CN111996266A - 一种致吐型蜡样芽孢杆菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种致吐型蜡样芽孢杆菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测技术领域，具体而言，涉及一种致吐型蜡样芽孢杆菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。该检测试剂盒包含2套正反向引物及探针、侧流层析试纸条；所述反向引物5'端用生物素进行标记；所述探针5'端用Fluorescein Isothiocyanate(FITC)标记，中间区域C碱基(距5'端至少30bp、距3'端至少15bp)用[THF]进行替换，3'端用C3‑spacer进行末端封闭。本发明使用RPA‑LFS(The isothermal recombinase polymerase amplification and the lateral flow strip)方法能够在不依赖仪器设备的非实验室环境下，实现实时、实地、即时的快速现场检测，且准确率高。

Description

一种致吐型蜡样芽孢杆菌特异性正反向引物及探针、检测试 剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种致吐型蜡样芽孢杆菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。
背景技术
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus,B.cereus)广义上指蜡样芽孢杆菌属，狭义上指蜡样芽孢杆菌这一特定物种，是一种革兰氏阳性、需氧、杆状、具有内生孢子、且耐干燥、耐高温的食源性致病菌。蜡样芽孢杆菌因其对营养的低需求和对复杂条件的高抗性而广泛分布于各种环境和食品中。经干燥、烹饪、巴氏杀菌等食品处理条件下存活的蜡样芽孢杆菌孢子，在适宜的条件10～60℃的温度下迅速发芽，产生毒素。蜡样芽孢杆菌毒素引起的典型临床症状有两种：腹泻和呕吐。腹泻是由热不稳定的肠毒素引起，肠毒素进入肠道后致使小肠上皮细胞中的腺苷环化酶增高，继而导致环磷酸腺苷的浓度逐渐增高，随后引起肠腔内液体潴留导致腹泻，其症状较轻，未经治疗即可自愈。致吐型蜡样芽孢杆菌(emetic Bacilluscereus,emetic B. cereus)能够产生cereulide毒素(由非核糖体多肽合成酶系NRPS 产生的ces基因编码)。cereulide毒素在121℃条件下热处理90min 仍具有活性。食用致吐型蜡样芽孢杆菌污染的食物后易引起食物中毒，产生呕吐等临床症状，继而引发急性脑炎、肝衰竭甚至死亡。据报道，蜡样芽孢杆菌是三大常见引起食物中毒的食源性致病菌之一，占食物中毒总数的84％，蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒人数占总中毒人数的14.8％，严重威胁着公众健康。因此，对蜡样芽孢杆菌中高致病性的致吐型蜡样芽孢杆菌鉴别诊断尤为重要。
现有的通常对于食源性致吐型蜡样芽孢杆菌的检测是通过培养法，需要实验室操作并且周期较长，检测较为繁琐；利用分子手段进行检测，通常需要昂贵的仪器设备及具备专业技能的实验人员，成本较高；近年由于重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA技术)、侧流层析试纸条检测技术(LFS)的兴起，本发明通过RPA-LFS技术快速鉴别致吐型蜡样芽孢杆菌，以期为该菌检测带来新的技术参考。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种致吐型蜡样芽孢杆菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明涉及一种蜡样芽孢杆菌特异性正反向引物及探针，其正向引物和反向引物分别为gyrB-F、gyrB-R，且序列分别为 TACATCGTGAAGGTAAAATCCATTACCAAAAATAC、 Biotin-TTATATTGAAGAGAAACCTCAACCTGAATACC，其探针为gyrB-P，且序列为 FITC-TTAAAAGTCATTGGTGACACCGATCAAACA[THF]GAGCAATAACTCGAT-/C3 -spacer/。
