CN102854235A

CN102854235A - 有序介孔碳构建的妇科肿瘤标志物免疫传感器制备及应用

Info

Publication number: CN102854235A
Application number: CN2012103408121A
Authority: CN
Inventors: 魏琴; 范海霞; 李贺; 张勇; 吴丹; 杜斌; 于海琴; 马洪敏; 庞雪辉; 王志玲; 罗川南; 李慧芝; 范大伟; 曹伟; 朱沛华; 张永芳
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2012-09-15
Filing date: 2012-09-15
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2032-09-15
Also published as: CN102854235B

Abstract

本发明涉及一种有序介孔碳构建的妇科肿瘤标志物免疫传感器制备及应用，属于新型纳米功能材料与生物传感器技术领域。其特征在于：（1）有序介孔碳纳米材料的制备；（2）有序介孔碳-甲苯胺蓝复合材料的制备；（3）妇科肿瘤标志物免疫传感器的制备。本发明的优点在于识别快速、灵敏度高、检测限低、成本低、便于操作，能实现多种妇科肿瘤标志物的高灵敏、特异性、快速准确检测，3min即可完成样品测定，可在短时间内实现批量样品的测定。

Description

有序介孔碳构建的妇科肿瘤标志物免疫传感器制备及应用

技术领域

本发明涉及一种有序介孔碳构建的妇科肿瘤标志物免疫传感器制备及应用。具体是基于有序介孔碳纳米材料和离子液体，构建的检测多种妇科肿瘤标志物的无标记型电化学免疫传感器，用于检测血清中的妇科肿瘤标志物。属于新型纳米功能材料与生物传感技术领域。

背景技术

肿瘤（tumor）是人体组织细胞由于内在和外界致病因素长时间的作用，导致细胞的遗传物质—脱氧核糖核酸（DNA）产生突变，使细胞的生长和分裂失去控制，从而发生异常增生和功能失调。肿瘤严重威胁人民健康，是近年来医学领域中备受重视的重大研究课题。

2010年中国深圳召开的国际抗癌联盟大会预计：到2020年全球每年将有1600万新增癌症患者，每年有1000万人死于癌症。

其中乳腺癌、卵巢癌、多囊卵巢综合症、子宫内膜癌、宫颈鳞癌、子宫颈癌等妇科肿瘤疾病严重影响了广大女性的健康，引起了社会各界和医学领域的广泛关注。

近30年来，癌症发病率每年以3% ~ 5%的速度增长，80%的新发肿瘤在中国、印度、巴西和墨西哥等发展中国家，在世界范围内肿瘤成为第一死亡原因，超过了艾滋病、结核、疟疾加起来的死亡原因。

以2007年为例，世界有790万人口死于癌症，世界卫生组织指出，如果能早期进行诊断并及时治疗，80% ~ 85 %的肿瘤都可以治愈。

肿瘤标志物（tumor marker）是指肿瘤组织及细胞所产生的活性物质的异常表达，并可以此诊断或监测肿瘤的发展。

肿瘤标志物在正常组织或良性疾病不产生或产量甚微，而肿瘤病人的组织、体液及排泄物中则有大量分泌，测得值异常升高。肿瘤标志物在肿瘤普查、诊断、治疗、病情监测、判断预后、评价疗效和高危人群随访观察等方面都具有很大的实用价值。

多少年来妇科肿瘤学家致力于妇科肿瘤早期诊断方法的研究，期望找到一种简易、敏感性特异性高的肿瘤标志物。近十余年来，这项工程得到了飞速地发展，特异性血清检测物的发现，挽救了大量妇科恶性肿瘤患者的生命。在治疗过程中，通过标志物作为病情监测依据，避免了盲目性。

随着现代生物技术包括蛋白质组、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、实时定量聚合酶链式反应（RT-PCR）、荧光原位杂交技术（FISH）和解吸离子化飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）等的飞速发展，逐渐发现了许多有应用前景的肿瘤标志物。

常用的妇科肿瘤标志物有以下几种：甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、绒毛膜促性腺激素（hCG）、糖类抗原CA12-5、糖类抗原CA19-9、糖类抗原CA72-4、鳞状上皮细胞癌抗原（SCC）等，它们对临床及病情监测有重要参考价值。

