KR101436222B1 - 리간드 결합능력을 가진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질을 확인하는 방법 - Google Patents

리간드 결합능력을 가진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질을 확인하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리간드 결합능력을 가진 헤테로-다량체 유비퀴틴 단백질을 확인하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 헤테로-다량체 유비퀴틴 단백질들의 집단을 인코딩하는 DNA 라이브러리, 상기 DNA 라이브러리의 발현에 의해 얻어진 단백질 라이브러리, 상기 DNA 또는 단백질을 포함하는 파아지 및 세포, 상기 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그리고 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 추가로, 선택된 리간드에 대해 높은 친화도를 갖고 특이적으로 결합할 수 있는 헤테로-다량체 유비퀴틴에 기초한 신규한 결합 단백질이 제공된다.

Description

리간드 결합능력을 가진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질을 확인하는 방법{A METHOD FOR IDENTIFYING HETERO-MULTIMERIC MODIFIED UBIQUITIN PROTEINS WITH BINDING CAPABILITY TO LIGANDS}
본 발명은 리간드 결합능력을 가진 헤테로-다량체 유비퀴틴(hetero-multimeric ubiquitin)을 확인하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 헤테로-다량체 유비퀴틴 단백질들의 집단을 인코딩하는 DNA 라이브러리, 상기 DNA 라이브러리의 발현에 의해 얻어진 단백질 라이브러리, 상기 DNA 또는 단백질을 포함하는 파아지 및 세포, 상기 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그리고 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 추가로, 선택된 리간드에 대해 높은 친화도를 갖고 특이적으로 결합할 수 있는 헤테로-다량체 유비퀴틴에 기초한 신규한 결합 단백질이 제공된다.
면역글로불린이 아닌 아미노산들로 구성된 결합분자에 대한 수요가 증대되고 있다. 지금까지는 항체들이 결합분자들 중 가장 잘 체계화된 부류로 대표되고 있으나, 면역글로불린은 주요한 결함을 갖고 있기 때문에 높은 친화도와 특이도로 리간드를 타겟팅하기 위한 새로운 결합분자들에 대한 요구가 여전히 있다. 비록 항체들이 상당히 용이하게 제조될 수 있고 어떠한 타겟에 대해서도 거의 지향성을 가질 수 있지만, 복잡한 분자 구조를 갖고 있다. 간단한 방식으로 사용될 수 있는 보다 작은 분자들에 의해 항체를 대체하고자 하는 계속적인 요구가 있다. 이러한 대안 결합제는 예를 들어 진단, 예방, 질병의 치료 등의 의료 분야에서 유리하게 사용될 수 있다.
통상 단백질 스캐폴드라고 불리는 상대적으로 한정된 3차 구조를 갖는 단백질은 상기 대안 결합제의 설계를 위한 출발물질로서 사용될 수 있다. 이들 스캐폴드는 전형적으로 특이적 또는 무작위 서열 변이로 수정가능한 하나 이상의 영역을 포함하고, 이러한 서열 무작위화가 종종 수행되어 특이적 결합 분자가 선택될 수 있는 단백질 라이브러리를 생성하게 된다. 항체 보다 작은 크기를 갖고 타겟 항원에 대해 상응하는 친화도 또는 보다 양호한 친화도를 갖는 분자들은 약동학적 특성(pharmacokinetic properties) 및 면역원성의 관점에서 항체 보다 우수할 것으로 기대된다.
다수의 앞선 접근방법들이 결합 단백질의 출발물질로서 단백질 스캐폴드를 사용했다. 예를 들어, 국제공개공보 WO 99/16873호에서는 특정 리간드에 대해 결합 활성을 나타내는 리포칼린 패밀리(lipocalin family)(소위 "안티칼린")의 변형된 단백질을 개발한 것을 설명하고 있다. 리포칼린 패밀리의 펩타이드 구조는 유전 공학 기법을 이용하여 원래의 리간드 결합 포켓에서 아미노산을 치환하여 변형된다. 면역글로불린과 같이, 안티칼린은 분자 구조들을 확인하거나 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 항체와 유사한 방식으로 유연한 루프 구조가 변형되고 이러한 변형은 원래의 리간드와는 다른 리간드를 인식할 수 있도록 한다.
국제공개공보 WO 01/04144호는 본래 결합 부위가 없는 베타 시트 구조의 단백질에서 단백질 표면 상에 인공적으로 결합 도메인을 생성하는 것을 기술하고 있다. 이러한 새로이 생성된 인공 결합 도메인, 예를 들어 높은 친화도 및 특이도로 리간드와 상호작용하는 γ-크리스탈린(γ-crystallin)(수정체 구조 단백질)에서의 변이들을 얻을 수 있다. 이미 존재하고 안티칼린에 대해 앞서 언급한 바와 같은 유연한 루프 구조로부터 형성된 결합 부위의 변형과는 대조적으로 이러한 결합 도메인은 베타 시트의 구조 상에 새로이 생성된 것이다. 그러나, 국제공개공보 WO 01/04144호는 새로운 결합 특성의 생성을 위해 상대적으로 큰 단백질의 전환만을 기술하고 있다. 국제공개공보 WO 01/04144호에 따른 단백질들은 그 크기로 인하여 수고를 요하는 방법에 의해 유전 공학 수준에서 변형될 수 있다. 더욱이, 지금까지 개시된 단백질들에서는 전체 아미노산의 백분율에서 상대적으로 적은 비율만이 변형되어야 단백질의 전체 구조를 유지할 수 있다. 따라서, 단백질 표면의 상대적으로 작은 영역만이 이전에 존재하지 않은 결합 특성의 생성을 위해 사용될 수 있다. 또한, 국제공개공보 WO 01/04144호는 γ-크리스탈린에 대한 결합 특성 생성만을 개시하고 있다.
국제공개공보 WO 04/106368호는 유비퀴틴 단백질에 기초한 인공적인 결합 단백질의 생성을 기술하고 있다. 유비퀴틴은 서열에서 높은 수준으로 보존적인 작은 단량체의 사이토졸 단백질(cytosolic protein)로서 원생동물부터 척추동물에 이르기까지 모든 알려진 진핵 세포 내에 존재한다. 유기체에서, 유비퀴틴은 세포 단백질의 분해 조절에서 중요한 역할을 하고 있다. 이러한 목적을 위해 분해대상이 되는 단백질은 연속적인 효소처리 과정 중 유비퀴틴 또는 폴리유비퀴틴 체인에 공유적으로 결합되고, 유비퀴틴 표지 때문에 선택적으로 분해된다. 최근의 연구 결과에 따르면, 유비퀴틴 또는 유비퀴틴에 의한 단백질의 표지는 각각 몇몇 단백질들의 도입 또는 이들의 유전자 조절과 같은 다른 세포 과정에서도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
유비퀴틴의 생리학적 역할의 규명 이외에도 유비퀴틴은 구조적 특성 및 단백질-화학 특성 때문에 연구 대상이 되고 있다. 유비퀴틴의 폴리펩타이드 체인은 이례적으로 치밀한 α/β 구조(Vijay-Kumar, 1987) 내에 접혀져 있는 76개의 아미노산으로 구성되며, 상기 폴리펩타이드 체인의 거의 87%는 수소 결합에 의해 2차 구조 요소들의 형성에 관여한다. 2차 구조는 3과 1/2 회전의 알파 헬릭스 구조이며 4개의 가닥으로 구성된 역평행 β 시트 구조이다. 이들 요소들의 특징적인 배열 (역평행 β 시트는 알파 헬릭스가 채워진 뒤쪽으로 단백질 표면에 대해 노출되고 알파 헬릭스는 상부에서 수직으로 놓여진 배열)은 소위 유비퀴틴-유사 폴딩 모티브로서 통상 간주된다. 추가적인 구조적 특징은 알파 헬릭스와 β 시트 사이의 단백질 내부에서의 소수성 영역이다.
유비퀴틴은 크기가 작기 때문에 화학적 합성 및 바이오테크놀로지 방법 모두에 의해 인공적으로 제작될 수 있다. 유리한 폴딩 특성 때문에, 유비퀴틴은 대장균과 같은 미생물을 이용한 유전공학 기법에 의해 세포기질 또는 주변 세포질 공간 내에 상대적으로 많은 양으로 생산될 수 있다. 주변 세포질 내에서 지배적인 산화 조건 때문에 주변 세포질 공간 내에서의 유비퀴틴 생성 전략은 일반적으로 분비성 단백질 생산을 위해 유보된다. 간단하고 효율적인 세균 내 제조 때문에 유비퀴틴은 생산에 문제가 있는 다른 외부 단백질에 대한 융합 파트너로서 사용될 수 있다. 유비퀴틴에 융합하는 것은 용해도를 향상시키고 향상된 수율의 달성을 가져온다.
항체 또는 다른 대안 스캐폴드에 비해, 유비퀴틴 단백질에 기초한 인공 결합 단백질(Affilin®으로도 불림)은 작은 크기, 높은 안정성, 높은 친화도, 높은 특이도, 비용면에서 효율적인 미생물 생산 및 혈청 반감기 조정과 같은 많은 장점을 갖는다. 그러나, 면역원성 잠재력, 신속하고 예측가능한 전임상 개발 추적 및 새로운 치료적 접근의 관점에서 이들 단백질을 추가로 개발할 필요성이 여전히 있다. 국제공개공보 WO 05/05730호는 인공 결합 단백질을 얻기 위해 유비퀴틴 스캐폴드의 사용을 일반적으로 기술하고 있으나, 합텐(hapten) 및 항원과 같은 리간드들, 예를 들어 단백질, 펩타이드 및 이들의 에피톱에 대해 보다 특이적으로 높은 친화도를 갖고 결합하도록 유비퀴틴 단백질을 어떻게 변형할 것인지 그리고 변형된 유비퀴틴 단백질을 어떻게 효율적으로 선택할 것인지에 대해서는 해결책이 제시되어 있지 않다.
국제공개공보 WO 05/05730호에 기술된 방법들은 변형된 유비퀴틴 단백질의 단량체 또는 변형된 유비퀴틴 단백질들이 커플링된 것에 대해 설명하고 있다. 커플링된 형태는 하나, 2개, 또는 그 이상의 변형된 유비퀴틴 단백질들을 스크린하여 선택하고, 이후 유전적 방법이나 화학적 방법으로 이들을 결합시켜 생성되는데, 커플링된 형태는 예를 들어 하나의 커플링된 유비퀴틴 분자에 의해 서로 다른 종류의 리간드들과 다가 특이적으로 결합(multispecific binding)할 수 있다. 일례로서, 단일의 변형된 유비퀴틴 분자에 비해 결합 친화도를 증가시키기 위해, 2개의 동일한 유비퀴틴 계열의 단백질 (호모 다이머)를 위치지정(site-directed) 방식으로 커플링하는 것이 개시되어 있다.
국제공개공보 WO 99/16873호 (1999.04.08) 국제공개공보 WO 01/04144호 (2001.01.18) 국제공개공보 WO 04/106368호 (2004.12.09) 국제공개공보 WO 05/05730호 (2005.01.20)
본 발명의 목적은 리간드에 대한 높은 결합능력을 가진 다량체 유비퀴틴 단백질을 어떻게 확인할 것인지에 대한 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 선택된 리간드에 대해 높은 친화도를 갖고 특이적으로 결합할 수 있는 변형된 유비퀴틴에 기초한 새로운 결합 단백질을 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
전술한 목적들은 첨부된 특허청구범위의 독립항의 기술적 사상에 의해 해결되며, 본 발명의 바람직한 실시예들은 후술하는 상세한 설명, 실시예 및 도면 뿐만아니라 특허청구범위의 종속항에 포함된다.
구체적으로, 본 발명은 리간드에 대한 결합능력을 가진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴을 확인하는 방법을 제공하며, 이러한 본 발명의 방법은,
a) 단량체의 변형 유비퀴틴 단백질로부터 유래하는 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질들의 집단으로서, 상이하게 변형된 2개 이상의 유비퀴틴 단량체 또는 선단과 말단(head-to-tail)의 배열로 연결되어 있는 적어도 하나의 변형 유비퀴틴 단량체를 포함하는 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질들을 구비하는 집단을 제공하되, 상기 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질의 적어도 2개의 유비퀴틴 단량체는 서열번호 1의 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 및 68 위치에서의 적어도 3개의 아미노산에 있어서 표면 노출 아미노산의 치환에 의해 상이하게 변형되고, 상기 변형된 유비퀴틴 단량체는 변형되지 않은 유비퀴틴 단백질에 대해 적어도 80% 상동성, 또는 적어도 90% 상동성, 또는 적어도 95% 상동성의 아미노산 서열 상동성을 갖는 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질들의 집단을 제공하는 단계와,
b) 상이하게 변형된 유비퀴틴 단백질들을 갖는 상기 집단에 대해 잠재적인 리간드를 제공하는 단계와,
c) 상이하게 변형된 유비퀴틴 단백질들을 갖는 상기 집단을 상기 리간드와 접촉시키는 단계와,
d) Kd = 10-7- 10-12 M 범위의 특이적인 결합 친화도로 상기 리간드에 결합하고 상기 리간드에 대해 1가의 결합 활성을 나타내는 변형된 유비퀴틴 단백질들을 스크린함으로써 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질을 확인하는 단계와,
e) 선택적으로, 상기 결합 친화도를 갖는 상기 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질을 분리하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 중요 용어의 정의
"유비퀴틴 단백질"이라는 용어는 서열번호 1에 따르는 유비퀴틴과 하기 정의에 따르는 유비퀴틴의 변형을 포함한다. 유비퀴틴은 진핵생물에서 높은 수준으로 보존되어 있다. 예를 들어, 현재까지 조사된 모든 포유동물에서 유비퀴틴은 동일 아미노산 서열을 갖고 있다. 특히, 사람, 설치류, 돼지 및 영장류의 유비퀴틴 분자가 바람직하다. 추가로, 다른 진핵생물 자원의 유비퀴틴도 사용될 수 있다. 예를 들어, 효모의 유비퀴틴은 서열번호 1의 서열과 단지 3개의 아미노산이 다를 뿐이다. 통상, "유비퀴틴 단백질"이라는 용어에 의해 포괄되는 유비퀴틴 단백질은 서열번호 1에 대해 70% 이상의 아미노산 상동성을 나타내고, 바람직하게는 75% 이상 또는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 또는 97%까지의 서열 상동성을 나타낸다.
서열번호 1의 아미노산 서열에 대한 유비퀴틴 유도체의 서열 상동성의 정도를 결정하기 위해, 예를 들어 SIM 로컬 유사도 프로그램(SIM Local similarity program) (Xiaoquin Huang and Webb Miller, Advances in Applied Mathematics, vol. 12: 337- 357, 1991) 또는 Clustal, W.가 사용될 수 있다(Thompson et al., Nucleic Acids Res., 22(22): 4673-4680, 1994.). 바람직하게는, 서열번호 1에 대한 변형된 단백질의 서열 상동성 정도는 서열번호 1의 완전한 서열에 대한 상대적인 값으로 결정된다.
본 명세서에서 사용되는 "리간드", "타겟(표적)" 및 "결합 파트너"라는 용어는 동의어로 사용되고 서로 대체되어 사용될 수 있다. 리간드는 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질에 대해 본 명세서에서 정의된 바와 같은 친화도로 결합할 수 있는 분자이다.
본 발명의 "헤테로-다량체 융합 단백질" 또는 "헤테로-다량체 단백질"은 하나 이상의 상이한 단량체 유비퀴틴 단백질을 포함하는 단백질로 간주된다. 따라서 본 발명의 "헤테로-다량체"는 특이적 결합 파트너에 대한 1가 결합 특성을 함께 제공하는 2개의 상호 작용하는 결합 도메인 영역을 갖는 적어도 2개의 상이하게 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질을 포함하는 단백질로 간주된다. 헤테로-이량체 또는 헤테로 삼량체가 바람직하다.
본 발명에 따르면, 하나의 리간드에 결합하는 적어도 2개의 상이하게 변형된 유비퀴틴 단량체들은 유전공학기술 등을 이용하여 서로에 대해 선단과 말단(head-to-tail)이 융합되어 연결된다. 상이하게 변형되어 융합된 유비퀴틴 단량체들은 1가 방식으로 결합하고 양쪽 "결합 도메인 영역"("BDR")이 함께 작용하는 경우에만 효과를 나타낸다. 헤테로머 단백질을 형성하는, 변형되어 연결된 유비퀴틴 단량체들은 단일 연속 결합 영역을 통해 동일한 에피톱에 결합한다. 상기 헤테로머(heteromer)의 연속 영역은 적어도 2개의 상이하게 변형된 유비퀴틴 단량체들에 의해 형성된 적어도 2개의 모듈의 양쪽 결합 결정 영역(binding determining region)에 의해 형성된다.
"선단과 말단의 융합"("head to-tail fusion")은 다량체에 포함된 유닛들의 수에 의존하여 N-C-N-C-의 방향으로 이들을 링크하여 2개의 이상의 단백질을 함께 융합하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 선단과 말단의 융합에서 유비퀴틴 단량체는 링커 없이 직접 연결될 수 있다. 대안으로, 유비퀴틴 단량체의 융합은 링커, 예를 들어 적어도 아미노산 서열 GIG를 갖는 링커, 적어도 아미노산 서열 SGGGG를 갖는 링커 또는 다른 링커, 예를 들어 GIG, SGGGG, SGGGGIG, SGGGGSGGGGIG 또는 SGGGGSGGGG를 통해 수행될 수 있다. 또한, 2개의 유비퀴틴 단량체의 유전적 융합을 위한 다른 링커들도 당업계에 알려져 있고 사용될 수 있다. 유사하게, 헤테로 다량체 변형 유비퀴틴 단백질은 2개, 3개, 또는 그 이상의 상이하게 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질들을 융합하여 제공되고, 이로써 변형된 유비퀴틴 단량체들의 융합 단백질을 얻을 수 있다. 추가의 실시예에서, 적어도 하나의 유비퀴틴 단량체들은, 적어도 하나의 다른 유비퀴틴 분자들이 변형되는 경우에도 변형되지 않는다.
"집단"("population")이라는 용어는 이형 핵산들(heterogenous nucleic acid)에 의해 인코딩되는 이형 폴리펩티드들의 혼합물인 라이브러리를 지칭한다. 상기 라이브러리는 하나의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 단일 폴리펩티드를 갖는 멤버들로 구성된다. 라이브러리 멤버들 간의 서열 차이는 라이브러리 내에 존재하는 다양성에 관여한다. 라이브러리는 폴리펩티드들 또는 핵산들의 단순 혼합물 형태를 취할 수 있거나, 핵산 라이브러리에 의해 형질전환된 세균, 바이러스, 동물 세포 또는 식물 세포 등과 같은 유기체 또는 세포 형태일 수 있다. 각각의 개별 유기체나 세포는 단지 하나의 라이브러리 멤버를 포함하는 것이 바람직하다. 유리하게는 핵산들은 발현 벡터로 도입되어 상기 핵산들에 의해 인코딩되는 폴리펩티드들이 생성되도록 할 수 있다. 따라서, 바람직한 측면에서 라이브러리는 숙주 유기체들의 집단 형태일 수 있고, 각 유기체는 핵산 형태의 단일 라이브러리 멤버를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터 카피들을 포함하며 상기 핵산은 발현되어 대응하는 폴리펩티드 멤버를 생성할 수 있다. 따라서, 숙주 유기체들의 집단은 유전적으로 다양한 폴리펩티드 변이들로 구성된 거대 레퍼토리(repertoire)를 인코딩하는 능력을 가진다.
헤테로-다량체 유비퀴틴 단백질의 집단은 예를 들어 상이하게 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질들 각각을 인코딩하는 DNA 라이브러리를 유전적으로 융합하고 (다른 방식으로서 상기 단량체 유비퀴틴 단백질들 중 적어도 하나가 변형), 상기 융합된 DNA를 헤테로-다량체 융합단백질로 해독하며, 해독된 융합단백질을 디스플레이하고 디스플레이된 융합단백질들에서 선단과 말단의 배열로 함께 연결되어 있는 단량체 유비퀴틴 단백질들을 포함하는 변형된 헤테로-다량체 유비퀴틴 단백질의 존재에 대해 스크린하여 제공되는데, 이때 상기 변형된 헤테로-다량체 유비퀴틴 단백질들은 10-7- 10-12 M 범위의 Kd를 갖는 특이적인 결합 친화도로 리간드에 결합하고 상기 리간드에 대해 1가의 결합 활성을 나타내는 것이 스크린된다. 헤테로-이량체 유비퀴틴 단백질을 얻기 위해 상이하게 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질 각각 또는 적어도 하나를 인코딩하는 2개의 DNA 라이브러리가 융합되고, 헤테로-삼량체 유비퀴틴 단백질을 얻기 위해 상이하게 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질 각각 또는 적어도 하나를 인코딩하는 3개의 DNA 라이브러리가 융합된다. 또한, 대안의 방법이 스크린을 위한 라이브러리를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 일례로 예를 들어 고체 상태 기술에 의해 단백질들을 화학적으로 합성하고 아미노산 조성에 변이를 도입하는 것이 있다. 당업자에게 유용한 것으로 알려진 다른 선택이 고려될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 실시예들에 제한되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
이에 따라 본 발명은 리간드에 결합할 수 있는 능력에 의해 결정되는 기능성에 따라 폴리펩티드 레퍼토리가 제공되는 방법과, 선정 결과로 얻어진 폴리펩티드의 서브세트(subset)가 타겟 리간드에 결합하는 능력에 따라 추가의 선정 과정에서 사용되어 리간드에 결합 친화도를 축적 및 증가시키는 방법을 개시한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 기술분야의 당업자는 선정된 폴리펩티드 레퍼토리로부터 청구항에 특정된 특이도로 타겟 리간드에 결합할 수 없는 폴리펩티드를 배제할 수 있다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 기술분야의 당업자는 기능성을 갖고 결합 친화도 요구를 만족시키는 폴리펩티드들에 대해 선정된 폴리펩티드 레퍼토리를 풍부하게 할 수 있다.
본 발명의 가장 주요한 핵심 사항 중 하나는 타겟에 대해 1가 결합 친화도를 갖는 변형된 헤테로-다량체 유비퀴틴 단백질들의 선정과, 결합 친화도에 관여하는 변형된 아미노산들의 후속 결정에 있다.
다량화(multimerization), 바람직하게는 이량화의 추가적인 장점은 새로운 높은 친화도 결합 특성을 생성하기 위해 변형될 수 있는 아미노산 잔기들의 수를 증가시킬 수 있다는 것이다. 상기 장점은 비록 보다 많은 아미노산이 변형되어도 타겟에 대해 새롭게 생성된 결합 단백질 스캐폴드의 전체 안정성을 감소시키지 않으면서 단백질의 화학적 성질은 유지된다는 것이다. 반면에, 변형된 잔기들은 2개, 3개 또는 그 이상의 단량체 유비퀴틴 단백질들에 할당될 수 있기 때문에 타겟에 대한 새로운 결합 부위를 생성하기 위해 변형될 수 있는 잔기의 전체 수는 증가한다. 따라서, 변형 수는 변형된 단량체 유비퀴틴 분자의 수에 대응하는 2배 또는 x배가 될 수 있다. 유비퀴틴 기반의 결합 단백질의 모듈 단위 구조(modular structure)는 변형된 아미노산의 전체 수를 증가시키도록 하는데, 이는 상기 변형된 아미노산들이 2개, 3개 또는 그 이상의 단량체 유비퀴틴 분자들 상에 포함되기 때문이다. 본 발명의 방법은 하나의 1가 특이성 (하나의 에피톱에 대해서임)을 갖는 헤테로-다량체 유비퀴틴 분자들의 확인을 위해 제공된다.
"1가"(monovalent)는 변형된 이량체 (선택적으로 삼량체 또는 일반적으로 다량체) 유비퀴틴의 제1 단량체 유닛과 제2 단량체 유닛(선택적으로 추가 단량체 유닛 가능)에서 생성된 양쪽 결합 영역들이 상호 의존적인 방식과 조합된 방식으로 ED-B에 함께 결합하는 능력, 즉 양쪽 결합 영역들이 함께 1가 결합 활성을 형성하기 위해 작용하는 능력으로서 이해되어야 한다. 상기 헤테로-이량체 분자 내의 제1 변형된 유비퀴틴 및 제2 변형된 유비퀴틴의 각각의 결합 영역을 별개로 취하면 이량체 분자 보다 훨씬 낮은 효율 및 친화도로 ED-B에 결합할 것이 명백하다. 양쪽 결합 영역은 헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 단백질의 표면 상에서 연속적인 아미노산 영역으로서 형성된 특유의 결합 영역을 형성하고 상기 변형된 유비퀴틴은 따로 떨어진 각각의 단량체 단백질 보다 ED-B에 대해 보다 높은 효율로 결합한다. 본 발명에 따르면, 2개의 단량체 단백질은 가장 강력한 결합 유비퀴틴 분자들을 스크린한 후 서로 연결되지 않지만 스크린 과정은 이미 헤테로-이량체 유비퀴틴의 존재 하에서 수행되는 것이 특히 중요하다. 가장 강력한 결합 유비퀴틴 분자들에 대한 서열 정보를 받은 후, 이들 분자들은 다른 방법, 예를 들어 화학적 합성 또는 유전공학기법, 예를 들어 2개의 이미 확인된 단량체 유비퀴틴 유닛들을 함께 연결함으로써 얻어질 수 있다. 이량체의 변형된 유비퀴틴 단백질에 대해 상기 설명된 모든 예들은 삼량체 또는 다량체의 변형된 유비퀴틴 단백질에 대해 변경되어 적용될 수 있다.
따라서, 결합 파트너에 대한 공통 결합 부위를 갖는 헤테로-다량체, 특히 헤테로-이량체의 사용은 최종 결합 분자의 단백질의 화학적 성질에 대해 부적합하게 영향을 주지 않고 증가된 수의 변형된 잔기들을 도입할 수 있는 가능성을 열었는데, 이는 상기 변형된 잔기들의 전체 수가 이량체 또는 다량체를 형성하는 2개 또는 그 이상의 단량체 유닛에 걸쳐 분포되기 때문이다. 상기 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질은 단백질 라이브러리로 존재한다.
단량체의 변형된 유비퀴틴 단백질들을 인코딩하는 예를 들어 적어도 2개의 상이한 DNA 라이브러리들이 단량체 유비퀴틴 유닛 각각에서 선정된 코돈들을 상이하게 변형하여 확립된 후, 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질을 인코딩하는 DNA 분자를 수득하기 위해 이들 라이브러리들은 유전적으로 융합된다. 이들 라이브러리들의 DNA는 단백질들로 해독되고, 이로써 얻어진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질들은 결합 친화도가 존재하는 결합 파트너들과 상호 결합하기 위해 본 발명에 따라 접촉된다. 바람직한 변형 유비퀴틴은 헤테로-이량체이다.
접촉 및 스크린 과정이 헤테로-다량체, 예를 들어 헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 단백질에 대해 수행되는 것은 본 발명의 주요 측면이다. 이러한 과정은 타겟에 대해 1가의 결합 활성을 제공하는 유비퀴틴 단백질들에 대한 스크린을 가능하게 한다.
특히, 본 발명에 따르면 단량체의 변형된 유비퀴틴 단백질들은 가장 강력하게 결합하는 유비퀴틴 분자들을 스크린한 후에 함께 연결되지 않고 헤테로-다량체 유비퀴틴들의 존재 하에 스크린 과정이 수행되는 것이 중요하다. 그러나, 가장 강력하게 결합하는 헤테로-다량체 유비퀴틴 결합 분자들에 대한 서열 정보를 얻은 후에는, 이들 분자들은 다른 방법, 예를 들어 화학적 합성, 유전공학적 방법, 또는 이미 확인된 2개의 상이하게 변형된 단량체 유비퀴틴 유닛들을 링크시켜 헤테로-이량체 결합 단백질을 형성하는 방식으로 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 접촉 과정은 파아지 디스플레이, 리보좀 디스플레이, TAT 파아지 디스플레이, mRNA 디스플레이 또는 세포 표면 디스플레이, 효모 표면 디스플레이 또는 세균 표면 디스플레이와 같은 적합한 표시 및 선정 방법에 의해 수행되는 것이 바람직하며, 리보좀 디스플레이 또는 파아지 디스플레이 방법에 의해 수행되는 것이 더욱 바람직하다. 완전한 개시를 위해 다음과 같은 참조문헌들을 참조한다(Hoess, Curr. Opin. Struct. Biol.. 3 (1993), 572-579; Wells and Lowmann, Curr. Opin. Struct. Biol. 2 (1992), 597-604; Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins-A Laboratory Manual (1996), Academic Press). 전술한 방법들은 본 발명의 기술분야의 당업자에게 알려져 있으며 본 발명 및 그 변경을 통해 사용될 수 있다.
변형된 단백질이 미리 결정된 결합 파트너에 대해 정량가능한 결합 친화도를 갖는지 여부를 결정하는 것은 본 발명에 따라 다음과 같은 하나 이상의 방법들에 의해 수행될 수 있다: ELISA, 표면 플라즈몬 공명 분광법(plasmon surface resonance spectroscopy), 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 형광 이방성 측정법(fluorescence anisotropy), 형광 분광법(fluorescence spectroscopy), FACS, ITC(isothermal titration calorimetry) 및 분석용 초원심분리법(analytical ultracentrifugation). 본 발명의 기술분야에서 입수가능한 다른 방법들 또한 통상의 지식을 가진 전문가에 의해 사용될 수 있다.
"헤테로-다량체"는 본 명세서에서 적어도 2개의 상이한 단량체 유비퀴틴 단백질들을 포함하는 단백질로서 간주된다. 본 발명의 "헤테로-이량체"는 2개의 상이하게 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질들의 융합으로서 간주된다. 모두 특이적 결합 파트너에 대한 조합된 1가 결합 특성을 나타낸다. 본 발명의 변형된 다량체, 예를 들어 이량체 리간드 결합 유비퀴틴 단백질은 각각의 단량체 유비퀴틴 단백질을 별개로 스크린하고 이들 적어도 2개의 단량체를 이후에 조합하여서는 수득될 수 없고, 리간드에 대한 1가 결합 활성을 함께 나타내는 제1 단량체 유닛과 제2 단량체 유닛 또는 추가의 단량체 유닛으로 구성된 다량체 단백질, 선택적으로 이량체 단백질을 스크린해야만 수득될 수 있다는 점에 주목해야 한다. 각각의 서브 유닛은 리간드에 대해 아주 제한된 결합 친화도를 나타내는 반면에 조합된 다량체 또는 이량체의 변형 유비퀴틴 단백질 만이 본 명세서에서 기술한 바와 같은 우수한 결합 특성을 나타낸다.
일실시예에서, 본 발명의 방법은 헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 단백질을 확인하는 방법에 관한 것으로서, 2개의 단량체 유비퀴틴 유닛들은 선단과 말단(head-to-tail)의 배열로 연결되어 있고 상기 헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 단백질의 각각의 단량체는 서열번호 1의 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 및 68 위치(이들 각각은 표면 노출됨)에서 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 6개의 아미노산의 치환에 의해 상이하게 변형되어 있으며, 상기 치환은 (1) 제1 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되고, 제2 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되며 선택적으로 아미노산 2 위치에서 추가적으로 치환되거나, (2) 제1 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되고, 제2 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되며 선택적으로 아미노산 2 위치에서 추가적으로 치환되는 것을 포함하며, 선택적으로 추가의 변형, 바람직하게는 다른 아미노산의 치환을 포함하고, 상기 변형된 단량체 유비퀴틴 유닛은 상기 서열번호 1에 대해 80% 상동성, 적어도 83% 상동성, 적어도 85% 상동성 및 적어도 90% 상동성으로 구성된 군 중 적어도 하나의 아미노산 상동성을 갖고, 상기 단백질은 리간드에 대해 Kd = 10-7- 10-12 M의 특이적인 결합 친화도를 가지며 상기 리간드에 대해 1가의 결합 활성을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 각각의 단량체 유비퀴틴 유닛에서 서열번호 1의 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 및 68 위치의 6개, 7개, 8개, 9개 또는 모든 아미노산들이 치환된다. 본 발명은 각각의 단량체 유닛, 예를 들어 제1 유닛 및 제2 유닛에서 이러한 변형들 각각의 조합을 허용하는 것을 본 발명의 기술분야의 당업자라면 이해할 것이다. 예를 들어, 제1 단량체 유닛이 6개의 변형을 포함하는 경우 제2 단량체 유닛은 7개 또는 8개 변형을 포함할 수 있고, 제1 단량체 유닛이 8개의 변형을 포함하는 경우 제2 단량체 유닛은 7개의 변형을 포함할 수 있는 것 등이다. 상기 열거된 아미노산들 각각은 제1 유닛 및 제2 유닛에서 선택될 수 있고, 그리고 나서 양 유닛은 조합될 수 있다. 바람직한 치환들은 본 명세서에서 후술된다.
헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질 디스플레이 방법 (Methods of displaying the modified hetero-multimeric ubiquitin proteins)
본 출원에 적용되는 파아지 디스플레이 및 리보좀 디스플레이 과정이 후술되며 실시예들에서 설명된다. 이들은 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 잠재적 리간드에 대해 결합 특성을 보이는 유비퀴틴의 변이들에 대한 본 발명에 따른 선택과정을 위한 예시로서 인용된다. 동일한 방식으로, 예를 들어, 세균에 대한 표시 방법(bacterial surface display; Daugherty et al., 1998, Protein Eng. 11(9):825-832) 또는 효모 세포 디스플레이(yeast surface display; Kieke et al., 1997 Protein Eng. 10(11):1303-10) 또는 리보좀 디스플레이와 같은 세포없는 선택 시스템 (Hanes and Pluckthun, 1997 Proc Natl Acad Sci U S A. 94(10):4937-4942; He and Taussig, 1997 Nucleic Acids Res. 25(24):5132-5134) 또는 시스(cis) 디스플레이 (Odegrip et al., 2004 Proc Natl Acad Sci U S A. 101(9):2806-2810) 또는 mRNA 디스플레이가 적용될 수 있다. 후자의 경우, 리보좀을 통해 단백질 변이체가 적합한 mRNA에 커플링됨으로써 유전자형과 표현형의 일시적인 물리적 연결이 달성된다.
본 명세서에서 기술된 파아지 디스플레이 과정에서, 유비퀴틴의 재조합 변종들은 사상 파아지(filamentous phage) 상에 나타나며 상기 변종들의 코딩 DNA는 동시에 파아지 외피 내에 단일 가닥 형태로 패키징되어 존재한다. 따라서, 특정 특성들을 갖는 친화도가 풍부한 변종들이 라이브러리로부터 선택되고, 이들의 유전 정보는 적합한 세균 감염에 의해 증폭되거나 다른 증폭 사이클에 추가될 수 있다. 파아지 표면 상에 돌연변이된 유비퀴틴이 나타나는 것은 아미노 말단 신호 서열, 바람직하게는 PelB 신호 서열에 대한 유전적 융합에 의해 달성되는데, 바람직하게 파아지의 캡시드 또는 표면 단백질은 캡시드 단백질 pIII 또는 이의 단편에 대한 카르복시 말단 융합이다. 또한, 인코딩된 융합 단백질은 예를 들어 친화 크로마토그래피에 의한 검출 및/또는 정제를 위한 친화 태그 또는 항체 에피톱, 또는 친화도 향상 과정에서 융합 단백질의 특이적 절단을 위한 프로테아제 인지 서열과 같은 기능적 요소들을 포함한다. 그리고, 예를 들어 유비퀴틴 변종 유전자와 파아지 캡시드 단백질 또는 이의 단편의 코딩 영역과의 사이에 앰버 정지 코돈(amber stop codon)이 존재할 수 있는데 파아지 캡시드 단백질 또는 이의 단편의 코딩 영역은 하나의 아미노산 도입에 부분적으로 기인하여, 적합한 억제균주(suppressor strain)에서의 해독 동안 인지되지 않는다.
타겟에 대한 결합 특성을 갖는 유비퀴틴 변종의 분리 관점에서 선택 과정에 적합하고 융합 단백질의 유전자 카세트가 삽입되는 세균 벡터는 파지미드(phagemid)라고 지칭된다. 무엇보다는 이는 사상 파아지(예를 들어 M13 또는 f1)의 인터제닉 영역(intergenic region) 또는 그 일부를 포함하는데, M13K07과 같은 헬퍼 파아지에 의해 파지미드를 운반하는 세균 세포의 중복감염(superinfection)이 나타나는 경우 파아지 캡시드로의 파지미드 DNA의 공유결합 폐쇄형 가닥(covalently closed strand)의 패키징이 일어난다. 이러한 방식으로 생성된 파아지 입자는 세균에 의해 분비되고 표면 상에 각각의 인코딩된 유비퀴틴 변종들이 나타나게 되는데 이는 파아지 입자 표면 상에서 캡시드 단백질 pIII 또는 이의 단편에 대한 융합에 기인한다. 원래의 pIII 캡시드 단백질은 파아지 입자 내에 존재하여 적합한 세균 균주를 재감염시키는 능력과 이에 따른 대응 DNA를 증폭하는 능력이 보유된다. 따라서, 유비퀴틴 변종의 표현형, 즉 잠재적 결합 특성과 유전자형 사이의 물리적 연결이 보장된다.
수득된 파아지 입자들은 그 위에 존재하는 유비퀴틴 변종이 임의의 타겟, 예를 들어, ED-B, TNF 알파, MIA-2, NGF, IgG 또는 다른 타겟과 결합하는 것과 관련하여 당업자에게 알려진 방법들에 의해 선별될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 유비퀴틴 변종들은 예를 들어 미세적정(microtiter) 플레이트 상에 결합된 물질을 표적화하기 위해 일시적으로 고정될 수 있고 비-결합 변종들이 분리된 후 특이적으로 용리될 수 있다. 이러한 용리는 예를 들어 100 mM 트리에틸아민과 같은 기본 용액에 의해 수행되는 것이 바람직하다. 대안으로, 상기 용리는 산성 조건, 단백질 가수분해 또는 감염된 세균의 직접 첨가에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방식으로 수득된 파아지 입자들은 예를 들어, ED-B, TNF 알파, MIA-2, NGF, IgG 또는 다른 타겟에 대한 결합 특성을 갖는 유비퀴틴의 선별 및 증폭의 연속적인 사이클을 수행함으로써 재증폭되어 증량될 수 있다.
파아지 디스플레이의 변형이 Tat 파아지 디스플레이 기술이다(Paschke, M. and W. Hohne (2005). Gene 350(1): 79-88; EP 1567643 참조). 이 방법에 의해 파지미드에 의해 인코딩되는 유비퀴틴 변종은 Tat(twin arginine translocation) 시스템을 통해 분비되는데, Tat 시스템은 세포질 내에서 이미 원래의 구조를 획득한 접힘 단백질(folded protein)을 수송한다(Bruser 2007 Appl Microbiol Biotechnol 76(1): 35-45). 분비에 필요한 것은 유비퀴틴 변종을 Tat 구멍으로 향하게 하는 특정 N-말단 시그날 펩티드에 융합되는 것이다. 주변 세포질 공간으로 들어간 후, N-말단 시그날 펩티드는 시그날 펩티다아제에 의해 제거된다. 그런 다음, 주변 세포질 공간에서 유비퀴틴 변종은 다른 파아지 단백질과 같이 Sec 경로를 통해 세포질로부터 분비되는 캡시드 단백질 pIII 또는 이의 C-말단 단편에 공유결합된다. 유비퀴틴과 pIII 사이의 연결은 pIII 단백질의 N-말단에서의 Jun 루신 지퍼(Jun leucine zipper)와 유비퀴틴 변종의 C-말단에서의 Fos 루신 지퍼(Fos leucine zipper)의 높은 친화도를 갖는 상호작용에 의해 실현된다. 루신 지퍼 각각의 N-말단과 C-말단에서의 추가적인 시스테인들은 2개의 단백질 사이의 공유결합을 가능하게 하고, 그 결과 파아지 입자 내에서 디스플레이된 유비퀴틴과 이의 인코딩 유전자 산물 사이의 공유결합을 가능하게 한다.
상기 방식으로 수득된 유비퀴틴 변종들에 대한 추가 특성화는 여전히 파지미드 형태일 때, 즉 파아지에 융합된 형태일 때, 또는 대응하는 유전자를 적합한 발현 벡터로 클론닝한 후 얻은 가용성 단백질 형태일 때 수행될 수 있다. 적절한 방법은 당업자나 문헌에 기술된 바와 같이 공지된 것이다. 특성화는 예를 들어 DNA 서열의 결정과 이에 따른 분리된 변종의 1차 서열의 결정을 포함할 수 있다. 또한, 분리된 변종들의 친화도 및 특이도는 ELISA, 표면 플라즈몬 공명 분광법(plasmon surface resonance spectroscopy), 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 형광 이방성 측정법(fluorescence anisotropy), 형광 분광법, FACS, ITC(isothermal titration calorimetry) 또는 분석용 초원심분리법 등과 같은 생화학적 표준 방법들에 의해 검출될 수 있다. 안정성 분석의 관점에서, 예를 들어 화학적 또는 물리적 풀림(unfolding)과 관련한 분광법들이 당업자에게 알려져 있다. 다른 잘 알려진 방법들로는 CD 분광법(CD spectroscopy), 단백질 형광 분광법(protein fluorescence spectroscopy) 및 NMR 분광법(NMR spectroscopy)이 있다.
본 발명의 추가 실시예인 리보좀 디스플레이 과정에서, 유비퀴틴의 변종들은 세포 없는 전사/해독 시스템에 의해 준비되고 리보좀 뿐만아니라 대응하는 mRNA와의 복합체로서 제공된다. 이러한 목적을 위해 전술한 바와 같은 DNA 라이브러리가 기반이 되며 여기서 변종들의 유전자들은 발현 및 단백질 생합성을 위한 대응 조절 서열들과 융합된 형태로 존재한다. 유전자 라이브러리의 3' 말단에서의 정지코돈의 결실과 적합한 실험 조건들(낮은 온도, 높은 Mg2+ 농도) 때문에, 초기 단백질, mRNA 및 리보좀으로 구성된 3원 복합체(ternary complex)는 시험관내 전사/해독 기간 동안에 유지된다.
헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 단백질을 포함하는 단백질 라이브러리가 단량체 유비퀴틴 유닛들 각각에서 선택된 아미노산들을 상이하게 변형함으로써 구축된 후, 상기 변형 이량체 단백질은 본 발명에 따라 타겟과 접촉되고 결합 친화도가 존재한다면 결합 파트너와의 결합이 가능하게 된다. 이러한 단백질 라이브러리는 변형된 단백질과 타겟 단백질 사이의 접촉을 가능하게 하는 방식에서 변형된 단백질을 디스플레이하는 디스플레이 방식의 라이브러리 형태로 존재하거나 변형된 단백질을 나타내는 다른 방법을 이용하는 라이브러리 형태로 존재할 수 있다. 상기 디스플레이 방식은 선택적으로 파아지 디스플레이, 리보좀 디스플레이, TAT 파아지 디스플레이, 세포 표면 디스플레이, 효모 디스플레이, 세균 디스플레이 또는 mRNA 디스플레이 방법이다.
헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질에 대한 잠재적 리간드(Potential ligands) 및 타겟
본 발명은 다음과 같은 대표적인 항원들, 즉 ED-B, TNF-알파, MIA-2, NGF 및 IgG에 대해 성공적으로 확립되었다. 이들 항원들은 단지 본 명세서에서 기술된 방법들이 명세서에 제공된 정보에 의해 과도한 노력없이도 본 발명의 기술분야의 당업자에 의해 성공적으로 수행될 수 있는 것을 보이기 위해 선택된 것임을 이해해야 한다. 본 발명은 특정 항원에 제한되는 것이 아니며 본 발명의 기술분야에 알려진 모든 또는 적어도 대부분의 리간드와 타겟 분자들에 대해 수행될 수 있다. 이들 타겟들은 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에 의해 선택될 수 있다. 이하에서는 항원 및 합텐 뿐만아니라 리간드 및 타겟에 대한 일반적인 정의를 설명하고 추가적인 잠재적 타겟 분자들에 대해 선택된 사례도 제공한다.
본 발명에 따르면, 항원은 항체에 비견되는 기능을 갖는 변형 유비퀴틴에 의해 결합될 수 있는 물질을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 대체 용어로는 리간드, 결합 파트너 또는 타겟이다. 본 발명의 변형 유비퀴틴 단백질들은 항체의 단점을 회피하면서 항체와 유사한 방식으로 작용하는 결합 분자들을 제공한다. 항원이라는 용어는 합텐, 펩티드, 단백질, 당, DNA 등을 포함한다. 로슈 렉시콘 메디신(Roche Lexikon Medizin) (4th edition; Urban & Fischer/Elsevier GmbH)에 따르면 항원 및 합텐의 정의는 다음과 같은데, 이는 본 명세서에서도 사용될 수 있다.
항원 (AG): 면역계에 의해 외부물질("비자기")로 인지되는 물질을 지칭한다. 대부분의 경우 면역 반응을 일으켜 면역원성(="면역원")을 유도한다. 알레르기(="알레르겐") 및 아토피("아토피겐")의 경우, 이러한 면역반응이 과도하게 일어난다. 항원은 체액성 방어 반응(항원-항체 반응) 및/또는 세포성 방어 반응(아래의 면역원성 참조)을 유도한다. 항원이 면역계에 의해 허용(면역 관용)되는 경우, 이러한 항원은 "관용원(tolerogen)"으로 불린다. 항원으로 유효한 물질은 주로 복합체이며 고분자 물질(단백질, 다당류, 뉴클레오티드 및 다수의 합성 화합물)로서 면역반응에 관여하는 화학적으로 확인가능한 기능기(결정기)를 갖는다. 항원은 다음과 같이 1) 대부분 고분자 물질이며 자체로서 면역반응을 일으킬 수 있는 완전 항원, 2) 저분자 물질이며 보다 큰 캐리어 분자에 커플링된 후에 면역원으로 작용하는 합텐(= 반화 항원(half antigen))으로 분류된다. 예를 들어, 이종 항원, 동종 항원 또는 자가 항원, 자가 이식 항원, 헤테로 이식 항원, 항-종양 바이러스 항원으로 불린다.
합텐: 항원의 특이도에 관여하거나 또는 그 구조(결정기)에 기인하여 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단순한 저분자 화합물이나, 완전 항원과는 대조적으로 알레르기를 생성할 수는 없다. 합텐은 캐리어라고 불리는 단백질 몸통과 결합한 후에 완전 항원이 된다.
"리간드", "타겟(표적)" 또는 "결합 파트너"는 본 명세서에서 기술되는 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질에 의해 인지되는 분자이다. 본 발명의 실시예에서 사용될 수 있으나 본 발명을 제한하지 않는 리간드의 예로는 세포막 수용체에 대한 애고니스트(agonist) 또는 길항제(antagonist), 독소 및 독, 바이러스 에피톱, 호르몬, 호르몬 수용체, 폴리펩티드, 펩티드, 효소, 효소 기질, 보조인자(cofactor), 약물(예를 들어, 아편, 스테로이드 등), 렉틴(lectins), 당, 폴리뉴클레오티드, 핵산, 올리고당, 단백질 및 단일 클론 항체를 들 수 있다.
요약하면, 본 발명에 따라 제공되는 변형된 단백질에 대한 결합 파트너로서는 모든 생물학적 및 의학적으로 활성인 관련 분자들이 사용될 수 있다. 가능한 결합 파트너들이 후술하는 실시예에서 기술된다. 그러나, 복수의 다른 가능한 리간드들이 사용가능 리스트에 추가될 수 있음을 주목해야 한다. 항체와 항원 간의 관계와 유사하게, 잠재적 결합 파트너들의 리스트는 추가적인 잠재적인 리간드들에 의해 완성될 수 있다.
본 발명에 있어서 헤테로-이량체 유비퀴틴에 대한 결합 파트너의 예로서는 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B (ED-B), 사이토카인 (TNF-α), MIA-2, 이뮤노글로불린 또는 그 일부, 예를 들어 전체 항체 (예를 들어, 이뮤노글로불린 G), 및 생장인자(예를 들어, NGF, 인간의 신경 생장 인자(human nerve growth factor))를 들 수 있다. 이러한 리간드들에 대한 간략한 설명이 후술된다. 그러나, 이들 리간드들 모두는 수 년간 본 발명의 기술분야에서 잘 알려져 있고 개별 기술 분야에서 전문가들에 의해 알려져 있다. 따라서, 후술하는 설명은 아미노산 서열들이 알려진 이들 단백질들의 일부 주요 파라미터들에 대한 간단한 요약이다.
피브로넥틴의 엑스트라도메인 B (ED-B)는 1차 RNA 전사물의 다른 방식의 스프라이싱에 의해 피브로넥틴 분자로 삽입된 작은 도메인이다. ED-B는 암과 건선에 관련된 것으로 알려져 있다. ED-B의 놀라운 높은 발현 수준은 유방암, 대장암, 비소세포암(non-small cell lung cancer), 췌장암, 간세포암(hepatocellular cancer), 두경부암, 인간 피부암, 두개 수막종(intracraneal meningeoma) 및 교모세포종(glioblastoma)을 포함하는 대부분의 인간의 고형암들의 전이 부위 뿐만아니라 1차 병변 부위에서 검출된다(Menrad u. Menssen, 2005). 또한, ED-B는 진단제에 결합될 수 있어 바람직하게 진단 수단으로서 사용될 수 있다. 한가지 예로서 죽상경화판(atherosclerotic plaques)의 분자적 이미징에서의 사용과, 암환자의 면역신티그라피(immunoscintigraphy)에 의한 암검출에서의 사용이다. 많은 다른 진단학적 사용들이 사용가능하다.
피브로넥틴의 인간 엑스트라도메인(ED-B)의 91개 아미노산의 서열은 서열번호 2와 같다. 단백질 발현을 위해 개시 메티오닌이 추가되어야 한다. ED-B는 예를 들어 설치류, 소, 영장류, 육식동물, 인간 등과 같은 포유동물에서 보존적이다. 인간의 ED-B와 100% 서열 상동성을 갖는 동물의 예로는 시궁쥐(Rattus norvegicus), 소(Bos taurus), 생쥐(Mus musculus), 말(Equus caballus), 붉은털원숭이(Macaca mulatta), 개(Canis lupus familiaris) 및 침팬지(Pan troglodytes)가 있다.
MIA (melanoma inhibitory activity) 단백질 ["CD-RAP (cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein)"라고도 불림]은 연골세포에서 발현되고 시험관내에서의 항-증식 특성에 기인하여 최초로 분리되었다. 최초, MIA는 흑색종 배양액의 상층액에서 검출되어 분리되었다. 정제 및 단백질의 부분적 시퀀싱 후, 인간의 MIA cDNA 단편을 축퇴 프라이머(degenerated primer) 및 RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction)을 이용하여 분리하였다. 현재는 인간, 쥐, 소, 래트 및 제브라피시의 MIA 서열이 알려져 있다. 관련 단백질인 MIA-2는 유럽특허 제1410803B1호 및 미국특허공개공보 제US 2010/0212037호에 기술되어 있다. 이들 문헌들은 본 명세서에 참조로서 통합된다.
TNF-알파(Tumor Necrosis Factor-alpha)는 주로 대식세포에 의해 생산되는 다면발현성 사이토카인(pleiotropic cytokine)이며 다른 타입의 세포들에 의해서도 생산된다. TNF-알파는 병인성 활성 뿐만아니라 유익한 활성도 나타낸다. 이는 자기 조절 효과(self-regulatory) 이외에도 생장 자극 효과와 생장 저해 효과를 모두 가진다. TNF-알파의 유익한 기능으로는 항상성을 유지하는 것인데, 이는 인체의 활동일 주기(circadian rhythm)를 조절하고 세균, 바이러스, 균류 및 기생충 감염에 대해 면역 반응을 준비시키며, 섬유아세포 생장을 자극하여 손상된 조직을 대체하거나 리모델링하고 이름이 나타내는 바와 같이 소정의 종양들을 사멸시킨다. TNF-알파는 다양한 질환들에서 매개자로서 관여한다.
NGF(Nerve growth factor)는 감각신경세포 및 교감신경세포의 생존과 분화를 촉진하는 분자로서 약 50년 전에 발견된 분비 단백질이다. NGF는 뉴로트로핀(Neurotrophin)으로 알려진 신경영양인자 패밀리의 일원이다. NGF는 TrkA로 알려진 트로포미오신(tropomyosin) 수용체 카이네이즈에 높은 친화도를 갖고 결합한다. 또한, NGF는 종양괴사인자 수용체(tumor necrosis factor receptor) 슈퍼패밀리의 일원이고 다른 뉴로트로핀과도 상호작용하는 p75라는 수용체와 결합할 수 있다. NGF의 베타 사슬은 단독으로 NGF의 신경 생장 자극 활성에 관여한다. 상기 베타 사슬은 호모-이량체화되어 보다 큰 단백질 복합체로 통합된다. NGF의 구조 및 기능은 예를 들어 다음의 문헌들에서 설명되어 있다(Sofroniew, M.V. et al. (2001) Annu. Rev. Neurosci. 24:1217-1281; Weismann, C. and de Vos, A.M. (2001) Cell. Mol. Life Sci. 58:748-759; Fahnestock, M. (1991) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 165:1-26).
IgG 항체는 4개의 펩티드 사슬들로 구성된 약 150 kDa의 대형 분자이다. 이는 약 50 kDa를 갖는 동일한 중쇄 2개와 약 25 kDa를 갖는 동일한 경쇄 2개를 포함하여 사량체의 4원 구조(quaternary structure)를 이룬다. 2개의 중쇄는 서로에 대해 연결되어 있고 이황화 결합에 의해 각각의 경쇄에 연결되어 있다. 최종적인 사량체는 Y자와 같은 형상(포크 형상)을 함께 형성하는 2개의 동일한 반쪽을 갖는다. 포크의 각 말단은 동일한 항원 결합 부위를 포함한다. IgG의 Fc 영역은 고도로 보존된 N-글리코실화 부위를 갖는다. 이 부위에 부착된 N-글리칸은 복합체 형태에 대해 코어-푸코실화(fucosyl)가 우세한 2개의 안테나를 갖는(diantennary) 구조이다. 또한, 이러한 N-글리칸들 중 소수는 2등분 GlcNAc와 α-2,6 링크된 시알산 잔기들을 갖는다.
디스플레이된 단백질들의 선별, 증량 및 특성화 방법
10-7- 10-12 M 범위의 Kd 값의 특이적 결합 친화도를 갖는 리간드에 대한 결합 활성을 보이는 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴들의 선별은 당업자에게 알려진 방법들에 의해 수행될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 예를 들어 리보좀 복합체 상에 존재하는 유비퀴틴 변종들은 예를 들어 미세적정 플레이트 상에 결합된 물질을 표적화하기 위해 일시적으로 고정되거나, 용액 내 결합 후 자성입자에 결합될 수 있다. 비-결합 변종들의 분리 후, 결합 활성을 갖는 변종들에 대한 유전 정보는 리보좀 복합체의 파괴에 의해 mRNA 형태로 특이적으로 용리될 수 있다. 상기 용리는 EDTA로 수행되는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로 얻어진 mRNA는 분리되고 적합한 방법들(역전사효소 반응)에 의해 DNA로 역전사되며, 역전사되어 얻어진 DNA는 재증폭될 수 있다.
시험관내 전사/해독, 선별 및 증폭의 연속적인 사이클에 의해 미리 정해진 합텐 또는 항원에 대해 결합 특성을 갖는 유비퀴틴 변종들은 증량될 수 있다.
전술한 방식으로 얻어진 유비퀴틴 변종들에 대한 추가 특성화는 대응되는 유전자 카세트를 적합한 발현 벡터로 클로닝한 후 앞서 상세히 기술한 바와 같이 가용성 단백질 형태에서 수행될 수 있다. 적합한 방법들은 당업자에 알려져 있거나 본 명세서에 언급된 문헌들에 기술되어 있다.
미리 정해진 결합 파트너에 대해 결합 친화도를 갖는 단백질 검출 단계 이후 검출된 단백질의 분리 및/또는 증량 단계(풍부하게 하는 단계)가 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라 변형된 유비퀴틴 단백질 발현 이후 당업계에 공지된 방법들에 의해 상기 변형된 유비퀴틴 단백질은 추가로 정제 및 증량될 수 있다. 선별 방법들은 당업자에게 알려진 몇가지 인자에 의해 좌우되는데, 예를 들어, 사용된 발현 벡터, 숙주 생물, 의도된 사용 분야, 단백질의 크기 및 기타 다른 요소들을 들 수 있다. 단순화된 정제를 위해 본 발명에 따라 변형된 단백질은 분리 물질에 대해 증가된 친화도를 갖는 다른 펩타이드 서열에 융합될 수 있다. 이러한 융합은 유비퀴틴 단백질의 기능에 악영향을 주지 않고 특이적 프로테아제 절단 부위의 도입에 의해 정제 후 분리될 수 있도록 선정되는 것이 바람직하다. 이러한 방법들은 당업자에게 공지되어 있다.
돌연변이 생성 출발점으로서의 변형되지 않은 유비퀴틴 단백질 및 변형된 유비퀴틴 단백질
"결합할 수 있는 단백질" 또는 "결합 단백질"이라는 용어는 이후 추가로 정의되는 바와 같이 하나의 결합 영역을 포함하는 유비퀴틴 단백질을 지칭한다. 결합 영역은 적어도 2개의 결합 결정 영역("BDR")을 지칭할 수 있다. 각각의 단량체는 적어도 하나의 결합 결정 영역을 갖고, 적어도 2개의 단량체는 하나의 항원에 대한 하나의 결합 영역을 형성하는 적어도 2개의 결합 결정 영역을 갖는 다량체를 형성한다. 이러한 유비퀴틴에 기초한 결합 단백질은 결합 도메인이 아닌 추가 단백질 도메인을 포함할 수 있는데, 예를 들어, 다량체화 부분(multimerization moieties), 폴리펩타이드 태그, 폴리펩타이드 링커 및/또는 비-단백질 폴리머 분자를 포함할 수 있다. 비-단백질 폴리머 분자의 예로는 히드록시에틸 전분(hydroxyethyl starch), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 등이 있다.
헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질에 대한 추가의 다량체화는 예를 들어, 다량체화 도메인을 갖는 이펙터 분자(예를 들어, TNF-α)에 대해 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질을 해독 후 융합시킴으로써 수행될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 추가의 다량체화는 폴레에틸렌 글리콜(PEG) 링커를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 상기 다량체화 도메인은 약제학적으로 활성 성분으로 작용하는데, 예를 들어, TNF-알파는 다량체화 도메인과 약제학적 성분으로 작용한다.
헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질
"변형된 유비퀴틴 단백질"은 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실 또는 이들의 조합 중 어느 하나에 의한 유비퀴틴 단백질의 변형을 지칭하고, 치환이 가장 바람직한 변형으로서 전술한 변형들 중 하나에 의해 보충될 수 있다. 상기 변형된 단량체 유비퀴틴 유닛은 서열번호 1에 대해 80% 상동성, 적어도 83% 상동성, 적어도 85% 상동성 및 적어도 90% 상동성으로 구성된 군 중 적어도 하나의 아미노산 상동성을 갖기 때문에 변형의 수는 엄격히 제한된다. 따라서, 변형된 아미노산들의 전체 수, 바람직하게는 단량체 유닛에서의 전체 치환수는 최대 15개 아미노산으로 제한되는데 이는 80% 아미노산 상동성에 해당된다. 대안으로, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개 또는 5개의 아미노산들이 변형될 수 있다. 이량체 유비퀴틴 분자에서 변형된 아미노산의 전체 수, 바람직하게는 전체 치환수는 30개 아미노산이며, 이는 이량체 단백질에 기초로 할 때 20% 아미노산 변형에 해당된다. 대안으로, 이량체 유비퀴틴 분자에서 28개, 26개, 24개, 22개, 20개, 18개, 16개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개 또는 5개의 아미노산들이 변형될 수 있다. 서열번호 1의 기본 단량체 서열을 갖는 2개의 변형되지 않은 단량체 유비퀴틴 단백질들로 구성된 이량체 유비퀴틴 단백질에 대해 이량체의 변형된 유비퀴틴 단백질의 아미노산 상동성은 80% 상동성, 적어도 83% 상동성, 적어도 85% 상동성 및 적어도 90% 상동성으로 구성된 군 중 적어도 하나의 아미노산 상동성이 선택된다.
본 발명의 방법에 따라 얻은 변형된 유비퀴틴 단백질은 타겟 분자, 리간드 또는 결합 분자(이러한 표현들은 본 명세서에서 교대로 사용됨)에 대해 신규한 결합 친화도를 갖도록 유전공학적으로 처리된 재조합 단백질이다.
"치환"이라는 용어는 예를 들어 원래 아미노산에 화학기 또는 잔기를 치환하거나 추가함으로써 아미노산이 화학적으로 변형된 것도 포함한다. 베타 시트 영역의 적어도 하나의 베타 시트 스트랜드에 위치한 아미노산 또는 상기 베타 시트 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 아미노산을 포함하는 단백질의 적어도 하나의 표면 노출 영역에서의 아미노산 치환이 중요하다.
변형은 당업계에 잘 알려지고 확립된 방법에 의해 수행된다. "무작위로 변형된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열"은 다수의 위치에서 삽입, 결실 또는 치환이 된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로서 그 성질은 예측할 수 없다. 많은 경우, 무작위의 뉴클레오티드(아미노산) 서열 또는 삽입 뉴클레오티드(아미노산) 서열은 완전하게 무작위로 된다(예를 들어, 무작위의 합성 또는 PCR 매개의 돌연변이의 결과임). 그러나, 무작위 서열은 공통의 기능성 특성(예를 들어, 발현 산물의 리간드와의 반응성)을 갖는 서열을 포함할 수도 있고, 또는 무작위 서열은 상이한 아미노산들이 골고루 분포하는 것과 같이 궁극적인 발현 산물이 완전히 무작위 서열인 의미에서 무작위적일 수 있다.
무작위화된 단편을 벡터에 적절하게 도입하기 위해서, 무작위 뉴클레오티드는 위치지정 PCR-매개 돌연변이 원리에 의해 발현벡터로 도입되는 것이 바람직하다. 그러나, 다른 방법들도 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어 합성된 무작위 서열 라이브러리를 벡터로 삽입하는 것 또한 가능하다.
돌연변이 또는 라이브러리를 생성하기 위해 융합 PCR, 예를 들어 3회 PCR 반응이 수행될 수 있다. 부분적으로 중첩되는 중간 단편(intermediate fragments)을 생성하기 위해 2회의 PCR 반응이 수행되고, 3번째 PCR 반응은 상기 중간 단편들을 융합시키기 위해 수행된다.
라이브러리 또는 돌연변이 변종들을 구축하는 방법은 원하는 제한 부위 주위의 제1 프라이머 세트(제한 부위 프라이머)로서 정방향 및 역방향 제한 프라이머와, 문제의 코돈 주위, 예를 들어 업스트림 및 다운스트림에 대한 제2 프라이머 세트(돌연변이 생성 프라이머)로서 정방향 및 역방향 돌연변이 생성 프라이머를 구성하는 것을 포함할 수 있다. 일실시예에 있어서, 프라이머들은 문제의 코돈에 대해 각각 업스트림과 다운스트림으로 구성된다. 제한 프라이머와 돌연변이 생성 프라이머는 제1 중간 단편과 제2 중간 단편을 구성하기 위해 사용된다. 2회의 PCR 반응은 이들 선형의 중간 단편들을 생성한다. 이들 선형의 중간 단편들 각각은 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 문제의 코돈, 주변 뉴클레오티드 서열(flanking nucleotide sequence) 및 절단 부위를 포함한다. 3차 PCR 반응은 2개의 중간 단편들과 정방향 및 역방향 제한 프라이머를 사용하여 융합된 선형 산물을 생성한다. 상기 선형 산물의 서로 대향하는 부착되지 않은 말단들은 제한 효소에 의해 절단되어 선형 산물 상에 접합 말단들이 생성된다. 상기 선형 산물의 접합 말단들은 DNA 라이게이즈의 사용에 의해 융합되어 원형의 산물, 예를 들어, 원형의 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하게 된다.
중간 단편을 구성하기 위해, 2개 세트의 정방향 및 역방향 프라이머의 설계와 합성이 수행되는데, 제1 세트의 프라이머는 제한 효소 절단 부위와 주변 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 세트의 프라이머(돌연변이 생성 프라이머)는 문제의 코돈에 대한 적어도 하나의 변이를 포함한다. 당업자라면 변종의 수는 원하는 변종 아미노산 변형의 수에 의존하는 것을 인지할 것이다. 다른 제한 효소가 본 과정에 사용된다면 절단 부위의 정확한 위치와 대응하는 정방향 및 역방향 프라이머는 이에 따라 변경된다는 것이 본 발명자들에 의해 고려되었다. 당업계에서 사용가능한 다른 방법들이 대신에 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명에 따라 스캐폴드에 무작위 발현산물의 단편이 도입되는 것과는 별도로, 적어도 하나의 융합 파트너를 인코딩하는 뉴클레오티드에 무작위 뉴클레오티드 서열을 융합시킴으로써 무작위 서열을 융합 파트너에 커플링하는 것도 종종 요구된다. 이러한 융합 파트너는 예를 들어, 발현 및/또는 발현 산물의 정제/분리 및/또는 추가 안정화를 촉진할 수 있다.
정제를 위해, 융합 파트너는 His6 태그(tag), myc 태그, BSP 비오틴화 표적 서열(biotinylation target sequence), BirA, flu 태그, lacZ 및 GST와 같은 정제 태그를 포함할 수 있다. 또한, 융합 파트너는 분류 시그널 또는 타겟팅 서열을 포함할 수 있다.
타겟 분자에 특이적인 새로운 결합 도메인의 생성을 위한 아미노산 치환은 바람직한 아미노산에 의해, 즉 타겟 분자에 대한 새로운 결합 특성을 생성하는 변형을 위한 아미노산에 의해 본 발명에 따라 수행될 수 있는데, 상기 아미노산의 특정 화학적 성질 또는 측쇄가 치환대상이 되는 아미노산의 특정 화학적 성질 또는 측쇄와 유사할 것을 고려할 필요가 없고 어떠한 바람직한 아미노산도 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다.
선택된 아미노산의 변형 과정은 바람직하게는 무작위 돌연변이생성에 의한 유전자 수준 상의 돌연변이, 즉 선택된 아미노산의 무작위 치환에 의해 본 발명에 따라 수행된다. 바람직하게는, 유비퀴틴의 변형은 각각의 단백질에 속하는 DNA의 전환을 위한 유전공학기법에 의해 수행된다. 바람직하기로는, 유비퀴틴 단백질의 발현은 원핵생물 또는 진핵생물에서 수행된다.
치환은 특히 베타 시트의 4개의 베타 스트랜드들의 표면 노출 아미노산 또는 유비퀴틴 단백질의 베타 시트 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 표면 노출 아미노산에서 일어난다. 각각의 베타 스트랜드는 통상 5개 내지 7개의 아미노산으로 구성된다. 서열번호 1을 참조하면, 예를 들어 단량체 유비퀴틴의 베타 스트랜드는 일반적으로 아미노산 잔기 2-7, 12-16, 41-45 및 65-71을 포괄한다. 추가로 바람직하게 변형될 수 있는 영역은 베타 시트 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치(즉, 1, 2, 또는 3)를 포함한다. 특히, 추가로 바람직하게 변형될 수 있는 바람직한 영역은 특정 아미노산 잔기 8-11, 62-64 및 72-75를 포함한다. 상기 바람직한 영역은 2개의 베타 스트랜드를 함께 연결하는 베타 회전(beta turn)을 포함한다. 하나의 바람직한 베타-회전은 아미노산 잔기 62-64를 포함한다. 베타 시트 스트랜드에 가장 인접한 가장 바람직한 아미노산은 위치 8의 아미노산이다. 또한, 아미노산 치환을 위한 추가의 바람직한 예는 위치 36, 44, 70, 71 및/또는 73이다. 예를 들어, 추가로 바람직하게 변형될 수 있는 이들 영역은 아미노산 62, 63 및 64 (3개의 아미노산), 또는 아미노산 72 및 73 (2개의 아미노산), 또는 아미노산 8 (1개의 아미노산)을 포함한다.
단량체 유비퀴틴 유닛에서 추가 또는 결실될 수 있는 아미노산의 수는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 그 이상으로 제한되고, 헤테로-이량체 유비퀴틴 단백질에서 추가 또는 결실될 수 있는 아미노산의 수는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 18개, 20개, 22개, 24개, 26개 또는 28개로서 일반적으로 단량체 단백질에서의 변형 수에 대해 x-배로 제한된다. 통상, 단량체 분자는 1개-10개의 아미노산 삽입 및/또는 1개-7개의 아미노산 결실을 포함한다. 치환 수는 단량체 분자 당 적어도 6개 아미노산 치환, 최대 14개 아미노산 치환이다. 이량체 분자는 적어도 12개 치환 및 최대 28개 치환, 적어도 1개 삽입 및 최대 20개 삽입, 및/또는 적어도 1개 결실 및 최대 14개 결실을 포함한다. 이들 범위의 수는 본 발명에 의해 사용될 수 있고 포괄되며, 결실 수, 삽입 수 및 치환 수의 조합도 분자의 전체 구조적 동질성이 유지되는 한 사용가능하다. 본 발명의 일실시예에서, 베타-시트 구조는 유지된다.
선택적인 실시예에서, 상기 아미노산 잔기들은 아미노산 치환에 의해 전환될 수 있다. 그러나, 결실 및 삽입도 허용가능하다. 추가되거나 결실될 수 있는 아미노산의 수는 단량체 유비퀴틴 서브 유닛에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산으로 제한되고, 따라서 이량체 유비퀴틴 단백질에 대해서는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 아미노산으로 제한된다. 일실시예에서, 아미노산 삽입은 수행되지 않는다. 또 다른 실시예에서는 결실이 수행되지 않았다.
본 발명의 변형된 유비퀴틴 단백질이 청구범위에 특정되고 상세한 설명에서 설명된 상기 치환들 외에 하나 이상의 아미노산의 결실 및/또는 추가를 포함한다면, 대응하는 단백질을 서로에 대해 할당하기 위해 야생형의 인간 유비퀴틴(서열번호 1)에 대한 아미노산 위치들은 상기 변형된 유비퀴틴과 정렬시켜야 한다. 융합 단백질(이하 참조)의 경우, 각각의 단량체 유비퀴틴 서브유닛에 대한 숫자 매김(및 정렬)은 동일한 방식, 즉 예를 들어 이량체의 정렬이 각각의 서브 유닛에 대한 아미노산 위치 1에서 시작하는 방식으로 수행된다.
바람직하게는 포유동물, 예를 들어 인간의 단량체 유비퀴틴 단백질에서 베타 스트랜드 또는 상기 베타 스트랜드에 인접하는 3개의 아미노산까지의 위치들에 존재하는 아미노산의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 25%는 변형, 바람직하게는 치환될 수 있다. 최대한 허용가능한 범위에서 바람직하게는 베타 스트랜드 또는 상기 베타 스트랜드에 인접하는 3개의 아미노산까지의 위치들에 존재하는 아미노산의 약 50%, 보다 바람직하게는 약 40% 또는 약 35%, 또는 약 30%까지 또는 약 25%까지는 변형, 바람직하게는 치환된다. 하나의 베타 스트랜드에서 통상 1개 내지 4개의 아미노산들이 변형된다. 일실시예에 있어서, 베타 스트랜드, 바람직하게는 제1 베타 스트랜드 및 제4 베타 스트랜드의 6개 아미노산들 중 2개의 아미노산, 예를 들어 아미노산 잔기 2-7 또는 65-71의 영역이 변형된다.
헤테로-이량체를 위한 단위 유닛으로 사용되는 본 발명에 따른 변형된 단량체 유비퀴틴은 전체적으로 아미노산의 20%까지 이른다. 이를 고려하면, 변형된 유비퀴틴 단백질의 서열번호 1에 대한 서열 상동성은 적어도 80%이다. 본 발명의 추가 실시예에서, 아미노산 수준의 서열 상동성은 적어도 83%, 적어도 85%, 적어도 87%이고, 더욱이 서열번호 1의 아미노산 서열에 대한 서열 상동성은 적어도 90%, 적어도 92% 또는 적어도 95%이다. 본 발명은 변형된 유비퀴틴 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 97% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것도 포괄한다.
본 발명의 추가의 실시예에서, 이미 사전에 변형된 유비퀴틴(서열번호 1의 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 및/또는 68 위치에서 3개의 아미노산, 4개의 아미노산, 5개의 아미노산, 6개의 아미노산 또는 7개의 아미노산이 변형된 유비퀴틴)이 타겟에 대해 결합 특성을 생성하는 추가 변형을 위한 출발점으로서 사용된다. 전체적으로 서열번호 1의 유비퀴틴의 아미노산이 9, 10, 11, 12, 13, 14개까지 변형 그리고 최대 15개의 아미노산이 변형, 바람직하게는 치환된 유비퀴틴이 수득될 수 있다. 예를 들어, 추가의 변형은 아미노산 74 및 75에서의 변형 또는 아미노산 45에서의 변형을 포함하여 보다 양호한 안정성 또는 단백질의 화학적 특성을 생성할 수 있다. 일례에 따르면, 헤테로-다량체 단백질을 위한 단위 블록으로서의 변형된 단량체 유비퀴틴은 이와 같은 방식으로 14개의 치환과 1개의 결실을 갖는 형태로 수득될 수 있다. 유비퀴틴의 아미노산 전체 수에 대해 이는 약 20%에 해당한다. 이는 매우 적은 비율의 치환이 단백질의 접힘(folding)을 방해하는 것이 일반적인 것을 감안할 때 매우 이례적이며 놀라운 예상 밖의 결과이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유비퀴틴 단백질의 표면 상에 연속 영역을 형성하는 새로운 결합 특성을 갖는 영역의 생성을 위해 상기 아미노산들이 변형된다. 이러한 방식에 있어서, 연속 영역은 타겟 리간드에 결합 특성을 갖는 것으로 생성될 수 있다. 본 발명에 따르는 "연속영역(Contiguous region)"은 다음을 지칭한다: 측쇄의 소수성/친수성, 하전, 공간적 구조 때문에, 아미노산들이 대응하는 방식으로 그들의 환경과 상호작용하는 것을 의미한다. 환경은 용매, 통상 물 또는 다른 분자, 예를 들어 공간적으로 인접한 아미노산일 수 있다. 단백질에 대한 구조적 정보 및 각각의 소프트웨어에 의해 단백질의 표면은 특성화될 수 있다. 예를 들어, 단백질과 용매 원자들 사이의 인터페이스 영역은 이러한 인터페이스 영역이 어떻게 구조화되었지, 어느 표면 영역이 용매에 접근가능한지 또는 전하가 표면 상에 어떻게 분포되었는지에 대한 정보를 포함하는 방식으로 시각화될 수 있다. 예를 들어, 연속 영역은 적합한 소프트웨어를 사용한 상기 방식의 시각화에 의해 드러날 수 있다. 이러한 방법들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려져 있다. 본 발명에 따르면, 기본적으로 전체 표면 노출 영역 역시 새로운 결합 특성 생성을 위해 변형대상이 되는 표면 상의 연속 영역으로서 사용될 수 있다. 일실시예에 있어서, 이러한 목적을 위해 변형은 α-헬릭스 영역을 포함할 수도 있다. 헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 단백질에서 결합-결정 영역은, 하나의 결합 결정 영역 길이의 2배 길이가 되는 하나의 연속 영역을 함께 형성하는 표면-노출 영역들 중 2개를 포함한다.
베타 시트 영역의 적어도 하나의 베타 스트랜드 또는 상기 베타 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치들을 포함하는 상기 유비퀴틴 단백질의 적어도 하나의 표면-노출 영역에서의 아미노산 변형은 중요하다. "베타 시트 구조"는 필수적으로 시트-유사이고 거의 완전히 펴져 있는 것에 의해 정의된다. 폴리펩타이드 체인의 중단되지 않는 세그먼트로부터 형성된 알파 헬릭스와 대조적으로, 베타 시트는 폴리펩타이드 체인의 다른 영역들에 의해 형성될 수 있다. 이러한 방식으로, 1차 구조에서 거리를 두고 떨어진 영역들이 서로 근접하게 위치할 수 있게 된다. 베타 스트랜드는 전형적으로 5-10개의 아미노산 길이(유비퀴틴에서는 통상 5-6개 잔기)를 갖고 거의 완전히 펴져 있는 형태를 가지고 있다. 베타 스트랜드들은 서로에 대해 근접하게 되어 하나의 스트랜드의 C-O 그룹과 다른 스트랜드의 NH 그룹(또는 그 반대로) 사이의 수소결합을 형성하게 된다. 베타 시트들은 수개의 스트랜드들로 형성될 수 있고 시트-유사 구조를 갖는데, C 알파 원자 위치는 시트-유사 평면의 위 또는 아래 사이에서 번갈아 위치하게 된다. 아미노산 측쇄들은 이러한 패턴을 따르고, 따라서 교대로 상부를 향하거나 하부를 향하게 된다. 베타 스트랜드의 방향에 의존하여 시트는 평행 시트와 역평행 시트로 분류된다. 본 발명에 따르면, 이들 모두 돌연변이될 수 있고 청구된 단백질의 제조에 사용될 수 있다.
베타 스트랜드 및 베타 시트 구조의 돌연변이 생성을 위해, 베타 스트랜드 또는 상기 베타 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치들이 유비퀴틴에서 선택되는데 표면에 근접한 것들이 선택된다. 표면-노출 아미노산들은 얻을 수 있는 X-선 결정학 구조에 대해 확인될 수 있다. 결정 구조를 얻을 수 없다면 컴퓨터 분석이 수행하여 표면-노출 베타 시트 영역 및 입수가능한 1차 구조에 대해 개개의 아미노산 위치들에 대한 접근성을 예상하거나, 3D 단백질 구조를 모델링하고 이러한 방식에서 가능한 표면-노출 아미노산들에 대한 정보를 얻을 수 있다. 이에 대한 추가 내용들은 예를 들어 J. Mol. Biol., 1987 Apr 5; 194(3):531-44. Vijay-Kumar S, Bugg C.E., Cook W.J.로부터 얻을 수 있다.
그러나, 돌연변이 대상이 되는 아미노산을 사전 선정하는 시간 소모적인 과정을 생략하고 베타 시트 내의 변형 또는 베타 시트 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치들의 변형을 수행하는 것도 가능하다. 베타 시트 구조 또는 베타 시트 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산을 인코딩하는 DNA 영역은 주변 DNA로부터 분리되어 무작위 돌연변이처리되고, 이후 유비퀴틴 단백질을 코딩하는 DNA(이로부터 베타 시트 구조 또는 베타 시트 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산을 인코딩하는 DNA 영역은 사전에 제거되었음)로 다시 삽입된다. 그리고 원하는 결합 특성을 갖는 돌연변이들에 대한 선정 과정이 수행된다.
본 발명의 다른 실시예에서, 표면에 근접한 베타 스트랜드 또는 베타 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산은 전술한 바와 같이 선택되고 이들 선택된 영역 내에서 돌연변이대상이 되는 아미노산 위치들이 확인된다. 이러한 방식으로 선택된 아미노산 위치들에 대해 위치지정돌연변이(site-directed mutagenesis), 즉 특정 아미노산을 인코딩하는 코돈이 사전에 선정된 다른 특정 아미노산을 인코딩하는 코돈에 의해 치환되는 방식에 의해 DNA 수준에서 돌연변이가 일어나도록 할 수 있고, 또는 치환되는 아미노산 위치는 정해지지만 새로운 아미노산과 이를 인코딩하는 코돈은 정해지지 않은 무작위 돌연변이가 일어나게 할 수도 있다.
표면-노출 아미노산(surface-exposed amino acids)은 주위 용매에 접근가능한 아미노산이다. 만약 유비퀴틴 단백질 내의 아미노산의 접근성이 트리펩타이드인 Gly-X-Gly 모델에서의 아미노산과 비교하여 8% 이상이면, 상기 아미노산은 "표면-노출"이라고 불린다. 이러한 단백질 영역 또는 개개의 아미노산 위치들은 각각 본 발명에 따라 수행되는 선정과정에서 가능한 결합 파트너를 위해 선호되는 결합 부위이기도 하다. 이에 대해 상세히 기술하고 있는 참고문헌(Caster et al., 1983 Science, 221, 709 - 713, and Shrake & Rupley, 1973 J. Mol. Biol. 79(2):351-371)은 본 발명의 명세서의 참고문헌으로서 통합된다.
새롭게 생성된 인공적인 결합 부위 영역에서 아미노산 치환에 의해 달라지는 유비퀴틴의 변이들(원래의 단백질과 상이하고 또한 서로 상이함)은 각각의 서열 세그먼트에 대해 표적화된 돌연변이에 의해 생성될 수 있다. 이 경우, 극성, 하전, 용해도, 소수성 또는 친수성과 같은 특성들을 갖는 아미노산들은 각각 다른 특성들을 갖는 아미노산들에 의해 대체 또는 치환될 수 있다. 치환 이외에도 "돌연변이", "변형" 및 "대체" 역시 삽입과 결실을 포함한다. 단백질 수준에서 변형은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 방법에 따라 아미노산 측쇄의 화학적 변경에 의해서도 수행될 수 있다.
유비퀴틴에 대한 돌연변이생성 방법
각각의 서열 세그먼트에 대한 돌연변이 생성 출발점으로서 예를 들어 본 발명이 속하는 기술의 분야의 당업자에게 알려진 방법에 의해 준비, 변경 및 증폭이 가능한 유비퀴틴의 cDNA가 사용될 수 있다. 1차 서열의 상대적으로 작은 영역(약 1개-3개의 아미노산)에서의 위치 특이적 변경을 위해 상업적으로 구입가능한 시약과 방법이 사용가능하다("Quick Change", Stratagene; "Mutagene Phagemid in vitro Mutagenesis Kit", Biorad). 보다 큰 영역의 위치지정돌연변이를 위해서는 예를 들어 당업계에 널리 알려진 PCR(polymerase chain reaction) 등이 사용될 수 있다. 상기 목적을 위해 원하는 부위에서 축퇴된(degenerated) 염기 쌍 구성을 갖는 합성 올리고데옥시뉴클레오티드의 혼합물이 돌연변이 도입을 위해 사용될 수 있다. 게놈 DNA에서 자연적으로 존재하지 않는 염기 쌍 유사체, 예를 들어 이노신을 사용하여 상기 돌연변이 도입 과정은 달성될 수도 있다.
베타 시트 영역의 하나 이상의 베타 스트랜드 또는 베타 시트 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치들에 대한 돌연변이 생성 출발점은 예를 들어 유비퀴틴 cDNA이거나 게놈 DNA일 수 있다. 또한, 유비퀴틴 단백질을 코딩하는 유전자는 합성되어 준비될 수도 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 돌연변이는 아미노산 코돈 NNK을 운반하는 DNA 올리고뉴클레오티드 어셈블리에 의해 수행된다. 그러나, 다른 코돈(트리플렛) 역시 사용될 수 있음은 물론이다. 돌연변이는 베타 시트 구조가 유지되는 것이 바람직한 방식으로 수행된다. 통상, 돌연변이는 유비퀴틴 단백질 표면 상에 노출된 안정한 베타 시트 영역의 바깥쪽에서 일어난다. 상기 돌연변이는 위치특이적 돌연변이와 무작위 돌연변이를 포함한다. 1차 구조에서 비교적 작은 영역(약 3개-5개 아미노산)을 포함하는 위치특이적 돌연변이는 상업적으로 입수가능한 Stratagene®의 키트(QuickChange®) 또는 Bio-Rad®의 키트(Mutagene® phagemid in vitro mutagenesis kit)에 의해 생성될 수 있다(미국특허 제5,789,166호; 미국특허 제4,873,192호 참조).
보다 확장된 영역이 위치특이적 돌연변이 대상인 경우, DNA 카세트가 준비되어야 하는데 여기서 돌연변이 대상이 되는 영역은 돌연변이된 위치들과 불변 위치들을 포함하는 올리고뉴클레오티드 어셈블리에 의해 얻어진다(Nord et al., 1997 Nat. Biotechnol. 8, 772-777; McConell and Hoess, 1995 J. Mol. Biol. 250, 460-470.). 무작위 돌연변이는 돌연변이 균주(mutator strain) 내 DNA의 전파 또는 PCR 증폭(오류 유발 PCR)에 의해 도입될 수 있다(예를 들어, Pannekoek et al., 1993 Gene 128, 135 140 참조). 이러한 목적을 위해, 증가된 에러율을 가진 폴리머라아제가 사용된다. 도입되는 돌연변이 생성 정도를 향상시키거나 다른 돌연변이들을 조합시키기 위해 PCR 단편들 내의 돌연변이들이 DNA 셔플링(shuffling)에 의해 조합될 수 있다(Stemmer, 1994 Nature 370, 389-391). 효소들에 대한 이러한 돌연변이 전략들은 "Kuchner and Arnold (1997) TIBTECH 15, 523-530" 문헌에 제공되어 있다. 선정된 DNA 영역에서의 무작위 돌연변이생성을 수행하기 위해, DNA 카세트는 돌연변이 생성용으로 구성되어야 한다.
돌연변이 생성을 위해 알려지고 사용가능한 방법들로는 위치특이적 돌연변이생성법(site-specific mutagenesis), 무작위 돌연변이생성법, PCR을 이용한 돌연변이생성법 또는 이들과 유사한 방법들이 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 돌연변이대상이 되는 아미노산 위치들은 미리 결정된다. 돌연변이대상이 되는 아미노산의 선정과정은 변형되어야 하는 아미노산과 관련하여 청구항 1항의 제한을 충족하도록 수행된다. 각각의 경우, 상이한 돌연변이들의 라이브러리가 공지된 방법을 이용하여 스크린되어 확립된다. 통상 변형대상이 되는 아미노산의 사전 선정은 변형되는 유비퀴틴 단백질에 대한 구조 정보가 충분히 입수될 수 있기 때문에 용이하게 수행될 수 있다.
예를 들어, PCR, 화학적 돌연변이생성 또는 세균성 돌연변이 균주(bacterial mutator strain)에 의한 긴 서열 세그먼트의 돌연변이생성 뿐만아니라 표적화된 돌연변이생성은 종래 기술로서 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 돌연변이는 아미노산 코돈 NNK을 운반하는 DNA 올리고뉴클레오티드 어셈블리에 의해 수행된다. 그러나, 다른 코돈(트리플렛) 역시 사용될 수 있음은 물론이다. 돌연변이는 베타 시트 구조가 유지되는 것이 바람직한 방식으로 수행된다. 통상, 돌연변이는 유비퀴틴 단백질 표면 상에 노출된 안정한 베타 시트 영역의 바깥쪽에서 일어난다. 상기 돌연변이는 위치특이적 돌연변이와 무작위 돌연변이를 포함한다. 1차 구조에서 비교적 작은 영역(약 3개-5개 아미노산)을 포함하는 위치특이적 돌연변이는 상업적으로 입수가능한 Stratagene®의 키트(QuickChange®) 또는 Bio-Rad®의 키트(Mutagene® phagemid in vitro mutagenesis kit)에 의해 생성될 수 있다(미국특허 제5,789,166호; 미국특허 제4,873,192호 참조).
보다 확장된 영역이 위치특이적 돌연변이 대상인 경우, DNA 카세트가 준비되어야 하는데 여기서 돌연변이 대상이 되는 영역은 돌연변이된 위치들과 불변 위치들을 포함하는 올리고뉴클레오티드 어셈블리에 의해 얻어진다(Nord et al., 1997 Nat. Biotechnol. 8, 772-777; McConell and Hoess, 1995 J. Mol. Biol. 250, 460-470.). 무작위 돌연변이는 돌연변이 균주(mutator strain) 내 DNA의 전파 또는 PCR 증폭(오류 유발 PCR)에 의해 도입될 수 있다(예를 들어, Pannekoek et al., 1993 Gene 128, 135 140 참조). 이러한 목적을 위해, 증가된 에러율을 가진 폴리머라아제가 사용된다. 도입되는 돌연변이 생성 정도를 향상시키거나 다른 돌연변이들을 조합시키기 위해 PCR 단편들 내의 돌연변이들이 DNA 셔플링(shuffling)에 의해 조합될 수 있다(Stemmer, 1994 Nature 370, 389-391). 효소들에 대한 이러한 돌연변이 전략들은 "Kuchner and Arnold (1997) TIBTECH 15, 523-530" 문헌에 제공되어 있다. 선정된 DNA 영역에서의 무작위 돌연변이생성을 수행하기 위해, DNA 카세트는 돌연변이 생성용으로 구성되어야 한다.
본 발명의 일례에 따른 아미노산 무작위 치환은 단량체 유비퀴틴의 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 및/또는 68 위치에서의 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 6개의 아미노산의 치환으로서, 이들 위치는 유비퀴틴 단백질의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 근접하여 위치하기 때문에 PCR에 의해 용이하게 치환이 이루어질 수 있다. 따라서, 조작되는 코돈들은 대응하는 cDNA 스트랜드의 5' 말단 및 3' 말단에 있게 된다. 즉, 돌연변이 생성 PCR 반응에 사용되는 제1 올리고데옥시뉴클레오티드는 돌연변이 대상이 되는 2, 4, 6 및/또는 8 위치에서의 코돈과는 떨어져 서열면에서 유비퀴틴의 아미노 말단에 대한 코딩 스트랜드에 대응한다. 또한, 제2 올리고데옥시뉴클레오티드는 돌연변이 대상이 되는 62, 63, 64, 65, 66 및/또는 68 위치의 코돈과는 떨어져 카르복시 말단의 폴리펩타이드 서열의 비-코딩 스트랜드에 적어도 부분적으로 대응한다. 양쪽 올리고데옥시뉴클레오티드에 의해 단량체 유비퀴틴 단백질을 인코딩하는 DNA를 주형으로서 사용하는 PCR 반응이 수행될 수 있다.
또한, 수득된 증폭 산물은 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제한 서열을 도입하는 주변 올리고데옥시뉴클레오티드를 이용한 다른 PCR 반응에 첨가될 수 있다. 본 발명에 따르면, 미리 결정된 합텐(hapten) 또는 항원에 대한 결합 특성을 갖는 유비퀴틴 변종들을 분리하는 후속 선정 과정에서 사용하기에 적합한 벡터 시스템에 대해 수득된 유전자 카세트를 도입하는 것이 바람직하다.
선택된 리간드에 특이적인 새로운 결합 도메인의 생성을 위한 아미노산 치환은 바람직한 아미노산에 의해, 즉 선택된 리간드에 대한 새로운 결합 특성을 생성하는 변형을 위한 아미노산에 의해 본 발명에 따라 수행될 수 있는데, 상기 아미노산의 특정 화학적 성질 또는 측쇄가 치환대상이 되는 아미노산의 특정 화학적 성질 또는 측쇄와 유사할 것을 고려할 필요가 없고 어떠한 바람직한 아미노산도 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다.
선택된 아미노산의 변형 과정은 바람직하게는 무작위 돌연변이생성에 의한 유전자 수준 상의 돌연변이, 즉 선택된 아미노산의 무작위 치환에 의해 본 발명에 따라 수행된다. 바람직하게는, 유비퀴틴의 변형은 각각의 단백질에 속하는 DNA의 전환을 위한 유전공학기법에 의해 수행된다. 바람직하기로는, 유비퀴틴 단백질의 발현은 원핵생물 또는 진핵생물에서 수행된다.
본 발명에 따르면, 변형된 유비퀴틴 단백질은 화학적 합성에 의해 준비될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 아미노산 잔기들은 아미노산 치환에 의해 변경된다. 그러나, 결실과 삽입도 가능하다. 선택적으로, 결실 또는 삽입되는 아미노산의 수는 1개-10개, 1개-5개, 2개, 3개 또는 4개이다. 일실시예에서는 아미노산 삽입이 일어나지 않는다. 또 다른 실시예에서는 결실이 수행되지 않았다.
전술한 바와 같은 변형을 만든 후, 본 발명자들은 실시예에서 기술되는 아미노산이 변경된 유비퀴틴 서열들이 매우 높은 친화도(10-10 M까지의 Kd 값)를 갖고 타겟에 결합하는 것을 확인하였다.
유비퀴틴에서 변형대상이 되는 영역
변형 영역들은 이들이 결합 파트너로서 타겟에 대해 접근가능한지 여부와 유비퀴틴 단백질의 전체 구조가 변형에 대해 견딜 수 있을 것인지 여부에 따라 기본적으로 선택될 수 있다.
표면-노출 베타 스트랜드에서의 변형 이외에도 유비퀴틴 단백질의 다른 표면-노출 영역에서의 변형도 수행되는데 바람직하게는 베타 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치에서 수행된다. 이들 영역들은 타겟에 대해 새롭게 생성된 높은 친화도를 가진 결합에 관여한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에 따르면, 유비퀴틴 바람직하게는 포유동물 또는 인간의 유비퀴틴 중 적어도 3개, 4개 또는 6개, 선택적으로 적어도 8개, 10개, 12개 및 최대 15개의 표면-노출 아미노산이 단량체 유비퀴틴에서 변형될 수 있으며 바람직하게는 치환될 수 있다. 이는 유비퀴틴 중 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 표면-노출 아미노산의 변형을 포함한다. 적어도 3개 및 최대 15개의 표면-노출 아미노산은 미리 결정된 결합 파트너에 대해 결합 친화도를 갖는 영역을 형성한다. 이러한 영역은 본 명세서에서 "결합 도메인 영역"("BDR")으로서 정의된다. 이러한 관점에서 적어도 2개, 선택적으로 적어도 4개, 추가로 선택적으로 적어도 6개, 8개, 10개, 12개 및 최대 15개의 표면-노출 아미노산이 베타-시트 영역, 즉 베타 시트 스트랜드 내에 또는 수개의 베타 스트랜드 상에 존재하거나 베타 시트 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치에 존재하는 것이 특히 바람직하다. 변형된 아미노산, 바람직하게는 치환된 아미노산 중 적어도 3개의 아미노산은 1차 서열에서 서로에 대해 직접 결합되는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 선택적인 실시예에서, 유비퀴틴 단백질에서 4개의 베타 스트랜드 중 1개 또는 2개, 바람직하게는 2개의 스트랜드 내의 아미노산, 또는 상기 4개의 베타 스트랜드 중 바람직한 2개의 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치들이 변형되어 새로운 결합특성을 생성하게 된다. 또한, 상기 4개의 베타 스트랜드 중 3개 또는 4개 스트랜드 내의 변형, 또는 상기 베타 스트랜드 중 3개 또는 4개 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치들에서의 변형은 선택된 타겟 또는 리간드에 대한 결합 생성을 위해 선택가능하다.
아미노 말단 및 카르복시 말단 스트랜드 내의 아미노산 또는 상기 아미노 말단 및 카르복시 말단 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치들에서의 아미노산들이 변형, 바람직하게는 치환되어 리간드 또는 타겟에 대한 새로운 결합 부위를 생성하도록 하는 것이 특히 바람직하다. 이러한 관점에서 카르복시 말단의 베타 시트 스트랜드에 인접한 3개까지의 아미노산이 변형, 바람직하게는 치환되고, 아미노 말단의 베타 시트 스트랜드에 인접한 1개까지의 아미노산이 변형, 바람직하게는 치환되는 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 따르면, 포유류 유비퀴틴, 바람직하게는 인간의 유비퀴틴 중 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66, 68 위치들에서 적어도 3개의 표면-노출 아미노산이 변형, 바람직하게는 치환되는 것이 바람직하다. 상기 아미노산 그룹에서 적어도 3개의 아미노산들은, 특이적 결합 파트너 예를 들어 ED-B, TNF-알파, NGF, IgG, MIA-2 또는 기타 다른 타겟에 대해 이전에 존재하지 않았던 결합 친화도를 갖는 변형된 단백질을 생성하기에 특히 적합한 것으로 판명된 유비퀴틴의 표면 상의 연속적인 표면-노출 영역을 형성한다. 이들 아미노산 잔기들 중 적어도 3개가 변형되어야 한다. 선택적으로, 상기 아미노산 잔기들 중 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개가 변형되되, 추가의 아미노산 잔기들과 조합하여 선택적으로 변형되고 바람직한 변형은 치환이다.
서열번호 1의 아미노산 서열에 대한 유비퀴틴 유도체의 서열 상동성의 정도를 결정하기 위해, 예를 들어 SIM 로컬 유사도 프로그램(SIM Local similarity program) (Xiaoquin Huang and Webb Miller, Advances in Applied Mathematics, vol. 12: 337- 357, 1991) 또는 다중 정렬 분석을 위해 프로그램 저작자 또는 저작기관으로부터 무료로 입수할 수 있는 Clustal, W.가 사용될 수 있다(Thompson et al., Nucleic Acids Res., 22(22): 4673-4680, 1994.). 바람직하게는, 서열번호 1에 대한 유도체의 서열 상동성 정도는 서열번호 1의 완전한 서열에 대한 상대적인 값으로 결정된다.
결합 친화도를 결정하는 방법들은 당업계에 알려져 있고 예를 들어 다음과 같은 방법들 중에서 선택될 수 있다: ELISA, SPR(Surface Plasmon Resonance) 기반 기술(예를 들어, Biacore®에 의해 제공), 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 형광 이방성 측정법(fluorescence anisotropy), 형광 분광법(fluorescence spectroscopy) 및 ITC(isothermal titration calorimetry).
추가의 실시예에서, 본 발명은 약제학적 활성 성분 및/또는 진단 활성 성분에 융합된 본 발명의 헤테로-다량체 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 예를 들어, 미국특허 제7,838,629호가 참조되며, 이 문헌의 전체 내용은 본 발명에 참조로서 통합된다.
본 발명의 융합 단백질은 비-폴리펩타이드 성분, 예를 들어 비-펩타이드 링커, 치료 또는 진단 관련 방사성 핵종(radionuclides)에 대한 비-펩타이드 리간드를 포함한다. 또한, 상기 융합 단백질은 작은 유기 화합물 또는 비-아미노산계열의 화합물, 예를 들어, 당, 올리고당 또는 다당류, 지방산 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 유비퀴틴 기반의 결합 분자는 펩티드, 아미노산 기반의 링커 또는 리간드에 연결되거나, 치료 또는 진단 관련 특성을 갖는 단백질에 연결된다.
결합 특이도 (해리 상수)
본 발명에 따른 융합 단백질의 결합 특이도는 비-융합 단백질에 대해 정의된 바와 같이 Kd로 표시된다. 본 발명에 따르면 "Kd"는 본 발명에서 10-7-10-12 M 범위의 특이적 결합 친화도를 정의한다. 10-5 M 이하의 값은 수량화할 수 있는 결합 친화도로 고려될 수 있다. 응용에 따라, 10-7 M 내지 10-11 M 값은 예를 들어 크로마토그래피 응용에 적합하고, 10-9 내지 10-12 M 값은 예를 들어 진단 또는 치료 응용에 적합하다. 또한, 바람직한 결합 친화도는 10-7 내지 10-10 M 범위이고, 바람직하게는 10-7 내지 10-11 M 이다.
유비퀴틴의 다량체화
본 발명에 따르면, 적어도 2개의 상이하게 변형된 유비퀴틴 단량체는 일반적으로 선단과 말단(head-to-tail) 융합에 의해 연결되어 타겟 분자, 예를 들어 ED-B, TNF-알파, IgG, Mia-2, NGF 또는 다른 기타 타겟 분자의 동일 에피톱에 결합하고 양쪽 결합 도메인 영역이 함께 작용하는 경우에만 효과를 나타낸다. 즉, 이들은 2개 모듈의 양쪽 결합 영역에 대해 함께 작용함으로써 형성되는 단일의 연속 결합 영역을 통해 동일한 에피톱에 결합한다.
유비퀴틴 단량체는 직접 연결되거나 링커를 통해 연결될 수 있다. 적합한 링커로는 서열번호 32의 링커, 또는 적어도 서열 GIG 또는 적어도 서열 SGGGG를 갖는 링커 또는 다른 링커로서, 예를 들어 GIG, SGGGG, SGGGGIG, SGGGGSGGGGIG 또는 SGGGGSGGGG를 들 수 있다. 그러나, 다수의 다른 가능한 링커들이 사용될 수 있음은 물론이다.
라이브러리(Libraries)
추가의 예에서, 본 발명은 전술한 바와 같은 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질들을 인코딩하는 DNA를 포함하는 라이브러리에 관한 것으로서 이는 헤테로-다량체 유비퀴틴 단백질, 바람직하게는 헤테로-이량체 유비퀴틴 단백질을 제공하기 위한 기초를 이룬다.
또 다른 예에서, 전술한 바와 같이 2개의 라이브러리를 융합하여 얻은 DNA를 포함하는 융합 라이브러리가 제공된다. 헤테로-이량체 유비퀴틴 융합 단백질을 얻기 위해 각각의 라이브러리는 상이하게 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질 유닛을 인코딩하고, 융합 단백질의 단량체 유닛은 선단과 말단 배열로 상호 연결되어 있다. 유비퀴틴의 헤테로-이량체 융합 단백질을 인코딩하는 라이브러리는 타겟에 대해 1가 결합 활성을 나타낸다. 유닛을 함께 연결하는 것은 본 발명의 기술분야의 당업자에 의해 알려진 링커 또는 본 명세서에서 설명된 링커를 이용하여 수행된다. 또한, "상이하게 변형된"이라는 용어는 대안으로 하나의 변형되지 않은 분자가 헤테로-이량체 단백질에 존재하는 경우를 포함한다.
실시예 1은 복합체 라이브러리 생산을 간략하게 설명한다. 그러나, 이러한 라이브러리의 질과 관련하여 주의를 해야 한다. 스캐폴드 기술에서 라이브러리의 질은 무엇보다 기능성(최종 후보들의 구조 및 단백질의 화학적 성질) 뿐만아니라 복잡성(개별 변이들의 수)에 의존한다. 그러나, 양쪽 특성은 서로에 대해 부정적인 영향을 줄 수 있다. 스캐폴드 상에 변형된 위치 수를 증가시켜 라이브러리의 복잡성을 증가시키는 것은 변이체에서의 단백질의 화학적 성질을 떨어뜨릴 수 있다. 이는 감소된 용해도, 응집 및/또는 낮은 수율로 귀결될 수 있다. 이는 열역학적으로 바람직한 단백질 패키징을 갖는 원래 단백질로부터 크게 이탈하였기 때문이다.
따라서, 균형이 잡힌 스캐폴드 라이브러리를 구축하는 것이 바람직한데, 원래 서열에 가능한 많은 변이들을 도입하여 타겟에 대해 최적화하면서도 한편으로는 부정적인 단백질-화학 영향을 피하기 위해 가능한 원래 1차 서열을 유지하는 것 사이에서 균형을 잡는 것이 필요하다.
헤테로-이량체 유비퀴틴 단백질에서의 특이적 변형
Kd= 10-7-10-12 M의 결합 친화도로 리간드에 결합하고 상기 리간드에 대해 1가 결합 활성을 나타내는 본 발명에 따른 유비퀴틴의 헤테로-이량체는 다음의 2가지 대안 중 선택된다.
(1) 제1 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되고, 제2 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되며 선택적으로 아미노산 2 위치에서 추가적으로 치환된 것; 그리고
(2) 제1 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되고, 제2 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되며 선택적으로 아미노산 2 위치에서 추가적으로 치환된 것.
일실시예에서, 융합 단백질은 상기 유비퀴틴 단백질의 유전적으로 융합된 이량체로서, 제1 유비퀴틴 단량체의 6, 8, 63-66 위치에서 아미노산이 치환되고, 제2 유비퀴틴 단량체의 6, 8, 62-66 위치에서 아미노산이 치환되며 선택적으로 제2 유비퀴틴 단량체의 2 위치에서 추가적으로 아미노산이 치환되고, 바람직하기로는 다음과 같은 것이 바람직하다.
- 제1 유비퀴틴 단량체의 치환
위치 6에서 리신(K) → 트립토판(W) 또는 페닐알라닌(F),
위치 8에서 류신(L) → 트립토판 또는 페닐알라닌(W, F),
위치 63에서 리신(K) → 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H),
위치 64에서 글루탐산(E) → 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H),
위치 65에서 세린(S) → 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W), 및
위치 66에서 트레오닌(T) → 프롤린(P);
- 제2 유비퀴틴 단량체의 치환
위치 6에서 리신(K) → 트레오닌(T), 아스파라긴(N), 세린(S) 또는 글루타민(Q),
위치 8에서 류신(L) → 글루타민(Q), 트레오닌(T), 아스파라긴(N) 또는 세린(S),
위치 62에서 글루타민(Q) → 트립토판(W) 또는 페닐알라닌(F),
위치 63에서 리신(K) → 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N) 또는 글루타민(Q),
위치 64에서 글루탐산(E) → 아스파라긴(N), 세린(S), 트레오닌(T) 또는 글루타민(Q),
위치 65에서 세린(S) → 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W), 및
위치 66에서 트레오닌(T) → 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D).
그리고, 선택적으로 위치 2에서 글루타민(Q)이 아르기닌(R), 히스티딘(H) 또는 리신(K)으로 치환되는 것이 바람직하다.
각각의 단량체에서 이러한 대안적인 치환들은, 생성된 변형 유비퀴틴 헤테로-이량체가 상기 리간드에 대해 Kd =10-7-10-12 M의 특이적 결합 친화도를 보이고 상기 리간드에 대해 1가 결합 활성을 나타내며 유비퀴틴 단백질의 구조적 안정성이 파괴되거나 방해되지 않는 경우에 제한없이 조합될 수 있다.
가장 바람직한 치환은 다음과 같다:
(1) 제1 단량체 유닛에서 적어도 - K6W, L8W, K63R, E64K, S65F, 및 T66P;
제2 단량체 유닛에서 적어도 - K6T, L8Q, Q62W, K63S, E64N, S65W, 및 T66E이고, 선택적으로 추가로 Q2R이거나,
(2) 제1 단량체 유닛에서 적어도 - Q2T, F4W, K6H, Q62N, K63F, E64K, S65L, 및 T66S;
제2 단량체 유닛에서 적어도 6, 8, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 변형되고, 추가로 선택적으로 제2 단량체 유닛에서 적어도 - K6X, L8X, Q62X, K63X, E64X, S65X, 및 T66X이며, 선택적으로 추가로 Q2X이고 상기 X는 어떠한 아미노산도 가능하다.
ED-B에 대한 결합 단백질을 생성하기 위해 제1 유비퀴틴 단량체에서 특히 바람직한 치환들은 다음과 같다: 2:Q→T, 4:F→W, 6:K→H, 62:Q→N, 63:K→F, 64:E→K, 65:S→L, 66:T→S.
2개의 단량체를 선단과 말단 방식으로 연결하기 위해 링커가 사용되지 않을 수도 있고 어떠한 링커도 사용할 수도 있다. 바람직한 링커는 서열번호 32의 링커 또는 서열 GIG, SGGGGIG 또는 SGGGGSGGGGIG의 링커이다.
바람직한 실시예에서, 리간드 ED-B 결합을 위해 함께 작용하는 2개의 결합 결정 영역을 갖는 유비퀴틴 헤테로-이량체는 서열번호 33 또는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함한다. 약제학적으로 활성 성분으로서 TNF-알파를 포함하는 본 발명의 바람직한 융합 단백질은 서열번호 35 또는 서열번호 36의 서열을 갖는다. 다른 실시예에서, 리간드 ED-B 결합을 위해 함께 작용하는 2개의 결합 결정 영역을 갖는 유비퀴틴 헤테로-이량체는 서열번호 ⅩⅩ에 해당하는 도 11의 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 바람직한 단백질은 아래의 서열에 의해 제공되며, 여기서 XXXX는 임의의 아미노산일 수 있다(서열번호 47).
Figure 112012052163846-pct00001
이들 서열을 갖는 단백질들의 예는 도 11에 도시되어 있다. 여기서 SGGGGSGGGGIG 서열은 링커로서 사용되었다. 다른 종류의 링커가 사용될 수 있으며 링커를 사용하지 않는 것도 가능한 것임은 물론이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드, 숙주세포, 벡터
본 발명의 추가의 관점에서, 본 발명은 전술한 단백질 또는 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 역시 포괄한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터도 본 발명에 의해 포괄된다.
본 발명의 추가적 관점에서, 본 발명의 전술한 단백질 또는 융합 단백질 및/또는 재조합 단백질 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 포함하는 숙주 세포도 본 발명에 의해 포괄된다.
헤테로-다량체 유비퀴틴 분자의 용도
높은 친화도로 리간드와 결합할 수 있는 본 발명의 변형된 유비퀴틴 단백질백질은 예를 들어 치료 수단 뿐만아니라 시험관 내 또는 생체내 진단 수단 제조에 사용된다. 본 발명에 따르는 단백질은 예를 들어 직접적인 에펙터 분자(조절인자, 길항제, 애고니스트(agonist)) 또는 항원-인지 도메인으로서 사용될 수 있다.
인간과 가축의 의학적 치료 및 예방 분야에서, 본 발명에 따라 변형된 적어도 하나의 헤테로 이량체 유비퀴틴 단백질을 포함하는 약제학적으로 유효한 의약은 당업계에 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 제제 방식에 따라, 상기 조성물은 주사 또는 주입에 의한 비경구 방식 투여, 전신 투여, 직장 투여, 복막내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 경피 투여되거나 또는 종래의 다른 알려진 적용 방법들에 의해 투여될 수 있다. 약제학적 제제의 형태는 치료대상이 되는 질환의 종류, 병의 경중, 치료대상 환자 및 의료분야에서 당업자에게 알려진 다른 요인들에 의해 결정된다.
선택된 융합 파트너에 따라 본 발명의 약제학적 조성물은 타겟이 풍부한 질환들의 치료 목적으로 적용될 수 있다.
상기 조성물은 치료학적 유효 투여량을 포함하도록 적용된다. 투여되는 용량은 치료대상이 되는 생물체, 질환의 종류, 환자의 나이 및 몸무게 그리고 현재 알려진 여러 요인들에 따라 다르다.
상기 조성물은 약제학적으로 또는 진단학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 선택적으로 알려진 추가의 보조제 및 부형제를 포함할 수 있다. 이들은 예를 들어 안정화제, 계면활성제(surface-active agent), 염, 완충용액, 착색제(colouring agent) 등을 포함하며, 본 발명이 이에 제한되는 것이 아님은 물론이다.
약제학적 조성물은 국소 도포를 위한 로션, 액체 제형, 크림, 에어로졸, 파우더, 과립, 태블릿, 좌약, 캡슐, 에멀션, 또는 리포좀 형태일 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고 비-발열성이며 등장성인 것이 바람직하고, 약제학적으로 통상 사용되고 허용가능한 알려진 첨가제를 포함한다(이에 대한 참고문헌: the regulations of the U.S. Pharmacopoeia or Remington's Pharmaceutical Sciences, Mac Publishing Company (1990)).
본 발명에 따른 "약제학적 조성물"은 조성물 형태로 존재할 수 있는데, 다른 활성 성분들과 희석제 및/또는 담체가 서로 혼합될 수 있거나, 조합된 제제 형태를 취할 수 있고, 활성 성분들은 부분적으로 또는 전체적으로 별개 형태로 존재한다. 이러한 조합 또는 조합된 제제의 예가 "부분별 키트 (kit-of-parts)"이다.
본 발명에 따른 "조성물"은 적어도 2개의 약리학적으로 활성인 화합물을 포함한다. 이들 화합물은 동시에 투여되거나 1분 내지 수일에 걸쳐 시간 간격을 두고 별개로 투여될 수 있다. 이들 화합물은 동일한 경로를 통해 투여되거나 다른 경로를 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나의 활성 화합물은 경구투여되고 다른 활성 화합물은 비경구 투여방식으로 투여될 수 있다. 또한, 일실시예에서 양쪽 활성 화합물들은 예를 들어 하나의 주입 용액 내에 제형화될 수 있고, 또는 서로 개별적으로 제형화된 화합물을 포함하는 키트로서 제조될 수 있다. 또한, 양쪽 화합물은 2개 이상의 패키지에 존재하는 것이 가능하다.
추가의 실시예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 부분별 키트 형태로서, 본 발명의 재조합 유비퀴틴 단백질/융합 단백질과 하나의 이상의 화학치료제가 분리된 성분으로서 제공된다.
본 발명에 따른 변형된 유비퀴틴 단백질은 보통의 유기 합성법, 고상-보조 합성(solid phase-assisted synthesis) 기술 또는 상업적으로 입수가능한 자동화 합성기와 같은 많은 종래의 공지기술들에 의해 제조될 수 있다. 한편, 상기 변형된 유비퀴틴 단백질은 종래의 재조합 기술 단독으로 또는 종래의 합성기술과 조합하여 제조될 수도 있다.
선택적으로, 상기 변형은 DNA 수준에서의 유전공학기술과, 원핵생물, 진핵생물 또는 시험관 내에서 상기 변형된 단백질의 발현에 의해 수행될 수 있다.
추가의 실시예에서, 상기 변형 단계는 화학적 합성 단계를 포함한다.
본 발명의 하나의 관점에서, 상이하게 변형된 단백질들의 집단은 상이하게 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질 각각을 인코딩하는 2개의 DNA 라이브러리를 유전적으로 융합함으로써 수득된다.
본 발명에 따르면, 리간드 결합능력을 가진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질을 확인하는 방법과, 선택된 리간드에 대해 높은 친화도를 갖고 특이적으로 결합할 수 있는 헤테로-다량체 유비퀴틴에 기초한 신규한 결합 단백질을 제공할 수 있다.
도 1은 전방 (제1의) 변형 유비퀴틴 단량체(BDR1로 지칭되는 결합 결정 영역을 가짐)와 다른 후방 (제2의) 변형 유비퀴틴 단량체 (BDR2로 지칭되는 결합 결정 영역을 가짐)의 재조합이 ED-B에 대한 결합 특이도의 증가 뿐만아니라 친화도의 유의적인 증가를 나타내는 헤테로-이량체를 생성하는 것을 도시하고 있다. 변형된 유비퀴틴 분자들은 Biacore®, 형광 이방성(fluorescence anisotropy) 분석, 세포 상의 결합 및 조직 절편을 통해 분석된다. 인간 ED-B에 대한 몇개의 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종들의 결합과 관련하여 농도 의존적인 ELISAs (conc.-ELISA)가 도시되어 있다.
도 1a는 단량체 41B10 (도면에서는 SPWF28-41B10th)에 대한 결합 친화도가 Kd = 9.45 μM = 9.45 x 10-6 M인 것을 도시하고 있으며, 검정색 원은 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B를 나타내는 단편 67B89에 대한 제1 단량체 41B10의 결합을 나타내고 있고 ED-B를 포함하지 않는 대조군 단편 6789는 백색 원으로 도시되어 있다.
도 1b는 헤테로-이량체 유비퀴틴의 결합 친화도를 도시하고 있다. 헤테로-이량체는 제1 단량체 41B10이 다른 제2 단량체와 결합하여 생성된 변종 46H9(도면에서는 SPWF28-46H9th)를 포함하고 있다. 46H9의 결합 친화도는 타겟 ED-B에 대한 양쪽 단량체의 1가 결합 때문에 도 1a에 도시된 단량체에 비해 훨씬 증가되어 있다(Kd = 131 nM= 1.3 x 10-7 M ; 도면에서는 검정색 원으로서 67B89로 표시). ED-B를 포함하지 않는 대조군 단편 6789는 백색 원으로 도시되어 있다.
도 2는 사이토카인에 융합된 변형 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 헤테로-이량체 분자의 친화도 및 활성을 나타낸다. 변형 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 사이토카인(Affilin®) 융합 단백질의 세포사멸 유도 활성(Apotosis inducing activity)은 EC50 0.78±0.24 pM이고, 자유로운 사이토카인의 세포사멸 유도 활성은 EC50 3.14±3.59 pM이다.
도 2a는 변형된 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 헤테로-이량체인 24H12의 친화도가 Kd = 50.7 nM = 5x 10-8 M인 것을 도시하고 있다. 검정색 원은 EBD에 대한 24H12의 결합을 나타내고 BSA (소혈청 알부민)에 대한 24H12의 결합은 음성 대조군으로 사용되었다(백색 원).
도 2b는 사이토카인 TNF 알파에 융합된 변형 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 헤테로-이량체인 24H12가 헤테로-이량체 24H12의 다량체화를 유도하여 친화도가 증가한 것을 도시하고 있다(Kd = 5.6 nM = 5.6 x 10-9 M).
도 2c는 헤테로 이량체 변형 유비퀴틴 라이브러리 선정에 의한 예시적인 후보들, 예를 들어, 헤테로-이량체 변종들 9E12, 22D1, 24H12 및 41B10에 대한 분석결과를 도시하고 있다. Kd ELISA 값은 대조군으로 사용된 사이토졸 피브로넥틴(c-FN)에 비해 타겟인 ED-B에 대해 그 값이 증가하여 상기 타겟에 대한 특이적 결합을 확인할 수 있다.
도 2d는 Biacore®를 이용한 표지없는 상호작용 분석을 통해 변형된 헤테로-이량체 유비퀴틴 분자인 9E12를 분석한 결과를 도시하고 있다. 칩(Biacore) 상에 고정된 ED-B에 대해 상이한 농도로 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종들을 분석하였고(0-15μM의 9E12), 헤테로-이량체 변종 9E12와 ED-B 사이의 상호작용을 분석하였다. Kd 값은 결합 및 해리 곡선의 분석으로부터 결정될 수 없었다.
도 2e는 Biacore®를 이용한 표지없는 상호작용 분석을 통해 변형된 헤테로-이량체 유비퀴틴 분자인 41B10을 분석한 결과를 도시하고 있다. 칩(Biacore) 상에 고정된 ED-B에 대해 상이한 농도로 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종들을 분석하였고(0-15μM의 41B10), 헤테로-이량체 변종 41B10과 ED-B 사이의 상호작용을 분석하였다. 결합 및 해리 곡선의 분석 결과 Kd는 623 nM (6.2 x 10-7 M)이었다.
도 3은 상이하게 변형된 유비퀴틴 기반의 변종들이 친화도 및 특이도에 기여하는 것을 도시하고 있다. 상이한 변종들은 소문자로 표시된 공통의 서열 모듈을 공유하고 있다. 변종들은 ED-B 결합에 대해 분석되었다. 도 3은 단량체들의 상이한 조합들에 의한 변형 유비퀴틴 헤테로-이량체를 나타내고 있다. 헤테로-이량체 변종들인 46-A5, 50-G11 및 46-H4는 모두 BDR1을 가진 동일한 제1의 (전방) 변형 단량체(도면에서 영문자 "a"로 표시됨)를 갖고, BDR2를 가진 상이한 위치에서 변형된 제2의 (후방) 유비퀴틴 단량체를 갖는다. 변종 52-D10 및 52-B3는 BDR1을 갖는 46-H9에 비해 상이한 제1의 (전방) 변형 단량체를 갖고, BDR2를 갖는 동일한 제2의 (후방) 유비퀴틴 단량체(도면에서 영문자 "e"로 표시됨)를 갖는다.
변형된 유비퀴틴 헤테로-이량체는 하기의 서열을 갖는다:
46-H4: 서열번호 25, 45-H9: 서열번호 26, 46-A5: 서열번호 27, 50-G11: 서열번호 28, 52-B3: 서열번호 29, 52-D10: 서열번호 30.
전술한 서열은 서열 LEHHHHHH (서열번호 31)을 갖는 His-태그를 추가함으로써 실험 과정에서 변형되었다.
도 3에서 확인되는 바와 같이, 46-H4는 ED-B에 대한 탁월한 결합 친화도를 갖고(Kd=189nM), 46-A5 및 52-D10은 결합 활성을 나타내지 않으며, 다른 변형 유비퀴틴 단백질들은 ED-B에 대한 46-H4의 활성에 비해 약한 결합 활성을 나타낸다. 따라서, 헤테로-이량체 변종에서의 양쪽 단량체는 타겟에 대한 높은 친화도 결합이 필요하고, 양쪽 단량체는 타겟에 대한 1가 결합을 나타낸다고 결론지을 수 있다.
높은 ED-B 결합 활성을 갖는 변형된 유비퀴틴 헤테로-이량체인 46 H9는 야생형 유비퀴틴 단량체에 비해 2개의 단량체의 양 결합 도메인 영역에서 다음과 같은 아미노산 치환이 있는 것이 확인된다:
제1 모듈 (BDR1)(a) Q2G, F4V, K6R, Q62P, K63H, E64A, S65T, T66L
제2 모듈 (BDR2) (e) K6H, L8M, Q62K, K63P, E64I, S65A, T66E
50G11
제1 모듈 (46H9)(a)　 Q2G, F4V, K6R, Q62P, K63H, E64P, S65T, T66L
제2 모듈 (c) K6M L8R, Q62M, K63N, E64A, S65R, T66L
46H4
제1 모듈 (46H9)(a)　 Q2G, F4V, K6R, Q62P, K63H, E64P, S65T, T66L
제2 모듈 (d) K6G, L8W, Q62T, K63Q, E64Q, S65T, T66R
52B3
제1 모듈 (g) Q2R, F4P, K6Y, Q62P, K63P, E64F, S65A, T66R
제2 모듈 (46H9) K6H, L8M, Q62K, K63P, E64I, S65A, T66E
52D10 (ED-B에 대한 결합 활성 없음)
제1 모듈 Q2V, F4C, K6R, Q62T, K63A, E64P, S65G, T66D
제2 모듈 (46H9)(e)　K6H, L8M, Q62K, K63P, E64I, S65A, T66E
46A5 (ED-B에 대한 결합 활성 없음)
제1 모듈 (46H9)(a)　Q2G, F4V, K6R, Q62P, K63H, E64P, S65T, T66L
제2 모듈 (b)　K6L, L8M, Q62L, K63A, E64F, S65A.
도 4는 서열 배열을 도시하고 있다. 라인 1: 야생형 유비퀴틴 단백질(첫번째 라인)의 2개의 단량체는 위치 77에서 시작하고 위치 88에서 끝나는 12개의 아미노산 링커 SGGGGSGGGGIG로 연결된다. BDR2를 가진 제2 단량체는 메티오닌을 가진 위치 89에서 시작한다. 이러한 이량체의 야생형 유비퀴틴 단백질은 제1 단량체 및 제2 단량체에서 상이한 변형을 가진 변형 유비퀴틴 헤테로-이량체 변종 46-H9 (2번째 라인)과 정렬되어 2개의 BDR이 위치하게 된다. 양쪽 BDRs은 타겟에 대한 1가 결합 때문에 타겟 결합에 있어 함께 작용한다.
도 5는 변형된 유비퀴틴 헤테로-이량체 변종 1041-D11 (첫번째 라인)을 "Ub2_Tsx9"(양쪽 단량체의 위치 45에서 트립토판으로 변형된 유비퀴틴으로서, 2개의 단량체 사이에 링커 GIG(위치 77 내지 위치 79)가 위치하고, 제2 단량체는 위치 80에서 메티오닌으로 시작됨)에 서열을 정렬시킨 것과, 2번째 단량체의 마지막 C-말단 아미노산이 글리신에서 알라닌으로 치환된 것을 도시하고 있다. 3번째 라인은 이량체의 야생형 유비퀴틴인 "Ubi-Dimer wt"를 나타내며 링커 정렬이 없는 것(따라서, 제2 단량체는 메티오닌을 가진 위치 77에서 시작)을 나타내고 있다. 4번째 라인은 인간의 야생형 유비퀴틴인 "Ubi-Monomer wt"를 나타낸다.
도 6은 인간의 ED-B에 대한 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 1041-D11의 결합에 대한 농도 의존적인 ELISA를 도시한다. 변종 1041-D11는 ED-B에 대해 매우 높은 친화도 결합을 나타낸다(Kd = 6.9 nM = 6.9 x 10-9 M). 검정색 점은 피브로넥틴 단편을 포함하는 ED-B (67B89-t0로 칭함)에 대한 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 1041-D11의 결합 친화도를 나타내는데, 상기 변종이 흰색 점의 음성대조군 (6789-t0로 칭함)에 대해 결합하지 않는 것과 대조된다.
도 7은 자유로운 타겟의 양을 증가시키는 조건에서 피브로넥틴 단편을 포함하는 고정된 ED-B (67B89)에 대한 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 1041-D11의 결합에 대한 경쟁적인 농도 의존적 ELISA를 도시한다. 1041-D11은 고정된 67B89로부터 IC50 값 140 nM (용해된 67B89)로 해리되며, 이는 1041-D11의 결합이 conc-ELISA 셋업에 사용된 소수성 표면으로의 고정으로 인한 ED-B 구조 변형의 결함으로 인한 것이 아님을 나타낸다.
도 8은 Biacore®를 이용한 표지없는 상호작용 분석을 통해 변형된 헤테로-이량체 유비퀴틴 분자인 1041-D11을 분석한 결과를 도시하고 있다. SA-칩 (Biacore)상에 고정된 피브로넥틴 단편을 포함하는 ED-B(67B89로 칭함)에 대한 결합에 대해 상이한 농도로 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종들을 분석하였다(0-200 nM 의 1041-D11). 결합 및 해리 곡선의 분석 결과 Kd는 1 nM (1 x 10-9 M)이고 7.7 x 10-4 s-1의 koff 레이트(rate)는 1041-D11과 ED-B 복합체의 긴 반감기를 나타낸다.
도 9는 결합 활성의 혈청-안정성을 동시에 분석하는 농도의존적인 ELISA에서 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 1041-D11의 ED-B에 대한 결합을 도시하고 있다. 마우스 또는 래트 혈청에서 변종을 37℃에서 1시간 동안 사전 인큐베이션하고, 대조군으로서 PBST에서 사전 인큐베이션하는 상이한 조건들이 도시되어 있다. Kd 값은 모두 10 nM과 20 nM 사이이다. 따라서, ED-B에 대한 헤테로-이량체 1041-D11은 혈청에 의해 유의적으로 영향받지 않는다고 결론지을 수 있다.
도 10은 피브로넥틴 단편과 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 1041-D11의 복합체 형성을 SE-HPLC에 의해 분석한 것을 도시하고 있다.
도 10a는 ED-B와 1041-D11의 복합체 형성을 도시한다. 3개의 HPLC 수행결과가 함께 나타나 있다. SE-HPLC 결과, 21.651분의 보유시간을 갖는 피크(파란색)는 순수한 1041-D11에서 유래한 것이고, 26.289분의 보유시간을 갖는 피크(검정색)는 피브로넥틴 단편 67B89를 나타내며, 1041-D11 및 67B89의 혼합물은 21.407분의 보유시간을 갖는 피크(적색)로 나타난다. 67B89 피크의 사라짐과 1041-D11 피크의 짧은 보유 시간으로의 이동은 1041-D11과 용해성 ED-B의 복합체 형성을 나타낸다.
도 10b는 3개의 SE-HPLC 수행결과를 함께 도시하는데, 1041-D11 (21.944분에서의 피크, 파란색), ED-B가 없는 피브로넥틴 단편 6789 (26.289분에서의 피크, 검정색) 그리고 1041-D11과 6789의 혼합물(21.929분과 26.289분에서의 피크, 적색)에 대한 결과가 나타나 있다. 1041-D11 피크 이동이 거의 관찰되지 않는다. 이는 6789 피크의 사라짐이 없는 것과 함께 ED-B가 없는 피브로넥틴 단편 6789에 대한 유의적인 결합이 없음을 나타낸다.
도 11은 ED-B 결합 변종들의 컨센서스 위치와 아미노산 치환을 도시하고 있다. ED-B에 대한 강한 결합 친화도를 갖는 것으로 확인된 16개의 대표적인 헤테로-이량체 서열들이 도시되어 있다. 컨센서스 아미노산 위치들은 제1 단량체 BDR(binding determining region)의 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65, 66에 위치하고 컨센서스 아미노산 치환은 Q2T, F4W, K6H, Q62N, K63F, E64K, S65L, 및 T66S이다.
도 12는 6개의 유비퀴틴 기반의 헤테로-이량체 MIA2 결합 단백질들의 서열 정렬을 도시하고 있다. 제2 유비퀴틴 단량체는 위치 89 (1111-B4, 1111-C9)의 메티오닌에서 시작하거나 위치 80 (1111-E10, 1111-F6, 1111-H12, 1111-H2)의 메티오닌에서 시작한다.
도 13은 도 12의 유비퀴틴 기반의 헤테로-이량체 MIA2 결합 단백질의 링커 뿐만아니라 결합 결정 영역 BDR1 및 BDR2의 정렬을 도시하고 있으며 유비퀴틴 서열에서의 추가적인 아미노산 교환을 도시하고 있다.
도 14는 도 12의 결합 변종 1111-E10의 비오틴화된 MIA-2 (biot. MIA2; Kd = 2.6 μM (검정색 원))에 대한 농도의존적인 ELISA를 도시하고 있다. 대조군인 인간 혈청 알부민(HSA)에 대해서는 백색 원으로 표시되어 있다.
도 15a는 일련의 제1 단량체 유닛들의 아미노산 잔기들의 변형들을 도시하고 도 15b는 일련의 제2 단량체 유닛들의 아미노산 잔기들의 변형들을 도시한다.
도 15c는 제1 유비퀴틴 단량체의 위치 2, 4, 6, 62-66, 68에서의 변형과 제2 유비퀴틴 단량체의 위치 6, 8, 62-66에서의 변형을 도시한다. 2개의 유비퀴틴 단량체들 사이의 링커는 SGGGGSGGGGIG이다.
도 15d는 인간의 TNF-알파에 대한 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 SPWF-15_6-A12의 결합에 대한 농도의존적인 ELISA를 나타낸다. 결합 단백질 SPWF-15_6-A12는 TNF-알파에 대해 매우 높은 친화도 결합 (Kd= 12 nM = 1.2×10-8 M)을 나타내는데, 인간의 TNF-알파에 대한 고친화도 결합(검정색 원)과 대조군인 BSA에 대한 결합 결과(백색 원)를 도시한다.
도 15e는 TNF-알파에 대한 특이도를 갖는 헤테로 이량체 유비퀴틴 결합 단백질 SPWF-15_16-D4_Th의 서열과, 제1 유비퀴틴 단량체의 위치 2, 4, 6, 62-66에서의 변형 및 제2 유비퀴틴 단량체의 위치 6, 8, 62-66에서의 변형을 도시한다. 2개의 유비퀴틴 단량체들 사이의 링커는 SGGGGSGGGGIG이다.
도 15f는 인간의 TNF-알파에 대한 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 SPWF-15_16-D4_Th의 결합에 대한 농도의존적인 ELISA를 나타낸다. 결합 단백질 SPWF-15_16-D4_Th는 TNF-알파에 대해 매우 높은 친화도 결합 (Kd= 1.7 nM = 1.7 x 10-9 M)을 나타내는데, 인간의 TNF-알파에 대한 고친화도 결합(검정색 원)과 대조군인 BSA(소혈청 알부민)에 대한 결합 결과(백색 원)를 도시한다.
도 16은 유비퀴틴 기반의 변형 헤테로 이량체의 NGF 결합을 도시한다.
도 16a는 NGF에 대한 특이도를 갖는 헤테로 이량체 유비퀴틴 결합 단백질 SPWF9-1B7-th의 서열과, 제1 유비퀴틴 단량체의 위치 2, 4, 6, 62-66 및 위치 51에서의 변형 및 제2 유비퀴틴 단량체의 위치 6, 8, 62-66에서의 변형을 도시한다. 2개의 유비퀴틴 단량체들 사이의 링커는 SGGGGSGGGGIG이다.
도 16b는 NGF에 대한 Kd = 0.9 μM = 9 x 10-7 M의 고친화도 결합을 결정하는 농도의존적인 ELISA를 나타낸다. 재조합 인간 NGF (rhNGF; 검정색 원)에 대한 결합과 대조군인 BSA에 대한 결합 결과(백색 원)를 도시한다.
도 16c는 NGF에 대한 특이도를 갖는 헤테로 이량체 유비퀴틴 결합 단백질 SPWF9-6A2-th의 서열과, 제1 유비퀴틴 단량체의 위치 2, 4, 6, 62-66에서의 변형 및 제2 유비퀴틴 단량체의 위치 6, 8, 62, 64-66에서의 변형을 도시한다. 2개의 유비퀴틴 단량체들 사이의 링커는 SGGGGSGGGGIG이다.
도 16d는 NGF에 대한 Kd = 180 nM = 1.8 x 10-7 M의 고친화도 결합을 결정하는 농도의존적인 ELISA를 나타낸다. 재조합 인간 NGF (rhNGF; 검정색 원)에 대한 결합과 대조군인 BSA에 대한 결합 결과(백색 원)를 도시한다.
도 17은 헤테로 이량체의 IgG 결합 단백질을 도시한다.
도 17a는 IgG에 대한 특이도를 갖는 헤테로 이량체 유비퀴틴 결합 단백질 SPVF4-16B2-ts의 서열과, 제1 유비퀴틴 단량체의 위치 6, 62, 63, 65, 66에서의 변형 및 제2 유비퀴틴 단량체의 위치 6, 62-66에서의 변형을 도시한다. 2개의 유비퀴틴 단량체들 사이의 링커는 SGGGGSGGGGIG이다.
도 17b는 IgG에 대한 Kd = 3.8 μM의 고친화도 결합을 결정하는 농도의존적인 ELISA를 나타낸다. IgG (검정색 원)에 대한 결합과 대조군인 BSA-1, BSA-1 및 엔브렐(Enbrel)에 대한 결합 결과(적색 원, 녹색 원 및 청색 원)를 도시한다. 엔브렐은 인간 IgG1의 Fc 부분을 갖는다. 엔브렐에 대한 약한 결합은 IgG의 Fab 부분에 대한 SPVF4-16B2-ts의 결합을 나타낸다.
도 17c는 IgG에 대한 특이도를 갖는 헤테로 이량체 유비퀴틴 결합 단백질 SPVF4-9C6-ts의 서열과, 제1 유비퀴틴 단량체의 위치 6, 8, 62-66에서의 변형 및 제2 유비퀴틴 단량체의 위치 6, 8, 62-66에서의 변형을 도시한다. 2개의 유비퀴틴 단량체들 사이의 링커는 SGGGGSGGGGIG이다.
도 17d는 IgG에 대한 Kd = 4.1 μM의 고친화도 결합을 결정하는 농도의존적인 ELISA를 나타낸다. IgG (검정색 원)에 대한 결합과 대조군인 BSA (백색 원) 및 에타너셉트(Etanercept)[상표명: 엔브렐(Enbrel)](적색 원)에 대한 결합 결과를 도시한다. 엔브렐은 인간 IgG1의 Fc 부분을 갖는다. 엔브렐에 대한 약한 결합은 IgG의 Fab 부분에 대한 SPVF4-9C6-ts의 결합을 나타낸다.
하기 실시예들은 본 발명의 추가 설명을 위해 제공된다. 본 발명은 예시로서의 유비퀴틴의 변형에 대해 설명된다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 하기 실시예들은 상기 기술된 기초 내용에 근거한 본 발명의 실행을 단지 보여주기 위한 것이다. 본 발명의 완전한 개시를 위해 본 명세서에 언급된 문헌들이 참조되고 상세한 설명 마지막에 첨부된 참고문헌들은 그 전체가 본 발명의 명세서에 참고로서 통합된다.
실시예 1. 변형된 유비퀴틴 단백질에 기초한 헤테로-이량체 ED-B 결합 단백질 확인
라이브러리 구축 및 클로닝
다르게 언급되지 않는 한, 이미 구축된 유전자 재조합 방법, 예를 들어 Sambrook et al.에 기술된 바와 같은 방법이 사용되었다.
높은 복잡성을 갖는 인간의 유비퀴틴 헤테로-이량체의 무작위 라이브러리는 전체 15개의 선택된 아미노산 위치에 대한 잘 조정된 돌연변이 생성에 의해 준비되었다. NNK 트리플렛에 의해 치환된 변형 아미노산들은 제1 유비퀴틴 단량체 내의 위치 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66, 68로부터 선택된 적어도 3개의 아미노산들과, 제2 유비퀴틴 단량체 내의 위치 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66, 68로부터 선택된 적어도 3개의 아미노산들을 포함한다. 양쪽 유비퀴틴 단량체는 적어도 서열 GIG를 갖는 글리신/세린 링커 또는 적어도 서열 SGGGG, 예를 들어 GIG, SGGGG, SGGGGIG, SGGGGSGGGGIG (서열번호 32) 또는 SGGGGSGGGG를 갖는 글리신/세린 링커에 의해 유전적으로 연결되었다. 그러나, 다른 링커의 사용도 가능함은 물론이다.
TAT 파아지 디스플레이 선택
헤테로 이량체 유비퀴틴은 예를 들어 선택 시스템으로서 TAT 파아지 디스플레이를 이용하여 타겟에 대해 증량되었다. 당업계에 알려진 다른 선택 방법들도 사용될 수 있다. 타겟이 단백질 결합 표면 상에 비특이적으로 고정화되거나 상기 단백질에 공유적으로 결합된 비오틴화된 잔기를 통해 고정될 수 있다. 스트렙타비딘 비드 또는 뉴트라비딘 스트립에 대해 비오틴을 통한 고정화가 선호된다. 타겟-결합 파아지들이 용액 내에서 또는 고정화된 타겟 상에서 선택된다. 예를 들어, 파아지와 함께 비오틴화되고 고정화된 타겟이 인큐베이션되고 매트릭스에 결합된 파아지를 세척하고 매트릭스-결합 파아지를 용리시켰다. 타겟 인큐베이션 이후 각 사이클에서, 비드들은 용액에서 자기적으로 분리되었고 수차례 세척되었다. 1회 내지 3회 선택 사이클에서 타겟이 결합된 자성 비드들 상에 고정된 3원 복합체(ternary complexes)가 세척되었다. 4번째 선택 사이클에서 세척은 수차례 수행되었다. 첫번째 선택 사이클에서, 비오틴화된 타겟은 뉴트라비딘 스트립에 고정화되는 반면에, 용액 내에서의 2회부터 4회 선택에서는 타겟-파아지 복합체가 스트렙타비딘이 코팅된 다이나비드(Dynabeads®)(Invitrogen) 상에서 고정화된다. 첫번째 2회 선택 사이클에서의 세척 후, 비드들은 재차 용액으로부터 자기적으로 분리되었고 타겟-결합 변형 유비퀴틴 분자의 파아지들이 산성 용액에 의한 용리에 의해 방출되었다. 선택 사이클에서 파아지들에 대한 3회 및 4회 용리가 과량의 타겟에 의한 경쟁적 용리에 의해 수행되었다. 용리된 파아지들은 재증폭되었다. 결합제의 특이도를 유도하기 위해, 타겟과 유사한 단백질이 선택과정 동안 포함될 수 있다.
TAT 파아지 디스플레이 선택에 대한 대안: 리보좀 디스플레이 선택
유비퀴틴 라이브러리는 예를 들어 선택 시스템으로서 리보좀 디스플레이를 사용하여 타겟에 대해 증량되었다(Zahnd et al., 2007; Ohashi et al., 2007). 당업계에 알려진 다른 선택 방법들도 사용될 수 있다. 표준 방법에 따라 타겟은 비오틴화되었고 스트렙타비딘이 코팅된 다이나비드(Dynabeads®)(Invitrogen) 상에 고정화되었다. 리보좀, mRNA 및 초기 유비퀴틴 폴리펩타이드로 구성된 3원 복합체는 시험관내 단백질 합성키트인 PURExpressTM(NEB)를 이용하여 구성되었다. 1차 선택을 위해 2회 반복되었는데, 3원 복합체는 인큐베이션된 후 2회의 유사한 선택과정이 수행되었다. 타겟 인큐베이션 후 각각의 사이클에서, 비드들은 용액에서 자기적으로 분리되었고, 점차 엄격한 조건 하에서 리보좀 디스플레이 완충용액으로 세척되었다. 1회 내지 3회 선택 사이클에서 타겟이 결합된 자성 비드들 상에 고정된 3원 복합체(ternary complexes)가 세척되었다. 4번째 선택 사이클에서 세척은 수차례 수행되었다. 첫번째 2번의 사이클에서 세척 후 비드들은 다시 용액으로부터 자기적으로 분리되었고, 타겟-결합 변형 유비퀴틴 분자의 mRNA는 50 mM EDTA를 추가하여 리보좀으로부터 방출되었다. 선택 사이클에 있어서, mRNA에 대한 3회 및 4회 용리는 과량의 타겟에 의한 경쟁적 용리에 의해 수행되었다(Lipovsek and Pluckthun, 2004). 각각의 사이클 이후, RNA 정제 및 cDNA 합성이 RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen, Germany), Turbo DNA-free Kit(Applied Biosystems, USA) 및 Transcriptor Reverse Transcriptase (Roche, Germany)를 이용하여 수행되었다.
증량된 풀에 대한 클로닝
4번째 선택 사이클 이후 합성된 cDNA는 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 방법에 따라 PCR에 의해 증폭되었고, 적합한 제한 뉴클레아제(restriction nucleases)를 이용하여 절단된 후 양립되는 접합 말단들을 통해 발현 벡터 pET-20b(+)(Merck, Germany)로 라이게이션되었다.
단일 콜로니 히트 분석 (Single Colony Hit Analysis)
NovaBlue(DE3) 세포(Merck, Germany)로의 형질전환 후, 앰피실린 내성 단일 콜로니들이 생장되었다. 타겟-결합 변형 유비퀴틴의 발현은 자동 유도 배지(auto induction medium)(Studier, 2005)를 이용하여 96-웰 플레이트(깊은 웰)(Genetix, UK)에서 배양함으로써 달성되었다. 세포들은 수확되었고 파쇄처리되었다. 원심분리한 후 얻어진 상등액을, 타겟과 HRP(horseradish peroxidase)에 접합된 유비퀴틴-특이적인 Fab 단편으로 코팅된 ELISA에 의해 스크린하였다. 검출시약으로서 TMB-Plus (Biotrend, Germany)가 사용되었고, 0.2 M H2SO4 용액을 이용하여 노란색을 발색시켜 450 nm 대 620 nm 파장에서 플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다.
타겟에 대한 수차례의 선택 디스플레이가 수행되었다. 마지막 2회의 선택 사이클에서 결합 분자들이 자유로운 과량의 타겟에 의해 용리되었다.
예를 들어, 타겟 ED-B에 대한 헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 결합 단백질로서, 46H9 (서열번호 6), 9E12 (서열번호 7), 22D1 (서열번호 8), 1041-D11 (도 5)(서열번호 33), 1045-D10 (서열번호 34) 등이 확인되었다. 예를 들어, 다른 타겟에 대한 헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 결합 단백질로서, 타겟 MIA-2에 대한 결합 단백질 1111-E10 (도 12)(서열번호 53), 타겟 TNF-알파에 대한 결합 단백질 SPWF-15_6-A12 (도 15c)(서열번호 57) 및 SPWF-15_16-D4 (도 15e)(서열번호 90), 타겟 NGF에 대한 결합 단백질 SPWF9-1B7-th (도 16a)(서열번호 91) 및 SPWF9-6A2-th (도 16c)(서열번호 92), 타겟 IgG에 대한 결합 단백질 SPVF4-16B2-ts (도 17a)(서열번호 93) 및 SPVF4-9C6-ts (도 17c)(서열번호 94) 등이 확인되었다.
야생형 유비퀴틴 단량체 (Ubi monomer wt)를 야생형 유비퀴틴 이량체 (ubi dimer wt)와 서열 정렬한 것과, 야생형 유비퀴틴 단백질(도 5에 Ub2-TsX9로 표시된 것으로서, 각 단량체의 위치 45에서 치환이 있고 C-말단에서 2개의 치환이 있는 것)을 변형된 유비퀴틴 헤테로-이량체 변종 1041-D11과 서열 정렬한 것이 도 5에 도시되어 있다. Ub2-TsX에서 단량체의 C-말단에서의 치환(GG → AA)은 혈청에서의 안정성을 증가시키는데, 이는 GG 뒤에 탈유비퀴틴화 효소(deubiquitinases) 절단 위치가 있고 AA 뒤에 없기 때문이다. C-말단에서의 치환을 갖는 유비퀴틴과 비교하여 야생형 유비퀴틴의 2차 구조는 거의 동일하다.
1041-D11로 지칭되는 우수한 ED-B 결합 활성을 갖는 변형 유비퀴틴(도 5에 도시된 것으로서 서열번호 36) 또는 1045-D10은 야생형에 비해 다음과 같은 아미노산 치환이 있는 것으로 확인된다. 즉, 제1 모듈에서 K6W, L8W, K63R, E64K, S65F, T66P이고, 제2 모듈에서 K6T, L8Q, Q62W, K63S, E64N, S65W, T66E이며, 선택적으로 Q2R (변종 1041-D11에는 있으나 변종 1045-D10에는 없음)이다. 융합 단백질에 대한 적합한 링커는 적어도 서열 GIG를 갖는 링커 또는 적어도 서열 SGGGG를 갖는 링커 또는 다른 링커로서, 예를 들어 GIG, SGGGG, SGGGGIG, SGGGGSGGGGIG 또는 SGGGGSGGGG를 들 수 있다. 그러나, 이 대신에 다수의 가능한 링커들이 사용될 수 있음은 물론이다. 추가로 제1 단량체 결합 결정 영역에서 컨센서스 서열을 갖는 EBD 결합 단백질은 도 11에 도시되어 있다.
우수한 MIA-2 결합 활성을 갖는 변형 유비퀴틴은 도 12 내지 도 14에 도시되어 있다.
우수한 NGF 결합 활성을 갖는 변형 유비퀴틴은 도 16에 도시되어 있다.
우수한 TNF-알파 결합 활성을 갖는 변형 유비퀴틴은 도 15에 도시되어 있다.
우수한 IgG 결합 활성을 갖는 변형 유비퀴틴은 도 17에 도시되어 있다.
실시예 2. 인간의 타겟에 대한 변형 유비퀴틴 기반 ED-B 결합 변종들의 결합 분석
실시예 2A. 농도 의존적인 ELISA에 의한 변형 유비퀴틴 기반 결합 변종들에 대한 결합 분석
인간의 타겟에 대한 유비퀴틴 기반 변종들의 결합은 농도의존적인 ELISA에 의해 분석되었다. 인간의 타겟, BSA 또는 HSA 및 가능한 추가 대조군(ED-B가 타겟으로 사용된 경우 세포 피브로넥틴(cFN)임)으로 코팅된 NUNC-메디소프 플레이트에 정제된 단백질을 증량시키면서 가하였다. 웰 당 50 ㎕ 단백질 용액(10 ㎍/ml)으로 항원 코팅을 4℃에서 하룻밤 동안 수행하였다. PBS, 0.1 % 트윈 20(Tween 20)(pH 7.4)(PBST)로 플레이트를 세척한 후, 웰들을 블로킹 용액(PBS pH 7.4; 3 % BSA; 0.5% Tween 20)을 이용하여 실온에서 2시간 동안 블로킹시켰다. 웰들을 다시 PBST로 3회 세척하였다. 코팅된 웰은 타겟 결합 단백질의 농도를 달리하면서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션되었다. PBST로 웰들을 세척한 후, 항-Ubi fab 단편 (AbyD) POD 컨쥬케이트가 PBST에 적절히 희석되어 가해졌다. 상기 플레이트가 PBST로 3회 세척되었다. 50 ㎕의 TMB 기질 용액 (KEM-EN-Tec)이 각각의 웰에 첨가되어 15분간 인큐베이션되었다. 반응은 0.2 M H2SO4를 첨가하여 정지되었다. ELISA 플레이터는 TECAN Sunrise ELISA-리더를 이용하여 판독되었다. 광학 흡광도 측정은 참조 파장(reference wavelength)으로 620 nm 파장을 사용하여 450 nm 파장에서 수행되었다. 도 6은 변종 1041-D11이 ED-B에 대한 매우 높은 친화도로 결합하는 것을 나타낸다(Kd=6.9 nM). 이는 다른 타겟 분자인 MIA-2, TNF-알파, NGF 및 IgG에 대해서도 확인되는데, 각각 도 14, 도 15, 도 16 및 도 17에서 결과로서 표시되어 있다. 따라서, 유비퀴틴 야생형에서 단지 소수의 변형만(각각의 단량체에서 8개 치환까지)이 낮은 마이크로 몰 범위에서 타겟에 대한 친화도를 갖게 된다.
실시예 2B. 경쟁적 농도의존적인 ELISA에 의한 변형된 유비퀴틴 기반의 결합 변종에 대한 결합 분석
본 실시예에서는 타겟 ED-B에 대한 결합 분석이 설명되지만, 추가적인 실험없이도 본 결합 분석은 다른 타겟에 대해 사용될 수 있다. 자유로운 타겟의 양을 증가시키는 조건 하에서 경쟁적 농도의존적인 ELISA에 의해 피브로넥틴 단편을 포함하는 고정화된 ED-B(67B89)에 대한 유비퀴틴 변종 1041-D11에 대한 결합을 분석하였다. ELISA의 조건은 1041-D11 단백질이 1시간 동안 ED-B (67B89)(0 μM - 10 μM) 또는 음성 대조군 6789 (0 μM - 10 μM)에 의해 미리 인큐베이션되는 것을 제외하고는 실시예 2A에 기술된 바와 같으며, 이후 혼합물은 메디소프-플레이트 상에 위치하는 타겟 67B89에 가해지고 이어서 변종은 대응하는 항체(항-유비퀴틴-Fab-POD; 1:6500 희석)에 의해 검출되었다.
도 7은 변종 1041-D11이 ED-B에 대한 매우 높은 친화도 결합을 갖는 것을 나타낸다(IC50 =140 nM). 도 6에 도시된 결과, 즉 유비퀴틴 야생형에서 단지 소수의 변형만(각각의 단량체에서 8개 치환까지)이 ED-B에 대한 매우 높은 친화도 결합을 갖게 된다는 사실이 확인된다.
실시예 2C. 결합 활성의 혈청 안정성을 동시에 분석하는 농도의존적인 ELISA에 의한 변형 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 변종에 대한 결합 분석
ELISA는 당업계에서 잘 알려진 과정, 실시예 2A 및 2B에 기술된 바와 같은 과정을 이용하여 수행되었다. ED-B(여기서는 67B89로 지칭됨)는 미세적정 플레이트에 코팅되고, 변종은 ED-B에 결합되며 특이적 유비퀴틴-항체(항-Ubi-Fab-POD)에 의해 검출된다. 본 분석에서 변종은 다른 방식으로 처리된다: 변종은 37℃에서 1시간 동안 마우스 혈청에서 인큐베이션되거나(도 9의 파란색 원); 37℃에서 1시간 동안 래트 혈청에서 인큐베이션되거나(도 9의 적색 원); 37℃에서 1시간 동안 PBS에서 인큐베이션된다(도 9의 검정색 원). 도 9는 변종 1041-D11의 전체 Kd 값이 10.3 nM (PBS에서)에서 20.74 nM (마우스 혈청에서)까지의 범위에 있는 것을 도시하고 있다.
실시예 2D. Biacore 어세이에 의한 변형 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 변종에 대한 결합 분석
변종의 농도를 달리하면서(예를 들어 변종, 바람직한 변종으로서 1041-D11의 농도를 0-200 nM으로 함), CM5-칩(Biacore) 상에 고정화된 피브로넥틴 단편을 포함하는 ED-B(67B89로 지칭됨)에 대한 결합을 당업자에 알려진 방법들을 사용하여 분석하였다. BIA 평가 소프트웨어(BIA evaluation software) 및 1:1 랭뮤어 맞춤(Langmuir-fitting)을 통해 얻어진 데이터들이 처리되었다. 변종 1041-D11의 KD는 도 8에 도시된 바와 같이 1.0 nM이었다. 결합 반응 속도 상수(kinetic binding constant)는 kon=7.6*105 M-1s-1; koff= 7.7*10-4s-1 이었다. 융합 단백질 1041-D11-TNF 알파의 KD는 1.13 nM이었다. 결합 반응 속도 상수(kinetic binding constant)는 kon= 4.5*105 M-1s-1; koff= 5.0*10-4s-1이었다.
실시예 2E. SE-HPLC에 의한 변형 유비퀴틴 기반 ED-B 결합 변종에 대한 복합체 형성 분석
복합체 형성 분석을 위해, Tricorn Superdex 75 5/150 GL 컬럼(GE-Healthcare) (V = 3 ml)이 사용되었고 50 ㎕의 단백질이 가해졌다. 추가의 조건들은 다음과 같다: 버퍼: 1x PBS, pH 7.3, 유량(flow-rate): 0.3 ml/분, 런닝시간: 45분 (샘플 주입: 15분 후).
조건: 0.72 nmol 1041-D11 단백질 + 0.72 nmol ED-B (여기서는 67B89로 지칭됨) 또는 음성대조군으로서 피브로넥틴(여기서는 6789로 지칭됨)이 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되고 복합체 형성 분석을 위해 칼럼에 가해졌다. 도 10에서, 변종만이 검정색으로 도시되고, 타겟 ED-B만이 파란색으로 도시되며, ED-B와 복합체를 만드는 변종은 분홍색으로 도시된다. 도 10a는 변종과 피브로넥틴을 포함하는 ED-B(67B89), 도 10b는 ED-B가 없는 피브로넥틴(6789)과 변종을 도시한다. 이 도면은 변종 1041-D11가 ED-B (67B89)와는 복합체를 구성하지만 6789와는 복합체를 구성하지 않는 것을 도시하여 특이도를 확인시켜 준다.
실시예 3. TNF-알파에 대한 향상된 결합 특성을 갖는 유비퀴틴-기반의 헤테로 이량체 결합 단백질
TNF-알파에 특이적인 유비퀴틴 기반의 헤테로-이량체 결합 단백질이 본 발명의 방법에 따라 선택되었다. 즉, 헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 결합 단백질의 집단을 포함하는 파아지 라이브러리를 확립하고 TNF-알파에 대한 결합 능력에 대해 스크린하였다. 다음과 같은 변형들이 수행되었다:
제1 단량체: 위치 2, 4, 6, 62-66에서 하나 이상의 아미노산 변형, 선택적으로 위치 68, 70, 72-74 중 적어도 하나에서 추가 아미노산 변형, 선택적으로 추가의 위치에서의 변형;
제2 단량체: 위치 6, 8, 62-66에서 하나 이상의 아미노산 변형.
1144-D11 (서열번호 79) 및 1144-E9 (서열번호 80)를 제외하고 대부분의 경우 SGGGGSGGGGIG가 링커로 사용되었다. 1144-D11 및 1144-E9의 경우 제1 유비퀴틴 단량체 및 제2 유비퀴틴 단량체 사이에 링커가 사용되지 않았다. 위치 75 및 76은 AA 또는 GG이다. 상기 링커는 도 15a의 파트 A에 도시되어 있다. 결합 특이도는 도 15c 내지 도 15f에 도시되어 있다.
실시예 4. MIA2에 대한 향상된 결합 특성을 갖는 유비퀴틴-기반의 헤테로 이량체 결합 단백질의 생성
MIA2는 진단 및 치료 마커로서, 특히 간경변증(cirrhosis), 섬유증(fibrosis) 및 간암에 있어서 의미있는 진단 및 치료 마커이다. 이 마커에 대한 상세한 설명은 미국공개특허공보 제US 2004/076965호에 개시되어 있다.
본 발명의 변형 유비퀴틴 결합 단백질의 타겟 단백질은 MIA-2 중 안정한 101 아미노산 코어 영역으로서 본 명세서에서는 SPR30-3으로 불린다. SPR30-3은 MIA-2의 구조 부분이다. 이는 시그널 펩티드를 제외하고는 MIA (CD-RAP), OTOR, TANGO에 상동성을 갖는다. 분자량은 11569.198 Da이다.
MIA-2의 아미노산 코어 영역은 다음과 같다(서열번호 95):
MLESTKLLADLKKCGDLECEALINRVSAMRDYRGPDCRYLNFTKGEEISVYVKLAGEREDLWAGSKGKEFGYFPRDAVQIEEVFISEEIQMSTKESDFLCL.
MIA-2에 대해 특이적인 유비퀴틴 기반의 헤테로-이량체 결합 단백질은 본 발명의 방법에 따라 선택되었다. 즉, 헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 결합 단백질의 집단을 포함하는 파아지 라이브러리를 확립하고 MIA-2에 대한 결합 능력에 대해 스크린하였다. 그 결과는 후술하는 바와 같다.
도 13은 유비퀴틴-기반의 헤테로-이량체 MIA2 결합 단백질의 정렬을 도시한다.
변종 1111-E10은 비오틴화 타겟에 대해 마이크로 몰 범위의 친화도를 나타내며 크기배제 크로마토그래피에서 복합체를 형성한다. 가장 강력한 결합 단백질이 1111-E10으로 지정되었는데, 이는 제1 단량체 유비퀴틴 유닛(BDR1)에서 위치 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66에서의 아미노산 치환과, 제2 단량체 유비퀴틴 유닛(BDR2)에서 위치 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66에서의 아미노산 치환을 갖는다.
제1 단량체 유비퀴틴 유닛(BDR1)은 1111-H2 및 1111-H12에서의 치환과 동일한 치환을 나타낸다. 따라서, 변종 1111-H2 및 1111-H12는 단지 하나의 치환된 아미노산만 상이한 BDR1 및 BDR2의 조합으로 여겨질 수 있다.
1111-C9, 1111-B4 및 1111-F6의 결합 분자에 대해 평가되었다. 이들 결합 단백질들은 불용성이거나 ELISA 내에서 그리고 SEC 상에서 MIA2의 SPR30-3에 대한 결합을 보이지 않았다. 변종 1111-E10 및 1111-C9 각각 및 1111-B4가 증량되었다. 1111-B4에서 추가의 치환 T9A가 수차례 일어났다. 1111-F6은 증량되지 않았고 히트-ELISA(Hit-ELISA)에서 높은 신호값을 나타내기 때문에 관심 후보로 여겨졌다. 그러나, 상기 결합 단백질은 불용성으로 나타났다.
도 14는 결합 변종 1111-E10의 비오틴화된 MIA-2 (biot. MIA2; Kd = 2.6 μM (검정색 원))에 대한 농도의존적인 ELISA를 도시하고 있다. 대조군인 HSA에 대해서는 백색 원으로 표시되어 있다. 변종 1111-E10은 MIA2에 대한 최상의 결합 분자로서 입증되었다. 서열은 다음과 같다(서열번호 53):
MQIFVETFTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIGWHPELHLVLRLRGGGIGMQIFVRTETGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNILMGYVLHLVLRLRAA
사용된 링커들은 첨부된 서열목록에 다음과 같이 첨부되어 있다:
1111-B4_21231: sggggsggggig (서열번호 96)
1111-C9_21265: sggggsggggig (서열번호 96)
1111-E10_21315: gig
1111-F6_21331: gig
1111-H12_21391: eig
1111-H2_21371: gig
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SEQUENCE LISTING <110> Scil Proteins GmbH <120> A METHOD FOR IDENTIFYING HETERO-MULTIMERIC MODIFIED UBIQUITIN PROTEINS WITH BINDING CAPABILITY TO LIGANDS <130> P27761-WO01 <150> EP09179147.5 <151> 2009-12-14 <150> EP10186980.8 <151> 2010-10-08 <150> EP10162264.5 <151> 2010-05-07 <160> 96 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 76 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Ubiquitin protein <400> 1 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 50 55 60 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly 65 70 75 <210> 2 <211> 91 <212> PRT <213> artificial <220> <223> ED-B domain of oncofetal fibronectin <400> 2 Glu Val Pro Gln Leu Thr Asp Leu Ser Phe Val Asp Ile Thr Asp Ser 1 5 10 15 Ser Ile Gly Leu Arg Trp Thr Pro Leu Asn Ser Ser Thr Ile Ile Gly 20 25 30 Tyr 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Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Thr Thr 50 55 60 Gly Pro Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala 65 70 75 <210> 83 <211> 76 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 1081-H11 <400> 83 Met Gln Ile Phe Val Val Thr Glu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Thr Thr 50 55 60 Gly Pro Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala 65 70 75 <210> 84 <211> 76 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 1082-A10 <400> 84 Met Gln Ile Phe Val Val Thr Glu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Thr Thr 50 55 60 Gly Pro Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala 65 70 75 <210> 85 <211> 76 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 1082-A11 <400> 85 Met Gln Ile Phe Val Val Thr Glu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Thr Thr 50 55 60 Gly Pro Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala 65 70 75 <210> 86 <211> 76 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 1088-A5 <400> 86 Met Gln Ile Phe Val Val Thr Glu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Thr Thr 50 55 60 Gly Pro Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala 65 70 75 <210> 87 <211> 76 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 1091-A2 <400> 87 Met Gln Ile Phe Val Val Thr Glu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Thr Thr 50 55 60 Gly Pro Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala 65 70 75 <210> 88 <211> 76 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 1094-D4 <400> 88 Met Gln Ile Phe Val Val Thr Glu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Thr Thr 50 55 60 Gly Pro Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala 65 70 75 <210> 89 <211> 164 <212> PRT <213> artificial <220> <223> SPWF-15_6-A12 <400> 89 Met Phe Ile Tyr Val Val Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala 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Gln 115 120 125 Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu 130 135 140 Ser Asp Tyr Asn Ile Asp Gln Gln Arg Ile Leu His Leu Val Leu Arg 145 150 155 160 Leu Arg Gly Gly <210> 93 <211> 164 <212> PRT <213> artificial <220> <223> SPVF-4_16-B2_ts <400> 93 Met Gln Ile Phe Val Asp Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Ile Glu 50 55 60 Trp Leu Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Ser Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Gly Met Gln Ile Phe Val Asp Thr Leu 85 90 95 Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu 100 105 110 Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln 115 120 125 Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu 130 135 140 Ser Asp Tyr Asn Ile Gly Ala Asp Ala Pro Leu His Leu Val Leu 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Thr Lys Leu Leu Ala Asp Leu Lys Lys Cys Gly Asp 1 5 10 15 Leu Glu Cys Glu Ala Leu Ile Asn Arg Val Ser Ala Met Arg Asp Tyr 20 25 30 Arg Gly Pro Asp Cys Arg Tyr Leu Asn Phe Thr Lys Gly Glu Glu Ile 35 40 45 Ser Val Tyr Val Lys Leu Ala Gly Glu Arg Glu Asp Leu Trp Ala Gly 50 55 60 Ser Lys Gly Lys Glu Phe Gly Tyr Phe Pro Arg Asp Ala Val Gln Ile 65 70 75 80 Glu Glu Val Phe Ile Ser Glu Glu Ile Gln Met Ser Thr Lys Glu Ser 85 90 95 Asp Phe Leu Cys Leu 100 <210> 96 <211> 12 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Glycine/serine linker <400> 96 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Gly 1 5 10

Claims (17)

  1. a) 단량체의 변형 유비퀴틴 단백질로부터 유래하는 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질들의 집단으로서, 선단과 말단(head-to-tail)의 배열로 연결되어 있는 적어도 2개의 유비퀴틴 단량체를 포함하는 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질들을 구비하는 집단을 제공하되, 상기 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질의 적어도 하나의 유비퀴틴 단량체는 서열번호 1의 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 및 68 위치에서의 적어도 3개의 아미노산에 있어서 표면 노출 아미노산의 치환에 의해 상이하게 변형되고, 상기 변형된 유비퀴틴 단량체 단백질은 변형되지 않은 유비퀴틴 단백질에 대해 적어도 80% 상동성, 또는 적어도 90% 상동성, 또는 적어도 95% 상동성의 아미노산 서열 상동성을 갖는 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질들의 집단을 제공하는 단계와,
    b) 상이하게 변형된 유비퀴틴 단백질들을 갖는 상기 집단에 대해 잠재적인 리간드를 제공하는 단계와,
    c) 상이하게 변형된 유비퀴틴 단백질들을 갖는 상기 집단을 상기 리간드와 접촉시키는 단계와,
    d) Kd = 10-7- 10-12 M 범위의 특이적인 결합 친화도로 상기 리간드에 결합하고 상기 리간드에 대해 1가의 결합 활성을 나타내는 변형된 헤테로-다량체 단백질들을 스크린함으로써 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질을 확인하는 단계와, 선택적으로,
    e) 상기 결합 친화도를 갖는 상기 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 리간드에 대한 결합능력을 가진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴을 확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질은 헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 단백질 또는 헤테로 삼량체 변형 유비퀴틴 단백질인 것을 특징으로 하는 리간드에 대한 결합능력을 가진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴을 확인하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단량체의 변형 유비퀴틴 단백질은 전체 1개 내지 10개의 아미노산 삽입 중 적어도 하나 및/또는 전체 1개 내지 7개의 아미노산 결실 중 적어도 하나를 포함하고, 추가로 상기 단량체의 변형 유비퀴틴 단백질은 선택적으로 적어도 6개 및 최대 14개의 아미노산 치환을 포함하며, 헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 단백질은 적어도 12개 및 최대 28개의 아미노산 치환, 적어도 1개 및 최대 20개의 아미노산 삽입, 및/또는 적어도 1개 및 최대 14개의 아미노산 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 리간드에 대한 결합능력을 가진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴을 확인하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단량체의 변형 유비퀴틴 단백질은 유비퀴틴을 인코딩하는 DNA를 유전공학적으로 변형시키고 원핵생물, 진핵생물 또는 시험관 내에서 상기 변형 유비퀴틴 단백질을 발현시킴으로써 수득되는 것을 특징으로 하는 리간드에 대한 결합능력을 가진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴을 확인하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질은 시험관내 선택 방법에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 리간드에 대한 결합능력을 가진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴을 확인하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 리간드는 항원 또는 합텐인 것을 특징으로 하는 리간드에 대한 결합능력을 가진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴을 확인하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    1개 내지 7개의 추가의 아미노산이 적어도 하나의 상기 단량체의 유비퀴틴 단백질에서 치환되는 것을 특징으로 하는 리간드에 대한 결합능력을 가진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴을 확인하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴 단백질들의 집단은 상이하게 변형된 단량체의 유비퀴틴 단백질 각각을 인코딩하는 2개의 DNA 라이브러리를 유전적으로 융합하고 상기 융합된 DNA를 헤테로-다량체 융합 단백질들로 해독하며 상기 해독된 융합 단백질들을 디스플레이하고 선단과 말단의 배열로 함께 연결되어 있는 단량체 유비퀴틴 단백질들을 포함하는 변형된 헤테로-다량체 유비퀴틴 단백질들의 존재에 대해 상기 디스플레이된 융합 단백질들을 스크린함으로써 제공되되, 10-7- 10-12 M 범위의 Kd를 갖는 특이적인 결합 친화도로 상기 리간드에 결합하고 상기 리간드에 대해 1가의 결합 활성을 나타내는 변형된 헤테로-다량체 유비퀴틴 단백질을 선택함으로써 제공되거나, 화학적 합성에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 리간드에 대한 결합능력을 가진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴을 확인하는 방법.
  9. 단량체 유비퀴틴 단백질로부터 유래하는 헤테로-다량체 유비퀴틴 융합 단백질들의 집단을 인코딩하는 DNA를 포함하는 DNA 라이브러리로서,
    각각의 헤테로-다량체 유비퀴틴 융합 단백질은 선단과 말단(head-to-tail)의 배열로 연결되어 있는 적어도 2개의 변형된 유비퀴틴 단량체를 포함하고, 상기 헤테로-다량체 유비퀴틴 융합 단백질을 구성하는 단량체 유비퀴틴 단백질들 중 적어도 2개는 서열번호 1의 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 및 68 위치에서의 적어도 3개의 아미노산에 있어서 표면 노출 아미노산의 치환에 의해 상이하게 변형되며, 상기 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질은 변형되지 않은 유비퀴틴 단백질에 대해 적어도 80% 상동성, 또는 적어도 90% 상동성, 또는 적어도 95% 상동성의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA 라이브러리.
  10. 제9항의 DNA 라이브러리의 발현에 의해 수득된 단백질 라이브러리.
  11. 제9항의 DNA 라이브러리 또는 제10항의 단백질 라이브러리를 포함하는 원핵생물 또는 진핵생물 세포, 또는 파아지 집단.
  12. 제10항의 단백질 라이브러리의 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  14. 제5항에 있어서,
    상기 시험관내 선택방법은 디스플레이 방법인 것을 특징으로 하는 리간드에 대한 결합능력을 가진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴을 확인하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 디스플레이 방법은 파아지 디스플레이 방법, 리보좀 디스플레이 방법, TAT 파아지 디스플레이 방법, 효모 디스플레이 방법, 세균 디스플레이 방법, 세포 표면 디스플레이 방법 또는 mRNA 디스플레이 방법인 것을 특징으로 하는 리간드에 대한 결합능력을 가진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴을 확인하는 방법.
  16. 제7항에 있어서,
    치환되는 아미노산은 서열번호 1의 36, 44, 70, 71 위치에서의 하나 이상의 아미노산으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 리간드에 대한 결합능력을 가진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴을 확인하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    치환되는 아미노산은 추가로 서열번호 1의 62, 63 및 64 위치, 또는 72 및 73 위치, 또는 8 위치에서 선택되는 것을 특징으로 하는 리간드에 대한 결합능력을 가진 헤테로-다량체 변형 유비퀴틴을 확인하는 방법.
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