BR112012014417B1

BR112012014417B1 - Proteínas ubiquitinas modificadas tendo uma atividade de ligação específica para o extradomínio b de fibronectina

Info

Publication number: BR112012014417B1
Application number: BR112012014417-0A
Authority: BR
Inventors: Arnd Steuernagel; Erik Fiedler; Markus Fiedler; Anja Kunert; Joerg Nerkamp; Thomas Goettler; Manja Gloser; Ilka Haenssgen
Original assignee: Scil Proteins Gmbh
Priority date: 2009-12-14
Filing date: 2010-12-14
Publication date: 2021-11-09
Also published as: WO2011073214A2; AU2010332938A1; EP2367843A1; EP2379581A2; KR101436222B1; DK2379581T3; IL219755A0; RU2553333C2; KR20110111304A; WO2011073208A1; WO2011073209A1; EP2379581B1; US20130157878A1; CA2778872C; US8921304B2; CA2778871A1; AU2010332932A1; JP2012523227A; JP2013513376A; WO2011073214A3

Abstract

proteína ubiquitinas modificas tendo uma atividade de ligação específica para o extra-domínio b de fibronectina. a presente invenção se refere a novas proteínas hetero-multiméricas obtidas de ubiquitina modificada capaz de se ligar ao extra-domínio b de fibronectina (ed-b) com alta afinidade. além disso, a invenção se refere a proteína de fusão compreendendo a dita proteína recombinante fusionada a um componente farmaceuticamente e/ou diagnosticamente ativo. a invenção é direcionada ainda ao uso das ditas proteínas em métodos de tratamento médico.

Description

DESCRIÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a novas proteínas hetero-multiméricas capazes de se ligar ao extra-domínio B de fibronectina (ED-B). Além disso, a invenção se refere a proteínas de fusão compreendendo a dita proteína de ligação hetero-multimérica fusionada a um componente farmaceuticamente e/ou diagnosticamente ativo. A invenção é direcionada 10 ainda a um método para a geração de tal proteína de ligação hetero-multimérica ou proteína de fusão e a composições farmacêuticas e/ou de diagnóstico contendo as ditas proteínas de ligação hetero-multiméricas. Além disso, a invenção se refere a bibliotecas contendo DNA que codifica as ditas proteínas.

Em modalidades adicionais, a invenção é direcionada a polinucleotídeos que 15 codificam a dita proteína de ligação hetero-multimérica ou proteína de fusão, vetores compreendendo o dito polinucleotídeo e células hospedeiras compreendendo a dita proteína, proteína de fusão, vector e/ou polinucleotídeo. Em uma modalidade preferida, a dita proteína de ligação hetero-multimérica ou proteína de fusão é incluída em um medicamento ou um agente de diagnóstico. Adicionalmente, métodos para produzir a dita 20 proteína recombinante ou proteína de fusão bem como o uso das ditas proteínas em métodos de tratamento médico são descritos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Existe uma demanda crescente para ligar moléculas consistindo em aminoácidos que não são imunoglobulinas. Enquanto que até agora os anticorpos representam a classe 25 melhor estabelecida de se ligar a moléculas existe ainda uma necessidade de novas moléculas de ligação com a finalidade de ligandos alvo com alta afinidade e especificidade uma vez que as moléculas de imunoglobulina sofrem de inconvenientes maiores. Embora possam ser produzidas muito facilmente e possam ser direcionadas a quase qualquer alvo, têm uma estrutura molecular bem complexa. Existe uma necessidade em progresso de 30 substituir anticorpos por moléculas menores que podem ser manuseadas de uma maneira mais fácil. Estes agentes de ligação alternativos podem ser beneficamente usados, por exemplo, nos campos médicos de diagnóstico, profilaxia e tratamento de doenças.

Proteínas tendo estruturas tridimensionais relativamente definidas, comumente denominadas como esqueletos de proteínas, podem ser usadas como material de partida 35 para o desenho dos ditos agentes de ligação alternativos. Estes esqueletos tipicamente contêm uma ou mais regiões que são responsáveis pela variação de sequência específica ou randômica, e tal randomização de sequências é com frequência levada a cabo para produzir uma biblioteca de proteínas a partir da qual as moléculas de ligação específica podem ser selecionadas. As moléculas com um tamanho menor que anticorpos e uma afinidade comparável ou mesmo melhor para um antígeno alvo são esperadas que sejam superiores a anticorpos em termos de propriedades farmacocinéticas e imunogenicidade.

Um número de abordagens prévias do uso de esqueletos de proteínas como material de partida de proteínas de ligação. Por exemplo, no documento WO 99/16873 proteínas modificadas da família da lipocalina (as assim chamadas Anticalinas) exibindo atividade de ligação para certos ligandos foram desenvolvidas. A estrutura de peptídeos da família da lipocalina é modificada pelas substituições de aminoácidos no seu bolso de 10 ligação de ligando natural usando métodos de engenharia genética. Da mesma forma que as imunoglobulinas, as Anticalinas podem ser usadas para identificar ou se ligar a estruturas moleculares. De uma maneira análoga a anticorpos, estruturas de alça flexíveis são modificadas; estas modificações possibilitam o reconhecimento de ligandos diferentes dos naturais.

O documento WO 01/04144 descreve a geração artificial de um domínio de ligação na superfície da proteína em proteínas estruturais de folha beta por si mesmo carecendo de um sítio de ligação. Por meio deste domínio de ligação artificial gerado de novo, por exemplo, variações em y-cristalino - uma proteína estrutural da lente do olho - podem ser obtidas as quais interagem com ligandos com alta afinidade e especificidade. Em contraste 20 à modificação de sítios de ligação que estão já presentes e formados a partir de estruturas de alça flexíveis como foi mencionado acima para Anticalinas, estes domínios de ligação são gerados de novo na superfície de folhas beta. No entanto, o documento WO 01/04144 somente descreve a alteração de proteínas relativamente grandes para a geração de novas propriedades de ligação. Devido ao seu tamanho as proteínas de acordo com o documento WO 01/04144 podem ser modificadas ao nível da engenharia genética somente pelos métodos que requerem algum esforço. Além disso, nas proteínas reveladas até o momento somente uma proporção relativamente pequena pela porcentagem dos aminoácidos totais foi modificada com a finalidade de manter a estrutura global da proteína. Portanto, somente uma região relativamente pequena da superfície da proteína está disponível que pode ser 30 utilizada para a geração de propriedades de ligação que não existiam anteriormente. Além disso, o documento WO 01/04144 revela somente a geração de uma propriedade de ligação ao y-cristalino.

O documento WO 04/106368 descreve a geração de proteínas de ligação artificiais com base em proteínas ubiquitinas. A ubiquitina é uma proteína pequena, monomérica e 35 citosólica que é altamente conservada em sequência e está presente em todas as células eucarióticas desde protozoários até vertebrados. No organismo, desempenha um papel crucial na regulação da degradação controlada de proteínas celulares. Para este propósito, as proteínas destinadas para a degradação são covalentemente ligadas a ubiquitina ou cadeias de poliubiquitina durante a sua passagem através de uma cascata de enzimas e são seletivamente degradadas por causa deste marcador. De acordo com resultados recentes, a ubiquitina ou a marcação de proteínas pela ubiquitina, respectivamente, desempenha um importante papel também em outros processos celulares tais como a importação de diversas proteínas ou a regulação de gene das mesmas.

Além do esclarecimento da sua função fisiológica, a ubiquitina é um objeto de pesquisa primariamente por causa das suas propriedades estruturais e químicas e de proteína. A cadeia de polipeptídeos de ubiquitina consiste em 76 aminoácidos dobrados em uma estrutura α/β extraordinariamente compacta (Vijay-Kumar, 1987): quase 87 % da cadeia de polipeptídeos estão envolvidos na formação dos elementos estruturais secundários por meio de ligações de hidrogênio. As estruturas secundárias são três voltas de alfa hélice e meia bem como uma folha β antiparalela consistindo em quatro fitas. A disposição característica destes elementos - uma folha β antiparalela exposta da superfície da proteína em cujo lado de trás uma alfa hélice é empacotada que se situa verticalmente na parte superior da mesma - é geralmente considerada como o assim chamado motivo de dobragem semelhante a ubiquitina. Uma característica estrutural adicional é uma região hidrofóbica marcada no interior da proteína entre a alfa hélice e a folha β.

Por causa do seu tamanho pequeno, a preparação artificial de ubiquitina pode ser levada a cabo tanto por meio de síntese química como por meio de métodos biotecnológicos. Devido às propriedades de dobragem favoráveis, a ubiquitina pode ser produzida por engenharia genética usando microrganismos tais como Escherichia coli em quantidades relativamente grandes no citosol ou no espaço periplasmático. Por causa das condições de oxidação que predominam no periplasma a última estratégia geralmente é reservada para a produção de proteínas secretórias. Devido à preparação bacteriana simples e eficiente a ubiquitina pode ser usada como um parceiro de fusão para outras proteínas estranhas a serem preparadas para a qual a produção é problemática. Por meio de fusão a ubiquitina uma solubilidade melhorada e deste modo um rendimento de produção melhorado pode ser alcançado.

Em comparação com anticorpos ou outros esqueletos alternativos, as proteínas de ligação artificiais com base em proteínas ubiquitinas (também denominadas como Affilin®) têm muitas vantagens: tamanho pequeno, alta estabilidade, alta afinidade, alta especificidade, custo de fabricação microbiana econômica, e ajuste de meia-vida no soro. No entanto, existe ainda uma necessidade de desenvolver mais aquelas proteínas em termos de novas abordagens terapêuticas com altas afinidades a alvos específicos. Enquanto que o documento WO 05/05730 geralmente descreve o uso de esqueletos de ubiquitina com a finalidade de obter proteínas de ligação artificiais, nenhuma solução é proporcionada de como modificar uma proteína ubiquitina com a finalidade de obter uma ligação específica e de alta afinidade ao ED-B de fibronectina.

O documento WO 2008/022759 descreve proteínas de ligação recombinantes em que o domínio de homologia 3 de Src (SH3) da quinase FYN é usado para obter novas 5 proteínas de ligação. Foi encontrado que a especificidade alvo pode ser desenhada pela mutação da alça TA e/ou da alça Src com a finalidade de desenvolver agentes terapêuticos e/ou de diagnóstico de proteína. De igual maneira que em lipocalinas usadas como esqueleto, os resíduos de aminoácido a serem mutageneizados estão situados dentro das regiões de alça variáveis e flexíveis que mimetizam o princípio subjacente à função de 10 ligação anticorpo/antígeno. Esta flexibilidade global do sítio de interação pelo qual os anticorpos se ligam ao epítopo é um processo principalmente entalpicamente dirigido; este processo, no entanto, leva a uma contribuição entrópica desfavorável pela perda de mobilidade após a associação da região de determinação de complementaridade flexível. Contrário a isso, ao usar ubiquitina como um esqueleto, os presentes inventores não 15 mudaram resíduos de aminoácido primariamente dentro das regiões de alça flexíveis, mas dentro das fitas β rígidas e inflexíveis de uma região de folha β ou proximamente adjacente às fitas beta. A vantagem de selecionar resíduos de aminoácido dentro das fitas β rígidas e inflexíveis ou proximamente adjacentes às fitas beta de ubiquitina como regiões de ligação para ED-B é inter alia a seguinte: é pensado que os parceiros de ligação já apresentam uma 20 geometria de complementaridade apropriada para a ligação firme. Consequentemente, estas interações envolvem a complementaridade em forma, carga e elementos hidrofílicos/hidrofóbicos das estruturas mais rígidas dos parceiros de ligação. Estas interações de corpo rígido otimizam a interface e acomodam a função biológica.

Fibronectinas (FN) são uma classe importante de glicoproteínas de matriz 25 extracelular de alto peso molecular abundantemente expressas em tecidos saudáveis e fluidos corporais. O seu papel principal consiste em facilitar a adesão de células a um número de diferentes matrizes extracelulares.

A presença de fibronectinas na superfície de células não transformadas em cultura bem como a sua ausência no caso de células transformadas teve como resultado a 30 identificação de fibronectinas como importantes proteínas de adesão. Interagem com numerosas várias outras moléculas, por exemplo, colágeno, heparan sulfato-proteoglicanas e fibrina e assim regulam a forma da célula e a criação do citoesqueleto. Além disso, são responsáveis pela migração de células e diferenciação de células durante embriogênese. Desempenham também um importante papel na cicatrização de feridas, em que facilitam a 35 migração de macrófagos e outras células imune e na formação de coágulos sanguíneos possibilitando a adesão de plaquetas sanguíneas a regiões danificadas dos vasos sanguíneos.

O extra-domínio B (ED-B) de fibronectina é um domínio pequeno que é inserido por meio de splicingalternativo do transcrito de RNA primário na molécula de fibronectina. A molécula está presente ou omitida em moléculas de fibronectina da matriz extracelular e representa um dos marcadores mais seletivos associados a angiogênese e remodelagem de tecidos, como é abundantemente expressa ao redor de novos vasos sanguíneos, mas indetectável em virtualmente todos os tecidos adultos normais (exceto para úteros e ovários). ED-B é conhecido por estar envolvido primariamente em câncer. Altos níveis de expressão de ED-B foram detectados em lesões primárias bem como sítios metastáticos de muitas entidades de câncer sólido humano, incluindo mama, pulmão de célula não pequena, colorretal, pancreático, pele humana, hepatocelular, meningioma intracranial, glioblastoma (Menrad u. Menssen, 2005). Além disso, ED-B pode ser ligado a agentes de diagnóstico e ser favoravelmente usado como ferramenta de diagnóstico. Um exemplo é o seu uso em formação de imagem molecular de, por exemplo, placas ateroscleróticas e detecção de câncer, por exemplo, por imunocintigrafia de pacientes com câncer. Uma abundância de usos de diagnóstico adicionais são concebíveis.

A sequência de aminoácidos de 91 aminoácidos de extra-domínio B (ED-B) humano de fibronectina é mostrada na SEQ ID NO: 2. Para a expressão da proteína, uma metionina de início tem que ser adicionada. ED-B é abundante em mamíferos, por exemplo, em roedores, gado, primatas, carnívoros, seres humanos etc. Exemplos de animais em que existe um 100 % de identidade de sequência a ED-B humano são Rattus norvegicus, Bos taurus, Mus musculus, Equus caballus, Macaca mulatta, Canis lupus familiarís, e Pan troglodytes. ED-B especificamente acumula em estruturas neo-vasculares e representa um alvo para a intervenção molecular em câncer. Um número de anticorpos ou fragmentos de anticorpo ao domínio ED-B de fibronectina são conhecidos na técnica como agentes terapêuticos potenciais para o câncer e outras indicações (ver, por exemplo, o documento WO 97/45544, o documento WO 07/054120, o documento WO 99/58570, o documento WO 01/62800). O fragmento de anticorpo Fv de cadeia simples humano ScFvL19 (também denominado como L19) é específico ao domínio ED-B de fibronectina e tem sido verificado para seletivamente direcionar neovasculatura tumoral, tanto em modelos tumorais experimentais como em pacientes com câncer. Além disso, conjugados compreendendo um anticorpo anti-ED-B ou um fragmento de anticorpo anti-ED-B com citocinas tais como IL-12, IL-2, IL-10, IL-15, IL-24, ou GM-CSF têm sido descritas para direcionar fármacos para a fabricação de um medicamento para inibir particularmente câncer, angiogênese, ou crescimento neoplásico (ver, por exemplo, WO 06/119897, WO 07/128563, WO 01/62298). O direcionamento seletivo de neovasculatura de tumores sólidos com anticorpos anti-ED-B ou fragmentos de anticorpo anti-ED-B tais como L19 conjugado a uma função efetora apropriada tal como um agente citotóxico ou um agente de imunoestimulação tem provado ser bem sucedido em experimentos em animais. Para a terapia de câncer pancreático, as proteínas de fusão compreendendo uma parte de lnterleucina-2 (IL-2) e uma parte de anticorpo anti-ED-B foram combinadas com a molécula pequena Gencitabina (2‘-deoxi-2',2'- difluorocitidina) (ver, por exemplo, o documento WO 07/115837).

Os documentos do estado da técnica discutidos acima descrevem o uso de vários esqueletos de proteínas incluindo anticorpos para gerar novas proteínas de ligação a ED-B. Direcionamento a ED-B com compostos atualmente disponíveis tem certas desvantagens. As moléculas menores (tais como proteínas de ligação a ED-B à base de ubiquitina hetero- multimérica desta invenção) com uma afinidade comparável ou mesmo mais alta para o antígeno de ED-B são esperadas que tenham vantagens significativas a anticorpos ou outras proteínas de ligação.

Uma vez que câncer representa uma das causas principais de morte no mundo, existe uma necessidade crescente de agentes melhorados para tratar câncer. Os agentes quimioterápicos e tratamento por radiação atuais sofrem de seletividade pobre e a maioria dos agentes quimioterápicos não acumulam no sítio do tumor e assim falham em alcançar níveis adequados dentro do tumor. Existe uma forte necessidade médica de tratar efetivamente o câncer.

É assim um objeto da presente invenção proporcionar proteínas de ligação hetero- multiméricas à base de ubiquitina que são capazes de se ligar especificamente com afinidade muito alta ao domínio extracelular de fibronectina (ED-B). É um objeto adicional da presente invenção identificar e proporcionar novas proteínas de ligação com especificidade de ligação muito alta a ED-B, por exemplo, para uso no tratamento de câncer. Além disso, um método deve ser proporcionado com a finalidade de produzir as ditas moléculas de ligação hetero-multiméricas.

Os objetos descritos acima são resolvidos pelo assunto das reivindicações independentes incluídas. Modalidades preferidas da invenção são incluídas nas reivindicações dependentes bem como na seguinte descrição, exemplos e figuras.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Mais especificamente, os inventores proporcionam uma proteína capaz de se ligar ao ED-B de fibronectina humana, compreendendo uma proteína ubiquitina hetero-dimérica modificada em que duas ubiquitinas monoméricas (unidades de ubiquitina) são ligadas umas às outras em uma disposição cabeça-cauda, em que cada monômero da dita proteína dimérica é diferentemente modificado pelas substituições de pelo menos 6 aminoácidos nas posições 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 e 68 da SEQ ID NO: 1 em que as ditas substituições compreendem (1) nas primeiras substituições de unidades monoméricas pelo menos nas posições de aminoácidos 6, 8, 63, 64, 65, e 66; e nas segundas substituições de unidades monoméricas pelo menos nas posições de aminoácidos 6, 8, 62, 63, 64, 65, e 66; opcionalmente adicionalmente 2, ou (2) nas primeiras substituições de unidades monoméricas pelo menos nas posições de aminoácidos 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65, e 66; e nas segundas substituições de unidades monoméricas pelo menos nas posições de aminoácidos 6, 8, 62, 63, 64, 65, e 66; opcionalmente adicionalmente 2, e opcionalmente modificações adicionais, preferivelmente substituições de outros aminoácidos, a dita unidade de ubiquitina monomérica modificada tendo uma identidade de aminoácido a SEQ ID NO: 1 de pelo menos um do grupo de 80 %, pelo menos 83 %, pelo menos 85 %, pelo menos 83 % e pelo menos 90 %, a dita proteína tendo uma afinidade de ligação específica ao dito domínio ED-B de fibronectina de Kd = 10'7 - 10'12 M e exibe uma atividade de ligação monovalente com respeito ao dito extra-domínio B (ED-B) de fibronectina.

