, Ic, 유사 유전자), FCGR2A(IgG 수용체 IIa의 Fc 단편), FCGR2B(IgG 수용체 IIb의 Fc 단편), FCGR2C(IgG 수용체 IIc의 Fc 단편), FCGR3A(IgG 수용체 IIIa의 Fc 단편), FCGR3B(IgG 수용체 IIIb의 Fc 단편), FCRH1, FCRH3, FCRH4, FCRL1(Fc 수용체 유사 1), FCRL2(Fc 수용체 유사 2), FCRL3(Fc 수용체 유사 3), FCRL4(Fc 수용체 유사 4), FCRL5(Fc 수용체 유사 5), FCRL6(Fc 수용체 유사 6), FCRLA(Fc 수용체 유사 A), FCRLB(Fc 수용체 유사 B), FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FGFRL1, FLT1(fms 관련 티로신 키나제 1), FLT3(fms 관련 티로신 키나제 3), FLT4(fms 관련 티로신 키나제 4), FSTL4(폴리스타틴 유사 4), FSTL5(폴리스타틴 유사 5), GP6(당단백질 VI 혈소판), GPA33(당단백질 A33), GPR116, GPR125, ADGRF5(부착 G 단백질-결합 수용체 F5), ADGRA2(부착 G 단백질-결합 수용체 A2), hEMMPRIN, HEPACAM(간 및 아교 세포 부착 분자), HEPACAM2(HEPACAM 패밀리 멤버 2), HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DQB, HLA-DQB1, HNT, HSPG2(헤파란 설페이트 프로테오글리칸 2), HYST2477, ICAM1(세포간 부착 분자 1), ICAM2(세포간 부착 분자 2), ICAM3(세포간 부착 분자 3), ICAM4(세포간 부착 분자 4 (Landsteiner-Wiener 혈액형)), ICAM5(세포간 부착 분자 5), DCC(DCC 네트린 1 수용체), NEO1(네오기닌 1), IGHA1, IGHD, IGHE, IGDCC4(면역글로불린 수퍼패밀리 DCC 아류 멤버 4), IGLON5(IgLON 패밀리 멤버 5), IGSF1(면역글로불린 수퍼패밀리 멤버 1), IGSF2(면역글로불린 수퍼패밀리 멤버 2), IGSF3(면역글로불린 수퍼패밀리 멤버 3), IGSF5(면역글로불린 수퍼패밀리 멤버 5), IGSF9(면역글로불린 수퍼패밀리 멤버 9), IGSF9B(면역글로불린 수퍼패밀리 멤버 9B), IGSF10(면역글로불린 수퍼패밀리 멤버 10), IGSF11(면역글로불린 수퍼패밀리 멤버 11), IGSF21(면역글로불린 수퍼패밀리 멤버21), IGSF23(면역글로불린 수퍼패밀리 멤버 23), IL1R1(인터루킨 1 수용체 유형 1), IL1R2(인터루킨 1 수용체 유형 2), IL1RAP(인터루킨 1 수용체 보조 단백질), IL1RAPL1(인터루킨 1 수용체 보조 단백질 유사 1), IL1RAPL2(인터루킨 1 수용체 보조 단백질 유사 2), IL1RL1(인터루킨 1 수용체 유사 1), IL1RL2(인터루킨 1 수용체 유사 2), IL6R(인터루킨 6 수용체), IL11RA(인터루킨 11 수용체 서브유닛 알파), IL12B(인터루킨 12B), IL18BP(인터루킨 18 결합 단백질), IL18R1(인터루킨 18 수용체 1), IL18RAP(인터루킨 18 수용체 보조 단백질), ISLR2(류신 풍부 반복 2를 포함하는 면역글로불린 수퍼패밀리), JAM2(접합 부착 분자 2), JAM3(접합 부착 분자 3), KDR(키나제 삽입 도메인 수용체), KIR-123FM, KIR2DL1(살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 2개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 꼬리 1), KIR2DL2(살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 2개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 꼬리 2), KIR2DL3(살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 2개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 꼬리 3), KIR2DL4 (살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 2개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 꼬리 4), KIR2DL5A(살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 2개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 꼬리 5A), KIR2DL5B(살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 2개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 꼬리 5B), KIR2DLX, KIR2DS1(살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 2개의 Ig 도메인 및 짧은 세포질 꼬리 1), KIR2DS2(살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 2개의 Ig 도메인 및 짧은 세포질 꼬리 2), KIR2DS3 (살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 2개의 Ig 도메인 및 짧은 세포질 꼬리 3), KIR2DS4(살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 2개의 Ig 도메인 및 짧은 세포질 꼬리 4), KIR2DS5(살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 2개의 Ig 도메인 및 짧은 세포질 꼬리 5), kir3d, KIR3DL1(살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 3개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 꼬리 1), KIR3DL2(살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 3개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 꼬리 2), KIR3DL3(살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 3개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 꼬리 3), KIR3DP1(살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 3개의 Ig 도메인 유사유전자 1, KIR3DS1(살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 3개의 Ig 도메인 및 짧은 세포질 꼬리 1), KIR3DX1(살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 3개의 Ig 도메인 X1), KIRREL1(키레(kirre) 유사 네프린 패밀리 부착 분자 1), KIRREL2(키레 유사 네프린 패밀리 부착 분자 2), KIRREL3(키레 유사 네프린 패밀리 부착 분자 3), KIT(KIT 원발암 유전자 수용체 티로신 키나아제), L1CAM, LAG3(림프구 활성화 3), LAIR1(백혈구 관련 면역 글로불린 유사 수용체 1), LAIR2(백혈구 관련 면역 글로불린 유사 수용체 2), LEPR(렙틴 수용체), LILRA1(백혈구 면역글로불린 유사 수용체 A1), LILRA2(백혈구 면역글로불린 유사 수용체 A2), LILRA3(백혈구 면역글로불린 유사 수용체 A3, LILRA4(백혈구 면역글로불린 유사 수용체 A4), LILRA5(백혈구 면역글로불린 유사 수용체 A5), LILRA6(백혈구 면역글로불린 유사 수용체 A6), LILRB1(백혈구 면역글로불린 유사 수용체 B1), LILRB2(백혈구 면역글로불린 유사 수용체 B2), LILRB3(백혈구 면역글로불린 유사 수용체 B3), LILRB4(백혈구 면역글로불린 유사 수용체r B4), LILRB5(백혈구 면역글로불린 유사 수용체 B5), LILRP2, LRIG1, LRIG2, LRIG3, LRIT1, LRRC4, LSAMP, LSR(지방분해 자극 지단백 수용체), LY9(림프구 항원 9), MADCAM1(점막 혈관 어드레신 세포 부착 분자 1), MAG(미엘린 관련 당단백질), MALT1(MALT1 파라카스파제), MCAM(흑색종 세포 부착 분자), MDGA1(MAM 도메인 함유 글리코실포스파티딜이노시톨 앵커 1), MDGA2(MAM 도메인 함유 글리코실포스파티딜이노시톨 앵커 2), MERTK(MER 원발암 유전자, 티로신 키나제), MFAP3, MIR, MILR1(비만 세포 면역글로불린 유사 수용체 1), MMP23A(기질 메탈로펩티다아제 23A (유사유전자)), MMP23B(기질 메탈로펩티다아제 23B), MUSK(근육 관련 수용체 티로신 키나아제), MXRA5(기질 리모델링 관련 5), MYBPC3, MYOM1(미오메신 1), MYOM2(미오메신 2), MYOM3(미오메신 3), NCA, NCAM1, NCAM2, NCR1(천연 세포독성 유발 수용체 1), NEGR1, NEO1, NFASC, NOPE, NPHS1(NPHS1, 네프린), NPTN(뉴로플라스틴), NRCAM(신경 세포 부착 분자), NTRK1(신경영양 수용체 티로신 키나아제 1), NRG1, NT, NTRK3, OBSCN, OBSL1(옵스쿠린 유사 1), OPCML, OSCAR(파골세포 관련 면역글로불린 유사 수용체), PAPLN, PDCD1LG2(프로그램된 세포 사멸 1 리간드 2), PDGFRA(혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파), PDGFRB(혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타), PDGFRL(혈소판 유래 성장 인자 수용체 유사), PECAM1(혈소판 및 내피세포 부착 분자 1), PRODH2, PSG1(임신 특이적 베타-1-당단백질 1), PSG2(임신 특이적 베타-1-당단백질 2), PSG3(임신 특이적 베타-1-당단백질 3), PSG4(임신 특이적 베타-1-당단백질 4), PSG5(임신 특이적 베타-1-당단백질 5), PSG6(임신 특이적 베타-1-당단백질 6), PSG7(임신 특이적 베타-1-당단백질 7(유전자/유사유전자)), PSG8(임신 특이적 베타-1-당단백질 8), PSG9(임신 특이적 베타-1-당단백질 9), PSG10(임신 특이적 베타-1-당단백질 10), PSG11(임신 특이적 베타-1-당단백질 11), PSG11s'(임신 특이적 베타-1-당단백질 11s'), PTGFRN(프로스타글란딘 F2 수용체 억제제), PTK7(단백질 티로신 키나아제 7 (비활성)), PTPRD(단백질 티로신 포스파타제, 수용체 유형 D), PTPRK(단백질 티로신 포스파타제, 수용체 유형 K), PTPRM(단백질 티로신 포스파타제, 수용체 유형 M), PTPRS (단백질 티로신 포스파타제, 수용체 유형 S), PTPRT(단백질 티로신 포스파타제, 수용체 유형 T), PTPsigma, PUNC, PVR(폴리오바이러스 수용체), PVRL1, PVRL2, PVRL4, NECTIN1(넥틴 세포 부착 분자 1), NECTIN2(넥틴 세포 부착 분자 2), NECTIN3(넥틴 세포 부착 분자 3), RAGE, ROBO3(우회 가이드 수용체 3), SCN1B(나트륨 전압 게이트-채널 베타 서브유닛 1), SDK1(사이드킥 세포 부착 분자 1), SDK2(사이드킥 세포 부착 분자 2), SEMA3A(세마포린 3A), SEMA3B(세마포린 3B), SEMA3E(세마포린 3E), SEMA3F(세마포린 3F), SEMA3G(세마포린 3G), SEMA4C(세마포린 4C), SEMA4D(세마포린 4D), SEMA4G(세마포린 4G), SEMA7A 8semaphorin 7A(John Milton Hagen 혈액형)), SIGIRR(단일 Ig 및 TIR 도메인 함유), SIGLEC1(시알산 결합 Ig 유사 렉틴 1), SIGLEC5(시알산 결합 Ig 유사 렉틴 5), SIGLEC6(시알산 결합 Ig 유사 렉틴 6), SIGLEC7(시알산 결합 Ig 유사 렉틴 7), SIGLEC8(시알산 결합 Ig 유사 렉틴 8), SIGLEC9(시알산 결합 Ig 유사 렉틴 9), SIGLEC10(시알산 결합 Ig 유사 렉틴 10), SIGLEC11(시알산 결합 Ig 유사 렉틴 11), SIGLEC12(시알산 결합 Ig 유사 렉틴 12 (유전자/유사유전자)), SIGLEC14(시알산 결합 Ig 유사 렉틴 14), SIGLEC15(시알산 결합 Ig 유사 렉틴 15), SLAMF1(신호전달 림프구 활성화 분자 패밀리 멤버 1), SLAMF6 (SLAM 패밀리 멤버 6), SLAMF8(SLAM 패밀리 멤버 8), SIRPG; TARM1(골수 세포의 T 세포 상호작용, 활성화 수용체 1), TEK(TEK 수용체 티로신 키나아제), THY1 Thy-1 세포 표면 항원), TIE1(면역 글로불린 유사 및 EGF 유사 도메인을 갖는 티로신 키나아제 1), TMEM81(막관통 단백질 81), TMIGD1(막관통 및 면역글로불린 도메인 함유 1), TMIGD2(막관통 및 면역글로불린 도메인 함유 2), TTN(티틴), TYRO3(TYRO3 단백질 티로신 키나제), UNC5D, VCAM1(혈관 세포 부착 분자 1), VSIG1(V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 1), VSIG2(V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 2), VSIG4(V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 4), VSIG10(V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 10), VSIG10L(V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 10 유사), VSTM1(V-세트 및 막관통 도메인 함유 1), VTCN1(V-세트 도메인 함유 T-세포 활성화 억제제 1), ZPBP(투명띠(zona pellucida) 결합 단백질), 또는 ZPBP2(투명띠 결합 단백질 2).
보다 바람직하게는, Ig-유사 도메인은 CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD22, CD33, CD80, CD86, 특히 CD4 중 어느 하나의 Ig-유사 도메인이다.
또한, 관심있는 (폴리)펩티드는 하나 이상의 가변 도메인(예를 들어, 경쇄 가변 도메인(VL) 또는 중쇄 가변 도메인(VH)) 및/또는 하나 이상의 불변 도메인(예를 들어, 경쇄 불변 도메인(CL) 또는 하나 이상의 (2 또는 3) 중쇄 불변 도메인(들)(CH1, CH2, CH3))과 같은 하나 이상의 항체 도메인을 포함하거나 그로 구성되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 관심있는 (폴리)펩티드는 (이종) VH 도메인을 포함하거나 그로 구성된다. 또 다른 예에서, 관심있는 (폴리)펩티드는 (이종) VH 및 (이종) VL 도메인을 포함하거나 그로 구성된다. 또 다른 예에서, 관심있는 (폴리)펩티드는 2개의 (이종) VH 및 1개의 (이종) VL 도메인(예를 들어, VH-VL-VH)을 포함하거나 그로 구성된다. 또 다른 예에서, 관심있는 (폴리)펩티드는 (이종) VH 도메인, (이종) CL 도메인 및 (이종) VL 도메인(예를 들어, VL-CL-VH))을 포함하거나 그로 구성된다. 또한, 항체 도메인은 수용체 도메인(예를 들어, 수용체 도메인 및 VH 도메인)과 같은 본원에 기재된 바와 같은 다른 기능적 도메인과 조합되는 것이 바람직하다.
Ig-유사 도메인의 추가의 바람직한 예는 아래에 설명된다.
또 다른 바람직한 기능적 도메인(관심있는 (폴리)펩티드에 포함됨)은 (알려진) 단백질의 세포외 및/또는 세포내 도메인을 포함하거나 그로 구성된다. 더욱이, 기능적 도메인은 바람직하게는 (알려진) 가용성 구형 단백질의 도메인을 포함하거나 그로 구성될 수 있다. 보다 바람직하게는, 기능적 도메인은 (알려진) 단백질의 세포외 도메인 또는 (알려진) 가용성 구형 단백질의 도메인을 포함하거나 그로 구성된다.
바람직하게는, 기능적 도메인(관심있는 (폴리)펩티드에 포함됨)은 운반 도메인, 리포터 도메인, 태그, 위치화 도메인, (독립적인) 결합 부위, 효소 또는 효소 도메인, 수용체 또는 이의 기능적 단편, 또는 리간드 또는 이의 기능적 단편를 포함하거나 그로 구성된다.
바람직하게는, 기능적 도메인(관심있는 (폴리)펩티드에 포함됨)은 효소 또는 이의 효소적 도메인을 포함하거나 그로 구성된다. "효소"는 폴리펩티드 또는 단백질 촉매이며, 즉 효소는 일반적으로 화학 반응을 촉진한다. 효소가 작용할 수 있는 분자를 기질이라고 하며 효소는 기질을 생성물로 알려진 다른 분자로 전환한다. 세포의 거의 모든 대사 과정은 생명을 유지하기에 충분히 빠른 속도로 발생하기 위해 효소를 필요로 한다. 바람직한 효소로는 옥시도리덕타제, 트랜스퍼라제, 가수분해효소, 리사제, 아이소머라제 및 리가제가 있다. 이량체를 형성하는 효소의 경우, 관심있는 (폴리)펩티드는 링커에 의해 연결된 두 개의 동일한 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 효소는 특정 부위, 예를 들어, 종양에서 프로드럭을 활성화하는 데 유용할 수 있다. 바람직한 효소의 예 및 이러한 효소를 포함하는 항체의 용도는 다음문헌[Andrady C, Sharma SK, Chester KA; Antibody-enzyme fusion proteins for cancer therapy; Immunotherapy. 2011 Feb;3(2):193-211 and in Boado RJ1, Zhang Y, Zhang Y, Xia CF, Wang Y, Pardridge WM; Genetic engineering of a lysosomal enzyme fusion protein for targeted delivery across the human blood-brain barrier; Biotechnol Bioeng. 2008 Feb 1;99(2):475-84]에 기재되어 있다.
바람직한 효소는 하기의 것들로 이루어진 군에서 선택된다: 탈수소효소, 루시퍼라제, DMSO 환원효소, 알코올 탈수소효소(NAD), 알코올 탈수소효소(NADP), 호모세린 탈수소효소, 아미노프로판올 산화환원효소, 디아세틸 환원효소, 글리세롤 탈수소효소, 프로판디올-인산 탈수소효소, 글리세롤-3-인산 탈수소효소(NAD+), D-자일룰로스 환원효소, L-자일룰로스 환원효소, 젖산 탈수소효소, 말산 탈수소효소, 이소시트레이트 탈수소효소, HMG-CoA 환원효소, 포도당 산화효소, L-굴로놀락톤 산화효소, 티아민 산화효소, 크산틴 산화효소, 아세트알데히드 탈수소효소, 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소, 피루베이트 탈수소효소, 옥소글루타레이트 탈수소효소, 빌리베르딘 환원효소, 모노아민 산화효소, 디하이드로폴레이트 환원효소, 메틸렌테트라하이드로폴레이트 환원효소, 사르코신 산화효소, 디하이드로벤조페난트리딘 산화효소, NADH 탈수소효소, 우레이트 산화효소, 아질산염 환원효소, 질산염 환원효소, 글루타티온 환원효소, 티오레독신 환원효소, 아황산염 산화효소, 사이토크롬 c 산화효소, 코엔자임 Q-사이토크롬 C 환원효소, 카테콜 산화효소, 라카제(Laccase), 시토크롬 c 과산화효소, 카탈라아제, 미엘로퍼옥시다제, 갑상선 과산화효소, 글루타티온 퍼옥시다제, 4-하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제, 레닐라-루시페린 2-모노옥시게나제, 사이프리디나-루시페린 2-모노옥시게나제, 반딧불이 루시페라제, 와타세니아-루시페린 2-모노옥시게나제, 오플로포러스-루시페린 2-모노옥시게나제, 아로마타데, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, 시토크롬 P450 산화효소, 산화질소 디옥시게나제, 산화질소 신타제, 아로마타제, 페닐알라닌 하이드록실라아제, 티로시나아제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제, 세룰로플라스민, 니트로게나제, 탈요오드효소, 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 카테콜-O-메틸 전이효소, DNA 메틸전이효소, 히스톤 메틸트랜스퍼라제, ATCase, 오르니틴 트랜스카바모일라제, 아미노레불린산 신타제, 콜린 아세틸트랜스퍼라제, Factor XIII, 감마 글루타밀 트랜스펩티다아제, 트랜스글루타미나아제, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제, 티아미나제, 알라닌 트랜스아미나제, 아스파테이트 트랜스아미나제, 부티레이트 키나아제, 뉴클레아제, 엔도뉴클레아제, 엑소뉴클레아제, 산 가수분해효소, 포스포리파제 A, 포스포리파제 C, 아세틸콜린에스테라제, 콜린에스테라제, 지단백질 리파제, 유비퀴틴 카르복시-말단 가수분해효소 L1, 포스파타제, 알칼리성 포스파타제, 과당 비스포스파타제, CGMP 특이적 포스포디에스테라 제 5 형, 포스포리파제 D, 제한 효소 제 1 형, 제한 효소 제 2 형, 제한 효소 제 3 형, 제한 효소 제 4 형, 데옥시리보뉴클레아제 I, RNase H, 리보뉴클레아제, 아밀라아제, 수크라아제, 키티나제, 리소자임, 말타아제, 락타아제, 베타-갈락토시다아제, 히알루로니다제, 아데노실메티오닌 하이드롤라제, S-아데노실-L-호모시스테인 하이드롤라제, 알케닐글리세로포스포콜린 가수분해효소, 알케닐글리세로포스포에탄올아민 가수분해효소, 콜레스테롤 -5,6- 옥사이드 가수분해효소, 헤폭실린-에폭사이드 가수분해효소, 이소콜리스마타제, 류코트리엔-A4 하이드롤라제, 리모넨-1,2-에폭사이드 하이드롤라제, 마이크로솜 에폭사이드 하이드롤라제, 트랜스-에폭시숙시네이트 하이드롤라제, 알라닌 아미노펩티다제, 안지오텐신 전환효소, 세린 프로테아제, 키모트립신, 트립신, 트롬빈, Factor X, 플라스민, 아크로신, Factor VII, Factor IX, 프롤릴 올리고펩티다아제, Factor XI, 엘라스타제, Factor XII, 프로테이나제 K, 조직 플라스미노겐 활성화제, 단백질 C, 세파라제, 펩신, 레넷, 레닌, 트립시노겐, 플라스멕신, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 메탈론도펩티다아제, 우레아제, 베타-락타마제, 아르기나제, 아데노신데 아미나제, GTP 사이클로하이드롤라제 I, 니트릴라제, 헬리카제, DnaB 헬리카제, RecQ 헬리카제, ATPase, NaKATPase, ATP 합성효소, 키누레니나제(Kynureninase), 할로아세테이트 데할로게나아제, 리아제, 오르니틴 탈탄산효소, 우리딘 모노포스페이트 합성효소, 방향족-L-아미노산 탈탄산효소, RubisCO, 탄산 탈수효소, 트립토판 합성효소, 페닐알라닌 암모니아 분해효소, 시스타티오닌 감마-분해효소, 시스타티오닌 베타-분해효소, 류코트리엔 C4 합성효소, 디클로로메탄 데할로게나제, 할로히드린 데할로게나제, 아데닐레이트 사이클라제, 구아닐레이트 시클라제, 아미노산 라세마제: 페닐알라닌 라세마제, 세린 라세마제, 만델레이트 라세마제, UDP-글루코스 4-에피머라제, 메틸말로닐 CoA 에피머라제, FKBP: FKBP1A, FKBP1B, FKBP2, FKBP3, FKBP5, FKBP6, FKBP8, FKBP9, FKBP10, FKBP52, FKBPL, 사이클로필린, 파르불린, 프롤릴 이소머라제, 2-클로로-4-카르복시메틸렌부트-2-엔-1,4-올라이드 이소머라제, 베타-카로틴 이소머라제, 파네솔 2-이소머라제, 푸릴푸라미드 이소머라제, 리놀레이트 이소머라제, 말레에이트 이소머라제, 말레아세토아세테이트 이소머라제, 말레일피루베이트 이소머라제, 파불린, 포토이소머라제, 프로리코펜 이소머라제, 프롤릴 이소머라제, 레티날 이소머라제, 레티놀 이소머라제,제타-카로틴 이소머라제, 에노일 CoA 이소머라제, 단백질 이황화 이소머라제, 포스포글루코무타제, 뮤코네이트 사이클로이소머라제, 3-카르복시-시스,시스-뮤코네이트 시클로이소머라제, 테트라히드록시프테리딘 시클로이소머라제, 이노시톨-3-포스페이트 합성효소, 카르복시-시스,시스-뮤코네이트 시클라제, 칼콘 이소머라제, 클로로뮤코네이트 시클로이소머라제, (+)-보르닐 디포스페이트 합성효소, 시클로유카레놀 시클로이소머라제, 알파-피넨-옥사이드 데시클라제, 디클로로뮤코네이트 사이클로이소머라제, 코팔릴 디포스페이트 합성효소, Ent-코팔릴 디포스페이트 합성효소, Syn-코팔릴 디포스페이트 합성효소, 테르펜테디에닐-디포스페이트 합성효소, 할리마디에닐-디포스페이트 합성효소, (S)-베타-마크로카르펜 합성효소, 리코펜 엡실론-시클라제, 리코펜 베타-사이클라제, 프로솔라나피론-III 사이클로이소머라제, D-리보스 피라나제, 스테로이드 델타 이소머라제, 토포이소머라제, 6-카르복시테트라히드로프테린 합성효소, FARSB, 글루타민 합성효소, CTP 합성효소, 아르기니노숙시네이트 합성효소, 피루베이트 카르복실라제, 아세틸-CoA 카르복실라제, 및 DNA 리가제.
보다 바람직한 효소는 카르복시펩티다제, β-락타마제, 사이토신 데아미나제, β-글루쿠로니다제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 그랜자임 B, 카스파제 및 RNase, 예를 들어 HPR(인간 췌장 RNase, 바나제, 소정액 RNase, 온코나제, RapLR1, 안지오게닌, 다이서, DIS3 유사 엑소뉴클레아제 2, 포스포디에스테라아제 ELAC 2, RNase HIII, RNase T2, 및 tRNA 스플라이싱 리보뉴클레아제로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
효소의 기능적 단편은 기능을 매개하는 능력을 갖는 효소의 임의의 단편일 수 있다. 일반적으로 이러한 단편은 "도메인"이라고 한다. 따라서, 효소의 기능적 단편은 효소의 임의의 도메인일 수 있다. 바람직한 예는 전술한 (예시된) 효소의 기능적 단편(예를 들어, 도메인)을 포함한다. 바람직하게는, 기능적 도메인에 포함되는 효소의 기능적 단편은 효소의 촉매 도메인이다. 효소의 촉매 도메인은 이의 기질과 상호작용하여 효소 반응을 일으키는 효소의 영역이다. 예를 들어, 기능적 도메인은 하기의 효소들 중 어느 하나의 촉매 도메인일 수 있다: 카르복시펩티다제, β-락타마제, 사이토신 데아미나제, β-글루쿠로니다제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 그랜자임 B, 카스파제 및 RNase, 예를 들어 HPR(인간 췌장 RNase, 바나제, 소정액 RNase, 온코나제, RapLR1, 안지오게닌, 다이서, DIS3 유사 엑소뉴클레아제 2, 포스포디에스테라아제 ELAC 2, RNase HIII, RNase T2, 및 tRNA 스플라이싱 리보뉴클레아제.
