KR20160017374A - 미세소포체 분리 방법 및 미체소포체 분리 장치 - Google Patents

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KR20160017374A
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박민철
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홍종욱
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고려대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 미세소포체 분리 방법 및 미세소포체 분리 장치에 관한 것으로, 본원 발명의 명세서에 기재된 (a) 내지 (d) 단계를 포함하는 미세소포체 분리 방법 및 이를 이용한 미세소포체 분리 장치는, 원심분리법이나 특정 항체에 의존하지 않고도 생물학적 시료로부터 미세소포체를 높은 수준으로 수득하는데 매우 효과적이며, 또한 실험자가 원하는 특정 미세소포체만을 별도의 추가 분류 과정 없이 선택적으로 분리할 수 있는 것이 특징이다.

Description

미세소포체 분리 방법 및 미체소포체 분리 장치{Method and apparatus for separating microvesicle}
본 발명은 미세소포체 분리 방법 및 미세소포체 분리 장치에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (a) 각각 밀도가 다른 제1버퍼, 제2버퍼 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체들을 각기 다른 경로로 주입하여 일정한 지점에서 합류시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 합류된 유체를 제1채널을 통해 흘려보내며 조인 흐름(pinched flow)을 유발하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 제1채널을 통과한 유체를 제1채널에 비해 넓은 채널 폭을 갖는 제2채널을 통해 흘려보내며, 상기 (a) 단계의 밀도가 다른 제1버퍼 및 제2버퍼에 의해 제2채널 속에 형성된 밀도구배에 따라 생물학적 시료 속에 포함된 미세소포체들이 경로를 변경하여 흐르며 분리되는 단계;및 (d) 상기 (c) 단계에서 각기 다른 경로로 분리된 미세소포체들이 상기 (c) 단계의 제2채널과 연결된 복수개의 서로 다른 배출경로로 배출되는 단계를 포함하는, 미세소포체 분리 방법, 상기 방법을 이용한 장치 및 미세유체칩에 관한 것이다.
현재에 급증하는 바이오 정보는 기존의 실험실 분석 시스템으로는 그 신속한 처리가 어려운 실정이다. 이러한 추세에 따라 생명현상의 규명과 신약 개발 및 진단을 위한 생물학적 검출시스템은 미세 유체공학(microfluidics)의 기반 위에서 보다 적은 양으로 빠른 시간에 정확하고 편리하게 시료를 분석하기 위한 미세 종합 분석시스템(μ-TAS : micro-Total Analysis System)과 랩온어칩(lab-on-a-chip)의 형태로 발전하고 있다. 분석의 대상이 되는 대부분의 생화학적 시료는 용액 상태로 존재하기 때문에 액체 시료를 전달하는 기술이 무엇보다도 중요한 요소라고 할 수 있다. 미세 유체 공학은 바로 이러한 미세 유체의 흐름을 조절하는 연구분야로서, 상기 미세 종합 분석시스템과 랩온어칩의 상용화에 기초가 되는 핵심기술을 연구 개발하는 분야이다.
상기 미세 종합 분석시스템은 다수의 실험 단계들과 반응을 거치는 화학 및 생물학 실험과 분석을, 하나의 실험대 위에 존재하는 하나의 유니트(unit)상에서 종합적으로 구현하는 시스템이다. 이러한 미세 종합 분석 시스템은 시료 채취 영역, 미세 유체 회로, 검출기 및 이들을 제어하는 제어기로 구성된다.
또한, 상기 랩온어칩이란 '칩 위의 연구실'이란 의미 그대로 상기 미세 종합 분석시스템의 개념과 기능을 하나의 칩(chip) 상에서 구현한 것을 나타낸다. 따라서, 상기 랩온어칩을 개발하기 위해서는 플라스틱이나 유리, 실리콘 등의 표면에 용액이 흐를 수 있는 미세 채널로 회로를 생성한 후, 시료의 전처리, 분리, 희석, 혼합, 생화학 반응, 검출 등을 하나의 칩에 소형화 및 집적화 시킬 수 있어야만 한다.
한편, 생체 내 미세소포체(마이크로베지클)는 여러 종류의 세포들에 존재하거나 세포로부터 분비되는 막 구조의 작은 소포이다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 (ⅰ)엑소좀: 식균 기원의 직경 30 내지 100 ㎚의 막성 소포, (ⅱ)엑토좀(쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicles, SMVs)이라고도 함): 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 내지 1000 ㎚의 큰 막성 소포, (ⅲ) 세포자살성 수포(apoptotic blebs): 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 내지 5000 ㎚의 소포를 포함한다.
상기 생체 내 미세소포체(마이크로베지클), 예를 들어 엑소좀은 마이크로RNA(microRNA, miRNA)를 포함하며 이러한 miRNA는 암등의 질병 조기진단과 같은 분자진단에 있어서 유용한 마커로 활용 가능하다. 상기와 같이 생체 내 미세소포체들의 중요성 및 가치가 밝혀지고 있지만, 상기 미세소포체들을 수득하는 데는 어려움이 따른다.
기존 마이크로베지클을 분리하는 방법은 마이크로베지클과 항체를 결합시켜 마이크로베지클을 면역-캡쳐하여 분리하는 방법이다. 이러한 방법은 단백질 구조 변화 등에 의한 항체 인식 부위의 마스킹(masking), 마이크로베지클 이질성(heterogeneity), 단백질 상호 작용 등에 의해 분리 또는 검출 타겟에 따라 편향(bias)이 발생할 수 있다. 분리 또는 검출을 위해 복잡한 프로세스나 고가의 장비가 필요할 수 있고, 시료의 소모량이 높을 수 있다. 따라서, 적은 양의 시료로부터 타겟에 비의존적으로 마이크로베지클을 효율적으로 분리하는 것이 필요하다.
또한 기존에 마이크로베지클 또는 엑소좀을 분리하기위해서 일반적으로 윈심분리 방법을 많이 사용하였다. 세포나 조직 시료액에 Ficoll 용액 또는 OptiPrep(Nycomed Pharma, Norway)등의 용액을 첨가하여 원심분리함으로서 마이크로 베지클을 수득하고자 하였다. 그러나 이러한 방법은, 세포나 조직 시료액에 전처리를 요할 뿐만 아니라 많은 양(부피)의 샘플을 필요로 한다. 여러 번의 원심분리 과정을 필요로 하며, 원심분리를 위한 특별한 시약 및 장치를 필요로하여 많은 시간 및 비용이 소요된다. 결과적으로 상기 원심분리를 통해 수득된 마이크로베지클이 포함된 펠렛에는 마이크로베지클 이외에도 이와 밀도나 질량이 유사한 미세 단백질 분자, 세포 파편 등 불순물이 많이 포함되어있다.
또한 기존에 입자나 세포를 처리하기 위해 미세유체학의 연속유동 및 다중층류의 원리를 사용하면, 밀도가 동일한 입자들에 있어서 그것을 크기별로 분리할 수 있는 것으로 알려져 있었다. 그러나 생물학적 시료 속에는 단백질을 비롯하여 미세소포체들과 크기가 유사한 입자(particle)들과 미세소포체와 같은 다양한 크기의 소낭(vesicle)들이 혼재하여 있어, 생물학적 시료로부터 목적하는 미세소포체만을 특이적으로 수득하기 위해 상기 연속유동 및 다중층류의 원리를 적용한 기존의 미세유체칩을 단순히 적용하여 하는 것은 의미가 없었다.
따라서 저비용 고효율로 생물학적 시료로부터 원하는 미세소포만을 선택적으로 고(高)수득할 수 있는 새로운 시스템의 개발이 필요하다.
