CN104531904A - 一种苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子检测领域，特别涉及一种苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，以ACLSV-Probe-F和ACLSV-Probe-R作为引物，并以ACLSV-Probe作为探针进行实时荧光定量PCR检测。该检测方法选用特定的引物和探针进行实时荧光定量PCR检测，特异性高，重复性好，灵敏度高。实时荧光定量PCR检测结果可由电脑软件直接读出，不需要进行后续处理，所以避免了检测结果假阳性的产生及环境的污染；实现了待测样本的定量检测；待测样本的实时荧光定量PCR检测过程只需要1小时左右，与常规PCR技术相比，大大简化了检测步骤，缩短了检测的时间。

Description

一种苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法
技术领域
本发明涉及分子检测领域，具体而言，涉及一种苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法。
背景技术
苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)可侵染苹果、梨、桃、李、杏、樱桃等多种果树，对果树的生长、产量、果品质量等造成严重的影响。目前检测ACLSV的方法主要是常规RT-PCR技术。
ACLSV的常规RT-PCR检测技术方案具体为：
(1)设计常规RT-PCR检测引物
(2)提取果树供试样品的RNA并反转录成cDNA
(3)以cDNA为模版，利用特异扩增引物进行常规PCR扩增
(4)将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳
(5)通过凝胶成像系统对电泳结果进行观察拍照，若观察到特异扩增条带可证明供试样品中含有ACLSV，反正则没有。
ACLSV的常规RT-PCR检测技术存在以下缺点：
(1)操作步骤较为繁琐，费时费力；
(2)需要对PCR扩增产物进行后处理，只有将扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳才能得到检测结果，但琼脂糖凝胶制作过程中需要加入致癌物质EB，易污染实验室环境，对实验人员的健康构成威胁，同时后处理过程中不同样品间易发生交叉污染，造成检测结果的假阳性现象；
(3)常规RT-PCR技术只能对病毒进行定性检测，无法定量检测。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，以解决上述操作步骤较为繁琐、费时费力、不同样品间易发生交叉污染、无法定量检测的问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，以ACLSV-Probe-F和ACLSV-Probe-R作为引物，并以ACLSV-Probe作为探针进行实时荧光定量PCR检测，其中，
ACLSV-Probe-F：CAGAGAAAAGATGACCCAAATCATG；
ACLSV-Probe-R：AACAGCCTGGATGGCAACA；
ACLSV-Probe：TTGAGACCTTCAATGTGCCTGCCATGT。
本发明提供的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，以ACLSV-Probe-F和ACLSV-Probe-R作为引物，并以ACLSV-Probe作为探针进行实时荧光定量PCR检测特异性高，重复性好，灵敏度高。
优选地，所述实时荧光定量PCR检测之前先制作由Ct值和起始模板的不同拷贝数构成的标准曲线。
其中的起始模板可以直接为苹果褪绿叶斑病毒的RNA反转录得到的cDNA，也可以为苹果褪绿叶斑病毒的RNA反转录得到的cDNA进行扩增，得到的含有ACLSV-Probe-F和ACLSV-Probe-R扩增产物的片段。将待测样本的苹果褪绿叶斑病毒的cDNA直接以与标准曲线相同的条件进行实时荧光定量PCR，得到的Ct值与标准曲线直接比较，即可得到待测样本中起始模板的拷贝数。
具体地，所述实时荧光定量PCR检测采用的模板为苹果褪绿叶斑病毒的cDNA；
所述cDNA与所述标准曲线以相同的条件进行实时荧光定量PCR，得到的Ct值直接与所述标准曲线比对即可。
其中，相同的条件是指PCR反应体系和PCR扩增程序相同。由于实时荧光定量PCR检测结果可由电脑软件直接读出，不需要进行后续处理，所以避免了检测结果假阳性的产生及环境的污染；实现了待测样本的定量检测；待测样本的实时荧光定量PCR检测过程只需要1小时左右，与常规PCR技术相比，大大简化了检测步骤，缩短了检测的时间。
优选地，所述标准曲线的纵横坐标分别为Ct值和起始模板的不同拷贝数的对数值。Ct值和起始模板的不同拷贝数的对数值具有很好的线性关系，更便于将待测样本的数值与标准曲线比对以得到检测结果。
