JP2003521892A - プライマー伸長を使用して変異を検出するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物学的サンプルにおけるヌクレオチドの欠失を検出するための方法が記載される。本発明の方法は、ポリヌクレオチド反復の領域の欠失を検出するために特に有用である。特に、本発明の方法は、ＢＡＴ２６座の欠失を検出するために有用である。本発明の方法は、欠失が生じることが疑われる領域のプライマー上流をアニーリングすること、この領域を通ってプライマーを伸長させること、公知の末端ポイントにおいて伸長を終了すること、ならびにその伸長プライマーの長さおよび／または重量を、対応する野生型（影響されていない）領域から伸長したプライマーのそれまたは分子量標準（公知かまたは平行に延びるかのいずれか）とを比較することを包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、一般的に生物学的サンプルにおける核酸変異を検出するための方法
に関し、より詳細には、プライマー伸長反応を使用して核酸の欠失または挿入を
検出するための方法に関する。

【０００２】 （発明の背景） 多くの疾患は、ゲノム安定性の破壊によって開始すると考えられている。例え
ば、鎌状赤血球貧血、フェニルケトン尿症、血友病、嚢胞性線維症、および種々
の癌は、１つ以上の遺伝子変異に関連している。疾患についての分子的基礎の知
識の増加は、疾患関連の核酸変異を検出し得るスクリーニングアッセイの増加を
導いている。

【０００３】 １つのこのような方法は、疾患と関連すると考えられるゲノム領域を同定し、
そしてその領域の野生型配列を患者のサンプルの配列と比較する。配列における
差異は、ポジティブスクリーニングを構成する。例えば、Ｅｎｇｅｌｋｅら，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：５４４−５４８（１９８８）を
参照のこと。このような方法は、時間がかかり、費用がかかり、しばしば目的の
変異を同定することができない。従って、配列決定は、大規模なスクリーニング
アッセイには実用的ではない。

【０００４】 酵素的および化学的切断技術を使用するＤＮＡの配列変異を利用する種々の検
出方法が開発されている。通常使用されるＤＮＡ多型性のスクリーニングは、制
限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化する工程およびサザンブロットによって得
られたフラグメントを分析する工程からなる（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら，Ａｍ．Ｊ．
Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，３２：３１４−３３１（１９８０）およびＷｈｉｔｅら
，Ｓｃｉ．Ａｍ．，２５８：４０−４８（１９８８）に報告される）。エンドヌ
クレアーゼの認識配列に影響する変異は、その部位の酵素的切断を妨げ、それに
よって、ＤＮＡの切断パターンを変える。配列は、制限フラグメントの長さの差
を探すことによって比較される。この方法（制限酵素ＤＮＡ断片長の多型マッピ
ング、つまりＲＦＬＰマッピングとして公知）の問題点は、制限エンドヌクレア
ーゼでの切断に影響しない変異を検出することができないことである。１つの研
究は、ヒトＤＮＡの４０，０００塩基対領域に存在すると推定される０．７％の
みの変異の改変が、ＲＦＬＰ分析を使用して検出されたことを報告した。Ｊｅｆ
ｆｒｅｙｓ，Ｃｅｌｌ，１８：１−１８（１９７９）。

【０００５】 単一塩基変異は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用するデ
ィファレンシャルハイブリダイゼーション技術によって検出されている。Ｓａｉ
ｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：６２３０−６２３４
（１９８９）。変異は、ミスマッチのプローブと比較した、完全にマッチしたプ
ローブのより高い熱安定性を基準にして同定される。変異分析についてのこのア
プローチの不利な点には、（１）各プローブのハイブリダイゼーションの最適化
についての要求、および（２）ミスマッチおよび局所配列の性質がプローブの区
別の程度に制限を課すことが挙げられる。実際に、試験サンプルの配列の複雑性
が高い（例えば、異質な生物学的サンプル）場合、試験は、核酸ハイブリダイゼ
ーション機能のパラメーターのみに不十分に基づく。これは、単一のヌクレオチ
ド変化によって生成するハイブリッド安定性における小さな熱力学的差異に部分
的に起因する。従って、核酸ハイブリダイゼーションは、一般的に、分析および
診断の目的のためのいくつかの他の選択または濃縮手順と組み合わせられる。

【０００６】 鋳型依存性のプライマー伸長に基づく多くの検出方法が開発されている。これ
らの方法は、以下の２つのカテゴリーのうちの１つで置きかえられ得る：（１）
変異を質問される（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）領域にわたるプライマーを使用す
る方法、および（２）変異を質問される領域の上流をハイブリダイズするプライ
マーを使用する方法。

【０００７】 第１のカテゴリーにおいて、米国特許第５，５７８，４５８号は、単一の塩基
変異がミスマッチを有するプライマーと比較して、完全にマッチしたプライマー
の結合を支持するハイブリダイゼーション条件下で競合的オリゴヌクレオチドプ
ライミングによって検出される方法を検出する。米国特許第４，８５１，３３１
号は、プライマーの３’末端ヌクレオチドが目的の改変ヌクレオチドに対応する
類似の方法を報告する。プライマーの３’末端ヌクレオチドにおけるプライマー
および鋳型のミスマッチは、伸長を妨げ、トレーサーヌクレオチドの組込み量に
おける有意な差異は、正常なプライマー伸長条件下で生じる。

【０００８】 第２のカテゴリーにおける方法は、伸長プライマーにおける検出可能な鎖末端
ヌクレオチドの組込みに基づく。このような単一ヌクレオチドプライマーガイド
伸長アッセイは、アスパルチルグリコサミン尿症、血友病Ｂ、および嚢胞性線維
症を検出するため、そしてＬｅｂｅｒ Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ Ｏｐｔｉｃ Ｎ
ｅｕｒｏｐａｔｈｙに関連する点変異を定量化するために使用されている。例え
ば、Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
，８８：１１４３−１１４７（１９９１）；Ｓｙｖａｎｅｎら，Ｇｅｎｏｍｉｃ
ｓ，８：６８４−６９２（１９９０）；Ｊｕｖｏｎｅｎら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ，９３：１６−２０（１９９４）；Ｉｋｏｎｅｎら，ＰＣＲ Ｍｅｔ
ｈ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１：２３４−２４０（１９９２）；Ｉｋｏｎｅ
ｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１１２２２−１
１２２６（１９９１）；Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４１６７−４１７５（１９９４）。鎖末端ヌクレオチ
ドの前へのいくつかのヌクレオチドの追加を含む代替のプライマー伸長法がまた
、それらの分子量に基づいて伸長プライマーの分離を高めるために提案されてい
る。例えば、Ｆａｈｙら、ＷＯ／９６／３０５４５（１９９６）を参照のこと。

