CN109576394A - 一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR引物及应用 - Google Patents

一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT‑PCR引物及应用，该引物的序列如SEQ ID NO:1～2所示。该引物可以应用于Nebovirus的快速诊断中，本发明可快速、特异、灵敏地检测Nebovirus，最低检测浓度为29copies/μL。本发明使用的操作方法简单、反应结果易于判断，灵敏性和检出率高，并且能够避免假阳性现象，适用于疾病监测、现场应急及临床样品的检测，适合大范围推广应用。

Description

一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR引物及 应用
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体地说，涉及一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR引物及应用。
背景技术
Nebovirus(NeV)是最近新发现的一种致犊牛腹泻的病原，与诺如病毒属(Norovirus)、扎幌病毒属(Sapovirus)、兔病毒属(Lagovirus)及水疱疹病毒(Vesivirus)同属杯状病毒科(Caliciviridae)。实验感染Nebovirus可在2至5天后引起肠道病变和腹泻，粪便颜色从浓稠的棕绿色糊状物到浅棕色糊状物最后到到黄色带有絮状碎屑液体状。临床症状表现为厌食，木糖吸收不良，嗜睡。Nebovirus首次在英国发现后，相继在美国、韩国、法国、日本、意大利、中东突尼斯、土耳其、巴西等11个国家均有报道。在2017年，该病毒被我国西南民族大学汤承课题组首次发现，并证明该病毒在我国广泛流行。
目前对于Nebovirus尚无预防用生物制品，能准确、快捷、有效的检测Nebovirus(NeV)对于提高对该病毒的防控是至关重要的。根据本实验室前期研究数据表明，我国的Nebovirus毒株的常用的分子检测靶基因序列与国外毒株的序列差异大，具有独特的共进化特征。国外建立的检测方法在国内并不适用，因此其检测结果的准确性是有待考究的。
由此可见，有必要对我国的Nebovirus建立分子检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR引物及应用，本发明在多株Nebovirus基因序列比对基础上，基于RdRp基因的3’端设计了特异性引物，对Nebovirus进行快速、准确地鉴别，具有简单、快速、灵敏度高和特异强的特点。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR引物，包括上游引物NeV F、下游引物NeV R，其中，上游引物NeV F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物NeV R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还公开了一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR的方法，包括以下步骤：
提取待检测样品的RNA，以待检测样品的RNA为模板，反转录得到cDNA，用上述的引物和SYBR Green对cDNA进行荧光定量RT-PCR扩增；通过实时荧光定量PCR仪进行结果的读取，判断S型扩增曲线和荧光强度值，在扩增曲线正常的情况下，若荧光强度值超过阈值时，则记为阳性，则该待检测样品含有Nebovirus病毒，若荧光强度值低于阈值时，则记为阴性，则该待检测样品不含有Nebovirus病毒。
可选地，所述反转录的步骤为：将RNA模板4μL、1号5×Prime Script Buffer 4μL、2号Prime ScriptRT Enzyme Mix 1μL、4号Random 6mers 2μL和5号RNase Free dH2O 9μL混匀，放入PCR仪上进行反转录。
可选地，所述反转录反应所需试剂为宝生物工程(大连)有限公司的PrimeScriptTMRT试剂。
可选地，荧光定量PCR反应检测体系为：TB Green Premix Ex Taq II10μL，上游引物NeV F、下游引物NeV R各1.0μL，cDNA模板100ng，用ddH2O补齐到20μL。
可选地，所述的荧光定量RT-PCR反应条件为:95℃预变性2min；PCR:95℃反应15sec，51℃反应20sec进行40个循环。
本发明还公开了一种上述的检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR引物在Nebovirus的快速诊断中的应用。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明首次建立检测Nebovirs的分子检测方法：Nebovirus作为我国犊牛腹泻的新发病原，尚未建立该病毒的检测方法。本发明设计的引物是根据国内毒株公布的所有Nebovirus序列，能很好的对国内牛的现有毒株进行检测。
2)本发明不仅操作步骤少，只需要常规的提取核酸，进行反转录后就能进行SYBRGreen荧光定量PCR检测；能节约大量时间，整个扩增只需要1h即可完成，检测的灵敏度到29copies/μL。
3)本发明的阳性结果鉴定便捷，只需要判断其CT值是否大于“0”即可；比国外的分子检测方法灵敏性高，稳定性好，检出率高；比检测Nebovirus的核酸电泳方法更加快捷、准确，为Nebovirus的快速诊断和流行病学调查奠定了基础。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明阳性模板经48℃-53℃7个退火温度PCR扩增后曲线图；其中，N代表阴性对照，1-7代表同一个实验样本；
图2是本发明本发明引物特异性实验结果图；其中，1：NeV病毒样品；2：牛轮状病毒样品；3：牛冠状病毒样品；4：牛病毒性腹泻样品；5：牛诺如病毒样品；6：大肠杆菌样品；7：沙门氏菌样品；
图3是本发明引物灵敏度实验的检测结果图，其中A:2.9×109拷贝/μL；B:2.9×108拷贝/μL；C:2.9×107拷贝/μL；D:2.9×106拷贝/μL；E:2.9×105拷贝/μL；F:2.9×104拷贝/μL；G:2.9×103拷贝/μL；H:2.9×102拷贝/μL；I:2.9×10拷贝/μL。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1引物设计
根据NCBI登陆的所有国内已经发表的24个NeV的毒株RdRp序列(MH718886–MH718908；MG599036.1)，应用Primer 5.0软件设计针对NeV的RdRp的3’端基因的特异性引物，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
