CN111996273A - 检测幽门螺杆菌耐药基因突变的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测幽门螺杆菌耐药基因突变的方法及试剂盒，具体的本发明基于多重PCR‑飞行时间质谱检测5种常用的幽门螺杆菌抗生素（包括克拉霉素、甲硝唑、喹诺酮类、阿莫西林和四环素）的耐药基因位点变异，并提供了配套引物、探针组合及试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于幽门螺旋杆菌耐药基因突变检测的试剂盒。
背景技术
幽门螺杆菌（H. pylori）是定植于胃上皮细胞的微需氧革兰氏阴性细菌，感染了世界约50％至70％的人口，有些发展中国家感染率甚至高达80%以上，是全球最普遍的病原体之一，可导致胃肠道疾病，包括消化性溃疡、胃边缘区/黏膜相关淋巴样组织（MALT）淋巴瘤和胃癌。幽门螺杆菌已被世界卫生组织和国际癌症研究机构（IARC）定为I类致癌物。据统计，全世界超过6％的癌症和大约90％的非贲门型胃癌病例均归因于幽门螺杆菌感染。根据世界卫生组织 （WHO）资料，2018年因感染引发的癌症占24.2％，其中45%归因为Hp感染。根除幽门螺杆菌将显着降低胃癌和消化性溃疡的发生率，并降低与控制这些发病率相关的成本，尤其在高流行人群中，根除幽门螺杆菌具有明显成本效益。目前，幽门螺杆菌的根除方案主要包括质子泵抑制剂（PPI）、胃粘膜保护剂和一种或两种抗生素，构成三联或四联疗法。用于根除幽门螺杆菌的抗生素包括克拉霉素、甲硝唑、喹诺酮类（左氧氟沙星）、阿莫西林、四环素、利福平等。在1990年代初，根除幽门螺杆菌的比率超过80％。但是近年来，随着全球幽门螺杆菌菌株对最常用抗生素的细菌耐药性不断增加，在过去20年中，许多国家的抗生素耐药性已超过15-20％的门槛，克拉霉素、阿莫西林和甲硝唑的耐药性水平最高分别达50％、30％和95％。多药耐药性的出现显著影响幽门螺杆菌根除标准疗法的疗效，导致幽门螺杆菌的根除率在全球范围内不断下降。为了最好地优化幽门螺杆菌感染的管理，幽门螺杆菌的治疗应基于局部和个体抗菌素耐药性模式，针对具体患者量身定制有效的抗生素治疗策略可能会大大减少治疗失败并降低抗生素耐药性。
在耐药性检测方面，内窥镜引导的幽门螺杆菌培养和表型药敏试验（DST）是检测耐药性的金标准技术。但由于需要进行侵入式内窥镜检查才能从患者那里获得胃活检标本，并且幽门螺杆菌运输和培养均需要严格的条件，难度较大且很费时，至少需要10天才能完成细菌培养和抗生素敏感性测试，既费时又费钱，因此不建议在进行一线治疗之前进行完整的表型DST。随着分子检测技术的不断发展和完善，分子检测在病原微生物感染诊断及治疗监测上的临床应用日益广泛，可以作为培养法药敏试验的一种有效替代方法。目前常用的病原微生物分子检测方法主要包括：基于PCR的电泳法、实时荧光定量PCR（qPCR）、基因芯片技术、测序技术（Sanger测序技术、焦磷酸测序技术、高通量NGS测序技术）等。PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，具有灵敏度高、特异性强、简便快速、对标本的纯度要求低等特点，是目前应用最为广泛的病原学检测技术。目前用于确定幽门螺杆菌抗性的分子检测方法主要包括限制性片段长度多态性PCR（PCR-RFLP）、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization ，FISH）、实时荧光定量PCR和等位基因特异性PCR等，检测样本包括活检标本、胃液、菌落甚至粪便，这些方法在检测23S rRNA和gyrA基因突变以预测克拉霉素和左氧氟沙星耐药性方面显示了良好的灵敏度和特异性。中国专利CN109797203A “幽门螺杆菌检测体系及检测试剂盒和应用”和CN111334592A “一种用于检测幽门螺杆菌耐药基因的核酸组合物及其试剂盒和应用”分别公开了用于幽门螺杆菌的鉴定、分型及抗生素耐药性的荧光定量PCR扩增体系，但是目前荧光定量PCR法由于本身的技术性限制，一个检测反应最多只能实现几个位点的同时检测，检测通量有限，当需要检测更多种基因变异点位时就会受到限制。另一方面，利用常规的荧光定量PCR方法可能无法满足大样本量快速检测的需求。中国专利CN105368825A “幽门螺杆菌抗生素耐药性分析试剂盒及耐药性检测方法” 和CN105506160A “幽门螺杆菌定量和毒力多重基因检测体系及其试剂盒和应用”均公开了一种基于多重PCR-毛细管电泳法在同一个反应体系内对幽门螺杆菌常用抗生素耐药性的分析，但是毛细管电泳法只能根据片段大小进行分型，对多重PCR扩增的均一性和特异性具有很高的要求。NGS高通量测序技术和芯片技术，近年来作为一种高通量高精度的核酸检测技术，由于无需对病原体进行分离培养，打破了传统微生物检验的局限性，在临床微生物学研究领域展现了广阔的应用前景。中国专利CN103060455B “一种幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片及应用”公开了是一种用于幽门螺杆菌感染个体化治疗的检测型基因芯片，可同时对人基因组CYP4502C19*2、CYP4502C19*3多态性和幽门螺杆菌克拉霉素、喹诺酮类耐药位点进行检测。但是由于芯片检测和高通量测序（下一代和第三代测序）的设备和流程复杂昂贵，检测成本高，耗时长，目前主要用于基因型和表型耐药性之间的关联性研究方面，在幽门螺杆菌临床分子检测中很少使用。因此，如何有效利用核酸分子检测的手段，快速、高效、高通量、且准确判断幽门螺杆菌耐药情况是迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用多重PCR-飞行时间质谱检测43个幽门螺旋杆菌耐药位点的方法、配套引物/探针组合及试剂盒、以及这种检测方法在临床耐药方面的应用，以便高效、准确地对幽门螺旋杆菌临床耐药菌株进行鉴定，能够极大的节省时间、和费用，使用极少的样本为临床提供更多更准确的诊断信息。
