CN117159725A - 通过dna水凝胶促进小分子药物结晶达到缓释效果的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种ATR抑制剂的药物组合物。具体地，本发明提供了一种ATR抑制剂的缓释药物组合物，包括治疗有效量的ATR抑制剂和水凝胶，其中所述的ATR抑制剂以结晶态分散于所述的水凝胶中。

Description

通过DNA水凝胶促进小分子药物结晶达到缓释效果的方法

技术领域

本发明属于药物化学领域。具体地，本发明设计一种通过促进药物结晶以达到缓释效果的方法。

背景技术

在过去的二十年中，包括血管生成抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)在内的数种分子靶向药物获得了美国食品和药物管理局的批准，这些药物极大地改变了癌症患者(例如，肝细胞癌，HCC，hepatocellular carcinoma)的全身辅助治疗模式。然而，这些抗肿瘤药物全身给药的副作用，如肝毒性和骨髓抑制，可能导致治疗中断，阻碍HCC患者的长期生存。此外，由于协同机制，联合疗法越来越受到关注，以避免临床环境中的耐药性。然而，增强的毒性，包括更高的发生率和更广谱的TRAE，仍然是这些创新疗法的主要缺点。根据meta分析，接受多种组合的患者中3级或4级TRAE的发生率高达58.8％。因此，迫切需要减少分子靶向药物在临床环境中更广泛应用的安全问题。

因此，急需开发一种毒副作用小、给药方便、缓释效果好的给药方法。

发明内容

本发明提供了一种DNA引发剂诱导的溶胶-凝胶转变方法来构建全DNA水凝胶，通过调节触发链的浓度来精确控制其孔径大小。DNA水凝胶的区室化作用有助于负载药物的微结晶，从而导致抗肿瘤药物的可控持续释放。

在本发明的第一方面，提供了一种包含ATR抑制剂的药物组合物，其特征在于，包括：

(1)治疗有效量的ATR抑制剂；

(2)用于负载所述的ATR抑制剂的水凝胶；

其中，所述的ATR抑制剂以结晶态分散于所述的水凝胶中。

在部分实施方式中，所述的ATR抑制剂为Elimusertib或其药学上可接受的盐，所述的Elimusertib具有如式(I)所示的结构：

在部分实施方式中，在所述的药物组合物中，所述的ATR抑制剂的浓度为1-100mM，优选地为5-80mM，更优选地为10-50mM。

在部分实施方式中，所述的水凝胶为DNA水凝胶。

在部分实施方式中，所述的DNA水凝胶用如序列SEQ ID No.1(即H1)和SEQ IDNo.2(即H2)所示的序列进行凝胶化从而形成的。

在另一优选例中，所述的DNA水凝胶是通过如下方法制备的：在SEQ ID No.3(即I)作为引发链下，用如序列SEQ ID No.1(即H1)和SEQ ID No.2(即H2)所示的序列进行凝胶化从而形成的。

在另一优选例中，所述的制备方法中，(H1/H2)与引发链I的摩尔比为n(H1/H2)：n(I)＝20-20,0000:1，较佳地为n(H1/H2)：n(I)＝30-15,0000:1。

在另一优选例中，所述的制备方法中，(H1/H2)与引发链I的摩尔比为n(H1/H2)：n(I)＝30-70:1。

在本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物制剂。

在另一优选例中，所述的药物制剂为透皮微针剂型。

在本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面所述的制剂的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(1)在含有所述的ATR抑制剂的水性体系中，制备水凝胶，得到所述的给药系统；或者

(1’)将所述的ATR抑制剂与含有水凝胶的溶液混合，得到所述的给药系统。

在另一优选例中，所述的制备方法包括：将H1、H2和引发剂I溶解在含有或不含Elimusertib的水相体系中，在35-40℃下放置从而进行凝胶化。

在另一优选例中，所述的水相体系为pH＝6-10的缓冲液体系；较佳地，所述的水相体系为1×TAE-Mg²⁺缓冲液体系；更佳地，所述的缓冲液体系pH＝7-9。

在另一优选例中，所述的水性体系中，H1或H2和ATR抑制剂的摩尔比为1:50-100。

在部分实施方式中，所述的水凝胶是通过如下方法制备的：在SEQ ID No.3(即I)作为引发链下，用如序列SEQ ID No.1(即H1)和SEQ ID No.2(即H2)所示的序列进行凝胶化，从而形成所述的水凝胶。

