CN107475401B

CN107475401B - 利用环介导等温扩增技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的方法及引物

Info

Publication number: CN107475401B
Application number: CN201710804909.6A
Authority: CN
Inventors: 徐云明; 卞蓉蓉
Original assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Current assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Priority date: 2017-09-08
Filing date: 2017-09-08
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2037-09-08
Also published as: CN107475401A

Abstract

本发明公开了一种利用环介导等温扩增技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的方法及引物。所述方法包括：提取待检测样品的DNA；以所述的DNA为模板，利用所述的引物进行LAMP反应；对反应产物进行鉴定，判断待检测样品中是否含有蜡样芽孢杆菌。发明针对蜡样芽孢杆菌毒力基因的保守序列设计引物，并进一对LAMP反应体系进行优化，可稳定、高特异性、高灵敏度的检测蜡样芽孢杆菌。

Description

利用环介导等温扩增技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的方法及引物

技术领域

本发明涉及食源性致病微生物的检测，尤其涉及一种利用环介导等温扩增技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的方法。

背景技术

目前对于细菌的检测方法主要有细菌分离培养鉴定方法、免疫学检测方法、病理组织切片方法和分子生物学方法。

细菌分离培养鉴定是应用液体培养基、半固体培养基或固体培养基将分离得到的疑似细菌进行培养，并应用溶血实验、运动性实验、产酸产气等生化实验及染色镜检对微生物进行诊断。目前，在我国境内最常见也是应用最广泛的是国标法(GB4789.30-94)，还有其他的分离鉴定方法如FDA(美国食品药品监督管理局)法、改良FDA法、行标法(SN)和GNFIS法等。这类方法在目前所有类型的检测方法中的准确性是最高的，但是无论是哪种分离培养技术，他们都有一个共同的缺点，就是从样品的采集到病原微生物的分离鉴定结果，需要的试验周期都会很长，一般微生物的培养需要2天左右，鉴定的所需要的时间和结果在一个星期左右，有些微生物的分离培养需要十多天，才得的出结果。因此，此类方法不能够适应目前快速、准确的诊断需求市场。同时由于操作的过程中，接触活体的细菌，对操作人员构成一定的健康威胁。

免疫学检测方法的原理是根据抗原-抗体结合形成沉淀的复合物，常见的方法包括凝集反应方法、沉淀反应方法、免疫荧光技术、放射免疫测定方法、酶联免疫吸附试验、补体结合试验等。免疫学检测方法是基于抗原与抗体特异性结合的原理进行检测的一种血清学方法。这种诊断方法的缺点是检测过程中，需要的试剂非常昂贵，同时此方法在检测过程中，根据不同的检测目标微生物，其特异性也不尽相同，容易出现假阳性结果，造成误判。同时人为的操作对于实验结果的影响也是有的，所以需要具有一定素质和能力的实验室专业人员。

病理组织切片方法是取一定大小的病变组织，用病理组织学方法制成病理切片〔通常将病变组织包埋在石蜡块里，用切片机切成薄片，再用苏木精－伊红(H-E)染色〕，用显微镜进一步检查组织的病变。根据病变的发生发展过程，最后作出病理诊断。这种检测方法虽然准确性很高，但是最大的问题是，对从事病理组织学诊断的人员的专业性的要求会非常高，需要专业的病理组织学教师或者从事病理组织学研究的研究生，才有可能进行准确的诊断，也可以说这类诊断方法需要在显微病理学知识上具有丰富经历和经验的实验人员。

分子生物学是在分子水平上研究生命现象物质基础的学科。常见的应用于检测微生物方法有核酸(DNA)的凝胶电泳实验、核酸的分子杂交实验、核酸的体外扩增实验等方法，这些方法的优点是检测方法的特异性非常理想，检测时间最快可以在6小时内完成。本方法的缺点在于，需要昂贵的变温反应设备和检测仪器。分子生物学诊断方法在实验过程中需要复杂的变温仪器，这种仪器的价格很高，对于基层的投放使用很难做到全覆盖。

蜡样芽孢杆菌食物中毒有明显的季节性，特别容易在6～10月份生长繁殖，发生食物中毒事件的概率与人类的活动密切相关。引起机体产生中毒的食品，通常是因保存的食物存放时间过长，存放的环境温度过高高或食品在加热过程中不彻底，导致细菌芽孢生长，致使该菌在食物中大量繁殖，产生毒素，从而导致中毒。中毒者症状为腹痛、呕吐、腹泻。

蜡样芽孢杆菌产生的芽孢是导致食源性疾病的一个重要因子，芽孢对高温、干燥、紫外线、电离辐射、有毒化学物质以及其他不利的环境因素都有非常强的抵抗能力。有研究报道从2500万～4000万年的琥珀中和贴有2.5亿年的盐水包含物中成功复活芽孢。一些蜡样芽孢杆菌的芽孢比嗜温型枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的芽孢更耐热，能够经受烹调食品中的很多程序。研究报道称通常的食品加热烹调(热冲击)无法杀死该菌的芽孢，芽孢会残存并发芽，从而导致生产的食物受污染。因此，蜡样芽孢杆菌难以杀灭的特性是导致其容易造成食品污染并致病的主要原因。

蜡样芽孢杆菌作为一种重要的食源性致病微生物，临床上主要感染有免疫缺陷的人，如老人、小孩、新生儿等。也能通过体液感染引起菌血症、心内膜炎、脑膜炎和人的眼部感染等疾病。其中，以蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒的社会影响最大，也是社会关注蜡样芽孢杆菌的原因。蜡样芽孢杆菌的检测分为常规检测方法和快速检测方法。常规检测方法是，首先进行细菌增菌培养、分离纯化，通过菌落形态观察、革兰氏染色镜检、生理生化试验、药敏试验等试验鉴定细菌。快速检测方法是运用PCR技术、免疫学技术和酶反应进行快速检测。王振国等建立了一种PCR方法，通过扩增致病性蜡样芽孢杆菌的hblA基因来实现对蜡样芽孢杆菌的快速检测，ELSEF等建立了用实时PCR检测蜡样芽孢杆菌的检测方法。快速检测具体操作的方法多样，检测速度快、灵敏度高、具有可靠性和准确性，但是样品制备较难、检测过程中需要的仪器水平要求高、试剂昂贵。

2000年，Notomi等人研发的一种新颖的核酸扩增方法-环介导等温扩增(Loop-Mediated isothermal amplification，LAMP)技术，其特点是针对目的基因特异性设计2对特异性引物，标定被检基因组的6个区域，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件下维持30～60min，即可完成核酸扩增反应。

发明内容

发明目的：为克服现有技术的问题，本发明提供了一种利用环介导等温扩增技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的引物及方法，可成功鉴定蜡样芽孢杆菌。

技术方案：本发明所述的利用环介导等温扩增技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的引物，包括外引物和内引物，外引物的碱基序列为：

F3：5’-GATACATCTTCAATCGCTGG-3’

B3：5’-GGAAGTATACTAAATCACCTGG-3’；

内引物的碱基序列为：

FIP：5’-TGAATCCACTGCAATCAAAACCATTTTTAAATGGTTCACCATACAGAACA-3’

BIP：5’-TGGTCATAAAGGCGCTCGTCTTTTCTAGTTTTTGTTTTAGAGCTCCAG-3’。

蜡样芽孢杆菌主要的感染方式是通过进食而造成感染和发病，中毒者症状为腹痛、呕吐腹泻。本发明中，食源性对蜡样芽孢杆菌的种类没有限制作用。

蜡样芽孢杆菌不同亚型的菌株，毒力基因的携带有非常大的差异性，本发明选择ent毒力基因作为检测目的基因，通过四个序列CP018935.1、CP012483.1、CP009628.1、CP022445.1进行比对得到目标保守区域，将该目标保守序列在美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)检索比对后，发现该列出的100个比对结果中，全部属于蜡样芽孢杆菌的基因片段，而未出现与其他菌株符合的现象，因此该保守序列适用于特异性检测蜡样芽孢杆菌。进一步的，针对该保守序列，本发明设计了LAMP引物，通过多套引物实验，发现上述的引物具有最佳的检测效果。