Em uma modalidade preferida, a proteína é recombinante.

Em modalidades adicionais da invenção, 7, 8, 9 ou todos os aminoácidos nas posições 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66, e 68 da SEQ ID NO: 1 são modificados em cada unidade de ubiquitina monomérica. É para ser entendido que a presente invenção permite uma combinação de cada uma destas variações em cada uma das unidades monoméricas, isto é, na primeira e na segunda unidade. Por exemplo, a primeira unidade monomérica pode compreender 6 modificações enquanto a segunda unidade compreende 7 ou 8 modificações, a primeira unidade pode compreender 8 modificações e a segunda unidade 7 modificações etc. Cada um dos aminoácidos listados acima pode ser selecionado na primeira e na segunda unidade e ambas as unidades são então combinadas. Substituições preferidas são descritas no presente documento a seguir.

Definições de Termos importantes usados no Pedido

O termo “extra-domínio B de fibronectina” ou de maneira breve designado como “ED-B” compreende todas as proteínas que mostram uma identidade de sequência a SEQ ID NO: 2 de pelo menos 70 %, opcionalmente 75 %, opcionalmente ainda 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 % ou 97 % ou mais, ou 100 % e tendo a funcionalidade definida acima de ED-B.

Os termos “proteína capaz de se ligar a” ou “proteína de ligação” se referem a uma proteína ubiquitina compreendendo um domínio de ligação a ED-B como será definido adicionalmente a seguir. Qualquer tal proteína de ligação à base de ubiquitina pode compreender domínios de proteína adicionais que não são domínios de ligação, tal como, por exemplo, frações de multimerização, etiquetas de polipeptídeo, ligantes de polipeptídeo e/ou moléculas de polímeros não proteináceos. Alguns exemplos de moléculas de polímeros não proteináceos são amido de hidroxietila, polietileno glicol, polipropileno glicol, ou polioxialquileno.

Anticorpos e fragmentos dos mesmos são bem conhecidos ao técnico no assunto. A proteína de ligação da invenção não é um anticorpo ou um fragmento do mesmo, tal como fragmentos Fab ou scFv. Além disso, o domínio de ligação da invenção não compreende uma dobra de imunoglobulina como está presente em anticorpos.

No presente relatório descritivo, os termos “ligando” e “alvo” e “parceiro de ligação” são usados como sinônimos e podem ser intercambiados. Um ligando é qualquer molécula capaz de se ligar com uma afinidade como foi definido no presente documento à proteína ubiquitina modificada hetero-multimérica.

O termo “proteína ubiquitina” cobre a ubiquitina de acordo com SEQ ID NO: 1 e modificações da mesma de acordo com a seguinte definição. A ubiquitina é altamente conservada em organismos eucarióticos. Por exemplo, em todos os mamíferos investigados até agora ubiquitina tem a sequência de aminoácidos idêntica. Particularmente preferidas são moléculas de ubiquitina de seres humanos, roedores, porcos, e primatas. Adicionalmente, a ubiquitina de qualquer outra fonte eucariótica pode ser usada. Por exemplo, ubiquitina de levedura difere somente em três aminoácidos da sequência da SEQ ID NO: 1. Geralmente, as proteínas ubiquitinas cobertas pelo dito termo “proteína ubiquitina” mostram uma identidade de aminoácido de mais de 70 %, preferivelmente mais de 75 % ou mais de 80 %, de mais de 85 %, de mais de 90 %, de mais de 95 %, de mais de 96 % ou até uma identidade de sequência de 97 % a SEQ ID NO: 1.

O termo “uma proteína ubiquitina modificada” se refere a modificações da proteína ubiquitina qualquer uma das substituições, inserções ou deleções de aminoácidos ou uma combinação das mesmas enquanto substituições são as modificações mais preferidas que podem ser suplementadas por qualquer uma das modificações descritas acima. O número de modificações é estritamente limitado à medida que as ditas unidades de ubiquitina monoméricas modificadas têm uma identidade de aminoácido a SEQ ID NO: 1 de pelo menos um do grupo de 80 %, pelo menos 83 %, pelo menos 85 %, pelo menos 83 % e pelo menos 90 %. No máximo, o número global de substituições em uma unidade monomérica é, portanto, limitado a 15 aminoácidos correspondendo a 80 % de identidade de aminoácido. O número total de aminoácidos modificados na molécula de ubiquitina hetero-dimérica é 30 aminoácidos correspondendo a 20 % de modificações de aminoácidos à base da proteína hetero-dimérica. A identidade de aminoácido da proteína ubiquitina modificada dimérica em comparação com uma proteína ubiquitina não modificada dimérica com uma sequência monomérica básica da SEQ ID NO: 1 é selecionada a partir de pelo menos um do grupo de 80 %, pelo menos 83 %, pelo menos 85 %, pelo menos 83 % e pelo menos 90 %.

Para determinar a extensão de identidade de sequência de um derivado da ubiquitina à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, por exemplo, o programa de similaridade SIM Local (Xiaoquin Huang e Webb Miller, “Advances in Applied Mathematics, vol. 12: 337- 357, 1991) ou Clustal, W. pode ser usado (Thompson et al., Nucleic Acids Res.. 22(22): 4673-4680, 1994.).

Preferivelmente, a extensão da identidade de sequência da proteína modificada a SEQ ID NO: 1 é determinada em relação à sequência completa da SEQ ID NO: 1.

A “proteína de fusão hetero-dimérica” ou “proteína hetero-dimérica” da invenção é considerada como uma proteína que compreende duas proteínas ubiquitinas monoméricas diferentemente modificadas com duas regiões de domínio de ligação de interação proporcionando juntas uma propriedade de ligação monovalente (domínio de ligação) para ED-B como o parceiro de ligação específico. Um hetero-dímero é conseguido pela fusão de duas moléculas de ubiquitina monoméricas em que ambas estas moléculas são diferentemente modificadas como é descrito no presente documento.

Uma vantagem de multimerização de monômeros de ubiquitina diferentemente modificados com a finalidade de gerar proteínas de ligação hetero-multiméricas (aqui: proteínas hetero-diméricas) com atividade de ligação monovalente está situada no aumento do número total de resíduos de aminoácido que pode ser modificado para gerar uma nova propriedade de ligação de alta afinidade a ED-B. A principal vantagem é que embora ainda mais aminoácidos sejam modificados, a integridade química e de proteína é mantida sem diminuir a estabilidade global do esqueleto da dita proteína de ligação recentemente criada a ED-B. O número total de resíduos que pode ser modificado com a finalidade de gerar um novo sítio de ligação para ED-B é aumentado uma vez que os resíduos modificados podem ser alocados a duas proteínas ubiquitinas monoméricas. O número de modificações pode assim ser dois correspondendo ao número de moléculas de ubiquitina monoméricas modificadas. Uma estrutura modular da proteína de ligação a ED-B à base de ubiquitina permite aumentar o número global de aminoácidos modificados à medida que os ditos aminoácidos modificados são incluídos nas duas moléculas de ubiquitina monoméricas. O presente método trata da identificação de moléculas de ubiquitina hetero-diméricas tendo uma especificidade monovalente (para um único epítopo) para ED-B.

Assim, o uso de hetero-dímeros tendo um sítio de ligação comum para ligar parceiros abre a possibilidade de introduzir um número aumentado de resíduos modificados que não influenciam indevidamente a integridade química e de proteína da molécula de ligação final, uma vez que a quantidade global daqueles resíduos modificados é distribuída sobre as duas unidades monoméricas que formam o dímero. As ditas proteínas ubiquitinas modificadas hetero-diméricas que se ligam a ED-B estão presentes em uma biblioteca de proteínas. “Monovalente” tem que ser entendido como a capacidade que ambas as regiões de ligação criadas na primeira e na segunda unidade monomérica da ubiquitina dimérica modificada juntas se ligam a ED-B de uma maneira sinergística e combinada, isto é, ambas as regiões de ligação agem juntas para formar uma atividade de ligação monovalente. Tomando cada região de ligação de ambas a primeira e a segunda ubiquitina modificada na dita molécula hetero-dimérica separadamente se ligará aparentemente a ED-B com uma afinidade e eficiência muito menores que com a molécula dimérica. Ambas as regiões de ligação formam um único sítio de ligação que é formado como uma região contígua de aminoácidos na superfície da proteína ubiquitina modificada hetero-dimérica de modo que a dita ubiquitina modificada é possibilitada a se ligar muito mais eficientemente a ED-B que cada proteína monomérica tomada em separado. É particularmente importante que de acordo com a presente invenção as duas proteínas monoméricas não são ligadas umas às outras após ter triado as moléculas de ubiquitina de ligação mais potentes, mas que o processo de triagem já seja realizado na presença das ubiquitinas hetero-diméricas. Após ter recebido a informação de sequência sobre as moléculas de ubiquitina de ligação mais potentes, estas moléculas podem ser obtidas por qualquer outro método, por exemplo, por meio de síntese química ou pelos métodos de engenharia genética, por exemplo, ligando as duas unidades de ubiquitina monoméricas já identificadas juntas.

De acordo com a invenção, os dois monômeros de ubiquitina diferentemente modificados que se ligam a um ligando são para serem ligados pela fusão cabeça-cauda um ao outro usando, por exemplo, métodos genéticos. Os monômeros de ubiquitina diferentemente modificados fusionados se ligam de uma maneira monovalente e são somente eficazes se ambas as “regiões de domínio de ligação” (“BDR”) agirem juntas. Uma “região de domínio de ligação” é definida no presente documento como região em um monômero de ubiquitina que tem aminoácidos modificados em pelo menos 6 aminoácidos de posições 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66, 68 da SEQ ID NO: 1 que estão envolvidos na ligação ao alvo.

Os monômeros de ubiquitina modificados e ligados que formam a proteína hetero- dimérica se ligam ao mesmo epítopo via uma única região de ligação contígua. Esta região contígua do heterómero é formada por ambas as regiões de determinação de ligação dos dois módulos formados pelos dois monômeros de ubiquitina diferentemente modificados.

Uma “fusão cabeça-cauda” é para ser entendida como fusionar as duas proteínas juntas por meio da conexão das mesmas na direção N-C-N-C- dependendo do número de unidades contidas no dímero. Nesta fusão cabeça-cauda, os monômeros de ubiquitina podem ser conectados diretamente sem qualquer ligante.

Alternativamente, a fusão de monômeros de ubiquitina pode ser realizada via ligantes, por exemplo, um ligante que tem pelo menos a sequência de aminoácidos GIG ou que tem pelo menos a sequência de aminoácidos SGGGG ou qualquer outro ligante, por exemplo, GIG, SGGGG, SGGGGIG, SGGGGSGGGGIG ou SGGGGSGGGG. Também outros ligantes para a fusão genética de dois monômeros de ubiquitina são conhecidos na técnica e podem ser usados.

As proteínas ubiquitinas modificadas da invenção são proteínas engenheiradas com novas afinidades de ligação a ED-B como alvo ou ligando (cujas expressões são usadas no 5 presente documento intercambiavelmente). O termo “substituição” compreende também a modificação química de aminoácidos por meio de, por exemplo, substituição ou adição de grupos químicos ou resíduos ao aminoácido original. A substituição de aminoácidos em pelo menos uma região exposta da superfície da proteína compreendendo aminoácidos localizados em pelo menos uma fita de folha beta da região de folha beta ou posicionados 10 até 3 aminoácidos adjacentes à fita de folha beta é crucial.

A substituição de aminoácidos para a geração do novo domínio de ligação específico ao ED-B pode ser realizada de acordo com a invenção com qualquer aminoácido desejado, isto é, para a modificação para gerar a nova propriedade de ligação a ED-B não é obrigatório tomar a precaução de que os aminoácidos tenham uma propriedade química 15 particular ou uma cadeia lateral, respectivamente, que é similar a essa dos aminoácidos substituídos de modo que qualquer aminoácido desejado pode ser usado para este propósito.

A etapa de modificação dos aminoácidos selecionados é realizada de acordo com a invenção preferivelmente por mutagênese ao nível genético por mutagênese randômica, isto 20 é, uma substituição randômica dos aminoácidos selecionados. Preferivelmente, a modificação de ubiquitina é levada a cabo por meio de métodos de engenharia genética para a alteração de um DNA que pertence à respectiva proteína. Preferivelmente, a expressão da proteína ubiquitina é então levada a cabo em organismos procarióticos ou eucarióticos.

Substituições são realizadas particularmente em aminoácidos de superfície exposta das quatro fitas beta das folhas beta ou aminoácidos de superfície exposta até 3 aminoácidos adjacentes à fita de folha beta de proteína ubiquitina. Cada fita beta consiste usualmente de 5-7 aminoácidos. Com referência a SEQ ID NO: 1, por exemplo, as fitas beta usualmente cobrem resíduos de aminoácido 2-7, 12 - 16, 41 -45 e 65-71. Regiões que 30 podem ser adicionalmente e preferivelmente modificadas incluem posições até 3 aminoácidos (isto é, 1,2, ou 3) adjacentes à fita de folha beta. As regiões preferidas que podem ser adicionalmente e preferivelmente modificadas incluem em particular resíduos de aminoácido 8-11, 62-64 e 72-75. As regiões preferidas incluem voltas beta que ligam duas fitas beta juntas. Uma volta beta preferida inclui amino resíduos 62 - 64. Um aminoácido 35 mais preferido que está proximamente adjacente à fita de folha beta é o aminoácido na posição 8. Além disso, exemplos adicionalmente preferidos para substituições de aminoácidos são as posições 36, 44, 70, e/ou 71. Por exemplo, aquelas regiões que podem ser adicionalmente e preferivelmente modificadas incluem aminoácidos 62, 63, e 64 (3 aminoácidos), ou 72, 73 (2 aminoácidos), ou 8 (1 aminoácido).

Em modalidades preferidas, os resíduos de aminoácido são alterados pelas substituições de aminoácidos. No entanto, também deleções e inserções são permissíveis. O número de aminoácidos que pode ser adicionado ou deletado é limitado a 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 aminoácidos em uma subunidade de ubiquitina monomérica, e consequentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ,15, 16 aminoácidos com respeito à proteína ubiquitina dimérica. Em uma modalidade, nenhuma inserção de aminoácidos é feita. Em uma modalidade ainda adicional, nenhuma deleção foi realizada.

Com a condição de que a proteína ubiquitina modificada da presente invenção compreenda adicionalmente às ditas substituições especificadas nas reivindicações e explicadas no presente documento também deleções e/ou adições de um ou mais aminoácidos, as posições de aminoácidos dadas para a ubiquitina humana do tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) têm que ser alinhadas com a ubiquitina modificada com a finalidade de repartir as correspondentes proteínas uma à outra. Em caso de proteínas de fusão (ver a seguir), a numeração (e alinhamento) de cada uma das subunidades de ubiquitina monomérica é feita da mesma maneira, isto é, um alinhamento de, por exemplo, um dímero é iniciado na posição de aminoácido 1 para cada respectiva subunidade.

Na ubiquitina monomérica, preferivelmente de mamíferos, por exemplo, ser humano, pelo menos 10 % dos aminoácidos presentes em fitas beta ou posições até 3 aminoácidos adjacentes à fita de folha beta, preferivelmente pelo menos 20 %, mais preferivelmente pelo menos 25 %, podem ser modificados, preferivelmente substituídos, de acordo com a presente invenção para gerar uma propriedade de ligação que não existia anteriormente. Em um máximo, preferivelmente aproximadamente 50 % dos aminoácidos presentes em fitas beta ou posições até 3 aminoácidos adjacentes à fita de folha beta, mais preferivelmente em um máximo aproximadamente 40 % ou aproximadamente 35 % ou até aproximadamente 30 % ou até aproximadamente 25 % são modificados, preferivelmente substituídos. Em uma fita beta, geralmente um a quatro aminoácidos são modificados. Em uma modalidade, três de seis aminoácidos preferivelmente na primeira e na quarta fita beta, por exemplo, região de resíduos de aminoácido 2-7 ou 65-71, são modificados.

Uma ubiquitina monomérica modificada de acordo com a invenção usada como unidade de construção para um hetero- dímero representa em total até 20 % de aminoácidos. Considerando isto, existe uma identidade de sequência a SEQ ID NO: 1 da proteína ubiquitina modificada a pelo menos 80 %. Em modalidades adicionais da invenção, a identidade de sequência ao nível de aminoácido é pelo menos 83 % ,pelo menos 85 %), pelo menos 87 % e além disso pelo menos 90 % pelo menos 92 % ou pelo menos 95 % de identidade de sequência à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. A invenção cobre também identidades de sequência de aminoácidos de mais de 97 % da proteína ubiquitina modificada em comparação com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

Em uma modalidade adicional da invenção, uma ubiquitina é modificada em 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 aminoácidos nas posições 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66, e/ou 68 da SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, a ubiquitina a ser modificada nestas posições, foi já pré- modificada. Por exemplo, as modificações adicionais poderiam compreender modificações nos aminoácidos 74 e 75 ou no aminoácido 45 para gerar melhores estabilidade ou propriedades químicas e de proteína. Um monômero de ubiquitina modificado é obtenível em que em total até 9, 10, 11, 12, 13, 14 e um máximo de 15 aminoácidos da ubiquitina da SEQ ID NO: 1 são modificados, preferivelmente substituídos. De acordo com um exemplo, uma ubiquitina monomérica modificada poderia ser obtida tendo 14 substituições e uma deleção. Baseado no número total de aminoácidos de ubiquitina isto corresponde a uma porcentagem de aproximadamente 20 %. Isto foi extraordinariamente surpreendente e poderia não ser esperado uma vez que usualmente uma porcentagem muito menor já é suficiente para perturbar a dobragem da proteína.