上游引物NeV F：CAGCCCGTCTGGGTGAAT，SEQ ID NO:1；
下游引物NeV R：CTGGATRGTTCTGACTTCGG(其中R代表A或G)，SEQ ID NO:2。
实施例2检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR方法的建立：
该方法包括以下步骤：
(1)待检测样品RNA提取：
待检粪便样品与PBS(1:5)充分重悬混匀，－80℃冰箱中反复冻融3次，3 000r·min-1离心10min，弃沉淀，再以8 000r·min-1离心5min，取上清。然后按照Trizol Reagent说明书提取总RNA，备用。
(2)提取的RNA加入到购自宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒进行反转录，得到cDNA模板：
反转录步骤为：将RNA模板4μL、1号5×PrimeScript Buffer 4μL、2号PrimeScriptRT Enzyme Mix 1μL、4号Random 6mers 2μL和5号RNase Free dH2O 9μL混匀，放入PCR仪上进行反转录。其反应条件：37℃15min，85℃15s，16℃10min。此反转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。
(3)SYBR Green荧光定量RT-PCR扩增反应：扩增反应20μL反应体系含有：TB GreenPremix Ex Taq II10μL，上游引物APPV F、下游引物APPV R各1.0μL，cDNA模板100ng，用ddH2O补齐到20μL。然后:95℃预变性2min；PCR:95℃反应15sec，51℃反应20sec进行40个循环，扩增产物大小为90bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
(4)结果判断：通过实时荧光定量PCR仪进行结果的读取，判断S型扩增曲线和荧光强度值，在扩增曲线正常的情况下，若荧光强度值超过阈值时，则记为阳性，则该待检测样品含有Nebovirus病毒，若荧光强度值低于阈值时，则记为阴性，则该待检测样品不含有Nebovirus病毒。
实施例3退火温度、引物浓度的优化、灵敏度、稳定性和特异性的测定
(1)退火温度的优化：NeV F/R引物反应条件中的退火温度设置48℃-53℃，对荧光定量PCR仪的扩增峰图进行观察，选取CT值最小的为最佳退火温度，如图1所示，本发明的最佳退火温度为51℃。
(2)引物浓度的优化：PCR按20μL反应体系，上下游引物各0.5μL～1.5μL。选取CT值最小的引物浓度为最佳引物浓度，最佳引物浓度为0.5μL。
(3)灵敏度评价：
克隆转化和重组阳性质粒：RT-PCR扩增出目的基因，进行电泳观测分析。电泳筛选出来的NeV阳性样本用购自OMGA公司PCR纯化试剂盒进行PCR产物纯化，将纯化的PCR产物与TMD-19T载体连接，放入金属浴3h后取出。得到的连接产物加入感受态细胞(大肠杆菌DH5α株)后液体加入1mL LB液体中，放入37℃摇菌箱2～3h，然后5000r/min 4min离心，弃800μL上清液，剩下200μL吹打混匀。吸取100μL菌液滴于含有氨苄青霉素的LB的培养基，并用涂布棒把菌液均匀的分布在培养基上，放37℃细菌培养箱12h～16h。挑取单菌落溶于10μL灭菌水中混匀，取2μL菌液为PCR模板做PCR扩增，将PCR产物做电泳检测后挑取亮条带的菌液加到2mL LB+AMP液体中摇菌12h。用质粒提取试剂盒对已摇好的菌液进行质粒的提取，得到的质粒即阳性模板，放-20℃保存。
将上述制备得到的阳性模板用无菌水做10倍连续稀释：10-1-10-11，取C:1.0×10-4、D:1.0×10-5、E:1.0×10-6、F:1.0×10-7、G:1.0×10-8、H:1.0×10-9、I:1.0×10-10稀释的质粒，按以上最优的SYBR Green荧光RT-PCR反应体系和反应条件进行扩增，对荧光PCR结果数据进行分析，发现检测其最低浓度见如图3所示，所建立的SYBR Green荧光定量RT-PCR反应最低检测量分别为：NeV毒株29拷贝/μL，表明灵敏性良好。
(5)重复性评价：将已稀释好的质粒，都统一按照(3)的操作方式进行3个平行试验，结果表明方法具有高度稳定性和可重复性(表1)
表1 SYBR Green荧光定量RT-PCR的重复性
特异性的评价：用上述优化好的体系对待样品进行检测，按照实施例2同等的方法对样本进行RNA提取，所检测的样品分别为NeV病毒样品；牛轮状病毒样品；牛冠状病毒样品；牛病毒性腹泻病毒样品；牛诺如病毒样品；大肠杆菌样品；沙门氏菌样品，以上样本均由西南民族大学提供，如图2所示，样本1(NeV病毒样品)扩增曲线正常且荧光强度值超过阈值；其余样本扩增曲线正常且荧光强度值＝0。
实施例4
本发明Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR检测方法在临床中的应用评价：使用本发明SYBR Green荧光定量RT-PCR检测方法与常规的PCR电泳检测方法分别检测65份临床疑似样本。检测结果见表2，结果显示，国外已报道的的常规PCR方法(巢氏PCR)，阳性检出率36.9％(24/65)；国外已报道的SYBR Green荧光定量RT-PCR方法，阳性检出率27.7％(18/65)；本发明对样本检测阳性率为50.8％(33/65)，阳性样本经克隆测序验证都为NeV。经统计学计算三种方法阳性率存在明显的差异。说明本发明方法对于临床标本检测能力优于已报道的RT-PCR检测方法(表2)。
表2本方法与常规PCR鉴定方法对临床标本检测的比较
方法 阳性结果 阴性结果 阳性率
常规PCR(巢氏) 24 41 36.9％
SYBR Green荧光定量RT-PCR 18 47 32.1％
本发明SYBR Green荧光定量RT-PCR 33 32 58.9％
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 西南民族大学
<120> 一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR引物及应用
<130> 2018
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
cagcccgtct gggtgaat 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ctggatrgtt ctgacttcgg 20
<210> 3
<211> 90
<212> DNA
<213> Nebovirus（NeV）
<400> 3
cagcccgtct gggtgaatgg tcctcggcgt tccgtgtggg accacgaagc ccaaccaatt 60
gaaattgaca ccgaagtcag aaccatccag 90