【０００９】 プライマー伸長に基づくストラテジーは、完全にアニールされたオリゴヌクレ
オチドのみが伸長反応のためにプライマーとして機能することを確実にするため
にかなりの最適化を必要とする。ポリメラーゼの高い忠実度によって与えられる
利点は、プライマーの鋳型へのハイブリダイゼーションにおけるヌクレオチドミ
スマッチの寛容性によって妥協され得る。任意の「偽」プライミングは、真の陽
性シグナルと区別するのは困難である。プライマー伸長反応の反応条件は、ミス
マッチオリゴヌクレオチドに起因する「偽」プライミングを減少させるために最
適化され得る。しかし、最適化は、労働集約的かつ高価であり、そしてしばしば
伸長プライマーの低収率に起因する低い感受性を生じる。

【００１０】 種々の形態の癌に導く多くの変異は、ゲノム配列からの複数のヌクレオチドの
欠失を含む。例えば、ＭＳＨ２ミスマッチ修復遺伝子のＢＡＴ２６セグメントで
ある。ＢＡＴ２６セグメントは、長いポリ−Ａトラクト（ｐｏｌｙ−Ａ ｔｒａ
ｃｔ）を含む。特定の癌において、特徴的な５塩基対の欠失が、ポリ−Ａトラク
トにおいて生じる。そのような欠失の検出は、診断的情報を提供し得る。従って
、本発明は、ＢＡＴ２６および他のもののようなゲノム領域における欠失（これ
らは、疾患と関連し得る）を検出するための方法を提供する。

【００１１】 （発明の要旨） 本発明の方法は、疾患を示すことが疑われるゲノム領域における欠失の同定に
ついてのアッセイを提供する。一般に、本発明の方法は、欠失が生じることが疑
われる領域のプライマー上流をアニーリングすること、この領域を通ってプライ
マーを伸長させること、公知の末端ポイントにおいて伸長を終了すること、なら
びにその伸長プライマーの長さおよび／または重量を、対応する野生型（影響さ
れていない）領域から伸長したプライマーのそれまたは分子量標準（公知かまた
は平行に延びるかのいずれか）とを比較することを包含する。好ましい実施形態
において、伸長されたプライマーは、欠失されることが疑われる領域の標識され
た下流である。非常に好適な実施形態において、伸長したプライマーの比較され
る長さおよび／または分子量が、ゲル電気泳動または質量分光法により測定され
る。また、非常に好ましい実施形態において、欠失を含むことが疑われる領域は
、欠失が生じることが疑われるポリヌクレオチドトラクトを含み、そして領域の
すぐ下流の配列は公知であり、そしてポリヌクレオチドトラクトに存在するヌク
レオチド種を反復しない。好ましくは、ポリヌクレオチドトラクトが、以下で詳
細に説明されるようなヌクレオチドの３個、２個、または好ましくは１個の種を
含む。本発明の方法は、伸長反応の成熟前終結に起因して、バックグラウンドを
減少させることにより、それらの感度を増大する一方、プライマー伸長アッセイ
の特異性を保持する。従って、本発明の方法は、主に野生型核酸の不均一サンプ
ルにおける少量の変異核酸を検出するための非常に高い感度でかつ非常に特異的
なアッセイを提供する。

【００１２】 本発明の方法は、１つ、せいぜい多くても３つのヌクレオチドの種を含み、そ
してすぐ上流のプライマーハイブリダイゼーションのための配列および欠失が疑
われる領域に存在するヌクレオチドを含まないすぐ下流の配列を有することによ
り特徴付けられる、ゲノムの領域における欠失の検出のためのスクリーニングア
ッセイを提供する。好ましい実施形態において、本発明の方法は、公知の野生型
配列を有しかつせいぜい３個の異なる型のヌクレオチドを含む領域（この領域の
欠失が疾患において疑われる）を有する核酸を選択すること；標的領域のすぐ上
流の、オリゴヌクレオチドプライマー、またはオリゴヌクレオチドプライマーの
対にハイブリダイズし；その標的領域のヌクレオチド塩基に相補的であるヌクレ
オチド塩基の存在下でポリメラーゼを使用することによりプライマーを伸長し、
それによりプライマー伸長産物を形成すること；標的領域から下流のヌクレオチ
ド塩基に相補的であるが、標的領域内のヌクレオチド塩基に相補的でない標識さ
れたヌクレオチドの存在下で、プライマー伸長産物をさらに伸長させること；お
よび、標準（例えば、野生型産物または分子量標準）と比較された伸長産物の大
きさを測定することを包含する。

【００１３】 好ましい実施形態において、欠失が生じることが疑われる標的領域は５ヌクレ
オチド長より大きく、そして／または欠失は、３ヌクレオチド長より大きい。好
ましい実施形態において、プライマー伸長反応は、連続的なアニーリング、伸長
、および変性温度を通じて反応温度を変更することにより、循環される。好まし
くは、分子量標準は、野生型伸長産物、または野生型核酸鋳型からの伸長産物に
ついて予期されるサイズに対応するものである。分子量標準より小さい伸長産物
の存在は、核酸鋳型の標的領域における欠失の存在を示す。好ましい実施形態に
おいて、プライマー伸長産物は、野生型核酸における標的領域から下流のヌクレ
オチドに相補的であるが、標的領域のヌクレオチドのいずれにも相補的でない、
ターミネーターヌクレオチドを取り込むことにより、終結される。より好ましい
実施形態において、標識されたヌクレオチドおよびターミネーターヌクレオチド
は同じである。代替的な実施形態において、１つより多い標識されたヌクレオチ
ド塩基は、ターミネーターヌクレオチドの取り込み前に伸長産物に取り込まれる
。好ましくは、欠失を含むことが疑われる領域を介する伸長の間に取り込まれる
ヌクレオチドは、標識されない。しかし、それらのヌクレオチドが標識さえる場
合、それらは、伸長産物の３’末端に取り込まれる標識されたヌクレオチドと好
ましく区別可能である。

