CN115518701A - 用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种简单、超灵敏的用于miRNA检测的金纳米花微电极阵列芯片，该芯片采用了一种纳米银信号探针与金纳米花微电极相结合的检测方法，对miRNA进行高通量、直接的电化学分析。通过两步杂交设计检测miRNA：首先miRNA与茎环探针杂交，打开的茎环将进一步与纳米银信号探针杂交以进行信号放大。以miR‑21作为检测对象，本发明金纳米花微阵列芯片显示出对miR‑21检测的优异性能，检测限为0.56fM，线性范围为1fM到10pM。本发明金纳米花微电极阵列芯片在区分3碱基错配靶序列方面也表现出良好的特异性，并且能够直接检测出肺癌细胞和正常细胞裂解物中miR‑21的表达差异，在癌症即时检测方面显示出巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及传感器件制备技术，尤其涉及一种用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备及检测方法。
背景技术
由于许多miRNA的表达失调与癌症的发生和发展有关，因此miRNA成为癌症诊断和预后的重要生物标志物。然而，miRNA的固有特性，如短长度、低丰度和高序列同源性为临床快速准确检测miRNA带来了巨大挑战。金标准miRNA分析技术RT-qPCR存在耗时，需要多步骤的样品预处理等缺点。因此，许多基于纳米技术的基因传感方法与电化学技术相结合，有望克服这些不足之处，并实现对基因样本的低成本、高灵敏、快速的直接定量分析。
为提高分子传感检测性能，金属纳米颗粒因其独特的物化特性而被广泛使用。其中，银纳米颗粒(AgNPs)由于可以产生强烈的电化学信号而被应用于各种电化学传感器中。并且，为了进一步提高分子传感的灵敏度，一些信号放大策略也被进一步引入到这些基于AgNPs的基因传感器中，如滚动圈扩增反应(RCA)、杂交链式反应(HCR)，双链特异核酸酶(DSN)和链置换反应(SDR)和基于四面体DNA纳米结构等。虽然这些策略可以显著提高传感器的灵敏度，但他们却增加了检测时间和操作难度，不适用于临床快速检测应用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于miRNA检测的金纳米花微阵列传感器的制备及检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)加工微阵列芯片，具体包括以下子步骤：
(1.1)选用玻璃作为基底，经过RCA标准清洗工艺清洗并烘干；
(1.2)在基底上依次溅射Cr粘附层、金电极层，金电极层的厚度为200nm；
(1.3)通过光刻法刻蚀出金传感区域、焊盘及导线；
(1.4)使用气相沉积技术沉积聚对二甲苯绝缘层；
(1.5)通过光刻法和反应离子刻蚀技术得到微孔金电极(10μm)；
(1.5)使用玻璃刀将芯片进行切割，得到微阵列芯片单元；
(2)在微阵列芯片的微孔中电沉积金纳米花微电极具体包括以下子步骤：
(2.1)将微阵列芯片依次用丙酮、异丙醇和水清洗1分钟并用氮气吹干。
(2.2)利用恒电压法在电镀液(50mM HAuCl4和0.5M HCl)中进行金纳米花结构电极电沉积。沉积电压为0.5V，沉积时间为200s。
(3)金纳米花微电极的表面功能化具体包括以下子步骤：
(3.1)将5μM茎环探针(5’-HS-C6-GGCCGTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAACATGATGACGGCC-3’)溶液(含有1M NaCl和10mM Tris-HCl)置于95℃水浴锅中加热10min然后缓慢冷却到室温，得到折叠好的茎环探针；
(3.2)将5μL茎环探针溶液滴在金纳米花结构微阵列芯片上并孵育过夜；
(3.3)用10mM PBS彻底冲洗金纳米花微阵列芯片以除去多余的茎环探针；
(3.4)通过将MCH溶液用10mM PBS溶液稀释至100μM，得到MCH封闭液；
