RU2820141C1 - Способ идентификации и определения патогенности штаммов Vibrio cholerae методом петлевой изотермической амплификации (LAMP) - Google Patents
Способ идентификации и определения патогенности штаммов Vibrio cholerae методом петлевой изотермической амплификации (LAMP) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2820141C1 RU2820141C1 RU2023107365A RU2023107365A RU2820141C1 RU 2820141 C1 RU2820141 C1 RU 2820141C1 RU 2023107365 A RU2023107365 A RU 2023107365A RU 2023107365 A RU2023107365 A RU 2023107365A RU 2820141 C1 RU2820141 C1 RU 2820141C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdqualifier
- insdseq
- primers
- insdfeature
- dna
- Prior art date
Links
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 title claims abstract description 57
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 title abstract description 9
- 101150057202 ompW gene Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 19
- 101150028842 ctxA gene Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 11
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 claims description 10
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 claims description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 230000001018 virulence Effects 0.000 claims description 4
- 101710200526 DNA polymerase 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 abstract description 39
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 abstract description 6
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 abstract description 4
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 3
- 241000602423 Vibrio cholerae O1 Species 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194314 Vibrio cholerae O139 Species 0.000 description 2
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 2
- 241000607265 Vibrio vulnificus Species 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L paraquat dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=C[N+](C)=CC=C1C1=CC=[N+](C)C=C1 FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010022678 Intestinal infections Diseases 0.000 description 1
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000936820 Vibrio cholerae non-O1 Species 0.000 description 1
- 241000025846 Vibrio cholerae non-O1/non-O139 Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 241000573739 bacterium V Species 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 102000007739 porin activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ идентификации и определения патогенности штаммов Vibrio cholerae методом петлевой изотермической амплификации (LAMP). Способ включает выделение ДНК из исследуемого материала, проведение петлевой изометрической амплификации и учет результатов. Он отличается тем, что амплификацию проводят с помощью разработанного набора праймеров к гену ompW и набора праймеров к гену ctxA. Техническим результатом, достигаемым при осуществлении данного изобретения, являются новые высокоспецифичные олигонуклеотидные праймеры для быстрого, специфичного и чувствительного выявления штаммов V. cholerae в пробах чистых культур методом петлевой изотермической амплификации (LAMP). 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 2 пр.
Description
Предлагаемое изобретение относится к областям медицинской микробиологии, биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к молекулярной диагностике и может быть использовано для лабораторной диагностики холеры, как в практическом здравоохранении, так и в научно-исследовательских учреждениях и лабораториях.
В настоящее время остается актуальной проблема распространения острой кишечной инфекции-холеры, которая характерна особой тяжестью течения, высокой летальностью и тенденцией к эпидемическому, а иногда и пандемическому распространению, поэтому отнесена ВОЗ к особо опасным карантинным инфекциям (1, 2).
Наиболее часто эпидемические вспышки холеры регистрируются в странах Африки, Латинской Америки, Юго-Восточной Азии. По оценкам ВОЗ, ежегодно регистрируется 3-5 млн. случаев заболевания холерой, из которых 100-120 тыс. заканчиваются смертельно (3). В связи с этим, холера на сегодняшний день остается глобальной проблемой мирового здравоохранения, что определяет необходимость совершенствования лабораторной диагностики данной инфекции.
Несмотря на многолетней опыт и имеющиеся подробные рекомендации по лабораторной диагностике, идентификация холерного вибриона традиционными методами (культуральные, биохимические и иммунологические) требует значительных затрат и времени. Новый и высокоспецифичный метод петлевой изотермической амплификации (LAMP) из-за его простоты, быстроты и пригодности для крупно масштабного скрининга на месте является альтернативным многообещающим инструментом для чувствительного и быстрого обнаружения холерных вибрионов, в том числе, содержащих ген холерного токсина СТХ (4). Известны различные коммерческие тест-системы для видовой идентификации, а также позволяющие определять наличие различных факторов патогенности холерных вибрионов. Они как правило основаны на методе ПЦР (5). Современный уровень развития лабораторной диагностики характеризуется появлением новых ускоренных способов альтернативных ПЦР. Изотермические методы амплификации нуклеиновых кислот становятся перспективной альтернативой ПЦР и значительно упрощают реализацию способов амплификации.