肿瘤标志物从发现、发展到现在，随着检测手段的不断提高，有许多检测方法。其中，具有推广应用价值或已被广泛应用的主要有：放射免疫分析法（RIA）、酶标记免疫分析技术（EIA）、免疫放射分析法（IRMA）、免疫化学发光分析（CLIA）、时间分辨荧光免疫分析技术（TrFLA）、液体芯片检测技术和SELDI-TOF-MS等。但这些技术一般需要复杂的监测仪器，检测时间长，普及性差，且有些试剂具有放射性，对人体有一定的危害。

电化学免疫传感器是一种将电化学分析方法与免疫学技术相结合而发展起来的生物传感器，其具有灵敏、特异、快速、成本低、操作简单、易数字化和易实现实时输出检测等优点，尤其适合于癌症疾病的诊断。

另外，电化学免疫传感器结合了纳米材料大的比表面积、较强的吸附能力、良好的定向能力和生物兼容性等特点，显著改善了传感器的性能，为电化学免疫传感器的研究和应用开辟了一个新的天地。

有序介孔碳（OMC）是一类新型的介孔材料，1999年合成方法首次被Ryoo等人报道。由于介孔碳具有较高的比表面积、有序的孔径分布，同时具有较高的机械强度、较强的吸附能力，可应用于催化、储氢、吸附等领域。

有序介孔碳的酸碱稳定性良好，合成方法简单，易于制得，其本身是很好的良导体，具有较好的导电性。

本发明采用有序介孔碳-甲苯胺蓝复合材料为电极基体材料，利用离子液体导电率高、电位窗口宽，以及蛋白质可与离子液体通过离子间的相互作用，连接妇科肿瘤肿瘤标志物的抗体、抗原制得无标记电流型免疫传感器。本发明免疫传感器的检出限低，对多种妇科肿瘤标志物的检出限在0.68 ~ 1.3 pg·mL^-1之间。

经对现有妇科肿瘤标志物检测学术研究成果和专利技术的检索发现，Tang等研究了检测CEA的电化学免疫传感器，该传感器的检测限为1.2 ng·mL^-1【参见Tang, D. P., Ren, J. J. Anal. Chem. 2010, 80, 8064-8070.】；CN200910212772.0公开了一种用于检测甲胎蛋白的电化学发光免疫传感器，该传感器的检测限达到0.035 ng·mL^-1。

由此可以看出，本发明的方法灵敏度得到了显著提高，灵敏度均优于以上两种方法，可以准确定量检测多种肿瘤标志物。

发明内容

本发明的目的之一是克服传统检测方法的缺点和不足，结合有序介孔碳纳米材料和离子液体的优势，提供了一种识别快速、灵敏度高、成本低、便于操作的检测多种妇科肿瘤标志物的电化学免疫传感器的制备方法。

本发明的目的之二是将该电化学免疫传感器应用于多种妇科肿瘤标志物的灵敏、特异、快速、准确检测。

为了实现上述目的，本发明技术方案如下：

1. 有序介孔碳构建的妇科肿瘤标志物免疫传感器制备，其特征在于，包括以下步骤：

（1）有序介孔碳纳米材料的制备；

（2）有序介孔碳-甲苯胺蓝复合材料的制备；

（3）妇科肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备。

（1）中所述的有序介孔碳纳米材料的制备，步骤如下：

1）取0.40 ~ 0.50 g苯酚，1.4 ~ 1.8 mL 37%的甲醛溶液，10 ~ 13 mL 0.1 mol·L^-1的NaOH分别加入三口瓶中，70 ℃搅拌反应液0.5 h；

2）预先将0.64 ~ 0.80 g聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物F127溶于44 ~54 mL超纯水中，搅拌溶解，加入1）反应液中，反应16 ~ 18 h，反应液由粉红色转变为红色，当沉淀出现时，停止反应，反应液冷却至室温；

3）加173 ~ 217 mL超纯水于2）得到的反应液中，混合均匀，转移至反应釜中，在马弗炉中130 ℃反应24 h，冷却至室温，离心洗涤，室温真空干燥，得粉末状固体；

4）将3）中粉末状固体放入管式炉，700 ℃保持3 h，即得到有序介孔碳纳米材料。

（2）中所述的有序介孔碳-甲苯胺蓝复合材料的制备，步骤如下：

1）将浓度为2 mg·mL^-1的有序介孔碳溶液与浓度为2 mg·mL^-1的甲苯胺蓝溶液以体积比1 : 0.5 ~ 1 : 2混合，在室温条件下搅拌24 ~ 30 h；

