CN107090399B - 痰液样品中病原菌的快速提纯装置及快速提纯方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种痰液样品中病原菌的快速提纯装置，包括病原菌收集通道和由串联的分离单元构成的主通道，多个串联的分离单元形成串状结构，所述串状结构与病原菌收集通道平行；每个分离单元包括至少有部分凸起朝向所述病原菌收集通道的弧形部分，弧形部分的凸起与所述病原菌收集通道通过栅栏连接。本发明还提出一种痰液样品中病原菌的快速提纯方法。本发明提出的痰液样品中病原菌的快速提纯装置操作方便，操作时只需要简单将样品推过芯片即可。稳定性高，对不同的流速大小，不同粘度的样品，不同细菌比率的样本，分离去除动物细胞的效率稳定在99％以上，收集病原菌能保持接近原样品一半的水平。

Description

痰液样品中病原菌的快速提纯装置及快速提纯方法
技术领域
本发明属于医疗诊断领域，具体涉及一种含有细胞的样品中细菌 的分离装置和分离方法。
背景技术
人的痰液样本主要由人体分泌物，人的免疫细胞，病原菌等微生 物组成，是潜在的一个重要无创医疗诊断的信息来源。在使用抗生素 前，往往需要对病原菌进行培养并作耐药性分析以避免抗生素的滥 用。在这个过程中，病原菌的培养难度比较大，同时需要在治疗前消 耗大量的时间。而目前在做痰液病原菌基因组分析，或者利用微液滴 技术做实时定量PCR检测的过程中，存在样本难以去除痰液中有的大 量的人的免疫细胞的问题，样品难以满足基因组分析或者微液滴定量 PCR的需求。
微流控技术是近几年飞速发展的前沿学科，凭借其用量少、高通 量和易于集成等优点，现已成为生物样品分析领域中一个强有力的手 段。近来，微流控装置(Morijiri,T.et al.,2011.Sedimentation pinched-flow fractionation for size-and density-based particle sorting in microchannels.Microfluidics and Nanofluidics,11(1),pp.105–110.)也 被广泛用来颗粒样品的分离和提纯。Huang LR等人制作的分离芯片 是基于确定性侧向位移法(deterministic lateral displacement，DLD)原 理设计的。芯片内有与流体流动方向呈一定角度的微柱阵列。不同尺 寸的颗粒在流动过程中与微柱碰撞后具有不同的运动轨迹，尺寸大的 颗粒会发生侧向位移向一侧汇聚，尺寸小的颗粒会按原轨迹运动，从 而达到分离不同尺寸的颗粒(Science.2004,304(5673):987-990)。总体 来说，这些芯片目前还存在需要多路流体控制，分离效率不高，无法 满足真实痰液样本病原菌的纯化等缺点。本发明相对的单位时间上样 量更大，能够手动上样，操作更为简便。
发明内容
为了解决本领域存在的问题，本发明在痰液样本中病原菌的快速 提纯上做了有益改进。本发明的第一个目的是提出一种痰液样品中病 原菌的快速提纯装置。
本发明的第二个目的是提出一种痰液样品中病原菌的快速提纯 方法。
实现本发明上述目的的技术方案为：
一种痰液样品中病原菌的快速提纯装置，包括病原菌收集通道和 由串联的分离单元构成的主通道，多个串联的分离单元形成串状结 构，所述串状结构与病原菌收集通道平行；每个分离单元包括至少有 部分凸起朝向所述病原菌收集通道的弧形部分，弧形部分的凸起与所 述病原菌收集通道通过栅栏连接。
其中，所述快速提纯装置包括上层芯片和下层芯片，所述主通道 和病原菌收集通道设置在中层芯片上，在上层芯片上一端设置有进液 孔，另一端设置有病原菌收集孔和废液收集孔，所述进液孔与所述分 离单元串状结构的一端连通，所述病原菌收集孔与所述病原菌收集通 道连通，所述废液收集孔与分离单元串状结构的另一端连通。
芯片的下层具有支撑作用，可采用玻片或其他材质的支撑基底。 上层芯片和中层芯片可采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。
