CN104893963A - 用于捕获空气中真菌孢子的微流控芯片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测分析技术领域，涉及一种可以捕获富集空气中的真菌孢子的微流控芯片及其制备方法。该芯片为双层结构，以弹性聚二甲基硅氧烷为材料，采用塑模法制备。芯片内含有气体流动通道和孢子截留通道，呈辐射状排列，汇聚于芯片中央的抽气孔，与往复泵相连接。通过往复泵抽气，在芯片内形成振荡气流，从而对空气中的真菌孢子进行沉积吸附和截留捕获，实现对空气真菌孢子的有效富集，并能够通过与PCR等微流控芯片结合进行分子生物学分析，从而达到对空气真菌孢子的含量和种类进行快速检测。本发明具有快速、便携和低价的特点，可用于针对空气真菌的现场快速检测分析。

Description

用于捕获空气中真菌孢子的微流控芯片及其制备方法
技术领域
本发明属于生物检测分析技术领域，具体涉及一种可以捕获富集空气中真菌孢子的微流控芯片，并提供了该芯片的制备方法。
背景技术
空气微生物具有传播快和范围广的特点，一旦爆发疫情，会迅速扩散而造成极大的社会恐慌，因此开发针对空气微生物的快速检测分析技术至关重要。空气中的真菌孢子的尺寸约10-50μm，可以粘附在大气气溶胶颗粒上并随风扩散传播，容易导致人呼吸道传染疾病和手术后医院院内感染(HAI)，对公民健康造成严重威胁。此外，空气真菌孢子随风飘落在农业作物上，容易引发大范围的真菌感染疫情，造成粮食减产，从而威胁食品安全。
当前，依据我国针对空气微生物的检测方法和卫生标准(GB/T18204.3-2013)，针对空气中的真菌的分析方法主要是重力沉降法(如平皿落板)和撞击采样法(如孢子采集器、安德森采样器)，其原理均是先将空气中的真菌或孢子收集到培养基上，然后在28℃经过约5天的培养繁殖，再进行显微镜镜检等分析研究。但是，此类方法中抽气获得的微生物快速撞击在培养基上，极易造成菌株的死亡。而气流速度相对较慢的静电场采样技术则难以有效捕获带电荷较少的气溶胶颗粒。这种技术方法存在的严重缺陷还有：(1)自然界绝大多数真菌尚无法培养，可培养的真菌种类只占总数的不到1％，因此基于培养法的分析技术，其检测对象极为有限。(2)从样本采集到得出分析结果，往往需要一周的时间，无法满足实时快速的需要。目前真正能够实现空气真菌快速监测的平台有美国Lawrence Livermore国家实验室开发的APDS系统(Autonomous Pathogen Detection System)，系结合了气溶胶飞行时间质谱(ATOFMS)，可以同时监测数十种微生物目标。类似的技术还有Pratt等建立的基于离子阱质谱(ITMS)的生物气溶胶监测系统。继911和炭疽菌事件以后，美国已经投资650多亿美元建立了3000多个基于上述技术的生物气溶胶监测站，在全国范围内监测可能出现的各种空气疾病疫情，但这些系统的价格极其昂贵，设备庞大且操作复杂，不利于快速布置和大范围应用。镜检、质谱、核酸和蛋白分析等方法，则对操作人员的专业技能和经验要求较高。传统的免疫学检测方法依赖于特异性抗体的开发，常见微生物的抗体容易获得，但目前环境中大多数微生物尚无商业化抗体，因此是无法检测到的。在我国，为了有效地对公共场所和中央空调出风口的病原细菌和真菌进行实时监测，有关部门对我国空气生物安全检测技术提出了新的要求：(1)分析速度快，有助于早期预警和快速反应；(2)检测通量高，可同时监测多种疾病疫情；(3)便携性好、成本低廉，利于全国范围内的推广普及。但是，现有的技术均无法满足上述三点需求，因此，对空气传播疾病的监测和预防仍是一个世界性难题，也是我国空气生物安全面临的重要挑战。