바람직하게는, (관심있는 (폴리)펩티드에 포함된) 기능적 도메인은 운반 도메인을 포함하거나 그로 구성된다. 본원에서 사용되는 "운반 도메인"은 항체를 다른 분자에 접합시키는 아미노산 서열을 의미한다. 바람직한 예에서, 운반 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을, 예를 들어 약물, 영상화제 또는 나노입자의 접합시킨다. 일반적으로, 본 발명의 맥락에서 유용할 수 있는 접합체(conjugate)의 바람직한 예는 다음문헌[Wu, A. M., and Senter, P. D. (2005) Arming antibodies: Prospects and challenges for immunoconjugates. Nat. Biotechnol. 23, 1137-1146]에 기재되어 있다.
예를 들어, 항체에 접합될 수 있는 약물에는 다음문헌[Thomas A, Teicher BA, Hassan R; Antibody-drug conjugates for cancer therapy; Lancet Oncol. 2016 Jun;17(6):e254-62. doi: 10.1016/S1470-2045(16)30030-4]에 기재된 것들과 같은 항암제가 있다. 예를 들어, 항체에 접합될 수 있는 영상화제(imaging agent)는 다음문헌[Steve Knutson, Erum Raja, Ryan Bomgarden, Marie Nlend, Aoshuang Chen, Ramaswamy Kalyanasundaram, and Surbhi Desai; Development and Evaluation of a Fluorescent Antibody-Drug Conjugate for Molecular Imaging and Targeted Therapy of Pancreatic Cancer; PLoS One 2016; 11(6): e0157762]에 기재되어 있다. 이러한 약물은 바람직하게는 세포독성제이다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편에 접합될 수있는 약물의 바람직한 예는 독소루비신, 절단된 슈도모나스 외독소 A, 메이탄시노이드 DM1을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편에 접합될 수 있는 영상화제의 예는 다움문헌[Schubert M, Bergmann R, Forster C, Sihver W, Vonhoff S, Klussmann S, Bethge L, Walther M, Schlesinger J, Pietzsch J, Steinbach J, Pietzsch HJ; Novel Tumor Pretargeting System Based on Complementary l-Configured Oligonucleotides; Bioconjug Chem. 2017 Apr 19;28(4):1176-1188 and in Bhusari P, Vatsa R, Singh G, Parmar M, Bal A, Dhawan DK, Mittal BR, Shukla J; Development of Lu-177-trastuzumab for radioimmunotherapy of HER2 expressing breast cancer and its feasibility assessment in breast cancer patients; Int J Cancer. 2017 Feb 15;140(4):938-947]에 기재된 것들과 같은 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성 동위원소의 바람직한 예는 include 90Y, 131I, 및 177Lu를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편에 접합될 수 있는 영상화제의 추가의 예는 형광 염료, 양자점 및 산화철을 포함한다. 형광 염료의 예는 리포터 도메인으로 아래에 기재된 것들을 포함한다. 산화철 나노 입자의 예는 다움문헌[Hengyi Xu, Zoraida P. Aguilar, Lily Yang, Min Kuang, Hongwei Duan, Yonghua Xiong, Hua Wei, and Andrew Wang: Antibody Conjugated Magnetic Iron Oxide Nanoparticles for Cancer Cell Separation in Fresh Whole Blood. Biomaterials. 2011 Dec; 32(36): 9758-9765]에 기재되어 있다.
항체 접합체(즉, 다른 분자에 접합된 항체)는 당업계에 알려져 있다. 특히, 항체에 접합된 분자는 절단 가능하거나 절단 불가능한 링커에 의해 항체에 연결될 수 있다(예를 들어, 다음문헌[Thomas H. Pillow. Novel linkers and connections for antibody-drug conjugates to treat cancer and infectious disease. Pharmaceutical Patent Analyst Vol. 6, No. 1, February 3rd, 2017, https://doi.org/10.4155/ppa-2016-0032; 또는 Beck A, Goetsch L, Dumontet C, Corvaia N. Strategies and challenges for the next generation of antibody-drug conjugates. Nat Rev Drug Discov. 2017 May;16(5):315-337)]에 기재되어 있다). 분자를 항체 또는 항원 결합 단편에 연결하는데 사용될 수 있는 이러한 링커의 예는 예를 들어 EP 2927227호 및 다음문헌[Thomas H. Pillow. Novel linkers and connections for antibody-drug conjugates to treat cancer and infectious disease. Pharmaceutical Patent Analyst Vol. 6, No. 1, February 3rd, 2017, https://doi.org/10.4155/ppa-2016-0032]에 기재되어 있다. 그러나, 선행 기술에서 링커는 항체의 Ig-도메인(즉, 항체의 가변 및/또는 불변 도메인)에 직접 부착되어 항체의 Ig-도메인의 기능을 방해할 수 있다. 이를 고려하여, 기능적 도메인이 항체에의 링커의 부착에 사용될 수 있다. 바람직한 링커는 추가의 시스테인 또는 리신을 포함하도록 조작된다는 점에서 "고전적인"링커와 다르다. 바람직하게는, 운반 도메인은 예를 들어 다음문헌[Link AJ, Mock ML, Tirrell DA. Non-canonical amino acids in protein engineering. Curr Opin Biotechnol. 2003 Dec;14(6):603-9]에 기재된 바와 같이, 부위 특이적 접합에 유용한 하나 이상의 비정규 아미노산을 포함한다. 더욱이, 운반 도메인은 다음문헌[section 6 of Dennler P., Fischer E., Schibli R. Antibody conjugates: From heterogeneous populations to defined reagents. Antibodies. 2015;4:197-224]에 기재된 바와 같이 접합에 사용될 수 있는 특정 아미노산을 변형하는 특정 효소(예를 들어, 포르밀글리신 생성 효소, 소타제 및/또는 트랜스글루타미나제)에 의해 인식되도록 설계될 수 있다.
추가의 바람직한 운반 도메인은 예를 들어 다음문헌[Pichichero ME: Protein carriers of conjugate vaccines: characteristics, development, and clinical trials, Hum Vaccin Immunother. 2013 Dec;9(12):2505-23]에 기재된 바와 같이, 디프테리아 독소, 파상풍 톡소이드(T), 수막 구균 외막 단백질 복합체(OMPC), 디프테리아 톡소이드(D) 및 H. 인플루엔자 단백질D(HiD의 유전적으로 변형된 교차 반응물질(CRM)과 같은 접합을 위한 도메인이다.
바람직하게는, 기능적 도메인(관심있는 (폴리)펩티드에 포함됨)은 리포터 도메인을 포함하거나 이로 구성된다. 리포터 도메인은 일반적으로 리포터 유전자에 의해 암호화된다. 리포터 도메인은 그의 존재(예를 들어 세포, 유기체에서)를 쉽게 관찰될 수 있는 도메인이다. 리포터 도메인에는 예를 들어, GFP/EGFP(녹색 형광 단백질/향상된 녹색 형광 단백질), YFP(노란색 형광 단백질), RFP(tdTomato 또는 DsRed와 같은 적색 형광 단백질) 및 CFP(시안 형광 단백질)와 같은 형광 단백질, 루시퍼라제 및 베타-갈라토시다제 및 퍼옥시다제와 같은 효소를 포함한다. 리포터 도메인은 생체내 및 생체외 접근 방식에 유용할 수 있다. 예를 들어, 형광 단백질은 특정 파장의 빛으로 여기될 때 세포가 형광을 발하게하고, 루시퍼라제는 세포가 빛을 생성하는 반응을 촉매하도록하며, 베타-갈락토시다아제와 같은 효소는 기질을 착색된 생성물로 전환시킨다. 특정 리포터 및 원하는 특성화 데이터의 종류에 따라 리포터를 측정하거나 정량화하는 여러 가지 방법이 있다. 일반적으로 현미경 검사는 특히 단일 세포 수준에서 리포터 활성에 대한 공간 및 시간 정보를 얻는데 유용하다. 유세포 분석기는 큰 세포 집단에서 리포터 활성의 분포를 측정하는데 가장 적합하다. 플레이트 판독기는 일반적으로 시간이 지남에 따라 다양한 샘플의 모집단 평균 측정을 수행하는데 가장 적합하다. 주어진 기질에 반응할 수 있는 베타-갈 락토시다제 및 퍼옥시다제와 같은 효소는 예를 들어 종양 진단에서 예를 들어 인간 샘플의 생체외 염색에 유용할 수 있다. 그러나, 몇몇 구체예에서, 관심있는 (폴리)펩티드는 GFP(녹색 형광 단백질) 또는 RFP(적색 형광 단백질, 예컨대 tdTomato 또는 DsRed)를 포함하지 않는다. 보다 일반적으로, 몇몇 구체예에서, 관심있는 (폴리)펩티드는 형광 (리포터) 단백질을 포함하지 않는다. 따라서, 몇몇 구체예에서, DNA 분자는 GFP 또는 RFP(또는 보다 일반적으로는 형광 (리포터) 단백질)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
바람직하게는, 리포터 도메인은 GFP/EGFP, YFP, RFP, CFP, 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제 또는 퍼옥시다제를 암호화하는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다. 또한 아래에 설명된 형광 태그도 리포터 도메인으로 유용하다.
바람직하게는, 기능적 도메인(관심있는 (폴리)펩티드에 포함됨)은 위치화(localization) 도메인을 포함하거나 그로 구성된다. 일반적으로 위치화 도메인은 예를 들어 유기체 또는 세포 수준에서 단백질을 특정 표적으로 유도한다. 위치화 도메인은 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 세포의 특정 물리적 위치, 예를 들어 핵, 막, 주변세포질, 세포 외부 분비물, 신체의 특정 부분 등으로 유도할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 세포 내로 유도하기 위해, 기능적 도메인은 세포 투과 펩티드(cell penetrating peptide)를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 용어 "세포 투과 펩티드" ("CPP", "단백질 전달 도메인"/"PTD"라고도 함)는 일반적으로 원형질막을 통해 다양한 유형의 화물(cargo) 분자를 수송함으로써 다양한 분자 화물(나노 크기 입자에서 작은 화학 분자 및 큰 DNA 조각까지)의 세포 흡수를 촉진할 수 있는 짧은 펩티드를 의미하기 위해 사용된다. 세포 투과 펩티드는 일반적으로 라이신 또는 아르기닌과 같은 양전하를 띤 아미노산을 비교적 많이 함유하거나 극성/대전 아미노산과 비극성, 소수성 아미노산의 교대 패턴을 포함하는 서열을 갖는 아미노산 조성을 갖는다. 이러한 두 가지 유형의 구조를 각각 다가양이온성 또는 양친매성이라고 한다. 일반적으로, 세포 투과 펩티드(CPP)는 세포막을 통과하여 대부분의 세포 유형에 유입될 수 있는 8 내 50개 잔기의 펩티드이다. 또는, 이들은 천연 단백질에서 발생하므로 그의 기원을 반영하여 단백질 전달 도메인(PTD)이라고도 한다. Frankel과 Pabo는 Green과 Lowenstein에게 동시에, 인간 면역 결핍 바이러스 1(HIV-TAT)의 트랜스-활성화 전사 활성화제가 세포에 침투하는 능력을 설명했다(Frankel, A.D. and C.O. Pabo, Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell, 1988. 55(6): p. 1189-93). 1991년에, 노랑초파리 유래의 안테노페디아 호메오도메인(Antennapedia homeodomain)(DNA 결합 도메인)의 신경 세포에의 형질도입이 설명되었다(Joliot, A., et al., Antennapedia homeobox peptide regulates neural morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(5): p. 1864-8). 1994 년에 페네드레틴(Penetratin)이라는 최초의 16-mer 펩티드 CPP가 안테나페디아의 호메오도메인으로부터 특성규명되었다(Derossi, D., et al., The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J Biol Chem, 1994. 269(14): p. 10444-50). 그후 1998년에, 단백질 형질도입에 필요한 TAT의 최소 도메인이 확인되었다(Vives, E., P. Brodin, and B. Lebleu, A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem, 1997. 272(25): p. 16010-7). 지난 20년 동안, 바이러스 단백질, 예를 들어 VP22(Elliott, G. and P. O'Hare, Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell, 1997. 88(2): p. 223-33), 독(venom), 예를 들어 멜리틴(Dempsey, C.E., The actions of melittin on membranes. Biochim Biophys Acta, 1990. 1031(2): p. 143-61), 마스트포란(Konno, K., et al., Structure and biological activities of eumenine mastoparan-AF (EMP-AF), a new mast cell degranulating peptide in the venom of the solitary wasp (Anterhynchium flavomarginatum micado). Toxicon, 2000. 38(11): p. 1505-15), 마우로칼신(Esteve, E., et al., Transduction of the scorpion toxin maurocalcine into cells. Evidence that the toxin crosses the plasma membrane. J Biol Chem, 2005. 280(13): p. 12833-9), 크로타민(Nascimento, F.D., et al., Crotamine mediates gene delivery into cells through the binding to heparan sulfate proteoglycans. J Biol Chem, 2007. 282(29): p. 21349-60) 또는 부포린(Kobayashi, S., et al., Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry, 2004. 43(49): p. 15610-6)포함한 다양한 기원 유래의 수십 개의 펩타이드가 설명되었다. 또한, 폴리아르기닌 (R8, R9, R10 and R12)(Futaki, S., et al., Arginine-rich peptides. An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery. J Biol Chem, 2001. 276(8): p. 5836-40) 또는 트랜스포르탄(Pooga, M., et al., Cell penetration by transportan. FASEB J, 1998. 12(1): p. 67-77)을 포함한 합성 CPP가 디자인되었다. 전술한 CPP 중 임의의 것은 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편에서 세포 투과 펩티드로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편에서 세포 투과 펩티드로 사용될 수 있는 다양한 CPP가 다음문헌[Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60, 2012]에 개시되어 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편에 사용될 수있는 위치화 도메인의 또 다른 예는 예를 들어 다음문헌[Farrington GK, Caram-Salas N, Haqqani AS, Brunette E, Eldredge J, Pepinsky B, Antognetti G, Baumann E, Ding W, Garber E, Jiang S, Delaney C, Boileau E, Sisk WP, Stanimirovic DB. A novel platform for engineering blood-brain barrier-crossing bispecific biologics. FASEB J. 2014 Nov;28(11):4764-78]에 기재된 바와 같이 혈뇌 장벽을 가로지르는 도메인이다.
위치화 도메인의 또 다른 예는 핵 위치화 도메인이다. 핵 위치화 도메인은 단백질, 특히 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 세포 핵으로 유도한다. 핵 위치화 도메인은 항체 또는 항원 결합 단편이 전사 인자의 활성을 차단하고 유전자 발현을 조절하도록 하는데 유용할 수 있다. 핵 위치화 도메인의 바람직한 예는 다음문헌[Kalderon D, Roberts BL, Richardson WD, Smith AE (1984) "A short amino acid sequence able to specify nuclear location" Cell 39 (3 Pt 2): 499-509 and in Lusk CP, Blobel G, King MC (May 2007) "Highway to the inner nuclear membrane: rules for the road" Nature Reviews Molecular Cell Biology 8 (5): 414-20]에 기재되어 있다.
바람직하게는, 기능적 도메인 (관심있는 (폴리)펩티드에 포함됨)은 태그를 포함하거나 그로 구성된다. 더 바람직하게는, 태그는 친화성 태그, 가용화 태그, 크로마토그래피 태그, 에피토프 태그 또는 형광 태그이다.
태그는 재조합 단백질에 그라프트된 펩티드 서열이다. 태그의 예로는 친화성 태그, 가용화 태그, 크로마토그래피 태그, 에피토프 태그, 형광 태그 및 단백질 태그가 있다. 친화성 태그는 친화성 기술을 사용하여 미정제 생물학적 공급원으로부터 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다. 친화성 태그의 예로는 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP) 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)가 있다. 추가의 예는 금속 매트릭스에 결합하는 폴리(His) 태그이다. 가용화 태그는 특히 대장균과 같은 샤페론이 부족한 종에서 발현되는 재조합 단백질에 사용되어 단백질의 적절한 접힘을 돕고 침전을 방지할 수 있다. 가용화 태그의 예로는 티오레독신(TRX) 및 폴리(NANP)가 있다. 크로마토그래피 태그를 사용하여 단백질의 크로마토그래피 특성을 변경하여 특정 분리 기법에 따라 다른 해상도를 제공할 수 있다. 크로마토그래피 태그는 종종 FLAG-태그와 같은 다중음이온성 아미노산으로 구성된다. 에피토프 태그는 고친화성 항체가 다양한 종에서 안정적으로 생산될 수 있기 때문에 선택되는 짧은 펩티드 서열이다. 이들은 일반적으로, 그의 높은 면역반응성을 설명하는 바이러스 유전자에서 유래된다. 에피토프 태그에는 V5-태그, Myc-태그, HA-태그 및 NE-태그가 있다. 이러한 태그는 항체 정제에도 사용되지만 웨스턴 블 롯팅, 면역 형광 및 면역 침강 실험에 특히 유용하다. 형광 태그는 단백질에 대한 시각적 판독을 제공하는데 사용될 수 있다. GFP 및 이의 변이체는 가장 일반적으로 사용되는 형광 태그이다. GFP는 접힘(folding) 리포터로 사용될 수 있다(접힌 경우 형광, 그렇지 않으면 무색). 단백질 태그는 특정 효소적 변형(예를 들어, 비오틴 리가아제에 의한 비오틴화) 또는 화학적 변형(예를 들어, 형광 이미징을 위한 FlAsH-EDT2와의 반응)을 가능하게 한다. 예를 들어, 태그는 단백질을 여러 다른 구성요소에 연결하기 위해 결합될 수 있다. 태그는 화학 작용제에 의해 또는 단백질 분해 또는 인테인 스플라이싱과 같은 효소적 수단에 의해 제거될 수 있다.
태그의 바람직한 예로는 하기의 것들이 있으나 이에 제한되지 않는다: twin-Strep-Tag(SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK; 서열번호 65); 효소 BirA에 의한 비오틴화를 가능하게 하여 단백질이 스트렙타비딘에 의해 분리될 수 있도록 하는 펩티드인 AviTag(GLNDIFEAQKIEWHE; 서열번호 66); 칼모둘린 단백질에 결합되는 펩티드인 칼모둘린-태그(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL; 서열번호 67); Mono-Q와 같은 음이온 교환 수지에 효율적으로 결합하는 펩티드인 폴리글루타메이트 태그(EEEEEE; 서열번호 68); 항체에 의해 인식되는 펩티드인 E-태그(GAPVPYPDPLEPR; 서열번호 69); 항체에 의해 인식되는 펩티드인 FLAG-태그(DYKDDDDK; 서열번호 70); 항체에 의해 인식되는 혈구응집소 유래의 펩티드인 HA-태그(YPYDVPDYA; 서열번호 71); 니켈 또는 코발트 킬레이트에 결합되는 5 내지 10개 히스티딘인 His-태그(HHHHHH; 서열번호 72); 항체에 의해 인식되는 c-myc 유래의 펩티드인 Myc-tag(EQKLISEEDL; 서열번호 73); 웨스턴 블롯팅, ELISA, 유세포 분석, 면역 세포 화학, 면역 침전 및 재조합 단백질의 친화성 정제를 포함한 광범위한 응용 분야에서 유용한 것으로, 단일 클론 IgG1 항체에 의해 인식되는 18개 아미노산 합성 펩티드인 NE-태그(TKENPRSNQEESYDDNES; 서열번호 74); 리보뉴클레아제 A에서 유래된 펩티드인 S-태그(KETAAAKFERQHMDS; 서열번호 75); 스트랩타비딘에 결합하는 펩티드인 SBP-태그(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP; 서열번호 76); 포유동물 발현을 위한 Softag 1(SLAELLNAGLGGS; 서열번호 77); 원핵세포 발현을 위한 Softag 3(TQDPSRVG; 서열번호 78); 스트랩타비딘 또는 스트랩탁틴이라고 불리는 변형된 스트랩타비딘에 결합하는 펩티드인 Strep-태그(Strep-tag II: WSHPQFEK; 서열번호 79); FlAsH 및 ReAsH 비아르세니칼(biarsenical) 화합물에 의해 인식되는 테트라시스테인 태그인 TC 태그(CCPGCC; 서열번호 80); 항체에 의해 인식되는 펩티드인 V5 태그(GKPIPNPLLGLDST; 서열번호 81); 항체에 의해 인식되는 펩티드인 VSV-태그(YTDIEMNRLGK; 서열번호 82); Xpress 태그(DLYDDDDK; 서열번호 83); pilin-C 단백질에 공유 결합하는 펩티드인 Isopeptag(TDKDMTITFTNKKDAE; 서열번호 84); SpyCatcher 단백질에 공유 결합하는 펩티드인 SpyTag(AHIVMVDAYKPTK; 서열번호 85); SnoopCatcher 단백질에 공유 결합하는 펩티드인 SnoopTag(KLGDIEFIKVNK; 서열번호 86); Ty1 태그(EVHTNQDPLD; 서열번호 87); 스트랩타비딘에 의한 인식을 가능하게 하는 BirA에 의해 비오틴화된 단백질 도메인인 BCCP(Biotin Carboxyl Carrier Protein); 고정화된 글루타티온에 결합하는 단백질인 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)-태그; 자발적으로 형광을 내고 나노바디에 의해 결합될 수 있는 단백질인 녹색 형광 단백질-태그; 반응성 할로알칸 기질에 공유적으로 부착되고 다양한 기질에의 부착을 가능하게 하는 돌연변이된 박테리아 할로알칸 탈할로게나아제인 HaloTag; 아밀로스 아가로스에 결합하는 단백질인 말토스 결합 단백질(MBP)-태그; Nus(N-이용 물질)-태그; 티오렉신(Trx)-태그; Fasciola hepatica 8-kDa 항원 (Fh8)-태그; 작은 유비퀴틴 변형(SUMO)-태그; 가용성-향상 펩티드 서열(SET)-태그; 단백질 G의 IgG 도메인(GB1)-태그; 단백질 A의 IgG 반복 도메인ZZ(ZZ)-태그; 가용성 향상 유비퀴틴 태그(SNUT)-태그; 17 킬로달톤 단백질(Skp)-태그; 파지 T7 단백질 키나제(T7PK)-태그; 대장균 분비 단백질 A(EspA)-태그; 단량체성 박테리오피지 T7 0.3 단백질(Orc 단백질)/Mocr-태그; 대장균 트립신 억제제(Ecotin)-태그; 칼슘 결합 단백질(CaBP)-태그; 스트레스 반응성 아르세네이트 환원효소(ArsC)-태그; 전사 개시 인자 IF2의 N-말단 단편(IF2-도메인 I)-태그; Expressivity tag(전사 개시 인자 IF2의 N-말단 단편); 스트레스 반응성 단백질인 RpoA, SlyD, Tsf, RpoS, PotD, Crr-태그; 대장균 산성 단백질인 msyB, yjgD, rpoD 태그(예를 들어, Costa S, Almeida A, Castro A, Domingues L. Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system. Frontiers in Microbiology. 2014;5:63, in particular Table 1 in Costa et al., 2014 참조).
따라서, 태그는 서열번호 65 내지 87 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열 또는 이의 서열 변이체를 포함하거나 그로 구성되는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 태그는 특히 서열번호 65 또는 79에 따른 Strep-태그이다.
바람직하게는, 기능적 도메인(관심있는 (폴리)펩티드에 포함됨)은 수용체 또는 이의 기능적 단편("수용체 도메인"이라고도 함)을 포함하거나 그로 구성된다. "수용체"는 특정 (신호) 분자, 이의 리간드에 결합하고 예를 들어 세포에서 반응을 개시할 수있는 폴리펩티드 또는 단백질이다. 본질적으로, 수용체는 특히 세포막(세포 표면 수용체) 또는 세포내(세포내 수용체) 상에 또는 안에 위치한다. 바람직한 수용체는 이온 채널 연결(이온성) 수용체, G 단백질 연결(대사성) 호르몬 수용체 및 효소-연결 호르몬 수용체, 세포질 수용체 및 핵 수용체를 포함한다. 이량체를 형성하는 수용체의 경우, 관심있는 (폴리)펩티드는 링커에 의해 연결된 두 개의 동일한 도메인을 포함할 수 있다.
바람직한 수용체는 Ig-유사 도메인을 포함하는 수용체이다. 특히, 수용체는 Ig-유사 도메인을 포함하는 억제 수용체 또는 Ig-유사 도메인을 포함하는 활성화 수용체일 수 있다. Ig- 유사 도메인을 포함하는 억제 수용체의 바람직한 예로는 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1 또는 PD1), 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4), B- 및 T- 림프구 감쇠제(BTLA), T-세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유 -3(TIM- 3; A형 간염 바이러스 세포 수용체 2(HAVCR2)로도 알려짐), Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT), 세포 표면 당단백질 CD200 수용체 1(CD200R1), 2B4(CD244; SLAMF4), Trem(골수성 세포에서 발현되는 트리거링 수용체)-유사 전사체 2(TLT2), 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 멤버 4(LILRB4) 및 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 2개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 꼬리 2(KIR2DL2)가 있다. Ig-유사 도메인을 포함하는 활성화 수용체의 바람직한 예에는 유도성 T 세포 COStimulator(ICOS) 및 CD28이 있다. 특히 바람직하게는, 수용체는 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1 또는 PD1) 또는 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM)이다.