Hollinshead et al., Vaccinia virus intracellular mature virions contain only one lipid membrane, J Virol. 1999 February; 73(2): 1503-1517. S. A. Glazier et al., Reconstitution of the Pore-Forming Toxin α-Hemolysin in Phospholipid/18-Octadecyl-1-thiahexa(ethylene oxide) and Phospholipid/ n -Octadecanethiol Supported Bilayer Membranes, Langmuir 2000, 16, 10428-10435.
이에 본 발명의 발명자들은 원심분리나 특정 항체에 의존하지 않고도 생물 시료 속에 포함된 미세소포체(마이크로베지클)만을 선택적으로 분리하는 방법에 관해 연구하던 중, 본원 발명의 분리 방법 및 고안 장치를 이용하면 저비용으로 원하는 미세소포체만을 높은 수득율로 얻을 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, (a) 각각 밀도가 다른 제1버퍼, 제2버퍼 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체들을 각기 다른 경로로 주입하여 일정한 지점에서 합류시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 합류된 유체를 제1채널을 통해 흘려보내며 조인 흐름(pinched flow)을 유발하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 제1채널을 통과한 유체를 제1채널에 비해 넓은 채널 폭을 갖는 제2채널을 통해 흘려보내며, 상기 (a) 단계의 밀도가 다른 제1버퍼 및 제2버퍼에 의해 제2채널 속에 형성된 밀도구배에 따라 생물학적 시료 속에 포함된 미세소포체들이 경로를 변경하여 흐르며 분리되는 단계;및 (d) 상기 (c) 단계에서 각기 다른 경로로 분리된 미세소포체들이 상기 (c) 단계의 제2채널과 연결된 복수개의 서로 다른 배출경로로 배출되는 단계를 포함하는, 미세소포체 분리 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서로 다른 밀도(점도)를 갖는 제1버퍼와 제2버퍼가 주입되는 제1주입구 및 제2주입구; 상기 제1버퍼와 제2버퍼에 의해 이동하게 되는 미세소포체가 포함된 생물학적 시료가 주입되는 제3주입구; 상기 제1 내지 제3주입구의 말단이 채널의 일단에 병렬연결된 제1채널; 상기 제1채널에 비해 넓은 채널폭을 갖고, 일단이 상기 제1채널의 타단에 직렬연결된 제2채널; 및 상기 제2채널부의 타단에 병렬연결된 복수 개의 배출부를 포함하며, 상기 제1채널에서 유체의 조인흐름(pinched flow)이 유도되고, 상기 주입된 제1버퍼 및 제2버퍼는 상기 제2채널 내부에서 밀도구배를 형성하고, 생물학적 시료 속에 포함된 미세소포체들은 상기 제2채널에 형성된 밀도구배에 따라 움직이는 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미세소포체 분리장치를 포함하는 상부 기판, 및 상기 상부 기판의 하부에 형성된 하부 기판을 포함하는, 생물학적 시료로부터 미세소포체를 분리하는 미세유체칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 각각 밀도가 다른 제1버퍼, 제2버퍼 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체들을 각기 다른 경로로 주입하여 일정한 지점에서 합류시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 합류된 유체를 제1채널을 통해 흘려보내며 조인 흐름(pinched flow)을 유발하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 제1채널을 통과한 유체를 제1채널에 비해 넓은 채널 폭을 갖는 제2채널을 통해 흘려보내며, 상기 (a) 단계의 밀도가 다른 제1버퍼 및 제2버퍼에 의해 제2채널 속에 형성된 밀도구배에 따라 생물학적 시료 속에 포함된 미세소포체들이 경로를 변경하여 흐르며 분리되는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 각기 다른 경로로 분리된 미세소포체들이 상기 (c) 단계의 제2채널과 연결된 복수개의 서로 다른 배출경로로 배출되는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계에서 복수개의 서로 다른 배출경로 중 어느 하나의 배출 경로로 배출된 분획 내에 포함된 미세소포체의 크기를 측정하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료로부터 단일층(monolayer) 미세소포체와 이중층(bilayer) 미세소포체를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 각각 밀도가 다른 제1버퍼, 제2버퍼 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체들을 각기 다른 경로로 주입하여 일정한 지점에서 합류시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 합류된 유체를 제1채널을 통해 흘려보내며 조인 흐름(pinched flow)을 유발하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 제1채널을 통과한 유체를 제1채널에 비해 넓은 채널 폭을 갖는 제2채널을 통해 흘려보내며, 상기 (a) 단계의 밀도가 다른 제1버퍼 및 제2버퍼에 의해 제2채널 속에 형성된 밀도구배에 따라 생물학적 시료 속에 포함된 미세소포체들이 경로를 변경하여 흐르며 분리되는 단계;및 (d) 상기 (c) 단계에서 각기 다른 경로로 분리된 미세소포체들이 상기 (c) 단계의 제2채널과 연결된 복수개의 서로 다른 배출경로로 배출되는 단계를 포함하는, 미세소포체 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서로 다른 밀도(점도)를 갖는 제1버퍼와 제2버퍼가 주입되는 제1주입구 및 제2주입구; 상기 제1버퍼와 제2버퍼에 의해 이동하게 되는 미세소포체가 포함된 생물학적 시료가 주입되는 제3주입구; 상기 제1 내지 제3주입구의 말단이 채널의 일단에 병렬연결된 제1채널; 상기 제1채널에 비해 넓은 채널폭을 갖고, 일단이 상기 제1채널의 타단에 직렬연결된 제2채널; 및 상기 제2채널부의 타단에 병렬연결된 복수 개의 배출부를 포함하며, 상기 제1채널에서 유체의 조인흐름(pinched flow)이 유도되고, 상기 주입된 제1버퍼 및 제2버퍼는 상기 제2채널 내부에서 밀도구배를 형성하고, 생물학적 시료 속에 포함된 미세소포체들은 상기 제2채널에 형성된 밀도구배에 따라 움직이는 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 장치를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 미세소포체 분리장치를 포함하는 상부 기판, 및 상기 상부 기판의 하부에 형성된 하부 기판을 포함하는, 생물학적 시료로부터 미세소포체를 분리하는 미세유체칩을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 각각 밀도가 다른 제1버퍼, 제2버퍼 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체들을 각기 다른 경로로 주입하여 일정한 지점에서 합류시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 합류된 유체를 제1채널을 통해 흘려보내며 조인 흐름(pinched flow)을 유발하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 제1채널을 통과한 유체를 제1채널에 비해 넓은 채널 폭을 갖는 제2채널을 통해 흘려보내며, 상기 (a) 단계의 밀도가 다른 제1버퍼 및 제2버퍼에 의해 제2채널 속에 형성된 밀도구배에 따라 생물학적 시료 속에 포함된 미세소포체들이 경로를 변경하여 흐르며 분리되는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 각기 다른 경로로 분리된 미세소포체들이 상기 (c) 단계의 제2채널과 연결된 복수개의 서로 다른 배출경로로 배출되는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계에서 복수개의 서로 다른 배출경로 중 어느 하나의 배출 경로로 배출된 분획 내에 포함된 미세소포체의 크기를 측정하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료로부터 단일층(monolayer) 미세소포체와 이중층(bilayer) 미세소포체를 분리하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
(a) 각각 밀도가 다른 제1버퍼, 제2버퍼 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체들을 각기 다른 경로로 주입하여 일정한 지점에서 합류시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 합류된 유체를 제1채널을 통해 흘려보내며 조인 흐름(pinched flow)을 유발하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 제1채널을 통과한 유체를 제1채널에 비해 넓은 채널 폭을 갖는 제2채널을 통해 흘려보내며, 상기 (a) 단계의 밀도가 다른 제1버퍼 및 제2버퍼에 의해 제2채널 속에 형성된 밀도구배에 따라 생물학적 시료 속에 포함된 미세소포체들이 경로를 변경하여 흐르며 분리되는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 각기 다른 경로로 분리된 미세소포체들이 상기 (c) 단계의 제2채널과 연결된 복수개의 서로 다른 배출경로로 배출되는 단계를 포함하는, 미세소포체 분리 방법을 제공한다.