在本发明的第四方面，提供了一种提高ATR抑制剂缓释效果的方法，其特征在于，将所述的ATR抑制剂分散在水凝胶中。

在部分实施方式中，所述的ATR抑制剂为Elimusertib。

在另一优选例中，所述的水凝胶为DNA水凝胶

在另一优选例中，所述的DNA水凝胶用如序列SEQ ID No.1(即H1)和SEQ IDNo.2(即H2)所示的序列进行凝胶化从而形成的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为使用可编程DNA水凝胶进行癌症治疗的持续局部药物输送系统示意图。a：高度可编程的DNA水凝胶系统的制造过程及其在HCC小鼠模型中的抗肿瘤应用示意图。亲水性药物Elimusertib在胶凝过程中被加载到水凝胶中。通过调整水凝胶的网孔大小和封装药物的结晶，实现了超过10天的延长药物递送。还显示了潜在的双重抗肿瘤机制，包括直接ATR靶向肿瘤抑制和肿瘤免疫微环境调节作用。b：载药DNA水凝胶典型应用场景示意图。对于不可切除或孤立的转移性肿瘤，水凝胶可在活检期间或放疗前瘤内注射或包埋在瘤周部位。对于(临界)可切除肿瘤，可以在手术过程中使用水凝胶。

图2显示了Elimusertib的结构及特性。a：ATR抑制剂BAY 1895344(Elimusertib)的分子结构。b：ATR通路示意图，ATR的抑制会阻断随后的ATR依赖性反应，导致有丝分裂灾难和细胞死亡。c：来自TCGA队列(n＝359)的HCC患者的基因组和转录组学特征。显示了已被确定为ATR抑制剂生物标志物的遗传缺陷和过表达因子(上图)，及其相应的ATR通路改变(底部)。

图3显示了可编程DNA水凝胶的设计和表征。a：制备具有不同孔径和机械刚度的DNA水凝胶的示意图。b，：移液器吸头上DNA水凝胶的代表性照片。c：DNA水凝胶的流变学测试。测量在25℃、1％的固定应变下进行。d：代表性的SEM图像(300x)显示了水凝胶的多孔结构，比例尺200μm。e：DNA水凝胶的孔数。f：DNA水凝胶的孔径。e-f中数据表示为平均值±s.d.。统计显著性性是通过单向方差分析和图基时候检验法(Tukey post hoc test)计算的。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图4显示了载有Elimusertib的DNA水凝胶作为药物递送库的表征。a：DNA水凝胶中Elimusertib封装(15μg/μl)及其延长释放过程的示意图。b：在注射器中胶凝前后载有Elimusertib的DNA水凝胶的代表性照片。c：代表性的SEM图像(300x)显示了载有Elimusertib的水凝胶的多孔结构。比例尺200μm。d：显示结晶的Elimusertib的代表性SEM图像(6000x)。比例尺10μm。e：Elimusertib在37℃下与PBS孵育后从DNA水凝胶中的体外释放动力学(n＝3个独立实验)。将荧光素添加到1mM、1:10000IDNA水凝胶中作为对照组(绿线)。f：释放测试期间载有Elimusertib的DNA水凝胶的代表性照片。

图5显示了从DNA水凝胶中持续释放Elimusertib适用于局部癌症治疗。a：给药方式对肿瘤生长影响的示意图。b：体外抗肿瘤药效研究装置。c：使用标准曲线使用Cell-Counting Kit-8评估的细胞数(n＝3个生物学独立实验)。数据以平均值±标准差表示。通过双尾学生t检验计算统计显著性。****P<0.0001。d：体内药物释放试验概述，收集肿瘤样品用于MALDI-MS研究。e：MALDI-MS的代表性图像。比例尺1000μm。f、g：相应肿瘤样本中γ-H2A.X表达的IHC染色的代表性图像。比例尺500μm。

图6显示了载有Elimusertib的DNA水凝胶的局部给药控制体内HCC生长。a：体内抗肿瘤功效研究的实验设计示意图。b：小鼠HCC的代表性肿瘤生物发光图像(每组n＝3只生物学上独立的动物)。c：肿瘤大小的定量分析。d：2周后移植肿瘤的代表性图像。比例尺2cm。