本发明还涉及一种致吐型蜡样芽孢杆菌特异性正反向引物及探针，其正向引物和反向引物分别为ces-F、ces-R-m，且序列分别为 ATAGTGGGAAAATAACGAGAAATGCATTTC、Biotin-GGGAGGATACGCTTATGCCCTACTTACATT，其探针为ces-P-m，且序列为 FITC-TCAAAAACAGTTTGAGAACGGGTCATCTAGAG[THF]GATTACACAAGAGAT-C 3-spacer/。
本发明还涉及一种致吐型蜡样芽孢杆菌特异性的检测试剂盒，其包含正反向引物及探针、侧流层析试纸条，所述反向引物5'端用生物素进行标记，所述探针5'端用Fluorescein Isothiocyanate(FITC) 标记，所述中间区域C碱基距5'端30bp、距3'端15bp，所述中间区域C碱基用[THF]进行替换，且3'端用C3-spacer进行末端封闭。
优选地，所述蜡样芽孢杆菌特异性正反向引物长度分别为35bp 和32bp，所述致吐型蜡样芽孢杆菌正反向引物长度均为30bp，所述蜡样芽孢杆菌特异性探针长度45bp，所述致吐型蜡样芽孢杆菌特异性探针长度47bp。
优选地，所述检测试剂盒还包括胶回收试剂、核酸提取试剂、RPA 扩增试剂。
优选地，所述RPA扩增试剂为重组酶聚合酶等温扩增试剂。
本发明的有益效果：
本发明使用RPA结合胶体金试纸条快速检测致吐型食源性蜡样芽孢杆菌，能够在不依赖仪器设备的非实验室环境下，实现实时、实地、即时的快速现场检测，且准确率高，耗时短。
附图说明
图1为本发明实施例中RPA引物扩增蜡样芽孢杆菌及其属内包含性和属外排他性检测结果；
图2为本发明实施例中RPA-LFS鉴定蜡样芽孢杆菌及其包含性和排他性结果；
图3为本发明实施例中RPA-LFS鉴定致吐型蜡样芽孢杆菌结果；
图4为本发明实施例中RPA-LFS致吐型蜡样芽孢杆菌属内特异性检测结果；
图5为本发明实施例中蜡样芽孢杆菌RPA-LFS反应条件优化结果；
图6为本发明实施例中致吐型蜡样芽孢杆菌RPA-LFS反应条件优化结果；
图7为本发明实施例中蜡样芽孢杆菌RPA-LFS最低检出限测定结果；
图8为本发明实施例中致吐型蜡样芽孢杆菌RPA-LFS最低检出限测定结果；
图9为试纸条组装示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明涉及一种蜡样芽孢杆菌特异性正反向引物及探针，其正向引物和反向引物分别为gyrB-F、gyrB-R，且序列分别为TACATCGTGAAGGTAAAATCCATTACCAAAAATAC、 Biotin-TTATATTGAAGAGAAACCTCAACCTGAATACC，其探针为gyrB-P，且序列为 FITC-TTAAAAGTCATTGGTGACACCGATCAAACA[THF]GAGCAATAACTCGAT-/C3 -spacer/。
本发明还涉及一种致吐型蜡样芽孢杆菌特异性正反向引物及探针，其正向引物和反向引物分别为ces-F、ces-R-m，且序列分别为 ATAGTGGGAAAATAACGAGAAATGCATTTC、Biotin-GGGAGGATACGCTTATGCCCTACTTACATT，其探针为ces-P-m，且序列为 FITC-TCAAAAACAGTTTGAGAACGGGTCATCTAGAG[THF]GATTACACAAGAGAT-C 3-spacer/。
本发明还涉及一种致吐型蜡样芽孢杆菌特异性的检测试剂盒，其包含正反向引物及探针、侧流层析试纸条，所述反向引物5'端用生物素进行标记，所述探针5'端用Fluorescein Isothiocyanate(FITC) 标记，所述中间区域C碱基距5'端30bp、距3'端15bp，所述中间区域C碱基用[THF]进行替换，且3'端用C3-spacer进行末端封闭，所述蜡样芽孢杆菌特异性正反向引物长度分别为35bp和32bp，所述致吐型蜡样芽孢杆菌正反向引物长度均为30bp，所述蜡样芽孢杆菌特异性探针长度45bp，所述致吐型蜡样芽孢杆菌特异性探针长度 47bp，所述检测试剂盒还包括胶回收试剂、核酸提取试剂、RPA扩增试剂，所述RPA扩增试剂为重组酶聚合酶等温扩增试剂。
实施例
试验材料