Em uma modalidade da invenção, aqueles aminoácidos são modificados para a geração de uma região que tem as novas propriedades de ligação a ED-B que formam uma região contígua na superfície da proteína. Dessa maneira, uma região contígua pode ser gerada tendo uma propriedade de ligação ao ED-B. “Região contígua” de acordo com a invenção se refere à seguinte: devido à carga, a estrutura espacial e a hidrofobicidade/hidrofilicidade das suas cadeias laterais, os aminoácidos interagem com o seu ambiente da maneira correspondente. O ambiente pode ser o solvente, geralmente água, ou outras moléculas, por exemplo, aminoácidos espacialmente próximos. Por meio de informação estrutural sobre a proteína bem como o respectivo software a superfície das proteínas pode ser caracterizada. Por exemplo, a região de interface entre os átomos da proteína e o solvente pode ser visualizada neste sentido incluindo a informação sobre como esta região de interface é estruturada, cujas áreas de superfície são acessíveis ao solvente ou como as cargas são distribuídas na superfície. Uma região contígua pode ser revelada, por exemplo, pela visualização deste tipo usando um software adequado. Tais métodos são conhecidos aos técnicos no assunto. De acordo com a invenção, basicamente, também toda a região exposta da superfície pode ser usada como a região contígua na superfície a ser modificada para a geração de novas propriedades de ligação. Em uma modalidade, para este propósito uma modificação pode também compreender a região de a-hélice. Em uma proteína ubiquitina modificada hetero-dimérica, uma região de determinação de ligação compreende duas das regiões de superfície exposta que formam juntas uma região contígua que compreende duas vezes o comprimento de uma região de determinação de ligação.

A modificação de aminoácidos em pelo menos uma região exposta da superfície da proteína compreendendo pelo menos uma fita beta da região de folha beta ou posições até 3 aminoácidos adjacentes à fita de folha beta é crucial. A “estrutura de folha beta” é definida como sendo essencialmente semelhante a folha e quase completamente esticada. Em contraste a alfa hélices que são formadas a partir de um segmento ininterrupto da cadeia de polipeptídeos, folhas beta podem ser formadas por diferentes regiões da cadeia de polipeptídeos. Neste sentido, regiões distanciadas ainda mais na estrutura primária podem entrar em íntima proximidade uma com a outra. Uma fita beta tipicamente tem um comprimento de 5-10 aminoácidos (usualmente 5-6 resíduos em ubiquitina) e tem uma conformação quase completamente esticada. As fitas beta se aproximam tanto uma com a outra que ligações de hidrogênio se formam entre o grupo C-0 de uma fita e o grupo NH da outra fita e vice versa. As folhas beta podem ser formadas a partir de diversas fitas e têm uma estrutura semelhante a folha em que a posição dos alfa átomos C alternados entre acima ou abaixo do plano semelhante a folha. As cadeias laterais dos aminoácidos seguem este padrão e, assim, alternativamente apontam para a parte superior ou para o fundo. Dependendo da orientação das fitas beta as folhas são classificadas em folhas paralelas e antiparalelas. De acordo com a invenção ambas podem ser mutadas e usadas para a preparação das proteínas reivindicadas. , Para a mutagênese das fitas beta e da estrutura da folha beta, uma fita beta ou posições até 3 aminoácidos adjacentes à fita beta (que é uma fita da folha beta) são selecionadas na ubiquitina as quais estão próximas à superfície. Aminoácidos de superfície exposta podem ser identificados com respeito à estrutura cristalográfica de raios X disponível. Se nenhuma estrutura cristalina estiver disponível podem ser feitas tentativas por meio de análise por computador para prever regiões de folha beta de superfície exposta e a acessibilidade de posições de aminoácidos individuais com respeito à estrutura primária disponível ou para modelar a estrutura 3d da proteína e para obter informação sobre potenciais aminoácidos de superfície exposta dessa maneira. Descrição adicional do mesmo pode ser tomada, por exemplo, de J. Mol. Biol., 5 de abril de 1987; 194(3):531-44. Vijay- Kumar S, Bugg C.E., Cook W.J. É, no entanto, também possível levar a cabo modificações na folha beta ou de posições até 3 aminoácidos adjacentes à fita beta para a qual a pré-seleção demorada de posições de aminoácidos a serem mutageneizados pode ser omitida. Aquelas regiões de DNA que codificam a estrutura de folha betas ou até 3 aminoácidos adjacentes à fita de folha beta são isoladas do seu ambiente de DNA, submetidas a mutagênese randômica e são depois disso re-integradas no DNA que codifica a proteína da qual foram removidas anteriormente. Isto é seguido por um processo de seleção para mutantes com as propriedades de ligação desejadas.

Em outra modalidade da invenção as fitas beta ou até 3 aminoácidos adjacentes à fita beta próximas à superfície são selecionadas como já foi explicado acima e as posições de aminoácidos a serem mutageneizados dentro destas regiões selecionadas são identificadas. As posições de aminoácidos selecionadas neste sentido podem então ser mutageneizadas ao nível do DNA pela mutagênese dirigida ao sítio, isto é, um códon que codifica um aminoácido específico é substituído por um códon que codifica outro aminoácido específico anteriormente selecionado, ou esta substituição é levada a cabo no contexto de uma mutagênese randômica em que a posição de aminoácido a ser substituída é definida, mas não o códon que codifica o novo aminoácido não determinado. “Aminoácidos de superfície exposta” são aminoácidos que são acessíveis ao solvente circundante. Se a acessibilidade dos aminoácidos na proteína for mais de 8 % em comparação com a acessibilidade do aminoácido no modelo tripeptídeo Gly-X-Gly, os aminoácidos são chamados “de superfície exposta”. Estas regiões de proteína ou posições de aminoácidos individuais, respectivamente, são também sítios de ligação específicos para potenciais parceiros de ligação para os quais uma seleção deve ser levada a cabo de acordo com a invenção. Além disso, é feita referência a Caster et al., JÍ983 Science, 221, 709 - 713, e Shrake & Rupley, 1973 J. Mol. Biol. 79(2):351-371, que para a descrição completa são incorporados por referência neste pedido.

Variações de esqueleto de proteína ubiquitina que diferem pelas substituições de aminoácidos na região do sítio de ligação artificial gerado de novo a partir da proteína precursora e a partir uma da outra podem ser geradas por uma mutagênese dirigida dos respectivos segmentos de sequência. Neste caso, os aminoácidos que têm certas propriedades tais como polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade ou hidrofilicidade podem ser trocados ou substituídos, respectivamente, por aminoácidos com outras propriedades respectivas. Além de substituições, os termos “mutagênese” e “modificado” e “substituído” compreendem também inserções e deleções. Ao nível de proteína as modificações podem também ser levadas a cabo pela alteração química das cadeias laterais dos aminoácidos de acordo com métodos conhecidos aos técnicos no assunto.

Métodos de mutagênese de ubiquitina

Como um ponto de partida para a mutagênese dos respectivos segmentos de sequência, por exemplo, o cDNA de ubiquitina que pode ser preparado, alterado, e amplificado pelos métodos conhecidos aos técnicos no assunto pode ser usado. Para a alteração específica ao sítio de ubiquitina em regiões relativamente pequenas da sequência primária (aproximadamente 1-3 aminoácidos) reagentes comercialmente disponíveis e métodos estão à mão (“Quick Change”, Stratagene; “Mutagene Phagemid in vitro Mutagenesis Kit”, Biorad). Para a mutagênese dirigida ao sítio de regiões maiores modalidades específicas de, por exemplo, a reação em cadeia da polimerase (PCR) estão disponíveis aos técnicos no assunto. Para este propósito uma mistura de oligodeoxinucleotídeos sintéticos tendo composições e pares de bases degeneradas nas posições desejadas pode ser usada, por exemplo, para a introdução da mutação. Isto pode também ser alcançado usando análogos de pares de base que não ocorrem naturalmente em DNA genômico, tal como, por exemplo, inosina.

O ponto de partida para a mutagênese de uma ou mais fitas beta da região de folha beta ou posições até 3 aminoácidos adjacentes à fita de folha beta pode ser, por exemplo, o cDNA de ubiquitina ou também o DNA genômico. Além disso, o gene que codifica a proteína ubiquitina pode também ser preparado sinteticamente.

Diferentes procedimentos conhecidos por si mesmos estão disponíveis para a mutagênese são métodos para a mutagênese específica ao sítio, métodos para a mutagênese randômica, mutagênese usando PCR ou métodos similares.

Em uma modalidade preferida da invenção as posições de aminoácidos a serem mutageneizados são pré-determinadas. A seleção de aminoácidos a serem modificados é levada a cabo para cumprir com as limitações da presente reivindicação 1 com respeito a aqueles aminoácidos que têm que ser modificados. Em cada caso, uma biblioteca de mutantes diferentes é geralmente estabelecida que é triada usando métodos conhecidos por si mesmos. Geralmente, uma pré-seleção dos aminoácidos a serem modificados pode ser particularmente facilmente realizada como suficiente informação estrutural está disponível para a proteína ubiquitina a ser modificada.

Métodos para a mutagênese dirigida bem como mutagênese de segmentos de sequência mais longos, por exemplo, por meio de PCR, por mutagênese química ou usando cepas mutagênicas bacterianas também pertencem à técnica anterior e podem ser usados de acordo com a invenção.

Em uma modalidade da invenção a mutagênese é levada a cabo pela montagem de oligonucleotídeos de DNA que possuem o códon de aminoácido NNK. deve ser entendido, no entanto, que também outros códons (tripletos) podem ser usados. As mutações são realizadas de um modo que a estrutura de folha beta é preferivelmente mantida. Geralmente, a mutagênese ocorre no lado de fora de uma região estável de folha beta exposta na superfície da proteína, compreende tanto a mutagênese específica ao sítio como a mutagênese randômica. A mutagênese específica ao sítio compreendendo uma região relativamente pequena na estrutura primária (aproximadamente 3-5 aminoácidos) pode ser gerada com os kits comercialmente disponíveis de Stratagene® (QuickChange®) ou Bio- Rad® (Mutagene® phagemid in vitro mutagenesis kit) (cf. US 5.789.166; US 4.873.192). se regiões mais extensas forem submetidas a mutagênese específica ao sítio um cassete de DNA precisa ser preparado em que a região a serem mutageneizados é obtido pela montagem de oligonucleotídeos contendo as posições mutadas e as posições não alteradas (Nord et al., 1997 Nat. Biotechnol. 8, 772-777; McConell e Hoess, 1995 J. Mol. Biol. 250, 460-470.). A mutagênese randômica podem ser introduzida pela propagação do DNA em cepas mutagênicas ou por amplificação de PCR (PCR propensa a erros) (por exemplo, Pannekoek et a!., 1993 Gene 128, 135 140). Para este propósito, uma polimerase com uma taxa de erro aumentada é usada. Para aumentar o grau da mutagênese introduzida ou para combinar diferentes mutações, respectivamente, as mutações nos fragmentos de PCR podem ser combinadas por meio de embaralhamento de DNA (Stemmer, 1994 Nature 370, 389-391). Uma revisão destas estratégias de mutagênese com respeito a enzimas é proporcionada na revisão de Kuchner e Arnold (1997) TIBTECH 15, 523-530. Para levara a cabo esta mutagênese randômica em uma região de DNA selecionada também precisa ser construído um cassete de DNA que é usado para a mutagênese.

A modificação randômica é realizada pelos métodos bem estabelecidos e bem conhecidos na técnica. Um “nucleotídeo ou sequência de aminoácidos randomicamente modificada” é um nucleotídeo ou sequência de aminoácidos que em um número de posições foi submetido a inserção, deleção ou substituição por nucleotídeos ou aminoácidos, cuja natureza não pode ser predita. Em muitos casos os nucleotídeos (aminoácidos) ou sequências de nucleotídeo (aminoácido) randômicas inseridas serão “completamente randômicas” (por exemplo, como uma consequência de síntese randomizada ou mutagênese mediada por PCR). No entanto, as sequências randômicas podem também incluir sequências que têm uma característica funcional comum (por exemplo, reatividade com um ligando do produto de expressão) ou as sequências randômicas podem ser randômicas no sentido de que o último produto de expressão é de sequência completamente randômica com, por exemplo, uma distribuição uniforme dos diferentes aminoácidos.

Com a finalidade de introduzir os fragmentos randomizados apropriadamente nos vetores, é de acordo com a invenção preferido que os nucleotídeos randômicos sejam introduzidos no vetor de expressão pelo princípio de mutagênese mediada por PCR dirigida ao sítio. No entanto, outras opções são conhecidas ao técnico no assunto, e é, por exemplo, possível inserir bibliotecas de sequência randômica sintética nos vetores também.

Para gerar mutantes ou bibliotecas pela fusão PCR, por exemplo, três reações de PCR podem ser levadas a cabo. Duas reações de PCR são realizadas para gerar fragmentos intermediários parcialmente sobrepostos. Uma terceira reação de PCR é levada a cabo para fusionar os fragmentos intermediários.

O método para a construção da biblioteca ou variantes de mutante pode incluir construir um primeiro conjunto de primers ao redor de um sítio de restrição desejado (primer de sítio de restrição), um primer de restrição direto e reverso e um segundo conjunto de primers ao redor de, por exemplo, a montante e a jusante do códon de interesse (os primers mutagênicos), um primer mutagênico direto e reverso. Em uma modalidade, os primers são construídos imediatamente a montante e a jusante respectivamente do códon de interesse. Os primers de restrição e mutagênicos são usados para construir o primeiro fragmento intermediário e o segundo fragmento intermediário. Duas reações de PCR produzem estes fragmentos intermediários lineares. Cada um destes fragmentos intermediários lineares compreende pelo menos um códon mutado de interesse, uma sequência de nucleotídeo flanqueante e um sítio de digestão. A terceira reação de PCR usa os dois fragmentos intermediários e os primers de restrição direto e reverso para produzir um produto linear fusionado. Os opostos, inclusive para as extremidades não unidas do produto linear são digeridos com uma enzima de restrição para criar extremidades coesivas no produto linear. As extremidades coesivas do produto linear são fusionadas pelo uso de uma DNA ligase para produzir um produto circular, por exemplo, uma sequência de polinucleotídeo circular.

Para construir os fragmentos intermediários, o desenho e síntese de dois conjuntos de primers direto e reverso são realizados, um primeiro conjunto contendo um sítio de digestão de enzima de restrição juntamente com a sua sequência de nucleotídeo flanqueante, e o segundo conjunto contém pelo menos um códon variante de interesse (primers mutagênicos). Os técnicos no assunto reconhecerão que o número de variantes dependerá do número de modificações de aminoácidos variantes desejado. É contemplado pelo inventor que se outras enzimas de restrição são usadas no processo, a localização exata deste sítio de digestão e a sequência correspondente dos primers direto e reverso podem ser alteradas consequentemente. Outros métodos estão disponíveis na técnica e podem ser usados no seu lugar.

À parte de ter o fragmento randomizado do produto de expressão introduzido em um esqueleto de acordo com a presente invenção, é com frequência necessário acoplar a sequência randômica a um parceiro de fusão por ter a sequência de nucleotídeo randomizada fusionada a uma sequência de nucleotídeo que codifica pelo menos um parceiro de fusão. Tal parceiro de fusão pode, por exemplo, facilitar a expressão e/ou purificação/isolamento e/ou estabilização adicional do produto de expressão.

A substituição randômica de aminoácidos de acordo com um exemplo da presente invenção de pelo menos 6 aminoácidos nas posições 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66, e/ou 68 de ubiquitina monomérica pode ser realizada particularmente facilmente por meio de PCR uma vez que as posições mencionadas estão localizadas próximas ao terminal amino ou carboxi da proteína. Consequentemente, os códons a serem manipulados são nas extremidades 5’ e 3’ da fita de cDNA correspondente. Assim, o primeiro oligodeoxinucleotídeo usado para uma reação mutagênica de PCR à parte dos códons nas posições 2, 4, 6, e/ou 8 a serem mutados - corresponde em sequência à fita codificante para o terminal amino de ubiquitina. Consequentemente, o segundo oligodeoxinucleotídeo - à parte dos códons de posições 62, 63, 64, 65, 66, e/ou 68 a serem mutados - pelo menos parcialmente corresponde à fita não codificante da sequência de polipeptídeo do terminal carboxi. Por meio de ambos os oligodeoxinucleotídeos uma reação em cadeia da polimerase pode ser realizada usando a sequência de DNA que codifica a ubiquitina monomérica como um molde. Além disso, o produto de amplificação obtido pode ser adicionado à outra reação em cadeia da polimerase usando oligodeoxinucleotídeos flanqueantes que introduzem, por exemplo, sequências de reconhecimento para endonucleases de restrição. É preferido de acordo com a invenção introduzir o cassete de gene obtido em um sistema de vetor adequado para uso no subsequente procedimento de seleção para o isolamento de variações de ubiquitina tendo propriedades de ligação a um hapteno ou antígeno pré- determinado.

Regiões a serem modificadas em ubiquitina As regiões para a modificação podem ser basicamente selecionadas como para que possam ser acessíveis para ED-B como parceiro de ligação e se a estrutura global da proteína mostrar presumivelmente tolerância a uma modificação.

Além das modificações nas fitas beta de superfície exposta também modificações em outras regiões de superfície exposta da proteína podem ser levadas a cabo, preferivelmente nas posições até 3 aminoácidos adjacentes à fita beta. Estas regiões modificadas estão envolvidas na ligação recentemente gerada com alta afinidade a ED-B.

Em outra modalidade opcional da presente invenção aminoácidos em uma ou duas, preferivelmente duas das quatro fitas beta na proteína ou posições até 3 aminoácidos adjacentes a preferivelmente duas das quatro fitas beta são modificadas para gerar uma nova propriedade de ligação. Também opcional é uma modificação em três ou quatro das quatro fitas beta ou posições até 3 aminoácidos adjacentes a três ou quatro das fitas beta para a geração de uma ligação a ED-B.

É particularmente preferido que os aminoácidos na fita amino-terminal e carboxi- terminal ou nas posições até 3 aminoácidos adjacentes à fita amino-terminal e carboxi- terminal são modificados, preferivelmente substituídos, para gerar um novo sítio de ligação a ED-B. Neste respeito, é particularmente preferido que até 4 aminoácidos adjacentes à fita carboxi-terminal de folha beta sejam modificados, preferivelmente substituídos, e até 1 aminoácido adjacente à fita amino-terminal de folha beta seja modificado, preferivelmente substituído.

Particularmente preferida é uma modificação, preferivelmente uma substituição, em pelo menos três aminoácidos de superfície exposta das seguintes posições de uma ubiquitina de mamíferos, preferivelmente ubiquitina humana: 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66, 68. Estes pelo menos quatro aminoácidos a partir do dito grupo de aminoácidos formam uma região de superfície exposta contígua na superfície de ubiquitina que foi encontrada como sendo particularmente adequada para a geração de proteínas modificadas tendo uma afinidade de ligação que não existia anteriormente com respeito ao ED-B como parceiro de ligação. Pelo menos 3 destes resíduos de aminoácido têm que ser modificados. Opcionalmente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dos ditos resíduos de aminoácido são modificados, opcionalmente em combinação com resíduos de aminoácido adicionais.

Após ter feito as modificações acima, os inventores encontraram as sequências de aminoácido de ubiquitina modificadas descritas nos exemplos que se ligam a ED-B com afinidade muito alta (valores de Kd até 10'9).

Proteínas de fusão Em outra modalidade preferida, a invenção se refere a uma proteína de fusão compreendendo uma proteína de ligação da invenção fusionada a um componente farmaceuticamente e/ou diagnosticamente ativo.