进一步地，所述起始模板由以下方法制备：
(a)、先提取苹果褪绿叶斑病毒的RNA，RNA经反转录获得cDNA；
(b)、以引物ACLSV-cp-F和ACLSV-cp-R对cDNA进行PCR扩增，扩增后对目标片段回收，其中，
ACLSV-cp-F：GAAGATCGCAGAAGGGGATATTC
ACLSV-cp-R：GTCTACAGGCTATTTATTATAAG；
(c)、回收的目标片段即得。
用于标准曲线的起始模板是先将含有ACLSV-Probe-F和ACLSV-Probe-R的片段进行扩增，具体为：根据GenBank中登录的苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)外壳蛋白基因(cp)的核苷酸序列，利用Primer Primer 5.0设计出扩增cp基因全序列的引物ACLSV-cp-F/R，用于阳性质粒标准品序列的克隆；利用clustalX(1.81)对该发明中克隆得到的苹果褪绿叶斑病毒cp基因序列及GenBank中已发表的苹果褪绿叶斑病毒cp基因序列进行多重比对，选择相对稳定的保守区域作为检测靶标序列，利用Primer Primer 5.0和Primer Express v3.0软件设计特异性扩增引物(ACLSV-Probe-F和ACLSV-Probe-R)和TaqMan探针ACLSV-Probe，该探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。该扩增得到的片段相当于将特定的片段先进行了预先分离和纯化，这样制作标准曲线更稳定，重复性好。
以ACLSV-cp-F/ACLSV-cp-R为引物扩增后，由于回收的片段量比较少，并且由于回收过程中可能会含有一些杂质，进一步地，所述步骤(c)还包括：将回收的目标片段连接至载体上，进行质粒扩增，扩增后提取质粒，经鉴定正确后，该质粒即为起始模板。
更进一步地，所述载体为pEASY-T3载体；
所述质粒扩增具体为：
将回收的目标片段连接至载体，转化至E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行增菌培养。
该质粒扩增的方法简单易行，且容易获得大量含有目标片段的质粒。
为了使质粒进行实时荧光定量PCR得到的标准曲线更稳定，优选地，作为起始模板的质粒OD260/OD280比值在1.8-2.0之间。
为了得到的标准曲线更稳定，并具有更大的范围，以便于待测样本的比对，优选地，所述起始模板的不同拷贝数的范围为：1.0×101拷贝-1.0×108拷贝，以10倍进行等分。
优选地，所述实时荧光定量PCR检测采用的PCR反应体系为：TransStart Probe qPCR Super Mix 10μl，ACLSV-Probe-F 4-5pmol、ACLSV-Probe-R 4-5pmol，ACLSV-Probe 4-5pmol，模板1pg-1μg，双蒸水补齐至20μl。
待测样本采用该PCR反应体系进行实时荧光定量PCR，得到的曲线稳定。此外，PCR反应体系的选择可以根据选用的试剂盒推荐进行，还可以选用其他体积，如常用的25μl体系、50μl体系、15μl体系等，其中成分的含量只需要相应地降低或升高即可。
优选地，实时荧光定量PCR扩增程序为：94℃预变性30-35s；94℃变性5-7s，55℃退火10-15s，72℃延伸15-20s，共35-40个循环。以该实时荧光定量PCR扩增程序进行扩增，扩增特异性好，扩增得到的数据稳定。
此外，标准曲线也采用相同的PCR反应体系和PCR扩增程序得到数据，其中，PCR反应体系的模板即为起始模板。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，检测结果可由电脑软件直接读出，不需要进行反应后处理，所以避免了检测结果假阳性的产生及环境的污染；
(2)本发明提供的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，通过标准曲线的制作实现对供试材料中ACSLV病毒的定量检测，而常规PCR技术只能实现ACLSV的定性检测；
(3)本发明提供的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，检测过程只需要1小时左右，与常规PCR技术相比，大大简化了检测步骤，缩短了检测的时间；
(4)本发明提供的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，与常规PCR技术对比，其灵敏度是常规RT-PCR技术的100倍。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例2实时荧光定量PCR特异性分析图；
图2为本发明实施例4常规PCR产物电泳检测图；