【００１４】 好ましい実施形態において、本発明の方法は、標的領域および野生型核酸にお
いて欠失を有する核酸の、不均一混合物を含む、生物学的サンプル（例えば、便
、尿、精液、血液、痰、脳脊髄液、膿、または吸引液）における核酸変異を検出
することを包含する。標的領域におけるこのような欠失は、標的領域を有する核
酸分子の約１〜５％のみで存在し得る。このアッセイの感度を増加させるために
、サンプルは、ポリメラーゼ連鎖反応産物を含み得る。本発明の方法は、このよ
うな生物学的サンプル（便中の結腸直腸癌または前癌組織を含む）における癌ま
たは前癌組織の存在を示す標的領域における欠失を分析することにおいて特に有
用である。

【００１５】 別の実施形態において、本発明の方法は、標識されたヌクレオチドおよび未標
識のヌクレオチドの存在下で、プライマー伸長産物をさらに伸長することを含み
、このヌクレオチドは、同じ型（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）であり、そ
して標的領域から下流の１つ以上のヌクレオチドに相補的であるが、標的領域内
のヌクレオチドに相補的ではない。１つの実施形態において、標識されたヌクレ
オチド対未標識のヌクレオチドの比は、１：１である。本発明の方法はまた、伸
長産物中に、標識されたヌクレオチドまたは未標識のヌクレオチドの１つより多
くのモノマーを取り込むことを含み得る。

【００１６】 別の実施形態において、本発明の方法は、公知の野生型配列を含みかつ欠失を
含むことが疑われる標的領域（ここで、標識領域は、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴ
ＴＰ、およびｄＣＴＰからなる群より選択されるヌクレオチド塩基のせいぜい３
個の異なる型を含む）を有する核酸を選択することによりサンプル中の欠失を検
出すること；核酸サンプル中で、この標的領域の上流の領域にオリゴヌクレオチ
ドプライマーをハイブリダイズさせること；このハイブリダイズされたオリゴヌ
クレオチドプライマーを、伸長反応混合物（ｉ）標的領域におけるヌクレオチド
と相補的であるヌクレオチド、ｉｉ）標的領域から下流に見出されるヌクレオチ
ドと相補的であるが、標的領域内に見出される任意のヌクレオチド塩基に相補的
でない、標識されたヌクレオチド、およびｉｉｉ）標的領域から下流に見出され
るヌクレオチドと相補的であるが、標的領域内に見出される任意のヌクレオチド
に対して相補的でないターミネーターヌクレオチドを含む）と接触させること；
標識された伸長産物を生成するために、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチ
ドプライマーを伸長すること；および分子量標準に対して工程ｄ）からの標識さ
れた伸長産物の大きさを比較する（ここで分子量標準より小さい標識された伸長
産物は、標的領域における欠失の存在を示す）ことにより、サンプル中の欠失を
検出することを包含する。

【００１７】 本発明の方法は、不均一サンプルにおける癌または前癌の印を検出するために
特に有用である。便は、本発明の方法が有用である、不均一サンプルの良い例で
ある。代表的な便サンプルは、患者の核酸を含むが、また、核酸、タンパク質、
および結腸において見出される種々のヌクレアーゼ、プロテイナーゼなどの溶解
機能と一致する他の細胞性細片を含む。正常な環境下で、便は、基部結腸から末
端の結腸まで進みながら、便が凝固する。凝固している便が結腸を通過する場合
、結腸上皮細胞が、便中に剥がれ落ちる。患者が発達中の腫瘍または腺腫を有す
る場合、腫瘍または腺腫由来の細胞がまた、便中に剥がれ落ちる。これらの細胞
、および／またはそれらの細片は、疾患の分子的印（例えば、変異またはヘテロ
接合性の欠失）を含む。発生の初期において、腺腫または腫瘍を示す核酸は、排
出された便中に約１％だけ核酸を含む。未処理のままである場合、割合的により
疾患に関連する核酸が、便中に見出される。本発明の方法は、便のような不均一
なサンプルにおいて初期の病変を検出するために有用である。本発明の方法は、
初期の疾患の検出について程度の高い感度および特異性を生じる。本発明の方法
は、結腸における例えば、腺腫の検出において特に有用である。腺腫は、転移に
対する潜在性をしばしば有する非転移性病変である。患者における全ての腺腫が
検出され、そして除去される場合、完全な治癒の可能性は、実質的に確かになる
。

【００１８】 ＭＳＨ２ミスマッチ修復遺伝子のＢＡＴ２６座における検出は、結腸直腸癌と
関連されている。従って、非常に好ましい実施形態において、欠失が生じること
が疑われる領域は、ＢＡＴ２６座である。その座は、欠失が、癌または前癌と関
連しているポリＡトラクトを含む。ＢＡＴ２６座における本発明の方法の使用は
、予期される野生型伸長産物より短い、影響されたＤＮＡにおいて伸長産物を産
生することにより、特徴的な欠失を同定する。本発明の方法は、ＢＡＴ２６座を
使用して、以下に例示される。しかし、本発明の方法は、欠失が生じる任意の遺
伝子座において有用であることが理解される。特に有用な座は、疾患および特に
癌を示す座である。

【００１９】 本発明の特定の好ましい実施形態の詳細な説明が、以下に提供される。本発明
の他の実施形態は、続く詳細な説明の再調査において明らかである。

【００２０】 （発明の詳細な説明） 本発明の方法は、核酸サンプルにおける変異の存在を検出するための非常に感
度のよいアッセイを提供する。本発明の方法は、不均一な生物学的サンプルにお
ける核酸の欠失および／または挿入の存在を検出するのに特に有用である。好ま
しい実施形態において、本発明の方法は、癌のような疾患と関連する座で変異を
検出するために有用である。

【００２１】 一般に、本発明の方法は、変異が疑われる標的核酸領域を同定すること、およ
びプライマー伸長反応を使用して、標的領域を調べることを包含する。プライマ
ーは、標的領域の上流にハイブリダイズされ、そして標的領域を通って伸長され
る。伸長反応は、標的領域を越えた部位で終結される。伸長産物が分析され、そ
してその産物のサイズは、標的核酸領域における変異の変異の存在または非存在
の指標として使用される。一般に、予期されるより小さい伸長産物の存在が、標
的領域における欠失の存在を示す。逆に、予期されるより大きい標識された伸長
産物の存在は、一般に、標的領域における挿入の存在を示す。しかし、小さいか
または大きい、標識される伸長産物の存在はまた、以下の節でより詳細に説明さ
れるように、標識領域における点変異の指標となり得る。