Em um aspecto ainda adicional, a invenção se refere a uma proteína de fusão compreendendo uma proteína de ligação hetero-dimérica da invenção fusionada a um componente farmaceuticamente e/ou diagnosticamente ativo. Uma proteína de fusão da invenção pode compreender componentes não polipeptídicos, por exemplo, ligantes não peptídicos, ligandos não peptídicos, por exemplo, para radionuclídeos terapeuticamente ou diagnosticamente relevantes. Pode também compreender compostos orgânicos pequenos ou não baseados em aminoácidos, por exemplo, um açúcar, oligo- ou polissacarídeo, ácido graxo, etc. Em uma modalidade preferida da invenção, a molécula de ligação a ED-B à base de ubiquitina heteromérica é covalentemente ou não covalentemente conjugada a uma proteína ou peptídeo tendo propriedades terapeuticamente ou diagnosticamente relevantes.

O seguinte fornece alguns exemplos de como obter proteínas de fusão à base de ubiquitina com capacidade de ligação a ED-B. a) conjugação da proteína via resíduos de Usina presentes em ubiquitina; b) conjugação da proteína de ligação à base de ubiquitina heterodimérica via resíduos de Cisteína - pode estar localizada C-terminal, ou em qualquer outra posição (por exemplo, resíduo de aminoácido 24 ou 57); conjugação com componentes selecionáveis de maleimida; c) conjugações peptídicas ou proteinogênicas - fusões genéticas (preferido C- ou N- terminal); d) fusões à base de “Etiqueta” - Uma proteína ou um peptídeo localizado no terminal C ou N da ED-B de proteína alvo. “Etiquetas” de fusão, por exemplo, poli-histidina (particularmente relevante para radio marcação).

Estes e outros métodos para unir covalentemente e não covalentemente uma proteína de interesse a um suporte são bem conhecidos na técnica, e assim não são descritos em mais detalhe aqui.

Opcionalmente, o dito componente ativo é uma citocina, preferivelmente uma citocina selecionada a partir do grupo consistindo em fatores de necrose tumoral (por exemplo, TNF alfa, TNF beta), interleucinas (por exemplo, IL-2, IL- 12, IL-10, IL- 15, IL.-24, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-8, IL-1 alfa, IL- 1 beta), interferons (por exemplo, IFN alfa, IFN beta, IFN gama), GM-CSF, GRO (GRO alfa, GRO beta, GRO gama,), MIP (MIP-1-alfa, MIP-1 beta, MIP-3 alfa, MIP-3 beta), TGF- beta LIF1 CD80, ligando CD-40, B70, LT-beta, ligando Fas, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-1 alfa/beta, BUNZO/STRC33,1-TAC, BLC/BCA-1, MDC, TECK, TARO, RANTES, HCC-1, HCC-4, DC- CK1, MCP-1-5, Eotaxina, Eotaxina-2,1-309, MPIF-1, 6Ckine, CTACK, MEC, Linfotactina, Fractalquina, e outros.

Uma das mais preferidas citocinas para uso na presente invenção é TNF alfa. A citocina inflamatória TNF tem múltiplas atividades no corpo de mamíferos incluindo um efeito antitumoral que é atualmente clinicamente irrelevante devido à inaceitável toxicidade de doses eficazes em seres humanos. Atualmente, TNF é terapeuticamente usado em combinação com substâncias citostáticas como Melfalano.

Opcionalmente ainda, o dito componente ativo que pode ser conjugado à proteína de ligação à base de ubiquitina hetero-multimérica é um composto tóxico, preferivelmente um pequeno composto orgânico ou um polipeptídeo, opcionalmente um composto tóxico, por exemplo, selecionado a partir do grupo consistindo em saporina, exotoxina A de Pseudomonastruncada, gelonina recombinante, Ricina-cadeia A, caliqueamicina, neocarzinostatina, esperamicina, dinemicina, kedarcidina, maduropeptina, doxorubicina, daunorubicina, auristatina, toxina do cólera, modecina, toxina da difteria.

Em uma modalidade adicional da invenção a proteína de ligação à base de ubiquitina hetero-multimérica de acordo com a invenção pode conter aminoácidos artificiais.

Em modalidades adicionais da proteína de fusão da presente invenção o dito componente ativo é um corante fluorescente, preferivelmente um componente selecionado a partir dos grupos de um radionuclídeo do grupo de isótopos de emissão gama, preferivelmente 99To, 123h 111m, ou do grupo de emissores positrônicos, preferivelmente 1 8F, 64CU, 68Ga> 86y, 124(, ou do grupo de emissor beta, preferivelmente 131b 90 Y, 177Lu, 67Cu, ou do grupo de emissor alfa, preferivelmente 213BÍ, 211 At! corantes Alexa Fluor ou Cy (Berlier et al., J Histochem Cytochem. 51 (12): 1699-1712, 2003); um fotossensibilizador; um fator pró-coagulante, preferivelmente fator tecidual (por exemplo, fator tecidual truncado tTF); uma enzima para a ativação pró-fármaco, preferivelmente uma enzima selecionada a partir do grupo consistindo em carboxi-peptidases, glucuronidases e glucosidases; e/ou um domínio Fc funcional, preferivelmente um domínio Fc funcional humano.

Uma modalidade adicional se refere a proteínas de fusão de acordo com a invenção, compreendendo ainda um componente de modulação da meia-vida no soro, preferivelmente um componente selecionado a partir do grupo consistindo em polietileno glicol, peptídeos de ligação a albumina, e imunoglobulina.

Especificidades de ligação (Constantes de dissociação) As especificidades de ligação das proteínas de fusão de acordo com a invenção são como foi definido acima para a proteína de não fusão dadas em Kd. De acordo com a invenção, o termo “Kd” define a afinidade de ligação específica que é de acordo com a invenção no intervalo de 10'7 - 10'12 M. Um valor de 10'5 M e inferior pode ser considerado como uma afinidade de ligação quantificável. Dependendo da aplicação um valor de 10‘7 M a 10'11 Mé preferido para, por exemplo, aplicações cromatográficas ou 10'9 a 10'12 M para, por exemplo, aplicações de diagnóstico ou terapêuticas. Afinidades de ligação preferidas adicionais são no intervalo de 10'7a 1O'10 M, preferivelmente a 10'11 M.

Os métodos para determinar as afinidades de ligação são conhecidos por si mesmos e podem ser selecionados, por exemplo, a partir dos seguintes métodos: ELISA, tecnologia de Ressonância de Plásmon de Superfície (SPR) (oferecida, por exemplo, por Biacore®), espectroscopia de fluorescência, calorimetria de titulação isotérmica (ITC), ultracentrifugação analítica, FACS.

Após ter feito as modificações acima, os inventores encontraram as sequências de aminoácido de ubiquitina modificadas descritas nos exemplos que se ligam aos seus alvos com afinidade muito alta (valores de Kd até W10 M).

Dimerização de ubiquitina

Um “dímero” é considerado como uma proteína nesta invenção que compreende duas proteínas ubiquitinas monoméricas. Se o dímero compreender dois monômeros diferentemente modificados, é chamado um “dímero heteromérico” ou “hetero-dímero”. Assim, o “hetero-dímero” da invenção é considerado como uma fusão de duas proteínas ubiquitinas monoméricas diferentemente modificadas exibindo uma propriedade de ligação monovalente combinada para o parceiro de ligação específico ED-B. É enfatizado que a proteína ubiquitina de ligação a ED-B hetero-dimérica modificada da invenção não é obtida pela triagem de maneira separada de cada proteína monomérica ubiquitina e combinação de duas das mesmas depois disso, mas pela triagem de proteínas hetero-diméricas consistindo em uma primeira e uma segunda unidade monomérica que exibem juntas uma atividade de ligação monovalente do ligando de ED-B. É para ser esperado que cada uma das ditas subunidades exibem uma afinidade de ligação bem limitada para ED-B enquanto somente a proteína ubiquitina modificada dimérica combinada terá as excelentes propriedades de ligação descritas no presente documento (ver, por exemplo, Figura 4).

De acordo com a invenção dois monômeros de ubiquitina diferentemente modificados geneticamente ligados pela fusão cabeça-cauda se ligam ao mesmo epítopo de ED-B e são somente eficazes se ambas as regiões de domínio de ligação agirem juntas. As BDR dos monômeros formam uma única região de ligação contígua. Assim, a proteína ubiquitina modificada de acordo com a invenção para se ligar eficientemente a ED- B de fibronectina é dimerizada. Os monômeros podem ser conectados diretamente ou via ligantes, como foi discutido acima. Muitos ligantes concebíveis podem ser usados.

Cada ubiquitina monomérica mostra modificações em pelo menos seis de aminoácidos 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66, 68. As proteínas monoméricas são geneticamente fusionadas uma à outra. A ligação ao alvo é mediada pelas ditas BDR em colaboração, isto é, as BDR cooperam e formam uma única e comum região de ligação capaz de se ligar ao dito domínio ED-B de fibronectina de uma maneira monovalente.

Hetero-dímeros de ubiquitina modificados se ligam a ED-B O hetero-dímero de ubiquitina de acordo com a invenção que se liga a ED-B com Kd = 107 — 10’12 M e que exibem uma atividade de ligação monovalente com respeito ao dito extra-domínio B (ED-B) de fibronectina é selecionado a partir das seguintes duas alternativas: (1) nas primeiras substituições de unidades monoméricas pelo menos nas posições de aminoácidos 6, 8, 63, 64, 65, e 66; e nas segundas substituições de unidades monoméricas pelo menos nas posições de aminoácidos 6, 8, 62, 63, 64, 65, e 66; opcionalmente adicionalmente 2, e (2) nas primeiras substituições de unidades monoméricas pelo menos nas posições de aminoácidos 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65, e 66; e nas segundas substituições de unidades monoméricas pelo menos nas posições de aminoácidos 6, 8, 62, 63, 64, 65, e 66; opcionalmente adicionalmente 2.

Em uma modalidade, a proteína de fusão é um hetero-dímero geneticamente fusionado da dita monômero de ubiquitina tendo substituições de aminoácidos nas posições 6, 8, 63-66 do primeiro monômero de ubiquitina e substituições em resíduos de aminoácido nas posições 6, 8, 62-66, e opcionalmente na posição 2 do segundo monômero de ubiquitina, preferivelmente - nas primeiras substituições de monômero de ubiquitina Lisina (K) a Triptofano (W) ou Fenilalanina (F) na posição 6, Leucina (L) a Triptofano ou Fenilalanina (W, F) na posição 8, Lisina (K) a Arginina (R) ou Histidina (H) na posição 63,

Ácido glutâmico (E) a Lisina (K), Arginina (R) ou Histidina (H) na posição 64, Serina (S) a Fenilalanina (F) ou Triptofano (W) na posição 65 e Treonina (T) a Prolina (P) na posição 66; - no segundo monômero de ubiquitina, as substituições Lisina (K) a Treonina (T), Asparagina (N), Serina (S) ou Glutamina (Q) na posição 6, Leucina (L) a Glutamina (Q) ou Treonina (T) ou Asparagina (N) ou Serina (S) na posição 8, Glutamina (Q) a Triptofano (W) ou Fenilalanina (F) na posição 62, Lisina (K) a Serina (S), Treonina (T), Asparagina (N) ou Glutamina (Q) na posição 63,

Ácido glutâmico (E) a Asparagina (N), Serina (S), Treonina (T), ou Glutamina (Q) na posição 64, Serina (S) a Fenilalanina (F) ou Triptofano (W) na posição 65, e Treonina (T) a Ácido glutâmico (E) ou Ácido aspártico (D) na posição 66, e

Opcionalmente Glutamina (Q) a Arginina (R), Histidina (H) ou Lisina (K) na posição 2 são preferidas.

Estas substituições alternativas em cada monômero podem ser combinadas uma com a outra sem quaisquer limitações com a condição de que os hetero-dímeros de ubiquitina modificados resultantes mostram uma afinidade de ligação específica ao dito extra-domínio B (ED-B) de fibronectina de Kd = 10'7 - 10'12 M e exibem uma atividade de ligação monovalente com respeito ao dito extra-domínio B (ED-B) de fibronectina e com a condição de que a estabilidade estrutural da proteína ubiquitina não é destruída ou obstaculizada.

As mais preferidas são as seguintes substituições: (1) na primeira unidade monomérica pelo menos- K6W, L8W, K63R, E64K, S65F, e T66P; e na segunda unidade monomérica pelo menos- K6T, L8Q, Q62W, K63S, E64N, S65W, e T66E; opcionalmente adicionalmente Q2R, ou (2) na primeira unidade monomérica pelo menos Q2T, F4W, K6H, Q62N, K63F, E64K, S65L, e T66S.; e na segunda unidade monomérica pelo menos- K6X, L8x, Q62X, K63X, E64X, S65X, e T66X; opcionalmente adicionalmente Q2X, em que X pode ser qualquer aminoácido (ver Fig. 2). Particularmente preferidas são as seguintes substituições no primeiro monômero de ubiquitina para gerar proteínas de ligação para ED-B 2: Q T, 4: F W, 6: K -> H, 62: Q —> N, 63: K —> F, 64: E -> K, 65: S L, 66: T —► S Nenhum ligante ou qualquer ligante pode ser usado para conectar os dois monômeros cabeça-cauda. Ligantes preferidos são aqueles da SEQ ID NO: 32 ou a sequência GIG ou SGGGGIG ou SGGGGSGGGGIG.

Em uma modalidade preferida, um hetero-dímero de ubiquitina com duas regiões de determinação de ligação (BDR) que agem juntas para ligar ED-B compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33 ou 34. Uma proteína preferida adicional é proporcionada pela seguinte sequência em que XXXX pode ser qualquer aminoácido (SEQ ID NO: 47). Como ligante, SGGGGSGGGGIG foi usado aqui: É para ser entendido que também outro tipo de ligantes ou nenhum ligante são alternativas factíveis. FKL S LHLVLRLRGGSGGGGSGGGGIG |f|iÍgxixiÍ||lÍ|Íi|Í|l|ÍÍlÍ|lÍÍlg|lÍÍÍl|Íl||ÍÍ|iÍÍÍ||ÍBÍ||lÍi|x XXXXLHLVLRLRGG

As sequências consenso de exemplos de proteínas com estas sequências são mostradas na Figura 2.

Uma proteína de fusão preferida da invenção compreendendo TNF-alfa como um componente farmaceuticamente ativo tem a sequência da SEQ ID NO: 35 ou 36.

Em um aspecto adicional da invenção, a presente invenção cobre também polinucleotídeos que codificam uma proteína ou proteína de fusão como foi descrito anteriormente. Adicionalmente, vetores compreendendo o dito polinucleotídeo são cobertos pela invenção.

Em um aspecto adicional da presente invenção, as células hospedeiras são cobertas as quais compreendem uma proteína ou uma proteína de fusão descrita no presente documento e/ou um polinucleotídeo que codifica a dita proteína recombinante ou proteína de fusão da invenção ou um vector contendo o dito polinucleotídeo.

Usos das proteínas da invenção, por exemplo, proteínas de ligação à base de ubiquitina hetero-dimérica especificamente para ED-B fusionada a um efetor tal como TNF alfa

As proteínas de ligação a ED-B de ubiquitina modificada da invenção são para serem usadas, por exemplo, para preparar meios de diagnóstico para uso in vitro ou in vivo bem como meios terapêuticos. As proteínas de acordo com a invenção podem ser usadas, por exemplo, como moléculas efetoras diretas (moduladoras, antagonistas, agonistas) ou domínios de reconhecimento a antígeno. Exemplos de tumores com aparência abundante de antígeno de ED-B são mostrados na tabela da Figura 1.

Dependendo do parceiro de fusão selecionado a composição farmacêutica da invenção é adaptada para ser direcionada ao tratamento de câncer, por exemplo, cânceres de mama e colorretal, ou quaisquer outras doenças tumorais em que ED-B é abundante (cf. exemplos do mesmo listados na Figura 1).

As composições são adaptadas para conter uma dose terapeuticamente eficaz. A quantidade da dose a ser administrada depende do organismo a ser tratado, o tipo de doença, a idade e peso do paciente e fatores adicionais conhecidos por si mesmos.

As composições contêm um transportador farmaceuticamente ou diagnosticamente aceitável e opcionalmente podem conter agentes auxiliares e excipientes adicionais conhecidos por si mesmos. Estes incluem, por exemplo, mas não estão limitados a agentes estabilizantes, agentes surfactantes, sais, tampões, agentes corantes etc.

A composição farmacêutica pode ser na forma de uma preparação líquida, um creme, uma loção para aplicação tópica, um aerossol, na forma de pós, grânulos, comprimidos, supositórios, ou cápsulas, na forma de uma emulsão ou uma preparação lipossomal. As composições são preferivelmente estéreis, não pirogênicas e isotônicas e contêm os aditivos farmaceuticamente convencionais e aceitáveis conhecidos por si mesmos. Adicionalmente, é feita referência às regulações da U.S. Pharmacopoeia ou Remington's Pharmaceutical Sciences, Mac Publishing Company (1990).

No campo de terapia e profilaxia médica veterinária e humana medicamentos farmaceuticamente eficazes contendo pelo menos uma proteína ubiquitina de ligação a ED- B heteromérica modificada de acordo com a invenção pode ser preparada pelos métodos conhecidos por si mesmos. Dependendo da preparação galênica estes composições podem ser administrados parentericamente pela injeção ou infusão, sistematicamente, retalmente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutaneamente, transdermicamente ou por outros métodos de aplicação convencionalmente empregados. O tipo de preparação farmacêutica depende do tipo de doença a ser tratada, a gravidade da doença, o paciente a ser tratado e outros fatores conhecidos aos técnicos no assunto de medicina.

Em uma modalidade, a composição farmacêutica contém uma proteína ou uma proteína de fusão da invenção ou uma combinação das mesmas e compreende ainda um ou mais agentes quimioterápicos, preferivelmente selecionados a partir da seguinte tabela:

Em uma modalidade preferida, o agente quimioterápico é selecionada a partir de melfalano, doxorubicina, ciclofosfamida, dactinomicina, fluorodesoxiuracila, cisplatina, paclitaxel, e gencitabina; ou a partir do grupo de inibidores de quinase.

Uma “composição farmacêutica” de acordo com a invenção pode estar presente na forma de uma composição, em que os diferentes ingredientes ativos e diluentes e/ou transportadores estão em mistura uns com os outros, ou podem tomar a forma de uma preparação combinada, onde os ingredientes ativos estão presentes em forma parcialmente ou totalmente distinta. Um exemplo para tal combinação ou preparação combinada é um kit- de-partes.

Uma “composição” de acordo com a presente invenção compreende pelo menos dois compostos farmacologicamente ativos. Estes compostos podem ser administrados simultaneamente ou separadamente com um espaço de tempo de um minuto a diversos dias. Os compostos podem ser administrados por meio da mesma via ou de maneira diferente; por exemplo, administração oral de um composto ativo e administração parentérica de outro são possíveis. Também, os compostos ativos podem ser formulados em um medicamento, por exemplo, em uma solução de infusão ou como um kit compreendendo ambos os compostos formulados separadamente. Também, é possível que ambos os compostos estejam presentes em dois ou mais pacotes.