추가의 바람직한 수용체는 예를 들어 다음문헌[Heaney ML, Golde DW. Soluble receptors in human disease. J Leukoc Biol. 1998 Aug;64(2):135-46]에 개시된 바와 같은 가용성 수용체이다. 이의 예로는 TNFR(종양 괴사 인자 수용체), p55, p75, Fas (CD95), 신경 성장 인자 수용체, CD27, CD30, 성장 호르몬 수용체, GM-CSF 수용체, 에리트로포이에틴 수용체(EpoR), 트롬보포이에틴 수용체, G-CSF 수용체, IL-1RI(인터루킨 1 수용체 I), IL-1RII(인터루킨 1 수용체 II), IL-2Rα(인터루킨 2 수용체 α, Tac, CD25), IL-4R(인터류킨 4 수용체), IL-5Rα(인터류킨 5 수용체 α), IL-7R(인터류킨 7 수용체), IL-6Rα(인터류킨 6 수용체 α), gp130, CNTFR(섬모신경 영양 인자 수용체), LIFR(백혈병 억제 인자 수용체), 렙틴 수용체, IL-11R(인터루킨 11 수용체), IL-12 p40(인터루킨 12 수용체 p40), 줄기 세포 인자 수용체(c-kit), 인터페론 수용체, 리포다당류 수용체(CD14), 보체 수용체 I 형(CD35), 히알루로네이트 수용체(CD44), CD58, IgE 수용체(FceRII, CD23), IgG 수용체(FcgRII), ICAM-1(CD54), ICAM-3(CD50), 형질 전환 성장 인자 β 수용체 III, 표피 성장 인자 수용체(c-erb B), 혈관 내피 성장 인자 수용체, 혈소판 유래 성장 인자 수용체, 섬유아세포 성장 인자, 콜로니 자극 인자-1 수용체(MCFR, c-fms), ARK(아드레날린 수용체 키나제), Tie타이(안지오포이에틴 수용체), 인슐린 수용체, 인슐린 유사 성장 인자 II 수용체, 및 만노스 6-포스페이트 수용체가 있다.
보다 바람직하게는, 가용성 수용체는 가용성 사이토카인 수용체, 예컨대 클래스 I 사이토카인 수용체 수퍼패밀리 수용체, 클래스 II 사이토카인 수용체 수퍼패밀리 수용체, IL-1/TLR 패밀리 수용체, TGF-β 수용체 패밀리 수용체, TNFR 수퍼패밀리 수용체, 또는 IL-17R 이다. 클래스 I 사이토카인 수용체 수퍼패밀리의 바람직한 수용체로는 IL-4Rα, IL-5Rα, IL-6Rα, IL-7Rα, IL-9Rα, EpoR, G-CSFR, GM-CSFRα, gp130, 및 LIFRα이 있다. 클래스 II 사이토카인 수용체 수퍼패밀리의 바람직한 수용체는 IFNAR1 및 IFNAR2α와 같은 I 형 IFNR을 포함한다. IL-1/TLR 패밀리의 바람직한 수용체는 IL-1RII 및 IL-1RacP를 포함한다. TGF-β 수용체 패밀리의 바람직한 수용체는 TβR-1 및 액티빈 수용체 유사 키나제 7을 포함한다. NFR 수퍼 패밀리의 바람직한 수용체는 TNFRSF6/Fas/CD95 및 TNFRSF9/4-1BB/CD137을 포함한다. 따라서, 사이토카인 수용체의 바람직한 예는 IL-4Rα, IL-5Rα, IL-6Rα, IL-7Rα, IL-9Rα, EpoR, G-CSFR, GM-CSFRα, gp130, LIFRα, IFNAR1, IFNAR2α, IL-1RII, IL-1RacP, TβR-I, 액티빈 수용체-유사 키나제 7, TNFRSF6/Fas/CD95, TNFRSF9/4-1BB/CD137 및 IL-17R를 포함한다. 이러한 수용체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 기능적 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편은 그 항체가 표적에 도달하면서 염증 반응을 조절할 수 있다. 예를 들어, 다양한 자극에 반응하여 단백질분해 절단에 의해 주로 생성되는 가용성 유형 II IL-1 수용체(sIL-1RII)는 IL-1β에 우선적으로 결합하여 과도한 IL-1 생물활성을 약화시킬 수 있다. 예를 들어, 가용성 IL-1RAcP는 엑토도메인 절단보다는 대체 스플라이싱에 의해 생성된다. 예를 들어, 가용성 IL-6 수용체는 막 IL-6R과 유사한 친화도로 IL-6에 결합하여 IL-6 반감기를 연장시킨다.
수용체의 기능적 단편은 기능을 매개하는 능력을 갖는 수용체의 임의의 단편일 수 있다. 일반적으로 이러한 단편을을 "도메인"이라고 한다. 따라서, 수용체의 기능적 단편은 수용체의 임의의 도메인일 수 있다. 바람직한 예는 전술한(예시 된) 수용체의 기능적 단편(예를 들어, 도메인)을 포함한다. 바람직하게는, 기능적 도메인에 포함된 수용체의 기능적 단편은 수용체의 세포외 도메인이다. 예를 들어, 기능적 도메인은 하기의 수용체 중 어느 하나의 세포외 도메인일 수 있다: IL-4Rα, IL-5Rα, IL-6Rα, IL-7Rα, IL-9Rα, EpoR, G-CSFR, GM-CSFRα, gp130, LIFRα, IFNAR1, IFNAR2α, IL-1RII, IL-1RacP, TβR-I, 액티빈 수용체-유사 키나제 7, TNFRSF6/Fas/CD95, TNFRSF9/4-1BB/CD137, IL-17R, p55, p75, 신경 성장 인자 수용체, CD27, CD30, 성장 호르몬 수용체, 트롬보포이에틴 수용체, IL-1RI(인터류킨 1 수용체 I), IL-2Rα(인터류킨 2 수용체 α, Tac, CD25), CNTFR(섬모신경 영양 인자 수용체), 렙틴 수용체, IL-11R(인터루킨 11 수용체), IL-12 p40(인터루킨 12 수용체 p40), 줄기 세포 인자 수용체(c-kit), 인터페론 수용체, 리포다당류 수용체(CD14), 보체 수용체 I 형(CD35), 히알루로네이트 수용체(CD44), CD58, IgE 수용체(FceRII, CD23), IgG 수용체(FcgRII), ICAM-1 (CD54), ICAM-3(CD50), 형질 전환 성장 인자 β 수용체 III, 표피 성장 인자 수용체(c-erb B), 혈관 내피 성장 인자 수용체, 혈소판 유래 성장 인자 수용체, 섬유모세포 성장 인자, 콜로니 자극 인자 -1 수용체(MCFR, c-fms), ARK(아드레날린 수용체 키나제), Tie(안지오포이에틴 수용체), 인슐린 수용체, 인슐린 유사 성장 인자 II 수용체, 및 만노스 6- 포스페이트 수용체.
바람직하게는, 기능적 도메인에 포함되는 수용체의 기능적 단편은 Ig-유사 도메인이다. 예를 들어, 기능적 도메인은 다음 수용체 PD1, SLAM, LAIR1, CTLA4, BTLA, TIM-3, TIGIT, CD200R1, 2B4 (CD244), TLT2, LILRB4, KIR2DL2, ICOS 또는 CD28 중 어느 하나의 Ig-유사 도메인일 수 있다. 바람직하게는, 기능적 도메인은 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 가장 바람직하게는, 수용체는 PD1, SLAM, 또는 LAIR1(의 단편), 예를 들어 서열번호 88 내지 90 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열 또는 이의 서열 변이체를 포함하거나 그로 구성된다.
더욱이, 기능적 도메인은 WO 2016/207402 A1호에 기재된 바와 같이 돌연변이된 백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체 1(LAIR1) 단편을 포함하거나 그로 구성되는 것이 특히 바람직하다. 서열 번호 88에 나타낸 돌연변이 LAIR1 단편, 또는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 아주 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱더 바람직하게는 90%, 특히 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체가 바람직하다.
돌연변이 LAIR1 단편:
EDLPRPSISAEPGTVIPLGSHVTFVCRGPVGVQTFRLERERNYLYSDTEDVSQTSPSESEARFRIDSVNAGNAGLFRCIYYKSRKWSEQSDYLELVVK
[서열번호 88]
특히 바람직하게는 (관심있는 (폴리)펩티드에 포함된) 기능적 도메인은 PD1 또는 SLAM의 Ig-유사 단편, 예를 들어 서열번호 89 또는 서열번호 90에 기재된 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 아주 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱더 바람직하게는 90%, 특히 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 서열 동일성을 그의 서열 변이체를 포함하거나 그로 구성된다.
PD-1 단편:
DSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVT
[서열번호 89]
SLAM 단편:
EQVSTPEIKVLNKTQENGTCTLILGCTVEKGDHVAYSWSEKAGTHPLNPANSSHLLSLTLGPQHADNIYICTVSNPISNNSQTFSPWPGCRTDPS
[서열번호 90]
바람직하게는, 기능적 도메인(관심있는 (폴리)펩티드에 포함됨)은 리간드 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 그로 구성된다. "리간드"는 단백질 또는 다른 분자의 특정 부위에 특이적으로 결합하는 분자이다. 본 발명의 맥락에서, 리간드는 관심있는 (폴리)펩티드에 포함되기 때문에 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이다. 리간드의 결합은 특히 이온 결합, 수소 결합 및 반 데르 바알스 힘과 같은 분자간 힘에 의해 발생한다. 리간드의 바람직한 예는 전술한 리간드, 특히 하기의 수용체 중 어느 하나의 리간드 및 시토카인이다: PD1, SLAM, LAIR1, CTLA4, BTLA, TIM-3, TIGIT, CD200R1, 2B4 (CD244), TLT2, LILRB4, KIR2DL2, ICOS 또는 CD28, 예를 들어 PD-L1, PD-L2, B7-1, B7-2, B7-H4 (B7 상동체), 갈렉틴-9, 폴리오바이러스 수용체(PVR), OX-2 막 당단백질, CD48, B7-H3(B7 상동체), MHCI, 및 ICOS-L.
바람직하게는, 리간드는 사이토카인 또는 이의 기능적 단편이다. 사이토카인은 일반적으로 세포 신호 전달에 중요한 작은 단백질(~ 5 내지 20 kDa)이다. 이들은 세포에 의해 방출되고 다른 세포의 행동에 영향을 미치며 때로는 방출 세포 자체의 거동에 영향을 미친다. 사이토카인은 사이토카인의 SIS 패밀리, 사이토카인의 SIG 패밀리, 사이토카인의 SCY 패밀리, 혈소판 인자-4 수퍼패밀리 및 인터크린, CC 케모카인 리간드(CCL)-1 내지 -28(특히 CCL12), CXCL1-CXCL17, XCL1 (림포탁틴-α) 및 XCL2(림포탁틴-β), 프랙탈카인(또는 CX3CL1)와 같은 케모카인; I형 IFN, II형 IFN 및 III형 IFN, 특히 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IFN-ε, IFN-β, IFN-β, IL10R2(CRF2-4라고도 함) 및 IFNLR1( CRF2-12라고도 함)과 같은 인터페론; IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, 및 IL-36와 같은 인터루킨; IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, GM-CSF, 및 인터페론-감마와 같은 림포카인; CD40LG (TNFSF5); CD70 (TNFSF7); EDA; FASLG (TNFSF6); LTA (TNFSF1); LTB (TNFSF3); TNF, TNFα, TNFSF4 (OX40L); TNFSF8 (CD153); TNFSF9; TNFSF10 (TRAIL); TNFSF11 (RANKL); TNFSF12 (TWEAK); TNFSF13; TNFSF13B; TNFSF14; TNFSF15 및 TNFSF18와 같은 종양 괴사 인자; CSF1("대식세포 콜로니-자극 인자"라고도 함), CSF2( "과립구 대식세포 콜로니 자극 인자"라고도 함; GM-CSF 및 sargramostim), CSF3("과립구 콜로니-자극 인자"라고도 함)과 같은 콜로니 자극 인자 자극 인자"; G-CSF 및 필그라스팀(filgrastim)) 뿐만 아니라 프로메가포이에틴(Promegapoietin)과 같은 합성 CSF로부터 선택될 수 있다. 따라서, 사이토카인의 바람직한 예로는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36, CCL-1, CCL-2, CCL-3, CCL-4, CCL-5, CCL-6, CCL-7, CCL-8, CCL-9, CCL-10, CCL-11, CCL-12, CCL-13, CCL-14, CCL-15, CCL-16, CCL-17, CCL-18, CCL-19, CCL-20, CCL-21, CCL-22, CCL-23, CCL-24, CCL-25, CCL-26, CCL-27, CCL-28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL2, 프랙탈카인, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IFN-ε, IFN-κ, IFN-ω, IL10R2, IFNLR1, CD40LG, CD70, EDA, FASLG(TNFSF6), LTA(TNFSF1), LTB(TNFSF3), TNFα, TNFSF4(OX40L), TNFSF8(CD153), TNFSF9, TNFSF10(TRAIL), TNFSF11(RANKL), TNFSF12(TWEAK), TNFSF13, TNFSF13B, TNFSF14, TNFSF15, TNFSF18, CSF1, CSF2(GM-CSF), 및 CSF3(G-CSF)이 있다. 사이토카인의보다 바람직한 예는 IL-2, IL6, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, 인터페론, GM-CSF 및 TNF를 포함한다. 사이토카인은 대식세포, B 림프구, T 림프구 및 비만 세포와 같은 면역 세포뿐만 아니라 내피 세포, 섬유 아세포 및 다양한 간질 세포를 포함한 광범위한 세포에 의해 생성되며, 이에 따라 주어진 사이토 카인은 하나 이상의 세포 유형에 의해 생성될 수 있다. 이러한 사이토카인 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 기능적 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편은 선택된 사이토카인에 따라 전염증 면역 자극 반응 또는 항염증 면역 억제 또는 세포 독성 반응을 유발할 수 있다.
다른 바람직한 리간드로는 예를 들어 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질인 호르몬이 있다. 호르몬은 신호전달 분자로, 순환계에 의해 운반되어 먼 기관을 표적하여 특히 생리상태 및 거동을 조절한다. 호르몬은 일반적으로 다세포 유기체의 땀샘에서 생성된다. 특히 바람직한 호르몬은 (인간) 성장 호르몬이다. 호르몬의 추가의 예로는 TRH, 바소프레신, 인슐린, 프로락틴, ACTH, 옥시토신, 심방 나트륨 이뇨 펩티드(ANP), 글루카곤, 소마토스타틴, 콜레시스토키닌, 가스트린, 렙틴, 안지오텐신 II, 염기성 섬유 아세포 성장 인자-2, 및 부갑상선 호르몬 관련 단백질이 있다.
리간드의 기능적 단편은 기능을 매개하는 능력을 갖는 리간드의 임의의 단편일 수 있다. 일반적으로 이러한 단편을 "도메인"이라고 한다. 따라서, 리간드의 기능적 단편은 리간드의 임의의 도메인일 수 있다. 바람직한 예로는 상기 기재된 (예시된) 리간드의 기능적 단편(예를 들어, 도메인)을 포함한다. 바람직하게는, 기능적 도메인에 포함되는 리간드의 기능적 단편은 Ig-유사 도메인이다.
바람직하게는, (관심있는 (폴리)펩티드에 포함된) 기능적 도메인은 (독립적 인) 결합 부위를 포함하거나 그로 구성된다. 따라서, 관심있는 (폴리)펩티드는 (독립적인) 결합 부위를 포함하거나 그로 구성되는 것이 바람직하다.
일반적으로, "(독립적인) 결합 부위"는 특정 표적(예를 들어, 분자 및/또는 이온)이 특히 화학 결합, 예를 들어 비공유 결합을 형성함으로써 결합할 수 있는 (폴리)펩티드 사슬의 영역이다. 비공유 결합은 친밀한 전자 공유를 포함하지 않는 비교적 약한 화학 결합이다. 다중 비공유 결합은 종종 거대 분자의 형태를 안정화하고 분자 간의 매우 특이적인 상호작용을 매개한다. 따라서, 결합 부위는 결합 기능을 제공하는 기능적 도메인이다. 특히, 결합 부위는 GS-링커와 같은 링커가 아니다. 링커는 일반적으로 결합 기능을 제공하지 않는다. 결합 부위가 선택적으로 GS-링커와 같은 링커(펩티드)를 포함할 수 있지만, GS-링커와 같은 링커(펩티드)로 구성되지 않는 것이 바람직하다. 즉, 결합 부위가 GS-링커와 같은 링커(펩티드)를 포함하더라도, 바람직하게는 두 펩티드를 서로 (순수하게) 연결하는 것과는 다른 기능을 매개하는 추가의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 따라서, 결합 부위는 GS-링커와 같은 링커(펩티드)와 구별되는 것이 바람직하다.
바람직하게는, (독립적인) 결합 부위는 수용체 및 이의 기능적 단편, 리간드 및 이의 기능적 단편, CD 분자 및 이의 기능적 단편, 단일 사슬 항체 및 이의 항원 결합 단편, 항원 및 이의 기능적 단편, 및 태그로 구성된 군에서 선택된다.
보다 바람직하게는, (독립적인) 결합 부위는 수용체 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 그로 구성된다. 수용체는 일반적으로 (특이적) 리간드에 결합할 수 있다. 따라서, 수용체는 (독립적인) 결합 부위라고도 할 수 있다. 다양한 수용체가 위에서 기재되어 있고 이의 바람직한 구체예 및 예가 그에 따라 적용된다.
결합 부위의 맥락에서, 수용체의 기능적 단편은 수용체의 리간드에 결합하는 능력을 보유하는 수용체의 단편이다. 결합 부위는 수용체 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있기 때문에, 결합 부위와 관련하여 사용되는 용어 "기능적"은 수용체의 결합 기능을 의미한다. 수용체의 다른 단편/도메인은 바람직하게는 (독립적인) 결합 부위에 포함되지 않을 수 있다. 예를 들어, 수용체는, 일반적으로 수용체의 결합 기능에 관여하지 않고 따라서 바람직하게는 (독립적인) 결합 부위에 포함되지 않는 하나 이상의 막과통 도메인(들)을 포함할 수 있다. 따라서, (독립적인) 결합 부위에 포함되는 수용체의 단편은 단지 수용체의 결합 부위(특히 수용체의 추가의 도메인이 없는)인 것이 가장 바람직하다.
또한, (독립적인) 결합 부위는 리간드 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 그로 구성되는 것이 더욱 바람직하다. 리간드는 일반적으로 (특정) 수용체에 결합할 수 있다. 따라서, 리간드는 (독립적인) 결합 부위라고도 할 수 있다. 다양한 리간드가 상기에 기재되어 있고 이의 바람직한 구체예 및 예가 그에 따라 적용된다.
결합 부위의 맥락에서, 리간드의 기능적 단편은 리간드의 결합 능력을 보유하는 리간드의 단편이다. 결합 부위는 리간드 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있기 때문에, 결합 부위의 맥락에서 사용되는 용어 "기능적"은 리간드의 결합 기능을 의미한다. 리간드의 다른 단편/도메인은 바람직하게는 (독립적인) 결합 부위에 포함되지 않을 수 있다. 따라서, (독립적인) 결합 부위에 포함되는 리간드의 단편은 단지 리간드의 결합 부위(특히 리간드의 추가 도메인이 없음)인 것이 가장 바람직하다.
바람직하게는, (독립적인) 결합 부위는 CD(분화 클러스터) 분자 또는 이의 기능적 단편이다. CD(분화 클러스터) 분자는 세포 표면 마커이다. CD 분자는 종종 수용체 또는 리간드로 작용하거나 세포 부착에 관여한다. CD 명명법은 1982년에 시작된 HLDA(Human Leukocyte Differentiation Antigens) 워크숍을 통해 개발되었고 유지되고 있다. 본 발명의 맥락에서 결합 부위 역할을 할 수 있는 CD 분자의 예는 예를 들어 http://www.ebioscience.com/resources/human-cd-chart.htm, BD Bioscience's "Human and Mouse CD Marker Handbook"( https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf에서 검색가능) 또는 www.hcdm.org와 같은, 당업자에게 알려진 다양한 소스로부터 검색할 수 있다. 따라서, (독립적인) 결합 부위는 CD 마커 또는 이의 기능적 단편일 수 있고, 예를 들어, 다음문헌[BD Bioscience's "Human and Mouse CD Marker Handbook" (https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf)에서 검색가능) 또는 적절한 결합 부위가 선택될 수 있도록 결합짝을 일반적으로 나타내는 "CD 마커 챠트"의 다른 소스에서 기재된 (인간) CD 마커일 수 있다.
CD 분자의 기능적 단편은 CD 분자의 결합 능력을 유지하는 CD 분자의 단편이다. 본 발명의 맥락에서, 결합 부위는 CD 분자 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있으므로, 이는 용어 "기능"이 지칭하는 CD 분자의 결합 기능이다. CD 분자의 다른 단편/도메인은 바람직하게는 (독립적인) 결합 부위에 포함되지 않을 수 있다. 따라서, (독립적인) 결합 부위에 포함되는 CD 분자의 단편은 단지 CD 분자의 결합 부위(특히 CD 분자의 추가의 도메인이 없는)인 것이 가장 바람직하다. 바람직하게는, (독립적인) 결합 부위에 포함되는 CD 분자의 기능적 단편은 Ig-유사 도메인이다.
바람직하게는, (독립적인) 결합 부위는 단일 사슬 항체(예를 들어, scFv 또는 VHH) 또는 이의 항원 결합 단편이다. 또한, (독립적인) 결합 부위는 항원 또는 에피토프와 같은 이의 기능적 단편인 것이 바람직하다.
바람직하게는, (독립적인) 결합 부위는 단일 사슬 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 단일 사슬 항체는 하나의 단일 폴리펩티드 사슬로만 구성된 재조합 항체이다. 단일 사슬 항체의 바람직한 예는 불변 도메인이 ?〈? 단일 사슬 항체, 예를 들어 단일 도메인 항체, 단일 사슬 가변 단편(scFv's)에 기반한 단일 사슬 항체 및 단일 사슬 디아바디(scDb), 및 단일 사슬 Fab 단편(scFab; Hust M, Jostock T, Menzel C, Voedisch B, Mohr A, Brenneis M, Kirsch MI, Meier D, Dubel S. Single chain Fab (scFab) fragment. BMC Biotechnol. 2007 Mar 8;7:14)과 같은, 불변 도메인을 갖는 단일 사슬 항체가 있다.
단일 사슬 가변 단편(scFv)에 기초한 단일 사슬 항체의 바람직한 예로는 scFv(하나의 단일 VH 및 하나의 단일 VL 도메인) 및 탠덤(tandem) scFv, 예컨대 탠덤-디-scFv(BiTE), 탠덤-트리-scFv 및 탠덤-테트라-scFv가 있다.
단일 도메인 항체("나노바디"라고도 함)는 하나의 단일 (단량체성) 가변 도메인만을 포함/구성되는 항체 단편이다. 전체 항체와 마찬가지로, 단일 도메인 항체는 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 최초의 단일 도메인 항체는 낙타류에서 확인되는 중쇄 항체로부터 조작되었다. 이를 "VHH" 또는 "VHH 단편"이라고 한다. 또한, 연골 어류는 중쇄 항체(IgNAR, '면역글로불린 새로운 항원 수용체')를 가지고 있으며, 이로부터 "VNAR" 또는 "VNAR 단편"이라고 하는 단일 도메인 항체를 얻을 수 있다. 대안적인 접근 방법은 인간 또는 마우스의 일반적인 면역글로불린 G(IgG) 유래의 이량체 가변 도메인을 단량체로 분할하는 것다. 따라서, 단일 도메인 항체는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인(VH 또는 VL)으로부터 유래될 수 있다. 단일 도메인 항체의 바람직한 예는 VHH, VNAR, IgG-유래 VH 및 IgG-유래 VL을 포함한다.
가장 바람직하게는, 기능적 도메인은 VHH 또는 scFv이다. VHH의 가장 바람직한 예는 T3-VHH 또는 F4-VHH이다. 예를 들어, 단일 도메인 항체는 바람직하게는 서열 번호 91 또는 93에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱더 바람직하게는 90%, 특히 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체를 포함하거나 그로 구성된다. scFv의 가장 바람직한 예는 TT39.7-scFv 또는 MPE8-scFv이다. 예를 들어, 단일 도메인 항체는 바람직하게는 서열번호 92 또는 94에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱더 바람직하게는 90%, 특히 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체를 포함하거나 그로 구성된다.