Одним из таких способов является технология петлевой амплификации (LAMP), которая была разработана Tsugunori Notomi и его коллегами (Япония) в 2000 г. (6), заключается в использовании четырех или шести олигонуклеотидных праймеров, что позволяет значительно повысить специфичность реакции, и фермента Bst-полимеразы, которая отличается сильной вытесняющей активностью.
Данный способ позволяет провести то же исследование, что и с помощью реакции ПЦР, но значительно быстрее, специфичнее, не требует дорогого приборного оснащения и квалифицированного персонала.
Однако, в связи с высокой стоимостью реактивов зарубежного производства, одним из этапов предлагаемой работы, в целях повышения экономической эффективности способа, была проведена оценка возможности применения реагентов для LAMP отечественного производства (ООО «Биолабмикс»).
За прототип выбран способ идентификации холерного вибриона на основе метода LAMP разработанный С. Srisuk с соавторами (7), заключающийся в том, что подобран набор из пяти праймеров, которые специфически распознают ген ompW V. cholerae. Оптимальные временные и температурные условия для анализа составляют 75 минут при 65°С. Специфичность и чувствительность разработанных праймеров была проверена на 16 штаммах V. cholerae, а также штаммах других близкородственных видов.
Отличие данного способа от разработанного нами является использование пяти, а не шести праймеров (отсутствует один петлевой праймер), в связи с чем и времени на реакцию требуется больше. При этом следует отметить маленькую выборку штаммов холерных вибрионов, на которых проверена специфичность праймеров.
Отсутствие отечественных наборов, предназначенных для выявления V. cholerae методом петлевой изотермической амплификации, поставило перед разработчиками задачу сконструировать собственный набор олигонуклеотидных праймеров.
При этом был разработан способ детекции видоспецифичного для Vibrio cholerae гена ompW и гена ctxA, кодирующего холерный токсин СТХ, с помощью реакции петлевой изотермической амплификации (LAMP). Предлагаемое изобретение позволяет быстро в течение 30-60 минут, с высокой специфичностью и чувствительностью 1×104 м.кл./мл. выявлять присутствие штаммов Vibrio cholerae, в том числе, продуцирующих холерный токсин.
Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка новых высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров для быстрого, специфичного и чувствительного выявления штаммов Vibrio cholerae в пробах чистых культур, основанного на петлевой изотермической амплификации фрагмента гена-мишени.
Поставленная задача достигается тем, что в известном способе идентификации и определения патогенности штаммов Vibrio cholerae методом петлевой изотермической амплификации (LAMP), включающем выделение ДНК из исследуемого материала, проведение петлевой изометрической амплификации и учет результатов, отличие состоит в том, что амплификацию проводят с помощью набора олигонуклеотидных праймеров к гену ompW и набора праймеров к гену ctxA, следующего состава:
к гену ompW
к гену ctxA
при этом реакцию петлевой изометрической амплификации проводят в два этапа, первоначально к гену ompW, кодирующему белок внешней мембраны холеры, для определения вида Vibrio cholerae, а затем к гену ctxA, кодирующему холерный токсин, для определения вирулентности, учет результатов осуществляют с помощью амплификатора с программой 65°С - 60 сек и снятием сигнала при каждом цикле и длительностью 60 циклов, а детекцию результатов амплификации осуществляют по каналам флуорофора FAM, где положительным считают образец, при анализе которого наблюдают рост флуоресцентного сигнала на цветовом канале амплификатора.
При этом для проведения предворительно готовят 10-кратную смесь праймеров для каждого из генов, которая включает: 16 мкМ каждого FIP- и BIP- праймеров, 2 мкМ каждого F3- и В3-праймеров, 4 мкМ каждого LoopF- и Loop В-праймеров, вода без нуклеаз до конечного объема 100 мкл, при этом положительный контроль включает в себя все компоненты реакции и препарат ДНК Vibrio cholerae (ctx+),a в случае отрицательного контроля в реакционную смесь вместо исследуемого препарата ДНК вносят соответствующее количество деионизованной воды, не содержащей исследуемой ДНК.
