CN103160606A

CN103160606A - 霍乱弧菌的lamp检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN103160606A
Application number: CN2013101196109A
Authority: CN
Inventors: 曾静; 张蕾; 程晋霞; 张西萌; 魏海燕; 张琳
Original assignee: Inspection and Quarantine Technology Center Beijing Entry-Exit Inspection and Q
Current assignee: Inspection and Quarantine Technology Center Beijing Entry-Exit Inspection and Q
Priority date: 2013-04-08
Filing date: 2013-04-08
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2033-04-08
Also published as: CN103160606B

Abstract

本发明公开了一种霍乱弧菌的LAMP检测试剂盒及其检测方法，具体涉及一组检测霍乱弧菌的引物，其具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示的寡核苷酸序列，及含有这些引物的试剂盒及其检测方法，本发明所述的试剂盒灵敏度高、特异性强、成本低、操作简便。

Description

霍乱弧菌的LAMP检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种霍乱弧菌的LAMP检测试剂盒及其检测方法，属生物技术领域。

背景技术

霍乱是由霍乱弧菌（Vibrio cholera，VC）引起的烈性肠道传病，该病起病急、传播快、涉及范围广，属国际检疫传染病，在我国被列为甲类传染病之一，是主要食源性致病微生物之一，时时威胁着人类并给人类带来危害。人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过污染的水源或饮食经口传染。在一定条件下，霍乱弧菌进入小肠后，依靠鞭毛的运动，穿过粘膜表面的粘液层，通过菌毛作用粘附于肠壁上皮细胞上，在肠粘膜表面迅速繁殖，经过短暂的潜伏期后便急骤发病。该菌不侵入肠上皮细胞和肠腺，也不侵入血液，在局部繁殖和产生霍乱肠毒素，此毒素作用于粘膜上皮细胞与肠腺使肠液过度分泌，从而患者出现上吐下泻，泻出物呈“米泔水样”并含大量弧菌，此为本病典型的特征。目前，该菌是多数进出口水产品必检的致病菌之一。

目前检测食品中致病微生物的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定方法，该方法所需时间长，一般情况下需要5～7天，有时达到10～15天，很难满足快速鉴定的需要；近几年发展起来的PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，增菌液中往往含有PCR抑制剂，从而影响PCR的扩增结果；快速的ELISA方法检测，作为筛选方法具有快速、灵敏的特点，是受到广泛欢迎的筛选方法，但是所使用的试剂盒均来自国外，价格昂贵，而且需要配备其专门的仪器。环介导等温扩增（LAMP）是继PCR技术发展起来的基于检测遗传物质DNA的一种新的扩增技术。该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列；其特点是无需特殊的、昂贵的检测仪器，只需简单的恒温设备或者是加热块，即可完成PCR扩增，可以满足现场检测的需要。

纳米磁珠是运用纳米技术，在传统生物学和现代分子生物技术的基础上，开展生物科学、医学等方面的研究。在分子、细胞和个体水平上为食源性致病菌检测和疾病的诊断等方面提供新材料、新技术和新方法。纳米磁珠在生物样品的分离分析中有着重要应用价值：（1）高效富集：纳米磁珠比表面积大，显著增加反应界面能够高效富集生物样品；（2）非常有效的去除核酸扩增反应中的抑制剂：以现在的检测方法，不同种的致病微生物采用不同的增菌液，增菌液中的添加剂往往对核酸扩增有较强的抑制作用，采用磁珠分离的方法可以非常有效的去除抑制剂；（3）可操作性：纳米磁珠具有超顺磁效应，外加磁场能够快速对其进行移动和分离；（4）标记性质：生物分子标记方法简单、可靠。抗体是一类重要的生物活性材料，广泛应用于检验检疫、疾病诊断、药物筛选、国防、航天、司法鉴定、食品卫生、环境监测及军事侦检等领域，已成为发展新型免疫检测技术和推动检测检疫产业快速发展的重要资源。本发明应用与抗霍乱弧菌单克隆抗体偶联的纳米磁珠，即免疫磁珠（Immunomagnetic Beads，IMB），其具有选择性好，特异性强，能起到富集浓缩细菌的作用，有效避免或减少漏检，且可去除食品样品中抑制核酸扩增的成分。将免疫磁珠分离（Immunomagneticseparation，IMS）与LAMP技术相结合，建立IMS-LAMP检测方法，可以极大地提高检测效率。并由此开发了霍乱弧菌IMS-LAMP检测试剂盒，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测霍乱弧菌的LAMP引物。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种操作简单、结果准确的霍乱弧菌的LAMP检测试剂盒。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种霍乱弧菌的IMS-LAMP检测方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一组检测霍乱弧菌的引物，该组引物是依据NCBI收录号DQ772779（DnaA）对应的基因序列设计的，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.6所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQ ID No.1为外侧上游引物，SEQ ID No.2为外侧下游引物，SEQ ID No.3为内侧上游引物，SEQ ID No.4为内侧下游引物，SEQ IDNo.5为环状上游引物，SEQ ID No.6为环状下游引物。详见表1。

