CN108753951A - 一种apoe和slco1b1基因多态性检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种APOE和SLCO1B1基因多态性检测试剂盒，所述试剂盒含有用于检测APOE基因T388C、C526T多态性位点的如SEQ ID NO.1‑6所示引物和用于检测SLCO1B1基因A388G、T521C多态性位点的如SEQ ID NO.7‑12所示引物，以及如SEQ ID NO.13‑20所示的内部质控管家基因引物。本试剂盒应用了ARMS‑PCR和荧光熔解曲线技术进行荧光PCR，实现在同一反应管中检测两种基因一种多态性的准确检测，灵敏度高，特异性强，可以满足口腔上皮细胞，干血片和全血样本的检测。整个检测过程耗时短，能在第一时间给医生提供用药依据，降低患者用药风险。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种APOE和SLCO1B1基因多态性检测试剂盒。
背景技术
APOE基因是编码人类载脂蛋白E(apolipoprotein E，APOE)的基因，该基因定位于染色体19p13，有4个外显子和3个内含子，其所编码的APOE蛋白属载脂蛋白家族，是血浆脂蛋白的重要组成部分，主要在肝脏和脑组织中表达，通过多种途径参与机体的脂质代谢，是影响血脂水平的重要内在因素。
研究表明，APOE基因具有核苷酸多态性，其中最常见的两个单核苷酸多态性位点为APOE T388C(rs429358)和APOE C526T(rs7412)，共形成3种单倍体，分别为E2(388T-526T)、E3(388T-526C)、E4(388C-526C)三种蛋白表型，生成包括三种纯合子(E2/E2、E3/E3、E4/E4)和三种杂合子(E3/E2、E4/E2、E4/E3)在内的6种APOE基因型。其中，E2等位基因携带者，其血液中APOE浓度高，胆固醇含量低，对动脉粥样硬化有防护作用；而E4等位基因携带者，其血液中APOE浓度低，胆固醇及三酰甘油含量高，是动脉粥样硬化的潜在危险因素。E4等位基因携带者患冠心病的风险要高40％，并且他汀类药物对E4等位基因携带者疗效往往不佳或无疗效，而对E2携带者的降脂作用最强。
APOE异构体与脂蛋白受体的亲和性及其在体内的代谢速度不同，从而导致个体间血脂水平的差异。临床上可根据APOE不同的基因表型指导患者正确选择调脂药物和饮食干预治疗，以达到降低冠心病的发病率和心血管疾病突发的风险。研究表明，E2型为长寿基因型，对他汀类药物敏感，故此类患者调脂可首选他汀类药物作为降脂药。E3型人群占人群中的大多数，对于他汀类药物降脂的效果正常，对于心脑血管的发病没有明显倾向性。E4型人群发生早发性心血管病、老年痴呆的风险较高，血脂异常时运用他汀类药物治疗效果比E2型、E3型人群的差，可选用普罗布考治疗，采用低脂饮食降脂效果效果明显。
服用他汀类药物的人群多为患有冠心病、心肌梗死等心血管疾病的病人，通过对APOE基因型检测，能够指导医生在有效地救治期限内进行精确用药，提高药物使用有效性，降低毒副作用。他汀类药物(statins)是三羟基三甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，自从问世以来就成为世界上临床使用最为广泛的降脂药，该类药物对抑制心脑血管疾病也有显著作用。他汀类药物通过竞争性抑制HMG-CoA(三羟基三甲基戊二酰辅酶A)还原酶从而减少胆固醇的生物合成，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低，进而达到降低血脂的作用，是目前防治冠心病、脑中风、高血脂、动脉粥样硬化的首选用药。
有机阴离子转运多肽1B1(OATP1B1)参与多种药物的转运，在他汀类药物代谢中负责将血液中的药物转移至肝脏中直接发挥药效或代谢转化为有活性的物质，其编码基因为位于12号染色体上的SLCO1B1。研究表明SLCO1B1基因具有遗传多态性，其中388A>G、521T>C是两种常见的单核苷酸多态性，可以形成4种单倍型，分别是SLCO1B1*1a(388A-521T)、SLCO1B1*1b(388G-521T)、SLCO1B1*5(388A-521C)和SLCO1B1*15(388G-521C)。SLCO1B1多态性可造成他汀类药物药动学的改变，突变型SLCO1B1基因引起编码的OATP1B1转运蛋白活力减弱，表现为肝脏摄取药物能力降低，引起他汀类药物血药浓度上升，增加横纹肌溶解症或肌病的发生风险。
表1 APOE基因和SLCO1B1基因多态性