【００２２】 本発明の方法は、標的領域が、伸長ポリメラーゼに、成熟前に、休止するか、
つまるか（ｓｔｕｔｔｅｒ）、または終結させる配列を含む場合、特に有用であ
る。例えば、ヌクレオチド反復（例えば、所定のヌクレオチドトラクト（例えば
、ＢＡＴ２６座のポリＡトラクト））、ジヌクレオチド反復またはトリヌクレオ
チド反復を含む領域。しかし、本発明は、公知の野生型核酸を有する座で変異を
検出するために一般的に有用である。

【００２３】 好ましい実施形態において、プライマーは、せいぜい３個の異なるヌクレオチ
ド塩基を含む標的領域の上流にハイブリダイズされる。このハイブリダイズされ
るプライマーは、標的領域のヌクレオチドと相補的である未標識のヌクレオチド
の存在下で標的領域を通って伸長される。プライマー伸長産物は、標的領域から
下流に見出されるヌクレオチドに相補的であるが、標的領域において見出されな
い標識されたターミネーターヌクレオチドの存在下でさらに伸長される。標識さ
れたターミネーターヌクレオチドが伸長反応に取り込まれる場合、伸長産物のみ
、標識される。結果的に、伸長産物が標的領域を通って、そして標識されるター
ミネーターヌクレオチドに相補的である鋳型ヌクレオチドに沿って伸長される場
合、伸長産物のみ、標識される。従って、成熟前に終結された伸長産物は標識さ
れず、そしてゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより、標識された産
物の検出および分析を干渉しない。

【００２４】 本発明は、プライマーが標識されるか、または標識されたヌクレオチドが、標
識領域を通る伸長が完了する前に伸長産物に取り込まれる実施形態を包含し、た
だし、さらなる標識が、成熟前に終結される伸長産物と区別され得るように十分
に伸長された産物に取り込まれる。１つの実施形態において、プライマーは、第
一標識で標識され、標識されたプライマーは、標識領域の上流にハイブリダイズ
され、そして標的領域を通じて伸長され、第二の標識が、標的領域から下流の伸
長産物中に取り込まれ、そして伸長反応が終結される。結果的に、標的領域内に
成熟前に終結する伸長産物が、第一の標識を含むだけであるが、一方、十分に伸
長された産物は、第１標識および第２標識の両方を含む。従って、診断上関連す
る伸長産物が、両方の標識を含む産物である。

【００２５】 本発明の方法はまた、標的領域を通る伸長が完了した後、伸長産物が標識され
、そして別個の工程で終結される。１つの実施形態において、鋳型核酸は、第１
のヌクレオチド塩基の反復からなる標的領域を含む。標的領域から下流は、第３
のヌクレオチド塩基が続く第２のヌクレオチド塩基である。プライマーは、標的
領域の上流にハイブリダイズされ、そして第１のヌクレオチドに相補的である未
標識のヌクレオチドの存在下で標的領域を通って伸長される。標的領域を通る伸
長が完了した後、伸長産物は、鋳型の第２のヌクレオチドに相補的である標識さ
れたヌクレオチドの存在下でさらに伸長される。最終的に、標識された伸長産物
は、鋳型の第３のヌクレオチドに相補的であるターミネーターヌクレオチド（例
えば、ジデオキシヌクレオチド）の存在下で、伸長反応を介して終結される。本
方法のこの局面の他の実施形態はまた、以下の節に記載される。

【００２６】 従って、本発明の重要な局面は、成熟前に終結された伸長産物が成熟前の終結
を起こさなかった完全な伸長産物と区別され得るプライマー伸長反応である。好
ましくは、成熟前に終結された伸長産物は標識されないが、一方、完全な伸長産
物が、検出可能に標識される。図１は、欠失検出アッセイにおける発明の有用性
を例示する。図１に関連する実験的な詳細が、実施例１により詳細に記載される
。図１は、本発明が、欠失を含むことが疑われる標的核酸領域を調査する場合、
バックグラウンドを最小化するための有効な方法を提供する。図１Ａは、標識さ
れるヌクレオチドを、標的領域の上流の伸長産物に取り込むプライマー伸長アッ
セイにより分析された複数のサンプルを示す。図１Ｂにおいて、同じサンプルが
、本発明の方法に従って分析された。図１Ｂは、図１Ａにおいて見られる標識さ
れた成熟前に終結された伸長産物のバックグラウンドを含まない。結果的に、欠
失の存在は、図１Ｂの列７に明らかに示されるが、一方、図１Ａの列７は、解釈
がより難しい。

【００２７】 本発明のさらなる局面が、以下の節に記載され、そして実施例により例示され
る。

【００２８】 （標的領域およびオリゴヌクレオチドプライマーの選択） 好ましくは、疾患（例えば、癌）に関連する座が、選択される。最も好ましく
は、しばしば１つ以上の欠失を示すことが公知の座が、選択される。有用な座と
しては、４個の可能なヌクレオチド塩基のうちせいぜい３個を含む座が挙げられ
る。好ましくは、選択される座は、欠失が生じることが疑われるポリヌクレオチ
ド領域を含む。一旦座が選択されると、プライマーは、欠失を含むことが疑われ
る領域のすぐ上流のヌクレオチド配列に結合する特異性を最大にするために、設
計されるかまたは選択される。プライマーは、欠失を含むことが疑われる領域の
すぐ上流にハイブリダイズしなければならず、その結果、標識されないヌクレオ
チドは、プライマー伸長産物中に取り込まれない。