Кроме того амплификацию проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит: 10хбуфер для Bst ДНК-полимеразы - 2.5 мкл; MgSO4 (100 mM) - 2 мкл; смесь dNTP - (25 mM) - 1,5 мкл; смесь праймеров к гену ompW - 2,5 мкл; Bst ДНК-полимераза - 2 мкл; флуоресцентный краситель EvaGreen (20Х водный раствор) - 1,25 мкл; образец ДНК - 2 мкл; вода, свободная от нуклеаз - до 25 мкл.
Техническим результатом, достигаемым при осуществлении данного изобретения, являются новые высокоспецифичные олигонуклеотидные праймеры для быстрого, специфичного и чувствительного выявления штаммов V. Cholera в пробах чистых культур методом петлевой изотермической амплификации (LAMP).
Обоснование выбора праймеров и ДНК-мишени
Для конструирования праймеров был использован интернет-сервис Primer Explorer 5 (LAMP primer designing software: http://primerexplorer.jp/e/), BLAST NCBI.
В качестве целевой мишени взяты ген ompW, кодирующий белок внешней мембраны и ген ctxA, кодирующий холерный токсин СТХ.
OmpW является членом основного семейства белков, которые локализуются на внешней мембране бактерий и участвуют в транспорте небольших гидрофобных молекул и железа (8). Ген ompW присутствует в штаммах V. cholerae и широко используется в качестве специфической мишени для обнаружения и идентификации V. cholerae (9). Ген ctxA кодируют холерный токсин СТХ (белковый экзотоксин). Холерный токсин секретируется вирулентными штаммами после попадания бактерии V. cholerae в организм человека.
Последовательности для подбора праймеров к генам ompW и ctxA были получены из базы GenBank NCBI:
к гену ompW
к гену ctxA
Способ осуществляется следующим образом.
Этапы:
1) подготовка смесей праймеров для проведения LAMP, исследуемых и контрольных образцов (положительный и отрицательный контроли);
2) выделение нуклеиновых кислот из исследуемых и контрольных образцов;
3) проведение петлевой изотермической амплификации (LAMP):
а) - определение принадлежности исследуемых культур к виду Vibrio cholerae - с праймерами к гену ompW;
б) - определение вирулентности штаммов Vibrio cholerae - с праймерами к гену ctxA;
4) учет и интерпретация результатов анализа.
Из полученной исследуемой чистой культуры готовят суспензию в 2 мл 0,9% раствора натрия хлорида в концентрации 1×109 м.кл./мл по стандарту мутности бактериальных взвесей ОСО 42-28-86-2018 (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России).
Исследуемые бактериальные суспензии обеззараживают в соответствии с требованиями МУ 1.3.2569-09 и СанПиН 3.3686-21 (10,11).
По первому этапу готовят 10-кратную смесь праймеров для каждого из генов, которая включает: 16 мкМ каждого FIP- и BIP- праймеров, 2 мкМ каждого F3- и В3-праймеров, 4 мкМ каждого LoopF- и Loop В-праймеров, вода без нуклеаз до конечного объема 100 мкл.
Положительный контроль включает в себя все компоненты реакции и препарат ДНК Vibrio cholerae (ctx+). В случае отрицательного контроля в реакционную смесь вместо исследуемого препарата ДНК вносится соответствующее количество деионизованной воды, не содержащей исследуемой ДНК.
По второму этапу выделяют ДНК V.cholerae из исследуемого материала с помощью зарегистрированных в установленном порядке наборов реагентов, в соответствии с инструкцией производителя.
Третий этап - с полученными пробами ДНК проводят реакцию петлевой изотермической амплификации (LAMP).
а) При этом на первом этапе с целью определения принадлежности к виду Vibrio cholerae реакцию ставят с праймерами к гену ompW.
Реакцию проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит:
10хбуфер для Bst ДНК-полимеразы - 2.5 мкл; MgSO4 (100 mM) - 2 мкл; смесь dNTP - (25 mM) - 1,5 мкл; смесь праймеров к гену ompW - 2,5 мкл; Bst ДНК-полимераза - 2 мкл; флуоресцентный краситель EvaGreen (20Х водный раствор) - 1,25 мкл; образец ДНК - 2 мкл; вода, свободная от нуклеаз - до 25 мкл.
Для мониторинга флуоресценции окрашенной реакционной смеси в режиме реального времени используют соответствующий амплификатор с программой: 65°С - 60 сек и снятием сигнала при каждом цикле и длительностью 60 циклов.