本发明的第一方面，提供了一种利用多重PCR-飞行时间质谱检测幽门螺旋杆菌耐药位点的试剂盒，所述试剂盒包括第一引物对组，所述第一引物对组包括序列如SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.42所示的引物。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二引物对组，所述第二引物对组包括序列如SEQ ID NO.43至SEQ ID NO.64所示的引物。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三引物对组，所述第三引物对组包括序列如SEQ ID NO.65至SEQ ID NO.76所示的引物。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四引物对组，所述第四引物对组包括序列如SEQ ID NO.77至SEQ ID NO.86所示的引物。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第一探针组，所述第一探针组包括序列如SEQID NO.87至SEQ ID NO.107所示的探针。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二探针组，所述第二探针组包括序列如SEQID NO.108至SEQ ID NO.118所示的探针。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三探针组，所述第三探针组包括序列如SEQID NO.119至SEQ ID NO.124所示的探针。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四探针组，所述第四探针组包括序列如SEQID NO.125至SEQ ID NO.129所示的探针。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内含有所述第一引物对组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内含有所述第二引物对组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第三容器，所述第三容器内含有所述第三引物对组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第四容器，所述第四容器内含有所述第四引物对组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第五容器，所述第五容器内含有所述第一探针组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第六容器，所述第六容器内含有所述第二探针组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第七容器，所述第七容器内含有所述第三探针组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第八容器，所述第八容器内含有所述第四探针组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第九容器，所述第九容器内含有PCR预混液，所述PCR预混液主要包括热启动Taq酶、dNTPs、Mg2+。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第十容器，所述第十容器内含有虾碱性磷酸酶（SAP）。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第十一容器，所述第十一容器内含有延伸酶。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第十二容器，所述第十二容器内含acyNTPs。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第十三容器，所述第十三容器内含延伸反应缓冲液。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括纯水。
本发明的第二方面，提供了一种利用多重PCR-飞行时间质谱检测幽门螺旋杆菌耐药位点的方法，所述方法包括步骤：
（1）提供待测样本，对所述待测样本中的核酸进行PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物；
（2）使用虾碱性磷酸酶（SAP）处理步骤（1）获得的扩增产物；
（3）使用延伸探针对步骤（2）处理过的扩增产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；
（4）纯化所述延伸产物；
（5）采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MASS）系统对纯化后延伸产物进行分子量检测，根据分子量标记确定待测样本是否发生某位点耐药突变；
其中，所述步骤（1）中，分别使用第一引物对组、第二引物对组、第三引物对组、和第四引物对组进行PCR扩增；
优选地，所述第一引物对组包括序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.42所示的引物；
所述第二引物对组包括序列如SEQ ID NO.43至SEQ ID NO.64所示的引物；
所述第三引物对组包括序列如SEQ ID NO.65至SEQ ID NO.76所示的引物；
所述第四引物对组包括序列如SEQ ID NO.77至SEQ ID NO.86所示的引物。
在另一优选例中，所述步骤（3）中，分别使用第一探针组、第二探针组、第三探针组、和第四探针组进行单碱基延伸反应；
优选地，所述第一探针组包括序列如SEQ ID NO.87至SEQ ID NO.107所示的探针；
所述第二探针组包括序列如SEQ ID NO.108至SEQ ID NO.118所示的探针；
所述第三探针组包括序列如SEQ ID NO.119至SEQ ID NO.124所示的探针；
所述第四探针组包括序列如SEQ ID NO.125至SEQ ID NO.129所示的探针。
在另一优选例中，所述方法为非诊断目的。例如，可以对环境样本进行检测，以鉴别环境样本中的耐药幽门螺旋杆菌。
本发明的第三方面，提供了引物对组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测幽门螺旋杆菌耐药位点；
所述引物对组为第一引物对组、第二引物对组、第三引物对组、和第四引物对组中的一组或多组引物对组；其中，