目前针基因多态性的检测方法很多，如DNA测序法，焦磷酸测序法，限制性片段长度多态性分析法(PCR-PFLP)，高分辨率溶解曲线检测法(High Resolution MeltingAnalysis，HRM)，基因芯片，荧光定量PCR法等。其中最常见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；限制性片段长度多态性分析法检测灵敏度不高、操作步骤繁琐，检测的结果仍需要进行一代测序法的再次验证，尤其当样本量多时极易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难；芯片检测其检测结果的准确性和重复性较差，实验周期长等；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法检测基因多态性一般采用Genotyping方法进行检测，该方法对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确检测。因此，需要建立一种快速有效易于推广的检测APOE和SLCO1B1基因多态性的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种APOE和SLCO1B1基因多态性检测试剂盒。
为了实现本发明目的，本发明经过优化设计，提供了一种检测APOE和SLCO1B1基因多态性的引物组合，分别为：
用于检测APOE基因T388C位点的引物为：
野生型ARMS上游引物A1-W：CGGACATGGAGGACGAAT
突变型ARMS上游引物A1-M：CGGACATGGAGGACGAGC
共用的下游引物A1-R：AGCATGGCCTGCACCTC；
用于检测APOE基因C526T位点的引物为：
野生型ARMS上游引物A2-W：CCGATGACCTGCAGACGC
突变型ARMS上游引物A2-M：CCGATGACCTGCAGACGT
共用的下游引物A2-R：GGTACACTGCCAGGCG；
用于检测SLCO1B1基因A388G位点的引物为：
野生型ARMS上游引物S1-W：CAGGTATTCTAAAGAAACTAATAGCA
突变型ARMS上游引物S1-M：CAGGTATTCTAAAGAAACTAATAGCG
共用的下游引物S1-R：AGGTCGATGTTGAATTTTCTGATG；
用于检测SLCO1B1基因T521C位点的引物为：
野生型ARMS上游引物S2-W：GGGTCATACATGTGGATATACGT
突变型ARMS上游引物S2-M：GGGTCATACATGTGGATATACGC
共用的下游引物S2-R：GCGAAATCATCAATGTAAGAAAGC。
在一些具体实施方案中，使用内参引物监控系统检测该样本是否含有DNA或是否存在抑制物，由于待检测样本中可能没有提取到，或DNA某些成分可能含有导致PCR出现部分或完全抑制，另外人为的加样错误也可能导致没有扩增的情况出现，因此本发明一些具体实施方案中采用内参系统来控制样本的质量，保证了检测结果的可靠信。
在一些具体实施方案中，所述内参系统针对人类基因组保守区域设计，具有高度的灵敏性和扩增特异性。
本发明提供了与上述引物组合配套使用的内部质控管家基因引物组合，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13-20所示。
本发明提供了所述引物组合和/或所述内部质控管家基因引物组合在制备心脑血管疾病用药指导试剂盒中的应用。
本发明提供了含有上述引物组合和/或所述内部质控管家基因引物组合的检测试剂。
进一步地，本发明提了一种APOE和SLCO1B1基因多态性检测试剂盒，含有所述引物组合和/或所述内部质控管家基因引物组合。
进一步地，本发明的试剂盒还含有阳性对照品和空白对照品，阳性对照品为P1,P2,P3,P4四种阳性对照品，其中P1是APOE 388T和SLCO1B1 521T的阳性对照品；P2是APOE388C和SLCO1B1 521C的阳性对照品；P3是APOE 526C和SLCO1B1 388A的阳性对照品；P4是APOE 526T和SLCO1B1 388G的阳性对照品。这4种阳性对照品的浓度相同，每种均为1500拷贝/μl；所述空白对照品为ddH2O。
所述试剂盒还包括DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液、MgCl2和细胞裂解液。
本发明所述的检测试剂盒，其在检测时，每个样本分4个反应体系分别含有的引物为：(1)用于检测APOE基因T388C位点的野生型ARMS上游引物A1-W，共用下游引物A1-R，用于检测SLCO1B1基因T521C位点的野生型ARMS上游引物S2-W，共用下游引物S2-R；SEQ IDNO.13-14所示的内部质控管家基因引物；