非致吐型蜡样芽孢杆菌(non-emetic B.cereus)、致吐型蜡样芽孢杆菌(emeticB.cereus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、韦氏芽孢杆菌(B.cytotoxicus)、蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)、假蕈状芽孢杆菌(B.pseudomycoides)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、短短芽孢杆菌 (B.brevis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、单增李斯特菌 (L.monocytogenes)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌O157(E.coli O157)标准菌株基因组均由本实验室保存；
Figure RE-GDA0002707419210000061
Basic kit、
Figure RE-GDA0002707419210000062
nfo kit 购自英国TwistDX公司；侧流层析试纸条购自杭州优思达生物技术有限公司；PCR清洁试剂盒购自莫纳生物科技有限公司；Qubit 4购自 Thermo Scientific；本研究所用引物和探针均由通用生物系统(安徽) 有限公司合成；罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪，购自罗氏制药。
试验方法
蜡样芽孢杆菌检测引物设计
从NCBI上获取蜡样芽孢杆菌gyrB基因序列(GenBank# NC_004722.1)，用Primer-Blast通过不同参数设计得到理论上可行的特异性引物。
RPA反应检测蜡样芽孢杆菌引物扩增效果
引物扩增效果检测所使用的
Figure RE-GDA0002707419210000063
Basic kit反应体系： gyrB-F(10μM)2.1μL、gyrB-R(10μM)2.1μL、2×Reaction Buffer 25μL、10×Basic E-mix 5μL、dNTP(1.8mM)2.25μL、模板1 μL、ddH2O 6.95μL、20×core Reaction mix 2.5μL、MgOAc(280mM) 2.5μL共50μL反应体系；反应温度：37℃；反应时间：30min；通过琼脂糖凝胶电泳及紫外凝胶成像仪检验引物扩增效果，包括扩增特异性、属内包含性、属外排他性。其中包含性测试应用的属内模板包括：非致吐型蜡样芽孢杆菌(non-emetic B.cereus)、致吐型蜡样芽孢杆菌(emetic B.cereus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、韦氏芽孢杆菌(B.cytotoxicus)、蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)、假蕈状芽孢杆菌(B.pseudomycoides)。排他性测试应用的属外模板包括：解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、短短芽孢杆菌(B.brevis)、地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)、单增李斯特菌(L.monocytogenes)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌O157 (E.coliO157)。结果表明：应用gyrB-F和gyrB-R引物对进行RPA 扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，可以特异性鉴定蜡样芽孢杆菌及其属内菌、且无法扩增出属外菌，gyrB-F和gyrB-R引物对具有良好的特异性、包含性和排他性，结果如图1所示。
蜡样芽孢杆菌检测探针设计和RPA-LFS检测蜡样芽孢杆菌引物-探针组应用效果
用Geneious软件在正反向引物间设计特异性探针，用Primer 5.0 验证引物探针特性，应在理论上尽量避免正方向引物二聚体、发夹结构、错配、探针和反向引物的二聚体等发生。探针筛选使用
Figure RE-GDA0002707419210000071