表1引物序列

本发明所提供的引物具有以下优点：（1）高效灵敏。近年来的研究显示引入环状引物将有助于提高检测灵敏度，缩短反应时间。（2）特异性强。

本发明提供了一种霍乱弧菌的LAMP检测试剂盒，其包括以下物质：

（1）偶联有抗霍乱弧菌单克隆抗体的免疫磁珠；

其中，抗霍乱弧菌单克隆抗体可以是现有技术中已经公开的抗霍乱弧菌单克隆抗体，优选地该单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.6754的杂交瘤细胞株分泌产生的霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，具体信息及获得方法在中国发明专利申请201210532294.3中有详细的记载。通过使用偶联有抗霍乱弧菌单克隆抗体的免疫磁珠，可有效富集待检样品中的霍乱弧菌，提高检测的特异性和灵敏度。

（2）LAMP反应液，其包括序列表SEQ ID No.1所示的外侧上游引物（F3），序列表SEQ ID No.2所示的外侧下游引物（B3），序列表SEQ ID No.3所示的内侧上游引物（FIP），序列表SEQ ID No.4所示的内侧下游引物（BIP），序列表SEQ ID No.5所示的环状上游引物（LF），序列表SEQ ID No.6所示的环状下游引物（LB）；所述引物均委托大连宝生物工程有限公司合成；

（3）Bst DNA聚合酶：8U/μL，购自NEB公司；

（4）阴性对照：DEPC水；

（5）阳性对照：由霍乱弧菌CMCC16001提取的核酸作为阳性对照，采用细菌基因组DNA提取试剂盒并按其操作说明提取1mL样品基因组DNA，核酸浓度约为80μg/mL；

（6）显色液：SYBR Green I染料，购自Invitrogen公司。

进一步地，上述LAMP反应液还包括ThermoPol缓冲液、dNTPs、甜菜碱和MgSO₄；其中ThermoPol缓冲液，购自NEB公司，1×ThermoPol缓冲液含0.1%TritonX-100、10mM(NH₄)₂SO₄、10mM KCl、20mM Tris-HCl(pH8.8)；dNTPs：购自天根。

本发明还提供了一种霍乱弧菌的检测方法，该方法包括以下步骤：

（1）免疫磁珠富集菌体：取1.5mL免疫磁珠于离心管中，置于磁分离架吸附1min后，弃上清，免疫磁珠用30μL PBS重悬；取1mL待检样品或菌悬液加入免疫磁珠悬液中，颠倒混匀使磁珠处于悬浮状态；30min后，磁分离架吸附磁珠1min以富集菌体，弃上清，免疫磁珠用PBS洗涤两次，每次30s，最后用50μL DEPC水重悬磁珠，获得富集后的菌体样品；

其中，10×PBS缓冲溶液为：NaCl80g，NaHPO₄×12H₂O29g，KCl2g，KH₂PO₄2g，先溶于900ml去离子水，待充分溶解后再加去离子水至1000ml，室温保存，使用时进行1:10稀释。

（2）提取步骤（1）获得的菌体样品的DNA，即模板DNA，可以利用现有技术中已知的方法或试剂盒提取，例如细菌基因组DNA提取试剂盒或等效试剂盒，或者煮沸方法提取样品基因组DNA；