图7显示了载有Elimusertib的DNA水凝胶的安全性、抗肿瘤作用和免疫调节效力。a：对从图6中的动物研究中收集的肿瘤和血液样本进行了进一步分析。b：血液样本中的AST水平。c：血液样本中的WBC计数。d：γ-H2A.X表达的IHC染色的代表性图像。比例尺，500μm。e、f：HCC组织中TIL的代表性流式细胞术图(上)在每组中门控CD4⁺(e)或CD8⁺(f)T细胞(每组n＝4个生物学独立实验)。T细胞分析的门控策略，参阅图9。还显示了INF-γ⁺、TNF-α⁺和INF-γ⁺TNF-α⁺T细胞亚群的定量分析(底部)。g：载有Elimusertib的DNA水凝胶的抗肿瘤机制示意图。b、c、e、f中数据表示为平均值±s.d。统计显著性是通过单向方差分析和图基事后检验计算的。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图8显示了自组装过程的PAGE分析。所有样品均在37℃下孵育过夜，然后用10％非变性PAGE进行分析。第1-8道是单个实体或I、H1-二聚体和H2的不同组合。第1-7道中H1/H2和I的最终浓度为200nM。在第8道中，H1/H2的最终浓度为200nM，I为20nM。

图9显示了肿瘤浸润淋巴细胞分析的门控策略。每组的携带HCC的小鼠在接种后第14天被安乐死。消化肿瘤组织并收集解离的细胞用于FCM分析。每个样本收集了100,000个事件。

图10显示了FCM分析得到的CD4⁺/CD8⁺细胞在荷肝癌小鼠肿瘤组织中的频率。显示了代表性的流式细胞仪图(左)和每个子集的定量分析(右)。数据以平均值±标准差表示。统计显著性是通过单向方差分析和图基事后检验计算的。

图11显示了FCM分析得到的PD-1⁺CD4⁺细胞在HCC小鼠肿瘤组织中的频率。显示了代表性的流式细胞仪图(左)和定量分析(右)。数据以平均值±标准差表示。统计显著性是通过单向方差分析和图基事后检验计算的。

图12显示了FCM分析得到的PD-1⁺CD8⁺细胞在荷肝癌小鼠肿瘤组织中的频率。显示了代表性的流式细胞仪图(左)和每个子集的定量分析(右)。数据以平均值±标准差表示。统计显着性是通过单向方差分析和图基事后检验计算的。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种基于DNA水凝胶的含有ATR抑制剂的药物组合物，本发明的药物组合物能够促进药物结晶，并以结晶态分散于水凝胶中，实现了药物的长时间可控缓释。在此基础上完成了本发明。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明利用DNA水凝胶分散ATR抑制剂，缓释效果好，抗肿瘤活性持续时间长，并且显著降低了药物的毒副作用。

(2)由于DNA链具有可编程性、互补性和化学可修饰性，因此可以灵活操纵它们以形成具有独特几何形状的各种DNA构建块，从而形成高度可预测和结构化的DNA网络。

(3)DNA水凝胶良好的生物相容性好、力学性能可调控、相变可控，并且制备方法简单。

(4)由于本发明药物组合物的可塑性，可以制成微针剂型，避免口服剂型的弊端，并且给药更方便，可以制成多种浓度规格。

(5)本发明的给药系统可持续作用时间较长，120小时后仍可测到血里药物浓度，可以避免服药过于频繁引起的服药依从性降低，并且不会导致局部聚积。

(6)本发明的给药系统可以有效控制药物释放速率，血药浓度波动小，不容易引起机体药物中毒或浓度不足。

材料和方法

材料

本发明实施例中使用的DNA链均由上海三工生物科技有限公司合成并经HPLC纯化。寡核苷酸序列如下：

H1：(5'-GAT CGC GAT CCT GGC TCC TGT GAT TGT GCT CTA GAC ATC GCT AGAGCA CAA TCA CAG G-3')；

H2：(5'-CTA GAG CAC AAT CAC AGG AGC CAG TTT TCC TGT GAT TGT GCT CTAGCGATG T-3')；

I：(5'-CTA GAG CAC AAT CAC AGG AGC CAG-3')。

Elimusertib(BAY-1895344)盐酸盐(S866)购自Selleck。Elimusertib的结构如下式(I)所示。

本研究中使用的抗体如下：

BV510-抗小鼠CD45(BD Pharmingen,30-F11,563891)、Fixable ViabilityStain780(BD Horizon,565388)、FITC-抗小鼠CD4(Invitrogen,RM4-5,11-0042-82)、BB700-抗小鼠CD8a(BD Pharmingen,53-6.7,566409)、PE/Cyanine7-抗小鼠TNF-α(BioLegend,MP6-XT22,506324)、BV421-抗小鼠IFN-γ(BD Horizon,XMG1.2,563376)、PE-抗小鼠CD279(PD-1)(BD Pharmingen,J43,5518921)、抗小鼠磷酸组蛋白H2A.X(Ser139)(Cell Signaling Technology,20E3,9718S)。Leukocyte Activation Cocktail和Cytofix/CytopermTM由BD提供。