针对空气真菌疾病的检测分析技术，未来的发展主要集中在检测仪器的微型化、高通量和低成本上，即：(1)便携性强，以满足现场快速布置的需要；(2)检测通量高，以满足针对多种微生物并行分析的需要；(3)制造简单且成本低，以满足大范围普及应用的需要。仪器设备的微型化集中体现在微流控芯片技术平台，以微流控芯片为基础的微型生物分析仪和传感器是未来生物学快速检测技术的一大发展趋势。
微流控技术是近年发展起来的新型交叉学科技术，在微生物检测分析领域已显现出诸多优势。与常规方法相比，微流控芯片平台可以进行微升、纳升甚至皮升级的生物化学反应，极大降低了试剂的消耗量(至少2-3个数量级)。芯片微通道中的传质和传热速率更高，使反应和分析时间都大幅缩短[19]。构建微流控芯片的聚二甲基硅氧烷材料(PDMS)具有良好的物理、化学特性和生物相容性，可以满足绝大部分的生物医学研究应用。同时，多种功能性模块(如微阀门、微泵和光电元件等)都可以集成在芯片中，通过计算机进行精确控制。这种集成化数控式微流控芯片可以方便地对温度、压力等生化反应条件进行更精确的自动化操控，满足不同检测和分析的需要，能够完成很多常规技术难以实现的复杂分析。此外，由于芯片的尺寸都很小，往往只有数平方厘米，重量仅数十克，因此便于携带，特别适合于现场快检的应用。芯片分析产生的废液极少(微升级)，对检测废物的封装和处理也都非常方便。目前，基于微流控技术的多种新型检测分析系统已经相继问世，如自动化PCR分析、肿瘤早期诊断、蛋白结晶分析和单细胞精确定量分析等设备。近年来随着加工制造工艺的不断提高，还可以在芯片内构建数十纳米的超微结构，从而实现对单分子DNA和病毒等纳米尺度的生命物质进行精确操控。可见，以微流控芯片为基础开发的新型生物检测分析设备特别适合于现场快速检测分析和现场得出结果(POCT)的应用。
总之，现有的针对空气真菌孢子的检测技术方法，均存在需耗时数天培养和依赖大型设备难以携带的严重缺陷，不利于现场快速检测。本发明的基于微流控技术的空气真菌孢子捕获富集芯片能够很好的解决上述问题，具有速度快和微型化的优势，可以满足现场快速检测的需要。
发明内容
本发明提供了一种具有高效、便携、低价和制造简单的用于对空气中的真菌孢子进行快速捕获富集的微流控芯片，并提供该芯片的制备方法。。该双层微流控芯片以光学透明材料为基材，由气体流动管道和孢子截留阵列管道对合组成，由往复泵作为芯片的抽气动力源。
本发明的技术方案如下：
一种用于捕获空气中真菌孢子的双层微流控芯片，包括双层芯片结构、往复泵、芯片抽气孔和空气样本进气孔；气体流动层的多条气体流动管道的宽度为700μm，深度为40μm，为光滑平直的凹槽；对应的截留层的多条孢子截留管道含有鱼骨状结构阵列，每一个截留单元的宽度为70μm，深度为70μm，截留单元间距为100μm；气体流动管道与孢子截留管道通过对接键合，组成双层芯片结构。气体流动层的多条管道一端分别含有位于微流控芯片外围的空气样本进气孔，另一端汇聚于微流控芯片中央位置的芯片抽气孔，并与往复泵相连接。
利用连接在芯片中央抽气孔的往复泵进行抽气，将空气样品通过位于芯片边缘的多个进气孔分别进入芯片内的气体流动和孢子截留管道中，并形成振荡气流，空气中的真菌孢子被沉积和截留吸附于管道内壁。然后用微升级的培养基或裂解缓冲液将捕获到的真菌孢子从芯片管道中洗脱；洗脱得到的样品溶液经过处理后直接连接PCR扩增微流控芯片，从而完成现场快速检测分析。