所述第一引物对组包括序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.42所示的引物；
所述第二引物对组包括序列如SEQ ID NO.43至SEQ ID NO.64所示的引物；
所述第三引物对组包括序列如SEQ ID NO.65至SEQ ID NO.76所示的引物；
所述第四引物对组包括序列如SEQ ID NO.77至SEQ ID NO.86所示的引物。
本发明的第四方面，提供了探针组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测幽门螺旋杆菌耐药位点；
所述探针组为第一探针组、第二探针组、第三探针组、和第四探针组中的一组或多组探针组；
所述第一探针组包括序列如SEQ ID NO.87至SEQ ID NO.107所示的探针；
所述第二探针组包括序列如SEQ ID NO.108至SEQ ID NO.118所示的探针；
所述第三探针组包括序列如SEQ ID NO.119至SEQ ID NO.124所示的探针；
所述第四探针组包括序列如SEQ ID NO.125至SEQ ID NO.129所示的探针。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1-1为克拉霉素耐药典型23S_A2143G-C突变的核酸质谱峰图；
图1-2为克拉霉素耐药典型23S_A2143G-C突变的最低检测限1000拷贝/mL的核酸质谱峰图；
图1-3为23S_A2143G-C检测阴性对照的核酸质谱峰图；
图2-1为喹诺酮类耐药典型GyrA_T-C261A-G突变的核酸质谱峰图；
图2-2为喹诺酮类耐药典型GyrA_T-C261A-G突变的最低检测限1000拷贝/mL的核酸质谱峰图；
图2-3为GyrA_T-C261A-G检测阴性对照的核酸质谱峰图；
图3-1为阿莫西林耐药典型PBP1A_A1777G突变的核酸质谱峰图；
图3-2为阿莫西林耐药典型PBP1A_A1777G突变的最低检测限1000拷贝/mL的核酸质谱峰图；
图3-3为PBP1A_A1777G检测阴性对照的核酸质谱峰图；
图4-1为甲硝唑耐药典型Rdx_G616A突变的核酸质谱峰图；
图4-2为甲硝唑耐药典型Rdx_G616A突变的最低检测限1000拷贝/mL的核酸质谱峰图；
图4-3为Rdx_G616A检测阴性对照的核酸质谱峰图；
图5-1为四环素耐药典型16S_A928C突变的核酸质谱峰图；
图5-2为四环素耐药典型16S_A928C突变的最低检测限1000拷贝/mL的核酸质谱峰图；
图5-3为16S_A928C检测阴性对照的核酸质谱峰图；
图6为对照引物对1和对照延伸探针1组合的核酸质谱峰图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于多重PCR-飞行时间质谱检测5种常用的幽门螺杆菌抗生素（包括克拉霉素、甲硝唑、喹诺酮类、阿莫西林和四环素）的耐药基因位点变异的方法，并提供配套引物、探针组合及试剂盒。基于MassARRAY 基质辅助激光解吸电离时间飞行质谱（MALDI-TOF）系统（Sequenom, Inc.,San Diego, CA, USA），能够实现在同一个反应体系内对43个常见HP耐药位点同时检测分析，包括五种耐药种类：四环素耐药（16S的3个位点）、克拉霉素耐药（23S rRNA的13个位点、InfB的1个位点）、喹诺酮类耐药（GyrA的9个位点、GyrB的2个位点）、阿莫西林耐药（PBP1A的7个位点、PBP2的2个位点和PBP3的2个位点）、甲硝唑耐药（RdxA的4个位点）。本发明提供的检测方法具有高精度、高敏感性、高通量、低成本、快速检测的优势。
多重PCR
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
影响多重PCR反应的因素有很多，比如：
（1）反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
（2）引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
（3）最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行 PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
（4）引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
本申请的测定方法基于多重PCR技术和飞行时间质谱对幽门螺旋杆菌（HP）核酸耐药位点进行检测，能够对HP常见5种耐药的共计43个位点同时检测，可准确的得出没有或有1个或几个耐药位点。
多重PCR-飞行时间质谱检测技术虽然能够进行超高通量的检测，但是其对PCR扩增产物的质量要求较高。本发明人在研究中发现，现有的能够进行多重荧光PCR法检测的引物和探针（如CN201710471030.4公开的部分引物探针），直接应用于多重PCR-飞行时间质谱检测中，存在很多缺陷，比如无法进行单碱基延伸反应导致质谱检测的假阴性，灵敏度较低且重复性差难以满足临床应用。因此，本发明人针对每个检测位点，重新设计了多对引物和延伸探针，在单位点检测能够满足要求的情况下，进行多重组合检测验证，经过大量试验筛选，最终获得了灵敏度高、特异性好，且检测结果稳定的适用于飞行时间质谱检测的多重PCR检测体系和延伸探针。
本发明采用多重PCR法对靶序列进行扩增，人工设计多对引物，再对其进行优化选择并验证，最终确定包含如下引物的检测HP常见5种耐药的共计43个位点的核酸检测试剂盒。各详细引物序列见表1所示：
表1引物序列
表1(续1)
表1(续2)
其中，F为正向引物，R为反向引物。
上述PCR引物分为4个多重组合，分别为：
W1多重引物组合：SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.42；
W2多重引物组合：SEQ ID NO.43至SEQ ID NO.64；
W3多重引物组合：SEQ ID NO.65至SEQ ID NO.76；
W4多重引物组合：SEQ ID NO.77至SEQ ID NO.86。
扩增反应时，每个反应管内含有一个多重引物组合。
探针序列组合，如表2所示：
表2
表2（续1）
表2（续2）
延伸引物（延伸探针）相对应也分为4个组合：