2）离心，用超纯水清洗，采用透析法除去材料中游离的甲苯胺蓝，即制得有序介孔碳-甲苯胺蓝复合材料；

3）将2）中所制得的复合材料重新分散于超纯水中，配制成有序介孔碳-甲苯胺蓝复合材料的混合液A，室温储存下备用。

（3）中所述的妇科肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备，步骤如下：

1）将直径3 ~ 5 mm 的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 mm 的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，超纯水冲洗干净，使电极表面呈镜面；

2）将5 ~ 8 μL混合液A滴涂到步骤1）处理好的玻碳电极表面，室温干燥；

3）将5 ~ 8 μL浓度为10 μg·mL^-1妇科肿瘤标志物抗体滴涂到步骤2）得到的电极表面，4 ℃湿润条件下晾干；

4）将3 ~ 6 μL浓度为100 μg·mL^-1牛血清白蛋白滴涂到步骤3）得到的电极表面，4 ℃湿润条件下晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存，制得妇科肿瘤标志物电化学免疫传感器。

2．本发明所述的制备的有序介孔碳构建的妇科肿瘤标志物免疫传感器，其特征在于，用于妇科肿瘤标志物的检测，步骤如下：

（1）工作曲线的绘制；

（2）妇科肿瘤标志物的检测。

（1）中所述工作曲线的绘制，步骤如下：

1）本发明将所述的妇科肿瘤标志物电化学免疫传感器作为工作电极，在该工作电极表面上滴涂不同浓度的妇科肿瘤标志物抗原标准溶液，4 ℃湿润条件下晾干，超纯水清洗，晾干，4 ℃保存；

2）将参比电极—饱和甘汞电极、对电极—铂柱电极和工作电极正确连接在电化学工作站上；

3）在pH=7.0 ~ 8.0磷酸盐缓冲液中，通过方波伏安法，检测妇科肿瘤标志物抗原标准溶液滴加前后电流响应值的变化；

4）根据所得电流响应值与妇科肿瘤标志物抗原标准溶液浓度的关系，绘制工作曲线。

3. 本发明所述的妇科肿瘤标志物免疫传感器，其特征在于，所述的妇科肿瘤标志物选自下列之一：原位性肿瘤相关物质（糖类抗原CA12-5、糖链抗原CA19-9、糖类抗原CA72-4、糖链抗原CA15-3、鳞状上皮细胞癌抗原SCC、碱性磷酸酶ALP），胎盘性及胚胎性肿瘤相关物质（甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA、组织多肽抗原TPA、人绒毛膜促性腺激素HCG），癌基因、抑癌基因及其产物（乳腺癌易感基因BRCA1、乳腺癌易感基因BRCA2）。

本发明的有益成果

（1）利用有序介孔碳纳米材料大的比表面积、较大的孔体积、优良的导电性能以及对甲苯胺蓝的吸附能力等特点，用有序介孔碳纳米材料作为本发明免疫传感器的电极修饰材料，显著改善了电极的性能。

（2）将离子液体引入本发明免疫传感器的制备中，利用离子液体导电率高，电位窗口宽等特点，及蛋白质可以与离子液体通过离子间的相互作用，连接妇科肿瘤肿瘤标志物的抗体，可增加修饰电极上抗体的固定量，从而提高了妇科肿瘤标志物电化学免疫传感器的灵敏度。

（3）本发明避免了酶的使用，克服了因酶的使用所造成的传感器不稳定，易失活的缺点。

（4）该传感器利用抗原与抗体的特异性结合，显著提高了检测方法的特异性。

（5）本发明改变妇科肿瘤标志物种类即可实现多种妇科肿瘤标志物的高灵敏、特异性检测，方法简单、经济，有利于肿瘤标志物传感器的商品化。

（6）本发明所制备的电化学免疫传感器，操作简单，检测速度快，3min即可完成样品测定，可在短时间内实现批量样品的测定。

附图说明

下面结合附图说明和具体实施例对本发明作进一步详细描述。

图1为有序介孔碳纳米材料的扫描电镜图。

图2为妇科肿瘤标志物免疫传感器的构建过程。

具体实施方式

实施例1

一种有序介孔碳构建的妇科肿瘤标志物免疫传感器制备，包括以下步骤：

（1）有序介孔碳纳米材料的制备，步骤如下：

1）取0.4 g苯酚，1.4 mL 37%的甲醛溶液，10 mL 0.1 mol·L^-1的NaOH分别加入三口瓶中，70 ℃搅拌反应液0.5 h；

2）预先将0.64 g聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物F127溶于44 mL超纯水中，搅拌溶解，加入1）反应液中，反应16 h，反应液由粉红色转变为红色，当沉淀出现时，停止反应，反应液冷却至室温；