Um combinação particularmente preferida é uma proteína de fusão de acordo com a invenção e melfalano, e/ou doxorubicina (lipossomal). À parte de agentes antineoplásicos da classe ATC L01, a proteína de fusão-TNF da invenção pode ser combinada com outras substâncias antineoplásicas incluindo citocinas e derivados das mesmas, radiofarmacêuticos, terapia à base de células e nanopartículas.

Devido à sua atividade de permeabilização tumoral, a proteína de fusão-TNF da invenção (mas também as outras proteínas recombinantes/proteínas de fusão da presente invenção) pode ser combinada com todos os agentes antineoplásicos como listados sob L01 no Sistema de Classificação Químico Terapêutico Anatômico [Anatomical Therapeutic Chemical] (ATC) proporcionado pela Organização Mundial da Saúde.

Foi surpreendente revelado que uma proteína de fusão de um hetero-dímero de ubiquitina fusionada ao TNF-alfa, em que a proteína de fusão preferivelmente tem a sequência da SEQ ID NO: 35 ou 36, pode ser vantajosamente aplicada em terapia. TNF-alfa é altamente tóxico e, assim, pode somente ser administrado em baixas dosagens, que usualmente estão situadas abaixo do limite terapêutico mínimo (e assim são terapeuticamente inativos). Devido a esta toxicidade de TNF-alfa, com a finalidade de alcançar uma concentração terapeuticamente eficaz, a abordagem de perfusão isolada de membro atualmente é selecionada ao usar TNF-alfa. A perfusão de membro é um técnica médica que pode ser usada para administrar fármacos anticâncer diretamente a um braço ou perna. O fluxo de sangue ao e desde o membro é temporariamente interrompido com um torniquete, e fármacos anticâncer são colocados diretamente no sangue do membro. Isto permite que o paciente receba uma alta dose de TNF-alfa na área onde ocorreu o câncer.

No entanto, pela aplicação das proteínas de fusão TNF-alfa da presente invenção, é possível administrar TNF-alfa em uma concentração não tóxica, mas ainda terapeuticamente eficaz. Uma vez que TNF-alfa tenha sido acoplado à proteína de fusão (ligação) da presente invenção, pode ser diretamente ativo no sítio da doença (por exemplo, sítio do tumor) e, assim, a quantidade de TNF-alfa “livre” pode ser drasticamente reduzida.

Os efeitos colaterais sistêmicos de TNF-alfa podem ser notavelmente reduzidos pela administração de TNF- alfa como uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção. Usando uma proteína de fusão TNF-alfa da invenção, a dosagem global de TNF- alfa para alcançar um efeito terapêutico assim pode ser reduzido em grande medida e pode ser vantajosamente usada para o tratamento tumoral sistêmico (sem a necessidade e restrições de perfusão de membro) em particular em combinação com agentes quimioterápicos (ver acima).

Em uma modalidade adicional, a composição farmacêutica é na forma de um kit de partes, proporcionando entidades separadas para a proteína ubiquitina recombinante/proteína de fusão da invenção e para o um ou mais agentes quimioterápicos. Método de produção das proteínas de ligação a ED-B hetero-diméricas da invenção

As proteínas de ligação a ED-B de acordo com a invenção podem ser preparadas por qualquer das muitas técnicas convencionais e bem conhecidas tais como estratégias de síntese orgânica plana, técnicas de síntese assistida por fase sólida ou por sintetizadores automatizados comercialmente disponíveis. Por outro lado, podem também ser preparados por técnicas recombinantes convencionais em separado ou em combinação com técnicas de síntese convencionais.

Em outro aspecto da presente invenção, um método para gerar uma proteína ubiquitina recombinante modificada é proporcionada. O método compreende pelo menos as seguintes etapas: a) proporcionar uma população de proteínas ubiquitinas diméricas diferentemente modificadas que se originam de proteínas ubiquitinas monoméricas, a dita população compreendendo proteínas ubiquitinas diméricas compreendendo dois monômeros de ubiquitina modificados ligados um ao outro em uma disposição cabeça- cauda em que cada monômero da dita proteína dimérica é diferentemente modificado pelas substituições de pelo menos 6 aminoácidos nas posições 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 e 68 da SEQ ID NO: 1 em que as ditas substituições compreendem (1) nas primeiras substituições de unidades monoméricas pelo menos nas posições de aminoácidos 6, 8, 63, 64, 65, e 66; e nas segundas substituições de unidades monoméricas pelo menos nas posições de aminoácidos 6, 8, 62, 63, 64, 65, e 66; opcionalmente adicionalmente 2; ou (2) nas primeiras substituições de unidades monoméricas pelo menos nas posições de aminoácidos 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65, e 66; e nas segundas substituições de unidades monoméricas pelo menos nas posições de aminoácidos 6, 8, 62, 63, 64, 65, e 66; opcionalmente adicionalmente 2 b) proporcionar o extra-domínio B (ED-B) de fibronectina como ligando potencial; c) contatar a dita população de proteínas diferentemente modificadas com o dito extra-domínio B (ED-B) de fibronectina; d) identificar uma proteína ubiquitina dimérica modificada por um processo de triagem, em que a dita proteína ubiquitina dimérica modificada se liga ao dito extra-domínio B (ED- B) de fibronectina com uma afinidade de ligação específica de Kd em uma faixa de 10’7 - 10’12 M e exibe uma atividade de ligação monovalente com respeito ao dito extra- domínio B (ED-B) de fibronectina, e opcionalmente e) isolar a dita proteína ubiquitina dimérica modificada com a dita afinidade de ligação.

Opcionalmente, a modificação pode ser realizada por engenharia genética ao nível do DNA e expressão da proteína modificada em organismos procarióticos ou eucarióticos ou in vitro.

Em uma modalidade adicional, a dita etapa de modificação inclui uma etapa de síntese química.

Em um aspecto da invenção, a dita população de proteínas diferentemente modificadas é obtida fusionando geneticamente duas bibliotecas de DNA que codificam cada uma proteínas ubiquitinas monoméricas diferentemente modificadas.

Em um aspecto ainda adicional, o dito método é adaptado com a finalidade de que a dita proteína ubiquitina hetero-dimérica modificada seja fusionada com um componente farmaceuticamente ativo, opcionalmente uma citocina, preferivelmente TNF-alfa, ou um componente de diagnóstico, ou em que a dita proteína recombinante ubiquitina hetero- dimérica modificada é formada via o dito componente farmaceuticamente ativo que é opcionalmente TNF-alfa, ou via o dito componente de diagnóstico.

De acordo com a invenção, uma proteína modificada pode ser preparada ainda por meio de síntese química. Nesta modalidade as etapas c) a d) de acordo com a reivindicação 1 são então realizadas em uma etapa.

Em um aspecto adicional, a presente invenção é direcionada a uma biblioteca contendo DNA que codifica proteínas ubiquitinas monoméricas modificadas como foi definido acima que formam a base para proporcionar as proteínas ubiquitinas hetero- diméricas da invenção.

Em um aspecto ainda adicional da invenção, uma biblioteca de fusão contendo DNA obtida fusionando duas bibliotecas como foi especificado acima é proporcionada cada biblioteca codificando unidades de proteína ubiquitina monomérica diferentemente modificada com a finalidade de obter proteínas de fusão ubiquitinas hetero-diméricas, as unidades monoméricas das mesmas sendo ligadas umas às outras em uma disposição cabeça-cauda, a dita biblioteca codificando proteínas de fusão hetero-diméricas de

ubiquitina exibindo uma atividade de ligação monovalente com respeito ao dito extra- domínio B (ED-B) de fibronectina. A dita ligação conjunta é realizada usando qualquer um dos ligantes conhecidos pelo técnico no assunto ou um ligante descrito no presente documento. Em uma modalidade da invenção TNF-alfa é usado como ligante que age simultaneamente como composto farmaceuticamente ativo.

O Exemplo 1 esboça a produção de uma biblioteca complexa. No entanto, precisa ser tomado cuidado com relação à qualidade de tal biblioteca. Qualidade de uma biblioteca em tecnologia de esqueleto é em primeiro lugar dependente da sua complexidade (número de variantes individuais) bem como funcionalidade (integridade estrutural e química e de proteína dos candidatos resultantes). Ambas as características, no entanto, podem exercer influências negativas uma sobre a outra: incrementar a complexidade de uma biblioteca pelo aumento do número de posições modificadas no esqueleto poderia levar a uma deterioração da características químicas e de proteína das variantes. Isto poderia ter como resultado uma solubilidade diminuída, agregação e/ou baixos rendimentos. Uma razão para isso é o maior desvio dos esqueletos nativos tendo um pacote de proteína energeticamente favorável.

Portanto, é um ato de equilíbrio construir tal biblioteca de esqueleto adequadamente entre as posições extremas de introdução de tantas variações quanto possível na sequência original com a finalidade de otimizar a mesma para um alvo e, por outro lado, de conservação da sequência primária original tanto quanto possível com a finalidade de evitar efeitos químicos e de proteína negativos.

É notado que a presente descrição abrange também cada combinação concebível das características descritas no presente documento em vista dos aspectos ou modalidades da invenção.

Seleção das proteínas ubiquitinas modificadas com afinidade de ligação com respeito ao ED-B alvo e determinação dos aminoácidos modificados responsáveis pela afinidade de ligação

Após, por exemplo, pelo menos duas bibliotecas de DNA diferentes que codificam proteínas ubiquitinas modificadas hetero-diméricas foram estabelecidas pela modificação de maneira diferente de aminoácidos selecionados em cada uma das unidades de ubiquitina monoméricas, estas bibliotecas são geneticamente fusionadas por meio de, por exemplo, tecnologia de ligante para obter moléculas de DNA que codificam proteínas ubiquitinas modificadas hetero-diméricas. O DNA destas bibliotecas é expresso em proteínas e as proteínas diméricas modificadas obtidas deste modo são contatadas de acordo com a invenção com o ED-B para opcionalmente possibilitar a ligação dos parceiros um ao outro se realmente existir uma afinidade de ligação.

É um aspecto crucial da invenção que o processo de contato e de triagem seja realizado já com respeito à proteína ubiquitina hetero-dimérica. Este processo possibilita a triagem naquelas proteínas ubiquitinas que proporcionam uma atividade de ligação monovalente a ED-B.

O contato de acordo com a invenção é preferivelmente realizado por meio de um adequado método de apresentação e seleção tal como os métodos de apresentação em fago, apresentação ribossômica, apresentação em mRNA ou apresentação em superfície celular, apresentação em superfície de leveduras ou apresentação em superfície bacteriana, preferivelmente por meio do método de apresentação em fago. Para a descrição completa, é feita referência também as seguintes referências: Hoess, Curr. Opin. Struct. Biol.. 3 (1993), 572-579; Wells e Lowmann, Curr. Opin. Struct. Biol. 2 (1992), 597-604; Kay et al.,Phage Display of Peptides and Proteins-A Laboratory Manual (1996), Academic Press. Os métodos mencionados acima são conhecidos aos técnicos no assunto e podem ser usados de acordo com a invenção incluindo modificações dos mesmos.

A determinação se a proteína modificada tem uma afinidade de ligação quantificável com respeito a um parceiro de ligação pré-determinado pode ser realizada de acordo com a invenção preferivelmente por um ou mais a partir dos seguintes métodos: ELISA, espectroscopia de ressonância de plásmon de superfície, espectroscopia de fluorescência, FACS, calorimetria de titulação isotérmica e ultracentrifugação analítica.

Método de seleção por apresentação em fago

Um tipo de procedimento de apresentação em fago adaptado para esta aplicação é descrito no seguinte como um exemplo para um procedimento de seleção de acordo com a invenção com respeito a variações de ubiquitina que mostram propriedades de ligação, da mesma maneira, por exemplo, métodos para a apresentação em bactérias (apresentação em superfície bacteriana; Daugherty et al., 1998, Protein Eng. ll(9):825-832) ou células de levedura (apresentação em superfície de leveduras; Kieke et al., 1997 Protein Eng. 10(11): 1303-10) ou sistemas de seleção livres de células tais como a apresentação em ribossoma (Hanes e Pluckthun, 1997 Proc Natl Acad Sci USA. 94(10):4937-4942; He e Taussig, 1997_Nucleic Acids Res. 25(24):5132-5134) ou a apresentação cis (Odegrip et al., 2004 Proc Natl Acad Sci USA. 101 (9):2806-2810) ou a apresentação em mRNA pode ser aplicada. No ultimo caso uma ligação física transiente de genótipo e fenótipo é alcançada pelo acoplamento da variação de proteína ao mRNA apropriado via o ribossoma.

No procedimento de apresentação em fago descrito no presente documento variações recombinantes de ubiquitina são apresentadas em um fago filamentoso enquanto o DNA codificante da variação apresentada está presente ao mesmo tempo empacotada em uma forma de fita simples no envelope do fago. Assim, no âmbito de um enriquecimento de afinidade variações tendo certas propriedades podem ser selecionadas a partir de uma biblioteca e a sua informação genética pode ser amplificada pela infecção de bactérias adequadas ou adicionadas a outro ciclo de enriquecimento, respectivamente. A apresentação da ubiquitina mutada na superfície do fago é alcançada pela fusão genética a uma sequência sinal amino-terminal-preferivelmente a sequência sinal PeIB-e um capsídeo ou proteína de superfície do fago-preferido é a fusão carboxiterminal à proteína de capsídeo plll ou um fragmento da mesma. Além disso, a proteína de fusão codificada pode conter elementos funcionais adicionais tais como, por exemplo, uma etiqueta de afinidade ou um epítopo de anticorpo para a detecção e/ou purificação por cromatografia de afinidade ou uma sequência de reconhecimento de protease para a clivagem específica da proteína de fusão no curso do enriquecimento de afinidade. Além disso, um códon de terminação âmbar pode estar presente, por exemplo, entre o gene para a variação de ubiquitina e a região codificante da proteína de capsídeo do fago ou o fragmento da mesma que não é reconhecido durante a tradução em uma cepa supressora adequada parcialmente devido à introdução de um aminoácido.

O vetor bacteriano adequado para o procedimento de seleção no contexto do isolamento de variações de ubiquitina com propriedades de ligação a ED-B e em que o cassete de gene para a proteína de fusão descrita é inserido é denominado como phagemid. Entre outros, contém a região intergênica de um fago filamentoso (por exemplo, M13 ou f1) ou uma porção da mesma que no caso de uma superinfecção da célula bacteriana que possui o phagemid por meio de fagos ajudantes tais como, por exemplo, M13K07 tem como resultado o empacotamento de uma fita fechada de DNA de phagemid em um capsídeo de fago. Os phagemids gerados dessa maneira são secretados pela bactéria e apresentam a respectiva variação de ubiquitina codificada-devido à sua fusão à proteína de capsídeo plll ou o fragmento da mesma-na sua superfície. Proteínas de capsídeo plll nativas estão presentes no phagemid de modo que a sua habilidade para re-infectar cepas bacterianas adequadas e portanto a possiblidade de amplificar o DNA correspondente é retida. Assim, a ligação física entre o fenótipo da variação de ubiquitina - isto é, a sua potencial propriedade de ligação - e o seu genótipo é assegurado.

Os phagemids obtidos podem ser selecionados com respeito à ligação da variação de ubiquitina apresentada na mesma a ED-B por meio de métodos conhecidos aos técnicos no assunto. Para este propósito, as variações de ubiquitina apresentadas podem ser transientemente imobilizadas à substância alvo ligada, por exemplo, em placas de microtitulação e podem ser especificamente eluídas após variações de não ligação terem sido separadas. A eluição é preferivelmente realizada por soluções básicas tais como, por exemplo, 100 mM de trietilamina. Alternativamente, a eluição pode ser realizada sob condições ácidas, por proteólise ou adição direta de bactérias infectadas. Os phagemids obtidos dessa maneira podem ser re-amplificados e enriquecidos por ciclos sucessivos de seleção e amplificação de variações de ubiquitina com propriedades de ligação a ED-B.

Caracterização adicional das variações de ubiquitina obtidas neste sentido pode ser realizada na forma do fagomid, isto é, fusionada ao fago, ou após clonagem do correspondente cassete de gene em um vetor de expressão adequado na forma de uma proteína solúvel. Os métodos apropriados são conhecidos aos técnicos no assunto ou descritos na literatura. A caracterização pode compreender, por exemplo, a determinação da sequência de DNA e assim da sequência primária das variações isoladas. Além disso, a afinidade e especificidade das variações isoladas podem ser detectadas, por exemplo, por meio de métodos bioquímicos padrão tais como ELISA ou espectroscopia de ressonância de plásmon de superfície, espectroscopia de fluorescência, FACS, calorimetria de titulação isotérmica, ultracentrifugação analítica ou outros. Em vista da análise de estabilidade, por exemplo, métodos espectroscópicos relativos a desdobragem química ou física são conhecidos aos técnicos no assunto.

Método de seleção de apresentação ribossômica

Em uma modalidade adicional de procedimento de apresentação ribossômica da invenção variações de ubiquitina são preparadas por meio de um sistema de tradução/transcrição livre de células e apresentada como um complexo com o mRNA correspondente bem como o ribossoma. Para este propósito, uma biblioteca de DNA como foi descrito acima é usada como uma base na qual os genes de variações estão presentes na forma de fusões com as sequências regulatórias correspondentes para a expressão e biossíntese de proteínas. Devido à deleção do códon de terminação na extremidade 3’ da biblioteca de gene bem como condições experimentais adequadas (baixa temperatura, alta concentração de Mg2+) o complexo ternário consistindo na proteína nascente, o mRNA e o ribossoma é mantido durante transcrição/tradução in vitro.

Após uma biblioteca de proteína contendo proteínas ubiquitinas modificadas hetero- diméricas ter sido estabelecida pela modificação de maneira diferente de aminoácidos selecionados em cada uma das unidades de ubiquitina monoméricas, as proteínas diméricas modificadas são contatadas de acordo com a invenção com o ED-B para possibilitar a ligação dos parceiros um ao outro se realmente existir uma afinidade de ligação. Estas bibliotecas de proteínas podem ser na forma de uma biblioteca de método de apresentação apresentando ou usando qualquer outro método que apresente as proteínas modificadas de uma maneira que possibilite o contato entre as proteínas modificadas e o ED-B proteína alvo, em que o dito método de apresentação é opcionalmente um método de apresentação em fago, apresentação ribossômica, apresentação em fago TAT, apresentação em leveduras, apresentação bacteriana ou apresentação em mRNA.