w1：SEQ ID NO.87至SEQ ID NO.107；
w2：SEQ ID NO.108至SEQ ID NO.118；
w3：SEQ ID NO.119至SEQ ID NO.124；
w4：SEQ ID NO.125至SEQ ID NO.129。
发明人针对43个常见幽门螺旋杆菌耐药位点，设计43个特异性位点引物，选择特异性保守序列，设计PCR引物，在引物的5’端带有10个碱基（ACGTTGGATG）序列，使总长度达到29个碱基或以上，从分子量上将引物与探针区别开。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针长度15-27个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过28个碱基。
表1和表2列出的合成多核苷酸，均采用常规的多核苷酸合成方法合成。纯化方式为ePAGE。
除上面提到的引物和探针外，本发明还提供了幽门螺旋杆菌耐药位点核酸检测试剂盒，所述检测试剂盒中各组分的具体含量如下：
表3
本发明还提供了基于多重PCR飞行时间质谱的幽门螺旋杆菌耐药位点核酸检测及鉴定的检测方法，包括以下步骤：
1、PCR反应：通过第一轮PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。
2、虾碱性磷酸酶（SAP）处理：使未结合的剩余核酸脱磷酸（dNTPs）失活，预防干扰下一步碱基延伸反应。
3、碱基延伸反应：在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与所述延伸探针及其它延伸产物之间的分子量差异不小于16Da。
4、树脂脱盐：纯化延伸反应产物，吸附体系中的Na、K离子。
5、质谱检测：将纯化后产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MASS）系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测样本是否发生某位点耐药突变，则可判型类别，软件自动处理报告判型结果。
优选的，在每次反应中加入阴性对照，所述阴性对照为正常人的血液DNA。
与现有检测幽门螺旋杆菌耐药的其它技术或同类技术相比，本发明技术方案充分发挥了PCR-质谱联用同时检测多个位点的优势，同时，不需要荧光标记、不需要洗涤、反应在微量体系中进行、样本上样量很少（浓度大于1ng/μL均可检出）等优势，使得试剂耗材成本与检测PCR重数成反比，从而实现以多条探针，在一个反应中可以同时最多检测21个耐药位点。首轮PCR扩增区域为50-130 bp的基因型特异性片段，第二轮PCR采用特异性探针末端单点法扩增，可以允许使用更多循环，最大限度地提高了检测灵敏度和特异性，使检测灵敏度达到1aM级单个拷贝水平，避免了检测漏诊造成地假阴性问题。同时，该特异性片段扩增设计技术会彻底排除PCR产物污染和同源序列探针错配引起地假阳性问题，为多重检测呼吸道病原体提供了可靠的实验方法。
本发明的主要优点在于：
目前，多数的检测手段主要是通过荧光定量PCR检测，而无法实现同时检测多个耐药位点，或者用测序手段，但其成本较高，本发明主要优点包括：
（1）本发明通过大量的筛选和深入的研究，最终获得了适用于飞行时间质谱检测的多重引物探针组合，使得多重PCR-飞行时间质谱检测幽门螺旋杆菌耐药位点成为可能，极大地提高了检测效率，显著地降低了检测成本。
（2）可以同时检测和识别43个常见的HP耐药位点，包括五种耐药种类：四环素耐药（16S的3个位点）、克拉霉素耐药（23S rRNA的13个位点、InfB的1个位点）、喹诺酮类耐药（GyrA的9个位点、GyrB的2个位点）、阿莫西林耐药（PBP1A的7个位点、PBP2的2个位点和PBP3的2个位点）、甲硝唑耐药（RdxA的4个位点）。
（3）本发明的方法灵敏度较高，检测浓度可低至1000拷贝/mL。
（4）本发明的方法具有极高的检测效率，可在同一批次内进行数百通量的检测，因而极大地提高了检测效率。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook. J等著《分子克隆实验室指南》（黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1
本实施例提供的高灵敏度检测/或鉴定幽门螺旋杆菌耐药位点的方法，待检测样本有：部分阳性质粒，测序已知耐药阳性样本和阴性样本对照。包括如下步骤：
（1）针对43个常见幽门螺旋杆菌耐药位点，设计43个特异性位点引物，选择特异性保守序列，设计PCR引物，用一对PCR引物，在引物的5’端带有10个碱基（ACGTTGGATG）序列，使总长度达到29个碱基或以上，从分子量上将引物与探针区别开。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针长度15-27个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过28个碱基。43个位点的探针见表2。
（2）通过PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。
样本选取：选择二代测序结果分别为克拉霉素耐药、喹诺酮类耐药、阿莫西林耐药、甲硝唑耐药和四环素耐药的阳性样本；合成了部分位点突变的阳性质粒，把质粒稀释成1000拷贝/mL。
PCR反应体系配制见表4.
表4
| 试剂 | 最终浓度 | 体积1× (μL) |
| 1mM PCR Primer Mix | 0.2mM | 1.00 |
| 2.5×PCR Mix | 1Unit | 2.00 |
| DNA Template（0.5-2ng/μL） | 1.00 | |
| RNase-Free Water | N/A | 1.00 |
| Total | 5.00 |
先95℃ 10分钟对Mix中PCR酶进行热启动，随后做PCR循环扩增。反应条件为95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共45个循环；最终72℃延伸5分钟，完成后恒温于4℃。
（3）通过虾碱性磷酸酶（SAP）处理，使得未结合的剩余核酸（dNTPs）脱磷酸失活，预防干扰下一步碱基延伸反应。SAP消化酶反应体系见表5。
表5
| 试剂 | 体积1× (μL) |
| ddH<sub>2</sub>O | 1.75 |