【００２９】 （サンプル調製およびハイブリダイゼーション） 本発明の方法は、生検サンプルを含む任意の組織または体液、および高濃度の
罹患している（すなわち、変異している）細胞または細胞片を有しているその他
のサンプルに対して実施される。しかし、本発明の方法は、特に、異種生物学的
サンプルにおける変異を検出することに有用である。好ましいサンプルは、糞便
である。糞便サンプルの分析のために、本発明の好ましい方法は、米国特許第５
，７４１，６５０号および同時係属中の同時所有の米国特許出願第０９／０５９
，７１８号（これらの両方は、本明細書中に参考として援用される）において教
示されるように排出された糞便の少なくとも断面部分または周辺部分を得る工程
を包含する。糞便の断面部分または周辺部分が、望ましいが、本明細書中で提供
される方法は、排出された糞便（スミアまたは切屑（ｓｃｒａｐｉｎｇ）を含む
）から得られた無作為のサンプルに対して行われる。得られた糞便試料は、一旦
、ホモジナイズされる。ホモジナイゼーションのための好ましい緩衝液は、同時
係属中の同時所有の米国特許出願第６０／１２２，１７７号（本明細書中で参考
として援用される）において教示されるように、少なくとも１６ｍＭエチレンジ
アミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む緩衝液である。少なくとも１６ｍＭのＥＤＴＡ
、および好ましくは１００ｍＭのＥＤＴＡの使用が、糞便から核酸の収量を非常
に向上させることが発見された。従って、糞便ホモジナイゼーションのために好
ましい緩衝液は、リン酸緩衝化生理食塩水、２０〜１００ｍＭ ＮａＣｌまたは
ＫＣｌ、少なくとも１６ｍＭのＥＤＴＡ、ならびに必要に応じて界面活性剤（例
えば、ＳＤＳ）およびタンパク質分解酵素（例えば、プロテイナーゼＫ）を含む
。

【００３０】 ホモジナイゼーションの後、核酸は、好ましくは糞便サンプルから単離される
。核酸の単離または抽出は、特定の検出技術が、核酸の単離を伴わないでホモジ
ナイゼーションした糞便において適切に実施され得る場合、本発明の全ての方法
において必要ではない。しかし、好ましい実施形態において、ホモジナイゼーシ
ョンした糞便は、スピンされ、核酸、タンパク質、脂質および他の細胞片を含む
上清を得る。この上清は、界面活性剤およびタンパク質分解酵素で処理し、タン
パク質を分解して、そして核酸は、フェノール−クロロホルム抽出される。次い
で、抽出された核酸は、アルコールを用いて沈殿される。他の技術を使用して、
このサンプルから核酸を単離し得る。このような技術としては、ハイブリッド捕
獲、およびこのホモジナイズした糞便からの直接的増幅が挙げられる。核酸は、
使用されるスクリーニングアッセイによって必要とされる程度まで精製および／
または単離され得る。

【００３１】 分析される核酸は、公知の、または推測される特定の変異と癌もしくは前癌と
の間の関係に基づいて選択される。所望の場合、配列特異的ハイブリッド捕獲を
使用して、サンプルから特定の核酸を単離する。標的核酸は、当該分野の任意の
方法によって分析され得る。好ましい方法の例としては、米国特許第５，６７０
，３２５号（本明細書中で参考として援用される）において教示されるような異
種接合性の欠失の列挙される分析が挙げられる。列挙される方法は、変異核酸の
配列の知識を必要としない。どちらかと言えば、このような方法は、野生型の核
酸における変更（欠失、置換、付加、再編成、または他の変異）が存在すること
を決定する。調査された遺伝子座は、癌または前癌と関連する変更の可能性に基
づいて選択される。列挙される方法は、癌または前癌における変更が既知ではな
い野生型核酸のサンプルにおける数を、癌または前癌における変更が既知または
推測されている野生型核酸の数と比較する。この２つの数における統計的に有意
な違いは、ポジティブスクリーンを示す。

【００３２】 （プライマー伸長、標識および終結） ハイブリダイズしたプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼを使用する伸長を含む
プライマー伸長のための公知の方法を使用する標的領域を通って伸長される。伸
長したプライマーは、好ましくは、検出可能な標識を使用して標識される。好ま
しくは、一旦、この標的領域を通る伸長が完了すると、標識されたヌクレオチド
は、伸長したプライマーに付加される。好ましい実施形態において、標識した伸
長反応は、その標的領域の下流の所定の位置で終結される。好ましい実施形態に
おいて、標識する工程および終結する工程は、同時に実施される。１つの実施形
態において、標識したターミネーターヌクレオチドは、その標的領域の下流の伸
長したプライマーに組み込まれる。あるいは、標識する工程および終結する工程
は、別々に実施される。好ましくは、標識反応および終結反応は、その標的領域
の下流のほぼ同一の所定の部位において実施される。そうでなければ、標識され
た伸長産物の成熟前の終結は、その結果の分析を妨害し得る。実際に、標識され
た伸長産物が、所定の終結部位に達するために有意に伸長されなければならない
場合、標識された伸長産物の成熟前の終結は、予期される標識された伸長産物よ
りも短くなる。この短い伸長産物は、欠失の偽陽性の徴候を生じるか、または標
的領域の欠失から生じる短い伸長産物の検出を妨害するバックグラウンドを作製
するかのいずれかであり得る。好ましくは、標識された塩基はまた、ターミネー
ター塩基である。より好ましくは、この標識された塩基は、このターミネーター
塩基のすぐ上流に組み込まれる。標識は、好ましくは、放射活性同位体である。
あるいは、蛍光タグ、分子量タグまたは他の検出可能な標識である。

【００３３】 （伸長産物の検出および分析） 本発明の好ましい方法において、未標識のプライマー伸長産物が意図されるが
、欠失を含むと推測される領域を通って伸長された伸長産物のみが分析される。
なぜなら、これらは、検出可能な標識を含む伸長産物のみであるためである。変
異を含むと推測される領域内の成熟前に終結される伸長産物は、このアッセイに
おいて標識されず、かつ検出されない。従って、これらの成熟前の伸長産物は、
この結果の分析を妨害するバックグラウンドノイズに関与しない。

【００３４】 伸長されたプライマー産物は、好ましくは、２つのプライマーの異なる長さを
決定するためにゲル電気泳動、質量分析、配列決定、および他の方法を用いて検
出される。

【００３５】 以下の実施例は、糞便試料から調製されたサンプルにおけるＢＡＴ２６および
ＡＰＣ１３０９遺伝子座における欠失検出を用いて本発明の実施を例示する。

【００３６】 （実施例１：ＢＡＴ２６遺伝子座における欠失検出） 実験を、ＢＡＴ２６遺伝子座における欠失を検出するために本発明の有用性を
実証するために実施した。以下の実験は、標的領域を通る伸長の前に標識を取り
込むプライマー伸長反応を使用するＢＡＴ２６遺伝子座における欠失の検出に対
する特異性対伸長産物の３’末端における標識を取り込むプライマー伸長反応を
使用するＢＡＴ２６遺伝子座における欠失の検出に対する特異性を比較する。

【００３７】 核酸鋳型は、以下のように調製した。ＢＡＴ２６遺伝子座を含む鋳型核酸を、
ＰＣＲによって増幅した。各々の５０μｌのＰＣＲ反応チューブに４０μｌの洗
浄したストレプトアビジン被覆Ｄｙｎａｌビーズを添加し、そして数秒間、高設
定のボルテクスによって混合した。この混合物を、棚において室温で１５分間イ
ンキュベートして、そして５分後にボルテクスによって混合して、そして１０分
間インキュベートした。このチューブを、磁気チューブホルダーに置き、そして
上清を取り出した。２×Ｂｉｎｄｉｎｇ ＆ Ｗａｓｈ（結合および洗浄）緩衝
液の１００μｌのアリコートを、各サンプルに添加し、そして数秒間、高設定で
ボルテクスした。このチューブを、再度、磁気チューブホルダーに置き、そして
上清を取り出した。０．１Ｍ ＮａＯＨの１００μｌのアリコートを、各チュー
ブに添加し、そして数秒間、高設定のボルテクスによって混合した。室温で５分
間インキュベーション後、このチューブを、磁気チューブホルダーに起き、そし
て上清を取り出した。さらに、１００μｌの０．１Ｍ ＮａＯＨを添加し、そし
て数秒間ボルテクスした。磁気チューブホルダーにチューブを置き、そして上清
を取り出した後、１００μｌの１×Ｂｉｎｄｉｎｇ ＆ Ｗａｓｈ緩衝液を添加
し、そして高設定で数秒間ボルテクスした。このチューブを磁気チューブホルダ
ーに置き、上清を取り出し、そして１００μｌの１×ＴＥ（ｐＨ８．０）を添加
した。このチューブを、数秒間、高設定でボルテクスし、磁気チューブホルダー
に置き、そして上清を取り出した。このビーズを、１００μｌの０．１×ＴＥ（
ｐＨ８．０）緩衝液中に数秒間、高設定でボルテクスすることによって再懸濁し
た。得られたサンプルを、アッセイにおいて使用し、そして４℃で、１ヶ月まで
保存し得る。

【００３８】 第１の実験において、５μｌのビーズ結合ＰＣＲ産物を、以下のプライマー伸
長反応混合物に添加した：９．６２５μｌの滅菌分子生物学グレードのｄｉＨ２
０、２．５μｌの１０×Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ緩衝液、２．５μｌの５μＭプライ
マー１、２．５μｌの２ｍＭ ｄＡＴＰ、２．５μｌの５０μＭ ｄｄＧＴＰ、
０．１２５μｌの３２Ｐ ｄＴＴＰ、および０．２５μｌのＳｅｑｕｅｎａｓｅ
。

【００３９】 この反応混合物を、以下の温度プロフィールに従ってＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｔｅｔｒａｄ Ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒにおいてサイクルした。

【００４０】 温度 時間 サイクル数 ９４℃ ５分 １ ９４℃ ３０秒 ５２℃ １０秒 ３０ ７２℃ １０秒 ４℃ 実行後直ぐにサイクラーから取り出してもよいし、または実行後
、一晩４℃にしておいてもよい。

【００４１】 ホルムアミドベースの停止溶液の１５μｌのアリコートを、各サンプルに添加
し、そして５分間上下にピペッティングすることによって混合した。各々のサン
プルからの７μｌのアリコートを、１×ＴＢＥ泳動緩衝液中７Ｍ 尿素を含有す
る１５％変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分析した。このゲルを乾燥させ、
そしてＰａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔａｎｔ Ｉｍａｇｅｒを用いて分析した。結果
を、図１Ａに示す。レーン１〜８は、患者の糞便サンプルから得られたＤＮＡの
分析である。レーン９〜１４は、コントロールである。レーン９は、ＤＮＡ鋳型
を含まない。レーン１０、１３、および１４は、それぞれＢＡＴ２６遺伝子座の
ポリＡストレッチ内に欠失を有する０％、１％、および５％の変異ＤＮＡを含む
。レーン１１および１２は、ＰＣＲコントロールではない。

【００４２】 第２の実験において、５μｌのビーズ結合ＰＣＲ産物を、以下のプライマー伸
長反応混合物に添加した：７．１２５μｌの滅菌分子生物学グレードのｄｉＨ２
０、２．５μｌの１０×Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ緩衝液、２．５μｌの５μＭプライ
マー２、２．５μｌの２ｍＭ ｄＡＴＰ、２．５μｌの５０μＭ ｄｄＴＴＰ、
２．５μｌの０．１μＭ ｄＧＴＰ、０．１２５μｌの３２Ｐ ｄＧＴＰ、およ
び０．２５μｌのＳｅｑｕｅｎａｓｅ。

【００４３】 この反応混合物を、第１の実験における反応混合物と同一の温度サイクルに曝
露し、そして産物を、同一の条件下でポリアクリルアミドゲル上で分離した。図
１Ｂのレーン１〜１４は、この第２の実験の結果を示す。同一の核酸鋳型を、図
１Ａのレーン１〜１４および図１Ｂのレーン１〜１４において示された反応にお
いて使用した。

【００４４】 図１Ａにおいて示された第１の実験において、放射活性のｄＧＴＰを、プライ
マー伸長産物に組み込み、その後、ＢＡＴ２６遺伝子座のポリＡストレッチを通
って伸長した。第１の実験において使用したプライマー１（５’−ＡＧＣＣＣＴ
ＴＡＡＣＣＴＴＴＴＴＣＡＧＧ−３’（配列番号１））は、ｄＴＴＰが組み込ま
れる部位（鋳型鎖上のＡ）の直ぐ上流にハイブリダイズする。従って、成熟前に
終結した伸長産物は標識され、そしてレーン１〜８の全てにおけるバックグラウ
ンドとして現れる。