A seleção das variações de ubiquitina modificada com respeito às suas atividades de ligação a ED-B com uma afinidade de ligação específica de Kd em uma faixa de 10'7 - 10'12 M pode ser realizada por meio de métodos conhecidos aos técnicos no assunto. Para este propósito, as variações de ubiquitina apresentadas, por exemplo, nos complexos ribossomais podem ser transientemente imobilizadas à substância alvo ligada, por exemplo, em placas de microtitulação ou podem ser ligadas a partículas magnéticas após a ligação em solução, respectivamente. Em seguida à separação de variações de não ligação a informação genética de variações com atividade de ligação pode ser especificamente eluída na forma do mRNA pela destruição do complexo ribossomal. A eluição é preferivelmente levada a cabo com 50 mM de EDTA. O mRNA obtido dessa maneira pode ser isolado e transcrito reversamente em DNA usando métodos adequados (reação de transcriptase reversa), e o DNA obtido dessa maneira pode ser re-amplificado.

Por meio de ciclos sucessivos de transcrição/tradução in vitro, seleção, e amplificação variações de ubiquitina com propriedades de ligação para um hapteno ou antígeno pré-determinado podem ser enriquecidas.

Caracterização das proteínas de ligação a EDB

A caracterização adicional das variações de ubiquitina obtidas dessa maneira pode ser realizada na forma de uma proteína solúvel como foi detalhado acima após clonagem do correspondente cassete de gene em um vetor de expressão adequado. Os métodos apropriados são conhecidos aos técnicos no assunto ou descritos na literatura.

Preferivelmente, a etapa de detecção das proteínas tendo uma afinidade de ligação com respeito a um parceiro de ligação pré-determinado é seguida por uma etapa de isolamento e/ou enriquecimento da proteína detectada.

Em seguida à expressão da proteína ubiquitina modificada de acordo com a invenção, pode ser purificada adicionalmente e enriquecida pelos métodos conhecidos por si mesmos. Os métodos selecionados dependem de diversos fatores conhecidos por si mesmos aos técnicos no assunto, por exemplo, o vetor de expressão usado, o organismo hospedeiro, o campo pretendido de uso, o tamanho da proteína e outros fatores. Para a purificação simplificada a proteína modificada de acordo com a invenção pode ser fusionada a outras sequências de peptídeo tendo uma afinidade aumentada para materiais de separação. Preferivelmente, tais fusões que são selecionadas são as que não têm um efeito prejudicial sobre a funcionalidade da proteína ubiquitina ou que podem ser separadas após a purificação devido à introdução de sítios de clivagem de protease específicos. Tais métodos são também conhecidos por si mesmos aos técnicos no assunto.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra uma Tabela que lista a ocorrência de ED-B em vários tumores.

A Figura 2 mostra as posições consenso e substituições de aminoácidos de 16 sequências adicionais que se descobriu que têm afinidades de ligação a ED-B surpreendentemente fortes. As posições consenso de aminoácidos são na primeira região de determinação de ligação monomérica 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65, 66 enquanto as substituições de aminoácidos consenso são Q2T, F4W, K6H, Q62N, K63F, E64K, S65L, e T66S. Como pode ser tomado a partir da Fig. 2, 4 famílias de sequências poderiam ser enriquecidas (sequências consenso, tamanho das letras corresponde à frequência de ocorrência dos aminoácidos). Posições 85 e 87 são as posições na proteína hetero- dimérica; com referência ao segundo monômero, as posições correspondentes são 6 e 8; 141 - 145 correspondem a posições 62 - 64). TWH NFKLS representado em cor azul escuro origina de 1071-C12. Resíduos marcados com cor vermelha pertencem a uma das ditas quatro famílias de sequências. Resíduos marcados em vermelho têm sido enriquecidos predominantemente (sequências 178/457) e incluem de acordo com HIT ELISAs as mais fortes moléculas de ligação.

A Figura 3 mostra que a tetramerização leva a um aumento em afinidade.

A tabela mostra os valores de Kd de monômeros de ubiquitina modificados em comparação com tetrâmeros consistindo em monômeros de ubiquitina modificados. São mostradas variantes de ubiquitina 5E1 e 1H4 como exemplos. A ligação a ED-B é em comparação com a ligação a c-FN (fibronectina celular). As figuras demonstram a significativa mais alta afinidade na ligação da variante tetramérica (por exemplo, 56 nM para 5E1 ou 1,4 nM para 1H4) ao ED-B alvo em comparação com o monômero (4,51 microM para 5E1 ou 9,98 microM para 1H4).

A Figura 4 mostra que a recombinação de um frontal (primeiro) monômero de ubiquitina modificado (tendo uma BDR1) com um posterior (segundo) monômero de ubiquitina diferente modificado (tendo uma BDR2) para gerar um hetero-dímero tem como resultado um aumento significativo de afinidade bem como especificidade. As moléculas de ubiquitina modificada são analisadas via Biacore, anisotropia de fluorescência, ligação em células e seções de tecido. São mostradas ELISAs dependentes de concentração (conc.- ELISA) da ligação de diversas variantes a ED-B humano.

A Figura 4 A mostra uma afinidade de ligação de Kd = 9,45 uM para o monômero 41B10.

A Figura 4 B mostra que uma afinidade de ligação de um Kd = 131 nM durante 41B10 combinada com um diferente segundo monômero que tem como resultado 46H9.

A Figura 5 mostra variantes específicas fusionadas a uma citocina (por exemplo, TNFalfa). As proteínas de fusão trimerizam o monômero de ubiquitina modificado e são moléculas biologicamente ativas.

A Figura 5 A é um desenho esquemático de uma proteína de fusão-efetora-de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada; em verde (estrutura na parte superior) - efetor, por exemplo, uma citocina, preferivelmente TNF-alfa; marrom: marrom claro: estrutura dos monômeros de ubiquitina modificados (Affilin®).

A Figura 5 B mostra que o conjugado efetor de ubiquitina modificada 5EI-TNF- conjugado tem atividade pró-apoptótica (como foi medido em um ensaio de apoptose L929).

A Figura 5 C mostra alta ligação de afinidade de IH4-TNFalfa-fusão a ED-B (Kd=15,1 nM) (círculos fechados conectados por uma linha ajustada). A ligação a BSA é colocada em gráfico como um controle (círculos fechados não conectados por uma linha).

A Figura 6 mostra a afinidade e atividade de uma molécula de hetero- dímero de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada fusionada a uma citocina, por exemplo, TNF alfa. • Atividade de indução de apoptose de fusão de citocina de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada: EC50 0,78 ±0,24 pM • Atividade de indução de apoptose de citocina livre: EC5o 3,14 ± 3,59 pM

A Figura 6A mostra a afinidade de hetero-dímero de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada 24H12 (Kd 50,7 nM).

A Figura 6B mostra a afinidade de hetero-dímero de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada 24H12 geneticamente fusionado a citocina TNFalfa para ter como resultado uma multimerização do hetero-dímero 24H12 (Kd = 5,6 nM

A Figura 6C mostra uma análise de candidatos exemplares de uma seleção de biblioteca de ubiquitina modificada hetero-dimérica, por exemplo, clones de hetero-dímero 9E12, 22D1, 24H12, 41B10. Os valores de ELISA de Kd são aumentados para o ED-B alvo em comparação com fibronectina citossólica usado como controle, confirmando uma ligação específica ao alvo.

A Figura 6D mostra os resultados de uma análise da molécula de ubiquitina hetero- dimérica modificada 9E12 via ensaios de interação livre de marcador usando Biacore®. Diferentes concentrações das variantes de ubiquitina hetero-dimérica foram analisadas (ver legenda da figura: 0-15 microM de 9E12) para ligar a ED-B imobilizadas em um chip (Biacore) para analisar a interação entre a variante hetero-dimérica 9E12 e ED-B. Um Kd poderia não ser determinado a partir da análise das curvas de associação e dissociação.

A Figura 6E mostra os resultados de uma análise da molécula de ubiquitina hetero- dimérica modificada 41B10 via ensaios de interação livre de marcador usando Biacore®. Diferentes concentrações das variantes de ubiquitina hetero-dimérica foram analisadas (ver legenda da figura: 0-15 microM de 41B10) para ligar a ED-B imobilizadas em um chip (Biacore) para analisar a interação entre a variante hetero-dimérica 41B10 e ED-B. A análise das curvas de associação e dissociação teve como resultado um Kd de 623 nM (623 x 10'9 M, 6,2 x 10'7 M).

A Figura 7 mostra a contribuição de diferentes variantes à base de ubiquitina modificada para a afinidade de ligação e especificidade. As diferentes variantes compartilham módulos de sequência comuns que são marcados com letras minúsculas. As variantes foram analisadas com respeito à sua ligação a ED-B. A Figura 3 mostra diferentes combinações de monômeros que tem como resultado hetero-dímeros de ubiquitina modificada. Variantes hetero-diméricas 46-A5, 50-G11 e 46-H4 têm todos o mesmo primeiro (frontal) monômero modificado com BDR1 (marcado com a letra “a” na figura), mas um segundo (posterior) monômero de ubiquitina modificado em diferentes posições com BDR2. Variantes 52-D 10 e 52-B3 têm um diferente primeiro (frontal) monômero modificado em comparação com 46-H9 com BDR1, mas o mesmo segundo (posterior) monômero de ubiquitina com BDR2 (marcado com a letra “e”).

Os hetero-dímeros de ubiquitina modificados têm as seguintes sequências: 46-H4: SEQ ID NO: 25, 45-H9: SEQ ID NO: 26, 46-A5: SEQ ID NO: 27, 50-G11: SEQ ID NO: 28, 52-B3: SEQ ID NO: 29, 52-D10: SEQ ID NO: 30

As sequências acima descritas foram modificadas no curso dos experimentos pela adição de uma cauda His com a sequência LEHHHHHH (SEQ ID NO: 31).

Como pode ser visto a partir da Figura 7, 46-H4 tem uma excelente afinidade de ligação a ED-B (Kd=189nM); 46-A5 e 52-D 10 não têm nenhuma atividade de ligação enquanto outras proteínas ubiquitinas modificadas proporcionam uma menor atividade de ligação em comparação com 46-H4 a ED-B. Assim pode ser concluído que ambos os monômeros em uma variante hetero-dimérica são requeridos para um alta ligação de afinidade a um alvo: ambos os monômeros mostram uma ligação monovalente ao alvo.

O hetero-dímero de ubiquitina modificado com alta atividade de ligação a ED-B denominado 46 H9 é identificado pelas seguintes substituições de aminoácidos em ambas as regiões de domínio de ligação nos dois monômeros quando comparado com monômeros de ubiquitina do tipo selvagem: no primeiro módulo (BDR1) (a) Q2G, F4V, K6R, Q62P, K63H, E64A, S65T, T66L no segundo módulo (BDR2) (e) K6H, L8M, Q62K, K63P, E64I, S65A, T66E 50G11 no primeiro módulo (46H9)(a) Q2G, F4V, K6R, Q62P, K63H, E64P, S65T, T66L no segundo módulo (c) K6M L8R, Q62M, K63N, E64A, S65R, T66L 46H4 no primeiro módulo (46H9)(a) Q2G, F4V, K6R, Q62P, K63H, E64P, S65T, T66L no segundo módulo (d) K6G, L8W, Q62T, K63Q, E64Q, S65T, T66R 52B3 no primeiro módulo (g) Q2R, F4P, K6Y, Q62P, K63P, E64F, S65A, T66R no segundo módulo (46H9) K6H, L8M, Q62K, K63P, E64I, S65A, T66E 52D10 (ligante não de ED-B) no primeiro módulo Q2V, F4C, K6R, Q62T, K63A, E64P, S65G, T66D no segundo módulo (46H9) (e) K6H, L8M, Q62K, K63P, E64I, S65A, T66E 46A5 (ligante não de ED-B) no primeiro módulo (46H9)(a) Q2G, F4V, K6R, Q62P, K63H, E64P, S65T, T66L no segundo módulo (b) K6L, L8M, Q62L, K63 A, E64F, S65A,

A Figura 8 mostra um alinhamento de sequências. Linha 1: Dois monômeros da proteína ubiquitina do tipo selvagem (1a linha) são ligadas com um ligante de 12 aminoácidos SGGGGSGGGGIG iniciando na Posição 77 e terminando na Posição 88; o segundo monômero com BDR2 começa na posição 89 com uma Metionina. Esta proteína ubiquitina do tipo selvagem dimérica é alinhada com a variante hetero-dimérica de ubiquitina modificada 46-H9 (2a linha) com diferentes modificações no primeiro e no segundo monômero que tem como resultado duas BDR's. Ambas as BDRs agem juntas na ligação do alvo devido a uma ligação monovalente ao alvo..

A Figura 9 mostra um alinhamento de sequências de variante hetero-dimérica de ubiquitina modificada 1041-D11 (1a linha) a “Ub2_TsX9” (ubiquitina modificada na posição 45 em ambos os monômeros a Triptofano, mostrando o ligante GIG entre os dois monômeros (posição 77 a 79; o segundo monômero começa com uma Metionina na Posição 80), e uma troca de Glicina a Alanina nos últimos aminoácidos c-terminal do 2° monômero. A terceira linha mostra “Ubi- Dimer wt”, a ubiquitina do tipo selvagem como dímero; mostrando nenhum alinhamento de ligante (assim, o segundo monômero começa na posição 77 com uma Metionina). A 4a linha mostra o “Ubi-Monomer wt” que é a ubiquitina do tipo selvagem humana.

A Figura 10 mostra uma ELISA dependente de concentração da ligação da variante de ubiquitina hetero-dimérica 1041-D11 a ED-B humano. A variante 1041-D11 mostra ligação de afinidade muito alta a ED-B (Kd = 6,9 nM = 6,9 x 10'9 M). Os pontos fechados mostram a afinidade da ligação de variante de ubiquitina hetero-dimérica 1041- D11 a um fragmento de fibronectina contendo ED-B (denominado como 67B89-Í0) em comparação com a não ligação deste variante para controle negativo (denominado como 6789-tO) (círculos abertos).

A Figura 11 mostra ELISAs dependentes de concentração competitivas da ligação de variante de ubiquitina hetero-dimérica 1041-D11 a fragmento de fibronectina contendo ED-B imobilizado (67B89) na presença de quantidades crescentes de alvo livre. A variante de ubiquitina hetero-dimérica 1041-D11 mostra uma ligação de afinidade muito alta a ED-B (CI50 =140 nM).

A Figura 12 mostra um resultado de uma análise da molécula de ubiquitina hetero- dimérica modificada 1041-D11 em ensaios de interação livre de marcador usando Biacore®. Diferentes concentrações da variante de ubiquitina hetero-dimérica foram analisadas (ver legenda da figura: 0-200 nM de 1041-D11) para ligar a um fragmento de fibronectina contendo ED-B (denominado como 67B89) imobilizado em um SA-chip (Biacore). A análise das curvas de associação e dissociação teve como resultado um Kd de 1 nM (1 x 10'9 M) e uma taxa koff de 7,7 x 10’4 s-1 que indica uma longa meia-vida de um complexo de 1041-D11 e ED-B.

A Figura 13 mostra a ligação de variante de ubiquitina hetero-dimérica 1041-D11 a ED-B em uma ELISA dependente de concentração simultaneamente analisando a estabilidade em soro de atividade de ligação. São mostradas diferentes condições, tais como pré-incubação durante 1 h a 37 °C da variante em soro de camundongo ou rato ou em PBST como controle. Os valores de Kd são todos entre 10 e 20 nM. Assim, pode ser concluído que a ligação do hetero-dímero 1041-D11 a ED-B não é significativamente influenciado pelo soro sanguíneo.

A Figura 14 mostra uma análise da formação de complexo de variante de ubiquitina hetero-dimérica 1041-D11 com fragmentos de fibronectina por SE-HPLC.

A Fig. 14 A mostra formação de complexo de 1041-D11 com ED-B. Três corridas de HPLC são sobrepostas: o pico azul com um tempo de retenção de 21,651 min origina de 1041 -D11 puro; o pico preto com um tempo de retenção de 26,289 min representa o fragmento de fibronectina 67B89; uma mistura de 1041-D11 e 67B89 tem como resultado o pico vermelho com um tempo de retenção de 21,407 min após SE-HPLC. O desvio do pico 1041-D11 a um tempo de retenção mais baixo bem como o desaparecimento do pico 67B89 indica formação de um complexo de 1041-D11 e ED-B solúvel.

A Fig. 14 B mostra a sobreposição de três corridas de SE-HPLC de 1041-D11 (azul, 21,944 min), fragmento de fibronectina 6789 sem ED-B (preto, 26,289 min) e uma mistura de 1041-D11 e 6789 (linha vermelha com picos a 21,929 min e 26,289 min). Quase nenhum desvio do pico 1041-D11 é observado. Este fato juntamente com uma falta de desaparecimento do pico 6789 indica nenhuma ligação significativa do fragmento de fibronectina livre de ED-B 6789.

A Figura 15 mostra a ligação de variante de ubiquitina hetero-dimérica 1041-D11 a células de cultura celular.

A Figura 15A mostra a ligação da variante de ubiquitina hetero-dimérica 1041-D11 em células de fibroblasto de pulmão fetal humano (Wi38) que foram fixas. A primeira coluna na Figura 15 mostra o controle usando anticorpos anti-ED-B, a segunda coluna mostra a incubação da variante a uma concentração de proteína de 58,7 nM, a terceira coluna uma concentração dez vezes mais alta de proteína 1041- D11 (587 nM), a quarta coluna é um controle negativo com PBS. Na primeira fila, células de fibroblasto Wi38 humano são mostradas no contraste de fases; a segunda fila mostra a imunofluorescência e a terceira fila um DAPI corando o núcleo. Pode ser concluído que a variante 1041-D11 se liga a Wi38 com alta especificidade a matriz extracelular contendo ED-B. Um controle usando células NHDF que expressam baixo nível de EDB foi realizado (dados não mostrados). As variantes não se ligam a aquelas células.

A Figura 15B mostra a ligação em células de fibroblasto de pulmão fetal humano vital (Wi38). As células de controle negativo tipo NHDF são células de fibroblasto normais primárias, que expressam baixos níveis de fibronectina de EDB. A primeira e a terceira linha mostram a variante a diferente concentração de proteína e o controle negativo. A segunda e a quarta linha mostra a incubação do controle usando anticorpos de EDB. As primeiras 2 linhas mostram a variante e controle positivo em linhagem celular Wi38. A terceira e quarta linha mostram a incubação de células NHDF. Pode ser visto que a variante 1 (MIDI 1 se liga a Wi38 com alta especificidade a matriz extracelular contendo ED-B.

A Figura 15C mostra a ligação em células Balb 3T3 murinas fixas. Três diferentes concentrações de proteína (1, 10, 50 nM) da variante foram testadas. As primeiras filas mostram a variante (SPVF-28-1041-41 l-TsX9) em células, a segunda fila mostra o controle positivo (Anticorpos Fv28-EDB), a terceira fila mostra a incubação com o controle negativo (UB2_TsS9; ubiquitina não modificada correspondente a SEQ ID NO: 1). Pode ser visto que a variante 1041- D11 se liga a células Balb 3T3 murinas com alta especificidade a matriz extracelular contendo ED-B.