nfo kit，其反应体系：gyrB-F(10μM)2.1μL、gyrB-R(10μM)2.1 μL、gyrB-P(10μM)0.6μL、Rehydration Buffer 29.5μL、ddH2O 11.2μL、加入冻干粉，混匀、模板2μL、MgOAc(280mM)2.5μL 共50μL反应体系；反应温度：37℃；反应时间：30min；反应结束置于冰上终止反应，再通过侧流层析试纸条检测引物-探针组应用效果，包括特异性、属内包含性、属外排他性。结果表明：应用 gyrB-F/gyrB-R/gyrB-P引物-探针组合进行RPA扩增和LFS检测，可以特异性检出蜡样芽孢杆菌及其属内菌、且无法检出属外菌， gyrB-F/gyrB-R/gyrB-P引物-探针组具有良好的特异性、包含性和排他性，测试结果如图2所示。
致吐型蜡样芽孢杆菌检测引物及探针设计
从NCBI上获取致吐型蜡样芽孢杆菌ces基因序列(GenBank# DQ360825.1825.1)，用Primer-Blast通过不同参数设计得到理论上可行的特异性引物。用Geneious软件在正反向引物间设计特异性探针，用Primer 5.0验证引物探针特性，应在理论上尽量避免正方向引物二聚体、发夹结构、错配、探针和反向引物的二聚体等发生。 RPA-LFS检测致吐型蜡样芽孢杆菌引物-探针组应用效果
使用
Figure RE-GDA0002707419210000081
nfo kit测试致吐型蜡样芽孢杆菌引物-探针组应用效果，其反应体系：ces-F(10μM)2.1μL、ces-R(10μM)2.1 μL、ces-P(10μM)0.6μL、Rehydration Buffer29.5μL、ddH2O 11.2 μL、加入冻干粉，混匀、模板2μL、MgOAc(280mM)2.5μL共50 μL反应体系；反应温度：37℃；反应时间：30min；反应结束置于冰上终止反应，再通过侧流层析试纸条检测引物-探针组应用效果。其中：ces-R序列为：5’ -Biotin-GGGAGGATACGCTTTTGCCCAACTTACTTT-3’，ces-P序列为：5’ -FITC-TCAAAAACAGTTTGAGAACGGGGCATATAGAG[THF]GATTACACAAAAGAT- C3-spacer-3’。结果表明：应用ces-F/ces-R/ces-P引物-探针组合进行RPA扩增和LFS检测，可以检出致吐型蜡样芽孢杆菌，但阴性对照(NTC)仍有扩增，测试结果如图3A所示。
接着对ces-R和ces-P可能产生的复合体情况进行分析，分析结果如图3B所示。这些可能形成的引物-探针复合体会引起NTC产生阳性信号。因RPA扩增可以耐受特定情况下的碱基错配而不影响其扩增效果，故对下游引物和探针序列进行碱基错配，修改其序列，获得 ces-R-m和ces-P-m。应用修改后的引物盒探针序列进行上述RPA-LFS 反应。结果表明：应用错配后的ces-F/ces-R-m/ces-P-m引物-探针组合进行RPA扩增和LFS检测，可以特异性检出致吐型蜡样芽孢杆菌，且阴性对照(NTC)无扩增，测试结果如图3C所示。
以致吐型蜡样芽孢杆菌(emetic B.cereus)、非致吐型蜡样芽孢杆菌(non-emeticB.cereus)、苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis)、韦氏芽孢杆菌(B.cytotoxicus)、蕈状芽孢杆菌 (B.mycoides)、假蕈状芽孢杆菌(B.pseudomycoides)基因组DNA 为模板，以错配后的ces-F/ces-R-m/ces-P-m引物-探针组合，进行属内特异性鉴定。结果表明：应用ces-F/ces-R-m/ces-P-m引物-探针组合进行RPA扩增和LFS检测，可以特异性检出致吐型蜡样芽孢杆菌，蜡样芽孢杆菌属内其它细菌物扩增，测试结果如图4所示。蜡样芽孢杆菌RPA-LFS反应条件优化
将反应混合物立即在37℃下孵育30min，采用方阵法确定RPA 反应的最佳反应温度(30℃、35℃、37℃、40℃、42℃)，反应时间 (5min、10min、15min、20min、25min)。RPA-LFS最佳反应温度和时间分别为：37℃和20min，结果如图5所示。
致吐型蜡样芽孢杆菌RPA-LFS反应条件优化