（3）进行LAMP反应，该LAMP反应体系见下表：

表2 LAMP反应体系

（4）反应条件：65℃恒温反应60min，85℃加热2min使酶失活，反应即结束；

（5）结果判定：

颜色变化：向反应终体系加入1μL显色液即SYBR GreenⅠ荧光染料，阳性反应呈荧光绿色，而阴性反应则保持SYBR GreenⅠ染料的荧光橙色。

电泳检测：LAMP法的扩增产物是各种不同长度的茎—环状结构DNA，因此阳性反应通过1.5%琼脂糖电泳检测呈梯形条带，而阴性反应则没有梯形扩增条带出现。

本发明的优点是：

本发明应用与抗霍乱弧菌单克隆抗体偶联的免疫磁珠，具有选择性好，特异性强，能起到富集浓缩细菌的作用，有效避免或减少漏检，且可去除食品样品中抑制核酸扩增的成分。本发明设计6条引物对靶序列的6个特异序列区的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性。即LAMP能从仅相差1个核苷酸的基因标本中，找出相应的靶序列进行扩增。并且本发明在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的损失，而且受非靶序列的影响小。同时耗时短，在1h内可将靶序列扩增至10⁹倍。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1IMS-LAMP检测特异性图；（其中M：分子量标准，DL2000；1霍乱弧菌核酸扩增结果；2溶藻弧菌核酸扩增结果；3创伤弧菌核酸扩增结果；4河流弧菌核酸扩增结果；5费尼斯弧菌核酸扩增结果；6解蛋白弧菌核酸扩增结果；7单增李斯特氏菌核酸扩增结果；8阴沟肠杆菌核酸扩增结果；9金黄色葡萄球菌核酸扩增结果；10甲型副伤寒沙门氏菌核酸扩增结果；11大肠杆菌核酸扩增结果；12肠炎沙门氏菌核酸扩增结果；13福氏志贺氏菌核酸扩增结果；14鼠伤寒沙门氏菌核酸扩增结果；15阪崎肠杆菌核酸扩增结果；16粪肠球菌核酸扩增结果；NC为阴性对照。）

图2IMS-LAMP检测灵敏度图；（其中M：分子量标准，DL2000；PC：霍乱弧菌阳性对照；-1～-7：霍乱弧菌阳性对照倍比稀释后扩增结果；NC为阴性对照。）

图3IMS-LAMP检测基质添加实验图；（其中M：分子量标准，DL2000；PC：霍乱弧菌阳性对照；2h～12h：相应时间增菌后检测结果；NC为阴性对照。）

具体实施方式

下面结合具体实施例，进—步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。

以下实施例中所用材料、试剂等如无特别说明均可从商业途径得到。

实施例1：偶联有抗霍乱弧菌单克隆抗体的免疫磁珠的制备

抗霍乱弧菌单克隆抗体的获得

本发明可以使用现有技术中已经公开的抗霍乱弧菌单克隆抗体，为了达到更好的检测效果，优选地，本发明使用由保藏编号为CGMCC No.6754的杂交瘤细胞株分泌产生的霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体的具体信息及获得方法在中国发明专利申请201210532294.3中已被详细记载。为了更加充分地公开上述内容，本发明在此提供了具体的获得方法：

1.菌体培养及鞭毛蛋白的提取

霍乱弧菌（Vibrio cholera）（VC-75，实验室分离保存）接种于T1N1培养基（购自北京陆桥技术有限责任公司，货号CM168），36℃活化24h；挑取单菌落接种于含2%NaCl的TSA培养基（购自北京陆桥技术有限责任公司，货号CM417）生长18～24h；用无菌棉签将生长良好的菌落均匀涂布在TSA（2%NaCl）培养基上，36℃培养18±2h。次日用无菌棉签刮下菌体悬浮于预冷的0.15M NaCl溶液中，冰浴15～30min，1000rpm匀浆45sec，立即置于冰上10min。匀浆液4℃条件下10000rpm离心10min；取上清液4℃条件下16000rpm离心2h，弃上清，沉淀重悬于TET（10mM Tris，2mM EDTA，pH8.0，1%TritonX-100)缓冲液中。离心过程重复3次。操作过程保持低温下进行。最后留取沉淀，溶于少量Tris-EDTA（0.1M Tris，0.1mM EDTA，pH7.8）buffer中，4℃保存备用。

2.动物的免疫

（1）BALB/c小鼠的免疫

以鞭毛蛋白为抗原，免疫6～8周龄的BALB/c小鼠5只，设2只不作免疫小鼠做阴性对照。初次免疫抗原加等量福氏完全佐剂充分乳化后，皮下注射免疫小鼠，40μg/小鼠。以后每隔两周用相同剂量抗原与福氏不完全佐剂充分乳化后免疫。第五次免疫3～5天后尾静脉采血，检测抗血清效价。