(2)用于检测APOE基因T388C位点的突变型ARMS上游引物A1-M，共用下游引物A1-R，用于检测SLCO1B1基因T521C位点的突变型ARMS上游引物S2-M，共用下游引物S2-R；SEQID NO.15-16所示的内部质控管家基因引物；
(3)用于检测APOE基因C526T位点的野生型ARMS上游引物A2-W，共用下游引物A2-R，用于检测SLCO1B1基因A388G位点的野生型ARMS上游引物S1-W，共用下游引物S1-R；SEQID NO.17-18所示的内部质控管家基因引物；
(4)用于检测APOE基因C526T位点的突变型ARMS上游引物A2-M，共用下游引物A2-R，用于检测SLCO1B1基因A388G位点的突变型ARMS上游引物S1-M，共用下游引物S1-R；SEQID NO.19-20所示的内部质控管家基因引物；
每管中加入相同体积的DNA量然后进行PCR反应并做熔解曲线分析。
该试剂盒进行荧光定量PCR时，其工作程序为：50℃处理2分钟，95℃预变性2分钟；95℃10秒，56℃45秒，45个循环，并收集荧光信号，熔解曲线为60℃-95℃，并采集荧光信号。
本发明提供的APOE和SLCO1B1基因多态性的检测试剂盒，可用于高通量、低成本快速检测APOE和SLCO1B1基因多态性，其灵敏度高，特异性强，对设备要求不高，临床推广较容易，可以满足口腔上皮细胞，干血片和全血样本。试剂盒检测应用了ARMS－PCR和荧光熔解曲线技术，进行荧光PCR反应，一次性在4管PCR反应液中实现对两个检测基因共4种常见位点多态性突变的检测。在每个反应体系中首先ARMS引物特异性结合到对应的DNA模板位点，随后高特异性的热启动Taq酶进行延伸，体系中的荧光染料结合到延伸后的双链DNA产物，并在实时荧光PCR仪上收集信号，然后逐步升温使PCR产物解链变性，荧光染料从双链DNA上脱落，并通过荧光熔解曲线峰图来确定样本中是否存在基因突变以及突变的种类。
本发明还提供一种用于检测APOE和SLCO1B1基因多态性的方法，该方法包括以下步骤：采用本发明的试剂盒或者本发明设计得到的引物组合对待测样本进行荧光定量PCR扩增：每个样本分4个反应管分别检测APOE和SLCO1B1基因多态性，每管中包括特异性引物组、内参引物、PCR反应液，将上述获得的基因组DNA先后取相同的量加入所述4个反应管中并同时进行PCR反应。
在一些具体实施方案中，以25μl反应体系为例，向反应管中加入待检测样品后得到的混合物中各组分终浓度及含量如下：
表2
| PCRBuffer | 1X |
| HotstartTaq酶 | 0.5-1U |
| UNG酶 | 0.2-0.5U |
| 各条引物 | 0.1-1uM |
| SYBRGreen | 0.2-1X |
| 样品DNA | 2ul |
| 加水至 | 25ul |
上述体系仅为示例性，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该混合物体积及其中各组分含量。
具体地，在上述25μl反应体系中，所述各对引物包括上述步骤(1)中的8条特异性引物，4对内参引物，所述样品为基因组DNA。
具体地，在步骤(3)中的荧光定量PCR反应条件为：
50℃处理2分钟，95℃预变性2分钟。45个循环：95℃10秒，56℃45秒并收集荧光信号。熔解曲线为60℃-95℃，并采集荧光信号。上述PCR反应后，所得结果按表3、表4进行结果判定。
表3
| 管号 | SLCO1B1 521的Tm | 内参的Tm | APOE 388的Tm |
| Mix1 | 75.5±1 | 86±1 | 80±1 |
| Mix2 | 75±1 | 70.5±1 | 80.5±1 |
| SLCO1B1 388的Tm | 内参的Tm | APOE 526的Tm | |
| Mix3 | 68±2 | 76±1 | 83.5±1 |
| Mix4 | 68±1 | 73.5±1 | 82.5±1 |
表4
本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、结果真实可信的优点，同时该检测方法操作简单快速，能在2小时内完成检测，并且结果判读简单客观，便于分析。
本发明提供了所述引物组合和/或所述内部质控管家基因引物组合在建立心脑血管疾病用药评价体系中的应用。
本发明提供了所述检测试剂盒在建立心脑血管疾病用药评价体系中的应用。
本发明的APOE和SLCO1B1基因多态性的检测试剂盒采用ARMS－PCR和荧光熔解曲线技术，建立了在同一反应管中检测两种基因一种多态性的多重荧光定量PCR检测方法，本发明APOE和SLCO1B1基因多态性的检测试剂盒采用ARMS引物特异性扩增目的模板的方法，可特异性检测两种基因一种多态性，同时引入内参系统和UNG酶防污染系统，能更加准确、稳定地对样本进行分型检测。本发明的试剂盒具有以下优点：
(1)操作简单，只需要在试剂中加入2ul DNA即可进行检测；
(2)可以准确检测最低4ng基因组DNA的基因型，100ng的高特异性；
(3)针对APOE和SLCO1B1的基因型设计ARMS引物，可以特异性扩增对应的多态性；并且在每个反应体系中，6条引物之间无互补配对，不会产生错配，不会干扰对目的基因位点的检测；
(4)本发明每个检测位点都对应有2条ARMS引物，分别只能与野生型模板DNA和突变型模板DNA结合配对；即A1-W和A1-M；A2-W和A2-M；S1-W和S1-M；S2-W和S2-M，3’模板碱基与待扩增类型的碱基配对，同时在其3’末端倒数几位增加一个碱基的错配，增强了引物扩增的特异性。使用荧光熔解曲线技术进行检测，通过PCR产物特异的Tm进行基因分型，特异性高，判读简单；
(5)检测过程均为闭管反应，显著降低污染，添加UNG酶防污染系统，确保结果真实可信；
(6)在同一反应管中检测两个基因的一种多态性，操作简便，能在2h内完成检测，结果判读方法简单客观，便于分析。
附图说明
图1基因型为SLCO1B1 521T/T,APOE388C/C样本的Mix1检测结果。
图2基因型为SLCO1B1 521T/T,APOE388C/C样本Mix2检测结果。
图3基因型为SLCO1B1 521C/C,APOE388T/T样本Mix1检测结果。
图4基因型为SLCO1B1 521C/C,APOE388T/T样本Mix2检测结果。
图5基因型为SLCO1B1 521T/T,APOE388T/C样本Mix1检测结果。
图6基因型为SLCO1B1 521T/T,APOE388T/C样本Mix2检测结果。
图7基因型为SLCO1B1 521T/C,APOE388T/T样本Mix1检测结果。
图8基因型为SLCO1B1 521T/C,APOE388T/T样本Mix2检测结果。
图9基因型为SLCO1B1 388A/G,APOE526C/C样本Mix3检测结果。
图10基因型为SLCO1B1 388A/G,APOE526C/C样本Mix4检测结果。
图11基因型为SLCO1B1 388A/A,APOE526C/C样本Mix3检测结果。
图12基因型为SLCO1B1 388A/A,APOE526C/C样本Mix4检测结果。
图13基因型为SLCO1B1 388G/G,APOE526C/T样本Mix3检测结果。
图14基因型为SLCO1B1 388G/G,APOE526C/T样本Mix4检测结果。
图15为实施例1中，Mix1和对比Mix1检测结果对比的溶解曲线图。
图16为实施例1中，Mix2和对比Mix2检测结果对比的溶解曲线图。
图17为Mix3和对比Mix3检测结果对比的溶解曲线图
图18为Mix4和对比Mix4检测结果对比的溶解曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
实施例1用于检测APOE和SLCO1B1基因多态性的引物和质控管家基因引物的优化实验
本发明设计了多对ARMS引物，并对引物的检测效率进行了对比，即PCR扩增曲线Ct值对比，Ct值越小说明引物效率越高，检测灵敏度越高。表5中后缀有D的引物为针对同一检测基因位点而设计的另一条引物。后缀有D的管家基因引物为设计的另一条引物。相同位点的下游引物为同一条引物。
表5
当形成反应体系时，本发明有4个反应体系，每个体系有6条引物，引物之间如果不进行优化改进，必然会存在引物之间进行配对或其他错配，从而消耗PCR资源(引物)而导致无法真实地检测到目的基因)。因此，需要设置的筛选对比试验，确定在一个拥有6条引物的反应体系中，所用的引物虽然都是针对已知的靶位点，但只有本发明设置的4个反应体系中的引物之间能够达到最佳的配比，互相无干扰，实现很好的检测。
对比实验：对比本发明设计的引物与其它引物在检测相同临床样本时各位点熔解峰图信号的强弱及均一性；实验设计方案见表6。
表6
| 引物组合 | APOE基因引物 | SLCO1B1基因引物 | 内参基因引物 |
| Mix1 | A1-W | S2-W | ACTB-1F,ACTB-1R |
| Mix2 | A1-M | S2-M | ACTB-2F,ACTB-2R |
| Mix3 | A2-W | S1-W | ACTB-3F,ACTB-3R |
| Mix4 | A2-M | S1-M | ACTB-4F,ACTB-4R |