(a) 단계는 각각 밀도가 다른 제1버퍼, 제2버퍼 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체들을 각기 다른 경로로 주입하여 일정한 지점에서 합류시키는 단계이다.
본 발명에서 용어‘밀도’는 물질의 질량을 부피로 나눈 값을 의미한다.
본 발명에서 용어‘비중’은 어떤 물질의 질량과 그것과 같은 체적의 표준물질의 질량과의 비율을 의미하는 것으로, 고체나 액체의 경우에는 표준물질로서 4℃의 물을 사용하며, 기체의 경우에는 일반적으로 0℃에서의 1기압의 공기를 표준으로 한다.
본 발명에서 용어 '유체(fluid)'란 현저한 유동성을 나타내는 물체를 의미하며, 기체와 액체를 포함한다. 본 발명에서 상기 유체는 제1버퍼, 제2버퍼 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유동성 액체 물질을 의미한다.
본 발명에서 용어‘유동’은 액체상태의 물질이 흘러 움직이는 것을 의미한다.
버퍼(buffer, 완충용액)는 외부로부터 어느 정도의 산이나 염기를 가했을 때, 영향을 크게 받지 않고 수소이온농도(pH)를 일정하게 유지하는 용액을 의미한다. 본원 발명에서 버퍼는 채널 속을 흐르며 시료속의 미세소포체를 운반 및 분리하기 때문에 캐리어 버퍼(carrier buffer) 및 분리 액체(partitioning fluid)로서의 역할을 동시에 수행한다.
본원 발명에서 상기 버퍼는 생물학적 시료 속에 포함된 미세소포체의 지질막 구조에 영향을 주지 않는 것이라면 그 종류가 제한되지 않으며, 이는 당업계에 알려져 있다. 예를 들어 인산완충 식염수(Phosphate buffer saline, PBS), 수크로오스를 포함하는 PBS 용액, 글라이신을 포함하는 PBS 용액 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게 수크로오스를 포함하는 PBS 용액일 수 있다.
상기 (a) 단계는 밀도가 서로 다른 2개의 제1 버퍼 및 제2버퍼가 사용되는 것을 특징으로 한다. 상기 제1버퍼 및 제2버퍼는 서로 다른 주입구를 통해 다른 위치에서 주입되는 것으로, 예를 들어 대칭 관계에 있는 상부의 제1주입구 및 하부의 제2주입구를 통해 서로 다른 위치에서 주입된다. 또한 상기 버퍼들의 주입은 시간에 따라 순차적으로 투입하는 방법 또는 동시에 여러 개의 버퍼를 동시에 투입하는 방법 등을 포함하여 주입 방법이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 여러 개의 버퍼를 동시에 투입하는 방법일 수 있다.
본 발명의 상기 제1버퍼 및 제2버퍼의 밀도는 수득하고자하는 미세소포체의 밀도에 따라 당업자가 선택적으로 변경 가능하며 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 0.95 내지 1.2 g/㎤ 밀도범위에서 선택된 서로 다른 밀도를 가지는 것일 수 있다. 상기 제1버퍼 및 제2버퍼의 밀도범위는 바람직하게 1.00 내지 1.25 g/㎤ 일 수 있고, 가장 바람직하게 1.00 내지 1.07 g/㎤ 의 밀도를 가지는 것 일 수 있다.
상기 제1버퍼 및 제2버퍼는 각각의 유체가 서로 다른 종류인 경우 또는 모두 같은 종류인 경우를 모두 포함한다. 상기‘제1버퍼 및 제2버퍼가 모두 같은 종류인 경우에는 상기‘밀도(또는 밀도구배)’는‘농도(또는 농도구배)’와 동일한 의미로서 이해된다.
상기 농도는 일정 질량이나 부피 등에 대해서 해당 성분이 얼마나 많이 포함되어있는 지를 나타내 주는 값으로, 상기 농도는 퍼센트 농도(% 농도), 몰농도(M 농도), 몰랄농도(m 농도), 노르말 농도(N 농도), ppm 등의 다양한 방법으로 산출 할 수 있고, 이는 당해 분야에 널리 알려져 있다.
상기 (a) 단계에 주입되는 제1버퍼 및 제2버퍼의 농도는 수득하고자하는 미세소포체의 밀도에 따라 당업자가 선택적으로 변경할 수 있으며, 예를 들어 상기 (a) 단계에 주입되는 제1버퍼 및 제2버퍼가 수크로오스를 포함하는 PBS 용액인 경우 0.001 내지 2.0 M(몰) 농도의 수크로오스를 포함하는 PBS 용액 일 수 있고, 가장 바람직하게 0.001 내지 0.88 M(몰) 농도의수크로오스를 포함하는 PBS 용액을 사용할 수 있다.
제1버퍼 및 제2버퍼의 점도는 1 내지 100 cp(centipoise, 센티포아즈) 범위에서 선택된 같거나 서로 다른 점도를 가지는 것 일 수 있다.
상기‘미세 소포체(마이크로 베지클)’이란 여러 종류의 세포들에 존재하거나 세포로부터 분비되는 막 구조의 작은 소포를 의미하는 것으로, 세포외 소포(extracellular vesicle)를 포함한다. 세포 외로 분비되는 상기 미세소포체(마이크로베지클)는 (ⅰ) 엑소좀: 식균 기원의 직경 30 내지 100 ㎚의 막성 소포, (ⅱ)엑토좀(쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicles, SMVs)이라고도 함): 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 내지 1000 ㎚의 큰 막성 소포, (ⅲ) 세포자살성 수포(apoptotic blebs): 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 내지 5000 ㎚의 소포를 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 목적하여 수득하고자하는 미세소포체는 바람직하게 엑소좀(exosome)일 수 있다.
상기‘엑소좀’은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소포이다. 엑소좀의 직경은 대략 30-100nm일 수 있다. 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막(plasma membrane)으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포내 특정 구획에서 기원하며 세포밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 그러한 소포들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 부른다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려져 있다. 엑소좀은 정상 상태, 병적 상태, 또는 이 두 상태 하에서 다수의 다른 세포 유형으로부터 분리되어 방출된다고 알려져 있다.
생물학적 시료에는 단백질을 비롯하여 미세소포체들과 크기가 유사한 입자(particle)들과, 미세소포체를 포함하는 다양한 크기의 소낭(vesicle)들이 혼재하여 있다. 상기 소낭 특히 미세소포체(microvesicle)들은 세포 내에서 생성(기원)되는 부위가 다름에 따라 소낭(즉, 베지클)을 구성하는 막 구조 지질층(lipid layer)이 단일층(monolayer) 또는 이중층(bilayer)으로 다양하고 소낭의 크기도 다양하게 존재한다.
본 발명의 상기 미세소포체를 포함하는 생물학적 시료는 목적하는 종류의 미세소포체를 수득할 수 있는 생물 유래 시료를 의미하며 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 체액 또는 세포 배양액을 포함한다. 상기 체액은 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 뇨, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 그의 조합일 수 있다. 상기 세포 배양액은 세포(또는 조직) 배양 후에 세포를 제거시킨 배지(culture medium)를 의미한다. 상기 배지의 조성은 세포로부터 미세소포체를 다량 분비시킬 수 있도록 당업자가 선택적으로 변경할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 컨디션드 배지(conditioned media, 무혈청 배지)배양액 또는 혈청일 수 있다.
또한 상기 시료의 제조시, 당업자가 목적하는 실험 효율에 따라 여과 및 농축 과정이 임의로 추가 될 수 있다. 상기 여과 과정은 공지의 여과 방법에 의할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 원심분리 또는 마이크로필터를 이용한 여과일 수 있다. 상기 농축 과정은 공지의 농축 방법에 의할 수 있으며 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 원심분리법을 이용하여 농축할 수 있다.
본 발명의 상기 미세소포체를 포함하는 생물학적 시료는 바람직하게 세포 배양 후 배양 배지(culture medium) 또는 혈청 농축액일 수 있다.
상기 제1버퍼, 제2버퍼 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료는 주입된 후 일정한 지점에서 합류되어 제1채널로 흘러 들어간다.
이때 상기 제1버퍼, 제2버퍼 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 주입 방법은 (i) 각각 밀도가 다른 제1버퍼 및 제2버퍼의 유체가 각각 다른 경로로 먼저 주입되고, 후속하여 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체를 상기 버퍼 주입 경로 외의 또 다른 경로로 주입하는 것, 또는 (ii) 각각 밀도가 다른 제1버퍼, 제2버퍼 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체들을 각기 서로 다른 경로로 동시에 주입하는 것일 수 있다.
(b) 단계는 상기 (a) 단계에서 합류된 유체를 제1채널을 통해 흘려보내며 조인 흐름(pinched flow)을 유발한다.
본 발명에서 용어‘채널’이란 주입된 유체들이 흐르는 미세한 통로 또는 도관을 의미한다. 본 발명에서 상기 채널의 단면(유체 흐름 방향에 대한 수직 방향) 모양은 제조상의 편이 또는 당업자가 목적하는 바에 따라 선택적으로 변경 될 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 원, 타원, 직사각형, 정사각형 등을 포함한다. 바람직하게 본 발명의 상기 채널의 단면 모양은 직사각형 일 수 있다.
상기 제1채널은 도관의 길이가 1 내지 30 mm 일 수 있으며, 바람직하게 1 내지 5 mm 일 수 있다.
상기 제1채널의 높이(도관의 횡단면 기준)는 50 내지 200㎛ 수 있으며, 바람직하게 95 내지 105 ㎛ 일 수 있다.
상기 제1채널의 너비(폭)는 50 내지 200㎛ 일 수 있으며, 바람직하게 95 내지 105 ㎛ 일 수 있다.
상기‘조인흐름(pinched flow)’은 얇은 채널로 입자가 든 유동(유체)과 버퍼 용액이 든 유동(유체)을 넣어주면 서로 조이게(pinched)되는 현상을 의미하는 것으로, 얇은 채널을 지나 다시 넓은 방(또는 공간, 또는 넓은 도관)이 나오면 입자들은 그들의 지름에 따라 위치가 정해지면서 나오게 되는 것으로 알려져 있다.
(c) 단계는 상기 (b) 단계의 제1채널을 통과한 유체를 제1채널에 비해 넓은 채널 폭을 갖는 제2채널을 통해 흘려보내며, 상기 (a) 단계의 밀도가 다른 제1버퍼 및 제2버퍼에 의해 제2채널 속에 형성된 밀도구배에 따라 생물학적 시료 속에 포함된 미세소포체들이 경로를 변경하여 흐르며 분리되도록 한다.
상기 제2채널은 도관의 길이가 10 내지 70 mm 일 수 있으며, 바람직하게 30 내지 40 mm 일 수 있다.
상기 제2채널의 높이(도관의 횡단면 기준)는 50 내지 200㎛ 일 수 있으며, 바람직하게 95 내지 105 ㎛ 일 수 있다. 상기 (b) 단계의 제1채널 및 상기 (c) 단계의 제2채널은 채널의 횡단면을 기준으로 높이가 동일한 것이 특징이다.
상기 제2채널의 너비(폭)는 2 내지 7mm 일 수 있으며, 바람직하게 4.5 내지 5.5 mm 일 수 있다.
상기 제1채널 및 제2채널을 관통하는 유체(제1버퍼, 제2버퍼 및 생물학적 시료)들은 채널 내부에서 층류를 이루는 것이 그 특징이다. 상기 유체 흐름에 대한 레이놀드 수(Reynolds number)는 주입된 유체들이 마세유체 체널에서 층류를 이루는 한 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 1 내지 1000 인 것을 특징으로 한다. 상기‘레이놀드 수’는 유체 흐름의 형태를 나타내는 중요한 무차원군(dimensionless group)으로, 지름 D, 길이 L인 원형관을 통하여 점도η인 유체가 평균유속 U로 흐를 때 레이놀드 수는 NRe = DUpm로 주어진다. 레이놀드 수가 2100 이하면 흐름은 항상 층류이고, 4000 이상이면 특수한 경우를 제외하고는 난류이다. 또한 레이놀드 수가 2100~4000일 때에는 천이영역(transition region)이라 부르며, 이 영역에서는 장치에 따라 층류 또는 난류가 되며, 불안정하여 약간의 교란만 있어도 흐름의 양상이 달라지는 것으로 알려져 있다.
상기 제2채널에는 상기 (a) 단계에서 주입한 제1버퍼 및 제2버퍼에 의해 채널 내부에 밀도구배가 형성되는 것이 특징이다. 상기 용어‘밀도 구배(density gradient)’는 용매 중에서 연속적 혹은 단계적으로 밀도가 변화하는 것을 의미하며, 밀도 경사, 밀도 기울기 등으로도 칭하며 본 명세서에서 상기 용어들이 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 제2채널에 형성되는 밀도구배는 유체 흐름(flow)에 대한 직각(transverse) 방향으로 형성되는 것이 특징이다.
상기 (b) 단계의 제1채널에서 조여진(pinched) 후 제2채널로 빠져나온 유체에서, 상기 유체에 포함되어있는 미세소포체들은 각각의 밀도별로 제2채널 내부의 특정 위치에 정렬되어 서로 다른 경로로 제2채널을 통과한다.
(d) 단계는 상기 (c) 단계에서 각기 다른 경로로 분리된 미세소포체들이 상기 (c) 단계의 제2채널과 연결된 복수개의 서로 다른 배출경로로 배출되는 단계이다.
상기 (c) 단계에서 제2채널 내부에 각각 정렬된 미세소포체들은 서로다른 배출경로로 배출된다. 상기 배출은 2개 이상의 서로 구분되는 배출구를 통해 이루어지며, 각 배출구별로 수득되는 미세소포체들은 그 특성(예를들어 크기 또는 밀도)이 상이하지만, 동일한 배출구에서 수득된 미세소포체는 그 특성(예를들어 크기 또는 밀도)이 동일하다. 배출구의 개수는 당업자가 목적하는 바에 따라 선택적으로 그 갯수를 설정 할 수 있고 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 9개 일 수 있다.
상기 (d) 단계의 배출경로는 상기 (c) 단계의 제2채널보다 좁은 폭(너비)의 채널인 것이 특징이다. 상기 배출경로의 너비는 50 내지 200㎛ 일 수 있으며, 바람직하게 95 내지 105 ㎛ 일 수 있다.
상기 배출경로의 높이(도관의 횡단면 기준)는 50 내지 200㎛ 일 수 있으며, 바람직하게 95 내지 105 ㎛ 일 수 있다.
상기 배출구들은 도관의 길이가 10 내지 50 mm 일 수 있으며, 바람직하게 35 내지 45 mm 일 수 있다. 상기 배출구들은 길이가 동일 한 것이 바람직하며, 이는 배출구로 나가기까지의 저항을 동일하게 해주기 위함이다. 만일 배출구들의 길이가 동일하지 않으면 저항이 적은 쪽으로 용액이 많이 빠져나가 에러 요인으로 작용한다.
종래에는 생물학적 시료로부터 미세소포체를 분리하기 위하여, 원심분리나 특정 항체를 이용한 면역- 캡쳐 방법을 사용하였다. 그러나 이러한 방법들은 많은 시간과 노력을 요하며, 시료의 양이 많이 필요하고 분리를 위하여 복잡한 프로세스나 고가의 장비가 필요하였다. 또한 상기 방법으로 분리해낸 결과물에는 미세소포체 외에도 저분자량의 단백질 또는 세포 파편 등의 불순물들이 상당히 포함되어있었고 , 미세소포체에 대한 잠재적 손상 가능성을 배재하기 어려워 만족스럽지 않은 결과를 나타냈다.
본원 발명의 상기 (a) 내지 (d) 단계를 포함하는 미세소포체 분리 방법은, 원심분리법이나 특정 항체에 의존하지 않고도 생물학적 시료로부터 미세소포체를 높은 수준으로 수득하는데 매우 효과적이며, 또한 실험자가 원하는 특정 미세소포체만을 별도의 추가 분류 과정 없이 선택적으로 분리할 수 있는 것이 특징이다.
또한 본 발명은
(a) 각각 밀도가 다른 제1버퍼, 제2버퍼 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체들을 각기 다른 경로로 주입하여 일정한 지점에서 합류시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 합류된 유체를 제1채널을 통해 흘려보내며 조인 흐름(pinched flow)을 유발하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 제1채널을 통과한 유체를 제1채널에 비해 넓은 채널 폭을 갖는 제2채널을 통해 흘려보내며, 상기 (a) 단계의 밀도가 다른 제1버퍼 및 제2버퍼에 의해 제2채널 속에 형성된 밀도구배에 따라 생물학적 시료 속에 포함된 미세소포체들이 경로를 변경하여 흐르며 분리되는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 각기 다른 경로로 분리된 미세소포체들이 상기 (c) 단계의 제2채널과 연결된 복수개의 서로 다른 배출경로로 배출되는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계에서 복수개의 서로 다른 배출경로 중 어느 하나의 배출 경로로 배출된 분획 내에 포함된 미세소포체의 크기를 측정하는 단계
를 포함하는, 생물학적 시료로부터 단일층(monolayer) 미세소포체와 이중층(bilayer) 미세소포체를 분리하는 방법을 제공한다.
상기 생물학적 시료로부터 단일층 미세소포체와 이중층 미세소포체를 분리하는 방법에서 (a) 내지 (d) 단계는, 상기 미세소포체 분리 방법에서 전술한 바와 같다.
상기 (e) 단계는 상기 (d) 단계에서 각각의 배출경로를 통해 배출되는 다수개의 분획들 중에서 하나를 선택하여, 상기 분획에 포함된 미세소포체의 크기를 측정하는 단계이다.
상기 크기 측정은 당업계에 알려진 통상의 미세입자 크기측정 방법이라면 그 종류가 제한되지 않으며, 예를 들어 DLS(dynamic light scattering)법, 주사전자현미경(SEM), 투과전자현미경(TEM) 등을 사용할 수 있다.
상기 크기 측정을 통해 상대적으로 크기가 작은 군은 지질-단일층(lipid-monolayer) 의 구조를 가지는 미세소포체로서, 크기가 큰 군은 지질-이중층(lipid bilayer)의 미세소포체로서 이분될 수 있다(실시예 2-4 참조).
상기 (e) 단계에 부가하여, 입자 크기에 따른 분리 수득과정이 추가로 포함 될 수 있다. 상기 분리 수득은 통상의 미세입자 분리수득 방법에 의한 것일 수 있고, 예를 들어 특정 크기의 개구부를 갖는 체, 거름망 또는 필터(filter) 등을 이용하여 분리 될 수 있다.
본 발명의 상기 (a) 내지 (e) 단계를 포함하는 방법은, 생물학적 시료로부터 간편하고, 고효율적으로 미세소포체를 막구조 특성 별로 분리할 수 있는 것이 그 특징이다.
일반적으로 엑소좀 내부 물질의 평균 밀도는 1.22g/cm3, 엑소좀을 구성하는 지질층은 단일층 및 이중층에서 모두 밀도가 0.95g/cm3 인 것으로 알려져 있어(Hollinshead et al., 1999 및 S. A. Glazier et al., 2000), 기존에 원심분리 및 항체를 이용한 방법으로는 실제적으로 sub-micron 크기의 엑소좀(또는 미세소포체)을 각각 지질-단일층 또는 지질-이중층의 막구조 특성별로 분리하여 수득하는 것이 기술적으로 매우 제한되어있었다.
본 발명자들은 sub-micron 크기의 엑소좀들에서 그들의 구조 특성, 밀도 및 크기 특성들 간의 상관관계 즉, 같은 밀도를 갖는 엑소좀이라고 하더라도 지질 이중층의 엑소좀이 지질 단일층의 엑소좀보다 크기가 크다는 사실 규명하였으며, 이를 이용하여 상기 (a) 내지 (e) 단계를 포함하는 방법으로 지질 단일층 및 지질 이중층을 가지는 엑소좀(또는 미세소포체)를 각각 분리 및 수득하였고, 이는 본 발명에서 최초로 공개하는 것이다.
본 발명은 서로 다른 밀도(점도)를 갖는 제1버퍼와 제2버퍼가 주입되는 제1주입구 및 제2주입구; 상기 제1버퍼와 제2버퍼에 의해 이동하게 되는 미세소포체가 포함된 생물학적 시료가 주입되는 제3주입구; 상기 제1 내지 제3주입구의 말단이 채널의 일단에 병렬연결된 제1채널; 상기 제1채널에 비해 넓은 채널폭을 갖고, 일단이 상기 제1채널의 타단에 직렬연결된 제2채널; 및 상기 제2채널부의 타단에 병렬연결된 복수 개의 배출부를 포함하며, 상기 제1채널에서 유체의 조인흐름(pinched flow)이 유도되고, 상기 주입된 제1버퍼 및 제2버퍼는 상기 제2채널 내부에서 밀도구배를 형성하고, 생물학적 시료 속에 포함된 미세소포체들은 상기 제2채널에 형성된 밀도구배에 따라 움직이는 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 장치를 제공한다.
도 1에서 본원 발명의 미세소포체 분리 장치의 대략적 개념이 도시된다. 본원 발명의 미세소포체 분리 장치는 서로 다른 밀도(또는 농도)를 갖는 제1버퍼, 제2버퍼를 주입하는 버퍼 주입부(100), 제3주입구(200), 제1채널(300), 제2채널(400), 배출부(500)를 포함하여 구성된다.
본원 발명의 상기 미세소포체 분리 장치는 2개 이상의 서로 다른 밀도(또는 농도)를 갖는 버퍼를 서로 다른 주입구를 통해 주입하는 것을 특징으로 한다. 따라서 버퍼 주입부(100)는 서로 다른 밀도를 갖는 버퍼를 주입할 수 있도록 2개 이상의 주입구를 가지는 것을 특징으로 하며, 당업자가 필요에 따라 주입구의 갯수를 설정할 수 있고 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 도 2에 도시된 바와 같이 높은 밀도(또는 농도)를 갖는 제1버퍼를 주입하는 제1주입구(101) 및 낮은 밀도(또는 농도)를 갖는 제2버퍼를 주입하는 제2주입구(102)의 최소 두개의 유체 주입구를 갖는 형태일 수 있다.
상기 제1주입구 및 제2주입구는 상하 또는 좌우 대칭으로 구성될 수 있다. 또한 제3주입구는 제1주입구 또는 제2주입구와 일정한 각도를 갖도록 경사지게 구성될 수 있는데, 예를 들어, 수직 방향으로 연결될 수 있다.
주입된 서로 다른 밀도를 가진 제1버퍼 및 제2버퍼는 제1채널(300) 및 제2채널(400)의 중심선 또는 특정 부위(중심선으부터 층류를 이루며 떨어진 특정 부위 )에 정렬되어 흐르게 된다. 이는 상기 제1버퍼 및 제2버퍼의 유체를 주입함에 있어서 상하부 방향으로부터 동일한 압력으로 주입하거나 상이한 압력으로 주입함으로써 가능하며, 또한 유체 흐름을 제어하기 위한 임의의 유체 제어소자가 사용될 수 있다.
측정 대상인 미세소포체가 포함된 생물학적 시료는 제3주입구(200)를 통해 주입되며 제1채널(300)의 일단에서 제1버퍼 및 제2버퍼와 합류한다. 즉, 상기 제1주입구(101), 제2 주입구(102) 및 제3주입구(200)의 말단은 제1채널(300)의 일단에서 서로 일정 각도를 이루며 병렬적으로 연결되어있다. 상기 주입구들을 통하여 유체를 주입하는 방법으로는 (i)상기 서로 다른 밀도를 갖는 제1버퍼 및 제2버퍼의 유체가 각각 제1주입구 및 제2주입구로 먼저 주입되고, 후속하여 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체를 상기 제3주입구로 주입하는 것, 또는 (ii) 상기 서로 다른 밀도를 갖는 제1버퍼, 제2버퍼의 유체 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료를 각각 제1주입구, 제2주입구 및 제3주입구로 동시에 주입하는 것 등이 포함되며, 상기 주입된 3종의 유체들은 제1채널(300)의 일단에서 합류되어 제1채널(300) 및 제2채널(400)을 관통한다.
상기 제1채널(300)의 직경 또는 단면적의 크기는 제2채널보다 좁은 직경 또는 단면적인 것을 특징으로 하며, 이는 전술한 바와 같다. 상기와 같은 제1채널의 특징은 주입된 유체들의 조임 흐름(pinched flow)을 유도하기 위함이며, 따라서 제1채널과 제2채널의 이음부(301)는 깔때기 모양으로 점점 확장되는 형태로 제작될 수 있다.
제2채널(400)은 주입된 유체들과 미세입자들을 배출부(500)로 통과시키는 도관으로서, 전술한 바와 같다. 제2채널(400)에서, 서로 다른 밀도(또는 농도)를 갖는 제1버퍼 및 제2버퍼의 유체들은 확산 현상에 의해 밀도 구배(또는 농도구배)되며, 미세소포체들은 각 밀도 특성에 따라 제2채널 내부의 특정 부위로 이동 및 정렬되고, 유체의 흐름과 동일한 방향으로 계속하여 진행경로를 이어나간다. 그 후, 미세입자들은 유체의 흐름에 의해 배출부(500)로 이동된다.
배출부(500)는 제2채널(400)을 통과하여 분리된 미세소포체들을 포획하는 영역이다. 상기 배출부는 분리된 각기 다른 특성의 미세소포체 입자들을 포획 할 수 있도록 제2채널(400)의 말단에서 갈림길이 형성된 구조를 갖고 있다. 상기 갈림길은 배출부에 다수의 배출구가 형성되는 것을 의미하며, 상기 배출구에 관해서는 전술한 바와 같다. 상기 배출부에서 배출구의 갯수는 당업자의 필요 즉, 당업자가 얻고자하는 미세소포체의 종류 및 미세소포체의 크기에 따라 설정 될 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 예를 들어 도 2에 도시된 바와 같이 9개 일 수 있다.
본 발명은 상기 미세소포체 분리장치를 포함하는 상부 기판, 및 상기 상부 기판의 하부에 형성된 하부 기판을 포함하는, 생물학적 시료로부터 미세소포체를 분리하는 미세유체칩을 제공한다.
본원 발명의 미세소포체 분리 장치를 집적한 미세유체 칩은 도 2 및 도 3을을 참조하여 설명된다. 도 2를 참조하면, 본원 발명의 미세유체 칩은 상기 미세소포체 분리장치를 포함하는(즉, 상기 미세소포체 분리장치의 채널패턴을 포함하는 것을 의미) 상부 기판(100 내지 500의 구성 모두 포함)과, 이의 바닥면을 구성하는 하부 기판 (600)으로 구성 될 수 있다.
상기 미세유체칩을 구성하는 상부 기판 및 하부 기판의 소재는, 당업계에 공지된 미세유체칩 제작 소재라면 그 종류가 제한되지 않으며, 예를 들어 폴리다이메틸실록산(PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA), 폴리아크릴레이트, 폴리카보닐레이트, 폴리사이클릭올레핀, 폴리이미드, 폴리우레탄, 석영(quartz) 및 유리(glass)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 소재인 것일 수 있고, 바람직하게 유리 일 수 있다.
상기 미세유체칩을 구성하는 상부 기판 및 하부 기판은 제작 소재에 따라 당업계에 알려진 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어 패터닝, 마이크로몰딩 등의 방법일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본원 발명의 상기 (a) 내지 (d) 단계를 포함하는 미세소포체 분리 방법은, 원심분리법이나 특정 항체에 의존하지 않고도 생물학적 시료로부터 미세소포체를 높은 수준으로 수득하는데 매우 효과적이며, 또한 실험자가 원하는 특정 미세소포체만을 별도의 추가 분류 과정 없이 선택적으로 분리할 수 있는 것이 특징이다.
도 1은 본 발명에 따른 미세소포체 분리 방법의 원리를 도시한 개념도이다.
도 2는 본 발명에 따른 미세소포체 분리를 위한 미세유체 장치를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 미세소포체 분리를 위한 미세유체 칩의 실제 제작 예시를 나타낸다(즉 도 2의 실제 제작 형태를 나타내며, 각 숫자는 분획별 번호를 나타냄).
도 4는 지질 이중층 또는 단층막을 가지는 엑소좀들에서 크기에 따른 밀도의 변화를 도시한다.
도 5는 수크로오즈를 포함하는 PBS 용액에서, 농도에 따른 밀도 변화를 도시한다.
도 6은 본 발명의 미세유체 칩을 이용해 생물학적 시료를 분리하여 수득된 9개의 분획에서, 각 분획속에 포함된 엑소좀의 크기를 DLS(Dynamic light scattering) 로 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 5번 분획 속에 포함된 엑소좀들의 밀도 특성을 분석한 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 미세유체 칩을 이용해 생물학적 시료를 분리하여 수득된 9개의 분획에서, 엑소좀의 존재를 syntenin-1 을 마커로 하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 미세유체 칩을 이용해 생물학적 시료를 분리하여 수득된 9개의 분획에서 관찰되는 엑소좀의 모양을 전자현미경으로 촬영한 결과이다(대표적으로 5,7,9 분획만 도시).
본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
시료의 제조
RAW 264.7 세포를 DMEM (Hyclone) serum free 배지에서 48시간동안 배양한 뒤 이를 serial-centrifugation (1000g 10min, 10,000g 20min) 방법을 통하여 cell 및 cell debris를 제거하였다. 세포에서 분비된 extracellular vesicles(microvesicle) 이 존재하는 culture medium을 centrifugal filter unit인 Amicon ultra(Millipore)을 사용하여 농축된 시료를 제조하였다. Amicon을 이용한 농축 조건은 500g이다.
SW620 세포를 RPMI (Hyclone) serum free 배지에서 48시간동안 배양한 뒤 위와 같은 과정을 거쳐 extracellular vesicles이 존재하는 농축된 시료를 제조하였다.
<실시예 2>
마이크로베지클(엑소좀)의 분리
<2-1> 마이크로베지클(엑소좀) 구성물의 특성 확인
Hollinshead et al., 1999 및 S. A. Glazier et al., 2000에 의하면 지질 이중층(lipid-bilayer) 또는 지질 단층막(lipid-ㅡmonolayer)을 가지는 엑소좀들에서, 각각의 엑소좀을 이루는 지질층의 두께, 상기 엑소좀들의 밀도 및 엑소좀 내부에 포함되어있는 내부 물질의 밀도는 하기의 [표 1] 및 [표 2]와 같다.
각 엑소좀의 지질층 두께
지질층 개수 두께 (nm)
lipid-bilayer 5
Lipid-monolayer 1.22
엑소좀 구성 성분의 밀도
구성 성분 밀도 ( g/cm3)
엑소좀 내부물질 1.2
lipid-bilayer 0.95
Lipid-monolayer 0.95
미세소포체 또는 엑소좀은 지질층(lipid layer) 내부에 cell 내부 물질이 포함되어있는 형태이다. 상기 [표 2] 에서 보는 바와 같이, 지질층의 밀도는 0.95 g/cm3 이고, 엑소좀 속에 포함된 내부 물질의 평균 밀도는 1.22g/cm3 로서 다양한 크기의 엑소좀이 존재하더라도 밀도는 이 사이의 값임을 알 수 있었다.
<2-2> 엑소좀 크기에 따른 밀도 변화
지질 이중층(lipid-bilayer) 또는 지질 단층막(lipid-monolayer)을 가지는 다양한 엑소좀들을 대상으로, 그 크기에 따른 밀도의 변화를 확인하였다. 구체적으로 상기 Hollinshead et al., 1999 및 S. A. Glazier et al., 2000의 문헌에 기재된 수치를 바탕으로 크기에 따른 밀도를 계산하였다.
그 결과 [도 4]에서 보는 바와 같이, 지질층이 이중층인 경우보다 단층막으로 이루어진 경우에 밀도가 더 큰 것을 확인하였다.
<2-3> 유체의 농도 선정
마이크로베지클을 분리하기 위한 캐리어 유체로서 수크로오즈를 선택하였고, 수크로오스(sucrose) 농도에 따른 밀도 변화를 확인하였다. 구체적으로 1xPBS 에 수크로오스를 용해하여 농도별 수크로오즈 용액을 준비하고, 일정 부피를 피펫으로 정량 후 정밀저울로 무게를 측정하여 밀도를 산출하였다.
[도 5]에서 보는 바와 같이, 수크로오즈 농도가 높아질수록 밀도가 높아졌으며, 엑소좀의 밀도 대역을 생각하여 partitioning fluid로 0.8M 과 1.8M의 sucrose 용액을 사용하였다.
<2-4> 분리 및 DLS를 통한 결과 분석
본 발명의 미세소포체 분리를 위하여 도 3과 같이 실제 미세유체칩을 제작하였고, 미세유체칩을 이용하여 상기 <실시예 1>에서 제작한 시료에서 미세소포체를 분리하였다. 구체적인 실험 방법은 다음과 같다. 3개의 주입구(inlet) 중에서 양쪽에는 각각 1.8M 수크로오즈 용액 및 0.8M 수크로오즈 용액을 10ul/min으로 흘려주었다. 중앙에 있는 주입구에는 상기 <실시예 1>에서 만든 시료를 2.5ul/min 으로 주입하였다. 상기 주입 시간은 60분 동안 이루어졌으며, 100 micron 의 직경을 가지는 미세유체 채널을 통과하여 분리된 9개의 배출구(outlet)에 모인 입자들을 수득하였고, DLS(dynamic light scattering) 법을 이용하여 크기분포 및 밀도를 측정하였다.
그 결과 [도 6]에서 보는 바와 같이, 9개의 각 배출구(outlet)마다 검출되는 미세소포체(엑소좀)의 크기가 다르게 나타났다. 미세소포체의 크기가 커질 수록 비중이 커지므로, 보다 비중이 큰 농도의 용액을 주입한 쪽에서 큰 사이즈의 입자들이 검출되는 경향이 나타났다.
5번 배출구(outlet)의 경우는 약 200nm 대와 900 nm 대의 크기 군을 갖는 입자들이 함께 검출되었는데, 이는 monolayer와 bilayer의 밀도 차이에 의한 결과로 생각할 수 있다. [도 7]에서 보는 바와 같이, 200nm 크기의 monolayer exosome과 900nm 크기의 bilayer exosome은 거의 같은 밀도이다. 이는 입자들이 밀도에 따라 분리된다는 증거이기도 하다.
<2-5> 마이크로베지클의 존재 확인
상기 실시예 <2-4>에서 분리된 9개의 배출구를 통해 수득된 각 분획(fraction)을 가지고 웨스턴 블롯을 수행하여 syntenin-1을 마커로 하여 엑소좀의 존재를 확인하였다.
그 결과 [도 8]에서 보는 바와 같이, 5, 6 및 7번 배출구에서 수득된 분획에서 엑소좀이 존재함을 확인하였다.
< 실시예 3>
마이크로베지클의 분리 및 모양 확인
SW620 세포를 가지고 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 serum free 세포에서 48시간 배양 및 농축하여 시료를 제조하였다. 또한 미세유체 채널의 직경을 50 micron으로 바꾼 것을 제외하고는 상기 실시예 <2-4>와 동일한 장치 및 방법으로 상기 시료를 분리하였다. 분리된 분획들을 가지고 투과전자현미경(TEM)으로 실제 microvesicle 의 모양 및 size를 측정하였다.
그 결과 [도 9]에서 보는 바와 같이, 비중이 큰 농도의 용액을 주입한 쪽(5번 분획)에서는 큰 미세소포체를 관찰 할 수 있었으며, 점점 밀도가 낮아지는 쪽의 분획으로 갈수록(9번 분획) 미세소포체의 크기가 작아지는 것을 관찰 할 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 미세소포체 분리 방법 및 미세소포체 분리 장치에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (a) 각각 밀도가 다른 제1버퍼, 제2버퍼 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체들을 각기 다른 경로로 주입하여 일정한 지점에서 합류시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 합류된 유체를 제1채널을 통해 흘려보내며 조인 흐름(pinched flow)을 유발하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 제1채널을 통과한 유체를 제1채널에 비해 넓은 채널 폭을 갖는 제2채널을 통해 흘려보내며, 상기 (a) 단계의 밀도가 다른 제1버퍼 및 제2버퍼에 의해 제2채널 속에 형성된 밀도구배에 따라 생물학적 시료 속에 포함된 미세소포체들이 경로를 변경하여 흐르며 분리되는 단계;및 (d) 상기 (c) 단계에서 각기 다른 경로로 분리된 미세소포체들이 상기 (c) 단계의 제2채널과 연결된 복수개의 서로 다른 배출경로로 배출되는 단계를 포함하는, 미세소포체 분리 방법, 상기 방법을 이용한 장치 및 미세유체칩에 관한 것이다.