3）加173 mL超纯水于2）得到的反应液中，混合均匀，转移至反应釜中，在马弗炉中130 ℃反应24 h，冷却至室温，离心洗涤，室温真空干燥，得粉末状固体；

4）将3）中粉末状固体放入管式炉，700 ℃保持3 h，即得到有序介孔碳纳米材料。纳米材料的形貌见图1，由图1可以看出，有序介孔碳纳米材料为球形介孔结构，其粒径约为100 nm，颗粒均匀。

（2）有序介孔碳-甲苯胺蓝复合材料的制备，步骤如下：

1）将浓度为2 mg·mL^-1的有序介孔碳溶液与浓度为2 mg·mL^-1的甲苯胺蓝溶液以体积比1 : 0.5混合，在室温条件下搅拌24 h；

（3）妇科肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备，结合图2进行制备，步骤如下：

1）将直径3 mm 的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 mm 的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，超纯水冲洗干净，使电极表面呈镜面；

2）将5 μL混合液A滴涂到步骤1）处理好的玻碳电极表面，室温干燥；

3）将5 μL浓度为10 μg·mL^-1妇科肿瘤标志物抗体滴涂到步骤2）得到的电极表面，4 ℃湿润条件下晾干；

4）将3μL浓度为100 μg·mL^-1牛血清白蛋白滴涂到步骤3）得到的电极表面，4 ℃湿润条件下晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存，制得妇科肿瘤标志物电化学免疫传感器。

实施例2

（1）有序介孔碳纳米材料的制备，步骤如下：

1）取0.45 g苯酚，1.6 mL 37%的甲醛溶液，11 mL 0.1 mol·L^-1的NaOH分别加入三口瓶中，70 ℃搅拌反应液0.5 h；

2）预先将0.72 g 聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物F127溶于49 mL超纯水中，搅拌溶解，加入1）反应液中，反应17 h，反应液由粉红色转变为红色，当沉淀出现时，停止反应，反应液冷却至室温；

3）加195 mL超纯水于2）得到的反应液中，混合均匀，转移至反应釜中，在马弗炉中130 ℃反应24 h，冷却至室温，离心洗涤，室温真空干燥，得粉末状固体；

（2）有序介孔碳-甲苯胺蓝复合材料的制备，步骤如下：

1）将浓度为2 mg·mL^-1的有序介孔碳溶液与浓度为2 mg·mL^-1的甲苯胺蓝溶液以体积比1 : 1混合，在室温条件下搅拌27 h；

1）将直径4 mm 的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 mm 的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，超纯水冲洗干净，使电极表面呈镜面；

2）将6 μL混合液A滴涂到步骤1）处理好的玻碳电极表面，室温干燥；

3）将6 μL浓度为10 μg·mL^-1妇科肿瘤标志物抗体滴涂到步骤2）得到的电极表面，4 ℃湿润条件下晾干；

4）将5 μL浓度为100 μg·mL^-1牛血清白蛋白滴涂到步骤3）得到的电极表面，4 ℃湿润条件下晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存，制得妇科肿瘤标志物电化学免疫传感器。

实施例3

一种有序介孔碳构建的妇科肿瘤标志物免疫传感器的制备，包括以下步骤。

（1）有序介孔碳纳米材料的制备，步骤如下：

1）取0.50 g苯酚，1.8 mL 37%的甲醛溶液，13 mL 0.1 mol·L^-1的NaOH分别加入三口瓶中，70℃搅拌反应液0.5 h；

2）预先将0.80 g 聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物F127溶于54 mL超纯水中，搅拌溶解，加入1）反应液中，反应18 h，反应液由粉红色转变为红色，当沉淀出现时，停止反应，冷却至室温；