A Figura 15D mostra a ligação em células ST-2 murinas fixas. Três diferentes concentrações de proteína (1, 10, 50 nM) da variante foram testadas. As primeiras filas mostram a variante (SPVF-28-1041-41 l-TsX9) em células, a segunda fila mostra o controle positivo (Anticorpos Fv28-EDB), a terceira fila mostra a incubação com o controle negativo (UB2_TsS9; ubiquitina não modificada correspondente a SEQ ID NO: 1). Pode ser visto que a variante de ubiquitina hetero-dimérica 1041-D11 se liga a células Balb ST-2 murinas com alta especificidade a matriz extracelular contendo ED-B.

A Figura 16 A mostra a especificidade de variante de ubiquitina hetero-dimérica 1041-D11 ao alvo em seções de tecido de mamíferos. Os tecidos tumorais F9 de sete amostras foram avaliados. A imunohistoquímica com diferentes concentrações entre 10 nM e 100 nM de variante de ubiquitina hetero-dimérica 1041-D11 teve como resultado coloração vascular específica a ED-B em tumores F9 de camundongos. ED-B é um marcador altamente específico para a vasculatura tumoral. A ED-B de proteína alvo está localizada no lado abluminal dos vasos. A variante 1041 -D11 especificamente decora a vasculatura em seções de tecido de tumores F9. Os resultados obtidos são comparáveis ao fragmento de anticorpo L19. Além disso, 48 tecidos foram testados; nenhuma coloração inespecífica em quaisquer dos 48 tecidos em painel relevante de FDA foi observada.

A Figura 16 B mostra a acumulação de 1041-D11 em tecido tumoral em comparação com ubiquitina do tipo selvagem (na figura, Ub2 (NCP2). Os tecidos tumorais F9 foram analisados para a presença de 1041-D11 e ubiquitina do tipo selvagem em diferentes pontos de tempo entre 30 min e 16 h. A mais alta acumulação de 1041-D11 em tecido tumoral é observada 30 min e 16 h após administração ao passo que a acumulação de ubiquitina do tipo selvagem em tecidos tumorais F9 é baixa. A variante é enriquecida em tumores que expressam ED-B quando em comparação com ubiquitina do tipo selvagem. Isto é uma evidência para o direcionamento dirigido de 1041-D11 a tecidos tumorais. Além disso, a razão tumor a sangue de 1041-D11 em um modelo de câncer claramente demonstra atividade in vivo de variante 1041-D11 em animais (dados não mostrados).

A Figura 17 mostra a alta seletividade e especificidade 1041-D11-TNF-alfa proteína de fusão para ED-B.

As Figuras 17A e 17B: Atividade de TNF-alfa de indução da apoptose da proteína de fusão 1041-D11-TNFa foi testada em um ensaio à base de células (células L929). As figuras claramente mostram que a proteína de fusão1041- D11-TNF-alfa (FIG. 17B) é tão ativa quanto TNF-alfa livre (FIG. 17B) em cultura celular.

A Figura 17C demonstra a alta seletividade da proteína de fusão 1041-D 11 TNF- alfa de ubiquitina hetero-dimérica ao ED-B alvo. O domínio de fibronectina de ED-B humano 67B89 é ligado com um valor de KD aparente de 1,8 nM a variante 1041-D 11 (círculos fechados), mostrando a alta afinidade para o alvo. Fibronectina humana carecendo do domínio ED-B (h6789) não é ligada pela 1041-D11 TNFalfa (círculos abertos).

A Figura 17D+E mostra a análise de ligação de proteína de fusão 1041- D11-TNF- alfa de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada por ensaios de Biacore. Os resultados demonstram a alta afinidade de proteína de fusão 1041-D11 TNF-alfa com um valor de KD de 1,13 nM.

A Figura 17F mostra a alta especificidade de ligação observada com variante 1041- D11 em cultura celular é conservada quando a 1041-D11 é fusionada ao TNF-alfa. A proteína de fusão especificamente se liga a células que expressam EDB. Assim, a proteína de fusão 1041-D11 TNF-alfa se liga com afinidade muito alta e especificidade ao ED-B alvo (“alvo(+)”). No soro sem ED-B (“alvo(-)”), nenhuma reação cruzada pode ser observada.

A Figura 18 mostra o crescimento tumoral relativo in vivo durante o tempo de tratamento de camundongos durante 7 dias com variante 1041-D11 fusionada a TNFalfa em combinação com Melfalano. Os dados claramente mostram que 1041-D11-TNFalfa em combinação com o agente citostático Melfalano reduz o crescimento tumoral relativo mais eficientemente que mTNF-alfa em combinação com Melfalano ou Melfalano em separado. A cinética de crescimento tumoral 7 dias após o tratamento mostra a redução eficiente de tumores por 1041-D11-mTNFa. Isto é uma clara evidência para a eficácia de um tratamento de tumores com proteína de fusão 1041-DII-TNF-alfa em combinação com Melfalano. ED-B é idêntico em diversas espécies de mamíferos, incluindo camundongos e seres humanos, e assim, os resultados são preditivos da performance de variante 1041-D 11-TNFalfa em seres humanos.

EXEMPLOS

Os seguintes Exemplos são proporcionados para ilustração adicional da invenção.

A invenção é particularmente demonstrada com respeito à modificação de ubiquitina como um exemplo. A invenção, no entanto, não é limitada à mesma, e os seguintes Exemplos meramente mostram a praticabilidade da invenção com base na descrição acima. Para uma descrição completa da invenção é feita referência também à literatura citada no pedido e no anexo os quais são todos incorporados em sua totalidade no pedido por referência.

Exemplo 1. Identificação de proteínas de ligação a ED-B hetero-diméricas à base de proteínas ubiquitinas modificadas

Construção de Biblioteca e Clonagem

A não ser que de outro modo indicado, métodos genéticos recombinantes estabelecidos foram usados, por exemplo, como foi descrito em Sambrook et al. A biblioteca randômica de hetero-dímeros de ubiquitina humana com alta complexidade foi preparada por mutagênese concertada de em total 15 posições de aminoácidos selecionadas. Os aminoácidos modificados, que foram substituídos por tripletos NNK, compreendiam pelo menos 3 aminoácidos selecionados a partir de posições 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66, 68 dentro do proximal (primeiro) monômero de ubiquitina e pelo menos 3 aminoácidos selecionados a partir de posições 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66, 68 dentro do distai (segundo) monômero de ubiquitina. Ambos os monômeros de ubiquitina foram geneticamente ligados (cabeça a cauda) por um ligante de Glicina/Serina com pelo menos a sequência GIG ou pelo ligante de Glicina/Serina com pelo menos a sequência SGGGG, por exemplo, GIG, SGGGG, SGGGGIG, SGGGGSGGGGIG (SEQ ID NO: 32) ou SGGGGSGGGG, mas qualquer outro ligante é possível.

Seleção de Apresentação em Fago TAT

A biblioteca de ubiquitina hetero-dimérica foi enriquecida contra o alvo usando, por exemplo, apresentação em fago TAT como sistema de seleção. Outros métodos de seleção conhecidos na técnica podem ser usados. O alvo pode ser imobilizado não especificamente em superfícies de ligação a proteínas ou via resíduos biotinilados que foram covalentemente acoplados à proteína. A imobilização via biotina em contas de estreptavidina ou tiras de neutravidina é preferida. Os fagos de ligação ao alvo são selecionados em solução ou no alvo imobilizado; por exemplo, o alvo biotinilado e imobilizado com fago foi incubado seguido pela lavagem dos fagos ligados à matriz e pela eluição dos fagos ligados à matriz. Em cada ciclo em seguida à incubação do alvo, as contas foram magneticamente separadas da solução e lavadas diversas vezes. No primeiro ciclo de seleção o alvo biotinilado foi imobilizado a tiras de neutravidina ao passo que em ciclos duas a quatro seleções em solução foram realizadas seguidas pela imobilização de complexos alvo-fago em Dynabeads® revestidas com estreptavidina (Invitrogen). Após a lavagem nos primeiros dois ciclos de seleção os fagos de moléculas de ubiquitina modificada de ligação ao alvo foram liberadas pela eluição com solução ácida. Nos ciclos de seleção três e quatro a eluição de fagos foi levada a cabo pela eluição competitiva com alvo em excesso. Os fagos eluídos foram re-amplificados. Para direcionar a especificidade de ligantes uma proteína similar ao alvo pode ser incluída durante a seleção.

Alternativamente à seleção de apresentação em fago TAT: Seleção de Apresentação em Ribossoma

A biblioteca de ubiquitina foi enriquecida contra o alvo usando, por exemplo, apresentação em ribossoma como sistema de seleção (Zahnd et al., 2007), Ohashi et a!., 2007). Outros métodos de seleção conhecidos na técnica podem ser usados. O alvo foi biotinilado de acordo com métodos padrão e imobilizado em Dynabeads® revestidas com estreptavidina (Invitrogen). Os complexos ternários compreendendo ribossomas, mRNA e polipeptídeo de ubiquitina nascente foram montados usando o Kit de Síntese de Proteína In vitro PURExpress™ (NEB). Duas rondas primárias de seleção foram realizadas, em que os complexos ternários foram incubados seguido por duas rondas similares de seleção. Em cada ciclo em seguida à incubação do alvo, as contas foram magneticamente separadas da solução e lavadas com apresentação em tampão de ribossoma com estringência crescente. Após a lavagem nos primeiros dois ciclos de seleção, as contas foram de novo magneticamente separadas da solução e mRNA de moléculas de ubiquitina modificada de ligação ao alvo foi liberado de ribossomas pela adição de 50 mM de EDTA. Nos ciclos de seleção três e quatro a eluição de mRNA foi levada a cabo pela eluição competitiva com alvo em excesso (Lipovsek e Pluckthun, 2004). Após cada ciclo, a purificação de RNA e a síntese de cDNA foram realizadas usando o Kit RNeasy MinElute Cleanup (Qiagen, Alemanha), Kit livre de DNA Turbo (Applied Biosystems, EUA) e Transcriptase Reversa Transcriptor (Roche, Alemanha). Clonagem de Agrupamentos Enriquecidos

Após o quarto ciclo de seleção o cDNA sintetizado foi amplificado por PCR via primers F1 (GGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTA ACTTTAAGAAGGAGATATACATATG) (SEQ ID NO: 9) e WUBI(co)RD_xho (AAAAAAAAACTCGAGACCGCCACGCAGACGCAGAACCAG) (SEQ ID NO: 10), cortado com as nucleases de restrição Ndel e Xhol (Promega, EUA) e ligado em vetor de expressão pET-20b(+) (Merck, Alemanha) via extremidades coesivas compatíveis. Análise de Acerto de Colônia Individual

Após a transformação em Células NovaBlue(DE3) (Merck, Alemanha) colônias individuais resistentes a ampicilina foram crescidas durante 6 h a 37 °C em 200 μl de meio SOBAG (meio SOB contendo 100 μg/ml de ampicilina e 20 g/l de glicose), a expressão da ubiquitina modificada de ligação a ED-B foi alcançada pela cultura durante 16 h a 37 °C em placas de 96 poços bem profundos (Genetix, UK) usando 500 μl meio de auto indução ZYM- 5052 (Studier, 2005). As células foram colhidas por 15 min de centrifugação a 4 °C e 3600 g e subsequentemente lisadas pela incubação durante 30 min a 37 °C com 300 μl de tampão de lise por poço, contendo 0,2 x BugBuster® (Merck, Alemanha), 0,3 mg/ml de lisozima (VWR, Alemanha) 0,2 mM de PMSF (Roth, Alemanha), 3 mM de MgCI2 e 0,2 U/ml Benzonase (VWR, Alemanha) em 50 mM de NaH2PO4, 300 mM de NaCI, pH8. Após a centrifugação durante 30 min a 4 °C e 3600 g os sobrenadantes resultantes foram triados por ELISA usando placas Nunc MediSorp (Thermo Fisher Scientific, EUA) revestidas com 4 μg/ml de ED-B e um fragmento Fab específico a ubiquitina conjugado com peroxidase de rábano silvestre (POD). Como reagente de detecção TMB-Plus (Biotrend, Alemanha) foi usado e a cor amarela se desenvolveu usando 50 pl/poço 0,2 M de solução de H2SO4 e foi medida em um leitor de placas a 450 nm versus 620 nm.

Usualmente, diversos, por exemplo, quatro ciclos de apresentação de seleção versus ED-B foram levados a cabo. Nos últimos dois ciclos de seleção moléculas de ligação foram eluídas com um excesso de ED-B livre. Estas variantes de ligação a ED-B foram identificadas, entre outros: Sequência de 46H9 MGIVVRTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSD YNIPHPTLLHLVLRLRGGSGGGGSGGGGIGMQIFVHTMTGKTITLEVEPSDTIENVKA KTQDKEGIPPDQQRLTWAGKQLEDGRTLSDYNIKPTAELHLVLRLRGG (SEQ ID NO: 6) Sequência de 9E12 MRIPVYTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDY NIPPFARLHLVLRLRGGSGGGGSGGGGIGMQIFVMTRTGKTITLEVEPSDTIENVKAKl QDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIMNARLLHLVLRLRGG (SEQ ID NO: 7) Sequência de 22D1 MLTLVRTLTDKTITLEVEPSDTTGNVKAKTQDKEGTPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDY NTSVGAMLHLVLRLRGGSGGGGSGGGGIGMQTFVLTWTGKTTTLEVEPSDTTENVKA KJQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIRRLPPLHLVLRLRGG (SEQ ID NO. 8)

Um alinhamento de sequências do monômero de ubiquitina do tipo selvagem (Ubi monomer wt), com ubiquitina do tipo selvagem dímero (ubi dimer wt) e proteína ubiquitina do tipo selvagem (Ub2-TsX na Figura 9, com uma troca na posição 45 de cada monômero e com duas substituições no terminal C) com a variante hetero-dimérica de ubiquitina modificada 1041-D11 é mostrado na Figura 9. Em Ub2-TsX as substituições no terminal C (GG a AA) do monômero increase a estabilidade no soro porque deubiquitinases clivam atrás do GG de ubiquitina, mas não atrás do AA. A estrutura secundária da ubiquitina do tipo selvagem em comparação com a ubiquitina com estas substituições no terminal C é quase idêntica.

As ubiquitinas modificadas com atividade de ligação a ED-B superior denominadas como 1041-D11 (mostrado na Figura 9; SEQ ID NO: 36) ou 1045-D10 são identificadas pelas seguintes substituições de aminoácidos quando comparado com o tipo selvagem: no primeiro módulo: K6W, L8W, K63R, E64K, S65F, T66P; no segundo módulo: K6T, L8Q, Q62W, K63S, E64N, S65W, T66E; opcionalmente Q2R (em variante 1041-D11, mas não em variante 1045-D10). Ligantes preferidos adequados para a proteína de fusão são aqueles da SEQ ID NO: 32 ou a sequência GIG. No entanto, existem muitos ligantes concebíveis que podem ser usado em lugar destes.

Como um exemplo preferido adicional uma proteína é proporcionada pela seguinte sequência em que XXXX pode ser qualquer aminoácido (SEQ ID NO: 47). Como ligante, SGGGGSGGGGIG foi usado aqui (mostrado em itálico). É para ser entendido que também outro tipo de ligantes ou nenhum ligante são alternativas factíveis. FKL S L8XA7LRLRGGS6GGGSGGGGT6 HQIFVXTXTGKT IENVKAKTQDKEG í PPDQQRLI5ÍAGKQLSDGR xLS DYNIX XXXXLHLVLRLRGe

Exemplo 2. Produção de proteínas de fusão de Variantes de ubiquitina modificada de ligação a ED-B e TNFalfa humano (hTNFa)

As variantes são expressas como proteínas de fusão entre a ubiquitina modificada, por exemplo, variante hetero-dimérica 1041-D11, e TNFa de camundongo ou humano em E. coli. A análise proteica da proteína de fusão inclui: expressão e pureza de proteína, nenhuma agregação potencial, atividade de TNFa em cultura celular, afinidade para o ED-B de proteína alvo, Seletividade, ligação específica em cultura celular. Pré-requisito para experimento animal para induzir o encolhimento do tumor em camundongos que portam tumor F9 é uma fusão com camundongo TNFa .

Etapa 1: Produção de um vector para a clonagem de proteínas de fusão (pETSUMO- TNFa) pETSUMOadapt é um vetor modificado pETSUMO (Invitrogen), que foi modificado pela inserção de um sítio de clonagem múltiplo adicional (MOS). Iniciando de TNFalfa clonado em pETSUMOadapt, sítios de restrição para a inserção de variantes de ubiquitina modificada que se ligam a ED-B-foram introduzidos. A construção resultante tem a estrutura His6-SUMO-TNFa com a seguinte sequência de DNA (SEQ ID NO: 11): ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACGGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCA GCGCTAGCATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGC CAGAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGA GATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCTTTAAGAAGGCTGATGGAAGCGTTC GCTAAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACGACGGTATTA GAATTCAAGCTGATCAGACCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATTAT TGAGGCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTGTGCGTAGCAGCAGCCGTACCCCGAG CGATAAACCGGTGGCGCATGTGGTGGCGAATCCGCAGGCGGAAGGCCAGCTGCA GTGGCTGAACCGTCGTGCGAATGCGCTGCTGGCCAACGGCGTGGAACTGCGTGAT AATCAGCTGGTTGTGCCGAGCGAAGGCCTGTATCTGATTTATAGCCAGGTGCTGT TTAAAGGCCAGGGCTGCCCGAGCACCCATGTGCTGCTGACCCATACCATTAGCCG TATTGCGGTGAGCTATCAGACCAAAGTGAACCTGCTGTCTGCGATTAAAAGCCCG TGCCAGCGTGAAACCCCGGAAGGCGCGGAAGCGAAACCGTGGTATGAACCGATT TATCTGGGCGGCGTGTTTCAGCTGGAAAAAGGCGATCGTCTGAGCGCGGAAATTA ACCGTCCGGATTATCTGGATTTTGCGGAAAGCGGCCAGGTGTATTTTGGCATTATT GCGCTGTAATAA

A sequência TNFalfa foi amplificada via PCR pela introdução de um sítio BamHI e Xhol. Primers usados: SUMO-EDB-TNFa-fw (SEQ ID NO: 12): TTT TTT GGA TCC GTG CGT AGC AGC AGC SUMO-EDB-TNFa-rev (SEQ ID NO: 13): CTT GTC TCT CGA GGC GGC CGC TTA TTA Ç

O fw-primer (SEQ ID NO: 12) reconhece os primeiros 15 pares de base de TNFa (região sublinhada) e tem uma sequência BamHI (mostrada em negrito). O rev-primer (SEQ ID NO: 13) contém o último par de bases de TNFa, os códons de terminação (sublinhados) e um sítio de restrição Xhol (negrito).

