CN104280438A - 一种电化学生物传感器及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种电化学生物传感器，通过液液界面法合成单分散金纳米薄膜并修饰到ITO电极表面并进一步修饰乙酰胆碱酯酶和壳聚糖，得到复合电化学生物传感器。该电化学生物传感器可以用于检测有机磷农药中甲胺磷，具有较宽的检测范围，低检出限，良好的稳定性与重现性，并可用于蔬菜有机磷农药甲胺磷残留的实样检测。

Description

一种电化学生物传感器及其应用

技术领域

本发明属于生物电化学传感器技术领域，具体地涉及一种电化学生物传感器及其应用。

背景技术

中国农业仪器网曾经报道陕西省对蔬菜中有机磷农药的调查，发现甲胺磷排在检出率与超标率前五位，这说明我国蔬菜农药残留问题依然很严重。利用高效液相色谱/质谱联用(HPLC-MS)或者气相色谱/质谱联用(GC-MS)检测的缺点在于：分析时间长、仪器设备昂贵、需要专业技术人员操作、不适合现场操作。电化学检测快速、灵敏、简便，因此利用甲胺磷抑制乙酰胆碱酯酶对底物乙酰胆碱的催化活性而构建的电化学生物传感器得到普遍研究。Liu等(Xiao T，Ju HX，Chen HY.Direct electrochemistry of horseradish peroxidase immobilized on acolloid/cysteamine-modified gold electrode.Anal.Biochem，2000，278(1)：22-28

Liu SQ，Ju HX.Reagentless glucose biosensor based on direct electron transferof glucose oxidase immobilized on colloidal gold modified carbon paste electrode.Biosens.Bioelectron.，2003，19(3)：177-183)，分析了纳米金提高传感器性能的原因，认为体系中纳米金可以提高酶的生物活性，增强酶与底物分子之间的作用。纳米金固定酶时具有表面反应活性高、吸附能力强、比表面积大、催化效率高、表面活性中心多等特点，已经成为固定化载体的重要研究对象。但现有的传感器检测范围较窄，稳定性和重现性差，不适宜用于蔬菜有机磷农药甲胺磷残留的实样检测。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种电化学生物传感器，通过在ITO电极表面修饰金纳米薄膜并进一步依次吸附乙酰胆碱酯酶和壳聚糖，从而使得到的复合电极能够用于检测有机磷农药甲胺磷残留，具有检测范围宽，稳定性和重现性好的。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出一种电化学生物传感器，该传感器通过如下步骤制备得到：

(1)用液液界面法在有机相和水相界面间合成单分散金纳米薄膜；

(2)清洗ITO电极并烘干，然后浸入到步骤(1)中的水相中通过提拉将单分散金纳米薄膜覆盖在所述ITO电极上，得到单分散金纳米薄膜修饰的ITO，即Au/ITO电极；

(3)将步骤(2)得到的Au/ITO电极浸泡在乙酰胆碱酯酶溶液中，使乙酰胆碱酯酶吸附到单分散金纳米薄膜表面上，洗涤，得到AChE/Au/ITO传感器。

为了减低金纳米薄膜与ITO电极剥离的可能性，在得到的AChE/Au/ITO传感器表面进一步滴涂壳聚糖溶液，得到Chi/AChE/Au/ITO传感器。

其中，步骤(1)中，液液界面法合成单分散金纳米薄膜的步骤为：首先将PPh₃与HAuCl₄反应形成Au(PPh₃)Cl，然后将其转移到甲苯中形成有机相溶液；其次，将CTAB和NaOH溶解到H₂O中形成水相溶液，并将N₂H₄·H₂O加入到水相中作为还原剂；然后将上述有机相溶液缓缓加入到水相溶液中，当界面出现紫色时表明反应开始进行，反应在50～60℃恒温条件下进行10～12h，随着反应进行，界面的颜色逐渐加深，最后在界面上形成单分散金纳米薄膜。