（2）新西兰纯种兔的免疫

用霍乱弧菌鞭毛蛋白免疫雌性新西兰兔0.5mg/只。每隔两周免疫一次，共免疫5次。五免后3-5天进行心脏大量取血，置37℃1小时，然后放冰箱4℃过夜，隔天取血清纯化得霍乱弧菌鞭毛蛋白多克隆抗体，-20℃冻存备用。

3.抗血清效价

抗血清效价采用间接ELISA方法：用PBS稀释VC抗原浓度至1μg/mL，加入96孔板，100μL/孔，4℃过夜。用PBST洗板3次。2%的牛血清白蛋白溶于PBS溶液中，200μL/孔，37℃封闭1h。用PBST洗板。5只免疫鼠血清用PBS梯度稀释加入对应孔中，100μL/孔，空白对照为PBS溶液，阴性对照为未免疫小鼠血清37℃包被45min后洗板。HRP标记的羊抗鼠以1:2500倍数稀释加入，100μL/孔，37℃包被40min后洗板。每孔加新鲜配制的底物溶液100μL，37℃作用15min后每孔加入2M浓硫酸50μL，用酶联检测仪测定OD450nm值，读数并观察结果。选择效价高且满足P/N值＞2.0的小鼠，一周后加强免疫，3～5天内取小鼠脾细胞进行细胞融合。

4.P2/0骨髓瘤细胞的复苏和培养

提前对冻存的骨髓瘤细胞（SP2/0）进行复苏，将-80℃冷冻冰箱中冻存的骨髓瘤细胞快速取出后，置于38℃水浴中轻微晃动使其迅速融化，注意冻存管口不能碰到水，以免污染，然后将细胞转移到含6～10ml RPMI-1640完全培养基（含10%小牛血清的RPMI-1640培养基，小牛血清购自Hyclone，货号SH30541.03）的细胞培养瓶中，放入37℃，5%CO₂培养箱中培养4～6个小时，待细胞全部贴壁生长时，及时换液，以后每隔2～3天传代一次，并调整细胞使其处于最适生长密度，当细胞达到一定活性，计数，准备进行融合。细胞融合前1～2天对细胞进行1比4传代，用新鲜培养基调整每瓶细胞浓度为1～2×10⁵/ml，一般1～2天即可获得对数生长期的细胞。

5.饲养细胞的制备

(1)将BALB/c小鼠拉颈处死，自来水冲洗后，完全浸泡于75%酒精中10min，移入超净工作台的平皿中，使其腹部朝上。

(2)用镊子提起小鼠胸腹部皮肤，用剪刀剪开一小口，用两把镊子将皮肤撕开一较大的口，然后重新换用新的镊子提起小鼠腹膜，剪开，找到小鼠的胸腺，用镊子，小剪刀小心将胸腺取出，放在一次性平皿中，细心剥去胸腺上附带的脂肪、结缔组织等，加入RPMI-1640培养基（购自Hyclone，货号SH30809.01）5ml，研磨胸腺，过筛，将胸腺细胞悬液加入离心管中，1000rpm离心10min，弃上清，离心洗涤两次。

(3)用5ml HAT培养液轻轻将细胞重悬并混和均匀，计数，补加HAT培养液至细胞浓度为1～2×10⁵/ml。

(4)将细胞悬液滴入96孔细胞培养板内，100μl/孔(两滴)，放入37℃、5%CO₂培养箱中培养。

6.免疫脾细胞悬液的制备

(1)加强免疫3～5天后，选血清效价较高的BALB/c小鼠，摘除眼球，放血，收集并分离血清作为抗体检测的阴性对照。

(2)断颈处死，自来水冲洗后浸泡于75%酒精中10min，取出小鼠放在无菌超净工作台的平皿中，使其腹部朝上。

(3)用镊子提起小鼠胸腹部皮肤，用剪刀剪开一小口，再用两把镊子将皮肤撕开一较大的口，然后重新换用新的镊子提起小鼠腹膜，剪开，找到小鼠的脾脏，小心将脾脏取出，放在一次性平皿中，细心去除脂肪和结缔组织。