3）加217 mL超纯水于2）得到的反应液中，混合均匀，转移至反应釜中，在马弗炉中130 ℃反应24 h，冷却至室温，离心洗涤，室温真空干燥，得粉末状固体；

（2）有序介孔碳-甲苯胺蓝复合材料的制备，步骤如下：

1）将浓度为2 mg·mL^-1的有序介孔碳溶液与浓度为2 mg·mL^-1的甲苯胺蓝溶液以体积比1 : 2混合，在室温条件下搅拌30 h；

1）将直径5mm 的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 mm 的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，超纯水冲洗干净，使电极表面呈镜面；

2）将8 μL混合液A滴涂到步骤1）处理好的玻碳电极表面，室温干燥；

3）将8 μL浓度为10 μg·mL^-1妇科肿瘤标志物抗体滴涂到步骤2）得到的电极表面，4 ℃湿润条件下晾干；

4）将6 μL浓度为100 μg·mL^-1牛血清白蛋白滴涂到步骤3）得到的电极表面，4 ℃湿润条件下晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存，制得妇科肿瘤标志物电化学免疫传感器。

实施例4

实施例1 ~ 3制备的有序介孔碳构建的妇科肿瘤标志物免疫传感器，分别用于妇科肿瘤标志物检测，包括以下步骤：

3）在pH=7.0 ~ 8.0磷酸盐缓冲液中，通过方波伏安法检测妇科肿瘤标志物抗原标准溶液滴加前后电流响应值的变化；

实施例5 原位性肿瘤相关物质：CA12-5、CA15-3或CA19-9

一种有序介孔碳构建的妇科肿瘤标志物免疫传感器制备及应用，包括以下步骤：

（1）选择原位性肿瘤相关物质，按照实施例1~3所述的步骤制备电化学免疫传感器；

（2）按照实施例4所述的步骤绘制工作曲线；

（3）原位性肿瘤相关物质的检测技术指标见表1。

表1 原位性肿瘤相关物质的检测技术指标

肿瘤标志物	线性范围，ng·mL^-1	检测限，pg·mL^-1
			CA12-5	0.002 ~ 20	1.1
CA15-3	0.002 ~ 25	1.3
			CA19-9	0.003 ~ 30	1.1

由表1检测技术指标的结果表明，该电化学免疫传感器用于原位性肿瘤相关物质的检测，其线性范围宽，检测限低，方法灵敏度高。

实施例6 胎盘性及胚胎性肿瘤相关物质：AFP、CEA或TPA

（1）选择胎盘性及胚胎性肿瘤相关物质，按照实施例1~3所述的步骤制备电化学免疫传感器；

（2）按照实施例4所述的步骤绘制工作曲线；

（3）胎盘性及胚胎性肿瘤相关物质的检测技术指标见表2。

表2 胎盘性及胚胎性肿瘤相关物质的检测技术指标

肿瘤标志物	线性范围，ng·mL^-1	检测限，pg·mL^-1
			AFP	0.002 ~ 25	1.2
CEA	0.001 ~ 30	0.72
			TPA	0.002 ~ 30	0.98

由表2检测技术指标结果表明，该电化学免疫传感器用于胎盘性及胚胎性肿瘤相关物质的检测，其线性范围宽，检测限低，方法灵敏度高。

实施例7 癌基因、抑癌基因及其产物：BRCA1或BRCA2

（1）选择癌基因、抑癌基因及其产物，按照实施例1~3所述的步骤构建电化学免疫传感器；

（2）按照实施例4所述的步骤绘制工作曲线；

（3）癌基因、抑癌基因及其产物的检测技术指标见表3。

表3 癌基因、抑癌基因及其产物的检测技术指标

肿瘤标志物	线性范围，ng·mL^-1	检测限，pg·mL^-1
			BRCA1	0.005 ~ 20	0.68
BRCA2	0.005 ~ 20	0.95

由表3检测技术指标结果表明，该电化学免疫传感器用于癌基因、抑癌基因及其产物的检测，其线性范围宽，检测限低，方法灵敏度高。

实施例8 人血清中妇科肿瘤标志物的检测

（1）新鲜血液5.0 mL，静置12 h，取上层清液，离心，取血清0.5 mL，用磷酸盐缓冲溶液稀释，备用。

（2）向血清中加入一定质量浓度的妇科肿瘤标志物抗原标准溶液，以处理好的血清为空白，进行加标回收实验，按照实施例4所述的步骤进行检测，测定样品中妇科肿瘤标志物的回收率，检测结果见表4。