【００４５】 図１Ｂにおいて示された第２の実験において、放射活性ｄＴＴＰを、ＢＡＴ２
６遺伝子座のポリＡストレッチを通って伸長した後に、プライマー伸長産物に取
り込んだ。第２の実験において使用したプライマー２（５’−ＧＣＣＣＴＴＡＡ
ＣＣＴＴＴＴＴＣＡＧＧＴ−３’（配列番号２））の３’末端は、プライマー１
の直ぐ下流にＴを含む。従って、第２の反応において、放射活性ｄＴＴＰのみが
、ポリＡストレッチを通って伸長した後にプライマー伸長産物に組み込まれる。
さらに、伸長反応はまた、３２Ｐ ｄＧＴＰ取り込み部位の近くで終結される。
第２の反応混合物はまた、ｄｄＴＴＰを含み、そしていくつかの伸長産物は、３
２Ｐ ｄＧＴＰを取り込み、その後、ポリＡストレッチの下流のＴ繰り返しにお
いてｄｄＴＴＰを取り込む。従って、第２の実験において、ポリＡストレッチ内
の成熟前に終結されるプライマー伸長産物は標識されず、かつレーン１〜８にお
けるバックグラウンドとしても、コントロールレーン９〜１４におけるバックグ
ラウンドとしても見られない。図１Ｂにおいて、レーン６および７のみ、ならび
にコントロールレーン１３および１４は、短い標識プライマー伸長産物を含む。
ポリＡストレッチにおいて欠失を有する核酸鋳型を含むサンプルのみが、レーン
６、７、１３および１４において分析されたサンプルであった。レーン６のサン
プルは、少量の欠失した鋳型で汚染されている。レーン７のサンプルは、ＢＡＴ
２６遺伝子座のポリＡストレッチにおける欠失に関連する結腸癌を有する患者由
来であった。レーン１３および１４のサンプルは、それぞれ１％および５％の変
異ＤＮＡを含んだ。

【００４６】 図１Ａと図１Ｂの比較は、本発明の方法が、プライマー伸長反応のバックグラ
ウンドを減少することを示す。結果として、この分析は解釈を非常に容易にする
。実際に、第２の実験において予期された伸長産物よりも小さい伸長産物の存在
は、このサンプルにおける変異核酸の存在のインジケーターとなる。第１の実験
において、予期された伸長産物よりも小さい伸長産物は、全ての反応において存
在し、そしてこの分析はより複雑となる。

【００４７】 さらに、第２の実験の結果によって例示された本発明の方法を使用して、主に
正常の核酸を含む異種サンプルにおける非常に少量の変異核酸を検出し得る。レ
ーン６および１３において示された結果は、最も著しい。図１Ａにおいて、欠失
産物が、レーン６および１３において存在するか否かを決定することは、困難で
ある。対照的に、欠失産物は、図１Ｂのレーン６および１３において明らかに存
在する。

【００４８】 本発明の方法は、ＢＡＴ２６のような遺伝子座を分析するために特に有用であ
り、ここで、繰り返しヌクレオチド配列のストレッチは、ＤＮＡポリメラーゼ反
応の効果的な伸長を妨害する。伸長反応の成熟前の終結は、代表的にこのような
遺伝子座においてより頻繁である。

【００４９】 （実施例２：ＡＰＣ１３０９遺伝子座における欠失検出） ５個のヌクレオチドの欠失は、しばしば、ＡＰＣ遺伝子のコドン１３０９にお
いて見出される。この位置におけるヌクレオチド配列は、野生型の遺伝子におけ
る５’−ＧＡＡＡＡＧＡＴＴ−３’（配列番号３）である。代表的な欠失は、Ｇ
ＡＡＡＡ（配列番号４）、ＡＡＡＡＧ（配列番号５）、またはＡＡＡＧＡ（配列
番号６）からなる。本発明の方法を用いてこれらの欠失のいずれかを検出するた
めに、最初のＧ（上記のＧＡＡコドンのＧ）の位置の直ぐ上流にハイブリダイズ
するように、１７塩基のオリゴヌクレオチドを設計した。ハイブリダイズしたプ
ライマーを、未標識のｄＡＴＰ、未標識のｄＧＴＰ、および３３Ｐ−ｄｄＴＴＰ
の存在下で伸長させた。従って、欠失を含むことが推測される標識領域を通って
伸長され、かつ標識されたｄｄＴＴＰが取り込まれる場合、この伸長産物のみが
標識される。予期された野生型産物は２５塩基長であるが、これに対して、上記
の欠失のいずれかは、２０塩基長伸長産物を生成する。

【００５０】 伸長反応は、２連の患者サンプルにおいて実施され、そしてこの結果は、図２
において示される。ＢＡＴ２６における５ｂｐ欠失を含んだ、０％、１％、およ
び５％の変異核酸を含むコントロールをまた分析した。コントロール結果は、１
％の変異核酸の存在が、明らかに検出され得ることを示した。患者番号５０８に
ついての両方の試験は、１３０９遺伝子座における欠失の存在を示した。実際に
、患者５０８は、１３０９遺伝子座における欠失と関連する結腸癌を有した。

【００５１】 対称的に、１３０９遺伝子座における欠失を有さない患者についての結果は、
欠失が伸長産物を含むことを特徴とする位置においてバックグラウンドを示さな
かった。従って、本発明の方法は、１３０９遺伝子座における欠失の存在につい
てサンプルを試験するために有用である。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａは、伸長産物の３’末端の前で標識された塩基を取り込むプライマー伸
長反応を使用して、ＢＡＴ２６欠失検出を示す。図１Ｂは、伸長産物の３’末端
に標識された塩基を取り込むプライマー伸長反応を使用して、ＢＥＴ２６欠失検
出を示す。

【図２】 図２は、ＡＰＣ１３０９座における欠失検出を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピアスオール， ウイリアム アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02482， ウェレスレイ， アボット ス トリート 17 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA09 HA14 HA19 4B063 QA01 QA13 QA17 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR55 QR62 QS25 QS34