| 对比Mix1 | A1-WD | S2-WD | ACTB-1FD,ACTB-1RD |
| 对比Mix2 | A1-MD | S2-MD | ACTB-2FD,ACTB-2RD |
| 对比Mix3 | A2-WD | S1-WD | ACTB-3FD,ACTB-3RD |
| 对比Mix4 | A2-MD | S1-MD | ACTB-4FD,ACTB-4RD |
结果分析：由图15-图18可知以下设置本发明体系中四管反应液里的引物组合其检测效果比对比引物组合效果要好，各熔解峰的信号均一性较好。经过上述对比试验，最终确定最佳的引物组合为：
用于检测APOE基因T388C位点的引物为：
野生型ARMS上游引物A1-W：CGGACATGGAGGACGAAT
突变型ARMS上游引物A1-M：CGGACATGGAGGACGAGC
共用的下游引物A1-R：AGCATGGCCTGCACCTC；
用于检测APOE基因C526T位点的引物为：
野生型ARMS上游引物A2-W：CCGATGACCTGCAGACGC
突变型ARMS上游引物A2-M：CCGATGACCTGCAGACGT
共用的下游引物A2-R：GGTACACTGCCAGGCG；
用于检测SLCO1B1基因A388G位点的引物为：
野生型ARMS上游引物S1-W：CAGGTATTCTAAAGAAACTAATAGCA
突变型ARMS上游引物S1-M：CAGGTATTCTAAAGAAACTAATAGCG
共用的下游引物S1-R：AGGTCGATGTTGAATTTTCTGATG；
用于检测SLCO1B1基因T521C位点的引物为：
野生型ARMS上游引物S2-W：GGGTCATACATGTGGATATACGT
突变型ARMS上游引物S2-M：GGGTCATACATGTGGATATACGC
共用的下游引物S2-R：GCGAAATCATCAATGTAAGAAAGC。内部质控管家基因引物：
ACTB-1F GATTCCTATGTGGGCGACGAG(SEQ ID NO.13)
ACTB-1R GGTCATCTTCTCGCGGTTG(SEQ ID NO.14)
ACTB-2F ATTCCTATGTGGGCGACGAG(SEQ ID NO.15)
ACTB-2R GTTGGCCTTGGGGTTCAGG(SEQ ID NO.16)
ACTB-3F TTCCTATGTGGGCGACGAG(SEQ ID NO.17)
ACTB-3R GAGCCACACGCAGCTCATTG(SEQ ID NO.18)
ACTB-4F GTGTAGGTACTAACACTGGCTC(SEQ ID NO.19)
ACTB-4R CCACACGCAGCTCATTGTAG(SEQ ID NO.20)
ACTB-1FD TGACTAGGTGTCTAAGACAGTG(SEQ ID NO.29)
ACTB-1RD GTCATCTTCTCGCGGTTG(SEQ ID NO.30)
ACTB-2FD GAGAAGATGACCCAGGTGAG(SEQ ID NO.31)
ACTB-2RD GCCACACGCAGCTCATTG(SEQ ID NO.32)
ACTB-3FD TGATGGTGGGCATGGGT(SEQ ID NO.33)
ACTB-3RD CACACGCAGCTCATTGTAG(SEQ ID NO.34)
ACTB-4FD TCCTATGTGGGCGACGAG(SEQ ID NO.35)
ACTB-4RD ACCTACTTAATACACACTCCAAGG(SEQ ID NO.36)
实施例2本发明的APOE和SLCO1B1基因多态性检测试剂盒的组装
1.引物合成：实施例1确定的特异性引物。将引物分别制备成100uM的母液储存。
2.制备内参系统：实施例1确定的人类基因组设计的4对内参引物，该引物对序列为ACTB-1F与ACTB-1R、ACTB-2F与ACTB-2R、ACTB-3F与ACTB-3R、ACTB-4F与ACTB-4R；将该内参引物分别配制成100μM的母液储存。
3.制备阳性对照品和空白对照品，该阳性对照品中含有4种质粒DNA，这些质粒DNA中含有APOE 388T、APOE 388C、APOE 526C、APOE 526T、SLCO1B1 388A、SLCO1B1 388G、SLCO1B1 521T、SLCO1B1 521C，管家基因的内参质粒ACTB，该质粒的选择及设计为本领域技术人员熟知，混合质粒中每种质粒均为1500拷贝/μl；该空白对照品为ddH2O。
4.PCR反应液配制：按照下表进行四个不同体系PCR反应液配制，见表7和表8。
表7
表8
5.组装试剂盒：试剂盒中包含4管分别检测APOE和SLCO1B1基因多态性的PCR反应液，根据PCR反应体系各成分使用量，计算24人份规格成分使用量，配制试剂盒各管中成分并组装。
实施例3
用实施例2制备的APOE和SLCO1B1基因多态性检测试剂盒对待测样品进行检测。1、配制各位点反应混合液(Mix)，按下表进行配制；
表9
| 成分 | 每反应体积 | N人份体系 |
| 2X Master mix | 12.5ul | N×12.5ul |
| 加水 | 10.5ul | N×10.5ul |
2.样本的荧光定量PCR检测
将提取好的合格DNA样品依次取2μl分别加入到23μl的实施例2的试剂盒的Mix1,Mix2,Mix3,Mix4检测反应体系中，使四种反应体系总体积均为25μl，并放入荧光定量PCR仪，按如下所示设置PCR反应程序后进行扩增反应：
50℃2min；95℃2min；95℃10s，56℃45s，45个循环；每个循环后收集SYBR的荧光信号。
熔解曲线：60℃-95℃，并采集荧光信号。
3.样本的检测结果分析：22例样品的检测结果如下：
APOE4 388T/T纯合野生样本19例，其中一个检测结果如图3、4所示；
APOE4 388T/C杂合突变样本2例，其中一个检测结果如图5、6所示；
APOE4 388C/C纯合突变样本1例，其中一个检测结果如图1、2所示；
APOE2 526C/C纯合野生样本18例，其中一个检测结果如图9、10所示；
APOE2 526C/T杂合突变样本4例，其中一个检测结果如图13、14所示；
SLCO1B1*1b 388A/A纯合野生样本2例，其中一个检测结果如图11、12所示；
SLCO1B1*1b 388A/G杂合突变样本5例，其中一个检测结果如图9、10所示；
SLCO1B1*1b 388G/G纯合突变样本15例，其中一个检测结果如图13、14所示；
SLCO1B1*5 521T/T纯合野生样本16例，其中一个检测结果如图1、2所示；
SLCO1B1*5 521T/C杂合突变样本5例，其中一个检测结果如图7、8所示；
SLCO1B1*5 521C/C纯合突变样本1例，其中一个检测结果如图3、4所示。
上述22例样本荧光定量PCR检测结果与测序结果一致。以上结果表明本发明提供的检测试剂盒用于人类APOE和SLCO1B1基因多态性检测结果可靠，与直接测序一致率达到100％，且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于大规模推广。
序列表
<110> 深圳市优圣康生物科技有限公司
<120> 一种APOE和SLCO1B1基因多态性检测试剂盒
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggacatgga ggacgaat 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggacatgga ggacgagc 18
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcatggcct gcacctc 17
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgatgacct gcagacgc 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccgatgacct gcagacgt 18
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtacactgc caggcg 16
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caggtattct aaagaaacta atagca 26
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caggtattct aaagaaacta atagcg 26
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggtcgatgt tgaattttct gatg 24
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gggtcataca tgtggatata cgt 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gggtcataca tgtggatata cgc 23