由表4检测结果可知，结果的相对标准偏差（RSD）小于3.7%，平均回收率为98.0%~ 102%，表明本发明用于人血清中多种妇科肿瘤标志物的检测，方法的精密度高，结果准确可靠。

Claims

1.一种有序介孔碳构建的妇科肿瘤标志物免疫传感器的制备，其特征在于，包括以下步骤：

（1）有序介孔碳纳米材料的制备；

（2）有序介孔碳-甲苯胺蓝复合材料的制备；

（3）妇科肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备。

2.如权利要求1所述的有序介孔碳构建的妇科肿瘤标志物免疫传感器的制备，其特征在于，所述有序介孔碳纳米材料的制备，步骤如下：

（1）取0.40 ~ 0.50 g苯酚，1.4 ~ 1.8 mL 37%的甲醛溶液，10 ~ 13 mL 0.1 mol·L^-1的NaOH分别加入三口瓶中，70 ℃搅拌反应液0.5 h；

（2）预先将0.64 ~ 0.80 g聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物F127溶于44 ~ 54 mL超纯水中，搅拌溶解，加入（1）反应液中，反应16 ~ 18 h，反应液由粉红色转变为红色，当沉淀出现时，停止反应，反应液冷却至室温；

（3）加173 ~ 217 mL超纯水于（2）得到的反应液中，混合均匀，转移至反应釜中，在马弗炉中130 ℃反应24 h，冷却至室温，离心洗涤，室温真空干燥，得粉末状固体；

（4）将（3）中粉末状固体放入管式炉，700 ℃保持3 h，即得到有序介孔碳纳米材料。

3.如权利要求1中所述的有序介孔碳构建的妇科肿瘤标志物免疫传感器的制备，其特征在于，所述有序介孔碳-甲苯胺蓝复合材料的制备，步骤如下：

（1）将浓度为2 mg·mL^-1的有序介孔碳溶液与浓度为2 mg·mL^-1的甲苯胺蓝溶液以体积比1 : 0.5 ~ 1 : 2混合，在室温条件下震荡24 ~ 30 h；

（2）离心，用超纯水清洗，采用透析法除去材料中游离的甲苯胺蓝，即制得有序介孔碳-甲苯胺蓝复合材料；

（3）将（2）中制得的复合材料重新分散于超纯水中，配制成有序介孔碳-甲苯胺蓝复合材料的混合液A，室温储存下备用。

4.如权利要求1中所述的妇科肿瘤标志物免疫传感器的制备，其特征在于，所述电化学免疫传感器的制备步骤如下：

（1）将直径3 ~ 5 mm 的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 mm 的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，超纯水冲洗干净，使电极表面呈镜面；

（2）将5 ~ 8 μL混合液A滴涂到步骤（1）处理好的玻碳电极表面，室温干燥；

（3）将5 ~ 8 μL浓度为10 μg·mL^-1妇科肿瘤标志物抗体滴涂到步骤（2）得到的电极表面，4 ℃湿润条件下晾干；

（4）将3 ~ 6 μL浓度为100 μg·mL^-1牛血清白蛋白滴涂到步骤（3）得到的电极表面，4 ℃湿润条件下晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存，电化学免疫传感器制备完成。

5.如权利要求1~4所述的制备的妇科肿瘤标志物电化学免疫传感器，其特征在于，用于妇科肿瘤标志物的检测，方法如下：

（1）工作曲线的绘制；

（2）妇科肿瘤标志物的检测；

（1）中所述的工作曲线的绘制，步骤如下：

6.如权利要求1 ~ 5所述的妇科肿瘤标志物免疫传感器，其特征在于，所述的妇科肿瘤标志物选自下列之一：原位性肿瘤相关物质（糖类抗原CA12-5、糖链抗原CA19-9、糖类抗原CA72-4、糖链抗原CA15-3、鳞状上皮细胞癌抗原SCC、碱性磷酸酶ALP），胎盘性及胚胎性肿瘤相关物质（甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA、组织多肽抗原TPA、人绒毛膜促性腺激素HCG），癌基因、抑癌基因及其产物（乳腺癌易感基因BRCA1、乳腺癌易感基因BRCA2）。