步骤(3)中，乙酰胆碱酯酶溶液的浓度为0.020～0.040g/L，浸泡条件为在0～8℃下浸泡6～12h。

优选地，步骤(3)中，所述的AChE/Au/ITO传感器用0.1mol/LpH＝7.0的PBS缓冲液进行洗涤。

在壳聚糖修饰的过程中，优选地，所述的壳聚糖溶液的浓度为0.1～0.5wt％，滴加的量为每mm² ITO电极滴加0.25～0.3μl。

优选地，上述传感器中，所述的ITO电极的大小为3mm×6mm。该尺寸的大小取决于制备金膜的菌种瓶大小有关，也和发生电化学反应的电解槽大小有关。可以根据实际需要对尺寸进行选择。

本发明进一步提出了上述的电化学生物传感器在检测有机磷农药中甲胺磷的应用。

有益效果：本发明得到的AChE/Au/ITO传感器在检测有机磷农药甲胺磷时，具有较宽的检测范围，低检出限，良好的稳定性与重现性，并可用于蔬菜有机磷农药甲胺磷残留的实样检测。本传感器可以快速检测有机磷农药残留，避免食用残留超标农产品而引起的中毒事件，为农产品安全生产提供技术保障。

附图说明

图1为界面法合成金纳米粒子(AuNPs)和单分散Au-AChE纳米复合膜的FESEM图，其中，(a)AuNPs(低倍)；(b)AuNPs(高倍)；(c)单分散Au-AChE纳米复合膜；

图2为电极在不同溶液中的循环伏安曲线图，其中，(a)为Au/ITO电极在8mmol/LATCl中的循环伏安曲线；(b)为Au/ITO电极0.1mol/LPBS(pH 7.0)中的循环伏安曲线；(c)为AChE/Au/ITO在8mmol/LATCl中的循环伏安曲线；

图3为AChE/Au/ITO分别在(a)0和(b)10μg/mL甲胺磷标准溶液中的循环伏安曲线；

图4为AChE/Au/ITO对不同浓度甲胺磷的CV响应(从a至1分别为0.005、0.02、0.05、0.2、0.5、1.5、5、5、10、25、50、100μgmL^-1，其中交点处即为5μgmL^-1浓度对应的值)；

图5为AChE/Au/ITO对甲胺磷检测的线性关系。

具体实施方式

以下通过具体的实施例详细说明本发明但不用于限制本发明。

本发明的电化学生物传感器的制备方法及应用步骤如下：

(1)构建电化学生物传感器：

A)利用液液界面法在有机相-水相界面间合成单分散金纳米薄膜：

首先将1.9mg PPh₃加入到25μL 0.24mol/L HAuCl4中反应形成Au(PPh₃)Cl，然后将其转移到5.0mL甲苯中形成有机相溶液；其次，将0.8mg CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)和2mg NaOH溶解到8mL H₂O中形成水相溶液，并将25μLN₂H₄·H₂O加入到水相中作为还原剂；然后将有机相缓缓加入到水相中。当界面出现紫色时表明反应开始进行。反应在60℃恒温条件下进行12h，随着反应进行，界面的颜色逐渐加深，最后在界面上形成了单分散薄膜。

B)ITO电极的修饰：首先将ITO(氧化铟锡)电极裁剪成面积大约为3mm×6mm，用水洗涤、超纯水洗涤，烘干密封保存。将清洗后ITO电极浸入到步骤(A)的水相中通过提拉将单分散纳米薄膜覆盖到ITO电极表面，得到单分散金纳米薄膜修饰的ITO，即Au/ITO电极，然后将有序的单分散金纳米薄膜修饰的ITO(即Au/ITO电极)浸泡在新配制的0.024g/L乙酰胆碱酯酶(AChE)溶液中，在4℃下浸泡12 h使AChE吸附到单分散金纳米薄膜上，从而得到AChE/Au/ITO电极(传感器)。得到的AChE/Au/ITO电极(传感器)用0.1mol/LpH＝7.0的PBS洗涤。最后在电极表面滴涂0.1％的壳聚糖溶液(Chi)，缓慢滴5微升得到Chi/AChE/Au/ITO电极(传感器)，所有电极在使用之前都储存在4℃冰箱中。