T3-VHH:
MAQVQLVESGGGLVQAGGSLTLSCAASGSTSRSYALGWFRQAPGKEREFVAHVGQTAEFAQGRFTISRDFAKNTVSLQMNDLKSDDTAIYYCVASNRGWSPSRVSYWGQGTQVTVSS
[서열번호 91]
TT39.7-scFv:
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSRVGVGWIRQPPGKALEWLSLIYWDDEKHYSPSLKNRVTISKDSSKNQVVLTLTDMDPVDTGTYYCAHRGVDTSGWGFDYWGQGALVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCSGAGSDVGGHNFVSWYQQYPGKAPKLMIYDVKNRPSGVSYRFSGSKSGYTASLTISGLQAEDEATYFCSSYSSSSTLIIFGGGTRLTVL
[서열번호 92]
F4-VHH:
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYYIGWFRQAPGKEREAVSCISGSSGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATIRSSSWGGCVHYGMDYWGKGTQVTVSS
[서열번호 93]
MPE8-scFv:
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISASSSYSDYADSAKGRFTISRDNAKTSLFLQMNSLRAEDTAIYFCARARATGYSSITPYFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYDNNNRPSGVPDRFSASKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDRNLSGVFGTGTKVTVL
[서열번호 94]
바람직하게는, (독립적인) 결합 부위는 항원 또는 이의 기능적 단편, 특히 에피토프이다. 항원은 분자 또는 항체에 의해 결합될 수있는 분자의 일부이다. 항원 또는 이의 기능적 단편이 폴리펩티드 사슬에 포함되기 때문에, 본 발명의 맥락에서 결합 부위가 항원 또는 이의 기능적 단편인 경우, 상기 항원 또는 이의 기능적 단편은 펩티드 또는 폴리펩티드인 것으로 이해된다. 항원은 일반적으로 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는(항체에 의해 "인식되는") 항원의 일부분이다. 항원의 바람직한 예에는 혈청 단백질, 예를 들어 IL4, IL5, IL9 및 IL13과 같은 사이토카인, 생체 활성 펩티드, 세포 표면 분자, 예를 들어, 수용체, 수송체, 이온 채널, 바이러스 및 박테리아 단백질, RAGE(당화 최종 생성물을 위한 수용체), GPVI 및 콜라겐이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
항원의 기능적 단편은 항원의 결합 능력을 유지하는 항원의 단편이다. 따라서, 항원의 단편은 바람직하게는 에피토프이거나 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 항원의 다른 단편/도메인은 바람직하게는 (독립적인) 결합 부위에 포함되지 않을 수 있다. 따라서, (독립적인) 결합 부위에 포함되는 항원의 단편은 에피토프이거나 하나 이상의 에피토프를 포함(특히 항원의 추가의 도메인이 없이)하는 것이 가장 바람직하다.
또한, (독립적인) 결합 부위는 결합 부위를 포함하는 태그인 것이 바람직하다. 친화성 태그와 같은 대부분의 태그는 결합할 수 있다. 따라서, 다른 분자에 결합하는 능력을 가진 태그는 (독립적인) 결합 부위라고도 할 수 있다. 결합 부위를 포함하는 태그를 포함하는 다양한 태그가 위에 설명되어 있고 이에 따라 이의 바람직한 구체예 및 예가 적용된다.
가장 바람직하게는 기능적 도메인은 Ig-유사 도메인, scFv, VHH 또는 Strep- 태그이다. 특히, 기능적 도메인은 바람직하게는 서열 번호 65, 79, 및 88 내지 94 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 아주 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체를 포함하거나 그로 구성된다.
특히 바람직한 구체예에서, 관심있는 (폴리)펩티드는 전술한 바와 같이 VH 도메인 또는 VH-VL 도메인을 포함하거나 그로 구성된다. 또한, 관심있는 (폴리)펩티드는 병원체 결합 도메인, 즉 병원체에 특이적으로 결합할 수있는 결합 부위를 포함하거나 이로 구성된 도메인을 포함하거나 그로 구성되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 용어 "병원체"는 질병을 일으킬 수 있는 모든 것, 특히 미생물 또는 미생물 자체에서 유래되는 감염원을 의미한다. 병원체는 세균성 병원체, 바이러스성 병원체, 진균성 병원체, 프리온성 병원체, 원생동물 병원체, (다른) (인간) 기생충의 병원체, 예를 들어. 기생충 또는 조류 병원체로부터 선택될 수 있다.
CD4, 디펩티딜 펩티다제 4, CD9, 또는 안지오텐신-전환 효소 2 또는 이의 단편 또는 서열 변이체를 포함하거나 그로 구성되는 관심의 (폴리)펩티드가 특히 바람직하다. 예를 들어, 분화 클러스터(CD) 4는 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)에 결합한다. 예를 들어, 디펩티딜 펩티다제 4(DPP-4) 및 CD9는 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스(MERS-CoV)의 표적이 된다. 예를 들어 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)는 중증 급성 호흡기 증후군(SARS-CoV)에 결합한다.
관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 특히 바람직한 예는 서열 번호 111에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 이와 적어도 70%, 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 88%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 아주 더 바람직하게는 적어도 92%, 아주 더 바람직하게 적어도 95%, 더더욱 바람직하게 적어도 96%, 더더욱 바람직하게 적어도 97%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 그의 (기능적) 서열 변이체를 포함하거나 그로 구성된다.
따라서, 본 발명에 따른 분리된 B 세포에 도입되는 DNA 분자의 특히 바람직한 예로는 서열번호 99 또는 110에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 이와 적어도 70%, 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 88%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 아주 더 바람직하게는 적어도 92%, 아주 더욱더 바람직하게 적어도 95%, 더더욱 바람직하게 적어도 96%, 더더욱 바람직하게 적어도 97%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 그의 (기능적) 서열 변이체를 포함하거나 그로 구성되는 DNA 분자가 있다.
B 림프구 배양 및 AID 활성화
상술한 바와 같이, 본 발명은 B 림프구의 게놈을 편집하는 방법을 제공한다. 특히, B 림프구의 게놈은 위에서 설명한 바와 같이 B 림프구가 그의 내인성(즉, 자연적으로 재조합된) B 세포 수용체(BCR)를 발현하지 않도록 편집될 수 있다. 예를 들어, B 림프구의 게놈을 편집하여 내인성 B 세포 수용체(BCR)를 맞춤형(단클론) 항체의 서열로 치환할 수 있다.
B 림프구의 게놈을 편집하기 위해, 분리된(바람직하게는 일차) B 림프구가 특히 배양에 제공된다. 분리된(바람직하게는 일차) B 세포를 배양하는 방법은 당 업계에 알려져 있다.
일반적으로, 배양 조건은 일반적으로 "완전 배양 배지"를 포함한다. 본원에서 일반적으로 사용되는 용어 "배양 배지"는 세포의 성장을 지원하도록 설계된 액체 또는 겔을 의미한다. "완전 배양 배지"는 적어도 하나의 추가 성분이 첨가된 기본 배지, 바람직하게는 기본 합성 배지를 의미한다. 완전 배양 배지의 비제한적인 예는 WO 03/076601호, WO 05/007840호, EP 787180호, US 6,114,168호, US 5,340,740호, US 6,656,479호, US 5,830,510호 및 다음문헌[Pain et al. (1996, Development 122:2339-2348)]에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 "기본 배지"는 그 자체로 적어도 세포 생존, 바람직하게는 세포 성장을 가능하게 하는 배지를 의미한다. 특히, 기본 배지는 고전적인 배지 조성을 가지고 있다. 기본 매체의 비제한적인 예로는 BME(Eagle's Basal Medium), MEM(minimum Eagle Medium), 배지 199, DMEM(Dulbecco's modified Eagle Medium), Knockout DMEM, GMEM(Glasgow modified Eagle medium), DMEM-HamF12, Ham-F12 및 Ham-F10, Iscove's Modified Dulbecco's 배지 (IMDM), MacCoy's 5A 배지, 및 RPMI 1640이 있다. 특히, 기본 배지는 한 종 무기 염(예를 들어, CaCl2, KCI, NaCl, NaHCO3, NaH2PO4, MgSO4 등), 한 종 이상의 아미노산, 한 종 이상의 비타민(예를 들어, 티아민, 리보플라빈, 엽산, D-Ca 판토텐산 등) 및/또는 예를 들어 글루코스, 베타-머 캅토-에탄올 및 나트륨 피루베이트와 같은 한 종 이상의 다른 성분을 포함한다. 바람직하게는, 기본 배지는 합성 배지이다. 가장 바람직하게는 기본 배지는 IMDM 및/또는 RPMI이다.
바람직하게는, 본 발명의 배양 배지는 동물 혈청, 특히 태아 동물 혈청을 추가로 포함한다. 바람직한 동물 혈청은 소 태아 혈청(FBS)이다. 특히 바람직한 FBS는 HyClone(GE Healthcare Life Sciences사; 예를 들어, HyClone 40mm 필터링, SH30070.03)이다. 그러나, 다른 동물 종의 혈청을 포함하는 동물 혈청도 사용될 수 있다. 배양 배지에서 동물 혈청의 최종 농도는 바람직하게는 약 0.01 내지 10%, 바람직하게는 0.05 내지 5%, 더 바람직하게는 0.1 내지 2.5%, 아주 더 바람직하게는 0.5 내지 1.5%, 가장 바람직하게는 약 1% 이다.
본 발명의 배양 배지는 바람직하게는 특히 박테리아 오염을 방지하기 위해 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신 및/또는 카나마이신과 같은 항생제를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 페니실린/스트렙토마이신의 조합이 바람직하다. 또한, 카나마이신도 바람직하다. 예를 들어, 최종 배양 배지는 페니실린/스트렙토마이신 및/또는 카나마이신을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 배양 배지에서 항생제의 농도는 1 내지 1000 U/ml, 더욱 바람직하게는 10 내지 500 U/ml, 더욱더 바람직하게는 50 내지 250 U/ml, 특히 바람직하게는 약 100 U/ml이다. 예를 들어, 페니실린/스트렙토마이신의 조합은 최종 배양 배지에서 다음 농도의 항생제로 사용될 수 있다: 1 내지 1000 U/ml 페니실린 및 1 내지 1000 μg/ml 스트렙토마이신, 더 바람직하게는 10 내지 500 U/ml 페니실린 및 10 내지 500 μg/ml 스트렙토마이신, 더욱더 바람직하게는 50 내지 250 U/ml 페니실린 및 50 내지 250 μg/ml 스트렙토마이신, 특히 바람직하게는 약 100 U/ml 페니실린 및 약 100 μg/ml 스트렙토마이신. 또한 최종 배양 배지에서 페니실린/스트렙토마이신의 농도는 0.01 내지 10%, 바람직하게는 0.05 내지 5%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 2.5%, 아주 더 바람직하게는 0.5 내지 1.5%, 가장 바람직하게는 약 1% 인 것이 바람직하다. 또한, 최종 배양 배지에서 카나마이신의 농도는 0.01 내지 10%, 바람직하게는 0.05 내지 5%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 2.5%, 더욱더 바람직하게는 0.5 내지 1.5%, 가장 바람직하게는 약 1% 인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 배양 배지는 바람직하게는 추가의 첨가제, 예를 들어 다음을 포함할 수 있다: 글루타민 유도체, 바람직하게는 GlutaMax, NEAA, 생물학적 완충액, 바람직하게는 HEPES, 피루베이트(예를 들어, 피루브산 나트륨), β-머캅토-에탄올 및/또는 트랜스페린. 일반적으로 상기 및 추가의 첨가제는 제조사에 따른 농도로 사용될 수 있다.
글루타민 유도체는 예를 들어 L-글루타민 또는 GlutaMax 일 수 있으며, 이 중 GlutaMax가 바람직하다. GlutaMax는 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드로, 예를 들어 0.85% NaCl에서 200 mM L-알라닐-L-글루타민 디펩티드(100x 원료 용액)로 제공된다. 글루타민 유도체는 바람직하게는 0.1 내지 100 mM, 보다 바람직하게는 0.5 내지 50 mM, 더욱더 바람직하게는 1 내지 10 mM, 특히 바람직하게는 약 2 mM의 농도로 최종 배양 배지에서 사용된다. 또한, 최종 배양 배지에서 GlutaMax의 농도는 0.01 내지 10%, 바람직하게는 0.05 내지 5%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 2.5%, 더욱더 바람직하게는 0.5 내지 1.5%, 가장 바람직하게는 약 1% 인 것이 바람직하다.
NEAA, 즉, 비필수 아미노산 용액은 Earle's Salts Base, 비필수 아미노산, 중탄산나트륨(NaHCO3) 및 pH 지시약으로 페놀 레드를 갖는 상업적으로 이용가능한 멸균 여과 및 세포 배양 테스트 액체 제제이지만, L-글루타민은 함유하지 않는디. 최종 배양 배지에서 NEAA의 농도는 일반적으로 제조사에 따라 다르지만, 예를 들어 100x 원료 용액의 경우 1:100 이다. 또한, 최종 배양 배지에서 NEAA의 농도는 0.01 내지 10%, 바람직하게는 0.05 내지 5%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 2.5%, 더욱더 바람직하게는 0.5 내지 1.5 %, 가장 바람직하게는 약 1% 인 것이 바람직하다.
피루베이트는 해당(glycolysis) 과정에서의 중간 유기산 대사산물이며 세포 안팎으로 쉽게 통과할 수 있는 첫 번째 Embden Myerhoff 경로이다. 따라서, 이를 세포 배양 배지에 첨가하면 동화 과정을 위한 에너지원과 탄소골격이 모두 제공된다. 바람직한 피루베이트는 피루브산 나트륨이며, 이는 또한 형광에 의한 광독성을 감소시키는데 도움이 될 수 있다. 피루베이트, 바람직하게는 피루브산 나트륨은 바람직하게는 0.05 내지 50 mM, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10mM, 더욱더 바람직하게는 0.5 내지 5 mM, 특히 바람직하게는 약 1 mM의 농도로 배양 배지에서 사용된다. 또한, 최종 배양 배지에서 피루베이트, 바람직하게는 피루브산 나트륨의 농도는 0.01 내지 10%, 바람직하게는 0.05 내지 5%, 더 바람직하게는 0.1 내지 2.5%, 아주 더 바람직하게는 0.5 내지 1.5%, 가장 바람직하게는 약 1% 이다.
베타-머캅토 에탄올(2-머캅토에탄올, β-ME 또는 2-ME라고도 함)은 자유 라디칼 제거제로 작용하는 것으로 간주된다. 베타-머캅토-에탄올은 바람직하게는 0.005 내지 5.0 mM, 보다 바람직하게는 0.01 내지 1.0 mM, 더욱더 바람직하게는 0.05 내지 0.5 mM, 특히 바람직하게는 약 0.1 mM의 농도로 최종 배양 배지에서 사용된다. 또한, 최종 배양 배지에서 베타-머캅토-에탄올의 농도는 0.01 내지 10%, 바람직하게는 0.05 내지 5%, 더 바람직하게는 0.1 내지 2.5%, 아주 더 바람직하게는 0.5 내지 1.5%, 가장 바람직하게는 약 1% 인 것이 바람직하다.
또한, 최종 배양 배지에서 트랜스페린의 농도는 0.01 내지 10%, 바람직하게는 0.05 내지 5%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 2.5%, 더욱더 바람직하게는 0.5 내지 1.5%, 가장 바람직하게는 약 1% 인 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명에 따른 특히 바람직한 배양 배지는 다음을 포함한다:
- 기본 배지, 바람직하게는 RPMI 또는 IMDM
- 바람직하게는 동물 혈청, 보다 바람직하게는 FBS;
- 바람직하게는 항생제, 보다 바람직하게는 페니실린/스트렙토마이신 및/또는 카나마이신;
- 바람직하게는 예를 들어 글루타민 유도체(바람직하게는 GlutaMax), NEAA, 피루베이트(예를 들어, 피루브산 나트륨), β-머캅토-에탄올 및/또는 트랜스페린을 포함하는 추가의 첨가제.
가장 바람직하게는, B 림프구는 10% FBS, 1% NEAA, 1% 피루브산 나트륨, 1% 베타-머캅토 에탄올, 1% GlutaMax, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% 카나마이신 및 1% 트랜스페린을 갖는 RPMI 또는 IMDM에서 배양된다.
또 다른 예에서, B 림프구는 10% FBS, 1% P/S(페니실린/스트렙토마이신), 1% HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산 및 1% L-글루타민을 갖는 RPMI(예를 들어, RPMI-1640))에서 배양될 수 있다.
바람직하게는, B 림프구는 약 0.5 x 105 내지 10 x 106 cells/ml, 바람직하게는 1 x 105 내지 1 x 106 cells/ml, 더욱 바람직하게는 1 x 105 내지 5 x 105 세포/ml, 아주 더 바람직하게는 1.5 x 105 내지 2.5 x 105 세포/ml, 가장 바람직하게는 2 x 105 세포/ml의 밀도로 배양된다.
본 발명에 따른 방법의 단계 (i)에서, B 세포의 내인성 AID가 활성화된다. 바람직하게는, B 림프구의 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소의 활성화는, 예를 들어 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소의 활성화제를 포함하는 배양 배지에서 B 세포를 배양함으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는, 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소의 활성화제는 사이토카인, 항-B 세포 수용체 항체 또는 이의 단편, TLR 작용제, CpG-B 작용제, 이미다조퀴놀린 화합물, 또는 상기 활성화제의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 즉, B 림프구는 사이토카인, 항-B 세포 수용체 항체 또는 이의 단편, TLR 작용제, CpG-B 작용제 및/또는 이미다조퀴놀린 화합물을 포함하는 배양 배지에서 배양되는 것이 바람직하다.
B 세포의 내인성 AID의 활성화를 위하여, B 림프구는 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소의 활성화제(예를 들어, 사이토카인, 항-B 세포 수용체 항체 또는 이의 단편, TLR 작용제, CpG-B 작용제 및/또는 이미다조퀴놀린 화합물)를 포함하는 세포 배양 배지에서 약 3 시간 내지 10 일, 바람직하게는 약 6 시간 내지 7 일, 더욱 바람직하게는 약 12 시간 내지 5 일, 더욱더 바람직하게는 약 18 시간 내지 3 일, 더욱더 바람직하게는 약 21 시간 내지 2 일 동안 배양되는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, B 세포는 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소의 활성화제(예를 들어, 사이토카인, 항-B 세포 수용체 항체 또는 이의 단편, TLR 작용제, CpG-B 작용제 및/또는 이미 다조 퀴놀린 화합물)를 포함하는 세포 배양 배지에서 약 24 시간 동안 배양된다.
따라서, B 림프구는 DNA 분자 도입(단계 (ii))전 약 3 시간 내지 10 일, 바람직하게는 DNA 분자 도입(단계 (ii))전 약 6 시간 내지 7 일, 더욱 바람직하게는 DNA 분자 도입(단계 (ii))전 약 12 시간 내지 5 일, 아주 더 바람직하게는 DNA 분자의 도입(단계 (ii))전 약 18 시간 내지 3 일, 더욱더 바람직하게는 DNA 분자의 도입(단계 (ii))전 약 21 시간 내지 2 일, 가장 바람직하게는 DNA 분자 도입(단계 (ii))전 약 24 시간 동안 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소의 활성화제(예를 들어, 사이토카인, 항-B 세포 수용체 항체 또는 이의 단편, TLR 작용제, CpG-B 작용제 및/또는 이미다조퀴놀린 화합물)를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양된다.
또한, B 림프구는 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소의 활성화제(예를 들어, 사이토카인, 항-B 세포 수용체 항체 또는 이의 단편, TLR 작용제, CpG-B 작용제 및/또는 이미다조퀴놀린 화합물)를 포함하는 세포 배양 배지에서 DNA 분자 도입(단계 (ii))전 적어도 3 시간, 바람직하게는 DNA 분자 도입(단계 (ii))전 적어도 6 시간, 더 바람직하게는 DNA 분자 도입(단계 (ii))전 적어도 12 시간, 더욱더 바람직하게는 DNA 분자 도입(단계 (ii))전 적어도 18 시간, 가장 바람직하게는 DNA 분자 도입(단계 (ii))전 적어도 21 시간, 예를 들어 DNA 분자 도입(단계 (ii))전 약 24 시간 동안 배양되는 것이 바람직하다.
또한, B 림프구는 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소의 활성화제(예를 들어, 사이토카인, 항-B 세포 수용체 항체 또는 이의 단편, TLR 작용제, CpG-B 작용제 및/또는 이미다조퀴놀린 화합물)를 포함하는 세포 배양 배지에서 DNA 분자 도입(단계 (ii))전 10 일 이하 , 바람직하게는 DNA 분자 도입(단계 (ii))전 7 일 이하, 더욱 바람직하게는 DNA 분자 도입(단계 (ii))전 5 일 이하, 더욱더 바람직하게는 DNA 분자 도입(단계 (ii))전 3 일 이하, 더욱더 바람직하게는 DNA 분자 도입(단계 (ii))전 2 일 이하, 가장 바람직하게는 DNA 분자 도입(단계 (ii))전 약 36 시간 이하, 예를 들어 DNA 분자 도입(단계 (ii))전 약 24 시간 동안 배양되는 것이 바람직하다.
즉, 본 발명에 따른 방법에서, DNA 분자를 B 림프구에 도입하는 것은 활성화 유도-시티딘 탈아미노효소를 활성화한 후 최대 10 일, 바람직하게는 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소를 활성화한 후 최대 7 일, 보다 바람직하게는 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소를 활성화한 후 최대 5 일, 더욱더 바람직하게는 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소를 활성화한 후 최대 2 일, 가장 바람직하게는 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소를 활성화한 후 약 1 일에서 수행되는 것이 바람직하다.
전술한 바와 같이, 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소의 활성화제는 바람직하게는 사이토카인, 항-B 세포 수용체 항체 또는 이의 단편, TLR 작용제, CpG-B 작용제 및/또는 이미다조퀴놀린 화합물이다.
바람직하게는, Toll-유사 수용체(TLR) 작용제는 R848 또는 CL264와 같은 TLR7 또는 TLR9의 작용제이다. 항-B 세포 수용체 항체 또는 이의 단편의 바람직한 예는 인간 면역 글로불린에 특이적인 항-B 세포 수용체 F(ab')2-단편을 포함한다. CpG-B 작용제의 바람직한 예는 ODN2006이다. 이미다조퀴놀린 화합물의 바람직한 예는 Clo97이다.
사이토카인의 예로는 IL1-유사, IL1a, IL1β, IL1RA, IL18, CD132, IL2, IL4, IL7, IL9, IL13, IL15, CD131, IL3, IL5, GM-CSF, IL6-like, IL6, IL11, G-CSF, IL12, LIF, OSM, IL10-like, IL10, IL20, IL21, IL14, IL16, IL17, IFNα, IFNβ, IFNγ, CD154, LTβ, TNFα, TNFβ, 4-1BBL, APRIL, BAFF, CD70, CD153, CD178, CD30L, CD40L, GITRL, LIGHT, OX40L, TALL-1, TRAIL, TWEAK, TRANCE, TGFββ, TGFβ2, TGFβ3, c-Kit, FLT-3, Epo, Tpo, FU-3L, SCF, M-CSF, aCD40, 또는 이들의 임의의 조합이 있다. 바람직하게는, 사이토카인은 CD40L, IL4, IL2, IL21, BAFF, APRIL, CD30L, TGF-β1, 4-1BBL, IL6, IL7, IL10, IL13, c-Kit, FLT-3, IFNα, 또는 이들의 임의의 조합으로 구선되는 군에서 선택된다. 가장 바람직하게는, B 림프구는 IL4 및/또는 CD40L을 포함하는 배지에서 배양된다.
예를 들어, B 세포는 DNA 분자의 도입(단계 (ii); 형질감염) 전에 CD40L 발현 세포주(예를 들어, K562L 또는 3T3 세포)와 공동 배양될 수 있다. B 세포는 형질감염 전에 적어도 12, 24, 36, 48 또는 72 시간 동안 공동 배양될 수 있다.
바람직하게는, (배양 배지에서) 사이토카인의 농도는 0.001 내지 20 ng/ml, 바람직하게는 0.001 내지 1 ng/ml, 더 바람직하게는 0.005 내지 0.5 ng/ml, 아주 더 바람직하게는 0.01 내지 0.1 ng/ml, 아주 더 바람직하게는 0.015 내지 0.02 ng/ml, 가장 바람직하게는 약 0.16 ng/ml 이다.
더욱이, B 림프구는 적어도 0.001 ng/ml, 바람직하게는 적어도 0.001 ng/ml, 더 바람직하게는 적어도 0.005 ng/ml, 더욱더 바람직하게는 적어도 0.01 ng/ml, 더욱 더 바람직하게는 적어도 0.015 ng/ml, 가장 바람직하게는 약 0.16 ng/ml의 농도로 사이토카인을 포함하는 세포 배양 배지에서 배양되는 것이 바람직하다.
또한, B 림프구는 20 ng/ml 이하, 바람직하게는 1 ng/ml 이하, 더욱 바람직하게는 0.5 ng/ml 이하, 보다 바람직하게는 0.1 ng/ml 이하, 더욱더 바람직하게는 0.02 ng/ml 이하, 가장 바람직하게는 약 0.16 ng/ml의 농도로 사이토카인을 포함하는 세포 배양 배지에서 배양되는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소를 활성화하는 것은 CD40L 및/또는 IL4의 (존재하에 B 림프구의 배양)에 의해 수행된다. 즉, B 림프구는 CD40L 및/또는 IL4를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양되는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소의 활성화는 CD40L 발현 세포주(상기 기재된 바와 같음)와 공동 배양하고 (상기 기재된 바와 같은 배양 배지에) IL-4를 첨가함으로써 수행된다. 가장 바람직하게는, CD40L 발현 세포주는 K562L이다.
일반적으로, 배양 배지에서 IL4의 농도는 사이토카인에 대하여 일반적으로 위에서 설명한 바와 같을 수 있다. 특히, (최종 배양 배지에서) IL4의 농도는 바람직하게는 0.005 내지 0.03 ng/ml, 보다 바람직하게는 0.01 내지 0.025 ng/ml, 더욱더 바람직하게는 0.015 내지 0.02 ng/ml, 가장 바람직하게는 0.16 ng/ml 이다.