Percoll^TM由瑞典cytiva提供。

1×红细胞(RBC)裂解缓冲液是eBioscience^TM(00-4333-57)的产品。

天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性比色测定试剂盒购自长春惠立生物科技有限公司。细胞计数试剂盒(CCK-8试剂盒)购自万酶有限公司。

DAPI和D-Luciferin，Potassium Salt(L2916)购自Invitrogen。

细胞系和培养

小鼠Hepa1-6细胞系购自中国科学院国家细胞鉴定保藏中心。Hepa1-6使用慢病毒用GFP-荧光素酶标记，用于进一步的体内成像。细胞在添加有10％胎牛血清(Invitrogen)、100U ml-1青霉素G钠(Invitrogen)和100μg ml-1硫酸链霉素(Invitrogen)的Dulbecco改良Eagle培养基(Gibco；Invitrogen)中，在CO₂浓度为5％、相对湿度为90％、37℃的气氛中培养。没有发现支原体污染的迹象。

动物

雄性C57BL/6小鼠(6-8周龄，20-25g)购自中国上海实验动物有限公司。住房条件是无特定病原体的，随意提供食物和水。动物程序经上海交通大学医学院附属仁济医院机构动物护理和使用委员会批准。

DNA水凝胶的制备

将H1和H2在95℃下加热5分钟，然后在冰中快速降温至4℃进行退火，以制备用于凝胶化的DNA寡核苷酸。将H1、H2和引发剂I溶解在含有或不含Elimusertib的1×TAE-Mg²⁺缓冲液(40mM Tris、20mM乙酸、2mM EDTA、12.5mM Mg²⁺、pH＝8.0)中，以制作空白或载药的DNA水凝胶样品。然后将混合物转移到注射器中，以便将水凝胶整体取出以进行进一步的表征测试。此外，将混合物在37℃下过夜以更好地凝胶化。可以调节[H1/H2]和[引发剂I]的比例以产生不同孔径的水凝胶。例如，在制备用于体内抗肿瘤功效研究的载药DNA水凝胶样品的典型程序中，使用33μL H1(3mM)、33μL H2(3mM)、5μL I(2μM)、18μL Elimusertib(200mM)和11μL 1×TAE-Mg²⁺缓冲液制备混合物。

电泳

对于聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)电泳测试，H1、H2和I的不同组合的混合物在室温下孵育过夜。将原始产品上样到10％天然PAGE(丙烯酰胺/N,N'-亚甲基双丙烯酰胺＝29:1,1×TAE-Mg2+)。凝胶在110V电压下运行100分钟，然后用Gel Red染色。

SEM表征

使用工作电压为5.0kV的Sirion 200显微镜(Thermo Fisher Scientific，德国)对DNA水凝胶的冻干样品进行成像。在SEM成像之前，使用Q150T ES plus涡轮分子泵镀膜仪(英国Quorum)对样品喷金45秒。

流变学测试

将100μL的DNA水凝胶样品加载到AR-G2流变仪(TA Instruments，美国)上。在25℃下，以固定的1％应变，进行100-0.01rad·s^-1之间的G'和G”的频率扫描测试。

体外药物释放曲线

将30μL的不同孔径的含有0.45mg Elimusertib的DNA水凝胶置于具有8μm聚碳酸酯膜(Millipore，MA，USA)的24孔转井室(transwell chamber)中。然后将上室插入装有700μL 1×PBS培养基的24孔板(Corning)中。每24小时取出培养基并更换为新鲜缓冲液，持续14天。使用分光光度法(Cary 100，Agilent)在394nm波长下定量释放在培养基中的Elimusertib的量。