本发明优选技术方案之一为，在中层芯片上设置有1～100条串联 单元构成的串状结构和1～100条病原菌收集通道设置，串状结构和病 原菌收集通道相间设置。
更优选地，相邻分离单元的弧形部分之间以“凹”形通道连接， “凹”形底部最窄处宽度d为10～80μm。
其中，所述栅栏包括多个栅栏通道，所述栅栏通道的内径为3～10μm。
其中，分离单元的弧形部分最宽处宽度D为200～900μm，所述 栅栏的宽度为D的5～90％。
上述的分离单元尺寸设计，使样品在主通道内保持层流形式，所 以栅栏的宽度之和为D的5～90％，则可以对样品中5～90％的液体进 行分离。
所述的快速提纯装置，通过以下方法制备而得：
步骤一，将印有所述痰液样品中病原菌快速提纯的装置形状的曝 光掩膜覆盖在涂有光刻胶的硅片上；
步骤二，将步骤一所得硅片曝光，硅片的覆盖有曝光掩膜部分上 的光刻胶在紫外线照射下反应，得到光刻胶模具；
步骤三，将用于制作所述痰液样品中病原菌快速提纯的装置的材 料浇铸在所述光刻胶模具内；
步骤四，将浇铸后得到的产品固化，并与玻片通过氧等离子体键 合得到痰液样品中病原菌快速提纯装置，一种痰液样品中病原菌的快 速提纯方法，包括步骤：
1)样品中病原菌快速提纯的装置的内部抽成5-100Pa的真空；
2)由进液孔填充入0.1％的牛血清蛋白(BSA)溶液备用。
3)将含有细胞的样品液化，从所述进液孔向痰液样品中病原菌 快速提纯的装置推入液化的痰液溶液，所述痰液溶液在所述装置被施 加的压力推入分离单元并由不同的出口收集；
4)收集病原菌收集孔的样本即为提纯后的病原菌样本。
优选地，推入样品的推液速度为0.2～30mL/hr。
本发明的有益效果在于：
本发明提出的痰液样品中病原菌的快速提纯装置，制备简单，流 速快于现有的提纯装置，提纯时不需使用流量泵，可以用于现场或野 外操作。
与现有技术和产品相比，本发明提出的痰液样品中病原菌的快速 提纯装置操作方便，操作时只需要简单将样品推过芯片即可。稳定性 高，对不同的流速大小(0.2-30ml/h)，不同粘度的样品，不同细菌比率 的样本，分离去除动物细胞的效率稳定在99％以上，收集病原菌能保 持接近原样品一半的水平。
附图说明
图1本发明微流控芯片上中下三层结构分解立体图；
图2是本发明的芯片上流道结构俯视图，
图3为主通道部分的流入病原菌收集通道部分的局部放大图
图4为实施例1分离单元局部放大图。
图5为流式细胞仪检测芯片分离KYSE30-GFP细胞 /T23101-cherry细菌混合液的效果；a)为数量比约为1:1的 KYSE30-GFP细胞与细菌T23101-cherry混合上样液；b)废液收集通 道收集部分；c)病原菌收集通道收集部分；P1：GFP区，P2：cherry 区；
图6为本发明痰液样本进样前(图6之a))和病原菌收集通道 收集(图6之b))的共聚焦荧光显微图；
图中，1为上层芯片，101为进液孔，102为病原菌收集孔，103 为废液收集孔；2为中层芯片，201为病原菌收集通道，202为废液 收集通道，203为主通道，204为栅栏；3为玻片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所 熟知的常规手段。
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1芯片结构及制备
参见图1，本快速提纯装置包括具有上中下三层结构的微流控芯 片。中层芯片2上设置有主通道203、废液收集通道202和病原菌收 集通道201；本实施例中，在中层芯片2上设置有8条串联单元构成 的串状结构和12条病原菌收集通道，串状结构和病原菌收集通道相 间平行设置。在上层芯片1上一端设置有进液孔101，另一端设置有 病原菌收集孔102和废液收集孔103，所述进液孔与所述分离单元串 状结构的一端连通，所述病原菌收集孔与所述病原菌收集通道连通， 所述废液收集孔与分离单元串状结构的另一端连通。下层为玻片3， 起支撑作用。
参见图2，中层芯片上设置有多个串联的分离单元和病原菌收集 通道201，串联单元构成的串状结构与病原菌收集通道201平行，每 个分离单元包括多个有部分为弧形的主通道203，相邻分离单元的弧 形主通道以“凹”形通道相连，使各分离单元串联连接成为串状的结 构，主通道中的弧形凸起部分通过栅栏与所述病原菌收集通道连接。 图2中箭头表示推液方向。
参见图3，本实施例中，相邻分离单元的弧形部分之间以“凹” 形通道连接，“凹”形底部最窄处宽度d为40μm。栅栏包括多个栅栏 通道，所述栅栏通道的内径(宽)为4μm。主通道203弧形部分最宽 处宽度D为500μm，栅栏的宽度为D的20％。
本快速提纯装置，通过以下方法制备而得：
步骤一，将印有所述痰液样品中病原菌快速提纯的装置形状的曝 光掩膜覆盖在涂有光刻胶的硅片上；
步骤二，将步骤一所得硅片曝光，硅片的覆盖有曝光掩膜部分上 的光刻胶在紫外线照射下反应，得到光刻胶模具；
步骤三，将用于制作所述痰液样品中病原菌快速提纯的装置的 PDMS材料浇铸在所述光刻胶模具内；
步骤四，将浇铸后得到的产品固化，并与玻片通过氧等离子体键 合得到痰液样品中病原菌快速提纯装置。
实施例2：芯片的使用以及分离效率的检测
分别以KYSE30-GFP细胞与红光标记细菌T23101-cherry模拟痰 液中的脱落细胞与病原菌，以一定数量比混合，通过快速提纯装置芯 片分离检测细胞与细菌分离效率。具体步骤是，胰酶消化稳定转染 GFP食管癌细胞KYSE30-GFP(绿光)，加入10％FBS RPM1640培养基终止，1000rpm离心5min，去除上清，加入含4％胎牛血清PBS (PH＝7.4)，细胞计数，调整细胞浓度0.5-1X106个/ml。挑取红光标 记细菌T23101-cherry至2ml LB培养基(AMP+)37℃200rpm培养 过夜，4000rpm离心5min，去除上清，加入PBS涡旋震荡悬浮细菌， 倍比稀释菌液后，计数细菌。
取500μl细胞悬液，加入400μl PBS(PH＝7.4)共3管，第一管 加入108个/ml细菌(100μl)，以下各管10倍比稀释，比例见表1第 一行。
将实施例1的病原菌快速提纯的装置的内部抽成10Pa的真空， 并由进液孔填充入0.1％的牛血清蛋白(BSA)溶液备用。以流速 10mL/hr手动推入样品，收集病原菌收集孔收集(分离的细菌部分) 与废液收集孔部分，利用BD FACSAria流式细胞仪检测细胞与细菌比率(图5)。根据流式结果，分析不同浓度细菌条件下细胞去除效 率与细菌回收率。通过表1定量的分析结果可以看出，测试样品中的 细胞滤除率应在99％以上。
表1：不同细菌密度样品纯化前后对比
初始细菌/细胞密度比 10 1 1/10
纯化后细菌/细胞密度比 2000 916 162
实施例3：痰液样本的分离效率检测
痰液样本经Saccomanno-DTT法液化后，加入细菌 BW25113(GFP+)后通入痰液样品中病原菌快速提纯的装置进行分离。 操作方法同实施例2。液化痰液分离后加入Hoechst33342(100×) 染色10min,3000rpm离心3min，PBS洗一次，1/50体积PBS悬起， 取1μl滴于载玻片，盖玻片封片后，激光扫描共聚焦显微镜分析芯片 分离液化痰液中细胞与细菌的效果，参见图6。同时以GFP基因代表 细菌，人BTF基因代表细胞，对原样与纯化收集样进行RT-PCR，检 测分析痰液样本中细胞与细菌的分离效率。
GFP引物(PCR产物长度168bp)：
引物GFP F：5’TGTTCCATGGCCAACACTTG 3’
引物GFP R：5’GCACGTGTCTTGTAGTTCCC 3’
Taqman探针：5’FAM-CGCGTATGGTCTTCAATGCT-BHQ-1 3’
BTF引物(PCR产物长度148bp)：
引物BTF F：5’ATGAGACGACCTTATGGGTAC 3’
引物BTF R：5’TTGGACTCCTGGAACGTGAA 3’
RT-PCR反应条件
结果见表2，RT-PCR的结果显示动物细胞的信号去除率达到 99％以上，而细菌的RT-PCR信号的回收信号大致都能保持在30％以 上。
表2不同细菌密度的痰液样本的RTPCR结果
细菌浓度个/ml 细菌回收率，％ 细胞去除率，％
10<sup>7</sup> 51.15 99.98
10<sup>6</sup> 39.05 99.99