| SAP Enzyme | 0.25 |
| Total | 2.00 |
反应条件为37℃孵育10分钟，去除剩余dNTPs；然后用85℃ 5分钟使SAP酶失活，完成后恒温于4℃。
（4）通过碱基延伸反应，在单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与所述延伸探针及各型别延伸产物之间的分子量差异不小于16Da，延伸反应体系见表6。
表6
| 试剂 | 体积1× (μL) |
| acyNTP | 1.20 |
| EXT Primer Mix* | 0.94 |
| EXT Enzyme | 0.36 |
| 10× EXT Buffer | 0.50 |
| Total | 3.00 |
*延伸反应探针Mix的浓度，按照各型分子量大小进行线性关系调节。
循环反应为200个短阶梯程序，包含两个循环嵌合，开始为95℃变性30秒，随后在95℃变性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共40个循环中，每个插入脱火和延伸5个小循环；最终72℃延伸3分钟，完成后恒温于4℃。
（5）采用树脂脱盐纯化延伸反应产物。
（6）将纯化后产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测样本是否发生某位点突变。
（7）质谱图中，横坐标为分子量，纵坐标为峰强度。图中纵行虚线同色为该基因型延伸探针的分子量位置，如果不存在该型别探针峰不变；如果被检测样本拷贝数大于1000，探针可被完全消耗，左侧峰消失转至右侧；右侧的同色虚线表示延伸产物分子量位置。用Type4.1软件阅读谱图，自动分析和报告结果，导出数据。数据解释为，每一个位点或内参基因的延伸探针在质谱图不同的质量处有相应的分子量峰，在探针发现目标基因工作时出现单碱基延伸产物，探针分子量峰发生转移为产物分子峰，分析结果报告为阳性。阳性结果分为四种判读情况：A、结果可靠；B、中度可靠；C、一般可靠；D、低度可靠。前三种视为延伸反应有效，可确诊为该位点发生突变，对应某种耐药，第四种需要人工辅助判断，观察探针是否消耗，判断为可疑感染或阴性结果。对可疑感染样本，在必要时可作重复性验证试验。
（8）本试验对测序或荧光定量结果显示分别为克拉霉素耐药、喹诺酮类耐药、阿莫西林耐药、甲硝唑耐药和四环素耐药的阳性样本进行质谱检测，结果发现检测结果与测序或荧光定量结果一致，都可以检测出相应的耐药位点（如图1-1、2-1、3-1、4-1、5-1所示）；对阳性质粒检测结果如图1-2、2-2、3-2、4-2、5-2所示；以及检测时的阴性对照结果如图1-3、2-3、3-3、4-3、5-3所示。
结论：本发明能够同时检测幽门螺旋杆菌五种耐药的一个或多个突变位点，共计43个检测位点。且检测灵敏度低至1000拷贝/mL。
实施例2 特异性测定
以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、白色念珠菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、甲型副伤寒沙门氏菌和人基因组DNA核酸为模板，经本发明多重PCR-飞行时间质谱检测试剂盒检测，结果未出现假阳性结果，表明本发明试剂盒具有良好特异性。
实施例3 临床样本检测
利用本发明所建立的高灵敏度检测/或鉴定幽门螺旋杆菌耐药位点的方法，对100例幽门螺旋杆菌阳性患者核酸样本进行检测，采用市售单重荧光定量PCR检测试剂盒进行验证。
结果显示：
100例阳性样本中，单重荧光定量PCR和本发明的多重PCR-飞行时间质谱检测方法均检出100例阳性，阳性检出率为100%。其中，鉴别出四环素耐药7例，克拉霉素耐药3例，喹诺酮类耐药2例，阿莫西林耐药18例，甲硝唑耐药15例，其余样本为敏感菌株感染。
对比例1 引物对和延伸探针的筛选
本发明人通过大量的实验，人工设计大量的引物和延伸探针，再对其进行优化选择并验证，最终确定了可以用于飞行时间质谱检测的多重PCR扩增引物和延伸探针序列及其组合。
本对比例以23S_A2143G-C位点为例，展示了部分效果不理想的引物和延伸探针。
23S_A2143G-C位点引物和延伸探针序列：
对照引物对1：
F-1：ACGTTGGATGGTGAAATTGTAGTGGAGGTG (SEQ ID NO.:130）
R-1：ACGTTGGATGTTCCCATTAGCAGTGCTAAG (SEQ ID NO.:131)
对照引物对2：
F-2：ACGTTGGATGGCTGTCTCAACCAGAGATTC (SEQ ID NO.:132)
R-2：ACGTTGGATGCGCATGATATTCCCATTAGC (SEQ ID NO.:133)
对照延伸探针1：
P-1：TCCTACCCGCGGCAAGACGG (SEQ ID NO.:134)
本发明引物对：SEQ ID NO.55和56
本发明延伸探针：SEQ ID NO.114
具体方法同实施例1，先用单重PCR扩增然后使用不同延伸探针进行单碱基延伸，再对延伸产物进行质谱检测，单重检测结果发现对照引物对1和对照延伸探针1组合检测能够正常工作，然而在多重体系中则无法通过质谱检测获得阳性结果（如图6所示）。
对照引物对2和本发明延伸探针（SEQ ID NO.114）的组合，检测灵敏度能够达到1×105拷贝/mL；而对照引物对2和对照延伸探针1的组合，检测灵敏度仅有1×106拷贝/mL。
本发明引物对（SEQ ID NO.55和56）和本发明延伸探针（SEQ ID NO.114）的组合，检测灵敏度能够达到1×103拷贝/mL。结果表明，对照引物对1在检测系统中，无法有效扩增靶核酸序列，因此不能够在检测体系中工作；对照引物对2可以在多重检测体系中工作，但是灵敏度较差；对照延伸探针1虽然也可以在延伸过程中工作，但是同样灵敏度较差。而本发明引物对（SEQ ID NO.55和56）和本发明延伸探针（SEQ ID NO.114）的组合能够在多重检测体系中正常工作，且灵敏度较高，达到1×103拷贝/mL。
对比例2 多重检测体系的构建
由于多重反应体系引物之间的竞争抑制、引物特异性差异、退火温度不一致、以及引物二聚体等原因，很难获得有效的多重PCR扩增引物以及单碱基延伸探针组合。
因而，需要将针对各突变位点筛选出的候选引物对和延伸探针进行多重组合，优化多重检测体系。本对比例列举了部分效果不理想的多重检测体系。
对照多重检测体系1：