本发明还提供了利用环介导等温扩增技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的方法，包括：提取待检测样品的DNA；

以所述的DNA为模板，利用所述的引物进行LAMP反应；

对反应产物进行鉴定，判断待检测样品中是否含有蜡样芽孢杆菌。

LAMP反应体系中，本发明对于反应的特异性和灵敏性皆有影响的甜菜碱浓度、外、内引物浓度比、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、反应时间和反应温度条件进行了优化。LAMP反应时共需要4条特异性引物，外引物的作用在于反应初始阶段通过链的置换过程，使内引物合成的链脱离DNA模板，产生哑铃状结构，自此之后的过程中，内引物的浓度直接影响着反应的扩增效率，适当提高内引物浓度可加快开始阶段的反应进程，提高反应效率，因此，适当的内、外引物比率不仅可以节约引物用量还可使反应达到最好的扩增效率。反应体系内的Mg²⁺不仅是形成稳定碱基的中间体而且对于酶活性的激活是必要的，可影响LAMP扩增反应的特异性和扩增产物的产量，若Mg²⁺浓度太高，很大程度上会增加引物错配的机率，出现非特异性扩增；若Mg²⁺浓度太低，就不能激活Bst DNA Polymerase的活性。甜菜碱在反应体系中，是作为一种辅助成分而存在的，实验中不加入甜菜碱也可以扩增反应。但是，甜菜碱为DNA变性剂，有利于DNA双螺旋的打开，不但可以提高引物和模板链结合的特异性而且可以增强DNA的扩增效率，并且对酶有一定的保护和稳定作用。dNTPs又称脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPMixture)，总共包含四个部分:dATP、dGTP、dCTP和dTTP。它影响着反应的特异性。如果它的浓度低于5μM或其余四个部分中的一种浓度低于其他部分的浓度，会导致LAMP扩增错误终止，扩增出的产物也就相对应的减少。如果dNTPs的浓度过高会和Mg²⁺反应从而抑制LAMP反应，产物也会减少。

综上所述，对各反应条件进行了优选，LAMP反应体系为：6-8mM Mg²⁺，1.4-1.6mMdNTPs，1.0-1.2M甜菜碱，0.2-0.3μM外引物，1.4-1.6μM内引物，1-1.5μL Bst DNA聚合酶，2.5-3μL反应缓冲液，1-2μL gDNA，ddH₂O补至25μL。

进一步优选的，所述LAMP反应体系为：6mM Mg²⁺，1.4mM dNTPs，1.0M甜菜碱，0.2μM外引物，1.6μM内引物，1μL Bst DNA聚合酶，2.5μL反应缓冲液，1μL gDNA，ddH₂O补至25μL。Bst DNA聚合酶的酶活为8-10U/μL。

优选的，LAMP反应的温度为65-67℃，进一步优选为65℃。

优选的，LAMP反应的时间为60-65min，进一步优选为60min。

扩增结束后，通过检测反应产物中是否扩增出目的片段来判断待检测样品中是否含有蜡样芽孢杆菌。优选的，对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析鉴定，琼脂糖的浓度为2％。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明针对蜡样芽孢杆菌ent毒力基因的保守序列设计引物，并进一对LAMP反应体系进行优化，可稳定、高特异性、高灵敏度的检测蜡样芽孢杆菌。

1、特异性更高：上述四种传统的诊断方法中，符合高特异性、快速的特点的是传统的分子生物学方法。传统的分子生物学方法，只锁定被检测微生物的遗传物质(DNA)的两个区域进行检测；本方法是以4条引物，锁定被检测微生物的遗传物质(DNA)的六个区域进行检测，特异性更高。