바람직하게는, B 림프구는 DNA 분자를 B 림프구에 도입한 후(형질감염 후)에 재활성화된다. 형질감염 후 세포의 재활성화는 생존력을 향상시킨다. 재활성화를 위해, 전술한 바와 같은 B 세포 자극제, 즉 사이토카인, 항-B 세포 수용체 항체 또는 이의 단편, TLR 작용제, CpG-B 작용제 및/또는 이미다조퀴놀린 화합물이 사용될 수 있다. 즉, 예를 들어 상기 정의된 바와 같은 B 세포 자극제(사이토카인, 항-B 세포 수용체 항체 또는 이의 단편, TLR 작용제, CpG-B 작용제 및/또는 이미다조퀴놀린 화합물)는 DNA 분자를 B 림프구에 도입한 후 B 림프구에 적용되는 것이 바람직하다.
일반적으로, B 림프구는 DNA 분자를 B 림프구에 도입한 후(형질감염 후) 1 회 또는 반복적으로 재활성화될 수 있다. 예를 들어, B 림프구는 약 1, 2, 3, 4, 5 일 이상 동안 재활성화될 수 있다. 바람직하게는, B 세포는 형질감염 후 24 시간 이내, 예를 들어 형질감염 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간 후에 재활성화된다(형질감염 후 처음으로). 보다 바람직하게는 B 세포는 형질감염 후 18 시간 이내에 재활성화되고, 더욱더 바람직하게는 B 세포는 형질감염 후 12 시간 이내에 재활성화되고, 가장 바람직하게는 B 세포는 형질감염 후 6 시간 이내에, 예를 들어 3 내지 5 시간 이내, 예를 들어 약 4 시간 이내에 재활성화된다. 이러한 재활성화는 가장 바람직하게는 IL4로 수행된다. 더욱이, 재활성화(예를 들어, IL4 사용)는 바람직하게는 1-5 일마다, 바람직하게는 2-4 일마다, 가장 바람직하게는 3 일마다 반복된다.
추가로 또는 대안적으로, B 림프구는 특히 바람직하게는 K562L 세포와 같은 CD40L 발현 세포에 의해, 예를 들어 1 회 또는 반복적으로, 가장 바람직하게는 형질감염 후 2 내지 10 일, 바람직하게는 형질감염 후 4 내지 9 일, 더 바람직하게는 형질감염 후 6 내지 8 일, 예를 들어 형질감염후 약 7 일 이후에 재활성화된다.
특히 바람직한 구체예에서, B 세포는 형질감염 4 시간 후에 IL4로 3 일의 연속 간격으로 재활성화되고 K562L 세포로 7 일째에 재활성화된다.
바람직하게는, B 림프구는 DNA 분자를 B 림프구에 도입하기 전에 대체 말단 결합(alternative-end joining)을 차단할 수 있는 DNA 억제제로 처리된다. 그러한 DNA 억제제의 바람직한 예는 올라파립이다. 이러한 전처리는 대체 말단 결합(a-EJ) 경로를 차단하여 c-NHEJ 경로의 사용을 강화하고 조작 효율을 더욱 증가시킨다.
또한, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자는 DNA 분자를 B 림프구에 도입하기 전에 Ku70/Ku80과 같은 Ku 단백질과 함께 인큐베이션되는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 구체예에서, DNA 분자/Ku 단백질 복합체(인큐베이션 동안 형성됨)가 B 림프구에 도입된다. 이에 따라, DNA 분자의 성공적인 통합 횟수가 더욱 증가할 수 있다.
또한, DNA 분자는 SV40 핵 위치화 신호, 예를 들어 서열번호 95에 따른 SV 탠덤 반복 또는 이의 서열 변이체와 같은 핵 위치화 신호를 포함하는 것이 바람직하다:
SV 탠덤 반복:
TGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCTGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACC
[서열번호 95]
이를 통해, B 림프구의 핵에서 DNA 분자의 고농도를 달성함으로써, B 림프구의 게놈에의 DNA 분자의 통합을 더욱 증가시킬 수도 있다.
또한, 특히 B 림프구의 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소의 활성화 후 적어도 약 24 시간 후에 B 림프구를 뉴클레아제 억제제로 처리하는 것이 또한 바람직하다. 뉴클레아제 억제제의 바람직한 예는 Mirin이다. 이를 통해, B 세포에 도입된 DNA 분자가 B 세포의 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제에 의해 분해되는 것을 피할 수 있다.
형질감염
전술한 바와 같이, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 도입하는 방법(즉, 형질감염 방법)은 예를 들어 바이러스 및 비바이러스 형질감염 방법을 포함한다. 유전자 전달에 사용될 수 있는 바이러스로는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 단순 포진 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 부속 바이러스(AAV)가 있다. 그러나, 몇몇 구체예에서, B 림프구에는 레트로바이러스가 형질도입되지 않는다. 더욱이, 나노입자도 형질감염을 위해 사용될 수 있다. 추가의 비바이러스 형질감염 방법에는 많은 화학적 및 물리적 방법이 포함된다. 화학적 형질 감염 방법으로는 예를 들어 양이온성 지질 및/또는 리포좀에 기반한 리포펙션, 칼슘 포스페이트 침전, 또는 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민(PEI) 등과 같은 양이온성 중합체에 기반한 형질 감염에 기반한 형질감염이 있다. 물리적 형질감염 방법으로는 전기천공, 탄도 유전자 전달(DNA로 코팅된 입자를 세포에 도입), 미세주입(DNA를 미세모세관을 통해 세포로 전달) 및 뉴클레오펙션이 있다. 바람직하게는, 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 B 림프구로 도입하는 것은 비바이러스성이다.
가장 바람직하게는, DNA 분자는 뉴클레오펙션에 의해 B 림프구에 도입된다. 뉴클레오펙션은 특정 전압을 인가하여 DNA 및 RNA와 같은 핵산을 세포에 전달할 수있는 전기천공 기반 형질감염 방법이다. 전기천공의 물리적 방법에 기반하여, 뉴클레오펙션은 뉴클레오펙터 장치("Nucleofector")에 의해 생성된 전기적 매개변수와 바람직하게는 세포 유형- 특이적 시약의 조합을 사용한다. DNA 분자(기질)는 세포핵 및 세포질로 직접 전달된다. 따라서, 뉴클레오펙션을 위해 뉴클레오펙션 장치를 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로 Neon®, MaxCyte 또는 Amaxa®와 같은 모든 뉴클레오펙션 장치를 사용할 수 있다. 바람직하게는 Amaxa® 또는 Neon® 뉴클레오펙션 장치가 사용된다.
일반적으로, 뉴클레오펙션 장치 제조사에서 제공하는 모든 뉴클레오펙션 프로그램을 사용할 수 있다. 바람직하게는 2100-2500V가 10 내지 20ms (msec)의 1 개 또는 2 개의 펄스로 사용된다. 보다 바람직하게는, 2100 내지 2400V는 10 내지 20ms (msec)의 1 개 또는 2 개의 펄스로 사용된다. 예를 들어, 2150V 및 10ms의 단일 펄스를 사용할 수 있다. 예를 들어, 2150V 및 15ms의 단일 펄스를 사용할 수 있다. 예를 들어, 2150V 및 20ms의 단일 펄스를 사용할 수 있다. 예를 들어, 2150V 및 10ms의 두 펄스를 사용할 수 있다. 예를 들어, 2400V 및 10ms의 단일 펄스를 사용할 수 있다. 예를 들어, 2400V 및 15ms의 단일 펄스를 사용할 수 있다. 예를 들어, 2400V 및 20ms의 단일 펄스를 사용할 수 있다. 예를 들어, 2500V 및 10ms의 단일 펄스를 사용할 수 있다. 예를 들어, 2500V 및 15ms의 단일 펄스를 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는, (정확히) 2150V 및 10ms의 두 펄스가 특히 Neon® 뉴클레오펙터(Nucleofector)와 함께 사용된다.
바람직하게는, B 세포용 뉴클레오펙터 키트(예를 들어, 인간 B 세포용 Lonza 's 뉴클레오펙터 키트), 특히 예를 들어 제조사의 지침에 따라 Amaxa® 뉴클레오펙터와 함께 사용된다. 가장 바람직하게는, Amaxa® 뉴클레오펙터는 U15 프로그램에 대한 제조사의 지침에 설명된 대로 인간 B 세포용 Lonza's Nucleofector 키트와 조합으로 사용되며, 여기서 바람직하게는 세포 수는 2 백만(변경됨)이고/이거나 DNA의 양은 Amaxa® 뉴클레오펙터의 경우 뉴클레오펙션당 약 2.5μg(변경됨)이다.
바람직하게는, DNA는 약 0.5 μg 내지 10 μg의 DNA의 양(형질감염, 특히 뉴클레오펙션 당 양)으로 형질감염되며, 예를 들어 DNA 농도는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 μg일 수 있다. 더 바람직하게는, DNA 농도는 약 1μg 내지 5μg DNA, 더욱더 바람직하게는 1.5μg 내지 3.5μg DNA, 더욱더 바람직하게는 1.0 내지 3.0μg DNA의 양(형질감염 당, 특히 뉴클레오펙션 당 양)으로 형질 감염된다. 가장 바람직하게는 형질감염 당 DNA의 양은 약 2.5μg DNA이다.
바람직하게는, 게놈 편집된 B 세포는 게놈 편집 과정 직후 또는 단기간 배양 후에 사용된다. 임상적 사용을 위해, 게놈 편집된 B 세포는 사용 전에 방사선조사될 수 있다. 방사선 조사는 면역 이펙터 세포 활성을 촉진하는 사이토카인의 발현을 유도한다.
조작된 B 림프구 및 이의 용도
추가의 측면에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 조작된 B 림프구를 제공한다. 즉, 본 발명은 또한 본원에 기재된 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 조작된 B 림프구를 제공한다.
따라서, 상기 개략된 본 발명에 따른 B 림프구의 게놈 편집 방법의 상세한 설명 및 바람직한 구체예는 이러한 방법에 의해 얻어질 수 있는 조작된 B 림프구에 적용되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 위에서 기술된 편집된 B 세포 및 특히 바람직한 (폴리)펩티드의 상세한 설명은 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는 B 세포에 적용된다.
일반적으로, 본 발명의 방법으로 얻은 B 세포는 B 세포 게놈의 스위치 영역에서의 이종 삽입물(heterologous insert)로 인해 쉽게 인식될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 스위치 영역에 삽입된 관심의 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 삽입물을 포함하는 편집된 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 조작된 B 림프구를 제공한다. 용어 "이종"은 내인성 서열, 즉 원래 이러한 게놈 위치에 있었던 서열과 구별되는 서열을 의미한다. 일반적으로, 상기 기재된 관심의 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자는 본질적으로 이종 삽입물에 해당한다. 따라서, 상기 기재된 관심의 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자 및 바람직한 구체예의 상세한 설명은 이에 따라 이종 삽입물에 적용된다. 특히, 관심있는 (폴리)펩티드는 위에서 기재된 것과 동일하다.
일반적으로, 이종 삽입물은 면역글로불린 유전자좌의 스위치 영역에 삽입된다. 이를 동해, 면역글로불린 유전자좌가 편집된다. 일반적으로, 또한 조작된 B 림프구의 경우, 위에서 개략된 본 발명에 따른 B 림프구의 게놈 편집 방법 및 바람직한 구체예의 상세한 설명이 그에 따라 적용된다.
일반적으로, 본 발명의 조작된 B 림프구는 임의의 종일 수 있다. 몇몇의 구체예에서, 조작된 B 림프구는 포유동물 B 림프구이다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 조작된 B 림프구는 인간 유래이다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 조작된 B 림프구는 닭 또는 뮤린 B 림프구가 아니다. 특히, B 림프구의 IgL 유전자좌는 결실되지 않는 것이 바람직하다.
특히, 본 발명에 따른 조작된 B 세포에서, B 세포의 게놈은 바람직하게는 N-에서 C-말단 방향으로 하기의 것들을 포함하는 변형된 면역글로불린 사슬을 발현하도록 편집된다: 가변 도메인, 관심있는 (폴리)펩티드(단계 (ii)에서 도입된 DNA 분자에 의해 암호화됨) 및 불변 도메인. 즉, B 림프구의 게놈은 바람직하게는 면역글로불린 사슬의 가변 도메인과 불변 도메인 사이에 배열된 관심의 (폴리)펩티드를 포함하는 변형된 면역글로불린 사슬을 발현하도록 편집된다. 따라서, 항체의 엘보우 영역에서 관심의 (폴리)펩티드를 포함하는 변형된 항체를 발현하도록 B 림프구의 게놈을 편집하는 것이 바람직하다. 더욱이, 항체의 엘보우 영역에서 관심의 (폴리)펩티드를 포함하는 변형된 B-세포 수용체를 발현하도록 B 림프구의 게놈을 편집하는 것이 바람직하다. 이러한 맥락에서, 본 발명에 따른 방법의 맥락에서 위에서 설명한 상세한 설명이 그에 따라 적용된다.
또한, B 림프구의 게놈은 내인성 가변 도메인이 관심의 (폴리)펩티드로 치환되어 있는 변형된 면역글로불린 사슬을 발현하도록 편집되는 것이 바람직하다. 따라서, B 림프구의 게놈은 내인성 가변 도메인이 관심의 (폴리)펩티드로 치환되어 있는 변형된 B-세포 수용체를 발현하도록 편집되는 것이 바람직하다. 따라서, B 림프구의 게놈은 내인성 가변 도메인 "대신"에 관심있는 (폴리)펩티드를 포함하는 변형된 항체를 발현하도록 편집되는 것이 바람직하다. 다시, 본 발명에 따른 방법의 맥락에서 위에서 개괄된 상세한 설명이 그에 따라 적용된다.
또한, B 림프구의 게놈은 내인성 불변 도메인이 관심의 (폴리)펩티드로 치환되어 있는 변형된 면역글로불린 사슬을 발현하도록 편집되는 것이 바람직하다. 따라서, B 림프구의 게놈은 내인성 불변 도메인이 관심의 (폴리)펩티드로 치환되어 있는 변형된 B-세포 수용체를 발현하도록 편집되는 것이 바람직하다. 따라서, B 림프구의 게놈은 내인성 불변 도메인 "대신"에 관심의 (폴리)펩티드를 포함하는 변형된 항체를 발현하도록 편집되는 것이 바람직하다. 따라서, 이러한 변형된 면역글로불린 사슬은 (내인성) 가변 도메인, 관심있는 (폴리)펩티드를 포함하지만 (내인성) 불변 도메인은 포함하지 않는다. 다시, 본 발명에 따른 방법과 관련하여 위에서 설명한 상세한 설명이 그에 따라 적용된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 조작된 B 림프구의 면역글로불린 유전자좌의 스위치 영역은 절단 부위, 보다 바람직하게는 T2A 절단 부위와 같은 자기-처리 부위를 포함한다. 다시, 본 발명에 따른 방법과 관련하여 절단 부위에 대해 위에서 개괄된 상세한 설명이 그에 따라 적용된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 조작된 B 림프구의 면역글로불린 유전자좌의 스위치 영역은 병원체 결합 도메인, VH 도메인 또는 VH-VL 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 조작된 B 림프구의 면역글로불린 유전자좌의 스위치 영역은 CD4, 디펩티딜 펩티다제 4, CD9, 또는 안지오텐신 전환 효소 2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편 또는 서열 변이체를 포함하는 것이 바람직하다. 다시, 본 발명에 따른 방법과 관련하여 위에서 설명한 상세한 설명이 그에 따라 적용된다.
몇몇 구체예에서, 조작된 B 림프구는 GFP(녹색 형광 단백질) 또는 RFP(적색 형광 단백질, 예컨대 tdTomato 또는 DsRed)를 발현하지 않는다. 보다 일반적으로, 몇몇 구체예에서, 조작된 B 림프구는 (형광) 리포터 단백질을 발현하지 않는다.
일반적으로, 조작된 B 세포는 B 세포 수용체 발현, 특이성 및/또는 기능을 조절하는 것이 요구되는 임의의 용도로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 조작된 B 림프구는 의학, 즉 의료용, 예를 들어 면역요법에 사용된다. 이를 위해, B 림프구는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이 조작(즉, 게놈 편집)된다.
일반적으로, 본 발명에 따른 조작된 B 림프구에 의해 표적화되는 질병은 (단클론) 항체로 치료될 수있는 모든 질병을 포함한다. 이러한 질병으로는 암, 전염병, 자가 면역 질환, 이식 거부, 골다공증, 황반 변성, 다발성 경화증 및 심혈관 질환이 있다. 암 및/또는 전염병의 치료 및/또는 예방이 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 조작된 B 세포는 암 또는 종양 질환의 예방, 치료 및/또는 개선을 위한 (의약의 제조)에 사용될 수 있다. 일반적으로, 용어 "암"은 고형 종양, 특히 육종, 암종 및 림프종과 같은 악성 고형 종양 및 백혈병과 같은 혈액 암을 포함한다. 암으로는 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 생식 세포 종양 및 모세포종이 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 조작된 B 세포는 감염성 질환의 예방, 치료 및/또는 개선을 위한 (의약의 제조)에 사용될 수 있다. 전염병에는 바이러스, 레트로 바이러스, 세균 및 원생동물 감염병이 포함된다.
더욱이, 본 발명에 따른 조작된 B 세포는 자가 면역 질환의 예방, 치료 및/또는 개선을 위한 (의약의 제조)에 사용될 수 있다. 일반적으로, 자가 면역 질환은 신체에 정상적으로 존재하는 물질 및 조직에 대한 신체의 비정상적인 면역 반응(자가 면역)으로부터 발생한다. 이것은 특정 기관으로 제한되거나 다른 위치의 특정 조직을 포함할 수 있다. 자가 면역 질환은 해당 유형의 과민성에 따라 분류될 수 있다: 유형 I(즉,자가 혈청에 의해 유도된 두드러기), 유형 II, 유형 III 또는 유형 IV.
의료용으로, 조작된 B 림프구는 바람직하게는 환자에게 투여된다. 환자에게 투여되는 B 림프구는 자가 B 림프구(즉, B 세포가 조작 전에 B 세포 또는 이의 전구 세포가 분리된 동일한 환자에게 투여됨) 또는 동종 B 림프구(다른 사람 (인간) 유래, 즉 B 세포는 조작 후에 투여되는 환자로부터 유래되지 않음)일 수 있다. 가장 바람직하게는, B 세포는 자가 B 림프구이고, 즉 조작된 B 림프구를 받는 환자는 조작 전에 B 림프구(또는 이의 전구 세포(들))가 분리된 환자와 동일한 환자이다.
따라서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 B 세포 치료 방법을 또한 제공한다 :
(a) 대상체(subject)부터 (조작되지 않은) B 림프구 분리하는 단계;
(b) 본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 따라 B 림프구를 조작하는 단계; 및
(c) 조작된 B 림프구를 (동일한) 대상체에게 투여하는 단계.
조작된 B 림프구(자가 또는 동종)가 대상체/환자에게 투여되는 경우, 대상체/환자에게 투여하기 전에 B 림프구를 암의 (발생에 관여하는 것으로 알려진 돌연변이에 대해 검사(예를 들어, 시험관 내에서)(즉, 이러한 돌연변이가 B 세포에서 발생하는지 여부를 검사)하는 것이 바람직하다. 이러한 암 유발 돌연변이의 예에는 염색체 전위가 포함된다. 따라서, 암의 (발달)에 관여하는 것으로 알려진 돌연변이를 갖는 것으로 확인된 조작된 B 림프구는 거부될 수 있다. 즉, 암의 (발달)에 관여하는 것으로 알려진 돌연변이를 갖는 것으로 확인된 조작된 B 림프구는 환자에게 투여되지 않는다. 따라서, 암 유발 돌연변이가 있는 B 세포를 투여할 위험이 크게 감소된다.
B 세포에서 암 유발 돌연변이를 검사하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, B 세포 표면의 면역글로불린 손실은 암 유발 돌연변이의 지표이다. 따라서, 조작된 B 세포는 B 세포를 환자에게 투여하기 전에 보존된 BCR 표면 발현을 위해 선별될 수 있다. 따라서, 환자에게 B 세포를 투여하기 전에 B 세포가 그 표면에 면역글로불린/B 세포 수용체를 발현하는 것을 확인하는 것이 바람직하다.
대안적으로 또는 추가적으로, 조작된 B 세포는 또한 환자/대상체에게 투여하기 전에 특정 종양 유전자의 존재에 대해 검사될 수 있다. 이러한 종양 유전자의 예에는 BCL6, BCL2 (MCL1), BCL11 및 MALT1이 포함된다. 따라서, B 세포를 환자에게 투여하기 전에, B 세포가 종양 유전자, 예를 들어 BCL6, BCL2 (MCL1), BCL11 및/또는 MALT1의 이상 발현(예를 들어, 과발현)을 나타내지 않는 것을 확인하는 것이 바람직하다.
추가의 측면에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 조작된 B 림프구의 세포주를 제공한다. 특히, 용어 "세포주"는 불멸화된 세포주를 의미한다. 불멸화된 세포주는 불멸화된 다세포 유기체의 세포 집단이므로, 시험관내에서 장기간 성장시킬 수 있다. B 세포를 불멸화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게는 EBV(Epstein-Barr 바이러스) 불멸화가 사용된다. 예를 들어, EBV를 이용한 B 세포 불멸화를 위한 개선된 방법은 다음문헌[Traggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. (2004): An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10(8):871-5]에 기재되어 있다.
이러한 불멸화된 B 세포주는 인간 항체의 생산에 특히 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는, (이종) (관심있는 폴리펩티드)를 포함하는 항체 또는 이의 단편을 생산하는 방법을 제공한다:
(1) 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따라 조작된 B 림프구 또는 B 세포주를 제공하는 단계로서, 상기 B 림프구는 스위치 영역에 삽입된 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 삽입물을 포함하는 편집된 면역글로불린 유전자좌를 포함하는, 단계;
(2) B 림프구 또는 B 세포주를 배양하는 단계; 및
(3) 관심있는 (이종) (폴리)펩티드를 포함하는 항체 또는 이의 단편을 B 세포 배양물로부터 분리하는 단계.
항체가 B 세포에 의해 분비되기 때문에 항체의 분리가 용이하다. 바람직하게는, 분리된 항체는 정제된다. 이는 항체가 일반적으로 다른 폴리펩티드가 실질적으로 없는 조성물에 존재한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 조성물의 90 (중량)% 미만, 일반적으로 60% 미만, 더 일반적으로 50% 미만이 다른 폴리펩티드로 구성된다.
또한, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편을 생산하는 방법은 바람직하게는 항체 또는 항체 단편의 특성을 규명하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 특성규명은
- 기능 분석을 수행하여 항체 또는 항체 단편의 기능을 결정하고/하거나;
- 결합 분석을 수행하여 항체 또는 항체 단편의 결합 특이성 및/또는 항체 또는 항체 단편에 의해 인식되는 결합 파트너/에피토프를 결정하고/하거나;
- 중화 분석을 수행하여 독소 또는 병원체를 중화하는 항체 또는 항체 단편의 능력을 결정하는 것을 포함한다.
기능 분석, 결합 분석 및 중화 분석은 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 항체의 기능에 따라 적절한 분석을 선택할 수 있다. 예를 들어, 항체가 결합 부위를 포함하는 경우(예를 들어, 삽입된 관심의 펩티드가 결합 부위를 포함하는 경우), 당업자는 상기 결합 부위의 결합 파트너를 이용한 결합 분석을 수행할 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 항체를 생성하기 위한 방법에 의해 얻어질 수 있는 항체를 또한 제공한다. 즉, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명에 따른 항체 생성 방법에 의해 제조된 항체를 또한 제공한다. 이러한 항체는 전술한 바와 같은 관심있는 (폴리)펩티드를 포함한다. 따라서, 관심있는 (폴리)펩티드는 전술한 바와 같이 항체의 엘보우 영역에 위치할 수 있다. 대안적으로, 관심있는 (폴리)펩티드는 본원에 기술된 항체의 (예를 들어, 중쇄의) 가변 영역 또는 불변 영역을 치환할 수도 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 조작된 B 림프구 또는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 조성물을 또한 제공한다. 바람직하게는, 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 추가로 포함한다. 따라서, 조성물은 바람직하게는 약학적 조성물이다.
담체 또는 부형제는 투여를 용이하게 할 수 있지만, 그 자체가 조성물을 받는 대상체에게 유해한 항체의 생성을 유도해서는 안된다. 독성도 없어야 한다. 적합한 담체는 단백질, 폴리펩티드, 리포좀, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자와 같은 크고 천천히 대사되는 거대분자일 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물에서 약제적으로 허용되는 담체는 활성성분 또는 불활성 성분일 수 있다.
약학적으로 허용되는 염, 예를 들어 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트과 같은 무기산 염, 또는 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트와 같은 유기산의 염이 사용될 수 있다.
약학적 조성물에서 약학적으로 허용되는 담체는 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충 물질과 같은 보조 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 대상체에 의한 섭취를 위해 약학적 조성물이 정제, 환약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 제형화될 수 있도록 한다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사액으로 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 비히클의 용액 또는 현탁에 적합한 고체 형태도 제조될 수 있다(예를 들어, 보존제를 함유하는 멸균수로 재구성하기 위해 SynagisTM 및 HerceptinTM과 유사한 동결건조된 조성물). 조성물은 예를 들어 연고, 크림 또는 분말로 제조될 수 있다. 조성물은 예를 들어 정제 또는 캡슐, 스프레이, 또는 시럽(선택적으로 향미제 첨가)으로 제조될 수 있다. 조성물은 예를 들어, 미세 분말 또는 스프레이를 사용하여 흡입제로서 제조될 수 있다. 조성물은 예를 들어 점안액(drop)으로 제조될 수 있다. 조성물은 조합된 조성물이 예를 들어 투여 직전에 재구성될 수 있도록 설계된 키트 형태일 수 있다. 예를 들어, 동결 건조된 항체는 멸균수 또는 멸균 완충액과 함께 키트 형태로 제공될 수 있다.