表7
| 序号 | 位点 |
| 1 | GyrA_A259T |
| 2 | 23S_A2144G |
| 3 | PBP1A_C1622T |
| 4 | PBP2_A1715G |
| 5 | GyrA_A260T |
| 6 | 16S_A928C |
| 7 | PBP1A_C-T1242A-G |
| 8 | GyrB_G1451A |
| 9 | 23S_A2143G-C |
| 10 | 16S_A926G |
| 11 | InfB_G160A |
| 12 | PBP1A_A1451G |
对照多重检测体系2：
表8
| 序号 | 位点 |
| 1 | GyrA_261 |
| 2 | GyrA_271 |
| 3 | 16S_A965G |
| 4 | 23S_T2182C |
| 5 | 23S_A2174G |
具体方法同实施例1，对照多重检测体系1为W2多重引物组合的优化之前体系，其中PBP2_A1715G和PBP1A_C-T1242A-G两个位点出现竞争抑制现象，从而导致检测不出的情况；对照多重检测体系2为W3多重引物组合优化前体系，其中16S_A965G和23S_T2182C两个位点由于新组合形成后，导致个别位点的延伸产物的分子量或其延伸探针及各型别延伸产物之间的分子量差异大于16Da，无法作为多重检测体系进行工作。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 北京健为医学检验实验室有限公司
<120> 检测幽门螺杆菌耐药基因突变的方法及试剂盒
<130> 3500001
<160> 134
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
acgttggatg gaaaacaccc ctaaaagagc g 31
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
acgttggatg atcaataagc ctaaaatcgc atg 33
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
acgttggatg tgttagctaa ctggcctgtg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
acgttggatg tactttttag gaggcgaccg 30
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<211> 30
<212> DNA
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acgttggatg gggcaacttt ggctctattg 30
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<211> 30
<212> DNA
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<211> 30
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<211> 30
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<211> 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<211> 29
<212> DNA
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<211> 30
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acgttggatg ggagcatgtg gtttaattcg 30
<210> 84
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 84
acgttggatg cactccacta tttctagcgg 30
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 85
acgttggatg taaccctttc agtgctgatg 30
<210> 86
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg gtaaagccaa tgaaccaagc 30
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aagcattgtc ctgcc 15
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<211> 15
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agtgtaacgc atcgc 15
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cgtgagacag ttcggt 16
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ccattctcac tagcgca 17
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<212> DNA
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caagctctta caacacg 17
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tgcgctagtg agaatgg 17
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ccctttggga cctgctcca 19
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agaccccctt gtggaatgat aa 22
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<211> 22