(4)用RPMI-1640洗液冲洗后，加入新的RPMI-1640洗液，用注射器针芯研磨，然后过筛，使脾细胞尽可能都通过网孔挤压到溶液中，将脾细胞悬液移入离心管中，1000rpm离心10min，弃上清，离心洗涤两次。

(5)用10ml HAT培养液轻轻将脾细胞重悬，计数，备用。

7SP2/0骨髓瘤细胞悬液的制备

(1)取4瓶100ml培养瓶培养好的骨髓瘤细胞（融合前一天换液，融合时细胞应处于对数生长期），收集于50ml离心管中。

(2)1000rpm离心5～10分钟，弃上清。

(3)沉淀中加入30ml RPMI-1640洗液，轻轻重悬，混匀，同法再离心洗涤一次。

(4)用10ml HAT培养液轻轻将脾细胞重悬并混和均匀，计数，备用。

8细胞融合

(1)轻轻吹下培养好的骨髓瘤细胞，将其转移到50mL离心管中，1000r/min离心7min，弃上清，10mL培养基洗液悬浮，计数。

(2)将含1×10⁸个脾细胞的悬液和含2×10⁷个骨髓瘤细胞的悬液混合于一支50ml的离心管内，补加培养基洗液至30ml，充分混匀。

(3)1000rpm离心7分钟，弃去上清，清洗两次，尽量去上清。

(4)用手轻轻弹离心管底，使细胞团块松散均匀呈糊状。置37℃水浴，预热5～10min，以达到融合温度。

(5)从4℃冰箱中拿出已配好的50%PEG（MW4000）、RPMI-1640洗液，放在37℃水浴中，预温备用。

(6)将离心管放进含有37～40℃水的烧杯中，转动离心管，用1ml吸管吸取50%的PEG1ml,沿管壁逐滴、缓慢加入离心管，时间控制在60秒内，然后再用30秒的时间吸取细胞悬液，静置30秒，再在30秒内将细胞缓缓吹入离心管内。

(7)加入预温好的RPMI-1640洗液，使PEG稀释而失去促融作用，具体方法：前两分钟内加2ml,第三分钟加入3ml，最后在3min内加入20ml。

(8)室温离心融合细胞，800rpm离心7min，弃上清。

(9)加入HAT培养液（50×，购自Sigma，货号H0262），轻轻吹吸、重悬沉淀细胞。

(10)将融合细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔培养板内，100μl/孔(两滴)，然后将培养板置37℃、5%CO₂的培养箱中培养。

9阳性克隆的筛选和克隆化培养

融合后第3天开始，每天观察各孔细胞生长情况，若有污染，立即用叠氮钠处理。融合后第6d、9d用HAT培养液半量换液，HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT（50×，购自Sigma，货号H0137）培养液半量换液，以后根据细胞生长情况，1～2d换一次液，两周后改用完全培养液。待杂交瘤细胞长满孔底面积的1/10时（约10d左右），吸取出现克隆的孔上清用于特异性检测。采用间接ELISA法。交叉反应：用副溶血性弧菌弧菌（VP）、创伤弧菌（VV）及溶藻弧菌（VA）的鞭毛蛋白为抗原，包被96孔板，测定VC抗血清与3种弧菌的交叉反应情况。用酶联检测仪测定OD450，满足P/N值＞2.0为阳性。将VC抗原包被板检测结果呈阳性，其他细菌抗原包被板检测结果呈阴性的杂交瘤细胞用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞长满孔底面积的1/10时再用同样方法检测，强阳性孔再克隆。如此反复3～4次，直到阳性克隆率达到100%。

10腹水制备与抗体鉴定

对最后筛选出的阳性克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，并且已于2012年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No.6754。常规腹水体内诱生方法制备单抗腹水。

偶联有该抗副溶血性弧菌单克隆抗体的免疫磁珠的制备

1.纳米磁珠的制备

本发明所述的免疫磁珠的制备方法包括纳米超顺磁性Fe₃O₄的制备及其特异性抗体的表面修饰，具体在此提供一种优选的制备方法：

2.聚丙烯酸稳定的超顺磁性Fe₃O₄的制备

（1）铁源的制备：准确称取0.8mmol FeCl₃和8mmol的聚丙烯酸（Mw=～1800）到34mL二乙二醇溶剂中，在快速机械搅拌的条件下，氩气气氛中将混合液加热到220℃，保持加热30min.