2、灵敏性更好：在细菌的传统分离培养鉴定、病理组织学诊断方法、免疫学检测方法、传统分子生物学检测方法中，分子生物学的检测方法的灵敏度是最高的，而本研究方法的灵敏性在对比试验聚合酶链式反应中，在更短的反应时间内，灵敏性至少高出一个数量级。

3、试验成本更低：本方法检测过程中，实在恒温水浴条件下进行的，因此不需要昂贵的变温仪器，在诊断结果时，可以通过肉眼或是加入简单的指示试剂便可进行结果的判断，实验的成本比其他传统方式都低。

4、快速的检测时间：上述四种检测方法中，传统的分子生物学方法的检测速度和周期最快，本方法也是分子生物学方法中的一种，因此也保持了分子生物学诊断快速周期短的特点。在观察结果时，花费的时间比传统的分子生物学方法更快,在对比与聚合酶链式反应的对比试验中，聚合酶链式反应大约在1.5h小时完成，本方法的反应时间只需要60分钟，所以检测周期和速度是更快的。

附图说明

图1为甜菜碱(betaine)浓度优化(M)，M：DL2000 DNA Marker，N：阴性对照；

图2为Mg²⁺浓度优化(mM)，M：DL2000 DNA Marker，*为选择的优化的条件，N：阴性对照；

图3为dNTPs浓度优化(mM)，M：DL2000 DNA Marker，*为选择的优化的条件，N：阴性对照；

图4为内外引物比例优化(内引物μM)，M：DL2000 DNA Marker，*为选择的优化的条件，N：阴性对照；

图5为反应温度优化(℃)，M：DL2000 DNA Marker，*为选择的优化的条件，N：阴性对照；

图6为反应时间优化(min)，M：DL2000 DNA Marker，*为选择的优化的条件，N：阴性对照；

图7-1为LAMP特异性检测的一部分结果，M：DL2000 DNA Marker，泳道1-10依次分别为：蜡样芽孢杆菌CGMCC 1.195、蜡样芽孢杆菌CMCC(B)63303、耶尔森氏菌、副溶血弧菌、白假丝酵母菌、猪霍乱沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌、枯草芽孢杆菌；

图7-2为LAMP特异性检测的另一部分结果，M：DL2000 DNA Marker，泳道1、2、11-18依次分别为：蜡样芽孢杆菌CGMCC 1.195、蜡样芽孢杆菌CMCC(B)63303、大肠杆菌(抗生素鉴定株)、藤黄微球菌、迟钝爱德华氏菌、沙门氏菌CMCC 50774、沙门氏菌CMCC 50001、沙门氏菌CMCC 50004、沙门氏菌CGMCC 50071、沙门氏菌CGMCC 500115，N：阴性对照；

图8-1为LAMP方法的灵敏性检测(ng/μL)，M：DL2000DNA Marker，N：阴性对照，甬道1-7的DNA浓度依次分别为7.75、7.75×10^-1、7.75×10^-2、7.75×10^-3、7.75×10^-4、7.75×10^-5、7.75×10^-6，*表示最低检测限；

图8-2为PCR方法的灵敏性检测(ng/μL)，M：DL2000 DNA Marker，N：阴性对照，甬道1-7的DNA浓度依次分别为7.75、7.75×10^-1、7.75×10^-2、7.75×10^-3、7.75×10^-4、7.75×10^-5、7.75×10^-6，*表示最低检测限；

图9为对比例1中特异性结果图；

图10为对比例2中特异性结果图；

图11为本发明方法的技术流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

本发明具体实施方式中，所用材料如下：

1主要试剂：

三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs，25mM)、甜菜碱(betaine)、DNaseⅠ型消化酶均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；镁离子(Mg²⁺，100mM)、反应缓冲液(10×thermpol reactionbuffer含2mM Mg²⁺)与Bst DNA Polymerase购于纽英伦生物技术(北京)有限公司；高纯PCR模板制备试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；2对LAMP引物均合成于生工生物工程(上海)股份有限公司；LB液体培养基购自青岛海博生物技术有限公司；2×PCR Master Mix、琼脂糖、50×TAE缓冲液、DL 2000DNA Maker、Gold viewⅠ型核酸染料均购于天根生化科技(北京)有限公司；其他试剂均为自配或分析纯。

2主要菌种

表1实验所用菌株

注：以上菌株均来源于吉林大学人兽共患病研究所，细菌组实验室，本领域技术人员也可以根据菌株编号从公司购买或者保藏机构获得。

3仪器设备

电子分析天平(BSA4202S-CW，北京赛多利斯公司)，微型高速冷冻离心机(SorvallLegend Micro 21R，赛默飞世尔公司)，2720型PCR扩增仪(ABI公司)，DYY-8C型电泳仪(北京六一仪器厂)，微孔板分光光度计(Epoch，BioTek公司)，化学发光凝胶成像系统(1708195，伯乐公司)，恒温水浴锅(XO-8D，南京先欧公司)，4℃冰箱(BCD-271TMBA，海尔公司)，-20℃冰柜(BD/BC-415DKMQ415，美的公司)，超净工作台(BCM-1300，苏州净化有限公司)。

4常用试剂的配制

5M甜菜碱(betaine)溶液的制备：称取甜菜碱粉末5.8g，加8mL灭菌ddH₂0摇匀，充分溶解，最后定容到10mL，0.22mm过滤器过滤，分装至无菌1.5mL离心管中，-20℃保存备用。

LB液体培养基的制备：称取LB粉末2.5g，加入80mL灭菌ddH₂O加热溶解，最后定容到100mL，调节PH至7.4，分装至试管内，121℃高压灭菌20min。

胰蛋白胨大豆琼脂培养基的制备：分别称取胰蛋白胨15.0g，大豆蛋白胨5.0g，氯化钠5.0g，营养琼脂15.0g，依次加入到1000mL灭菌ddH₂O中加热，充分溶解，调节PH至7.4，121℃高压灭菌20min，等待温度降至60℃时，在无菌超净台中将培养基倒入灭菌平板中，冷却备用。

实施例1

1细菌的复壮与培养

培养前，取保存的各菌种在胰蛋白胨大豆琼脂平板上进行划线复壮，放入恒温培养箱37℃培养12h。用接种环挑取单个菌落接种至LB液体培养基中，37℃振荡培养18-24h。分装于已加入适量甘油的2.0mL离心管中，-20℃保存。

2细菌基因组的提取

取分装备用的2.0mL离心管，12000rpm/min，离心1min，弃掉上清液，用灭菌ddH₂O洗涤菌体两次，然后用50μL无菌水溶解菌体。依据高纯PCR模板制备试剂盒的说明提取相应细菌的基因组，-20℃保存备用。

3蜡样芽孢杆菌LAMP引物的设计与处理

在NCBI网站内搜索蜡样芽孢杆菌ent毒力基因(登录号：CP018935.1、CP012483、CP009628.1、CP022445.1)，对上述ent基因序列进行对比，找出保守序列，再针对保守序列设计一系列LAMP引物，包括一对内引物和一对外引物。引物序列见表2。

表2 LAMP引物序列

注α：根据蜡样芽孢杆菌ent基因(GenBank登录号CP022445.1请核对登录号)标注的引物位置。

LAMP引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，按照引物合成报告单的说明书，将装有引物的离心管12000×g，离心30s，使黏附在管壁的引物集中到管底。加入规定量的灭菌ddH₂O，内引物稀释终浓度为100μM，外引物稀释终浓度为10μM。

4 LAMP检测蜡样芽孢杆菌的条件优化

LAMP反应体系：1μL Bst DNA Polymerase(8U/μL)，甜菜碱(betaine)，2.5μL10×thermpol reaction buffer，Mg²⁺，dNTPs，1μL基因组模板(gDNA)，内引物(BIP和FIP)和外引物(B3和F3)，最后用灭菌ddH₂O补足至25μL，反应条件是65℃水浴60min。其中对于反应的特异性和灵敏性皆有影响的甜菜碱浓度、外内引物浓度比、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、反应时间和反应温度条件进行优化。