体外抗肿瘤功效研究

将1×105个Hepa1-6细胞接种在24孔板中，孵育12小时进行贴壁。

载药水凝胶的体外抗增殖活性与单剂量组相比进行了研究，单剂量组在培养基中添加了0.2μg Elimusertib，而在水凝胶组中，将载有0.2μg Elimusertib的30μL DNA水凝胶置于转井室中，如上所述。两组均每24小时更新一次培养基。使用CCK-8测定法确定细胞活力。每孔加入100μL CCK-8溶液，37℃孵育1小时。使用半定量分析的分光光度法检测溶液在450nm处的吸光度。

体内抗肿瘤功效研究

第0天，将GFP-荧光素酶标记的Hepa1-6细胞(每只小鼠5×106个细胞在50μL PBS中)皮下注射到C57BL/6小鼠(6-8周龄)的右侧。第3天，肿瘤体积相近的小鼠被随机分配到每个治疗组，即对照组，口服(p.o.)组(6.25mg/kg，每日两次(b.i.d)，服用3天/停药4天，口服/口服)和水凝胶组。在水凝胶组中，在肿瘤附近做一个小皮肤切口，并将载有药物的DNA水凝胶放置在通过钝性分离产生的皮下浅筋膜腔中。为了监测肿瘤的生长动力学，在第3天、第6天、第9天和第13天通过游标卡尺记录长度和宽度，并通过IVIS光谱(PerkinElmer，USA)记录生物发光信号。具体地，为了可视化荧光素酶信号，在100μl PBS中以100mg kg^-1的剂量给小鼠腹腔注射D-荧光素。小鼠在5分钟后成像，采集时间为40秒。按照长×宽²×0.5的公式计算肿瘤体积。第14天，处死所有小鼠，解剖肿瘤并成像。每个肿瘤被切成两块，分别用于磷酸组蛋白H2A.X的IHC染色和肿瘤浸润淋巴细胞的流式细胞术分析。采集血样用于全血细胞分析和AST活性测量。

用于体内药物释放分析的MALDI-MSI

在第6天，将p.o组和水凝胶组中如上所述的方法产生的皮下肿瘤移除并包埋在OCT中。在-20℃下将样品切成20μm厚的冰冻切片，放在相同的氧化铟锡涂层载玻片(Sigma-Aldrich，578274)上进行MALDI-MSI测试。邻近的层被切割到正常载玻片上用于DAPI和苏木精-伊红染色。MALDI TOF-TOF质谱仪(岛津Shimadzu，MALDI-7090TM)用于成像。在正离子模式下使用m/z 20–600的扫描范围进行。m/z值为376.18827的峰用于锁定质量。以100μm的像素大小获取图像。原始数据被转换为imzl文件，并使用MSiReader生成MALDI图像。

肿瘤浸润淋巴细胞的流式细胞术分析

肿瘤用胶原酶消化15分钟，然后用注射器活塞在孔径为70μm的细胞过滤器上轻轻研磨。通过在Percoll^TM上进行密度梯度离心分离单核细胞，并通过RBC裂解缓冲液去除红细胞。然后将细胞悬浮液用如上所述的材料在PBS中的包括3％FBS的溶液染色。对于表面染色，将细胞与抗体在4℃下孵育30分钟。对于细胞内细胞因子染色，单核细胞在表面染色前通过白细胞活化混合物和BD GolgiPlugTM进行刺激。使用Cytofix/Cytoperm^TM固定/透化试剂盒固定和透化免疫细胞。使用数字流式细胞仪(LSRFortessa^TM，BD Biosciences)分析抗体标记的细胞悬浮液。使用制造商提供的FlowJo 10软件进一步处理结果。

统计分析

使用双尾学生t检验(Two-tailed Student’s t-test)进行两个实验组之间的统计比较，而当涉及多个组时，使用单向方差分析。使用Prism 7(GraphPad软件)进行绘图和P值计算。显著差异标记为*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001和****P<0.0001。

实施例

实施例1：用于药物缓释的可编程DNA-水凝胶系统的设计

发明人开发了一种基于钳式杂交链式反应(clamped hybridization chainreaction，C-HCR)的引发剂诱导的DNA水凝胶。该系统使用两个发夹链H1、H2和一个短的引发链I。当未将引发剂I添加到混合物中时，H1链可在退火后形成二聚体并与H2亚稳态共存，因为它们的短环结构阻止了它们的杂交。一旦引入引发剂I，它就会通过置换反应结合并打开H1。然后激活的H1会激活H2，导致它们杂交。上述过程往复进行，构建水凝胶的三维骨架。我们使用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)来确认逐步凝胶化过程(图8)。第4道表明H1-I复合体的形成，而第5和6道中的对照组没有显示链组装的迹象。在第7道中，H1、H2和I与[I]:[H1/H2]的比例为1:1的混合物孵育过夜，显示出几个迁移速度比H1-I复合体慢得多的条带。当较少的引发剂I添加到混合物中时(第7道中的1/10)，过多的I全部被H1结合，并且可以形成在电泳下几乎不移动的更大的DNA聚合物，如第8道所示。