(3.5)将10μL MCH封闭溶液滴加到芯片表面以封闭金纳米花电极表面空余位点；
(3.6)用10mM PBS彻底冲洗金纳米花微阵列芯片以除去多余的MCH，得到用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片。
所述金纳米花微阵列芯片由玻璃、Cr粘附层、金电极层、聚对二甲苯绝缘层、金纳米花微电极组成，所述玻璃上侧依次溅射有Cr粘附层、金电极层，所述Cr粘附层、金电极层上侧沉积有聚对二甲苯绝缘层，所述聚对二甲苯绝缘层形成的微孔中沉积有金纳米花微电极。
一种利用金纳米花微阵列芯片检测miRNA的方法，该方法包括以下步骤：
(1)选用miR-21作为检测对象，制备不同浓度的miR-21溶液(含有10mMPBS,1MNaCl，40mM MgCl2)，取200μL滴加到金纳米花微阵列芯片上，在37℃下进行茎环探针与miR-21之间的碱基互补配对，1h后，用10mM PBS进行清洗，再加入纳米银信号探针(5μL,1nM)25℃下孵育1h以结合被miR-21打开的茎环探针。对用10mM PBS清洗后的金纳米花微阵列芯片进行电化学循环伏安法扫描并绘制miR-21浓度与循环伏安曲线氧化峰电流的对应关系曲线。
进一步地，所述步骤(1)中纳米银信号探针的制备具体包括以下子步骤：
(a)纳米银制备：在搅拌(700rpm)条件下煮沸柠檬酸三钠(5mM)和单宁酸(0.01mM)溶液的混合物(50mL)。然后向其中加入AgNO3溶液(500μL，25mM)继续煮沸15min得到纳米银溶液。
(b)将纳米银(500μL，1nM)与单链DNA(5μL,100μM)(HS-C6-TTTTTGGCCGTCA)混合，并在0.1M NaCl存在下孵育48h。离心清洗信号单链DNA修饰的纳米银两次(12000rpm，10min)得到纳米银信号探针。
进一步地，将金纳米花微阵列芯片作为工作电极、外接参考电极(Ag/AgCl电极)、外接对电极(Pt电极)插入到电化学池中，以0.3M KCl作为底液进行CV表征。具体检测参数为：电压范围为-0.1V到0.7V，扫描速度为0.05V/s。
本发明的有益效果：
1.本发明开发了一种简单、易操作的miRNA检测金纳米花微阵列芯片，该芯片通过金纳米花微电极与纳米银信号探针的级联放大作用，可直接对miRNA的进行高通量电分析。
2.本发明所开发的金纳米花微阵列芯片具有超灵敏的检测性能(0.56fM)和区分3碱基错配序列的优异特异性。
3.金纳米花微阵列芯片能够直接从未纯化的细胞裂解物(103个细胞)中检测肺癌细胞和正常细胞中miR-21的差异表达，具有广阔的应用前景。
4.本发明采用纳米银AgNPs作为信号探针，构建无需放大策略、能够直接从复杂生物样本中快速检测miRNA的微型传感芯片，提高miRNA检测效率，为癌症的早期诊断提供一种新型基因检测技术。
5.本发明在玻璃基底上图案化微孔金阵列，可实现低成本和高通量检测；金纳米花微电极电沉积在微孔中用于提高杂交效率；利用纳米银信号探针实现信号报告和放大。两步杂交策略用于检测miR-21，其中miR-21与固定在金纳米花微电极上的茎环探针杂交，以首先打开茎环结构，接着被打开的茎环探针可以进一步与设计的纳米银信号探针杂交，以实现miR-21的高灵敏检测。
6.本发明生产的为金纳米花微阵列芯片，上侧沉积的金纳米花用于提高电极的比表面积、增大检测灵敏度，纳米银是用于产生电化学还原信号。
7.本发明在价格低廉易实现的玻璃基底上，光刻出带有微米孔洞的阵列，并用于后续电化学沉积金纳米花微电极，简单方便且成本低廉。
附图说明
图1是在玻璃基底上依次溅射Cr粘附层、金电极层及绝缘层；
图2是本发明微阵列芯片示意图；
图3是本发明微阵列芯片孔电极及金纳米花微电极的电沉积示意图；
图4是本发明微阵列芯片孔电极及金纳米花微电极的SEM图；
图5是本发明用于miR-21检测的金纳米花微阵列芯片的制备图；
图6是本发明金纳米花微阵列芯片检测不同浓度miR-21的循环伏安曲线(氧化过程)；