将反应混合物立即在37℃下孵育30min，采用方阵法确定RPA 反应的最佳反应温度(30℃、35℃、37℃、40℃、42℃)，反应时间(5min、10min、15min、20min、25min、30min)。RPA-LFS最佳反应温度和时间分别为：37℃和20min，结果如图6所示。
蜡样芽孢杆菌和致吐型蜡样芽孢杆菌RPA-LFS检测灵敏度测定
由于蜡样芽孢杆菌在食物中的起始含量和有无其它细菌干扰不能确定，在方法建立过程中检测的模板浓度通常较高且均为单一蜡样芽孢杆菌基因组，再加上蜡样芽孢杆菌多存在于高蛋白含量的食物中，食物基质对检测效果有无影响，这些不确定的因素可能会影响该检测试剂盒的效果，考虑到上述可能的情况，我们分别制备：(1)终浓度为108～103copies/mL和106～10CFU/mL的非致吐型蜡样芽孢杆菌菌液/致吐型蜡样芽孢杆菌；(2)向终浓度为108～103copies/mL的非致吐型蜡样芽孢杆菌菌液/致吐型蜡样芽孢杆菌中加入李斯特菌，至终浓度为108copies/mL；(3)向180μL/份的牛奶样品中加入20μ L非致吐型蜡样芽孢杆菌菌液/致吐型蜡样芽孢杆菌至终浓度为106～ 10CFU/mL，将上述样本进行热失活(100℃条件下孵育10min)处理后，评估纯菌液的检测灵敏度、以及其它细菌干扰、食物基质干扰条件下对试剂盒检测灵敏度的影响。结果表明：蜡样芽孢杆菌菌液/致吐型蜡样芽孢杆菌RPA-LFS检测系统具有较高的检测灵敏度，即 104copies/mL或102CFU/mL，且一定程度上可以耐受其他细菌和食物基质的干扰，检测灵敏度不受影响，结果如图7和8所示。
应用2种蜡样芽孢杆菌RPA-LFS检测试剂盒检测极低浓度蜡样芽孢杆菌污染及区分非致吐型和致吐型蜡样芽孢杆菌污染的奶油样本
目前细菌培养结合生化法鉴定蜡样芽孢杆菌是非常灵敏的方法，在低浓度蜡样芽孢杆菌污染的奶油样本检测中，采用培养法作为对照，能够评价蜡样芽孢杆菌RPA-LFS检测试剂盒的准确度，同时可以比较在相同的检出条件下，两种方法的检测效率等。
奶油样品根据(GB/T 4789.14-2003)方法检测确定无蜡样芽孢杆菌污染。为了评估食品中蜡样芽孢杆菌污染量较低的情况，将25g 奶油溶解于225mL营养肉汤(NB)中，分别添加非致吐型蜡样芽孢杆菌菌液/致吐型蜡样芽孢杆菌至最终浓度100～102CFU/mL，然后在30℃温度下进行富集，对照组使用等量PBS。分别于0、2、4、6h 收集1mL的富集细菌培养液，从培养液中提取DNA，并进行RPA-LFS 检测。同时通过营养琼脂(NA)培养基30℃培养24h，利用培养法测定每个时间点的菌落数。
结果表明：样本内污染的蜡样芽孢杆菌在不富集的情况下，应用两种RPA-LFS检测试剂盒均能检测到102CFU/mL奶油样品，而传统培养法检测到10CFU/mL样品。富集2h后，两种RPA-LFS方法均能检测到10CFU/mL的奶油样品，传统培养法检测到1CFU/mL样品。富集4h后，两种方法均可检测到初始添加的菌液浓度1CFU/mL。相同的检测灵敏度下，应用两种RPA-LFS检测试剂盒可以大大提高低浓度污染样本的检测效率，且可以成功鉴定出低浓度污染的致吐型蜡样芽孢杆菌，结果如表1所示。
表1人工污染奶油样品中蜡样芽孢杆菌的RPA-LFS检测
Figure RE-GDA0002707419210000111
Figure RE-GDA0002707419210000121
Figure RE-GDA0002707419210000131
NC：等量PBS的负对照；NTC：无模板负对照
应用2种蜡样芽孢杆菌RPA-LFS检测试剂盒检测蜡样芽孢杆菌孢子污染及区分非致吐型和致吐型蜡样芽孢杆菌污染的奶油样本
蜡样芽孢杆菌具有内生孢子，经干燥、烹饪、巴氏杀菌等处理条件下存活的蜡样芽孢杆菌孢子，在适宜的条件10～60℃的温度下迅速发芽，产生毒素。因此，需要利用建立的检测方法评估食物样本中的孢子萌发情况。
孢子悬浮液的制备：将非致吐型蜡样芽孢杆菌和致吐型蜡样芽孢杆菌标准菌株活化后，接种于营养肉汤(NB)中培养3代，取新鲜的菌液接种到营养琼脂(NA)，30℃，分别培养24h、36h、48h、60 h，用光学显微镜检查孢子纯度，以确定无营养体形态菌存在，用菌落计数法测定孢子浓度，制备完成的孢子4℃保存。