조성물의 활성 성분은 본 발명에 따른 조작된 B 세포 또는 항체인 것이 바람직하다. 조성물은 항체를 분해로부터 보호하거나 B 세포의 생존을 보장하는 제제를 함유할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체에 대한 철저한 논의는 다음문헌[Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN: 0683306472]에서 확인될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 일반적으로 pH가 5.5 내지 8.5이고, 몇몇 구체예에서는 6 내지 8 일 수 있고, 다른 구체예에서는 약 7 일 수 있다. pH는 완충제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 조성물은 멸균이고/이거나 발열원이 없을 수 있다. 조성물은 인간에 대해 등장성일 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 밀봉된 용기에 제공된다.
조성물은 유성 또는 수성 비히클에서 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있으며, 특히 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자는 사용전에 적절한 멸균 액체로 재구성하기 위한 건조 형태일 수 있다.
조성물은 물 또는 식염수와 같은 비히클을 포함할 수 있다. 비히클은 일반적으로 화합물, 예컨대 약학적 활성 화합물, 특히 본 발명에 따른 항체를 저장, 수송 및/또는 투여하기에 적합한 물질인 것으로 이해된다. 예를 들어, 비히클은 약학적 활성 화합물, 특히 본 발명에 따른 항체를 저장, 수송 및/또는 투여하기에 적합한 생리학적으로 허용되는 액체일 수 있다.
조성물은 발열원이 없고 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 수용액일 수 있다. 당업자는 예를 들어 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 수유 링거 주사액와 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다. 필요에 따라, 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 기타 첨가제가 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 예를 들어 미리충전된 주사기 형태로 제공될 수 있다.
또한, 상기 정의된 바와 같은 조성물은 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하지만 이에 제한되지 않는 투여 형태일 수 있다. 정제의 경우, 일반적으로 사용되는 담체는 유당과 옥수수 전분을 포함한다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제 또한 일반적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경우, 유용한 희석제는 유당 및 건조 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁액이 요구되는 경우, 활성 성분은 유화제 및 현탁제와 결합될 수 있다. 원하는 경우, 특정 감미료, 향료 또는 착색제를 첨가할 수도 있다.
조성물에 포함된 담체의 추가의 예는 광물유, 액체 바셀린, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 조성물은 적합한 로션 또는 크림으로 제형화 될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 적합한 담체는 미네랄 오일, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알코올 및 물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 항체를 포함할 수 있으며, 이때 항체는 조성물 내의 전체 단백질의 적어도 50 중량%(예를 들어, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)을 구성할 수 있다. 이러한 조성물에서 항체는 바람직하게는 정제된 형태이다.
약학적 조성물은 특히 다중 용량 형태로 포장된 경우 항균제를 포함할 수 있다. 이들은 세제, 예를 들어 Tween(폴리소르베이트), 예컨대 Tween 80을 포함할 수 있다. 세제는 일반적으로 0.01% 미만의 낮은 수준으로 존재한다. 또한, 조성물은 등장성을 제공하기 위해 나트륨 염(예를 들어, 염화나트륨)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 10 ± 2 mg/ml NaCl의 농도가 일반적이다.
추가로, 약학적 조성물은 특히 이들이 동결 건조되는 경우 또는 동결건조된 물질로부터 재구성된 물질을 포함하는 경우, 당 알코올(예를 들어, 만니톨) 또는 이당류(예를 들어, 수크로스 또는 트레할로스)를 약 15 내지 30 mg/ml(예를 들어, 25 mg/ml)로 포함할 수 있다. 동결건조를 위한 조성물의 pH는 동결건조 전에 5 내지 8, 또는 5.5 내지 7, 또는 약 6.1로 조절될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 한 종 이상의 면역조절제를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 면역 조절제 중 하나 이상은 보조제(adjuvant)를 포함한다.
본 발명에 따른 조작된 B 세포 또는 항체를 포함하는 조성물은 바람직하게는 의료 용도, 즉 의약으로 사용하기 위한 것이다. 이와 관련하여, 조작된 B 세포의 의학적 용도에 대하여 위에서 설명한 바와 같은 상세한 설명이 예를 들어 치료할 질병에 그에 따라 적용된다.
따라서, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 조작된 B 세포 또는 본 발명에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 면역 치료 방법을 제공한다.
아래에서는 첨부 도면의 간략한 설명이 제공된다. 도면은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것이다. 그러나, 그 도면들은 어떤 식으로든 본 발명의 요지를 제한하려는 의도는 아니다.
도 1은 원하는 특이성(관심있는 (폴리)펩티드)을 포함하는 항체를 생성하는 (관심의 (폴리)펩티드)의 여분의 엑손 요소의 통합에 의한 염색체 14상의 항체 스위치 영역의 AID 매개 B 세포 조작의 개략도를 보여준다.
도 2는 본 발명에 따라 조작된 B 세포로부터 얻을 수 있는 항체 사슬을 암호화하는 조작된 유전자의 개략적인 예 및 각각의 항체의 개략도를 나타낸다. (A) 항체의 엘보우 영역(가변 영역과 불변 영역 사이)에서 추가의 삽입물을 포함하는 예. (B) 예를 들어 항체의 본래 가변 영역을 치환하기 위한 T2A 프로테아제 절단 부위를 포함하는 예. V, D, J - 본래의 V, D, J 유전자. 불변 - 본래의 불변 도메인(들). T2A - 도입된 T2A 절단 부위. VH - 도입된 중쇄 가변 영역. VL - 도입된 경쇄 가변 영역. 수용체 도메인 - 도입된 수용체 도메인.
도 3은 게놈 LAIR1 삽입의 검출(실시예 1; exp 1), LAIR1-Ab 발현 일치 세포 생산 및 분류(sorting)에 의한 선별(실시예 2; exp 2) 또는 고처리량 스크리닝(실시예 3; exp 3)에 의한 선별을 위한 실시예에 대한 개략적 개요를 제공한다. 일수는 자극 뉴클레오펙션이 수행된 후에 경과된 일수를 나타내고 "뉴클레오펙션" 칼럼에서의 비고는 뉴클레오펙션에 사용된 핵산의 특징을 나타내고, "스크리닝" 칼럼에서의 비고는 수행된 스크리닝의 유형을 나타낸다.
도 4는 실시예 1에서 스위치 영역 PCR의 설계(A) 및 이중 가닥(dsDNA) LAIR1 기질의 뉴클레오펙션 후 MinION 시퀀싱 기술에 의한 긴 스위치-μ-영역 PCR 앰플 리콘에서 코돈 최적화된 LAIR1(부분적 통합을 포함)의 검출 결과(B)를 보여준다.
도 5는 실시예 2에 대한 것으로, (A)는 음성 (MME17) 및 양성 (MMJ5) 대조 B 세포주와 비교하여 FACS 분류에 의해 뉴클레오펙션후에 선택된 LAIR1-함유 항체를 발현하는, 본 발명에 따라 생성된 B 세포주의 LAIR1 및 IgM 표면 동시염색을 보여준다. (B)는 LAIR1 야생형 및 LAIR1 CH1/J6 인트론 최적화 기질이 뉴클레오펙션된 B 세포주에 의해 분비된 인공 LAIR1-함유 항체의 비드 풀다운(Bead pull down) 및 FACS 분석을 보여준다.
도 6은 실시예 2에 대한 것으로, (A)는 배양 상청액의 LAIR1 및 IgM 특이적 웨스턴 블롯을 보여준다. (B)는 재조합 LAIR1-함유 항체를 발현하는 조작된 B 세포주로부터 분리된 게놈 DNA의 스위치-μ-정방향 및 LAIR1-역방향 프라이머를 이용한 PCR 증폭을 보여준다. (C)는 스위치 영역(회색으로 강조 표시), LAIR1 인트론(회색), 스플라이스 수용체 부위(굵게 표시) 및 LAIR1 엑손(검은색)을 커버하는 스위치 영역 및 5' LAIR1 삽입물의 PCR 생성물 서열 정렬을 보여준다.
도 7은 실시예 3에 대한 것으로, (A)는 각각 60,000 및 35,000개 세포의 고처리량 스크리닝에 의해 검출된 재조합 LAIR1-함유 항체를 발현하는 조작된 B 세포주의 반도를 보여준다. 세포는 LAIR1 야생형 기질 또는 CH1/J6 인트론 최적화 버전으로 뉴클레오펙션되었다. II)의 스크리닝 조건은 배양 상청액에서 더 높은 항체 농도를 달성하기 위해 배양 시간을 증가시키면서 세포 시딩 수(seeding number)를 감소시킴으로써 최적화되었다. (B) 대조 비드에 대하여 항-LAIR1에 의해 포착된 IgM의 MFI 비율을 측정하는 2 개의 384 웰 배양 플레이트의 비드 스크리닝의 예. 열린 원은 양성 대조군을 나타내고 직사각형은 인공 LAIR1 함유 항체를 분비하는 배양물을 보여준다.
도 8은 실시예 4에 대한 것으로, (A)는 PBMC의 조사후 DNA 이중 가닥 절단을 나타내는 H2AX 염색(FACS 플로트)을 보여주고, (B) CD40L/IL4 자극 및 AID 유도 후 일치 B 세포를 보여준다. MFI = 평균 형광 세기.
도 9는 실시예 4에 대한 것으로, (A)는 pMAX-GFP 대조 플라스미드의 NEON 뉴클레오펙션 후 2일째에서 생존 및 GFP 발현 세포의 %를 보여준다. (B)는 추가의 스크리닝 실험을 위해 사용된 조건 d)(2150V, 10ms, 2회 펄스) 및 대조(mock) 뉴클레오펙션의 게이팅 전력을 보여주는 FACS 플로트이다.
도 10은 실시예 5의 원리와 결과를 보여준다. (A) 시험관내 스위치 삽입은 c-NHEJ에 의존한다. (B) 나이브 분류된 B 세포는 CD40L 및 IL4로 자극하고 c-NHEJ(SCR7), a-NHEJ(Olaparib) 또는 역전사효소(ddI/AZT)에 대한 억제제의 존재하에 9일 동안 배양했다. 천연 스위치 삽입물은 MinION 시퀀싱 기술에 의해 50,000 개의 시험관내 IgG + 스위칭된 B 세포에서 검출되었다.
도 11은 스플라이스 부위 인식을 위한 인트론 최적화의 개략도를 보여준다.
실시예
하기에서는, 본 발명의 다양한 구체예 및 측면을 예시하는 특정 실시예가 제시된다. 그러나, 본 발명은 본원에 설명된 특정 실시예에 의해 범위가 제한되지 않아야 한다. 하기의 제조예 및 실시예는 당업자가 본 발명을 보다 명확하게 이해하고 실시할 수 있도록 제공된다. 그러나, 본 발명은 단지 본 발명의 단일 측면의 예시로서 의도된 예시된 실시예에 의해 범위가 제한되지 않으며, 기능적으로 동등한 방법은 본 발명의 범위 내에 있다. 실제로, 본 명세서에 기재된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명, 첨부 도면 및 하기 실시예로부터 당업자에게 쉽게 명백해 질 것이다. 모든 이러한 수정은 첨부된 청구범위에 속한다.
실시예 1: 본 발명에 따라 조작되고 재조합 항체를 발현하는 B 세포의 생산
실시예 1 내지 3의 근본적인 근거는 분리된 인간 B 세포의 면역글로불린 스위치 영역이 유전적 변형을 위해 표적화될 수 있고 이어서 재조합 항체의 생산을 결과할 수 있음을 입증하는 것이었다. 예를 들어, 삽입된 LAIR1 도메인을 갖는 항체를 생산하는 조작된 인간 일차 B 세포를 생성하기 위해 여러 실험이 성공적으로 수행되었다(실시예 1 내지 3).
방법:
B 세포 분리, 자극 및 뉴클레오펙션. Miltenyi Biotec사의 항-CD19 마이크로 비드를 사용한 자기 세포 분류에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 일차 인간 B 세포를 분리했다. 1ml 당 100,000개의 B 세포를 12-웰에 도말했다. CD40L를 발현하는 방사선조사된 K562L 세포를 1:2 비율로 B 세포에 첨가하였다. 인간 재조합 IL4는 16 ng/ml로 첨가하였다. 다음날, 세포를 8 ng/ml IL4로 재자극하였다. 뉴클레오펙션은 세포 시딩 1 일후, IL4 재자극 4 시간 후에 수행되거나, 세포는 추가 배양하고, 8 ng/ml IL4로 3 일마다 재자극하고 지정된 시점에 뉴클레오펙션하였다. 뉴클레오펙션을 위해, B 세포를 수확하고 2x106 B 세포를 제조업사의 지침에 따라 NEON® 장치 및 2150V, 10ms 및 2 펄스를 이용하여 1μg DNA로 뉴클레오펙션하였다.
DNA 뉴클레오펙션 생성물. 코돈 최적화된 LAIR1은 자사의 코돈 최적화 도구를 사용하여 GenScript®로부터 유전자 합성을 통해 얻었다. ssDNA 생성을 위해, "LsODN(긴 단일 가닥 DNA) 제조 키트"(funakoshi)를 사용하였다. 코돈 최적화된 LAIR1은 pLSODN-1 벡터에 클로닝하였다.벡터의 제한 효소 분해를 수행하여 코돈 최적화된 LAIR1의 ssDNA 또는 블런트/점착 말단 dsDNA를 생성했다.
서열 분석. gDNA는 시판 키트(QIAGEN사)를 사용하여 뉴클레오펙션 7 일 후 뉴클레오펙션된 B 세포로부터 분리하였다. 50 μl 반응 부피로 LongAmp Taq 폴리머라제(New England Biolabs사)를 이용하여 gDNA에 대한 스위치 영역 PCR을 수행했다. PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 3 분의 인큐베이션; 다음에 95℃에서 40 초, 60℃에서 30 초 및 65℃에서 3 분의 30 사이클, 및 65℃에서 10 분의 최종 신장. 상류 스위치-μ 정방향 프라이머 S-μ-FW(cacccttgaaagtagcccatgccttcc; 서열번호 96)를 S-g-REV(cctgcctcccagtgtcctgcattacttctg; 서열번호 97)와 합쳤다. 대신에, 뉴클레오펙션된 B 세포 gDNA의 스위치-μ 영역은 S-μ-FW 프라이머를 S-μ-REV(ggaacgcagtgtagactcagctgagg; 서열번호 98)와 합쳐서 증폭했다. PCR 반응은 하기의 조건에서 50 μl 체적으로 1 M 베타인 및 3% DMSO와 함께 Herculase II Fusion DNA 폴리머라제(Agilent사)를 이용하여 수행했다: 98℃에서 4 분, 다음에 98℃에서 40 초, 58℃에서 30 초 및 72℃에서 4 분의 30 사이클, 및 72℃에서 10 분의 최종 신장. 스위치 영역 PCR의 디자인에 대한 개요는 도 4A에 제공되어 있다. 올리고클론 B 세포 배양물로부터 크기에 따라 선택되고 정제된 스위치 앰플리콘은 MinION/Oxford Nanopore Technology(ONT)에 의해 서열분석하였다. 바코드는 권장 BC-서열을 S-μ 및 S-g 프라이머에 추가하고 PCR 증폭하여 도입했다. 서열분석 라이브러리는 Nanopore 2D 서열분석 키트 SQK-LSK207을 사용하여 준비한 다음, Nanopore 플로우 셀 FLO-MIN106에 로딩하고 MinION Mk1B 서열분석장치로 최대 20 시간 동안 서열분석했다.
첫 번째 실험에 사용된 DNA 기질은 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 인트론 서열을 포함하는(flanking) 코돈 최적화 LAIR1 엑손 및 야생형을 갖는 ssDNA 및 dsDNA 버전을 포함했다:
TTGTGAGCAAGTCTCAGGGTCCTCACTGTCAACTGGGAAAAAACTCTGCAGTGATGAGAATCACATGCACGTAGAAGGTGCAGGAGGCGTGGGAATGTTCTAAGGTTGGGCTGTGGTCATGGCTGCATAACTCTATAAAATTGCTAAAATCCCTGAATTGTGATGCTAAAATGACGTGTGTGGCATGGTGACTTCCTACAGTGGACGCTGAGATCCTGCTCTGCTTCCCTCCT AG AAGATCTGCCCAGACCCTCCATCTCGGCTGAGCCAGGCACCGTGATCCCCCTGGGGAGCCATGTGACTTTCGTGTGCCGGGGCCCGGTTGGGGTTCAAACATTCCGCCTGGAGAGGGACAGTAGATCCACATACAATGATACTGAAGATGTGTCTCAAGCTAGTCCATCTGAGTCAGAGGCCAGATTCCGCATTGACTCAGTAAGAGAAGGAAATGCCGGGCTTTATCGCTGCATCTATTATAAGCCCCCTAAATGGTCTGAGCAGAGTGACTACCTGGAGCTGCTGGTGAAAG GT GAGGACGTCACCTGGGCCCTGCCCCAGTCTCAGCTCGACCCTCGAGCTTGTCCCCAGGT
[서열번호 99]
(관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 밑줄로 표시된다. 5' 및 3' 스플라이스 인식 부위는 굵은 이탤릭체로 표시된다)
결과
일반적으로, ssDNA 및 dsDNA 기질 모두를 사용한 뉴클레오펙션으로 인해 핵산 기질이 B 세포 게놈에 성공적으로 통합되었다. 예를 들어, 도 4B는 dsDNA를 이용하여 얻은 결과를 보여준다.
실시예 2: 본 발명에 따라 조작되고 재조합 항체를 발현하는 B 세포주의 추가의 조사
항체를 포함하는 LAIR1의 생산적인 삽입 및 발현에 대한 증거를 제공하기 위해, 일차 B 세포를 dsDNA LAIR1 야생형 기질로 뉴클레오펙션하고 LAIR1 및 IgM 공동 염색에 대한 세포 분류에 의해 스크리닝했다. Epstein-Barr 바이러스(EBV) 불멸화 후에 천연 LAIR1 수용체가 하향조절됨에 따라, 이러한 실험 세팅에서는 EBV 세포주가 생성되어 천연 수용체가 조작된 B 세포 수용체와 구별되었다.
뉴클레오펙션을 위한 LAIR1 야생형(wt) 생성물을 제조하기 위하여, 다음 프라이머(LAIR1_IN_FW ccacctccaaacggcaggcatcc(서열번호 100); LAIR1_INTR_REV ccaaaggccgcatgaccatcacgc(서열번호 101))을 이용하여 인간 게놈 DNA(gDNA)로부터 인간 야생형 LAIR1를 PCR 증폭했다. 인간 면역글로불린 유전자좌로부터 유래되는 LAIR1 엑손 및 인트론을 포함하는 키메라 DNA 생성물은, 우선 프라이머 IgM-CH1-IN-fw cctcagctgagtctacactgcgttcc (서열번호 102), IgM-CH1-IN-rev ctgaggacccgcaggacaaaagagaaaggg (서열번호 103), J6-IN-fw ggtcaccgtctcctcaggtaagaatggcc (서열번호 104), J6_IN-REVgccttttcagtttcggtcagcctcgc (서열번호 105)를 이용하여 단일 생성물을 증폭한 다음, 이들을 오버래핑 프라이머를 이용한 PCR에 의해 LAIR1-CH1-FW gcgggtcctcagaagatctgcccagaccc (서열번호 106) 및 LAIR1-J6-REV ggccattcttacctttcaccagcagctccagg (서열번호 107)을 갖는 LAIR1wt을 갖는 앰플리콘에 융합하여 생성했다. 최적화된 버젼은 프라이머 LAIR1-CH1-opt-FW gcgggtcctcaggggaagatctgcccagaccc (서열번호 108) 및 LAIR1-J6-REV ggccattcttacctgaggagacggctttcaccagcagctccagg (서열번호 109)을 이용하여 생성했다. 증폭동안 폴리머라제에 의해 도입된 돌연변이를 최소화하기 위하여, 높은 교정 활성을 갖는 Q5® High-Fidelity DNA Polymerase(New England Biolabs사)는 표준 PCR 증폭 프로그램을 적용하여 사용하였다.
위에서 설명한 바와 같이 B 세포를 분리, 자극 및 뉴클레오펙션하였다. 뉴클레오펙션 다음날, B 세포를 다음문헌[Traggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 2004 Aug;10(8):871-5. Epub 2004 Jul 11]에 기재된 바와 같이 37℃에서 4시간 회전 바이러스 배양하여 Epstein-Barr 바이러스(EBV)로 불멸화시켰다. B 세포를 세척하고, CpG-DNA (2.5 μg/ml)의 존재하에 24-웰 플레이트에 1x106/ml로 벌크 도말했다. 불멸화 및 B 세포의 LAIR1 야생형 수용체의 하향조절 1 주후, B 세포를 먼저 단일론 항-LAIR1 PE-접합 (클론 DX26, BD Bioscience, 550811) 및 항-IgM APC-접합 항체(Jackson ImmunoResearch, 109-606-129)로 표지한 다음 FACS 분류함으로써 LAIR1 및 IgM 동시 발혐에 대하여 라벨링하여 B 세포를 선별했다. LAIR1 및 IgM를 동시 발현한 세포를 96U 웰에 도말하고, 2주간 확장배양한 다음, FACS 분류를 통해 반복적으로 선별했다. 세포주로부터 분리된 gDNA의 게놈 분석 및 스위치-μ 영역 PCR 증폭을 위에서 설명한대로 수행한 다음 Sanger 서열분석을 수행했다.
EBV 불멸화된 B 세포에 의한 LAIR1 함유 항체의 분비를 확인하기 위해, 배양 상청액을 웨스턴 블롯 분석으로 분석하였다. 상청액을 물에 희석하고 4x 샘플 로딩 버퍼(Life Technologies사) 및 10x 환원제(Life Technologies사)와 함께 70℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 샘플을 4 내지 12% 아크릴아미드 구배(Invitrogen사)로 프리캐스트 겔에 로딩했다. 단백질은 iBlot2 장치(Life Technologies사)에 의해 PVDF 막으로 옮긴 다음 TBS에서 3% BSA로 실온에서 1 시간 동안 블로킹했다. 그 막은 인큐베이션 사이에 막을 세척하기 위해 2 개의 순차적인 TBS 인큐베이션과 함께 실온에서 1 시간 동안 TBS/1% BSA에 희석된 1차 및 2차 항체의 상이한 조합과 인큐베이션하였다. IgM 동형은 10 μg/ml 비표지 염소 항-인간 IgM(Southern Biotech사, 2020-01) 및 8 ng/ml 당나귀 항-염소 HRP(Jackson ImmunoResearch사, 705-036-147)로 염색하였다. LAIR1 함유 항체는 2 μg/ml의 다클론 염소 항-인간 LAIR1 항체(R&D)로 검출하였고 2차 당나귀 항-염소 HRP와 결합했다. 막은 Las4000 이미저(General Electric Company사)에서 ECL 기질을 이용하여 발색했다.
도 5는 FACS 분석 결과를 보여준다. 도 5A는 그의 표면에 LAIR1-IgM을 발현하는 B 세포가 성공적으로 생성되었음을 보여준다. LAIR1 도메인의 분비된 항체에의 통합은 위에서 설명한 대로 비드 캡처 분석(도 5B) 및 웨스턴 블롯 분석(도 6A)에 의해 확인하였다. 또한, 하기의 서열을 갖는 면역 글로불린-로커스 인트론 영역, 즉 J-세그먼트 하류 인트론 및 CH1-상류 인트론(LAIR1 CH1/J6으로 명명됨)이 LAIR1 야생형 엑손의 측면에 있는 기질을 사용하여 성공적인 통합이 달성되었다:
CCTCAGCTGAGTCTACACTGCGTTCCCCATCACACTCACCCTCCCTATACTCACTCCCAGGCCTGGGTTGTCTGCCTGGGGAGACTTCAGGGTAGCTGGAGTGTGACTGAGCTGGGGGCAGCAGAAGCTGGGCTGGAGGGACTCTATTGGCTGCCTGCGGGGTGTGTGGCTCCAGGCTTCACATTCAGGTATGCAACCTGGGCCCTCCAGCTGCATGTGCTGGGAGCTGAGTGTGTGCAGCACCTACGTGCTGATGCCTCGGGGGAAAGCAGGCCTGGTCCACCCAAACCTGAGCCCTCAGCCATTCTGAGCAGGGAGCCAGGGGCAGTCAGGCCTCAGAGTGCAGCAGGGCAGCCAGCTGAATGGTGGCAGGGATGGCTCAGCCTGCTCCAGGAGACCCCAGGTCTGTCCAGGTGTTCAGTGCTGGGCCCTGCAGCAGGATGGGCTGAGGCCTGCAGCCCCAGCAGCCTTGGACAAAGACCTGAGGCCTCACCACGGCCCCGCCACCCCTGATAGCCATGACAGTCTGGGCTTTGGAGGCCTGCAGGTGGGCTCGGCCTTGGTGGGGCAGCCACAGCGGGACGCAAGTAGTGAGGGCACTCAGAACGCCACTCAGCCCCGACAGGCAGGGCACGAGGAGGCAGCTCCTCACCCTCCCTTTCTCTTTTGTCCTGCGGGTCCTC AG AAGATCTGCCCAGACCCTCCATCTCGGCTGAGCCAGGCACCGTGATCCCCCTGGGGAGCCATGTGACTTTCGTGTGCCGGGGCCCGGTTGGGGTTCAAACATTCCGCCTGGAGAGGGACAGTAGATCCACATACAATGATACTGAAGATGTGTCTCAAGCTAGTCCATCTGAGTCAGAGGCCAGATTCCGCATTGACTCAGTAAGAGAAGGAAATGCCGGGCTTTATCGCTGCATCTATTATAAGCCCCCTAAATGGTCTGAGCAGAGTGACTACCTGGAGCTGCTGGTGAAAG GT AAGAATGGCCACTCTAGGGCCTTTGTTTTCTGCTACTGCCTGTGGGGTTTCCTGAGCATTGCAGGTTGGTCCTCGGGGCATGTTCCGAGGGGACCTGGGCGGACTGGCCAGGAGGGGATGGGCACTGGGGTGCCTTGAGGATCTGGGAGCCTCTGTGGATTTTCCGATGCCTTTGGAAAATGGGACTCAGGTTGGGTGCGTCTGATGGAGTAACTGAGCCTGGGGGCTTGGGGAGCCACATTTGGACGAGATGCCTGAACAAACCAGGGGTCTTAGTGATGGCTGAGGAATGTGTCTCAGGAGCGGTGTCTGTAGGACTGCAAGATCGCTGCACAGCAGCGAATCGTGAAATATTTTCTTTAGAATTATGAGGTGCGCTGTGTGTCAACCTGCATCTTAAATTCTTTATTGGCTGGAAAGAGAACTGTCGGAGTGGGTGAATCCAGCCAGGAGGGACGCGTAGCCCCGGTCTTGATGAGAGCAGGGTTGGGGGCAGGGGTAGCCCAGAAACGGTGGCTGCCGTCCTGACAGGGGCTTAGGGAGGCTCCAGGACCTCAGTGCCTTGAAGCTGGTTTCCATGAGAAAAGGATTGTTTATCTTAGGAGGCATGCTTACTGTTAAAAGACAGGATATGTTTGAAGTGGCTTCTGAGAAAAATGGTTAAGAAAATTATGACTTAAAAATGTGAGAGATTTTCAAGTATATTAATTTTTTTAACTGTCCAAGTATTTGAAATTCTTATCATTTGATTAACACCCATGAGTGATATGTGTCTGGAATTGAGGCCAAAGCAAGCTCAGCTAAGAAATACTAGCACAGTGCTGTCGGCCCCGATGCGGGACTGCGTTTTGACCATCATAAATCAAGTTTATTTTTTTAATTAATTGAGCGAAGCTGGAAGCAGATGATGAATTAGAGTCAAGATGGCTGCATGGGGGTCTCCGGCACCCACAGCAGGTGGCAGGAAGCAGGTCACCGCGAGAG
[서열번호 110]
(관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 밑줄로 표시된다. 5' 및 3' 스플라이스 인식 부위는 굵은 이탤릭체로 표시된다)
LAIR1 야생형 서열의 스위치 영역에의 게놈 삽입은 특정 PCR 반응 및 서열 분석에 의해 확인하였다(도 6B 및 도 6C).