Четвертый этап-детекцию результатов амплификации осуществляют по каналу FAM. Положительным считается образец, при анализе которого наблюдают рост флуоресцентного сигнала на цветовом канале амплификатора, используемом для учета.
Результат считается достоверным только в случае прохождения положительного контроля реакции и отсутствия амплификации специфического продукта для отрицательного контроля реакции.
б) На втором этапе для определения вирулентности, идентифицированных на первом этапе как Vibrio cholerae штаммов, проводят реакцию LAMP с праймерами к гену ctxA по той же схеме.
При использовании готовых наборов для проведения петлевой изотермической амплификации в режиме реального времени с использованием флуоресцентных красителей или с визуальным колориметрическим способом детекции реакцию проводят согласно инструкции производителя реакционной смеси.
Апробацию праймеров осуществляли на наборе коллекционных и свежевыделенных штаммов V. cholerae, взятых из коллекции ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора. Специфичность отобранных праймеров подтвердили путем исследования культур близкородственных видов и родов в количестве 57 штаммов. Чувствительность реакции амплификации с праймерами оценивают при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений штаммов холерных вибрионов. В результате проведенной оценки установлено, что данные праймеры обладают 100% специфичностью и чувствительностью 1×104 м.кл./мл. (см. таблицу 1, 2).
Сущность изобретения поясняется примерами
Пример 1.
Определение принадлежности культуры к виду V. cholerae в реакции LAMP с помощью праймеров к гену ompW.
Штаммы V. cholerae O1 №№20000, V. cholerae O139 №16064, V. cholerae non O1/non O139 №19874, Vibrio parahaemolyticus №19005 с точно установленной видовой принадлежностью взяты из коллекции ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора. В качестве положительного контроля взят штамм V. cholerae O1 Р-15415. В качестве отрицательного контрольного образца используют деионизованную стерильную воду, свободную от ДНКаз.
Бактериальные взвеси клеток суточных культур вибрионов, выросших на питательной среде, готовят в 2 мл 0,9% стерильного раствора натрия хлористого по стандартному образцу мутности 5 единиц (ОСО 42-28-86-2018), что соответствует 1×109 микробных клеток в 1 мл для холерного вибриона. Обеззараживание подготовленных бактериальные взвесей проводят в соответствии с МУ 1.3.2569-09.
Из обеззараженных проб выделяют ДНК с помощью набора реагентов «ДНК-сорб В» («Интерлабсервис», Москва). Работу проводят в соответствии с инструкцией производителя.
Затем проводят постановку петлевой изотермической амплификации (LAMP) с выделенной ДНК с использованием предложенных праймеров к гену ompW по вышеизложенной технологии.
Учет результатов осуществляют с помощью реал-тайм амплификатора ДТ-Lite (ДНК-технология, Россия) с программой: 65°С - 60 сек и снятием сигнала при каждом цикле и длительностью 60 циклов. Результаты учитывают в реальном времени по наличию флуоресцентного сигнала характерного для флуорофора FAM (фиг. 1).
На фигуре 1 результаты детекции гена ompW V. cholerae с помощью предложенных праймеров, где А1-А3-штаммы V. cholerae №№20000, 16064, 19874; А4 - штамм Vibrio parahaemolyticus №19005; А5 - положительный контроль; А6 - отрицательный контроль.
Таким образом - график показывает, что кривые штаммов А1-А3 и А5 имеют флуоресцентный сигнал, что подтверждает их принадлежность к виду V. cholerae.
Пример 2.
Идентификация патогенных штаммов Vibrio cholerae (по наличию фактора вирулентности - гена ctxA)
Штаммы V. cholerae O1 19188 (ctx+), 20068 (ctx+), 20555 (ctx-), 18963 (ctx-), 19992 (ctx-), V. cholerae non O1/non P-19669 (ctx-), 19675 (ctx-), P-20165 (ctx-), V. cholerae O139 16064 (ctx+) с точно установленной видовой принадлежностью и с заведомо известными данными по наличию гена ctxA взяты из коллекции ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора. В качестве отрицательного контроля был взят штамм Vibrio vulnificus №15828.