（2）氢氧化钠溶液的制备：准确称取2.0gNaOH到20mL二乙二醇溶剂中，在氩气气氛下将混合液加热到120℃，保持1h，然后将温度降低到70℃，待用。

（3）取1.75mL氢氧化钠溶液，快速注入到铁源的混合液中，然后将反应温度调节到210℃，在快速的机械搅拌下保持1h，然后降温到室温，对样品进行清洗。

（4）样品清洗：以乙醇为沉淀剂（体积比2:1）对所得样品进行离心清洗（10000r/min），重复清洗三次，最后将样品分散在去离子水中。

3.特异性抗体的修饰

抗体的修饰包括磁性粒子表面的活化，特异性抗体的偶联修饰及非特异性位点的BSA封闭。

（1）磁性粒子的表面活化：取2mg所制备的磁性纳米粒子，在1mL PH=6.0的磷酸缓冲溶液中通过磁分离的方法对粒子进行清洗两次。

（2）准确称取1.38mg Sufo-NHS和3mg EDC到1mL2mg/mL磁性纳米粒子分散液中，在冰浴中震荡条件下保持30min进行表面活化。然后对混合液进行磁分离两次，洗掉过量的Sufo-NHS和EDC活化剂。

（3）将活化后的磁性纳米粒子分散到pH=7.9的磷酸缓冲溶液中，分散液中磁性纳米粒子的浓度为2mg/mL。取100μg特异性抗体到1mL活化的磁性纳米粒子溶液中，室温下在摇床（200r/min）中保持4h，最后通过磁分离进行清洗，去除未偶联到磁性粒子表面的过量的特异性抗体。

（4）将2mg步骤3中清洗后的粒子分散到2mL BSA质量浓度为1%的磷酸缓冲溶液中（pH=7.4），室温下在摇床(200r/min)中保持10h进行非特异性位点的封闭，然后通过磁分离将所得粒子进行分离，最后分散到2mL BSA质量浓度为0.1%的磷酸缓冲溶液中（pH=7.4）保存。

（5）所得免疫磁珠的粒径在90nm左右，饱和磁化强度可以达到64emu/g，超顺磁性能好，磁响应性强，分散稳定性好，生物免疫活性高。

实施例2：霍乱弧菌的LAMP检测试剂盒的组成

（1）偶联有抗霍乱弧菌单克隆抗体的免疫磁珠；例如实施例1中制备的免疫磁珠；

进一步地，所述LAMP反应液还包括ThermoPol缓冲液、dNTPs、甜菜碱和MgSO₄；其中ThermoPol缓冲液，购自NEB公司，1×ThermoPol缓冲液含0.1%TritonX-100、10mM(NH4)₂SO₄、10mM KCl、20mM Tris-HCl(pH8.8)；dNTPs：购自天根；

（3）Bst DNA聚合酶：8U/μL，购自NEB公司；

（4）阴性对照：DEPC水；

（5）阳性对照：由霍乱弧菌CMCC16001提取的核酸作为阳性对照，采用细菌基因组DNA提取试剂盒并按其操作说明提取1mL样品基因组DNA，核酸浓度约为80ug/ml；

（6）显色液：SYBR Green I染料，购自Invitrogen公司。

实施例3：检测霍乱弧菌试剂盒的特异性和灵敏性试验

1.检测特异性分析

对表3中所列菌株分别进行IMS-LAMP检测，结果显示霍乱弧菌标准菌株的扩增产物经SYBR Green Ⅰ染色显荧光绿色，经琼脂糖凝胶电泳检测则出现典型的梯状扩增带；而其余菌株均无特异性扩增（见图1），无任何假阳性和假阴性结果出现，说明该方法检测霍乱弧菌具有良好的特异性。

表3实验用菌株列表

序号	菌株名称	编号
			1	霍乱弧菌	分离株VC-75
2	溶藻弧菌	ATCC1833
			3	创伤弧菌	ATCC1758
4	河流弧菌	ATCC1.1611
			5	费尼斯弧菌	ATCC1.1612
6	解蛋白弧菌	ATCC1.1826
			7	单增李斯特氏菌	ATCC15313
8	阴沟肠杆菌	CGMCC1.57
			9	金黄色葡萄球菌	ATCC25923
10	甲型副伤寒沙门氏菌	CMCC50001
			11	大肠杆菌	ATCC25912
12	肠炎沙门氏菌	CMCC50041
			13	福氏志贺氏菌	CMCC51571
14	鼠伤寒沙门氏菌	CMCC50115