실시예 3: 본 발명에 따라 조작되고 재조합 항체를 발현하는 B 세포주의 추가의 조사
LAIR1-함유 항체를 생산하는 성공적으로 뉴클레오펙션된 세포의 빈도를 평가하기 위해, 384 웰 형태의 웰 배양물 당 10 내지 30개의 세포를 LAIR1-포획 비드 분석을 통해 스크리닝하였다.
B 세포 분리, 자극, 뉴클레오펙션 및 EBV 불멸화를 위에서 기재한 바와 같이 수행했다. 바이러스 인큐베이션 후, 피더 세포로서 25,000개의 조사된 자가 PBMC 및 CpG-DNA(2.5 μg/ml)의 존재히에 B 세포를 10 또는 30개 세포/웰로 도말하였다. 2주의 배양 후, 세포의 상층액을 2-결정 비드 기반 면역분석(two-determinant bead-based immunoassay)에 의해 LAIR1 함유 항체의 분비에 대하여 분석했다. 따라서, 항-염소 IgG 마이크로비드(Spherotech사)를 염소 항-인간 LAIR1(R & D Systems사, AF2664) 또는 대조군 항체 염소 항-인간 EGF(R & D Systems사, AF-259-NA)로 20분 동안 실온에서 코팅했다. SYBR Green I(ThermoFisher Scientific사)를 LAIR1 항체 코팅 용액에 40x로 첨가하여 대조군 비드로부터 LAIR1-코팅 것을 구별했다. 비드를 세척하고, 혼합하고, 불멸화된 B 세포의 상청액과 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 비드에 의해 포착된 LAIR1 함유 항체는 2.5 μg/ml Alexa Fluor 647-접합 당나귀 항-인간 IgM(Jackson ImmunoResearch사, 709-606-073)를 이용하여 검출했다.
결과는 도 7에 나타낸다. 그 결과는 약 12,000 개의 일차 B 세포에서 하나의 생산적인 삽입의 빈도를 확인시켜 준다(도 7A, 도 7B).
실시예 4: 뉴클레오펙션 시점 및 조건의 최적화
본 실시예에서는, 뉴클레오펙션의 최적의 시점 및 조건을 조사했다.
B 세포는 항-CD19 비드를 이용한 자기 세포 분류에 의해 PBMC로부터 분리하였고, 전술한 바와 같이 CD40L 발현 K562L 세포 및 IL4를 이용하여 자극하였다. DNA 이중 가닥 절단의 유도를 평가하기 위해, 지정된 시점에서 세포를 수확하고 3.7% 포름 알데히드로 고정하고 90% 메탄올로 투과시키고 -20℃에서 보관했다. 분석 당일에, 세포를 0.25 μg/ml의 토끼 항-β(히스톤 H3, 클론 D1H2, # 12167S, 세포 신호전달)로 염색하고 유세포 분석에 의해 분석하였다. 항체 염색 특이성을 제어하기 위해, 조사되거나 처리되지 않은 PBMCS의 염색을 수행했다.
B 세포는 배양 개시 1 내지 10 일 후에 뉴클레오펙션하였다. 결과는 도 8에 도시되어 있다. 도 8B에서 H2AX 히스톤 마커의 염색에 의해 나타낸 바와 같이, 최대 DNA 이중 가닥 절단은 2 일 내지 3 일에 출발하여 달성된다.
다음에, B 세포는 2150V 10ms 1 펄스, 2150V 15ms 1 펄스, 2150V 20ms 1 펄스, 2150V 10ms 2 펄스, 2400V 10ms 1 펄스, 2400V 15ms 1 펄스, 2150V 20ms 1 펄스, 2500V 10ms 1 펄스 및 2500V 15ms 1 펄스에서 Neon® 형질감염 시스템(Thermo Fisher Scientific사)를 이용하여 별개의 조건하에서 뉴클레오펙션하였다. 결과는 도 9에 도시되어 있다. 모든 조건에서 성공적인 뉴클레오펙션이 달성되었다. 최상의 결과는 2150V, 10ms, 2 펄스를 사용하여 얻었다.
실시예 5: 스위치 영역에서 삽입물 획득에 미치는 c-NHEJ 및 a-EJ의 영향
조작 효율을 높이기 위해, 시험관내 시스템을 사용하여 천연 삽입물 획득에 미치는 c-NHEJ 및 a-EJ의 영향을 연구했다.
이를 위해, 항-CD19 비드를 사용한 자기 비드에 의해 B 세포를 분리한 다음 FACS 분류 및 나이브 B 세포(IgM+ IgD+ CD27- IgG- IgA-)의 선별을 수행했다. 세포를 50,000개 B 세포/ml의 농도로 48-웰 플레이트에 도말하고 25,000개의 방사선조사된 K562L/ml 및 8 ng/ml IL4를 이용하여 자극하였다. DNA 복구 억제제인 Olaparip(4nM), SCR7(100nM) 또는 대조구로서 DMSO(1:100)를 배양 배지에 첨가했다. 3 일 및 6 일째에, IL4 및 억제제가 첨가된 신선한 배지로 배양 배지를 교체하였다. 10 일째에 세포를 수확하고 형광표지된 항-CD19 및 항-IgG 항체로 염색하였다. 스위칭된 IgG B 세포는 유세포 분석법에 의해 분류되었고 gDNA는 상용 키트를 사용하여 분리하였다. 50,000개의 분류된 세포의 게놈 DNA는 위에서 설명한 바와 같이 γ-스위치 영역 PCR 증폭 및 MINION 서열분석에 사용하였다. 삽입물 빈도는 생물정보학 파이프라인(bioinformatics pipeline)을 이용하여 분석하였다(Pieper K, Tan J, Piccoli L, Foglierini M, Barbieri S, Chen Y, Silacci-Fregni C, Wolf T, Jarrossay D, Anderle M, Abdi A, Ndungu FM, Doumbo OK, Traore B, Tran TM, Jongo S, Zenklusen I, Crompton PD, Daubenberger C, Bull PC, Sallusto F, Lanzavecchia A: Public antibodies to malaria antigens generated by two LAIR1 insertion modalities. Nature. 2017. Aug 31 ; 548(7669):597-601).
일반적인 원리는 도 10A에 도시되고 결과는 도 10B에 도시되어 있다. 그 결과에 따르면, SCR7 존재하의 삽입 빈도는 Olaparib이 배양 배지에 첨가된 때 증가하면서 감소되기 때문에 천연 스위치 삽입물은 c-NHEJ DNA 복구 경로에 의존한다는 것이 확인된다(도 10A, 도 10B). 따라서, 억제제인 Olaparib의 존재하에서의 B 세포 조작은 조작 효율을 증가시킬 수 있다. 마찬가지로, c-NHEJ 매개 복구의 첫 번째 과정인 DNA 결합 단백질 Ku70/80을 이용한 DNA 기질의 전인큐베이션(pre-incubation) 및 DNA-Ku70/80 단백질 복합체의 뉴클레오펙션은 성공적인 통합의 수를 증가시킬 수 있다(도 10A).
서열 및 서열번호의 표(서열 목록):
서열번호 서열 비고
서열번호 1 AGGTAAGT 3' 스플라이스 부위
서열번호 2 YNCTGAC
여기서 Y는 C 또는 T 이고 N은 A, G, C 및 T로부터 선택된 임의의 뉴클레오티드일 수 있다.		 분기 부위
서열번호 3 GTAGTGAGGG 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 4 GTTGGTGGTT 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 5 AGTTGTGGTT 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 6 GTATTGGGTC 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 7 AGTGTGAGGG 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 8 GGGTAATGGG 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 9 TCATTGGGGT 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 10 GGTGGGGGTC 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 11 GGTTTTGTTG 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 12 TATACTCCCG 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 13 GTATTCGATC 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 14 GGGGGTAGG 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 15 GTAGTTCCCT 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 16 GTTAATAGTA 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 17 TGCTGGTTAG 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 18 ATAGGTAACG 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 19 TCTGAATTGC 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 20 TCTGGGTTTG 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 21 CATTCTCTTT 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 22 GTATTGGTGT 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 23 GGAGGGTTT 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 24 TTTAGATTTG 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 25 ATAAGTACTG 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 26 TAGTCTATTA 인트론 스플라이싱 인핸서
서열번호 27 CGAGGAGGCAGCTCCTCACCCTCCCTTTCTCTTTTGTCCTGCGGGTCCTCAG 인트론 서열
서열번호 28 CGAAGGGGGCGGGAGTGGCGGGCACCGGGCTGACACGTGTCCCTCACTGCAG 인트론 서열
서열번호 29 TCCGCCCACATCCACACCTGCCCCACCTCTGACTCCCTTCTCTTGACTCCAG 인트론 서열
서열번호 30 CCACAGGCTGGTCCCCCCACTGCCCCGCCCTCACCACCATCTCTGTTCACAG 인트론 서열
서열번호 31 TGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAG 인트론 서열
서열번호 32 GGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG 인트론 서열
서열번호 33 AGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAG 인트론 서열
서열번호 34 GGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAG 인트론 서열
서열번호 35 TGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCAGTCACATGGCGCCATCTCTCTTGCAG 인트론 서열
서열번호 36 AGATACCTTCTCTCTTCCCAGATCTGAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG 인트론 서열
서열번호 37 ACGCATCCACCTCCATCCCAGATCCCCGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG 인트론 서열
서열번호 38 ACGCGTCCACCTCCATCCCAGATCCCCGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG 인트론 서열
서열번호 39 ACGCATCCACCTCCATCCCAGATCCCCGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG 인트론 서열
서열번호 40 ACGCATCCACCTCCATCCCAGATCCCCGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG 인트론 서열
서열번호 41 GACCCACCCTCTGCCCTGGGAGTGACCGCTGTGCCAACCTCTGTCCCTACAG 인트론 서열
서열번호 42 TGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAG 인트론 서열
서열번호 43 AGACACCTTCTCTCCTCCCAGATCTGAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAG 인트론 서열
서열번호 44 AGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACGCATCCACCTCCATCTCTTCCTCAG 인트론 서열
서열번호 45 GGCCCACCCTCTGCCCTGGGAGTGACCGCTGTGCCAACCTCTGTCCCTACAG 인트론 서열
서열번호 46 GTGAGTCTGCTGTCTGGGGATAGCGGGGAGCCAGGTGTACTGGGCCAGGCAA 인트론 서열
서열번호 47 GTGAGTCCCACTGCAGCCCCCTCCCAGTCTTCTCTGTCCAGGCACCAGGCCA 인트론 서열
서열번호 48 GTAAGATGGCTTTCCTTCTGCCTCCTTTCTCTGGGCCCAGCGTCCTCTGTCC 인트론 서열
서열번호 49 GTGAGTCCTCACAACCTCTCTCCTGCTTTAACTCTGAAGGGTTTTGCTGCAT 인트론 서열
서열번호 50 GTGAGTCCTCACCACCCCCTCTCTGAGTCCACTTAGGGAGACTCAGCTTGCC 인트론 서열
서열번호 51 GTAAGAATGGCCACTCTAGGGCCTTTGTTTTCTGCTACTGCCTGTGGGGTTT 인트론 서열
서열번호 52 CATGGTGACTTCCTACAGTGGACGCTGAGATCCTGCTCTGCTTCCCTCCTAG 인트론 서열
서열번호 53 GTGAGGACGTCACCTGGGCCCTGCCCCAGTCTCAGCTCGACCCTCGAGCTTG 인트론 서열
서열번호 54 LEVLFQGP 절단 태그
서열번호 55 DDDDK 절단 태그
서열번호 56 IEGR 절단 태그
서열번호 57 ENLYFQG 절단 태그
서열번호 58 LVPRGS 절단 태그
서열번호 59 DX1EX2NPGP
여기서 X1은 Val 또는 Ile 이고,
X2 는 임의의 (천연 발생) 아미노산일 수 있다		 자기 처리 부위
서열번호 60 EGRGSLLTCGDVEENPGP 자기 처리 부위
서열번호 61 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP 자기 처리 부위
서열번호 62 ATNFSLLKQAGDVEENPGP 자기 처리 부위
서열번호 63 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP 자기 처리 부위
서열번호 64 RKRRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP 자기 처리 부위
서열번호 65 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK 트윈 StrepTag aa
서열번호 66 GLNDIFEAQKIEWHE AviTag
서열번호 67 KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL Calmodulin-태그
서열번호 68 EEEEEE polyglutamate 태그
서열번호 69 GAPVPYPDPLEPR E-태그
서열번호 70 DYKDDDDK FLAG-태그
서열번호 71 YPYDVPDYA HA-태그
서열번호 72 HHHHHH His-태그
서열번호 73 EQKLISEEDL Myc-태그
서열번호 74 TKENPRSNQEESYDDNES NE-태그
서열번호 75 KETAAAKFERQHMDS S-태그
서열번호 76 MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP SBP-태그
서열번호 77 SLAELLNAGLGGS Softag 1
서열번호 78 TQDPSRVG Softag 3
서열번호 79 WSHPQFEK Strep-태그
서열번호 80 CCPGCC TC 태그
서열번호 81 GKPIPNPLLGLDST V5 태그
서열번호 82 YTDIEMNRLGK VSV-태그
서열번호 83 DLYDDDDK Xpress 태그
서열번호 84 TDKDMTITFTNKKDAE Isopeptag
서열번호 85 AHIVMVDAYKPTK SpyTag
서열번호 86 KLGDIEFIKVNK SnoopTag
서열번호 87 EVHTNQDPLD Ty1 태그
서열번호 88 EDLPRPSISAEPGTVIPLGSHVTFVCRGPVGVQTFRLERERNYLYSDTEDVSQTSPSESEARFRIDSVNAGNAGLFRCIYYKSRKWSEQSDYLELVVK 돌연변이 LAIR1 단편 aa
서열번호 89 DSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVT PD-1 단편 aa
서열번호 90 EQVSTPEIKVLNKTQENGTCTLILGCTVEKGDHVAYSWSEKAGTHPLNPANSSHLLSLTLGPQHADNIYICTVSNPISNNSQTFSPWPGCRTDPS SLAM 단편 aa
서열번호 91 MAQVQLVESGGGLVQAGGSLTLSCAASGSTSRSYALGWFRQAPGKEREFVAHVGQTAEFAQGRFTISRDFAKNTVSLQMNDLKSDDTAIYYCVASNRGWSPSRVSYWGQGTQVTVSS T3-VHH aa
서열번호 92 QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSRVGVGWIRQPPGKALEWLSLIYWDDEKHYSPSLKNRVTISKDSSKNQVVLTLTDMDPVDTGTYYCAHRGVDTSGWGFDYWGQGALVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCSGAGSDVGGHNFVSWYQQYPGKAPKLMIYDVKNRPSGVSYRFSGSKSGYTASLTISGLQAEDEATYFCSSYSSSSTLIIFGGGTRLTVL TT39.7-scFv aa
서열번호 93 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYYIGWFRQAPGKEREAVSCISGSSGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATIRSSSWGGCVHYGMDYWGKGTQVTVSS F4-VHH aa
서열번호 94 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISASSSYSDYADSAKGRFTISRDNAKTSLFLQMNSLRAEDTAIYFCARARATGYSSITPYFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYDNNNRPSGVPDRFSASKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDRNLSGVFGTGTKVTVL MPE8-scFv aa
서열번호 95 TGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCTGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACC SV40 핵 위치화 신호
서열번호 96 cacccttgaaagtagcccatgccttcc 프라이머
서열번호 97 cctgcctcccagtgtcctgcattacttctg 프라이머
서열번호 98 ggaacgcagtgtagactcagctgagg 프라이머
서열번호 99 TTGTGAGCAAGTCTCAGGGTCCTCACTGTCAACTGGGAAAAAACTCTGCAGTGATGAGAATCACATGCACGTAGAAGGTGCAGGAGGCGTGGGAATGTTCTAAGGTTGGGCTGTGGTCATGGCTGCATAACTCTATAAAATTGCTAAAATCCCTGAATTGTGATGCTAAAATGACGTGTGTGGCATGGTGACTTCCTACAGTGGACGCTGAGATCCTGCTCTGCTTCCCTCCTAGAAGATCTGCCCAGACCCTCCATCTCGGCTGAGCCAGGCACCGTGATCCCCCTGGGGAGCCATGTGACTTTCGTGTGCCGGGGCCCGGTTGGGGTTCAAACATTCCGCCTGGAGAGGGACAGTAGATCCACATACAATGATACTGAAGATGTGTCTCAAGCTAGTCCATCTGAGTCAGAGGCCAGATTCCGCATTGACTCAGTAAGAGAAGGAAATGCCGGGCTTTATCGCTGCATCTATTATAAGCCCCCTAAATGGTCTGAGCAGAGTGACTACCTGGAGCTGCTGGTGAAAGGTGAGGACGTCACCTGGGCCCTGCCCCAGTCTCAGCTCGACCCTCGAGCTTGTCCCCAGGT DNA 기질
서열번호 100 ccacctccaaacggcaggcatcc 프라이머
서열번호 101 ccaaaggccgcatgaccatcacgc 프라이머
서열번호 102 cctcagctgagtctacactgcgttcc 프라이머
서열번호 103 ctgaggacccgcaggacaaaagagaaaggg 프라이머
서열번호 104 ggtcaccgtctcctcaggtaagaatggcc 프라이머
서열번호 105 gccttttcagtttcggtcagcctcgc 프라이머
서열번호 106 gcgggtcctcagaagatctgcccagaccc 프라이머
서열번호 107 ggccattcttacctttcaccagcagctccagg 프라이머
서열번호 108 gcgggtcctcaggggaagatctgcccagaccc 프라이머
서열번호 109 ggccattcttacctgaggagacggctttcaccagcagctccagg 프라이머
서열번호 110 CCTCAGCTGAGTCTACACTGCGTTCCCCATCACACTCACCCTCCCTATACTCACTCCCAGGCCTGGGTTGTCTGCCTGGGGAGACTTCAGGGTAGCTGGAGTGTGACTGAGCTGGGGGCAGCAGAAGCTGGGCTGGAGGGACTCTATTGGCTGCCTGCGGGGTGTGTGGCTCCAGGCTTCACATTCAGGTATGCAACCTGGGCCCTCCAGCTGCATGTGCTGGGAGCTGAGTGTGTGCAGCACCTACGTGCTGATGCCTCGGGGGAAAGCAGGCCTGGTCCACCCAAACCTGAGCCCTCAGCCATTCTGAGCAGGGAGCCAGGGGCAGTCAGGCCTCAGAGTGCAGCAGGGCAGCCAGCTGAATGGTGGCAGGGATGGCTCAGCCTGCTCCAGGAGACCCCAGGTCTGTCCAGGTGTTCAGTGCTGGGCCCTGCAGCAGGATGGGCTGAGGCCTGCAGCCCCAGCAGCCTTGGACAAAGACCTGAGGCCTCACCACGGCCCCGCCACCCCTGATAGCCATGACAGTCTGGGCTTTGGAGGCCTGCAGGTGGGCTCGGCCTTGGTGGGGCAGCCACAGCGGGACGCAAGTAGTGAGGGCACTCAGAACGCCACTCAGCCCCGACAGGCAGGGCACGAGGAGGCAGCTCCTCACCCTCCCTTTCTCTTTTGTCCTGCGGGTCCTCAGAAGATCTGCCCAGACCCTCCATCTCGGCTGAGCCAGGCACCGTGATCCCCCTGGGGAGCCATGTGACTTTCGTGTGCCGGGGCCCGGTTGGGGTTCAAACATTCCGCCTGGAGAGGGACAGTAGATCCACATACAATGATACTGAAGATGTGTCTCAAGCTAGTCCATCTGAGTCAGAGGCCAGATTCCGCATTGACTCAGTAAGAGAAGGAAATGCCGGGCTTTATCGCTGCATCTATTATAAGCCCCCTAAATGGTCTGAGCAGAGTGACTACCTGGAGCTGCTGGTGAAAGGTAAGAATGGCCACTCTAGGGCCTTTGTTTTCTGCTACTGCCTGTGGGGTTTCCTGAGCATTGCAGGTTGGTCCTCGGGGCATGTTCCGAGGGGACCTGGGCGGACTGGCCAGGAGGGGATGGGCACTGGGGTGCCTTGAGGATCTGGGAGCCTCTGTGGATTTTCCGATGCCTTTGGAAAATGGGACTCAGGTTGGGTGCGTCTGATGGAGTAACTGAGCCTGGGGGCTTGGGGAGCCACATTTGGACGAGATGCCTGAACAAACCAGGGGTCTTAGTGATGGCTGAGGAATGTGTCTCAGGAGCGGTGTCTGTAGGACTGCAAGATCGCTGCACAGCAGCGAATCGTGAAATATTTTCTTTAGAATTATGAGGTGCGCTGTGTGTCAACCTGCATCTTAAATTCTTTATTGGCTGGAAAGAGAACTGTCGGAGTGGGTGAATCCAGCCAGGAGGGACGCGTAGCCCCGGTCTTGATGAGAGCAGGGTTGGGGGCAGGGGTAGCCCAGAAACGGTGGCTGCCGTCCTGACAGGGGCTTAGGGAGGCTCCAGGACCTCAGTGCCTTGAAGCTGGTTTCCATGAGAAAAGGATTGTTTATCTTAGGAGGCATGCTTACTGTTAAAAGACAGGATATGTTTGAAGTGGCTTCTGAGAAAAATGGTTAAGAAAATTATGACTTAAAAATGTGAGAGATTTTCAAGTATATTAATTTTTTTAACTGTCCAAGTATTTGAAATTCTTATCATTTGATTAACACCCATGAGTGATATGTGTCTGGAATTGAGGCCAAAGCAAGCTCAGCTAAGAAATACTAGCACAGTGCTGTCGGCCCCGATGCGGGACTGCGTTTTGACCATCATAAATCAAGTTTATTTTTTTAATTAATTGAGCGAAGCTGGAAGCAGATGATGAATTAGAGTCAAGATGGCTGCATGGGGGTCTCCGGCACCCACAGCAGGTGGCAGGAAGCAGGTCACCGCGAGAG
 DNA 기질
서열번호 111 AAGATCTGCCCAGACCCTCCATCTCGGCTGAGCCAGGCACCGTGATCCCCCTGGGGAGCCATGTGACTTTCGTGTGCCGGGGCCCGGTTGGGGTTCAAACATTCCGCCTGGAGAGGGACAGTAGATCCACATACAATGATACTGAAGATGTGTCTCAAGCTAGTCCATCTGAGTCAGAGGCCAGATTCCGCATTGACTCAGTAAGAGAAGGAAATGCCGGGCTTTATCGCTGCATCTATTATAAGCCCCCTAAATGGTCTGAGCAGAGTGACTACCTGGAGCTGCTGGTGAAAG 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 112 TTGTGAGCAAGTCTCAGGGTCCTCACTGTCAACTGGGAAAAAACTCTGCAGTGATGAGAATCACATGCACGTAGAAGGTGCAGGAGGCGTGGGAATGTTCTAAGGTTGGGCTGTGGTCATGGCTGCATAACTCTATAAAATTGCTAAAATCCCTGAATTGTGATGCTAAAATGACGTGTGTGGCATGGTGACTTCCTACAGTGGACGCTGAGATCCTGCTCTGCTTCCCTCCTAG 인트론 서열
서열번호 113 GTGAGGACGTCACCTGGGCCCTGCCCCAGTCTCAGCTCGACCCTCGAGCTTGTCCCCAGGT 인트론 서열
서열번호 114 CCTCAGCTGAGTCTACACTGCGTTCCCCATCACACTCACCCTCCCTATACTCACTCCCAGGCCTGGGTTGTCTGCCTGGGGAGACTTCAGGGTAGCTGGAGTGTGACTGAGCTGGGGGCAGCAGAAGCTGGGCTGGAGGGACTCTATTGGCTGCCTGCGGGGTGTGTGGCTCCAGGCTTCACATTCAGGTATGCAACCTGGGCCCTCCAGCTGCATGTGCTGGGAGCTGAGTGTGTGCAGCACCTACGTGCTGATGCCTCGGGGGAAAGCAGGCCTGGTCCACCCAAACCTGAGCCCTCAGCCATTCTGAGCAGGGAGCCAGGGGCAGTCAGGCCTCAGAGTGCAGCAGGGCAGCCAGCTGAATGGTGGCAGGGATGGCTCAGCCTGCTCCAGGAGACCCCAGGTCTGTCCAGGTGTTCAGTGCTGGGCCCTGCAGCAGGATGGGCTGAGGCCTGCAGCCCCAGCAGCCTTGGACAAAGACCTGAGGCCTCACCACGGCCCCGCCACCCCTGATAGCCATGACAGTCTGGGCTTTGGAGGCCTGCAGGTGGGCTCGGCCTTGGTGGGGCAGCCACAGCGGGACGCAAGTAGTGAGGGCACTCAGAACGCCACTCAGCCCCGACAGGCAGGGCACGAGGAGGCAGCTCCTCACCCTCCCTTTCTCTTTTGTCCTGCGGGTCCTCAG 인트론 서열
서열번호 115 GTAAGAATGGCCACTCTAGGGCCTTTGTTTTCTGCTACTGCCTGTGGGGTTTCCTGAGCATTGCAGGTTGGTCCTCGGGGCATGTTCCGAGGGGACCTGGGCGGACTGGCCAGGAGGGGATGGGCACTGGGGTGCCTTGAGGATCTGGGAGCCTCTGTGGATTTTCCGATGCCTTTGGAAAATGGGACTCAGGTTGGGTGCGTCTGATGGAGTAACTGAGCCTGGGGGCTTGGGGAGCCACATTTGGACGAGATGCCTGAACAAACCAGGGGTCTTAGTGATGGCTGAGGAATGTGTCTCAGGAGCGGTGTCTGTAGGACTGCAAGATCGCTGCACAGCAGCGAATCGTGAAATATTTTCTTTAGAATTATGAGGTGCGCTGTGTGTCAACCTGCATCTTAAATTCTTTATTGGCTGGAAAGAGAACTGTCGGAGTGGGTGAATCCAGCCAGGAGGGACGCGTAGCCCCGGTCTTGATGAGAGCAGGGTTGGGGGCAGGGGTAGCCCAGAAACGGTGGCTGCCGTCCTGACAGGGGCTTAGGGAGGCTCCAGGACCTCAGTGCCTTGAAGCTGGTTTCCATGAGAAAAGGATTGTTTATCTTAGGAGGCATGCTTACTGTTAAAAGACAGGATATGTTTGAAGTGGCTTCTGAGAAAAATGGTTAAGAAAATTATGACTTAAAAATGTGAGAGATTTTCAAGTATATTAATTTTTTTAACTGTCCAAGTATTTGAAATTCTTATCATTTGATTAACACCCATGAGTGATATGTGTCTGGAATTGAGGCCAAAGCAAGCTCAGCTAAGAAATACTAGCACAGTGCTGTCGGCCCCGATGCGGGACTGCGTTTTGACCATCATAAATCAAGTTTATTTTTTTAATTAATTGAGCGAAGCTGGAAGCAGATGATGAATTAGAGTCAAGATGGCTGCATGGGGGTCTCCGGCACCCACAGCAGGTGGCAGGAAGCAGGTCACCGCGAGAG 인트론 서열