Mistura de reação de PCR (100 ul): 84,5 μl de H2O; 10 μl 10x tampão Pwo + Mg; 2 μl 10 mM de dNTPs (=200 μM); cada 0,5 μl 100 primer fw/rev (=cada 0,5 μM); 2 μl de DNA (=0,25 μg); 0,5 μl de polimerase Pwo (=2,5 U; Roche) Programa de PCR: 3 min 94 °C, 30 s 94 °C, 30 s 60 °C, 2 min 72 °C (etapas 2 - 4: 30 ciclos), 5 min 72 °C, seguido por 4 °C seguido por purificação do produto de PCR com o Kit Qiagen-MinElute (eluição em 10 μl de EB). O produto de PCR é introduzido no MCS do vetor pETSUMOadapt via restrição de BamHI-Xhol e ligação.

Mistura de restrição (100 ul): vetor: 83 μl de H2O; 10 μl 10x tampão NE 3; 1 μl 100x BSA; 3 μl de BamHI (=30 U; NEB), 1,5 μl de Xhol (=30 U; NEB); 1,65 μl de vetor; 3 h 37 °C incubação. Produto de PCR: 76,5 μl de H2O; 10 μl 10x tampão NE 3; 1 μl 100x BSA; 3 μl de BamHI (=30 U; NEB), 1,5 μl de Xhol (=30 U; NEB); 8 μl de inserto; 3 h 37 °C incubação Separação de Restrição em 1 % de gel de Agarose (100 V 60 min corrida); fragmento de vetor cortado (5659 pb) e inserto (491 pb); Purificação com kit de extração em gel de Qiagen (eluição em 30 μl de EB).

Ligação (20 ui): 15,2 μl DE H2O; 2 μl 10Xtampão ligase de DNA T4; 2,26 μl de vetor (200 ng); 0,54 μl de inserto (40 ng) 5 min 65 °C incubação; resfriar até 16 °C; adicionar 1 μl de ligase de DNA T4 (=3 U; NEB); 16 h 16 °C incubação.

Precipitação de NaAc/lsopropanol: Mistura de ligação (20 μl) + 2,2 μl 3 M NaAc (pH 5,0) + 22,2 μl de isopropanol; 30 min -20 °C; 15 min 4 °C 13000 Upm; precipitado de ressuspensão em 500 μl 70 % EtOH; spin; precipitado de ressuspensão em 10 μl H2O. T ransformação: Misturar células eletro-competentes Novablue(DE3) (40 μl-aliquota) com 10 μl de produto de ligação; transferir a cuveta de eletroporação de 0,1 cm; pulso em eletroporador (1,8 kV, 50 μF, 100 Ohm); incubar a solução com 1 ml de meio SOC 45 min 37 °C 220 Upm; 100 μl em placa LB com kanamicina: incubação durante a noite 37 °C.

Etapa 2: Clonagem de proteínas de fusão de EDB à base de ubiquitina modificada

Para a produção de fusões de variantes à base de ubiquitina modificada de ligação a EDB e TNFa, a sequência à base de ubiquitina modificada de EDB de interesse é amplificada a partir de um vetor pET20b via PCR; sítios Bsal e BamHI de restrição são introduzidos. O método é adequado para variantes à base de ubiquitina modificada de EDB monomérica e para dimérica. Primer para Ubiquitina WT monomérica (Wubi): SUMO-EDB-WUBI-fw (SEQ ID NO: 14):: GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG CAG ATC TTC GTG SUMO-EDB-Linkcr-rcv (SEQ ID NO: 15):: GTG GTG GGA TCC ACC GCC ACC ACC AGA ACC GCC ACG CAG ACG O fw-primer (SEQ ID NO: 14) reconhece os primeiros 15 pares de base de ubiquitina modificada (região sublinhada) e tem uma sequência Bsal (mostrada em negrito). O rev-primer (SEQ ID NO: 15) reconhece os últimos 15 pares de base de ubiquitina modificada e inserta um ligante de aminoácido (sequência SGGGG) e um sítio de restrição BamHI (negrito). Para cada variante à base de ubiquitina modificada, um fw-primer específico é usado. Primers de variantes à base de ubiquitina modificada de EDB monoméricas 1H4, 5E1 e 4B10: 1H4 (MWIKV...): Primer (SUMO-EDB-lH4-fw) (SEQ ID NO: 16): GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG TGG ATC AAG GTG 4B10 (MLILV): Primer (SUMO-EDB-4B10-fw) (SEQ ID NO: 17): GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG TTG ATC CTG GTG 5E1 (MV1NV...): Primer (SUMO-EDB-5El-fw) (SEQ ID NO: 18): GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG GTT ATC AAT GTG O rev-primer é usado para todas as variantes à base de ubiquitina modificada monoméricas. Rev-Primer para variantes à base de ubiquitina modificada diméricas: Dimer-tOa-rev (SEQ ID NO: 19): GTG GTG GGA TCC ACC GCC ACC ACC AGA ACC ACC ACG TAA ACG fw-Primer para a clonagem de ubiquitinas WT diméricas (WubiHubi) e para variantes à base de ubiquitina modificada de EDB diméricas: WT (MQIFV...) Primer (SUMO-EDB-WUBl-fw) (SEQ ID NO: 20): GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG CAG ATC TTC GTG (nota: fw-Primer para ubiquitina WT dimérica é idêntico para fw-Primer para ubiquitina WT monomérica.) 9EÍ2 (MRIPV...): Primer (9E12-t0a-fw) (SEQ ID NO: 21): GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG CGT ATC CCT GTG 24H12 (MV1KV...): Primer (24H12-t0a-fw) (SEQ ID NO: 22):GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG GTT ATC AAG GTG 15G7 (MEIGV...): Primer (15G7-t0a-fw) (SEQ ID NO: 23): GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG GAG ATC GGT GTG 22D1 (MLILV...): Primer (22Dl-t0a-fw) (SEQ ID NO: 24): GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG CTT ATC TTG GTG Mistura de PCR (100 til): 84,5 μl de H2O; 10 μl 10x tampão Pwo + Mg; 2 μl 10 mM dNTPs (=200 μM); cada 0,5 μl 100 μM Primer fw/rev (=je 0,5 μM); 2 μl de DNA (dependente da variante); 0,5 μl de Polimerase Pwo (=2,5 U; Roche) Programa de PCR: 1. 3 min 94 °C 2. 30 s 94 °C 3. 30 s 60 °C 4. 2 min 72 °C (etapas 2 - 4: 30 ciclos) 5. 5 min 72 °C, seguido por 4 °C Purificação dos produtos de PCR em gel de agarose, cortar banda requerida e purificar com kit de extração em gel de Qiagen. Clonagem do produto de PCR via restrição Bsal-BamHI (em pETSUMO-TNFa) Restrição (100 ul): 75 μl de H2O; 10 μl 10x Tampão NE 3; 1 μl 100x BSA; 3 μl de Bsal (=30 U; NEB); 8 μl de DNA (vetor ou Produto de PCR) 2 h 50 °C incubação, 10 min 65 °C, adicionar 3 μl de BamHI (=30 U; NEB), 2 h 37 °C Separação de restrição em 1 % de gel de agarose; fragmento de vetor cortado e inserto; purificação com kit de extração em gel de Qiagen (eluição em 30 μl EB). Ligação (20 ul): 12,5 μl de H2O; 2 μl 10x tampão ligase de DNA T4; 5 μl de vector (66 ng); 0,5 μl de inserto (variável) 5 min 65 °C incubação; resfriar até 16 °C; adicionar 1 μl ligase de DNA T4 (=3 U; NEB); 16 h 16 °C incubação Precipitação de NaAc/isopropanol (ver Etapa 1)

Transformaçãoem células Novablue(DE3) eletro-competentes como foi descrito acima. O resultado é a seguinte construção de fusão: ubiquitina modificada de EDB e TNFa em pETSUMOadapt com der His6-SUMO- ubiquitina modificada-SGGGG-TNFa (359 aminoácidos com ubiquitina monomérica modificada 447 aminoácidos com ubiquitina modificada dimérica) Exemplo 3: Expressão e Purificação de Proteínas de fusão TNFalfa à base de Ubiquitina

A análise de sequência de DNA mostrou as sequências corretas das proteínas de fusão SUMO-TNFa. Para a expressão das variantes os clones foram cultivados em um frasco agitador pela diluição de uma pré-cultura 1:100 com LB/Kanamicina e agitando a cultura a 200 rpm e 37 °C até uma densidade óptica a 600 nm (OD6OO) de 0,5. Expressão foi induzida pela adição de IPTG (concentração final 1 mM). A cultura foi continuada durante 4 horas a 30 °C e 200rpm. As células bacterianas foram colhidas por centrifugação a 4 °C, 6000 x g durante 20 min. O precipitado de células foi suspenso em 30 ml de tampão NPI-20 incluindo benzonase e lisozima. As células foram rompidas por ultrasonicação (3x20 seg) em gelo. O sobrenadante contendo as proteínas solúveis foi obtido após a centrifugação da suspensão a 4 °C e 40000 x g durante 30 min. Ambas as proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade a temperatura ambiente. Uma coluna de Ni-Agarose (5 ml, GE Healthcare) foi equilibrada com 50 ml de NPI-20. O sobrenadante contendo as proteínas solúveis foi aplicado à coluna, seguido por uma etapa de lavagem com NPI-20. A proteína ligada foi eluted com um gradiente linear até 50 % NPI-500 em 100ml. As frações foram analisadas por SDS-PAGE com respeito à sua pureza. As frações adequadas foram agrupadas e aplicadas a uma coluna de filtração em gel (Superdex 75, 1,6 x 60 cm, GE Healthcare) equilibrada com tampão de clivagem SUMO-hidrolase (50 mM Tris, 300 mM NaCI, pH 8,0) a uma taxa de fluxo de 1 ml/min.

A reação de clivagem foi feita de acordo com a instrução do fabricante (Invitrogen).

Após a divagem a proteína foi aplicada a uma coluna Ni-agarose (5ml, GE Healthcare). SUMO-hidrolase com cauda His e SUMO com cauda His foram ligados à coluna e a correta proteína de fusão passou na coluna (cauda His livre). Pureza das proteínas foi verificada por análise de rpHPLC e eletroforese em gel. A correta massa molecular do trímero (via TNFa) foi confirmada usando análise SEC analítica (10/30 Superdex G75, GE Healthcare).

Exemplo 4: Análise de ligação de variantes de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada a ED-B humano

Exemplo 4A. Análise de ligação de variantes de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada por ELISA dependente de concentração.

A ligação de variantes à base de ubiquitina a ED-B humano foi ensaiada por uma ELISA dependente de concentração. Quantidades crescentes de proteína purificada aplicada a placas NUNC-medisorp revestidas com ED-B humano, BSA e fibronectina celular (cFN). O revestimento de antígeno com 50 μl (10 μg/ml) por poço foi realizado a 4 °C durante a noite. Após a lavagem as placas com PBS, 0,1 % de Tween 20 pH 7,4 (PBST) os poços foram bloqueados usando solução de bloqueio (PBS pH 7,4; 3 % BSA; 0,5 % de Tween 20) a 37 °C durante 2 h. Os poços foram lavados de novo três vezes com PBST. Diferentes concentrações de proteína de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada foram então incubadas nos poços a TA durante 1 h (50 μl de volume)(na FIG. 10, como concentração de início, 500 nM de proteína 1041-D11 foram usados). Após a lavagem os poços com PBST, o fragmento fab anti-Ubi (AbyD) POD conjugado foi aplicado em uma diluição apropriada (por exemplo, 1:2000 ou 1:6500) em PBST. A placa foi lavada três vezes com 300 tampão PBST/poço. 50 TMB solução de substrato (KEM-EN-Tec) foram adicionados a cada poço e foi incubado durante 15 min. A reação foi interrompida pela adição de 50 μl 0,2 M H2SO4 por poço. As placas de ELISA foram lidas usando o leitor TECAN Sunrise ELISA. As medições de absorbância fotométrica foram feitas a 450 nm usando 620 nm como um comprimento de onda de referência. A Figura 1 mostra claramente a ligação específica do 1H4 a ED-B com um valor de KD aparente de 11 nM. A variante 5E1 mostra um valor de KD aparente de 7,7 uM e 4B10 de 280 nM respectivamente. A Figura 10 mostra a ligação de afinidade muito alta de variante 1041-D11 a ED-B (KD=6,9 nM). Assim, somente umas poucas modificações (até 8 substituições em cada monômero) na ubiquitina de tipo selvagem têm como resultado uma ligação de afinidade a ED-B muito mais alta.

Exemplo 4B. Análise de ligação de variantes de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada por ELISA dependente de concentração competitiva.

As ELISAs dependentes de concentração competitivas analisaram a ligação de variante de ubiquitina 1041- D11 a fragmento de fibronectina contendo ED-B imobilizado (67B89) na presença de quantidades crescentes de alvo livre. Condições da ELISA foram como foi descrito para o Exemplo 5 A, exceto que a proteína 1041-D11 foi pré-incubada com ED-B (67B89) (0 μM - 10 μM) ou também com controle negativo 6789 (0 μM - 10 μM) durante 1 h e subsequentemente a mistura foi dada ao alvo 67B89 que foi colocado em uma placa Medisorp; em seguida a isso, a variante foi detectada pelo anticorpo correspondente (anti-Ubiquitina-Fab-POD; diluição 1:6500). A Figura 11 mostra que a variante 1041-D11 tem uma ligação de afinidade muito alta a ED-B (CI50 =140 nM). O resultado mostrado na Figura 10 é confirmado; somente umas poucas modificações (até 8 substituições em cada monômero) na ubiquitina de tipo selvagem têm como resultado uma ligação de afinidade a ED-B muito mais alta.

Exemplo 4G. Análise de ligação de variantes de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada por ELISA dependente de concentração simultaneamente analisando a estabilidade em soro de atividade de ligação.

A ELISA é realizada usando procedimentos bem conhecidos na técnica e como foi descrito acima (Exemplo 5A e 5B). ED-B (aqui denominado como 67B89) é revestido a placas de microtitulação, a variante é ligada a ED-B e detectada por um anticorpo de ubiquitina específico (Anti-Ubi-Fab-POD). A variante neste ensaio é tratada de diferentes maneiras: a variante é incubada em soro de camundongo durante 1 h a 37 °C (ver na Fig. 13, círculos em azul); a variante é incubada em soro de rato durante 1 h a 37 °C (na Fig. 13, círculos em vermelho); ou a variante é incubada PBS durante 1 h a 37 °C (na Fig. 13, círculos em preto). A Figura 13 mostra que todos os KDs de variante 1041-D11 são entre 10,3 nM (em PBS) a 20,74 nM (em soro de camundongo).

Exemplo 4D. Análise de ligação de variantes de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada por ensaios de Biacore.

Diferentes concentrações da variante foram analisadas (por exemplo, 0-200 nM da variante, preferivelmente 1041-D11) para ligar a um fragmento de fibronectina contendo ED- B (denominado como 67B89) imobilizado em um CM5-chip (Biacore) usando métodos conhecidos aos técnicos no assunto. Os dados obtidos foram processados via o software BIAevaluation e ajuste l:l-Langmuir. O Kd de variante 1041-D11 foi 1,0 nM, como foi mostrado na Figura 12. As constantes de ligação de cinética foram kon = 7,6*105 M'1s’1; kotf = 7,7*10'4 s’1. O Kd da proteína de fusão 1041- D11 - TNFalfa foi 1,13 nM, como foi mostrado na Figura 17D. As constantes de ligação de cinética foram kon - 4,5* 105MV; kOft = 5,0* W4 s’1.

Exemplo 4E. Análise de formação de complexo de variantes de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada por SE-HPLC.

Para a análise de formação de complexo, colunas Tricorn Superdex 75 5/150 GL (GE- Healthcare) (V = 3 ml) foram usadas, a quantidade de proteína de 50 μl foi aplicada. Condições adicionais: tampão: 1x PBS, pH 7,3, taxa de fluxo: 0,3 ml/min, corrida: 45 min (injeção de amostra: após 15 min). Condição: 0,72 nmol de proteína 1041-D11 + 0,72 nmol de ED-B (no presente documento denominado 67B89 ou também como um controle negativo 6789) incubados durante 1 h a TA; então aplicados à coluna para a análise de formação de complexo. Na Figura 14, somente a variante é mostrada em preto, somente o ED-B alvo é mostrado em azul, a ligação de variante construindo um complexo com ED-B em rosa. A Figura 14 A mostra ED-B com a variante; a Figura 14 B é a variante sem ED-B. A figura mostra quea variante 1041-D11 constrói um complexo juntamente com ED-B (67B89), mas não constrói complexo com 6789.

Exempio 5: Ensaio Biológico de TNF aifa

A atividade fisiológica de TNF-alfa de fusões de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada de TNF-alfa foi determinada usando o ensaio de apoptose L929 (Flick et a!., 1984 J. Immunol. Methods. 68:167-175). Neste ensaio, TNF-alfa eficientemente estimula a morte celular em células sensibilizadas com actinomicinaD em valores de EC5o na faixa picomolar.

As células têm sido ressuspensas em meio contendo FBS e antibióticos. Uma suspensão celular de 100 μl de uma densidade de 3,5x105 células/ml foi semeada nos poços de uma placa de cultura celular padrão de 96 poços seguido por incubação durante a noite em um incubador de CO2 umidificado. Depois disso, o meio de cultura foi removido e 50 de meio contendo FBS, ActinomicinaD e antibióticos foi adicionado a cada poço seguido por um tempo de incubação adicional de 30 min. Depois disso, 50 μl dos itens de teste, fusões de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada de TNF-alfa ou o controle TNFalfa recombinante humano, a uma faixa de concentração apropriada de entre 10‘7 e 10'18 M, foram adicionados. Após um tempo de incubação adicional de 48 h a atividade metabólica como uma medida de sobrevivência celular foi determinada usando reagente WST-1 (Roche).

Por item de teste pelo menos três experimentos independentes foram conduzidos, cada um dos mesmos em triplicata. Cada teste de proteínas de fusão de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada de TNF-alfa foi colocado em paralelo pelo teste de uma faixa de dose de TNF-alfa recombinante humano para obter informação sobre a variabilidade inter-ensaio.

A avaliação quantitativa é à base do valor de EC50, isto é, o valor de acordo com a concentração de item de teste que promove a sobrevivência de metade das células.

Tabela 2

mub: ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada

Da fusão de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada de TNF-alfa um monômero de ubiquitina (Wubi) e três construções de dímero de ubiquitina foram analisados. Dependendo da variante de ligação a ED-B à base de ubiquitina modificada acoplada à fração de TNF-alfa a atividade associada a TNF-alfa foi aumentada (SPWF- 28_24-H12_TNF-alfa) ou diminuída (SPWF- 28_22-DI_TNF-alfa, Wubi-Hubi-TNF-alfa) em aproximadamente uma ordem de magnitude. