CN105353003A

CN105353003A - 一种基于微阵列电极的抗生素残留检测方法

Info

Publication number: CN105353003A
Application number: CN201510671949.9A
Authority: CN
Inventors: 郭业民; 胥清翠; 张前前; 孙霞; 戚彬
Original assignee: Shandong University of Technology
Current assignee: Shandong University of Technology
Priority date: 2015-10-19
Filing date: 2015-10-19
Publication date: 2016-02-24

Abstract

本发明公开了一种基于微阵列电极的抗生素残留检测方法，属于农产品安全检测技术领域。本发明利用微阵列电极体积小、传质速率快、扩散层薄等优点，将一定量纳米ATO（氧化锡锑）修饰在微电极表面，有效提高所制备生物传感器的灵敏度，另一方面利用壳聚糖良好的生物相容性，实现抗体在修饰界面的有效固定。整个试验过程中，对参数进行优化，获得最佳的测试条件：7.5作为底液pH值、6μM作为适配体浓度、选取30min作为抗生素与适配体的孵育时间。制备出的四环素免疫传感器，通过计算接触样品前后免疫传感器的阻抗值的变化，获得样品中四环素的浓度信息。该传感器在1-1.0×10⁶ng/mL浓度范围检测四环素的线性关系良好，可用于实际样品中目标成分四环素的检测。

Description

一种基于微阵列电极的抗生素残留检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于微阵列电极的抗生素残留检测方法，属于农产品安全检测技术领域。

技术背景

抗生素是一种能抑制或杀死其他微生物细胞的生理活性物质，主要由微生物产生。自20世纪30年代发现青霉素以来，现如今已被发现的抗生素有2000多种。常在奶牛中使用的抗生素主要有氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类和大环内酯类等。其中，四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括四环素、金霉素、土霉素及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素和二甲胺基四环素等。如果人类长期食用含抗生素残留的动物性食品后，药物不断在体内蓄积，会对人体产生毒性作用，增加细菌的耐药性，引起人体的过敏和变态反应，甚至会产生致癌、致畸、致突变作用。虽然近年来国际上严格限制抗生素的残留最大量，但由于其对某些作物具有生长刺激作用，所以仍有不少违章使用现象，因此实现对抗生素的检测是至关重要的。

普通电极上生物识别过程引起的阻抗变化非常小，微阵列电极则可以将反应过程中发生的阻抗变化放大，从而降低了检测时间，减少非目标分析物的干扰影响；传统电极表面的半无限线性扩散层易使反应物损耗，而微电极表面的球形扩散场能够加快反应物的供给速率；微电极能够加快反应物的供给速率，普通电极则易造成更大的反应物损耗。相比传统电极，微电极只需要较低浓度的电活性离子形成双层。所以，微电极能够在传统电极的灵敏度不足的低导电性的溶液中进行阻抗测试，同时，微阵列电极可实现传感器微型化，因此微电极与传统的检测系统相结合成为具有潜力的选择。传统的农药残留检测方法具有选择性好、灵敏度高和准确度高，同时检测多种元素或化合物的优势，但其需要昂贵的仪器设备,样品的前处理过程繁琐、费时,并且对分析人员的技术水平要求很高,不适于现场快速检测。因此本文尝试制备一种四环素残留的适配体传感器。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能克服上述方法的缺陷，且灵敏度高、特异性高、集成化、便携化的四环素残留检测的适配体传感器检测方法。采用的技术方案为：利用微阵列电极的集成化、便携化，将纳米ATO-壳聚糖溶液滴在微电极工作区域，由于壳聚糖溶液良好的生物相容性，使四环素适配体稳定的固定在电极表面，从而使抗原抗体反应更有效,检测电极表面的阻抗值，研究该传感器的电化学性能。

所述方法的步骤如下：

1）首先对微阵列电极清洗，测试其阻抗值的变化；

2）将步骤1）所得微阵列电极进行底液pH、适配体浓度、孵育时间等参数，进行优化，筛选出最佳的试验取值；

3）将步骤2）所得的微阵列电极，在最优条件下滴加纳米ATO-壳聚糖溶液，将其固定在电极表面，从而获得纳米ATO-壳聚糖修饰界面；

4）在步骤3）所得纳米ATO-壳聚糖修饰电极上滴加适配体，使其与纳米ATO-壳聚糖自组装后获得适配体修饰界面；

5）利用抗原抗体间的特异性反应，滴加不同浓度的四环素标准液，加入底液PBS后进行阻抗检测，建立不同四环素浓度与微阵列电极阻抗变化之间的关系曲线；

6）将牛奶样品液滴加在微阵列电极表面，加入底液PBS后进行阻抗检测，获得牛奶样品中是否含有四环素及是否超标的信息。

所述方法的步骤1）所述清洗并测试微阵列电极，是分别进入一定浓度的NaOH、HCl溶液中15min，再用蘸有无水乙醇的擦镜纸对电极表面擦拭；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗。

