CN112322761A

CN112322761A - 从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法

Info

Publication number: CN112322761A
Application number: CN202011297237.2A
Authority: CN
Inventors: 易弋; 罗福广; 佀再勇; 黄杰; 龙秀锋; 文衍红
Original assignee: Guangxi University of Science and Technology
Current assignee: Guangxi University of Science and Technology
Priority date: 2020-11-19
Filing date: 2020-11-19
Publication date: 2021-02-05

Abstract

本发明公开了从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法，本发明是一种超高灵敏度的从水体中检测无乳链球菌的方法，该方法的灵敏度可达到1‑10CFU/10ml。通过本发明的方法，可以在无乳链球菌大面积感染鱼体之前，就从水体中检出无乳链球菌是否存在，如果存在，立刻采取池塘消毒，投喂抗生素等措施对疾病进行预防，由于处理手段是在疾病发展的最初期实施，因此防止罗非鱼患病效果非常明显。

Description

从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法

【技术领域】

本发明涉及DNA片段检测技术领域，具体涉及从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法。

【背景技术】

罗非鱼是世界上养殖最广泛的鱼类之一，具有生长快、抗病力与抗逆性强、肉质好、繁殖力强、适应性广以及群体产量高等一系列优点，全球产量仅在2013年就达到450万吨。在我国，罗非鱼现已成为南方各省出口型养殖规模最大的鱼类，产量占全世界的50％，罗非鱼产业对于增加就业机会、提高农民收入都有十分重要的意义。

尽管罗非鱼在差水质中耐受力比其他淡水鱼更好，但随着水产养殖活动的广泛开展，近年来，由于高密度饲养，种群退化，加上养殖水质、环境及气候恶化，各类病害时常大面积爆发，严重影响到罗非鱼产业的健康发展。罗非鱼养殖业受到了各种各样的病原体的影响，最为突出的就是链球菌，链球菌病的病原菌主要是无乳链球菌和海豚链球菌，具有发病率高和死亡率高的特点，会造成巨大经济损失。2009-2011年，国内主要的罗非鱼养殖区爆发了非常严重的罗非鱼流行病，患病罗非鱼在水面离群独游，游姿失衡，眼球突出，被养殖户形象的称为“突眼病”，该病发病率一般达20-30％，死亡率在95％以上。病原分析表明引起罗非鱼“突眼病”的病原为链球菌，主要为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。据统计，近几年因链球菌病导致罗非鱼产业的损失达20亿元，如何防治罗非鱼链球菌病已成为农业和渔业管理部门最为关注的问题。

目前，已经有一些新技术被应用于罗非鱼链球菌的诊断：

分子诊断技术是当代医学发展的重要前沿领域之一，主要包括免疫诊断技术和分子生物学诊断技术，二者都具有操作简便、快速、准确、特异性强、阳性率高的特点。免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应，检测病原微生物，简化了病原微生物的鉴定步骤，备受关注。各大文献数据库提供的数据显示，几乎建立了所有病原体的血清学检测方法，表明该方法已成为一种微生物实验室常用的成熟的检测技术，具有操作简便、快速、准确、特异性强、阳性率高等特点。免疫学方法中常见的几种诊断技术包括凝集技术、荧光抗体技术、酶联免疫技术等。随着分子生物学技术的迅速发展，使人们对微生物的认识从外部表型逐渐转向内部基因结构特征，微生物的检测也从生化、免疫方法转向基因水平检测，对于那些难培养和不可能培养的微生物，可直接通过获得基因信息，给微生物学的检测带来崭新的领域。分子生物学诊断技术中常用的方法有PCR技术、核酸分子杂交、多位点序列分型、环介导等温扩增技术等。同免疫诊断试剂相比较，分子生物学诊断试剂具有生产工艺简单，灵敏度更高的特点，逐渐成为新一代分子诊断试剂开发的主流。

CAMP因子是无乳链球菌特异性产生的一种蛋白质，是无乳链球菌区别于其他细菌的重要特征指标。在传统的无乳链球菌生理生化鉴定中，CAMP试验已成为鉴定无乳链球菌的关键试验。CAMP因子的编码基因是cfb基因，利用分子生物学技术检测样品中是否含有cfb基因即可判断样品是否受到了无乳链球菌的感染。

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温30-60min，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，能不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测。

通过分子检测手段，在养殖过程中定期检测罗非鱼是否受到无乳链球菌的感染，是预防链球菌病的一种有效措施。目前已公开的专利和论文多使用PCR的方法检测无乳链球菌，该方法能够特异性的检测无乳链球菌，但检出灵敏度低，只适用于感染后期鱼体内病原菌含量较多的时候。由于感染已发展至后期，因此在得出检测结果后采取预防措施的效果会大打折扣，更有可能在采取措施之前，疾病就已爆发。

除了以上所述，还有很多技术被应用于罗非鱼链球菌的诊断，如16S测序技术、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验、循环介导等温扩增技术、双重、多重和定量PCR等。但这些技术也存在一定的不足，如16S测序技术很难区分同源性较高的种类；荧光抗体技术和ELISA存在成本昂贵及操作步骤繁杂等；LAMP易发生假阳性；定量PCR需要昂贵的仪器、专业的操作并且成本较高；双重和多重PCR的两对及以上的引物间会产生干扰等。

现有的罗非鱼链球菌防治技术都是要等到鱼体发病后才开始治疗，到发病这个阶段，病原在水体和鱼体中已经大量存在，非常难以根治，一般都需要长期用药才能控制，会造成鱼体抗生素残留以及水体药物残留等问题。因此，需要建立一种从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法。

【发明内容】

针对现有技术中对于罗非鱼无乳链球菌感染的防治都是要等到鱼体大量感染病原才能检测并防治的弊端，本发明提供了从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法，本发明是一种超高灵敏度的从水体中检测无乳链球菌的方法，该方法的灵敏度可达到1-10CFU/10ml。通过本发明的方法，可以在无乳链球菌大面积感染鱼体之前，就从水体中检出无乳链球菌是否存在，如果存在，立刻采取池塘消毒，投喂抗生素等措施对疾病进行预防，由于处理手段是在疾病发展的最初期实施，因此防止罗非鱼患病效果非常明显。

本发明所述的从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法，包括如下步骤：

1)取1000ml池塘水，平均装入4个250ml离心管中，离心；

2)去掉上清液，每管留10ml的液体，与沉淀重悬均匀，将4管重悬液装入50ml离心管中，离心，去掉上清，留1-2ml的液体，与沉淀重悬均匀；

3)提取上步骤重悬液的总DNA，并以所提取总DNA为模板，进行PCR扩增，扩增无乳链球菌cfb基因片段；

所用引物序列为P1：5-TATCTGGAACTCTAGTGGCTG-3，P2：5-TGACGTTAAGTACTTTTTTATC-3；

反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环，扩增片段大小为605bp；

4)将上步骤反应液稀释100倍，以稀释液为模板，进行实时荧光PCR；

所用引物序列为P3：5-GCTGGTGCATTGTTATTTTCAC-3，P4：5-CAATAGAATTCAAATCATAA-3；

反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环，扩增片段大小为271bp，反应过程中实时观察荧光信号，根据荧光信号判断水体中是否存在无乳链球菌；

5)对检测结果为阳性的池塘进行针对性处理，处理步骤如下：

(1)第1天：使用二氧化氯进行消毒；

(2)第2天-第3天：投喂抗菌药物；

(3)第4天：使用二氧化氯进行消毒。

本发明步骤1)和步骤2)所述的离心，是8000rpm离心10min。

步骤2)所述的进行实时荧光PCR，是采用染料法进行实时荧光PCR。

步骤5)所述的使用二氧化氯进行消毒，二氧化氯使用量为1亩水体(按1米水深计)使用有效含量6-8％的二氧化氯泡腾片400g。

步骤5)所述的投喂抗菌药物，投喂标准是每10000斤鱼投喂25g复方磺胺嘧啶(按药物有效含量计)，药物溶于水后拌料投喂，每天投喂一次，连续2天。

和现有技术相比，本发明具有如下优点：

在水产养殖中，由细菌引起的疾病是通过水体传播病原的，在鱼体大量感染病原之前，细菌一定先在水体中进行增殖，增值到一定的浓度才能够大面积传播病原细菌。本发明的方法，是一种超高灵敏度的从水体中检测无乳链球菌的方法，该方法的灵敏度可达到1-10CFU/10ml，可以在无乳链球菌大面积感染鱼体之前，就从水体中检出无乳链球菌是否存在，如果存在，立刻采取池塘消毒，投喂抗生素等措施对疾病进行预防处理，由于处理手段是在疾病发展的最初期实施，因此防止罗非鱼患病的效果非常明显。

【附图说明】

图1是本发明实施例1的PCR反应特异性实验的图，其中图1(a)为P1/P2引物扩增的图，图1(b)为P3/P4引物扩增的图。

图2是本发明实施例1的巢氏PCR灵敏度试验的图。

附图标号：

图1中，M：DNA分子质量标准；1.无乳链球菌；2.阴性对照；3.金黄色葡萄球菌；4.嗜水气单胞菌；5.摩氏摩根菌；6.维氏气单胞菌；7.路德维希肠杆菌；8.志贺邻单胞菌；9.苏云金芽孢杆菌；10.简达气单胞菌。

图2中，M.Marker；1-7模板浓度分别为5.6×10⁷CFU/ml、5.6×10⁶CFU/ml、5.6×10⁵CFU/ml、5.6×10⁴CFU/ml、5.6×10³CFU/ml、5.6×10²CFU/ml、5.6×10¹CFU/ml、5.6CFU/ml。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1：

从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法，包括如下步骤：

1)取1000ml池塘水，平均装入4个250ml离心管中，8000rpm离心10min；

2)去掉上清液，每管留10ml的液体，与沉淀重悬均匀，将4管重悬液装入50ml离心管中，8000rpm离心10min，去掉上清，留1-2ml的液体，与沉淀重悬均匀；