4.1甜菜碱(betaine)的优化

甜菜碱浓度优化条件范围：0～1.4M，每0.2M一个梯度。反应体系内，除甜菜碱浓度外其他组分浓度不变，包括8mM Mg²⁺，1.6mM dNTPs，0.2μM外引物(B3和F3)，1.6μM内引物(BIP和FIP)，65℃水浴60min后，在80℃水浴5min灭活Bst DNA Polymerase终止LAMP反应，用2％的琼脂糖凝胶，加入核酸染料与5μL反应样品充分混匀后，进行核酸电泳。

4.2Mg²⁺浓度的优化

Mg²⁺浓度优化条件范围：1.0～8.0mM，每1.0mM一个梯度。反应体系内，除Mg²⁺浓度外其他组分浓度不变，包括1.6mM dNTPs，1.0M甜菜碱(betaine)，0.2μM外引物(B3和F3)，1.6μM内引物(BIP和FIP)，65℃水浴60min后，在80℃水浴5min灭活Bst DNA Polymerase终止LAMP反应，用2％的琼脂糖凝胶，加入核酸染料与5μL反应样品充分混匀后，进行核酸电泳。

4.3 dNTPs浓度的优化

dNTPs浓度优化范围：1.0～2.4mM，每0.2mM一个梯度。反应体系内，除dNTPs浓度外其他组分浓度不变，包括8mM Mg²⁺，1.0M甜菜碱，0.2μM外引物(B3和F3)，1.6μM内引物(BIP和FIP)，65℃水浴60min后，在80℃水浴5min灭活Bst DNA Polymerase终止LAMP反应，用2％的琼脂糖凝胶，加入核酸染料与5μL反应样品充分混匀后，进行核酸电泳。

4.4内、外引物浓度比的优化

内引物浓度优化范围：0.2～1.6μM，每0.2μM一个梯度。内、外引物浓度比优化范围：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1和8:1。反应体系内，除内引物(BIP和FIP)浓度外其他组分浓度不变，包括8mM Mg²⁺，1.0M甜菜碱，1.4mM dNTPs，0.2μM外引物(B3和F3)，65℃水浴60min后，在80℃水浴5min灭活Bst DNA Polymerase终止LAMP反应，用2％的琼脂糖凝胶，加入核酸染料与5μL反应样品充分混匀后，进行核酸电泳。

4.5反应温度的优化

反应温度优化范围：55～80℃，每5℃一个梯度。25μL反应体系，包括2.5μL10×thermpol reaction buffer，1μLBst DNA Polymerase，8mM Mg²⁺，1.0M甜菜碱，1.4mMdNTPs，0.2μM外引物(B3和F3)，1.6μM内引物(BIP和FIP)，反应时间是60min。最后在80℃水浴5min灭活Bst DNA Polymerase终止LAMP反应，用2％的琼脂糖凝胶，加入核酸染料与5μL反应样品充分混匀后，进行核酸电泳。

4.6反应时间的优化

反应时间优化范围：30～80min，每10min一个梯度。25μL反应体系，包括2.5μL10×thermpol reaction buffer，1μLBst DNA Polymerase，8mM Mg²⁺，1.0M甜菜碱，1.4mMdNTPs，0.2μM外引物(B3和F3)，1.6μM内引物(BIP和FIP)，反应温度是65℃。最后在80℃水浴5min灭活Bst DNA Polymerase终止LAMP反应，用2％的琼脂糖凝胶，加入核酸染料与5μL反应样品充分混匀后，进行核酸电泳。

检测结果见图1-图6，优化的最佳条件为：甜菜碱1.0M，Mg²⁺6mM，dNTPs1.4mM，内引物1.6μM，外引物0.2μM，反应温度为65℃，反应时间为60min。