Исследование проводят как в примере 1. Петлевую изотермическую амплификацию проводят с применением праймеров к гену ctx А. Технология и условия проведения реакции сходные. Детектирующее флуоресцентное свечение молекулы флуорофора FAM свидетельствуют о наличии гена ctxA у штаммов V. cholerae (и как следствие о продукции холерного токсина) (фиг. 2), где кривые штаммов А1, А2, В1 - штаммы V. cholerae, содержащие ген холерного токсина; A3- А8 - атоксигенные ctx- штаммы V. cholerae; В2 - отрицательный контроль штамм Vibrio vulnificus №15828.
Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет набора новых высокоспецифичных праймеров быстро в течение 30-60 минут, достоверно, и эффективно проводить идентификацию представителей вида V. cholerae, а также определять патогенность штаммов, дифференцируя токсигенные штаммы от нетоксигенных методом изотермической петлевой амплификации.
Кроме того, простота в исполнении анализа, низкая себестоимость, высокая чувствительность 1×104 м.кл./мл и специфичность данных праймеров дает возможность применять их в практике бактериологических лабораторий, центров гигиены и эпидемиологии, лечебно-профилактических, противочумных и других учреждений.
Источники информации:
1. Шувалова Е.П., Белозеров Е.С., Беляева Т.В., Змушко Е.И. Инфекционные болезни. Спб. СпецЛит. 2016: 783 с.
2. Andrew S. Azman, Kara Е. Rudolph, Derek A.T. Cummings, Justin Lessler. The incubation period of cholera: A systematic review. Infection. 2013;. 66 (5): 432-438. doi: 10.1016/j.jinf.2012.11.013.
3. Всемирная организация здравоохранения (16 декабря 2022 г.). Новости о вспышках болезней. Холера - ситуация в мире. См. по адресу: https://www.who.int/ru/emergencies/disease-outbreak-news/item/2022-DON426.
4. Notomi Т., Okayama Н., Masubuchi Н. et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA // Nucleic Acids Res. - 2000. - Vol. 28. - e63-e63. DOI: 10.1093/nar/28.12.e63.
5. МУК 4.2.3745-22. Методы лабораторной диагностики холеры. Методические указания. Москва 2022.
6. Notomi Т., Okayama Н., Masubuchi Н., Yonekawa Т., Watanabe K., Amino N., Hase Т. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids. Res., 2000, vol. 28, no. 12, e63 (7 p.). DOI: 10.1093/nar/28.12.e63.
7. Srisuk C., Chaivisuthangkura P., Rukpratanporn S., Longyant S., Sridulyakul P., Sithigorngul P. Rapid and sensitive detection of Vibrio cholerae by loop-mediated isothermal amplification targeted to the gene of outer membrane protein ompW. Lett Appl. Microbiol. 2010; 50(1): 36-42. DOI: 10.1111/j.1472-765X.2009.02749.x.
8. Gil F., Ipinza F., Fuente J., Fumeron R., Villarreal J.M., Aspee A. et al. The ompW (porin) gene mediates methyl viologen (paraquat) efflux in Salmonella enterica serovar typhimurium. RES. Microbiol. 2007; 158: 529-36. DOI: 10.1016/j.resmic.2007.05.004.
9. Nandi В., Nandy R.K., Mukhopadhyay S., Nair G.В., Shimada Т., Ghose A.C. et al. Rapid method for species-specific identification of Vibrio cholerae using primers targeted to the gene of outer membrane protein OmpW. J Clin Microbiol. 2000; 38: 4145-51. DOI: 10.1128/JCM.38.11.4145-4151.2000.
10. СанПиН 3.3686-21. Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней.
11. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности: методические указания МУ 1.3.2569-09. - М.; 2009.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ
идентификации и определения патогенности штаммов Vibrio cholerae
методом петлевой изотермической амплификации (LAMP)..xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"
productionDate="2023-03-15">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>185</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-03-15</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>185</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Ростовский- на –Дону противочумный
институт Роспотребнадзора</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Rostov-on-Don Plague Control Research Institute
of the Rospotrebnadzor</ApplicantNameLatin>
<InventorName languageCode="ru">Чемисова Ольга
Сергеевна</InventorName>
<InventorNameLatin>Chemisova Olga Sergeevna</InventorNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ идентификации и определения
патогенности штаммов Vibrio cholerae методом петлевой
изотермической амплификации (LAMP).</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>12</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>43</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..43</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atggggacttgctgctaacgttttcgttgaggaaccagctatc</INSD
Seq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>53</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..53</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aatcactcaatccagcattagtaccttttgaattacaccactttctttg
atga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tggcataccacacagaag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtccatatgttggtgcgg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttggcctttgattatatgctcaat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtaccattaaagctttcatc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>51</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..51</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gctgctggagcaatatctaagttacttttcaattacatcgtaatagggg
ct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>42</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..42</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aggtttccctccggagcatattttttggagcattcccacaac</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cattttggggtgcttgatg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q20">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcgcaagtattactcatcga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q22">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtaatatctatctctgtagc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q24">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gagccgtggattcatcatgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (18)
1. Способ идентификации и определения патогенности штаммов Vibrio cholerae методом петлевой изотермической амплификации (LAMP), включающий выделение ДНК из исследуемого материала, проведение петлевой изометрической амплификации и учет результатов, отличающийся тем, что амплификацию проводят с помощью набора праймеров к гену ompW и набора праймеров к гену ctxA, следующего состава:
к гену ompW
FIP- ATGGGGACTTGCTGCTAACGTTTTCGTTGAGGAACCAGCTATC
BIP- AATCACTCAATCCAGCATTAGTACCTTTTGAATTACACCACTTTCTTTGATGA
F3-TGGCATACCACACAGAAG
В3-GTCCATATGTTGGTGCGG
LoopF-TTGGCCTTTGATTATATGCTCAAT
LoopB-GTACCATTAAAGCTTTCATC
к гену ctxA
FIP- GCTGCTGGAGCAATATCTAAGTTACTTTTCAATTACATCGTAATAGGGGCT
BIP- AGGTTTCCCTCCGGAGCATATTTTTTGGAGCATTCCCACAAC
F3- CATTTTGGGGTGCTTGATG
B3- TCGCAAGTATTACTCATCGA
LF-GTAATATCTATCTCTGTAGC
LB-GAGCCGTGGATTCATCATGC,
при этом реакцию петлевой изометрической амплификации проводят в два этапа, первоначально к гену ompW, кодирующему белок внешней мембраны холеры, для определения вида Vibrio cholerae, а затем к гену ctxA, кодирующему холерный токсин, для определения вирулентности, учет результатов осуществляют с помощью амплификатора с программой 65°С - 60 сек и снятием сигнала при каждом цикле и длительностью 60 циклов, а детекцию результатов амплификации осуществляют по каналам флуорофора FAM, где относящимся к виду Vibrio cholerae и патогенным считают тот образец, при анализе которого наблюдают рост флуоресцентных сигналов на цветовых каналах амплификатора.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для проведения LAMP предварительно готовят 10-кратную смесь праймеров для каждого из генов, которая включает: 16 мкМ каждого FIP- и BIP- праймеров, 2 мкМ каждого F3- и В3-праймеров, 4 мкМ каждого LoopF- и Loop В-праймеров, вода без нуклеаз до конечного объема 100 мкл, при этом положительный контроль включает в себя все компоненты реакции и препарат ДНК Vibrio cholerae ctx+, a в случае отрицательного контроля в реакционную смесь вместо исследуемого препарата ДНК вносят соответствующее количество деионизованной воды, не содержащей исследуемой ДНК.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что амплификацию проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит: 10хбуфер для Bst ДНК-полимеразы -2.5 мкл; MgSO4 100 mM - 2 мкл; смесь dNTP - 25 mM - 1,5 мкл; смесь праймеров к гену ompW - 2,5 мкл; Bst ДНК-полимераза - 2 мкл; флуоресцентный краситель EvaGreen 20Х водный раствор - 1,25 мкл; образец ДНК - 2 мкл; вода, свободная от нуклеаз - до 25 мкл.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2820141C1 true RU2820141C1 (ru) | 2024-05-29 |