构建原理：固定于电极表面的Au-AChE纳米复合膜中的AChE催化氯化乙酰胆碱(ATCl)水解生成硫代胆碱，硫代胆碱在特定电位下产生氧化峰电流。有机磷农药甲胺磷对AChE有抑制作用，当溶液中有机磷农药甲胺磷增多时，AChE催化ATCl水解生成硫代胆碱量减少，氧化峰电流下降。

C)产品的表征：对液液界面法合成的金纳米粒子和单分散Au-AChE纳米复合膜进行表征，结果如图1所示。其中，图(a)为金纳米粒子低倍镜下的FESEM图，图(b)为为金纳米粒子高倍镜下的FESEM图，图(c)为单分散Au-AChE纳米复合膜的FESEM图。从(a)中可以看出AuNPs生长得枝繁叶盛，枝叶之间具有空隙，这样的Au NPs膜比表面积大，分散性好。从(b)中可以看出纳米粒子呈片状生长，片层上有不规则似鱼鳞形状的花纹，直径大约在25～30nm之间。这与Munaiz等研究发现金纳米粒子的尺寸在20nm时电化学响应最好相符合(Escosura-Muniz A，Parolo C，Maran F，A.Size-dependent directelectrochemical detection of gold nanoparticles：application in magnetoimmunoassays.Nanoscale，2011，3(8)：3350-3356)。同时在片层上还生长着类似鱿鱼须上的小乳突，乳突大多在垂直于片层的方向上生长，少数有倾斜，长度在20～60nm之间。从(c)中可以看出纳米粒子好像被覆盖了一层凝胶，小乳突将凝胶鼓起，外形酷似仙人掌表面，说明金膜已经被AChE和壳聚糖包裹。

(2)建立检测方法：将制备的Chi/AChE/Au/ITO电极电极浸入不同浓度的甲胺磷标准溶液中8min，然后转移到电解池中。电解液是pH＝7.0，8mmol/LATCl的PBS缓冲体系，电解池中配置三电极体系，在0～1V进行循环伏安扫描。并根据下面公式计算甲胺磷对酶的抑制率：

$I(\%)=\frac{i_1-i_2}{i_1}\×100\%$

其中，I表示酶的抑制率，i₁表示未浸泡甲胺磷的传感器的峰电流，i₂表示浸泡了甲胺磷的传感器的峰电流，结果如图5所示。在最佳条件下，本发明制备的电化学生物传感器用于甲胺磷检测的线性范围0.005～5μg/mL，5～100μg/mL，最低检出限0.0011μg/mL，并显示出良好的稳定性与重现性，可用于实际样品中甲胺磷的检测。

(3)Chi/AChE/Au/ITO的电化学行为测试：

A)AchE对电极在ATCl中的循环伏安特性的影响：取制备的Au/ITO电极，分别置于8mmol/L ATCl中和0.1mol/L PBS(pH 7.0)中，同时取制备的Chi/AChE/Au/ITO电极置于8mmol/L ATCl中，比较三者的循环伏安曲线，结果如图2所示。其中，(a)为Au/ITO电极在8mmol/L ATCl中的循环伏安曲线；(b)为Au/ITO电极0.1mol/L PBS(pH 7.0)中的循环伏安曲线；(c)为Chi/AChE/Au/ITO电极在8mmol/LATCl中的循环伏安曲线。从图2中可以看出，曲线(a)和(b)没有明显的氧化峰，形成对比的是，曲线c在0.825V出现了一个很明显的不可逆氧化峰，说明AChE催化氯化乙酰胆碱(ATCl)水解生成硫代胆碱，硫代胆碱在特定电位下产生氧化峰电流。

B)甲胺磷对Chi/AChE/Au/ITO电极的循环伏安特性影响：将制备的Chi/AChE/Au/ITO电极分别置于0μg/mL和10μg/mL甲胺磷标准溶液中并检测循环伏安曲线，结果如图3所示。从图3可以看出，当溶液中出现甲磷胺时，电极的氧化峰电流下降。