实施例2LAMP检测蜡样芽孢杆菌的特异性检测

对表1所列的18株细菌应用试剂盒法提取基因组DNA，以灭菌ddH₂O为模板设阴性对照，按照优化后的25μL反应体系进行LAMP扩增(2.5μL10×thermpol reaction buffer，1μLBst DNA Polymerase，6mM Mg²⁺，1.0M甜菜碱，1.4mM dNTPs，0.2μM外引物(B3和F3)，1.6μM内引物(BIP和FIP)，65℃水浴60min)，检验LAMP反应的特异性。反应结束后，在80℃水浴5min灭活Bst DNA Polymerase，首先用肉眼观察肺炎克雷伯杆菌管与阴性结果对照管比较，简单离心之后观察管底，进行初步判断结果。用2％的琼脂糖凝胶，加入核酸染料与5μL反应样品充分混匀后，进行核酸电泳。

结果参见图7-1、与7-2，本发明发明可特异性检测蜡样芽孢杆菌。

实施例3蜡样芽孢杆菌灵敏性检测的比较

1 LAMP检测蜡样芽孢杆菌灵敏性

取少量2步骤中提取的蜡样芽孢杆菌基因组DNA，用微孔板分光光度计的Take3程序及仪器测定(Gene公司)基因组的初始浓度。然后用灭菌ddH₂O对基因组进行10倍稀释，共稀释7个梯度。

用优化好的反应体系(2.5μL10×thermpol reaction buffer，1μLBst DNAPolymerase，6mM Mg²⁺，1.0M甜菜碱，1.4mM dNTPs，0.2μM外引物(B3和F3)，1.6μM内引物(BIP和FIP)，65℃水浴60min)对7个梯度的基因组进行特异性扩增。反应结束后，在80℃水浴5min灭活Bst DNA Polymerase。用2％的琼脂糖凝胶，加入1μL 6×loading buffer与5μL的样品充分混匀后，进行核酸电泳，于凝胶成像仪下观察、分析结果。

2常规PCR方法检测蜡样芽孢杆菌灵敏性

查阅文献(Davide Porcellato,Judith Narvhus,Siv BorghildSkeie.Detection and quantification of Bacillus ceres group in milk by dropletdigital PCR[J].Journal of Microbiological Methods,2016.)，根据蜡样芽孢杆菌cer基因设计一对PCR引物，引物序列：

上游(SEQ ID NO.5)5’-GCTAAAAGGTGTACTTAGCTTAGG-3’；

下游(SEQ ID NO.6)5’-TATATACATTATGCGTCATCAC-3’。PCR反应体系为25μL，包括2×PCR Master Mix 12.5μL，1.0μL上游引物，1.0μL下游引物，dNTPs1.4mM，1μL gDNA，最后用灭菌ddH₂O补至25μL。反应条件如下：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，35次循环；72℃7min。反应结束后进行1.0％凝胶电泳。扩增目的片段大小在297bp。

结果参见图8-1、图8-2，LAMP方法的最低检测限为7.75×10^-4ng/μL，常规PCR方法的最低检测限为7.75×10^-2ng/μL。

综上，本次试验基于ent毒力基因，成功设计了蜡样芽孢杆菌LAMP实验所需的引物。优化了LAMP反应体系，最终的反应体系确定是：6mM Mg²⁺，1.4mM dNTPs，1.0M甜菜碱，0.2μM外引物(B3和F3)，1.6μM内引物(BIP和FIP)，1μL Bst DNA Polymerase(8U/μL)，2.5μL10×thermpol reaction buffer，1μL gDNA，用灭菌ddH₂O补至25μL，反应条件是65℃水浴60min。结果表明：LAMP方法检测蜡样芽孢杆菌基因组最低检测限是0.775pg/μL，是传统PCR方法的100倍，检测时间缩短了近1h，具有很高的灵敏性和稳定性。

对比例1

在NCBI网站内搜索蜡样芽孢杆菌ces毒力基因(登录号：JN112796.1、CP001166.1、AP007210.1、AY691650.1)，对ces基因序列进行对比，找出保守序列，再针对保守序列设计一系列LAMP引物，包括一对内引物和一对外引物。引物序列见表3。