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ggacgggtgg tatctcaagg at 22
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<211> 22
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gagatgggag gctttgaagt aa 22
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<212> DNA
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tagtattgaa gcgcttgctt gaa 23
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agcgtcaatt caacgcttca tctt 24
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tgatcaagaa aatcaaaagt tgat 24
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aatcgcatga aagaaaagga tatg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 105
tcgtttaata attgtcttct ttttt 25
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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attgtatgat agcgcaatct ttctat 26
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<211> 21
<212> DNA
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<400> 107
ctcctacccg cggcaagacg g 21
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cacccccatg gcgat 15
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aaggtccacg gggtc 15
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tgctgatgaa tgcggtagaa aatggca 27
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tgattttatg atagcgcaat 20
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<211> 21
<212> DNA
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tcatacccgc ggcaagacgg a 21
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<212> DNA
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ggagcatgtg gtttaattcg a 21
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caggcaagct atacaaatac att 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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tgccgtaatt agaaaataaa gaa 23
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cccccatggc gataa 15
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ggctcgcacg gcaagg 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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cgcatgaaat acgaatacac a 21
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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aaacttgcga gaataatt 18
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<212> DNA
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tcccacctat cctgc 15
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<212> DNA
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cgggacttct aacaac 16
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acgttggatg gtgaaattgt agtggaggtg 30
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<211> 30
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acgttggatg ttcccattag cagtgctaag 30
<210> 132