所述方法的步骤2）所述底液pH、适配体浓度、孵育时间等参数进行了优化：底液pH选取值为7.5；适配体浓度选取6μM；孵育时间30min；对不同条件下的阻抗值进行分析测试，确定微阵列电极测试过程中的最佳参数。

所述方法的步骤3）所述滴加纳米ATO-壳聚糖溶液，滴加量为3μL，固定30min。

所述方法的步骤4）所述滴加不同浓度的四环素适配体溶液，滴加量为3μL，固定40min，孵育温度为室温。

所述方法的步骤5）所述滴加不同浓度的四环素标准液，加入底液PBS后进行阻抗检测。

所述方法的步骤6）所述滴加不同浓度的四环素标准液，孵育30min，滴加底液PBS后进行阻抗检测。

所述方法的具体步骤如下：

1）微阵列电极的清洗：首先在1MNaOH溶液中浸泡15min；然后在1MHCl溶液中浸泡15min；再用蘸有无水乙醇的擦镜纸对电极表面擦拭；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗。获得清洗干净的微阵列电极，便于在其表面进行修饰，保证构建传感器的准确性；

2）所述底液pH、适配体浓度、孵育时间等参数进行了优化：底液pH很小时，测试阻抗值也很小，pH值增大的同时，阻抗值也在增加；当pH值在7.5时，阻抗值达到最大，继续增大pH值，其测试的阻抗值呈现出减小趋势，可能是由于在碱性或者酸性条件下，适配体的活性受到了影响，所以，本试验中选取7.5作为底液最佳pH值。将不同浓度的适配体分别固定到微阵列电极表面，修饰好的电极在与四环素结合反应前后进行阻抗分析，并对各浓度适配体的阻抗值变化进行比较：当适配体浓度从2μM增到6μM时，阻抗值不断增加，当适配体浓度进一步增大，其阻抗差也在增大，但几乎稳定不变，说明适配体在6μM浓度时，适配体在电极表面的固定量达到了饱和状态，所以，本实验最优适配体浓度为6μM。对于适配体和四环素孵育时间，对测试阻抗值的变化进行研究：随着时间的增加，阻抗差也不断增大，说明适配体传感器和目标检测物在发生结合反应，当孵育时间达到30min后，阻抗差值基本达到一个稳定的值，变化幅度很小，说明适配体与四环素的结合反应完成。因此，该实验选择四环素与适配体的最佳孵育时间为30min；

3）取纳米ATO-壳聚糖溶液，根据微阵列电极工作区域的大小，确定出试验所用最佳量，滴加纳米ATO-壳聚糖溶液的量为3μL，固定30min，从而获得ATO-壳聚糖修饰的适配体传感器界面；

4）取四环素适配体原液，用PBS稀释不同倍数，配置2μM，4μM，5μM，6μM，8μM，10μM等不同浓度，对其阻抗值进行测定，筛选出试验所用最佳的浓度值为6μM，滴加四环素适配体的浓度为6μM，固定40min；进而完成适配体在修饰界面的固定；

5）滴加不同浓度的四环素标准液，加入底液PBS后进行阻抗检测，分析该适配体传感器对四环素的测试性能；

本方法的有益效果：

本发明对底液pH值、适配体浓度和孵育时间等参数进行了优化：7.5作为底液pH、6μM作为适配体浓度、30min作为孵育时间。为进一步研究奠定了基础，且

1-1.0×10⁶ng/mL范围内线性范围良好；

采用本发明制备的基于微阵列电极的四环素残留检测方法操作工艺简单，低电阻电压降，高分析效率，样品和试剂消耗量少，灵敏度高，特异性高，可实现样品检测的自动化。符合我国抗生素残留快速检测技术发展和国际化要求。

附图说明

图1纳米ATO-壳聚糖复合物的扫描电镜图

（a.低倍率下纳米ATO-壳聚糖复合物的扫描电镜图；b.高倍率下纳米ATO-壳聚糖复合物的扫描电镜图）

图2适配体传感器在不同浓度的四环素标准液：0.0到1.0×10⁶ng/mL范围内的Impensence响应曲线

（a.微阵列电极；b.纳米ATO-CS复合物修饰后的电极；c.固定适配体后的电极；d.孵育四环素后的电极）

图3适配体传感器影响参数的优化

（a.底液pH值的优化；b.适配体浓度的优化；c.孵育时间的优化）

图4适配体传感器对四环素检测的的标准曲线

图5适配体传感器在实际样品检测中的加标回收率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1一种基于微阵列电极适配体传感器的制备步骤：

1）微阵列电极的清洗：首先在1MNaOH溶液中浸泡15min；然后在1MHCl溶液中浸泡15min；再用蘸有无水乙醇的擦镜纸对电极表面擦拭；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗，如有需要，可以通过显微镜观察微阵列电极的表面状态，（清洗过程与乙醇、丙酮等方法进行对比清洗效果，选出了适当的清洗方法）；

2）纳米ATO-壳聚糖溶液的制备：取0.2g壳聚糖粉末溶解于100mL0.2%乙酸溶液中并不断搅拌3h，制备质量分数为0.2﹪的壳聚糖溶液；然后用电子天平称量1.2g纳米ATO粉体溶于上述制备好的4mL壳聚糖溶液中，利用超声清洗仪超声30min，然后置于程式振荡器上，震荡30min，直到溶液达到均匀稳定的状态。图1为纳米ATO-壳聚糖复合物的扫描电镜图。根据微阵列电极工作区域的大小，确定出试验所用最佳量，滴加纳米ATO-壳聚糖溶液的量为3μL，固定30min；

3）取四环素适配体，滴加量为3μL，固定40min，孵育温度为室温。

实施例2微阵列电极的线性关系

配置1-1.0×106ng/mL的四环素标准溶液，将上述制备好的微阵列电极适配体传感器分别滴加不同浓度的四环素标准溶液，滴加量为3μL，在常温下孵育30min，检测发生免疫反应前后阻抗变化得到其工作曲线。如图2，曲线分别代表不同四环素浓度所对应的阻抗值，随着浓度的增加，阻抗值逐渐增大。本试验中，对影响适配体传感器的性能参数进行了优化（如图3）。以四环素浓度的对数为横坐标，阻抗变化值为纵坐标建立关系曲线，可以得到在1-1.0×10⁶ng/mL范围内线性相关，线性回归方程分别为：ΔR=14.002LogC(M)+137.8(R²=0.9657)（如图4），该方法有利于整个制备过程中试验条件的严格控制，更好地实现人为因素的干扰作用，还充分体现了微阵列电极操作便捷、响应快速、试剂消耗少等优势。有待用于实际样品中四环素残留的快速检测工作。

实施例3使用微阵列电极适配体传感器检测牛奶样品的加标回收率测定

从当地超市购买纯牛奶进行实际样品检测。在测试之前，对牛奶进行预处理：把牛奶按照1:10的比例进行稀释，然后分装到离心管中，以20000转/秒（rpm）的速度离心90min。离心结束后，牛奶分为明显的三层，上、下层是脂肪和酪蛋白等大分子物质，为了避免大分子物质对四环素的包裹，我们去中间一层的乳清，搜集乳清，向搜集好的乳清中添加四环素，浓度分别是g/mL，g/mL，g/mL。使用本发明的微阵列电极适配体传感器进行接触样品前后的阻抗值测试。测试后根据已经获得的阻抗变化与四环素浓度的关系曲线得到实际的检测值。实际样品检测的回收率在94%-104%之间，说明本发明的微阵列电极适配体传感器能够较好的用于牛奶实际样品的抗生素残留的检测，具体的如图5所示。

实施例4使用微阵列电极适配体传感器检测牛奶实际样品

1）选取纯牛奶，把牛奶按照1:10的比例进行稀释，然后分装到离心管中，以20000转/秒（rpm）的速度离心90min；离心结束后，取中间一层乳清，搜集乳清，向搜集好的乳清中添加四环素，制备浓度分别是g/mL，g/mL，g/mL的四环素溶液，备用；

2）微阵列电极的清洗：首先在1MNaOH溶液中浸泡15min；然后在1MHCl溶液中浸泡15min；再用蘸有无水乙醇的擦镜纸对电极表面擦拭；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗，如有需要，可以通过显微镜观察微阵列电极的表面状态，（清洗过程与乙醇、丙酮等方法进行对比清洗效果，选出了适当的清洗方法）；