본원 발명의 상기 (a) 내지 (d) 단계를 포함하는 미세소포체 분리 방법은, 원심분리법이나 특정 항체에 의존하지 않고도 생물학적 시료로부터 미세소포체를 높은 수준으로 수득하는데 매우 효과적이며, 또한 실험자가 원하는 특정 미세소포체만을 별도의 추가 분류 과정 없이 선택적으로 분리할 수 있는 것이 특징이므로 산업상 이용가능성이 높다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
100 : 버퍼 주입부
101 : 제1주입구(제1버퍼 주입구)
102 : 제2주입구(제2버퍼 주입구)
200 : 제3 주입구(미세소포체가 포함된 생물학적 시료 주입구)
300 : 제1채널
301 : 제1채널 및 제2채널 이음부
400 : 제2채널
500 : 배출부
501 : 제1 배출구
502 : 제2 배출구
503 : 제3 배출구
504 : 제4 배출구
505 : 제5 배출구
506 : 제6 배출구
507 : 제7 배출구
508 : 제8 배출구
509 : 제9 배출구
600 : 미세유체칩 하부 기판

Claims (33)

  1. (a) 각각 밀도가 다른 제1버퍼, 제2버퍼 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체들을 각기 다른 경로로 주입하여 일정한 지점에서 합류시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 합류된 유체를 제1채널을 통해 흘려보내며 조인 흐름(pinched flow)을 유발하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 제1채널을 통과한 유체를 제1채널에 비해 넓은 채널 폭을 갖는 제2채널을 통해 흘려보내며, 상기 (a) 단계의 밀도가 다른 제1버퍼 및 제2버퍼에 의해 제2채널 속에 형성된 밀도구배에 따라 생물학적 시료 속에 포함된 미세소포체들이 경로를 변경하여 흐르며 분리되는 단계;및
    (d) 상기 (c) 단계에서 각기 다른 경로로 분리된 미세소포체들이 상기 (c) 단계의 제2채널과 연결된 복수개의 서로 다른 배출경로로 배출되는 단계를 포함하는, 미세소포체 분리 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 제2채널은 (b) 단계의 제1채널에 비하여 10 내지 20 배 폭이 넓은 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 제2채널 속에 형성된 밀도구배는 유체 흐름(flow)에 대한 직각(transverse) 방향으로 형성되는 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 각각 밀도가 다른 제1버퍼 및 제2버퍼의 유체가 각각 다른 경로로 먼저 주입되고, 후속하여 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체를 상기 버퍼 주입 경로 외의 또 다른 경로로 주입하는 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 각각 밀도가 다른 제1버퍼, 제2버퍼 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체들을 각기 서로 다른 경로로 동시에 주입하는 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 제2채널에서 유체의 흐름에 대한 레이놀드 수(Reynolds number)는 1 내지 1000인 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에 주입되는 제1버퍼 및 제2버퍼는 0.95 내지 1.2 g/㎤ 밀도범위에서 선택된 서로 다른 밀도를 가지는 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에 주입되는 제1버퍼 및 제2버퍼는 0.5 내지 2.0 M(몰) 농도범위에서 선택된 서로 다른 농도를 가지는 수크로오스를 포함하는 PBS 용액인 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에 주입되는 제1버퍼 및 제2버퍼의 점도는 1 내지 100 cp 범위에서 선택된 같거나 서로 다른 점도를 가지는 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 미세소포체를 포함하는 생물학적 시료는 세포 배양 후 배양 배지(culture medium) 또는 혈청인 것을 특징으로 하는, 미세소포체 분리 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 배출경로는 상기 (c) 단계의 제2채널보다 좁은 폭의 채널인 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 제1채널 및 상기 (c) 단계의 제2채널은 채널의 횡단면을 기준으로 높이가 동일한 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 방법.
  13. 제13항에 있어서, 상기 (b) 단계의 제1채널 및 상기 (c) 단계의 제2채널은 채널의 횡단면을 기준으로 높이가 100 내지 200μm인 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 제1채널은 채널의 폭이 100 내지 200μm인 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 제2채널은 채널의 폭이 2 내지 5mm인 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 방법.
  16. 서로 다른 밀도(점도)를 갖는 제1버퍼와 제2버퍼가 주입되는 제1주입구 및 제2주입구;
    상기 제1버퍼와 제2버퍼에 의해 이동하게 되는 미세소포체가 포함된 생물학적 시료가 주입되는 제3주입구;
    상기 제1 내지 제3주입구의 말단이 채널의 일단에 병렬연결된 제1채널;
    상기 제1채널에 비해 넓은 채널폭을 갖고, 일단이 상기 제1채널의 타단에 직렬연결된 제2채널; 및
    상기 제2채널부의 타단에 병렬연결된 복수 개의 배출부를 포함하며,
    상기 제1채널에서 유체의 조인흐름(pinched flow)이 유도되고, 상기 주입된 제1버퍼 및 제2버퍼는 상기 제2채널 내부에서 밀도구배를 형성하고, 생물학적 시료 속에 포함된 미세소포체들은 상기 제2채널에 형성된 밀도구배에 따라 움직이는 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 장치.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제2채널은 상기 제1채널에 비하여 10 내지 20 배 폭이 넓은 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 장치.
  18. 제16항에 있어서, 상기 제2채널 속에 형성된 밀도구배는 유체 흐름(flow)에 대한 직각(transverse) 방향으로 형성되는 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 장치.
  19. 제16항에 있어서, 상기 서로 다른 밀도를 갖는 제1버퍼 및 제2버퍼의 유체가 각각 제1주입구 및 제2주입구로 먼저 주입되고, 후속하여 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체를 상기 제3주입구로 주입하는 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 장치.
  20. 제16항에 있어서, 상기 서로 다른 밀도를 갖는 제1버퍼, 제2버퍼 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체들을 각각 제1주입구, 제2주입구 및 제3주입구로 동시에 주입하는 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 장치.
  21. 제16항에 있어서, 상기 제2채널에서 유체의 흐름에 대한 레이놀드 수(Reynolds number)는 1 내지 1000인 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 장치.
  22. 제16항에 있어서, 상기 제1버퍼 및 제2버퍼는 0.95 내지 1.2 g/㎤ 밀도범위에서 선택된 서로 다른 밀도를 가지는 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 장치.
  23. 제16항에 있어서, 상기 제1버퍼 및 제2버퍼는 0.5 내지 2.0 M(몰) 농도범위에서 선택된 서로 다른 농도를 가지는 수크로오스 용액인 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 장치.
  24. 제16항에 있어서, 상기 제1버퍼 및 제2버퍼의 점도는 1 내지 100 cp 범위에서 선택된 같거나 서로 다른 점도를 가지는 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 장치.
  25. 제16항에 있어서, 상기 미세소포체를 포함하는 생물학적 시료는 세포 배양 후 배양 배지(culture medium) 또는 혈청인 것을 특징으로 하는, 미세소포체 분리 장치.
  26. 제16항에 있어서, 상기 배출경로는 상기 제2채널보다 좁은 폭의 채널인 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 장치.
  27. 제16항에 있어서, 상기 제1채널 및 제2채널은 채널의 횡단면을 기준으로 높이가 동일한 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 장치.
  28. 제16항에 있어서, 상기 제1채널 및 제2채널은 채널의 횡단면을 기준으로 높이가 100 내지 200μm인 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 장치.
  29. 제16항에 있어서, 상기 제1채널은 채널의 폭이 100 내지 200μm인 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 장치.
  30. 제16항에 있어서, 상기 제2채널은 채널의 폭이 2 내지 5mm인 것을 특징으로 하는 미세소포체 분리 장치.
  31. 제16항의 미세소포체 분리장치를 포함하는 상부 기판, 및 상기 상부 기판의 하부에 형성된 하부 기판을 포함하는, 생물학적 시료로부터 미세소포체를 분리하는 미세유체칩.
  32. 제31항에 있어서, 상기 상부 기판 및 하부기판은 폴리다이메틸실록산(PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA), 폴리아크릴레이트, 폴리카보닐레이트, 폴리사이클릭올레핀, 폴리이미드, 폴리우레탄, 석영(quartz) 및 유리(glass)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 소재인 것을 특징으로 하는, 생물학적 시료로부터 미세소포체를 분리하는 미세유체칩.
  33. (a) 각각 밀도가 다른 제1버퍼, 제2버퍼 및 미세소포체가 포함된 생물학적 시료의 유체들을 각기 다른 경로로 주입하여 일정한 지점에서 합류시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 합류된 유체를 제1채널을 통해 흘려보내며 조인 흐름(pinched flow)을 유발하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 제1채널을 통과한 유체를 제1채널에 비해 넓은 채널 폭을 갖는 제2채널을 통해 흘려보내며, 상기 (a) 단계의 밀도가 다른 제1버퍼 및 제2버퍼에 의해 제2채널 속에 형성된 밀도구배에 따라 생물학적 시료 속에 포함된 미세소포체들이 경로를 변경하여 흐르며 분리되는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 각기 다른 경로로 분리된 미세소포체들이 상기 (c) 단계의 제2채널과 연결된 복수개의 서로 다른 배출경로로 배출되는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계에서 복수개의 서로 다른 배출경로 중 어느 하나의 배출 경로로 배출된 분획 내에 포함된 미세소포체의 크기를 측정하는 단계
    를 포함하는, 생물학적 시료로부터 단일층(monolayer) 미세소포체와 이중층(bilayer) 미세소포체를 분리하는 방법.
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