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcgaaatcat caatgtaaga aagc 24
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gattcctatg tgggcgacga g 21
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggtcatcttc tcgcggttg 19
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
attcctatgt gggcgacgag 20
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gttggccttg gggttcagg 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttcctatgtg ggcgacgag 19
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gagccacacg cagctcattg 20
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtgtaggtac taacactggc tc 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccacacgcag ctcattgtag 20
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cggacatgga ggacgcat 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cggacatgga ggaccagc 18
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ccgatgacct gcagatgc 18
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccgatgacct gcagtcgt 18
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
caggtattct aaagaaacta attgca 26
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
caggtattct aaagaaacta ataccg 26
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gggtcataca tgtggatata agt 23
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gggtcataca tgtggatatt cgc 23
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tgactaggtg tctaagacag tg 22
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gtcatcttct cgcggttg 18
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gagaagatga cccaggtgag 20
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gccacacgca gctcattg 18
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tgatggtggg catgggt 17
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cacacgcagc tcattgtag 19
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tcctatgtgg gcgacgag 18
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
acctacttaa tacacactcc aagg 24
Claims (10)
1.一种检测APOE和SLCO1B1基因多态性的引物组合，其特征在于，
(1)用于检测APOE基因T388C位点的引物为：
野生型ARMS上游引物A1-W：CGGACATGGAGGACGAAT
突变型ARMS上游引物A1-M：CGGACATGGAGGACGAGC
共用的下游引物A1-R：AGCATGGCCTGCACCTC；
(2)用于检测APOE基因C526T位点的引物为：
野生型ARMS上游引物A2-W：CCGATGACCTGCAGACGC
突变型ARMS上游引物A2-M：CCGATGACCTGCAGACGT
共用的下游引物A2-R：GGTACACTGCCAGGCG；
(3)用于检测SLCO1B1基因A388G位点的引物为：
野生型ARMS上游引物S1-W：CAGGTATTCTAAAGAAACTAATAGCA
突变型ARMS上游引物S1-M：CAGGTATTCTAAAGAAACTAATAGCG
共用的下游引物S1-R：AGGTCGATGTTGAATTTTCTGATG；
(4)用于检测SLCO1B1基因T521C位点的引物为：
野生型ARMS上游引物S2-W：GGGTCATACATGTGGATATACGT
突变型ARMS上游引物S2-M：GGGTCATACATGTGGATATACGC
共用的下游引物S2-R：GCGAAATCATCAATGTAAGAAAGC。
2.与权利要求1所述引物组合配套使用的内部质控管家基因引物组合，其特征在于，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13-20所示。
3.含有权利要求1所述引物组合和/或权利要求2所述内部质控管家基因引物组合的检测试剂。
4.一种APOE和SLCO1B1基因多态性检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述引物组合和/或权利要求2所述内部质控管家基因引物组合。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，还含有阳性对照品和空白对照品，所述阳性对照品包括P1,P2,P3,P4四种阳性对照品，其中P1是APOE 388T和SLCO1B1 521T的阳性对照品；P2是APOE 388C和SLCO1B1 521C的阳性对照品；P3是APOE 526C和SLCO1B1388A的阳性对照品；P4是APOE 526T和SLCO1B1 388G的阳性对照品。
6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液、MgCl2。
7.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，在检测时，每个样本分4个反应体系分别含有的引物为：
(1)用于检测APOE基因T388C位点的野生型ARMS上游引物A1-W，共用下游引物A1-R，用于检测SLCO1B1基因T521C位点的野生型ARMS上游引物S2-W，共用下游引物S2-R；SEQ IDNO.13-14所示的内部质控管家基因引物；
(2)用于检测APOE基因T388C位点的突变型ARMS上游引物A1-M，共用下游引物A1-R，用于检测SLCO1B1基因T521C位点的突变型ARMS上游引物S2-M，共用下游引物S2-R；SEQ IDNO.15-16所示的内部质控管家基因引物；
(3)用于检测APOE基因C526T位点的野生型ARMS上游引物A2-W，共用下游引物A2-R，用于检测SLCO1B1基因A388G位点的野生型ARMS上游引物S1-W，共用下游引物S1-R；SEQ IDNO.17-18所示的内部质控管家基因引物；
(4)用于检测APOE基因C526T位点的突变型ARMS上游引物A2-M，共用下游引物A2-R，用于检测SLCO1B1基因A388G位点的突变型ARMS上游引物S1-M，共用下游引物S1-R；SEQ IDNO.19-20所示的内部质控管家基因引物；
每管中加入相同体积的DNA量然后进行PCR反应并做熔解曲线分析。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒进行荧光定量PCR时，其工作程序为：50℃处理2分钟，95℃预变性2分钟；95℃10秒，56℃45秒，45个循环，并收集荧光信号，熔解曲线为60℃-95℃，并采集荧光信号。
9.权利要求1所述引物组合和/或权利要求2所述内部质控管家基因引物组合在制备心脑血管疾病用药指导试剂盒中的应用。
10.权利要求1所述引物组合和/或权利要求2所述内部质控管家基因引物组合或权利要求4-8任一所述的检测试剂盒在建立心脑血管疾病用药评价体系中的应用。
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