发明人研究了DNA水凝胶的宏观特征、微观结构和可编程性。H1、H2和引发剂I溶解于1×TAE-Mg²⁺缓冲液中，最终浓度分别为600μM、600μM和12μM。在37℃下孵育过夜后，发生凝胶化，可以用移液器吸头取出外观透明的水凝胶(图3b)。然后通过流变学测试检查DNA水凝胶的机械强度。如图3c所示，在频率扫描测试中，G'值(储能模量)比G”值(损耗模量)高10倍以上，表明所有样品具有凝胶状机械性能。此外，当H1/H2浓度升高到1mM时，G'和G”值显着增加。

此外，在具有相同H1/H2浓度的样品中，G'值的变化与[I]:[H1/H2]比率变化非常一致。通过扫描电子显微镜(SEM)进一步研究了DNA水凝胶的结构。从SEM图像(图3d)来看，DNA水凝胶的冻干样品显示出典型的多孔结构形态。同时，网格的数量和大小与H1/H2浓度和[I]:[H1/H2]比值成正比，准确反映了其力学性能的结构基础(图3e、3f)。总之，这些数据表明本发明的DNA水凝胶系统是高度可编程的，使其成为进一步应用的有希望的候选者。

实施例2：载有Elimusertib的DNA水凝胶作为药物递送库的表征

通过Elimusertib添加到H1、H2和I的混合物中来制备载有Elimusertib的DNA水凝胶(图4a)。孵育后，透明溶液转变成具有不透明外观的凝胶(图4b)。推测Elimusertib可能在凝胶化过程中形成晶体，因为3D网络将结构分隔开，并且网格中的局部药物浓度增加，与溶剂蒸发诱导的结晶过程类似。更重要的是，微米级的药物晶体可以作为类似于H1-I复合物的引发剂，反过来加速凝胶化。使用SEM检查了具有不同交联密度的载药DNA水凝胶，如图4c所示，在不同的H1/H2浓度和[I]:[H1/H2]比例下，载药水凝胶主链与空白水凝胶主链相似。此外，DNA骨架中镶嵌有三斜晶系和分散的单晶簇(图4d)。

然后，我们通过将载药水凝胶放入上部转井室(孔径40μm)内的PBS中来研究载药水凝胶的体外释放曲线。如图4e所示，Elimusertib从所有交联密度不同的样品中持续释放。宏观图像(图4f)显示了不同参数的水凝胶的释放模式，并表明水凝胶骨架几乎完好无损，降解最小。

具体而言，本发明的系统实现了大约10％的快速释放(k)(即1天内的释放分数，以指示药物释放的初始动力学)和4-8天的半衰期(t_1/2)。这两个参数类似于平均尺寸为1-20μm的结晶药物制剂的释放特性，而不同于对照组中未结晶荧光素的释放特性(图4e，绿线)(简单扩散主导机制，前期大量快速释放(k>50％)，释放持续时间较短(t_1/2<24h))。

实施例3：从适用于局部癌症治疗的DNA水凝胶中持续释放Elimusertib

为了测试从DNA水凝胶中持续释放Elimusertib是否适合局部区域癌症治疗(图5a)，发明人使用转井(transwell)测定来验证体外抗肿瘤活性。载有0.2g Elimusertib的DNA水凝胶在顶部细胞过滤器(孔径40μm)中孵育(图5b)，并将Hepa1-6鼠肝癌细胞接种在底部室中。对照组及时在培养基中加入等量药物。两组每天更换新鲜培养基，并通过CCK-8测定法测量细胞活力(图5c)。48小时后，Hepa1-6细胞数量显着减少，表明Elimusertib作为单一疗法治疗肝细胞癌的潜在疗效。然而，随着药物被洗脱，残留的肿瘤细胞继续繁殖。相比之下，由于Elimusertib在10天内从水凝胶中持续释放，Hepa1-6细胞的数量不断减少。总的来说，这些数据表明本发明的DNA-水凝胶系统可以作为Elimusertib的储库，其延长的药物释放特性比单次给药表现出更好的抗肿瘤活性。