3）取纳米ATO-壳聚糖溶液，滴加量为3μL，固定30min；

4）取四环素适配体，滴加量为3μL，固定40min，孵育温度为室温；

5）固定抗体后，微阵列电极滴加底液PBS后进行阻抗检测，利用得到的Impensence阻抗图谱获取所测阻抗值Z₁；

6）滴加牛奶样品液，加入底液PBS后进行阻抗检测，利用得到的Impensence阻抗图谱，获取所测阻抗值Z₂；

7）计算四环素添加前后的阻抗变化ΔZ=Z₂-Z_1，根据阻抗变化与四环素浓度的关系曲线获得牛奶实际样品四环素浓度的信息。

Claims

1.一种基于微阵列电极的抗生素残留检测方法，其特征在于，该传感器的组装过程为：将一定量纳米ATO与壳聚糖的混合液修饰微电极表面；再将四环素适配体有效固定在微电极表面；最后，利用抗原抗体间的特异性反应，滴加不同浓度的抗生素，加入磷酸盐缓冲溶液（PBS）底液后进行阻抗检测，进而制备出了一种新型的抗生素残留适配体传感器。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述抗生素分子为四环素。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，使用的微电极为叉指阵列微电极（IDAM电极）是由一对电极间相互啮合组合的微阵列电极构成的，其中每个微阵列电极又是由多个宽度及间距都为微米级的电极并联组成，微阵列电极的具体尺寸一般是：电极长为2~10毫米，电极高为0.1~0.2微米，电极宽为1~20微米，电极梳齿间的间距为1~20微米金叉指微电极，总尺寸为2cm×1cm×0.05cm，由50对指宽和指间距均为15μm的交叉阵列电极组成。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，适配体在微阵列电极上的固定步骤如下：

1）清洗并测试微阵列电极；

2）将步骤1）所得微阵列电极进行底液pH、适配体浓度、孵育时间等参数，进行优化；

3）将步骤2）所得的微阵列电极，在最优条件下滴加纳米ATO-壳聚糖混合液，获得纳米ATO-壳聚糖修饰界面；

4）在步骤3）所得纳米ATO-壳聚糖修饰电极表面滴加四环素适配体，获得适配体修饰界面。

5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1）所述清洗并测试微阵列电极，是分别浸入一定浓度的氢氧化钠、盐酸溶液中等一段时间，再经超纯水冲洗；最终，用氮气吹干后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗。

6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2）所述底液pH、适配体浓度、孵育时间等参数进行了优化：底液pH选取7.5；适配体浓度选取6μM；孵育时间30min。

7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3）所述滴加纳米ATO-壳聚糖混合液，滴加量为3μL，固定30min。

8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4）所述滴加四环素适配体，滴加量为3μL，固定40min，孵育温度为室温。

9.根据权利要求2所述方法，其特征在于，检测方法建立具体步骤如下：

2）取0.2g壳聚糖粉末溶解于100mL0.2%乙酸溶液中并不断搅拌3h，制备质量分数为0.2﹪的壳聚糖溶液；然后用电子天平称量1.2g纳米ATO粉体溶于上述制备好的4mL壳聚糖溶液中，利用超声清洗仪超声30min，然后置于程式振荡器上，震荡30min，直到溶液达到均匀稳定的状态，根据微阵列电极工作区域的大小，确定出试验所用最佳量，滴加纳米ATO-壳聚糖溶液的量为3μL，固定30min；

3）取四环素适配体原液，用PBS稀释不同倍数，配置2μM，4μM，5μM，6μM，8μM，10μM等不同浓度，对其阻抗值进行测定，筛选出试验所用最佳的浓度值为6μM，滴加四环素适配体的浓度为6μM，固定40min；

4）滴加不同浓度的四环素标准液，加入底液PBS后进行阻抗检测，建立四环素浓度与阻抗变化之间的标准曲线，在1-1.0×10⁶ng/mL范围内线性范围良好，线性回归方程分别为：ΔR=14.002LogC(M)+137.8(线性相关系数R²=0.9657)。

10.根据权利要求1所述方法，牛奶中四环素残留具体检测步骤如下：

1）牛奶样品预处理方法如下：把牛奶按照1:10的比例进行稀释，然后分装到离心管中，以20000转/秒（rpm）的速度离心90min；离心结束后，取中间一层乳清，搜集乳清，向搜集好的乳清中添加四环素，制备浓度分别是g/mL，g/mL，g/mL的四环素溶液，备用；

2）在微阵列电极上固定适配体后，加入底液PBS进行阻抗检测，利用得到Impensence阻抗图谱，获取所测阻抗值Z₁；

3）滴加牛奶样品液，加入底液PBS后进行阻抗检测，利用得到的Impensence阻抗图谱，获取所测阻抗值Z₂；

4）计算四环素添加前后的阻抗变化ΔZ=Z₂-Z₁，根据阻抗变化与四环素浓度的关系曲线获得牛奶实际样品四环素浓度的信息。