C)Chi/AChE/Au/ITO电极对甲胺磷的CV响应：将制备的Chi/AChE/Au/ITO电极置于不同浓度的甲胺磷溶液中，检测其循环伏安特性，结果如图4所示。其中，从a至1分别为0.005、0.02、0.05、0.2、0.5、1.5、5、5、10、25、50、100μgmL^-1，其中交点处即为两个5μgmL^-1。

D)Chi/AChE/Au/ITO电极的稳定性测试：将Chi/AChE/Au/ITO电极在4℃下储存12天之后，氧化峰电流仍能保持90％。这说明界面金膜能有效地保持AChE的生物活性。

E)Chi/AChE/Au/ITO电极的重现性测试：使用4组Chi/AChE/Au/ITO电极检测1.5μg/mL甲胺磷，在最优化的条件下，峰电流相对标准偏差为1.6％。证明了传感器的重现性较好。

(4)Chi/AChE/Au/ITO电极的应用。

称取10组黄瓜样品，每组平行3份，每份25.0g。每份样品匀浆于250mL三角锥形瓶中，加入50.0mL乙腈，同时加入相应的甲胺磷标样溶液，在匀浆机中高速匀浆1min后用滤纸过滤到装有5g氯化钠的100mL具塞量筒中，盖上塞子，剧烈震荡1min，在室温下静置30min，使乙腈相和水相分层。从具塞量筒中吸取10.00mL乙腈溶液，放入15mL试管中，将试管放在40℃水浴锅上加热，并通入氮气，蒸发近干，加入5.0mL丙酮定容，涡旋1min，用0.2μm滤膜过滤，滤液分为两份，一份用Chi/AChE/Au/ITO电极(传感器)检测，另一份用GC检测。结果如表1所示，从表1中可以看出，用Chi/AChE/Au/ITO电极检测的数据无论RSD(相对标准差)还是回收率都优于用GC检测的数据。10组样品甲胺磷浓度范围0.01～20μg/mL，回收率范围83.0～95.2％，因此Chi/AChE/Au/ITO传感器可以用于实际样品的检测。

表1 蔬菜样品中甲胺磷浓度的检测

Claims (8)

1.一种电化学生物传感器，其特征在于，其通过如下步骤制备得到：

(1)用液液界面法在有机相和水相界面间合成单分散金纳米薄膜；

(2)清洗ITO电极并烘干，然后浸入到步骤(1)中的水相中通过提拉将单分散金纳米薄膜覆盖在所述ITO电极上，得到单分散金纳米薄膜修饰的ITO，即Au/ITO电极；

(3)将步骤(2)得到的Au/ITO电极浸泡在乙酰胆碱酯酶溶液中，使乙酰胆碱酯酶吸附到单分散金纳米薄膜表面上，洗涤，得到AChE/Au/ITO传感器。

2.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，在得到的AChE/A_u/ITO传感器表面进一步滴涂壳聚糖溶液，得到Chi/AChE/Au/ITO传感器。

3.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，步骤(1)中，液液界面法合成单分散金纳米薄膜的步骤为：首先将PPh₃与HAuCl₄反应形成Au(PPh₃)Cl，然后将其转移到甲苯中形成有机相溶液；其次，将CTAB和NaOH溶解到H₂O中形成水相溶液，并将N₂H₄·H₂O加入到水相中作为还原剂；然后将上述有机相溶液缓缓加入到水相溶液中，当界面出现紫色时表明反应开始进行，反应在50～60℃恒温条件下进行10～12h，随着反应进行，界面的颜色逐渐加深，最后在界面上形成单分散金纳米薄膜。

4.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，步骤(3)中，乙酰胆碱酯酶溶液的浓度为0.020～0.040g/L，浸泡条件为在0至8℃下浸泡6至12h。

5.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，步骤(3)中，所述的AChE/Au/ITO传感器用0.1mol/L pH＝7.0的PBS缓冲液进行洗涤。

6.根据权利要求2所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述的壳聚糖溶液的浓度为0.1～0.5wt％，滴加的量为每mm²ITO电极滴加0.25～0.3μl。

7.根据权利要求1～6任一项所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述的ITO电极的大小为3mm×6mm。

8.权利要求1或2所述的电化学生物传感器在检测有机磷农药中甲胺磷的应用。