图3为本发明实施例4实时荧光定量PCR特异性分析图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
下面实施例中，涉及的材料、试剂和设备具体来源为：
1、材料：感染ACLSV的田间苹果叶片于2012年6月采自河北省清苑县温仁村，田间供试材料2013年8月采自河北省卢龙县狮子庄村，苹果脱毒组培苗由河北农业大学生物技术实验室提供。
2、主要试剂和设备：
RNAiso Plus，RNAiso-mate for Plant Tissue，EASY Dilution forReal Time PCR)，购自大连宝生物工程有限公司；TransStart ProbeqPCR Super Mix，TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix及pEASY-T3Cloning Kit购自北京全式金生物技术有有限公司；DNA凝胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司。
3、设备：Bio-Rad iQTM5荧光定量PCR仪为美国Bio-Rad公司产品，NanoDrop 2000微量紫外分光度计为美国Thermo Scientific公司产品。
实施例1
1、引物、探针的设计和合成
根据GenBank中登录的苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)外壳蛋白基因(cp)的核苷酸序列(登录号：D14996.1)，利用Primer Primer5.0设计出扩增cp基因全序列的引物ACLSV-cp-F/R(表1)，用于阳性质粒标准品序列的克隆。
利用clustalX(1.81)对本研究中克隆得到的苹果褪绿叶斑病毒cp基因序列及GenBank中已发表的苹果褪绿叶斑病毒cp基因(登录号：D14996.1，JN848991，HQ398252，NC001409，JN849007，GU328004.1)序列进行多重比对，选择相对对稳定的保守区域作为检测靶标序列，利用Primer Primer 5.0和Primer Express v3.0软件设计特异性扩增引物和TaqMan探针(表1)，探针5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团BHQ1，由大连宝生物工程有限公司合成。
表1 引物及探针序列
2、总RNA的提取及cDNA的合成
称取0.1g苹果样品叶片，利用试剂盒RNAiso Plus及RNAiso-mate for Plant Tissue提取总RNA，以Oligo(dT)18为引物利用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix试剂盒进行反转录获得cDNA。
3、重组质粒标准品的制备
利用引物ACLSV-cp-F/R对田间染病苹果叶片的cDNA进行ACLSV-cp基因的PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，采用DNA凝胶回收试剂盒对符合目标片段大小(1784bp)的特异条带进行切胶回收，纯化后连接至pEASY-T3载体上，并转化至E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行增菌培养，用质粒小量提取试剂盒提取后测序和双酶切(Not I和Nde I)鉴定。经鉴定正确的阳性重组质粒作为标准品，命名为ACLSV-cp，置于-70℃备用。
4、标准曲线的绘制
用NanoDrop 2000测定提取质粒的OD260和OD280值及其浓度，OD260/OD280比值在1.8-2.0的质粒则用于制作标准曲线。根据质粒的分子量将质粒样品浓度换算为拷贝数浓度：copies/μl＝(ng/μl×10-9)×(6.02×1023)/(DNA length×660)；用Easy Dilution将质粒依次稀释成1.0×108拷贝/μl～1.0×101拷贝/μl，共制得8个浓度梯度的模板。以此为模板参照试剂盒说明书建立20μl扩增体系：TransStart Probe qPCR Super Mix 10μl，上、下游引物(10pmol/μl)各0.4μl，Taqman探针(10pmol/μl)0.4μl，模板1.0μl，双蒸水7.8μl。在Bio-Rad iQTM5荧光定量PCR仪上按下列反应参数进行扩增：94℃预变性30s；94℃变性5s，55℃退火15s，72℃延伸15s，共40个循环。反应结束后，利用分析软件自动生成标准曲线。
结果标准品起始模板浓度与Ct值均呈现良好的线性关系，相关系数R2达0.999，扩增效率E为103.7％，标准曲线的回归方程为：Y＝-3.24log(x)+43.37，其中，Y为Ct值，x为起始模板的不同拷贝数的对数值。
实施例2
特异性试验