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg gctgtctcaa ccagagattc 30
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg cgcatgatat tcccattagc 30
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 134
tcctacccgc ggcaagacgg 20
Claims (10)
1.一种利用多重PCR-飞行时间质谱检测幽门螺旋杆菌耐药位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一引物对组，所述第一引物对组包括序列如SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.42所示的引物。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二引物对组，所述第二引物对组包括序列如SEQ ID NO.43至SEQ ID NO.64所示的引物；和/或
所述试剂盒还包括第三引物对组，所述第三引物对组包括序列如SEQ ID NO.65至SEQID NO.76所示的引物；和/或
所述试剂盒还包括第四引物对组，所述第四引物对组包括序列如SEQ ID NO.77至SEQID NO.86所示的引物。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第一探针组，所述第一探针组包括序列如SEQ ID NO.87至SEQ ID NO.107所示的探针。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二探针组，所述第二探针组包括序列如SEQ ID NO.108至SEQ ID NO.118所示的探针；和/或
所述试剂盒还包括第三探针组，所述第三探针组包括序列如SEQ ID NO.119至SEQ IDNO.124所示的探针；和/或
所述试剂盒还包括第四探针组，所述第四探针组包括序列如SEQ ID NO.125至SEQ IDNO.129所示的探针。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第一容器，所述第一容器内含有所述第一引物对组；
所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内含有所述第二引物对组；
所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内含有所述第三引物对组；和/或
所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内含有所述第四引物对组。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第五容器，所述第五容器内含有所述第一探针组；
所述试剂盒还包括第六容器，所述第六容器内含有所述第二探针组；
所述试剂盒还包括第七容器，所述第七容器内含有所述第三探针组；
所述试剂盒还包括第八容器，所述第八容器内含有所述第四探针组。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括虾碱性磷酸酶（SAP）。
8.一种利用多重PCR-飞行时间质谱检测幽门螺旋杆菌耐药位点的方法，所述方法为非诊断目的，其特征在于，所述方法包括步骤：
（1）提供待测样本，对所述待测样本中的核酸进行PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物；
（2）使用虾碱性磷酸酶（SAP）处理步骤（1）获得的扩增产物；
（3）使用延伸探针对步骤（2）处理过的扩增产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；
（4）纯化所述延伸产物；
（5）采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MASS）系统对纯化后延伸产物进行分子量检测，根据分子量标记确定待测样本是否发生某位点耐药突变；
其中，所述步骤（1）中，分别使用第一引物对组、第二引物对组、第三引物对组、和第四引物对组进行PCR扩增；
所述第一引物对组包括序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.42所示的引物；
所述第二引物对组包括序列如SEQ ID NO.43至SEQ ID NO.64所示的引物；
所述第三引物对组包括序列如SEQ ID NO.65至SEQ ID NO.76所示的引物；
所述第四引物对组包括序列如SEQ ID NO.77至SEQ ID NO.86所示的引物。
9.引物对组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测幽门螺旋杆菌耐药位点；
所述引物对组为第一引物对组、第二引物对组、第三引物对组、和第四引物对组中的一组或多组引物对组；其中，
所述第一引物对组包括序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.42所示的引物；
所述第二引物对组包括序列如SEQ ID NO.43至SEQ ID NO.64所示的引物；
所述第三引物对组包括序列如SEQ ID NO.65至SEQ ID NO.76所示的引物；
所述第四引物对组包括序列如SEQ ID NO.77至SEQ ID NO.86所示的引物。
10.探针组的用途，用于制备多重PCR-飞行时间质谱检测幽门螺旋杆菌耐药位点的试剂盒；
所述探针组为第一探针组、第二探针组、第三探针组、和第四探针组中的一组或多组探针组；
所述第一探针组包括序列如SEQ ID NO.87至SEQ ID NO.107所示的探针；
所述第二探针组包括序列如SEQ ID NO.108至SEQ ID NO.118所示的探针；
所述第三探针组包括序列如SEQ ID NO.119至SEQ ID NO.124所示的探针；
所述第四探针组包括序列如SEQ ID NO.125至SEQ ID NO.129所示的探针。
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