SEQUENCE LISTING <110> Institute for Research in Biomedicine <120> ENGINEERING B LYMPHOCYTES BY UTILIZING ENDOGENOUS ACTIVATION-INDUCED CYTIDINE DEAMINASE <130> IR01P010WO1 / IMP203756 <160> 115 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <400> 1 000 <210> 2 <400> 2 000 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> intronic splicing enhancer <400> 3 gtagtgaggg 10 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> intronic splicing enhancer <400> 4 gttggtggtt 10 <210> 5 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> intronic splicing enhancer <400> 5 agttgtggtt 10 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> intronic splicing enhancer <400> 6 gtattgggtc 10 <210> 7 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> intronic splicing enhancer <400> 7 agtgtgaggg 10 <210> 8 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> intronic splicing enhancer <400> 8 gggtaatggg 10 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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T3-VHH <400> 91 Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ser Arg 20 25 30 Ser Tyr Ala Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Phe Val Ala His Val Gly Gln Thr Ala Glu Phe Ala Gln Gly Arg Phe 50 55 60 Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu Gln Met Asn 65 70 75 80 Asp Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val Ala Ser Asn 85 90 95 Arg Gly Trp Ser Pro Ser Arg Val Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 92 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TT39.7-scFv <400> 92 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Arg Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ser Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Glu Lys His Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Leu Thr Asp Met Asp Pro Val Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Arg Gly Val Asp Thr Ser Gly Trp Gly Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro 130 135 140 Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser 145 150 155 160 Gly Ala Gly Ser Asp Val Gly Gly His Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Lys Asn 180 185 190 Arg Pro Ser Gly Val Ser Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Tyr 195 200 205 Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Thr 210 215 220 Tyr Phe Cys Ser Ser Tyr Ser Ser Ser Ser Thr Leu Ile Ile Phe Gly 225 230 235 240 Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 245 <210> 93 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F4-VHH <400> 93 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr 20 25 30 Tyr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Ile Arg Ser Ser Ser Trp Gly Gly Cys Val His Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 94 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MPE8-scFv <400> 94 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ala Ser Ser Ser Tyr Ser Asp Tyr Ala Asp Ser Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Arg Ala Thr Gly Tyr Ser Ser Ile Thr Pro Tyr Phe Asp 100 105 110 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Val Thr 130 135 140 Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser 145 150 155 160 Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn 180 185 190 Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser 195 200 205 Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu 210 215 220 Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Asn Leu Ser Gly Val Phe 225 230 235 240 Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 245 <210> 95 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40 nuclear localization signal <400> 95 tggttgctga ctaattgaga tgcatgcttt gcatacttct gcctgctggg gagcctgggg 60 actttccaca cctggttgct gactaattga gatgcatgct ttgcatactt ctgcctgctg 120 gggagcctgg ggactttcca cacc 144 <210> 96 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 96 cacccttgaa agtagcccat gccttcc 27 <210> 97 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 cctgcctccc agtgtcctgc attacttctg 30 <210> 98 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 98 ggaacgcagt gtagactcag ctgagg 26 <210> 99 <211> 590 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA substrate <400> 99 ttgtgagcaa gtctcagggt cctcactgtc aactgggaaa aaactctgca gtgatgagaa 60 tcacatgcac gtagaaggtg caggaggcgt gggaatgttc taaggttggg ctgtggtcat 120 ggctgcataa ctctataaaa ttgctaaaat ccctgaattg tgatgctaaa atgacgtgtg 180 tggcatggtg acttcctaca gtggacgctg agatcctgct ctgcttccct cctagaagat 240 ctgcccagac cctccatctc ggctgagcca ggcaccgtga tccccctggg gagccatgtg 300 actttcgtgt gccggggccc ggttggggtt caaacattcc gcctggagag ggacagtaga 360 tccacataca atgatactga agatgtgtct caagctagtc catctgagtc agaggccaga 420 ttccgcattg actcagtaag agaaggaaat gccgggcttt atcgctgcat ctattataag 480 ccccctaaat ggtctgagca gagtgactac ctggagctgc tggtgaaagg tgaggacgtc 540 acctgggccc tgccccagtc tcagctcgac cctcgagctt gtccccaggt 590 <210> 100 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 100 ccacctccaa acggcaggca tcc 23 <210> 101 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 101 ccaaaggccg catgaccatc acgc 24 <210> 102 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 102 cctcagctga gtctacactg cgttcc 26 <210> 103 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 103 ctgaggaccc gcaggacaaa agagaaaggg 30 <210> 104 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 104 ggtcaccgtc tcctcaggta agaatggcc 29 <210> 105 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 105 gccttttcag tttcggtcag cctcgc 26 <210> 106 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 106 gcgggtcctc agaagatctg cccagaccc 29 <210> 107 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 107 ggccattctt acctttcacc agcagctcca gg 32 <210> 108 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 108 gcgggtcctc aggggaagat ctgcccagac cc 32 <210> 109 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 109 ggccattctt acctgaggag acggctttca ccagcagctc cagg 44 <210> 110 <211> 1965 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA substrate <400> 110 cctcagctga gtctacactg cgttccccat cacactcacc ctccctatac tcactcccag 60 gcctgggttg tctgcctggg gagacttcag ggtagctgga gtgtgactga gctgggggca 120 gcagaagctg ggctggaggg actctattgg ctgcctgcgg ggtgtgtggc tccaggcttc 180 acattcaggt atgcaacctg ggccctccag ctgcatgtgc tgggagctga gtgtgtgcag 240 cacctacgtg ctgatgcctc gggggaaagc aggcctggtc cacccaaacc tgagccctca 300 gccattctga gcagggagcc aggggcagtc aggcctcaga gtgcagcagg gcagccagct 360 gaatggtggc agggatggct cagcctgctc caggagaccc caggtctgtc caggtgttca 420 gtgctgggcc ctgcagcagg atgggctgag gcctgcagcc ccagcagcct tggacaaaga 480 cctgaggcct caccacggcc ccgccacccc tgatagccat gacagtctgg gctttggagg 540 cctgcaggtg ggctcggcct tggtggggca gccacagcgg gacgcaagta gtgagggcac 600 tcagaacgcc actcagcccc gacaggcagg gcacgaggag gcagctcctc accctccctt 660 tctcttttgt cctgcgggtc ctcagaagat ctgcccagac cctccatctc ggctgagcca 720 ggcaccgtga tccccctggg gagccatgtg actttcgtgt gccggggccc ggttggggtt 780 caaacattcc gcctggagag ggacagtaga tccacataca atgatactga agatgtgtct 840 caagctagtc catctgagtc agaggccaga ttccgcattg actcagtaag agaaggaaat 900 gccgggcttt atcgctgcat ctattataag ccccctaaat ggtctgagca gagtgactac 960 ctggagctgc tggtgaaagg taagaatggc cactctaggg cctttgtttt ctgctactgc 1020 ctgtggggtt tcctgagcat tgcaggttgg tcctcggggc atgttccgag gggacctggg 1080 cggactggcc aggaggggat gggcactggg gtgccttgag gatctgggag cctctgtgga 1140 ttttccgatg cctttggaaa atgggactca ggttgggtgc gtctgatgga gtaactgagc 1200 ctgggggctt ggggagccac atttggacga gatgcctgaa caaaccaggg gtcttagtga 1260 tggctgagga atgtgtctca ggagcggtgt ctgtaggact gcaagatcgc tgcacagcag 1320 cgaatcgtga aatattttct ttagaattat gaggtgcgct gtgtgtcaac ctgcatctta 1380 aattctttat tggctggaaa gagaactgtc ggagtgggtg aatccagcca ggagggacgc 1440 gtagccccgg tcttgatgag agcagggttg ggggcagggg tagcccagaa acggtggctg 1500 ccgtcctgac aggggcttag ggaggctcca ggacctcagt gccttgaagc tggtttccat 1560 gagaaaagga ttgtttatct taggaggcat gcttactgtt aaaagacagg atatgtttga 1620 agtggcttct gagaaaaatg gttaagaaaa ttatgactta aaaatgtgag agattttcaa 1680 gtatattaat ttttttaact gtccaagtat ttgaaattct tatcatttga ttaacaccca 1740 tgagtgatat gtgtctggaa ttgaggccaa agcaagctca gctaagaaat actagcacag 1800 tgctgtcggc cccgatgcgg gactgcgttt tgaccatcat aaatcaagtt tattttttta 1860 attaattgag cgaagctgga agcagatgat gaattagagt caagatggct gcatgggggt 1920 ctccggcacc cacagcaggt ggcaggaagc aggtcaccgc gagag 1965 <210> 111 <211> 294 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding (poly)peptide of interest <400> 111 aagatctgcc cagaccctcc atctcggctg agccaggcac cgtgatcccc ctggggagcc 60 atgtgacttt cgtgtgccgg ggcccggttg gggttcaaac attccgcctg gagagggaca 120 gtagatccac atacaatgat actgaagatg tgtctcaagc tagtccatct gagtcagagg 180 ccagattccg cattgactca gtaagagaag gaaatgccgg gctttatcgc tgcatctatt 240 ataagccccc taaatggtct gagcagagtg actacctgga gctgctggtg aaag 294 <210> 112 <211> 235 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> intronic sequence <400> 112 ttgtgagcaa gtctcagggt cctcactgtc aactgggaaa aaactctgca gtgatgagaa 60 tcacatgcac gtagaaggtg caggaggcgt gggaatgttc taaggttggg ctgtggtcat 120 ggctgcataa ctctataaaa ttgctaaaat ccctgaattg tgatgctaaa atgacgtgtg 180 tggcatggtg acttcctaca gtggacgctg agatcctgct ctgcttccct cctag 235 <210> 113 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> intronic sequence <400> 113 gtgaggacgt cacctgggcc ctgccccagt ctcagctcga ccctcgagct tgtccccagg 60 t 61 <210> 114 <211> 685 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> intronic sequence <400> 114 cctcagctga gtctacactg cgttccccat cacactcacc ctccctatac tcactcccag 60 gcctgggttg tctgcctggg gagacttcag ggtagctgga gtgtgactga gctgggggca 120 gcagaagctg ggctggaggg actctattgg ctgcctgcgg ggtgtgtggc tccaggcttc 180 acattcaggt atgcaacctg ggccctccag ctgcatgtgc tgggagctga gtgtgtgcag 240 cacctacgtg ctgatgcctc gggggaaagc aggcctggtc cacccaaacc tgagccctca 300 gccattctga gcagggagcc aggggcagtc aggcctcaga gtgcagcagg gcagccagct 360 gaatggtggc agggatggct cagcctgctc caggagaccc caggtctgtc caggtgttca 420 gtgctgggcc ctgcagcagg atgggctgag gcctgcagcc ccagcagcct tggacaaaga 480 cctgaggcct caccacggcc ccgccacccc tgatagccat gacagtctgg gctttggagg 540 cctgcaggtg ggctcggcct tggtggggca gccacagcgg gacgcaagta gtgagggcac 600 tcagaacgcc actcagcccc gacaggcagg gcacgaggag gcagctcctc accctccctt 660 tctcttttgt cctgcgggtc ctcag 685 <210> 115 <211> 986 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> intronic sequence <400> 115 gtaagaatgg ccactctagg gcctttgttt tctgctactg cctgtggggt ttcctgagca 60 ttgcaggttg gtcctcgggg catgttccga ggggacctgg gcggactggc caggagggga 120 tgggcactgg ggtgccttga ggatctggga gcctctgtgg attttccgat gcctttggaa 180 aatgggactc aggttgggtg cgtctgatgg agtaactgag cctgggggct tggggagcca 240 catttggacg agatgcctga acaaaccagg ggtcttagtg atggctgagg aatgtgtctc 300 aggagcggtg tctgtaggac tgcaagatcg ctgcacagca gcgaatcgtg aaatattttc 360 tttagaatta tgaggtgcgc tgtgtgtcaa cctgcatctt aaattcttta ttggctggaa 420 agagaactgt cggagtgggt gaatccagcc aggagggacg cgtagccccg gtcttgatga 480 gagcagggtt gggggcaggg gtagcccaga aacggtggct gccgtcctga caggggctta 540 gggaggctcc aggacctcag tgccttgaag ctggtttcca tgagaaaagg attgtttatc 600 ttaggaggca tgcttactgt taaaagacag gatatgtttg aagtggcttc tgagaaaaat 660 ggttaagaaa attatgactt aaaaatgtga gagattttca agtatattaa tttttttaac 720 tgtccaagta tttgaaattc ttatcatttg attaacaccc atgagtgata tgtgtctgga 780 attgaggcca aagcaagctc agctaagaaa tactagcaca gtgctgtcgg ccccgatgcg 840 ggactgcgtt ttgaccatca taaatcaagt ttattttttt aattaattga gcgaagctgg 900 aagcagatga tgaattagag tcaagatggc tgcatggggg tctccggcac ccacagcagg 960 tggcaggaag caggtcaccg cgagag 986

Claims (65)

  1. 분리된 B 림프구의 게놈을 편집하는 방법으로서,
    (i) 상기 B 림프구의 내인성 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소를 활성화하는 단계; 및
    (ii) 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 상기 B 림프구에 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 CRISPR 뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제와 같은, 외인성 뉴클레아제 및/또는 조작된 뉴클레아제를 포함하지 않는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 DNA 분자는 선형 또는 선형화된 DNA 분자인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 분자는 단일 가닥 DNA 분자(ssDNA) 또는 이중 가닥 DNA 분자(dsDNA)인, 방법.
  5. 제4항에 있어서. 상기 DNA 분자는 dsDNA 분자인, 방법.
  6. 제5항에 있어서. 상기 DNA 분자는 블런트 말단 또는 오버행을 갖는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 분자는 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 상류 및/또는 하류에서 인트론 서열을 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서. 상기 인트론 서열은 스플라이스 인식 부위를 포함하는, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 인트론 서열은 Ig-유전자좌인트론 서열을 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서. 상기 인트론 서열은 J-세그먼트 하류 인트론의 인트론 서열 및/또는 CH-상류 인트론의 인트론 서열을 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 분자는 스플라이싱 인핸서를 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 림프구의 게놈은 N-말단에서 C-말단 방향으로 가변 도메인, 관심있는 (폴리)펩티드 및 불변 도메인을 포함하는 변형된 면역글로불린 사슬을 발현하도록 편집되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 림프구의 게놈은 내인성 가변 도메인이 관심있는 (폴리)펩티드로 치환되어 있는 변형된 면역글로불린 사슬을 발현하도록 편집되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 분자는 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 상류 및/또는 하류에서 절단 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 절단 부위는 T2A 절단 부위인, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심있는 (폴리)펩티드는 병원체 결합 도메인, VH 도메인, 또는 VH- VL 도메인을 포함하거나 그로 구성되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심있는 (폴리)펩티드는 CD4, 디펩티딜 펩티다제 4, CD9, 또는 안지오텐신-전환 효소 2 또는 이의 단편 또는 서열 변이체를 포함하거나 그로 구성되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 B 림프구는 일차 B 림프구인, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 B 림프구의 게놈이 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 조작된 B 림프구를 얻는 것을 포함하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 (iii) 상기 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 B 림프구의 게놈에의 통합을 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 B 림프구는 10% FBS, 1% NEAA, 1% 피루브산 나트륨, 1% 베타-머캅토에탄올, 1% 글루타맥스(Glutamax), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% 카나마이신 및 1% 트랜스페린을 갖는 RPMI 또는 IMDM에서 배양되는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 B 림프구는 1 x 105 내지 1x 106 개 세포/ml, 바람직하게는 2 x 105 개 세포/ml로 배양되는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 림프구는 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소의 활성화제를 포함하는 배양 배지에서 배양되는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소의 활성화제는 사이토카인, 항-B 세포 수용체 항체 또는 이의 단편, TLR 작용제, CpG-B 작용제, 이미다조퀴놀린 화합물 또는 상기 활성화제들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 사이토카인은 CD40L, IL4, IL2, IL21, BAFF, APRIL, CD30L, TGF-β1, 4-1BBL, IL6, IL7, IL10, IL13, c-Kit, FLT-3, IFNα 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인은 0.01 내지 20 ng/ml의 농도로 투여되는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 림프구는 IL4 및/또는 CD40L을 포함하는 배지에서 배양되는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소의 활성화는 CD40L 발현 세포주와의 공동 배양 및 IL-4의 첨가에 의해 수행되는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, (최종 배양 배지에서) IL-4의 농도는 0.005 내지 0.03 ng/ml, 바람직하게는 0.01 내지 0.025 ng/ml, 더 바람직하게는 0.015 내지 0.02 ng/ml, 가장 바람직하게는 0.16 ng/ml인, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 CD40L 발현 세포주는 K562L인, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 림프구에의 DNA 분자의 도입은 상기 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소를 활성화한 후 최대 10일, 바람직하게는 상기 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소를 활성화한 후 최대 7일, 더 바람직하게는 상기 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소를 활성화한 후 최대 5일, 더욱더 바람직하게는 상기 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소를 활성화한 후 최대 2일, 가장 바람직하게는 상기 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소를 활성화한 후 약 1일 후에 수행되는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 B 림프구에 레트로바이러스를 형질도입하는 것을 포함하지 않는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 분자는 뉴클레오펙션에 의해 도입되는, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 림프구는 DNA 분자를 B 림프구에 도입한 후 재활성화되는, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 예를 들어 제25항 내지 제31항에 정의된 바와 같은 B 세포 자극제는 DNA 분자를 B 림프구에 도입한 후 B 림프구에 적용되는, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 림프구는 DNA 분자를 B 림프구에 도입하기 전에 대체 말단 결합을 차단할 수 있는 DNA 억제제로 처리되는, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자는 DNA 분자를 B 림프구에 도입하기 전에 Ku70/Ku80과 같은 Ku 단백질을 이용하여 인큐베이션되는, 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 분자는 SV40 핵 위치화 신호와 같은 핵 위치화 신호를 포함하는, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 분자는 GFP 또는 RFP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 분자는 프로모터를 포함하는, 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 분자는 전사 단위를 포함하는, 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 림프구의 활성화-유도 시티딘 탈아미노효소의 활성화 후 약 24 시간 후, 상기 B 림프구는 Mirin과 같은 뉴클레아제 억제제로 처리되는, 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 림프구는 인간 B 림프구인, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 조작된 B 림프구.
  46. 스위치 영역에 삽입된 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 삽입물을 포함하는 편집된 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 조작된 B 림프구.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 B 림프구는 인간 유래인, B 림프구.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 림프구의 면역글로불린 유전자좌의 스위치 영역은 절단 부위, 특히 T2A 절단 부위를 포함하는, B 림프구.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 림프구의 면역글로불린 유전자좌의 스위치 영역은 병원체 결합 도메인, VH 도메인, 또는 VH- VL 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, B 림프구.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 림프구의 면역글로불린 유전자좌의 스위치 영역은 CD4, 디펩티딜 펩티다제 4, CD9, 또는 안지오텐신-전환 효소 2 또는 이의 단편 또는 서열 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, B 림프구.
  51. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 림프구는 형광 리포터 단백질을 발현하지 않는, B 림프구.
  52. 의료 용도를 위한 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 B 림프구.
  53. 제52항에 있어서, 상기 B 림프구는 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따라 조작되는 B 림프구.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 조작된 B 림프구는 환자에게 투여되는 B 림프구.
  55. 제54항에 있어서, 상기 조작된 B 림프구를 투여받은 환자는 상기 B 림프구가 조작 전에 분리된 환자와 동일한 환자인 B 림프구.
  56. B 세포 치료를 위한 방법으로서,
    (a) 환자로부터 B 림프구를 분리하는 단계;
    (b) 상기 B 림프구를 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따라 조작하는 단계; 및
    (c) 상기 조작된 B 림프구를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  57. 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 B 림프구의 세포주.
  58. 관심있는 (이종) (폴리)펩티드를 포함하는 항체 또는 이의 단편을 생성하는 방법으로서,
    (1) 제45항 내지 제51항 및 제57항 중 어느 한 항에 따른 조작된 B 림프구 또는 B 세포주를 제공하는 단계로서, 상기 B 림프구는 스위치 영역에 삽입된 관심있는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 삽입물을 포함하는 편집된 면역글로불린 유전자좌를 포함하는, 단계;
    (2) 상기 조작된 B 림프구 또는 B 세포주를 배양하는 단계; 및
    (3) 상기 관심있는 (이종) (폴리)펩티드를 포함하는 항체 또는 이의 단편을 상기 B 세포 배양물로부터 분리하는 단계를 포함하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 조작된 B 림프구는 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어지는, 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편의 특성을 규명하는 것을 추가로 포함하고, 상기 특성 규명은
    - 기능 분석을 수행하여 상기 항체 또는 항체 단편의 기능을 결정하고;
    - 결합 분석을 수행하여 상기 항체 또는 항체 단편의 결합 특이성 및/또는 상기 항체 또는 항체 단편에 의해 인식되는 결합 파트너/에피토프를 결정하고/하거나;
    - 중화 분석을 수행하여 독소 또는 병원체를 중화하는 상기 항체 또는 항체 단편의 능력을 결정하는 것을 포함하는, 방법.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 항체.
  62. 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 B 림프구 또는 제61항에 따른 항체를 포함하는 조성물.
  63. 제62항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  64. 의료 용도를 위한 제62항 또는 제63항에 따른 조성물.
  65. 제61항에 따른 항체, 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 조작된 B 세포 또는 제62항 또는 제63항에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 면역치료 방법.
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