为了评估食品中蜡样芽孢杆菌孢子萌发导致污染的情况，将25g 奶油溶解在225mL NB培养基中，分别加入非致吐型和致吐型蜡样芽孢杆菌孢子使终浓度达到103～105CFU/mL，对照组使用等量PBS。制备好的样品在4℃培养2周，收集1mL污染样本，从蜡样芽孢杆菌和孢子中提取总DNA，并进行2种RPA-LFS检测。其中，奶油样本的基因组DNA提取方法如下：将1mL奶油污染样本加入130μL裂解液DB(Tris 1.21g、EDTA 2.92g、0.5％SDS(w/v)，ddH2O定容至 100mL，HCl调pH至8.0)，使其充分裂解，再加入200μL 17.5mg/mL Pronasesolution，使用细胞破碎仪对菌液和孢子进行充分破碎，置于40℃条件下孵育3h，然后采用核酸提取试剂盒提取基因组DNA。同时通过营养琼脂(NA)培养基30℃培养24h，利用培养法测定菌落数。结果表明：蜡样芽孢杆菌RPA-LFS检测试剂盒具有良好的应用检测性能，可以有效检测食物样本中萌发的孢子，具有较高的检测效率，且可以区分致吐型蜡样芽孢杆菌孢子污染的奶油样本，结果如表 2所示。
表2孢子污染奶油样本检测
Figure RE-GDA0002707419210000141
Figure RE-GDA0002707419210000151
NC：等量PBS的负对照；NTC：无模板负对照
试纸条检测原理
吸取无需纯化的扩增产物5μL加入95μL缓冲液中，插入试纸条，在试纸条吸水纸的虹吸作用下，扩增产物与金标抗体、缓冲液向吸水纸端流动。当有扩增产物存在时，扩增产物一端修饰有FITC，与鼠抗FITC金标抗体结合，接着液相继续向吸水纸端流动到达检测线，固定在检测线上的链霉亲和素另一端修饰有生物素的扩增产物捕获，这样就使被扩增产物一端结合的胶体金都停留在检测线处，产生红色的条带。多余的胶体金继续层析，最终被质控线上的抗鼠抗体的 Fc片段抗体捕获，使质控线同样显色。当扩增产物不存在时，胶体金颗粒无法停留在检测线处，而被质控线上的抗鼠抗体捕获，所以质控线的显色情况可以用来对试纸条的质量进行指控，示意图如图5所示。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种蜡样芽孢杆菌特异性正反向引物及探针，其特征在于，其正向引物和反向引物分别为gyrB-F、gyrB-R，且序列分别为TACATCGTGAAGGTAAAATCCATTACCAAAAATAC、Biotin-TTATATTGAAGAGAAACCTCAACCTGAATACC，其探针为gyrB-P，且序列为FITC-TTAAAAGTCATTGGTGACACCGATCAAACA[THF]GAGCAATAACTCGAT-/C3-spacer/。
2.一种致吐型蜡样芽孢杆菌特异性正反向引物及探针，其特征在于，其正向引物和反向引物分别为ces-F、ces-R-m，且序列分别为ATAGTGGGAAAATAACGAGAAATGCATTTC、Biotin-GGGAGGATACGCTTATGCCCTACTTACATT，其探针为ces-P-m，且序列为FITC-TCAAAAACAGTTTGAGAACGGGTCATCTAGAG[THF]GATTACACAAGAGAT-C3-spacer/。
3.一种致吐型蜡样芽孢杆菌特异性的检测试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1和2所述的正反向引物及探针、侧流层析试纸条，所述反向引物5'端用生物素进行标记，所述探针5'端用Fluorescein Isothiocyanate(FITC)标记，所述中间区域C碱基距5'端30bp、距3'端15bp，所述中间区域C碱基用[THF]进行替换，且3'端用C3-spacer进行末端封闭。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌特异性正反向引物长度分别为35bp和32bp，所述致吐型蜡样芽孢杆菌正反向引物长度均为30bp，所述蜡样芽孢杆菌特异性探针长度45bp，所述致吐型蜡样芽孢杆菌特异性探针长度47bp。
5.根据权利要求3中任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括胶回收试剂、核酸提取试剂、RPA扩增试剂。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RPA扩增试剂为重组酶聚合酶等温扩增试剂。
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