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 核酸の挿入または欠失を検出するための方法であって、該方
   法は、以下： ａ）公知の野生型配列を有し、かつｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＴ、およびｄ
   ＣＴＰからなる群より選択される多くて３つの異なる型のヌクレオチド塩基を含
   む標的領域を有する核酸を選択する工程； ｂ）サンプルを、該標的領域のすぐ上流の該核酸の部分に相補的であるオリゴ
   ヌクレオチドプライマーと接触させる工程； ｃ）該プライマーを、該標的領域のヌクレオチド塩基に相補的であるヌクレオ
   チド塩基の存在下で伸長し、それによってプライマー伸長産物を形成する工程； ｄ）該プライマー伸長産物を、該核酸の標的領域から下流のヌクレオチド塩基
   に相補的な標識されたヌクレオチドの存在下で伸長する工程であって、ここで、
   該標識されたヌクレオチドが、該標的領域のヌクレオチド塩基のいずれとも相補
   的でない、工程；および ｅ）工程ｄ）で得られた該標識された伸長産物の大きさを、標準と比較する工
   程であって、ここで、該標準より小さい標識された伸長産物は、該標的領域の欠
   失の存在を示し、そして該標準より大きい標識された伸長産物は、該標的領域に
   おける挿入の存在を示す、工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、さらに、野生型核酸の前記
   標的領域から下流のヌクレオチドに相補的である前記産物中にターミネーターヌ
   クレオチドを組み込むことによって前記プライマー伸長産物を終結する工程を包
   含し、ここで、該ターミネーターヌクレオチドが、該標的領域のヌクレオチドの
   いずれとも相補的でない、方法。
3. 【請求項３】 請求項２に記載の方法であって、ここで、前記標識されたヌ
   クレオチドおよび前記ターミネーターヌクレオチドが同じである、方法。
4. 【請求項４】 請求項２に記載の方法であって、ここで、１つより多くの標
   識されたヌクレオチドが、ターミネーターヌクレオチドの組み込みの前に前記伸
   長産物に組み込まれる、方法。
5. 【請求項５】 請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記工程
   ｃ）のヌクレオチドが、標識されていない、方法。
6. 【請求項６】 請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記工程
   ｄ）の標識反応が、同じ型の標識されたヌクレオチドおよび標識されていないヌ
   クレオチドの存在下で行われる、方法。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の方法であって、標識されていないヌクレオ
   チド塩基に対する標識されたヌクレオチドの比が、１：１．６（標識されていな
   い：標識された）である、方法。
8. 【請求項８】 請求項６に記載の方法であって、ここで、工程ｄ）からの１
   つより多いヌクレオチドが、伸長産物に組み込まれる、方法。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法であって、ここで、前記組み込まれた
   ヌクレオチドの１つだけが、標識される、方法。
10. 【請求項１０】 請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記生
    物学的サンプルが、前記標的領域に欠失を有する変異核酸および該標的領域に欠
    失を有さない野生型核酸の不均一混合物を含む、方法。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記標的領域
    の欠失が、該標的領域を含む核酸分子の約１％〜約５％で存在する、方法。
12. 【請求項１２】 請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記サ
    ンプルが生物学的サンプルである、方法。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記生物学的
    サンプルが、糞便およびホモジネートされた糞便からなる群から選択される、方
    法。
14. 【請求項１４】 請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記生物学的
    サンプルが、尿、精液、血液、痰、脳脊髄液、膿、および吸引液からなる群より
    選択される、方法。
15. 【請求項１５】 請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記標的領域
    の欠失が、前記生物学的サンプルにおける癌性組織または前癌性組織の存在を示
    す、方法。
16. 【請求項１６】 請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記標
    的領域が、ＢＡＴ２６座のポリＡトラクトである、方法。
17. 【請求項１７】 請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記標
    的領域における欠失の存在が、別の遺伝子座における変異の存在と関連する、方
    法。
18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の方法であって、ここで、前記別の遺伝
    子座が、癌または前癌と関連する遺伝子座である、方法。
19. 【請求項１９】 請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記遺伝子座
    が、ＡＰＣ、ＤＣＣ、Ｐ５３、およびＲＡＳからなる群より選択される、方法。
20. 【請求項２０】 請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記癌性組織
    または前癌性組織が、結腸直腸起源である、方法。
21. 【請求項２１】 請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記癌または
    前癌が、結腸直腸の癌または前癌である、方法。
22. 【請求項２２】 請求項１または２に記載の方法であって、ここで、一対の
    オリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的領域のすぐ上流でハイブリダイズさ
    れる、方法。
23. 【請求項２３】 請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記伸
    長反応が、熱安定性ポリメラーゼによって触媒される、方法。
24. 【請求項２４】 請求項２３に記載の方法であって、ここで、一回よりも多
    いサイクルの伸長反応が、連続的なアニーリング、伸長、および変性温度によっ
    て反応温度を循環させることによって行われる、方法。
25. 【請求項２５】 請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記サ
    ンプルが、ポリメラーゼ連鎖反応産物を含む、方法。
26. 【請求項２６】 サンプル中の核酸欠失を検出するための方法であって、該
    方法が、以下の工程： ａ）公知の野生型配列を有し、そして欠失を含むと疑われる標的領域を有する
    核酸を選択する工程であって、ここで、該標的領域が、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄ
    ＴＴＰ、およびｄＣＴＰからなる群より選択される多くて３つの異なる型のヌク
    レオチドを含む、工程； ｂ）核酸サンプル中において、オリゴヌクレオチドプライマーを該標的領域の
    上流の領域にハイブリダイズさせる工程； ｃ）該ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーを伸長反応混合物
    と接触させる工程であって、該混合物が、以下： ｉ）該標的領域のヌクレオチドに相補的であるヌクレオチド、 ｉｉ）該標的領域から下流に見出されるヌクレオチドに相補的であるが、該
    標的領域内に見出されるいずれのヌクレオチドにも相補的でない、標識されたヌ
    クレオチド、および ｉｉｉ）該標的領域から下流に見出されるヌクレオチドに相補的であるが、
    該標的領域内に見出されるいずれのヌクレオチドにも相補的でない、ターミネー
    ターヌクレオチド、 を含有する、工程； ｄ）該ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させて、標
    識された伸長産物を作製する、工程；ならびに ｅ）工程ｄ）からの該標識された伸長産物の大きさを標準と比較する工程であ
    って、ここで、該標準より小さい標識された伸長産物は、該標的領域の欠失の存
    在を示し、そして該標準よりも大きい標識された伸長産物は、挿入の存在を示す
    、工程、 を包含する、方法。
27. 【請求項２７】 請求項１または２６に記載の方法であって、ここで、前記
    標的領域が、５塩基長より長い、方法。
28. 【請求項２８】 請求項１または２６に記載の方法であって、ここで、前記
    欠失または挿入が、３塩基長より長い、方法。
29. 【請求項２９】 請求項１または２６に記載の方法であって、ここで、前記
    標準が野生型の標識された伸長産物である、方法。
30. 【請求項３０】 請求項１または２６に記載の方法であって、ここで、前記
    標準が分子量標準である、方法。