以苹果褪绿叶斑病毒cp基因重组质粒(ACLSV-cp)为阳性对照，以苹果茎痘病毒cp基因重组质粒(ASPV-cp)、苹果茎沟病毒cp基因重组质粒(ASGV-cp)为阴性对照，设双蒸水为空白对照，其中，各质粒的浓度为10000拷贝每微升；实时荧光定量PCR反应体系及程序同实施例1。得到的结果如图1所示。
其中，图1中，1为ACLSV-cp；2为ASPV-cp；3为ASGV-cp；4为ddH2O。从图1可以看出，利用建立的实时荧光定量PCR方法对ACLSV-cp、ASPV-cp、ASGV-cp三种重组质粒进行检测，设空白对照，结果只有ACLSV-cp反应管中检测到特异扩增信号，其它反应管均无荧光信号积累，表明该方法具有良好的特异性。
实施例3
重复性试验
以稀释成107拷贝/μl、105拷贝/μl和103拷贝/μl三个浓度梯度的ACLSV-cp质粒为模板，每个浓度重复3孔进行组内重复性检测；进行组间重复性检测时，同一次反应每个浓度重复3孔，重复3次反应。实时荧光定量PCR反应体系及程序同实施例1。结果如表2所示。
表2 实时荧光定量PCR的重复性分析
从表2可以看出，各浓度质粒组内、组间的Ct值的变异系数均小于1％，表明该方法具有良好的重复性。
实施例4
与常规PCR灵敏度的比较试验
以10倍倍比稀释成108拷贝/μl～101拷贝/μl的8个浓度的ACLSV-cp质粒为模板，分别进行ACLSV病毒的实时荧光定量PCR和常规PCR检测，对比两种方法的灵敏度。常规PCR检测方法参考陈红霞的方法进行(陈红霞等，2012)。结果如图2和图3所示。其中，图2中序号1-8对应108拷贝/μl-101拷贝/μl，序号9为阴性对照；图3中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光信号强度。
从图2可以看出，当质粒浓度为103拷贝/μl及以下时，电泳图上未出现特异性扩增条带，说明常规PCR的检测下限为104/μl拷贝。用相同浓度梯度的质粒进行实时荧光定量PCR检测，结果如图3所示，当质粒浓度为108～102拷贝/μl时，其荧光信号强度高于检测阈值，表明该实时荧光定量PCR方法的检测下限为102拷贝/μl，其灵敏度是常规PCR的100倍。
实施例5
利用建立的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法对15份田间苹果叶片和1份苹果脱毒组培苗叶片进行检测，设空白对照。具体为：
1、总RNA的提取及cDNA的合成
各称取0.1g苹果样品叶片，利用试剂盒RNAiso Plus及RNAiso-mate for Plant Tissue提取总RNA，以Oligo(dT)18为引物利用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix试剂盒进行反转录分别获得不同样品的cDNA。
2、控制cDNA的浓度在1pg-1μg进行实时荧光定量PCR。
PCR反应体系为：TransStart Probe qPCR Super Mix 10μl，ACLSV-Probe-F 4pmol、ACLSV-Probe-R 4pmol，ACLSV-Probe4pmol，模板1pg-1μg，双蒸水补齐至20μl；
其中，引物和探针的基因序列为：
ACLSV-Probe-F：CAGAGAAAAGATGACCCAAATCATG；
ACLSV-Probe-R：AACAGCCTGGATGGCAACA；
ACLSV-Probe：TTGAGACCTTCAATGTGCCTGCCATGT；
实时荧光定量PCR扩增程序为：94℃预变性30s；94℃变性5s，55℃退火15s，72℃延伸15s，共40个循环。
实时荧光定量PCR在Bio-Rad iQTM5荧光定量PCR仪上进行。其中的软件为Bio-Rad iQ5Optical System Software Version 2.1。该软件直接读出供试材料中的ACLSV的检测结果。检测结果如表3所示。
表3 检测结果
样品 检测结果 Ct值
1 + 26.48
2 + 34.31
3 + 31.02
4 + 30.66
5 - 0
6 + 30.29
7 + 33.91
8 + 34.08
9 + 29.88
10 - 0
11 + 35.05
12 + 30.71
13 + 34.49
14 + 28.71
15 + 33.51
苹果脱毒组培苗叶片 - 0
CK - 0
从表3可以看出，15份田间样品ACLSV的检出率为86.7％，Ct值为26.48-35.05，脱毒组培苗和空白对照无特异扩增信号，表明该方法可用于田间苹果样品中ACLSV的检测。
此外，实时荧光定量PCR检测采用的PCR反应体系为：TransStart Probe qPCR Super Mix 10μl，ACLSV-Probe-F 5pmol、ACLSV-Probe-R 5pmol，ACLSV-Probe 5pmol，模板1pg-1μg，双蒸水补齐至20μl；