3)提取重悬液的总DNA，并以所提取总DNA为模板，进行PCR扩增，扩增无乳链球菌cfb基因片段；所用引物序列为P1：5-TATCTGGAACTCTAGTGGCTG-3，P2：5-TGACGTTAAGTACTTTTTTATC-3；反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环，扩增片段大小为605bp；

4)将上一步反应液稀释100倍，以稀释液为模板，采用染料法进行实时荧光PCR；所用引物序列为P3:5-GCTGGTGCATTGTTATTTTCAC-3，P4：5-CAATAGAATTCAAATCATAA-3；反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环，扩增片段大小为271bp；反应过程中实时观察荧光信号，根据荧光信号判断水体中是否存在无乳链球菌；

5)对检测结果为阳性的池塘进行针对性处理，处理方案如下：

(1)第1天：使用二氧化氯进行消毒，使用量为：1亩水体(按1米水深计)使用有效含量6％的二氧化氯泡腾片400g；

(2)第2天-第3天：投喂抗菌药物，投喂标准每10000斤鱼投喂25g复方磺胺嘧啶(按药物有效含量计)，药物溶于水后拌料投喂，每天投喂一次，连续2天；

(3)第4天：使用二氧化氯进行消毒，使用量为：1亩水体(按1米水深计)使用有效含量6％的二氧化氯泡腾片400g。

实施例2：

从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法：

和实施例1的区别在于步骤5)中使用二氧化氯进行消毒，使用量为：1亩水体(按1米水深计)使用有效含量7％的二氧化氯泡腾片400g；

其他同实施例1。

实施例3：

从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法：

和实施例1的区别在于步骤5)中使用二氧化氯进行消毒，使用量为：1亩水体(按1米水深计)使用有效含量8％的二氧化氯泡腾片400g；

其他同实施例1。

实验例1：引物特异性试验

分别用无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)、志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、简达气单胞菌(Aeromonas jandaei)菌液作为模版，分别用P1/P2，P3/P4为引物进行PCR扩增，1％琼脂凝胶电泳分析特异性结果。

结果参见图1，PCR反应特异性实验，a为P1/P2引物扩增，b为P3/P4引物扩增

M:DNA分子质量标准；1.无乳链球菌；2.阴性对照；3.金黄色葡萄球菌；4.嗜水气单胞菌；5.摩氏摩根菌；6.维氏气单胞菌；7.路德维希肠杆菌；8.志贺邻单胞菌；9.苏云金芽孢杆菌；10.简达气单胞菌。

实验结果显示：

无乳链球菌条带清晰，大小正确；而其他菌株及阴性对照均未扩增出任何条带。说明该实验能够从对罗非鱼致病的多种细菌中特异性的区分出无乳链球菌，而不会将其他的致病菌混淆。

实验例2：灵敏度试验

采用P1/P2引物进行第一轮PCR以后，将产物稀释100倍作为模板，再用引物P3/P4进行常规的PCR，测试常规巢氏PCR的灵敏度，结果见图2。从图中可以看出，普通的巢氏PCR的检测灵敏度可以达到5.6×10²CFU/ml，菌的含量再低一个数量级就无法检测了。

结果参见图2，巢氏PCR灵敏度试验

M.Marker；1-6.模板浓度分别为5.6×10⁵CFU/ml，5.6×10⁴CFU/ml，5.6×10³CFU/ml，5.6×10²CFU/ml，5.6×10¹CFU/ml，5.6CFU/ml。

利用本发明的从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法，通过离心、巢式PCR和荧光PCR提高灵敏度，重复6次检测，结果见表1：

表1灵敏度实验

从表中可以看出，经过离心和荧光PCR 2个技术手段，能明显提高检测灵敏度。6次重复实验中，灵敏度都达到了56CFU/100ml，个别批次的实验灵敏度达到了5.6CFU//100ml，说明本发明从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法的检测限能稳定在1-10CFU/10ml这个数量级。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。

序列表

<110> 广西科技大学

<120> 从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tatctggaac tctagtggct g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tgacgttaag tactttttta tc 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gctggtgcat tgttattttc ac 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

caatagaatt caaatcataa 20

Claims

1.从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)取1000ml池塘水，平均装入4个250ml离心管中，离心；

(1)第1天：使用二氧化氯进行消毒；

(2)第2天-第3天：投喂抗菌药物；

(3)第4天：使用二氧化氯进行消毒。

2.根据权利要求1所述的从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法，其特征在于：步骤1)和步骤2)所述的离心，是8000rpm离心10min。

3.根据权利要求1所述的从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法，其特征在于：步骤2)所述的进行实时荧光PCR，是采用染料法进行实时荧光PCR。

4.根据权利要求1所述的从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法，其特征在于：步骤5)所述的使用二氧化氯进行消毒，二氧化氯使用量为1亩水体，按1米水深计，使用有效含量6-8％的二氧化氯泡腾片400g。

5.根据权利要求1所述的从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法，其特征在于：步骤5)所述的投喂抗菌药物，投喂标准是每10000斤鱼投喂25g复方磺胺嘧啶，按药物有效含量计，药物溶于水后拌料投喂，每天投喂一次，连续2天。