Family
ID=
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103160606A (zh) * | 2013-04-08 | 2013-06-19 | 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 霍乱弧菌的lamp检测试剂盒及其检测方法 |
CN105648054A (zh) * | 2016-01-13 | 2016-06-08 | 江苏和创生物科技有限公司 | 霍乱弧菌荧光pcr检测试剂盒 |
DE102015012691A1 (de) * | 2015-09-28 | 2017-03-30 | Biotecon Diagnostics Gmbh | Verfahren zum quantitativen Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae |
RU2766192C1 (ru) * | 2021-05-05 | 2022-02-09 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ выявления токсигенных штаммов 01 vibrio cholerae "постгаитянской" линии методом пцр в режиме реального времени |
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103160606A (zh) * | 2013-04-08 | 2013-06-19 | 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 霍乱弧菌的lamp检测试剂盒及其检测方法 |
DE102015012691A1 (de) * | 2015-09-28 | 2017-03-30 | Biotecon Diagnostics Gmbh | Verfahren zum quantitativen Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae |
CN105648054A (zh) * | 2016-01-13 | 2016-06-08 | 江苏和创生物科技有限公司 | 霍乱弧菌荧光pcr检测试剂盒 |
RU2766192C1 (ru) * | 2021-05-05 | 2022-02-09 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ выявления токсигенных штаммов 01 vibrio cholerae "постгаитянской" линии методом пцр в режиме реального времени |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zhou et al. | Development and evaluation of a real-time fluorogenic loop-mediated isothermal amplification assay integrated on a microfluidic disc chip (on-chip LAMP) for rapid and simultaneous detection of ten pathogenic bacteria in aquatic animals | |
JP6544847B2 (ja) | 食品試料における志賀毒素産生大腸菌(stec)の存否を決定する方法 | |
Lin et al. | Immuno-and nucleic acid-based current technique for Salmonella detection in food | |
US20220098645A1 (en) | Fast and portable microfluidic detection system as an alternative to salmonella's classical culture method | |
Paton et al. | Methods for detection of STEC in humans: an overview | |
CN101113471A (zh) | 运用复合荧光pcr技术检测食源性致病肠杆菌的方法 | |
RU2820141C1 (ru) | Способ идентификации и определения патогенности штаммов Vibrio cholerae методом петлевой изотермической амплификации (LAMP) | |
JP4899009B2 (ja) | LAMP法を用いたクロストリディウム・ディフィシルtoxinB遺伝子検出方法およびこの方法に用いるプライマーセット | |
KR101437385B1 (ko) | 브루셀라 아보투스 균 특이적 동정용 고리매개등온증폭 프라이머 세트 및 이를 이용한 브루셀라 아보투스 균의 검출 방법 | |
CN115747361A (zh) | 检测海豚链球菌的实时荧光mira和mira-lfd引物组及检测方法 | |
JP3525259B2 (ja) | ペクチネータス属菌の検出 | |
CN108060244A (zh) | 一种用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列及应用 | |
KR101752274B1 (ko) | 장출혈성 대장균의 시가독소 유전자형 stx1 및 stx2를 동시에 판별하기 위한 고감도 실시간 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이를 이용한 장출혈성 대장균의 시가독소 유전자형의 판별 방법 | |
Missoum | Methods for Isolation and Identification of Microorganisms | |
JP2018093756A (ja) | 改良された腸内細菌のスクリーニング方法 | |
RU2819101C1 (ru) | Способ выявления гена холодового шока csh1 у штаммов Vibrio cholerae O1 и неО1/неО139 методом петлевой изотермической амплификации (LAMP) | |
US20130102000A1 (en) | Peptide nucleic acid probe, kit and method for detection and/or quantification of salmonella spp. and applications thereof | |
RU2795987C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов и способ выявления ДНК возбудителя бруцеллеза | |
RU2738358C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов и способ выявления ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР с детекцией продукта в режиме реального времени | |
RU2808577C1 (ru) | Способ обнаружения жизнеспособных холерных вибрионов 01 серогруппы биоваров Classical и El Tor в окружающей среде с помощью бактериофага M3 методом количественной ПЦР | |
RU2706570C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров Ft 40 и способ определения бактерий Francisella tularensis (Варианты) | |
Salisu et al. | Molecular Techniques for Rapid Diagnosis of Infectious Livestock Diseases | |
Sutherland et al. | Cultural, serological, and genetic methods for identification of bacteria | |
Yan et al. | Molecular methods to characterize foodborne microbial pathogens | |
Thomson‐Carter | General recovery, characterisation and typing protocols for VTEC |