图7是本发明金纳米花微阵列芯片分别与不同浓度的miR-21反应后循环伏安曲线氧化峰电流与miR-21浓度之间的对数关系；
图8是本发明金纳米花微阵列芯片在不同基因序列干扰下的循环伏安曲线(氧化过程)。
图9是本发明金纳米花微阵列芯片检测正常细胞(HEK293T)以及癌细胞(A549)裂解物中miR-21的循环伏安曲线(氧化过程)。
如图，玻璃1、Cr粘附层2、金电极层3、聚对二甲苯绝缘层4。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明，但并不限制本发明。
本发明开发了一种超灵敏、高通量、简单、易操作的电化学miRNA分析金纳米花微阵列芯片。该装置设计有三个独特的特点：(1)玻璃基底上图案化微孔金阵列，可实现低成本和高通量检测；(2)金纳米花微电极电沉积在微孔中用于提高杂交效率；(3)利用纳米银信号探针实现信号报告和放大。两步杂交策略用于检测miR-21，其中miR-21与固定在金纳米花微电极上的茎环探针杂交，以首先打开茎环结构，接着被打开的茎环探针可以进一步与设计的纳米银信号探针杂交，以实现miR-21的高灵敏检测。
本发明提出的一种用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)加工微阵列芯片，具体包括以下子步骤，如图1所示：
(1.1)选用玻璃1作为基底，经过RCA标准清洗工艺清洗并烘干；
(1.2)在基底上依次溅射Cr粘附层2、金电极层3，金电极层3的厚度为200nm；
(1.3)通过光刻法刻蚀出金传感区域、焊盘及导线；
(1.4)使用气相沉积技术沉积聚对二甲苯绝缘层4；
(1.5)通过光刻法和反应离子刻蚀技术得到微孔金电极(10μm)；
(1.6)使用玻璃刀将芯片进行切割，得到微阵列芯片，如图2所示，其中该芯片大小为1.2cm×1cm，由位于引线尖端的6个微孔1组成，用于金纳米花微电极电沉积；每个芯片微孔可分为两组，每组三个重复，用于测试两个不同的样品，在电化学检测时，将电极夹夹于焊盘位置2以导通信号。
(2)为了提高miRNA检测灵敏度，在微阵列芯片的微孔中电沉积金纳米花微电极(图3)，具体包括以下子步骤：
(2.1)将微阵列芯片依次用丙酮、异丙醇和水清洗1分钟并用氮气吹干。
(2.2)利用恒电压法在电镀液(50mM HAuCl4和0.5M HCl)中进行金纳米花结构电极电沉积。沉积电压为0.5V，沉积时间为200s。为了验证金纳米花电极的成功电沉积，利用扫描电子显微镜对微孔及金纳米花微电极进行了表征，如图4所示，微孔直径约为12μm，电沉积的金纳米花电极直径约为40μm。
(3)金纳米花微电极的表面功能化如图3所示，具体包括以下子步骤：
(3.1)将5μM茎环探针(5’-HS-C6-GGCCGTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAACATGATGACGGCC-3’)溶液(含有1M NaCl和10mM Tris-HCl)置于95℃水浴锅中加热10min然后缓慢冷却到室温，得到折叠好的茎环探针；
(3.2)将5μL茎环探针溶液滴在金纳米花结构微阵列芯片上并孵育过夜；
(3.3)用10mM PBS彻底冲洗金纳米花微阵列芯片以去除多余的茎环探针；
(3.4)通过将MCH溶液用10mM PBS溶液稀释至100μM，得到MCH封闭液；
(3.5)将10μL MCH封闭溶液滴加到芯片表面以封闭金纳米花表面空余位点；
(3.6)用10mM PBS彻底冲洗金纳米花微阵列芯片以除去多余的MCH，得到用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片。
一种利用金纳米花微阵列芯片检测miRNA的方法，该方法包括以下步骤：
(1)选用miR-21作为检测对象，制备不同浓度的miR-21溶液(含有10mMPBS,1MNaCl，40mM MgCl2)，取200μL滴加到金纳米花微阵列芯片上，在37℃下进行茎环探针与miR-21之间的碱基互补配对，1h后，用10mM PBS进行清洗，再加入纳米银信号探针(5μL,1nM)25℃下孵育1h以结合被miR-21打开的茎环探针。对用10mM PBS缓冲液清洗后的金纳米花微阵列芯片进行CV扫描，提取CV氧化电流峰值，发现电化学氧化峰电流随着miR-21浓度(1fM-10pM)的增大而增大(图6)。绘制线性关系曲线为y＝21.083LogCmiR-21+357.67，其中CmiR-21是miR-21的浓度，y是不同浓度miR-21对应的氧化电流峰值，计算金纳米花微阵列芯片检测miR-21检出限为0.56fM(图7)。同时，阴性对照组(共三个序列，分别是两种随机序列(5’-AATACCCCACCACCTTTTGA-3’,5’-GCAAACGAGACATCATAGGCA-3’)和一种3碱基错配序列(5’-TAGCTTATCAGACTGATGTGAC-3’))处理前后的曲线与没加miR-21组没有明显变化，只有miR-21组显示出增大的峰电流信号，说明本发明miRNA检测金纳米花微阵列芯片具有良好的特异性(图8)。
进一步地，所述步骤(1)中纳米银信号探针的制备具体包括以下子步骤：
(a)纳米银制备：在搅拌(700rpm)条件下煮沸柠檬酸三钠(5mM)和单宁酸(0.01mM)溶液的混合物(50mL)。然后向其中加入AgNO3溶液(500μL，25mM)继续煮沸15min得到纳米银溶液。
(b)将纳米银(500μL，1nM)与单链DNA(5μL,100μM)(HS-C6-TTTTGGCCGTCA)混合，并在0.1M NaCl存在下孵育48h。离心清洗单链DNA修饰的纳米银两次(12000rpm，10min)得到纳米银信号探针。
(2)利用金纳米花微阵列芯片直接检测细胞裂解液中miR-21的浓度：在含有107个细胞的离心管中加入细胞裂解缓冲液(1％Triton-X 100,10mMTris-HCl,DEPC)，置于冰上裂解5分钟，然后离心去除细胞碎片。将细胞裂解后的溶液加入到金纳米花微阵列表面。37℃下进行茎环探针与miR-21之间的碱基互补配对，1h后，用10mM PBS进行清洗，再加入5μL,1nM纳米银信号探针25℃下孵育1h以结合被miR-21打开的茎环探针。对用10mM PBS缓冲液清洗后的金纳米花微阵列芯片进行电化学循环伏安扫描，提取循环伏安氧化电流峰值。如图9所示，两种细胞的细胞数为103个细胞，与正常细胞HEK293T裂解物相比，来自癌细胞A549裂解物的电化学信号增加了约3倍(图9)，表明金纳米花微阵列芯片在复杂样本miRNA分析方面具有巨大的应用潜力。
进一步地，将金纳米花微阵列芯片作为工作电极、外接参考电极(Ag/AgCl电极)、外接对电极(Pt电极)插入到电化学池中，以0.3M KCl作为底液进行CV表征。具体检测参数为：电压范围为-0.1V到0.7V，扫描速度为0.05V/s。
需要声明的是，本发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)加工微阵列芯片；
(2)在微阵列芯片的微孔中电沉积金纳米花微电极；
(3)对步骤(2)加工完毕的微阵列芯片中的金纳米花微电极进行表面功能化。
2.按照权利要求1所述的一种用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法，其特征在于所述加工微阵列芯片具体包括以下子步骤：
(1.1)选用玻璃作为基底，经过RCA标准清洗工艺清洗并烘干；
(1.2)在基底上依次溅射Cr粘附层、金电极层，金电极层的厚度为200nm；
(1.3)通过光刻法刻蚀出金传感区域、焊盘及导线；
(1.4)使用气相沉积技术沉积聚对二甲苯绝缘层；
(1.5)通过光刻法和反应离子刻蚀技术得到微孔金电极(10μm)；
(1.6)使用玻璃刀将芯片进行切割，得到微阵列芯片单元。