Claims (7)

1.一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR引物，其特征在于，包括上游引物NeV F、下游引物NeV R，其中，上游引物NeV F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物NeV R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待检测样品的RNA，以待检测样品的RNA为模板，反转录得到cDNA，用权利要求1中所述的引物和SYBR Green对cDNA进行荧光定量RT-PCR扩增；通过实时荧光定量PCR仪进行结果的读取，判断S型扩增曲线和荧光强度值，在扩增曲线正常的情况下，若荧光强度值超过阈值时，则记为阳性，则该待检测样品含有Nebovirus病毒，若荧光强度值低于阈值时，则记为阴性，则该待检测样品不含有Nebovirus病毒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反转录的步骤为：将RNA模板4μL、1号5×Prime Script Buffer 4μL、2号Prime ScriptRT Enzyme Mix 1μL、4号Random6mers 2μL和5号RNase Free dH2O 9μL混匀，放入PCR仪上进行反转录。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述反转录反应所需试剂为宝生物工程(大连)有限公司的PrimeScriptTMRT试剂。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR反应检测体系为：TB GreenPremix Ex Taq II 10μL，上游引物NeV F、下游引物NeV R各1.0μL，cDNA模板100ng，用ddH2O补齐到20μL。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的荧光定量RT-PCR反应条件为:95℃预变性2min；PCR:95℃反应15sec，51℃反应20sec进行40个循环。
7.权利要求1所述的检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR引物在Nebovirus的快速诊断中的应用。
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