使用基质辅助激光解吸电离质谱成像(MALDI-MSI)研究体内药物释放模式，以可视化Elimusertib在肿瘤组织中的空间分布(图5d)。将载药水凝胶(0.75mg Elimusertib)植入C57BL/6小鼠皮下HCC肿瘤附近，而在对照组中，在3天内口服等量药物(6.25mg/kgb.i.d.)。在水凝胶植入和p.o治疗开始后的第3天，移除两组中的肿瘤并通过免疫组织化学(IHC)评估Ser139(γH2A.X)处的磷酸化H2A.X，一种DNA损伤诱导标记物，还通过MALDI-MSI研究了药物渗透和定位。如图5e所示，Elimusertib深入渗透到组织中，在水凝胶组的大部分肿瘤中具有广泛且相对均匀的信号。相比之下，在p.o组中仅观察到散点信号。此外，在p.o组中不存在的明显坏死的肿瘤部分(图5f)可以在载药水凝胶的一侧被识别出来，进一步证明了其在更复杂的体内环境中的缓释特性和抗肿瘤作用。

实施例4：载有Elimusertib的DNA水凝胶的局部给药控制体内HCC生长

在给小鼠接种表达荧光素酶的Hepa1-6细胞后的第3天，右侧可见皮下肿瘤。然后在每次治疗前将具有相似肿瘤体积的小鼠随机分组。有肿瘤的小鼠在分组后立即接受载药DNA水凝胶植入或口服游离药物。未经治疗的小鼠用作对照。Elimusertib在每个水凝胶贴片中以每剂1.5mg的剂量使用，体积仅为100μL。在第3天、第6天、第9天和第13天进行肿瘤大小测量和生物发光测定。在第14天处死所有小鼠以进行详细研究(图6a、7a)。如图6b所示，局部区域载有Elimusertib的DNA水凝胶治疗发挥了最强的肿瘤生长抑制作用。而p.o.组的小鼠在大多数情况下(4/5，80％)表现出中等的抗肿瘤作用。肿瘤体积的直接测量(图6c)和整块解剖肿瘤的图像(图6d)表明，与p.o.组或对照组相比，水凝胶组小鼠在第2周肿瘤明显更小。值得注意的是，已发表的关于这种ATR抑制剂在小鼠临床前肿瘤模型中的口服单药治疗研究报告表明，最佳剂量为30至50mg/kg b.i.d，p.o.以服用3天/停药4天循环已达到充分的肿瘤抑制(Wengner A.M.等，The Novel ATR Inhibitor BAY 1895344 IsEfficacious as Monotherapy and Combined with DNA Damage-Inducing or Repair-Compromising Therapies in Preclinical Cancer Models.分子癌症疗法(Mol.Cancer.Ther.)19(1),26-38(2020))，这一剂量比本实施例中通过水凝胶给药的剂量高出5倍以上。

实施例5：载有Elimusertib的DNA水凝胶的安全性、抗肿瘤作用和免疫调节效能

IHC染色的γH2A.X的在移除的肿瘤中成像。图7b表明与其他组相比，水凝胶组中该标记物的显着治疗增加。该结果与ATR抑制剂的药效学靶点调节机制非常一致。同时，从小鼠身上采集血液样本用于全血细胞分析和AST活性测量。在口服接受Elimusertib的小鼠中，白细胞计数显着降低，天冬氨酸转氨酶(AST)水平显着高于其他组(图7c、7d)。这一结果与已发表的报告一致，该报告描述了在一项口服BAY 1895344的首次人体试验中，最常见的全级别治疗紧急不良事件(TEAE)是血液系统疾病(Yap,T.A.等，First-in-Human Trial ofthe Oral Ataxia Telangiectasia and RAD3-Related(ATR)Inhibitor BAY 1895344inPatients with Advanced Solid Tumors.癌症发现(Cancer.Discov.)11(1),80-91(2021))。水凝胶组的WBC计数和AST水平与未治疗组相当，显示了本发明方案的安全性。本发明的局部药物递送方法在不减弱其抗增殖活性的情况下大大减少了全身药物暴露引起的副作用。

在第14天收获肿瘤以分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。通过流式细胞术检测TIL的免疫学特征。在p.o.组中观察到CD4⁺和CD8⁺T细胞略有减少(图10)，尽管两者均无统计学意义；而对照组和水凝胶组的数量基本相同。这种减少可能是由于白细胞减少症的系统性不良事件引起的。根据现有研究，DNA损伤反应(DDR)缺乏是肿瘤免疫原性的重要决定因素(Germano,G.等，Inactivation of DNA repair triggers neoantigen generation andimpairs tumor growth.自然(Nature)552,116–120；Ding,L.等PARP inhibition elicitsSTING-dependent antitumor immunity in Brca1-deficient ovarian cancer.细胞报告(Cell Rep.)25,2972–2980(2018)；Murai,J.等，SLFN11 blocks stressed replicationforks independently of ATR.分子细胞(Mol.Cell)69,371–384.e6(2018))。

如图7e、7f所示，水凝胶组的CD4⁺T细胞以及CD8⁺T细胞分泌的干扰素-γ(INF-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平明显高于其他组。这一观察表明，细胞因子介导的T细胞杀伤可能与局部DNA水凝胶疗法更好的抗肿瘤作用有关。此外，发明人发现PD-1表达在CD4⁺T细胞上略有增加，在CD8⁺T细胞上略有降低(图11、12)，尽管两者均无统计学意义，表明ATR抑制可能会影响免疫检查点表达。总的来说，数据表明，通过DNA水凝胶给药Elimusertib对肿瘤免疫细胞界面产生了影响，并强调了与检查点抑制剂联合治疗的前景广阔。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种包含ATR抑制剂的药物组合物，其特征在于，包括：

(1)治疗有效量的ATR抑制剂；

(2)用于负载所述的ATR抑制剂的水凝胶；

其中，所述的ATR抑制剂以结晶态分散于所述的水凝胶中。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的ATR抑制剂为Elimusertib或其药学上可接受的盐，所述的Elimusertib具有如式(I)所示的结构：

3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，在所述的药物组合物中，所述的ATR抑制剂的浓度为1-100mM，优选地为5-80mM，更优选地为10-50mM。

4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的水凝胶为DNA水凝胶。

5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的DNA水凝胶用如序列SEQ IDNo.1(即H1)和SEQ ID No.2(即H2)所示的序列进行凝胶化从而形成的。

在另一优选例中，所述的DNA水凝胶是通过如下方法制备的：在SEQ ID No.3(即I)作为引发链下，用如序列SEQ ID No.1(即H1)和SEQ ID No.2(即H2)所示的序列进行凝胶化从而形成的。

在另一优选例中，所述的制备方法中，(H1/H2)与引发链I的摩尔比为n(H1/H2)：n(I)＝20-20,0000:1，较佳地为n(H1/H2)：n(I)＝30-15,0000:1。

在另一优选例中，所述的制备方法中，(H1/H2)与引发链I的摩尔比为n(H1/H2)：n(I)＝30-70:1。

6.如权利要求1-5任一项所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物制剂。

在另一优选例中，所述的药物制剂为透皮微针剂型。

7.如权利要求1-5任一项所述的制剂的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(1)在含有所述的ATR抑制剂的水性体系中，制备水凝胶，得到所述的给药系统；或者

(1’)将所述的ATR抑制剂与含有水凝胶的溶液混合，得到所述的给药系统。

在另一优选例中，所述的制备方法包括：将H1、H2和引发剂I溶解在含有或不含Elimusertib的水相体系中，在35-40℃下放置从而进行凝胶化。

在另一优选例中，所述的水相体系为pH＝6-10的缓冲液体系；较佳地，所述的水相体系为1×TAE-Mg²⁺缓冲液体系；更佳地，所述的缓冲液体系pH＝7-9。

在另一优选例中，所述的水性体系中，H1或H2和ATR抑制剂的摩尔比为1:50-100。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的水凝胶是通过如下方法制备的：在SEQID No.3(即I)作为引发链下，用如序列SEQ ID No.1(即H1)和SEQ IDNo.2(即H2)所示的序列进行凝胶化，从而形成所述的水凝胶。

9.一种提高ATR抑制剂缓释效果的方法，其特征在于，将所述的ATR抑制剂分散在水凝胶中。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的ATR抑制剂为Elimusertib。

在另一优选例中，所述的水凝胶为DNA水凝胶

在另一优选例中，所述的DNA水凝胶用如序列SEQ ID No.1(即H1)和SEQ IDNo.2(即H2)所示的序列进行凝胶化从而形成的。