15	阪崎肠杆菌	ATCC29544
			16	粪肠球菌	CGMCC1.2135

2.检测灵敏度分析

对霍乱弧菌分离株VC-75的菌悬液进行10倍梯度稀释，分别取1mL各梯度稀释液进行IMS-LAMP检测。结果发现LAMP可检测到-4稀释度（图2），相应的霍乱弧菌菌体浓度为2×10²CFU/mL，即该检测方法的灵敏度为2×10²CFU/mL。

IMS-LAMP检测方法如上所述。

实施例4：检测霍乱弧菌试剂盒的食品基质添加实验

（1）霍乱弧菌分离株VC-75菌悬液用梯度稀释并平板计数，取浓度为0～10CFU/mL的菌悬液做低浓度添加实验。

（2）取经传统方法（GB4789.7）验证无霍乱弧菌的扇贝25g，加入装有225mL碱性蛋白胨水（APW）的广口瓶中（已灭菌），加入1mL添加浓度为0～10CFU/mL的菌悬液。充分混匀后，置于36℃培养。

（3）分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h取1mL培养液进行IMS-LAMP检测，IMS-LAMP检测方法如上所述。

经计数，用于添加实验的菌悬液浓度为4CFU/mL，表明食品基质添加实验的添加浓度为4CFU/25g样品。增菌8h后取样，可用IMS-LAMP检测方法检出霍乱弧菌（图3）。

结果表明本发明所述的检测霍乱弧菌IMS-LAMP试剂盒在食品样品的检测中，灵敏度可达4CFU/25g样品。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一组检测霍乱弧菌的引物，其特征在于，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQID No.6所示的碱基序列组成；其中SEQ ID No.1为外侧上游引物，SEQ ID No.2为外侧下游引物，SEQ ID No.3为内侧上游引物，SEQ ID No.4为内侧下游引物，SEQ IDNo.5为环状上游引物，SEQ ID No.6为环状下游引物。

2.权利要求1所述的检测霍乱弧菌的引物在制备检测霍乱弧菌试剂盒中的应用。

3.一种霍乱弧菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下物质：

（1）偶联有抗霍乱弧菌单克隆抗体的免疫磁珠；

（2）LAMP反应液，其包括：序列表SEQ ID No.1所示的外侧上游引物，序列表SEQID No.2所示的外侧下游引物，序列表SEQ ID No.3所示的内侧上游引物，序列表SEQ IDNo.4所示的内侧下游引物，序列表SEQ ID No.5所示的环状上游引物，序列表SEQ ID No.6所示的环状下游引物；

（3）Bst DNA聚合酶；

（4）阴性对照；

（5）阳性对照；

（6）显色液：SYBR Green I染料。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述抗霍乱弧菌单克隆抗体为保藏编号为CGMCC No.6754的杂交瘤细胞株分泌产生的霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液还包括ThermoPol缓冲液、dNTPs、甜菜碱和MgSO₄。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液中各种成分的使用终浓度为1×ThermoPol缓冲液、1.4mM dNTPs、0.8M甜菜碱、4.0mM MgSO₄、0.2μM外侧上游引物、0.2μM外侧下游引物、1.6μM内侧上游引物、1.6μM内侧下游引物、0.8μM环状上游引物、0.8μM环状下游引物。

7.一种霍乱弧菌的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1）免疫磁珠富集菌体；

2）提取菌体的DNA；

3）进行LAMP反应；反应条件为65℃恒温反应60min，85℃2min使酶失活，反应结束；

4）通过反应体系颜色变化和/或电泳检测进行结果判定。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中，进行LAMP反应时，使用的引物为序列表SEQ ID No.1所示的外侧上游引物，序列表SEQ ID No.2所示的外侧下游引物，序列表SEQ ID No.3所示的内侧上游引物，序列表SEQ ID No.4所示的内侧下游引物，序列表SEQ ID No.5所示的环状上游引物，序列表SEQ ID No.6所示的环状下游引物。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述免疫磁珠为偶联有抗霍乱弧菌单克隆抗体的免疫磁珠。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述抗霍乱弧菌单克隆抗体为保藏编号为CGMCC No.6754的杂交瘤细胞株分泌产生的霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体。