3.按照权利要求1所述的一种用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法，其特征在于所述金纳米花微阵列芯片由玻璃、Cr粘附层、金电极层、聚对二甲苯绝缘层、金纳米花微电极组成，所述玻璃上侧依次溅射有Cr粘附层、金电极层，所述Cr粘附层、金电极层上侧沉积有聚对二甲苯绝缘层，所述聚对二甲苯绝缘层形成的微孔中沉积有金纳米花微电极。
4.按照权利要求1所述的一种用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法，其特征在于所述在微阵列芯片的微孔中电沉积金纳米花微电极具体包括以下子步骤：
(2.1)将微阵列芯片依次用丙酮、异丙醇和水清洗1分钟并用氮气吹干。
(2.2)利用恒电压法在电镀液(50mM HAuCl4和0.5M HCl)中进行金纳米花结构电极电沉积。沉积电压为0.5V，沉积时间为200s。
5.按照权利要求1所述的一种用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法，其特征在于所述金纳米花微电极的表面功能化具体包括以下子步骤：
(3.1)将5μM茎环探针(5’-HS-C6-GGCCGTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAACATGATGACGGCC-3’)溶液(含有1M NaCl和10mM Tris-HCl)置于95℃水浴锅中加热10min然后缓慢冷却到室温，得到折叠好的茎环探针；
(3.2)将5μL茎环探针溶液滴在金纳米花结构微阵列芯片上并孵育过夜。
(3.3)用10mM PBS彻底冲洗金纳米花微阵列芯片以除去多余的茎环探针；
(3.4)通过将MCH溶液用10mM PBS溶液稀释至100μM，得到MCH封闭液；
(3.5)将10μL MCH封闭溶液滴加到芯片表面以封闭金纳米花电极表面空余位点；
(3.6)用10mM PBS彻底冲洗金纳米花微阵列芯片以除去多余的MCH，得到用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片。
6.按照权利要求1所述的一种用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法，其特征在于该芯片检测miRNA的方法包括以下步骤：
选用miR-21作为检测对象，制备不同浓度的miR-21溶液(含有10mM PBS,1M NaCl，40mMMgCl2)，取200μL滴加到金纳米花微阵列芯片上，在37℃下进行茎环探针与miR-21之间的碱基互补配对，1h后，用10mM PBS进行清洗，再加入纳米银信号探针(5μL，1nM)25℃下孵育1h以结合被miR-21打开的茎环探针。对用10mM PBS清洗后的金纳米花微阵列芯片进行电化学循环伏安法扫描并绘制miR-21浓度与循环伏安曲线氧化峰电流的对应关系曲线。
7.根据权利要求6所述的一种miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法，其特征在于，纳米银信号探针的制备具体包括以下子步骤：
(a)纳米银制备：在搅拌(700rpm)条件下煮沸柠檬酸三钠(5mM)和单宁酸(0.01mM)溶液的混合物(50mL)。然后向其中加入AgNO3溶液(500μL，25mM)继续煮沸15min得到纳米银溶液。
(b)将纳米银(500μL，1nM)与单链DNA(5μL,100μM)(HS-C6-TTTTTGGCCGTCA)混合，并在0.1M NaCl存在下孵育48h。离心清洗单链DNA修饰的纳米银两次(12000rpm，10min)得到纳米银信号探针。
8.根据权利要求6所述的一种miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法，其特征在于，将金纳米花微阵列芯片作为工作电极、外接参考电极(Ag/AgCl电极)、外接对电极(Pt电极)插入到电化学池中，以0.3M KCl作为底液进行电化学循环伏安扫描。
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