10<sup>5</sup> 44.03 99.96
10<sup>4</sup> 33.56 99.99
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以 做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院北京基因组研究所
<120> 痰液样品中病原菌的快速提纯装置及快速提纯方法
<130> KHP171111763.8TQ
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgttccatgg ccaacacttg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcacgtgtct tgtagttccc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgcgtatggt cttcaatgct 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgagacgac cttatgggta c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttggactcct ggaacgtgaa 20

Claims (8)

1.一种痰液样品中病原菌的快速提纯装置，其特征在于，包括病原菌收集通道和由串联的分离单元构成的主通道，多个串联的分离单元形成串状结构，所述串状结构与病原菌收集通道平行；每个分离单元包括至少有部分凸起朝向所述病原菌收集通道的弧形部分，弧形部分的凸起与所述病原菌收集通道通过栅栏连接；
相邻分离单元的弧形部分之间以“凹”形通道连接，“凹”形底部最窄处的宽度d为10～80μm。
2.根据权利要求1所述的快速提纯装置，其特征在于，所述快速提纯装置包括上层芯片和下层芯片，所述主通道和病原菌收集通道设置在中层芯片上，在上层芯片上一端设置有进液孔，另一端设置有病原菌收集孔和废液收集孔，所述进液孔与所述分离单元串状结构的一端连通，所述病原菌收集孔与所述病原菌收集通道连通，所述废液收集孔与分离单元串状结构的另一端连通。
3.根据权利要求2所述的快速提纯装置，其特征在于，在中层芯片上设置有1～100条串联单元构成的串状结构和1～100条病原菌收集通道设置，串状结构和病原菌收集通道相间设置。
4.根据权利要求1～3任一项所述的快速提纯装置，其特征在于，所述栅栏包括多个栅栏通道，所述栅栏通道的内径为3～10μm。
5.根据权利要求1～3任一项所述的快速提纯装置，其特征在于，所述分离单元的弧形部分最宽处宽度D为200～900μm，所述栅栏的宽度为D的5～90％。
6.根据权利要求1～3任一项所述的快速提纯装置，其特征在于，通过以下方法制备而得：
步骤一，将印有所述痰液样品中病原菌快速提纯的装置形状的曝光掩膜覆盖在涂有光刻胶的硅片上；
步骤二，将步骤一所得硅片曝光，硅片的覆盖有曝光掩膜部分上的光刻胶在紫外线照射下反应，得到光刻胶模具；
步骤三，将用于制作所述痰液样品中病原菌快速提纯的装置的材料浇铸在所述光刻胶模具内；
步骤四，将浇铸后得到的产品固化，并与玻片通过氧等离子体键合得到痰液样品中病原菌快速提纯装置。
7.一种利用权利要求1～6任一项所述的提纯装置提取痰液样品中病原菌的方法，其特征在于，包括步骤：
1)样品中病原菌快速提纯的装置的内部抽成5-100Pa的真空；
2)由进液孔填充入0.1％的牛血清蛋白溶液备用；
3)将含有细胞的样品液化，从所述进液孔向痰液样品中病原菌快速提纯的装置推入液化的痰液溶液，所述痰液溶液在所述装置被施加的压力推入分离单元并由不同的出口收集；
4)收集病原菌收集孔的样本即为提纯后的病原菌样本。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤3)中，推入样品的推液速度为0.2～30mL/hr。
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