表3 LAMP引物序列

注b：根据蜡样芽孢杆菌ces基因(GenBank登录号JN112796.1)标注的引物位置。

应用本引物，进行特异性实验过程中，出现被检测的蜡样芽孢杆菌没有阳性

结果，说明引物特异性不理想。结果在图9。

(注:1、2为蜡样芽孢杆菌，3-5为其他非蜡样芽孢杆菌株，N：阴性对照)

对比例2

在NCBI网站内搜索蜡样芽孢杆菌ces毒力基因(登录号：JN112795.1、DQ889676.1、AP007210.1、CP001179.1)，对ces基因序列进行对比，找出保守序列，再针对保守序列设计一系列LAMP引物，包括一对内引物和一对外引物。引物序列见表4。

表4 LAMP引物序列

注α：根据蜡样芽孢杆菌ces基因(GenBank登录号JN112795.1)标注的引物位置。

应用本引物，进行特异性实验过程中，被检测的蜡样芽孢杆菌虽然有阳性结果，但是在特异性检测过程中，其他菌种也有阳性结果，说明引物特异性不理想。结果在图10(注:泳道1、2为蜡样芽孢杆菌，3-5为其他非蜡样芽孢杆菌株，N：阴性对照)。

序列表

<110> 江苏农林职业技术学院

<120> 利用环介导等温扩增技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的方法及引物

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatacatctt caatcgctgg 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaagtatac taaatcacct gg 22

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgaatccact gcaatcaaaa ccatttttaa atggttcacc atacagaaca 50

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggtcataaa ggcgctcgtc ttttctagtt tttgttttag agctccag 48

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctaaaaggt gtacttagct tagg 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tatatacatt atgcgtcatc ac 22

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttccagtact gcctgacg 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cactgcaaca catttggc 18

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggataaaggg aagcaagagg agttattttt acataatata tgccgtatct tctg 54

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccttcgatgt ccacaaacgg aattttatag cggtgcaaaa gtcc 44

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atagcggtgc aaaagtcc 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

accataaccc cttttggtt 19

<210> 13

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgatgtccac aaacggaact ttttttccta gggaaaaatg aaacaac 47

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aagggaagca gaggagttag tttttttcca gtactgcctg acg 43

Claims

1.一种利用环介导等温扩增技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的引物，包括外引物和内引物，其特征在于，外引物的碱基序列为：

F3：5’-GATACATCTTCAATCGCTGG-3’

B3：5’-GGAAGTATACTAAATCACCTGG-3’；

内引物的碱基序列为：

FIP 5’-TGAATCCACTGCAATCAAAACCATTTTTAAATGGTTCACCATACAGAACA-3’

BIP 5’-TGGTCATAAAGGCGCTCGTCTTTTCTAGTTTTTGTTTTAGAGCTCCAG-3’。

2.一种非疾病诊断目的的利用环介导等温扩增技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括：提取待检测样品的 DNA；

以所述的 DNA 为模板，利用权利要求 1 所述的引物进行 LAMP 反应；

对反应产物进行鉴定，判断待检测样品中是否含有蜡样芽孢杆菌；

LAMP 反应体系为：6-8 mM Mg²⁺，1.4-1.6 mM dNTPs，1.0-1.2 M 甜菜碱，0.2-0.3 μM外引物，1.4-1.6 μM 内引物，1-1.5 μL Bst DNA 聚合酶，2.5-3 μL 反应缓冲液，1-2 μLgDNA， ddH2O 补至 25 μL。

3.根据权利要求 2 所述非疾病诊断目的的利用环介导等温扩增技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于，LAMP 反应的温度为 65-67 ℃。

4.根据权利要求 2 所述非疾病诊断目的的利用环介导等温扩增技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于，LAMP 反应的时间为 60-65 min。

5.根据权利要求 2 所述非疾病诊断目的的利用环介导等温扩增技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于，对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。