本发明的气体流动管道和孢子截留管道的个数可由实际情况确定，选择18条为宜，也可以根据实际需求增加或减少管道数量。气体流动管道或孢子截留管道之间也可以进行串联或并联。
本发明中微流控芯片的基材为光学透性良好且具有弹性的聚二甲基硅氧烷聚合物(PDMS)。
本发明提供上述双层微流控芯片的制备方法，步骤如下：
(1)基片制备：利用Prianha溶液对单晶硅片进行清洗，用氮气吹干后采用SU-82050系列负光刻胶经旋涂机甩涂后，在恒温加热板上软烘焙，使光刻胶固化；
(2)曝光：将设计好的含有气体流动管道和孢子截留管道的掩膜板分别置于硅片表面，利用紫外曝光机在负光刻胶上进行曝光；
(3)显影：将硅片置于显影液中显影，再用异丙醇清洗干净，用氮气吹干；
(4)烘焙：将硅片置于在加热板上，缓慢加热以固定阳模；
(5)浇注：将聚二甲基硅氧烷单体与固化剂在5:1的比例混匀，分别倾倒在双层芯片的硅基模具上，在烘箱内固化、剥离；
(6)键合：将气体流动管道和孢子截留管道两层PDMS芯片校准后进行对接、键合，再置于80℃高温烘焙过夜，从而完成芯片的构建。
本发明的微流控芯片可以用于捕获富集空气中的真菌孢子，方法是使用收集空气样本的动力装置(往复泵)，通过连接在芯片中央位置的管道进行抽气，并在芯片内形成振荡气流。而后利用培养基或孢子壁裂解液将截留在芯片管道内壁的真菌孢子进行洗脱。洗脱样品可以进行标准培养法分析或经处理后直接进入PCR扩增微流控芯片，完成现场快速检测分析。
该芯片可内置或外接专用的微泵和微阀门，与控制部分(计算机)和操作系统(集成化为微流控芯片和数控界面)相结合，精确控制进样及洗脱过程。
本发明设计的微流控芯片能够快速和高效地捕获富集空气中的真菌孢子，具有体积小、成本低和制造简单的特点，而且能与其它微型检测装置兼容。
附图说明
图1为本发明的微流控芯片结构示意图。
图2为鱼骨状截留阵列结构图。
图中：1往复泵；2芯片抽气孔；3空气样本进气孔。
具体实施方式
1.制备硅基基片：将单晶硅片置于Piranha溶液(98％浓硫酸：30％双氧水＝7：3)，煮沸清洗10分钟，后用去离子水清洗干净，，氮气吹干，并置于200℃烘焙15分钟。
2.甩涂：将SU-82050系列负光刻胶缓慢倾倒在硅片表面，静置5分钟后，用旋涂机(KW-4A型)进行1800转/分钟的甩涂，时间为2分钟，静置1分钟使得光刻胶均匀分布在硅片表面。
3.前烘焙：将硅片置于恒温加热板上进行烘烤，在65℃和95℃温度下分别静置3分钟和6分钟，缓慢降至室温。
4.曝光：将掩膜置于硅片表面固化后的正光胶表面，利用紫外曝光机进行曝光(曝光波长365nm)。
5.显影：将硅片置于负光胶显影液(丙二醇甲醚酯酸酯，PGMEA)中，静置10分钟，之后用异丙醇和去离子水清洗干净，氮气吹干。
6.后烘焙：将硅片阳模置于120℃烘焙20分钟，使其固化完全。
7.气体流动通道层构建：PDMS单体及固化剂按照5:1的比例混合均匀，用真空泵除去其中的气泡，分别倾倒在经过三甲基氯硅烷处理后的样品通道和扩增微室的硅片模具上，置于80℃进行烘烤，形成气体流动通道层。
8.孢子截留通道层：在硅片上甩涂SU-82025系列负光胶，采用PDMS单体与固化剂5:0.8的比例混匀，在旋涂机上以1800转/分钟的速度甩涂2分钟，经过紫外曝光和显影后，形成阳模，于120℃烘焙20分钟使其固化。将阳模置于三甲基硅氧烷熏蒸5分钟，使其表面硅烷化。
9.键合：将固化后的气体流动通道层和孢子截留通道层PDMS胶分别与硅片模具剥离，在微通道层进行打孔后，将两层进行对接，于80℃过夜固化，可形成键合牢固的完整芯片。
将往复泵(图1中标注为1号)与芯片抽气孔(图1中标注为2号)相连接，放置于需要采集空气样本的场所。通过往复泵的抽气作用，使空气样本通过进气孔(图1中标注为3号)进入芯片管道，并形成振荡气流状态。待采样结束后，根据目标检测的真菌种类，选择约10-50μL的不同培养基、吐温缓冲液或孢子裂解液，通过芯片进气孔注入芯片管道，控制适当的液体流速，对管道内截留捕获的真菌孢子进行洗脱。收集芯片洗脱液用于标准培养法分析或直接进行后续PCR扩增分析等。

Claims (6)

1.一种用于捕获空气中真菌孢子的双层微流控芯片，包括双层芯片结构、往复泵、芯片抽气孔和空气样本进气孔；其特征在于,
气体流动层的多条气体流动管道的宽度为700μm，深度为40μm，为光滑平直的凹槽；对应的截留层的多条孢子截留管道含有鱼骨状结构阵列，每一个截留单元的宽度为70μm，深度为70μm，截留单元间距为100μm；气体流动管道与孢子截留管道通过对接键合，组成双层芯片结构；
气体流动层的多条管道一端分别含有位于微流控芯片外围的空气样本进气孔，另一端汇聚于微流控芯片中央位置的芯片抽气孔，并与往复泵相连接。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，微流控芯片的基材为光学透性良好且具有弹性的聚二甲基硅氧烷聚合物。
3.根据权利要求1或2或所述的微流控芯片，其特征在于，气体流动管道和孢子截留管道的个数为18条，根据实际需求增加或减少管道数量。
4.根据权利要求1或所述的微流控芯片，其特征在于，气体流动管道或孢子截留管道之间进行串联或并联。
5.权利要求1、2或4所述的双层微流控芯片的制备方法，其特征在于如下步骤：
(1)基片制备：利用Prianha溶液对单晶硅片进行清洗，用氮气吹干后采用SU-8 2050系列负光刻胶经旋涂机甩涂后，在恒温加热板上软烘焙，使光刻胶固化；
(2)曝光：将设计好的含有气体流动管道和孢子截留管道的掩膜板分别置于硅片表面，利用紫外曝光机在负光刻胶上进行曝光；
(3)显影：将硅片置于显影液中显影，再用异丙醇清洗干净，用氮气吹干；
(4)烘焙：将硅片置于在加热板上，缓慢加热以固定阳模；
(5)浇注：将聚二甲基硅氧烷单体与固化剂在5:1的比例混匀，分别倾倒在双层芯片的硅基模具上，在烘箱内固化、剥离；
(6)键合：将气体流动管道和孢子截留管道两层PDMS芯片校准后进行对接、键合，再置于80℃高温烘焙过夜，从而完成芯片的构建。
6.权利要求3所述的双层微流控芯片的制备方法，其特征在于如下步骤：
(1)基片制备：利用Prianha溶液对单晶硅片进行清洗，用氮气吹干后采用SU-8 2050系列负光刻胶经旋涂机甩涂后，在恒温加热板上软烘焙，使光刻胶固化；
(2)曝光：将设计好的含有气体流动管道和孢子截留管道的掩膜板分别置于硅片表面，利用紫外曝光机在负光刻胶上进行曝光；
(3)显影：将硅片置于显影液中显影，再用异丙醇清洗干净，用氮气吹干；
(4)烘焙：将硅片置于在加热板上，缓慢加热以固定阳模；
(5)浇注：将聚二甲基硅氧烷单体与固化剂在5:1的比例混匀，分别倾倒在双层芯片的硅基模具上，在烘箱内固化、剥离；
(6)键合：将气体流动管道和孢子截留管道两层PDMS芯片校准后进行对接、键合，再置于80℃高温烘焙过夜，从而完成芯片的构建。
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