实时荧光定量PCR扩增程序为：94℃预变性35s；94℃变性7s，55℃退火10s，72℃延伸20s，共35个循环；得到的结果同实施例1-5结果一致。
综上，本发明提供的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，根据ACLSV外壳蛋白基因保守序列设计了特异性引物和Taqman探针，建立了ACLSV的基于Taqman探针的实时荧光定量PCR检测方法，整个检测过程只需要1h左右，检测结果直接由电脑软件得出，不需要进行PCR后处理，可有效地防止检测过程中的污染和假阳性。该方法可在20μl反应体系中检测到100拷贝/μl的ACLSV-cp重组质粒，并对其它病毒重组质粒(ASGV-cp、ASPV-cp)无特异扩增，且批内和批间重复检测结果的变异系数均小于1％。因此，同以往检测方法相比，具有简便、快速、准确、灵敏、稳定等优点，本方法将为进一步研究ACLSV的侵染、增殖、分布及时序变化等规律提供可靠的技术保障。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，以ACLSV-Probe-F和ACLSV-Probe-R作为引物，并以ACLSV-Probe作为探针进行实时荧光定量PCR检测，其中，
ACLSV-Probe-F：CAGAGAAAAGATGACCCAAATCATG；
ACLSV-Probe-R：AACAGCCTGGATGGCAACA；
ACLSV-Probe：TTGAGACCTTCAATGTGCCTGCCATGT。
2.根据权利要求1所述的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR检测之前先制作由Ct值和起始模板的不同拷贝数构成的标准曲线。
3.根据权利要求2所述的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR检测采用的模板为苹果褪绿叶斑病毒的cDNA；
所述cDNA与所述标准曲线以相同的条件进行实时荧光定量PCR，得到的Ct值直接与所述标准曲线比对即可。
4.根据权利要求2所述的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述标准曲线的纵横坐标分别为Ct值和起始模板的不同拷贝数的对数值。
5.根据权利要求3所述的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述起始模板由以下方法制备：
(a)、先提取苹果褪绿叶斑病毒的RNA，RNA经反转录获得cDNA；
(b)、以引物ACLSV-cp-F和ACLSV-cp-R对cDNA进行PCR扩增，扩增后对目标片段回收，其中，
ACLSV-cp-F：GAAGATCGCAGAAGGGGATATTC
ACLSV-cp-R：GTCTACAGGCTATTTATTATAAG；
(c)、回收的目标片段即得。
6.根据权利要求5所述的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(c)还包括：将回收的目标片段连接至载体上，进行质粒扩增，扩增后提取质粒，经鉴定正确后，该质粒即为起始模板。
7.根据权利要求6所述的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述载体为pEASY-T3载体；
所述质粒扩增具体为：
将回收的目标片段连接至载体，转化至E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行增菌培养。
8.根据权利要求6所述的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，作为起始模板的质粒OD260/OD280比值在1.8-2.0之间。
9.根据权利要求2所述的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述起始模板的不同拷贝数的范围为：1.0×101拷贝-1.0×108拷贝，以10倍进行等分。
10.根据权利要求3所述的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR检测采用的PCR反应体系为：TransStart Probe qPCR Super Mix 10μl，ACLSV-Probe-F 4-5pmol、ACLSV-Probe-R 4-5pmol，ACLSV-Probe4-5pmol，模板1pg-1μg，双蒸水补齐至20μl；
优选地，实时荧光定量PCR扩增程序为：94℃预变性30-35s；94℃变性5-7s，55℃退火10-15s，72℃延伸15-20s，共35-40个循环。
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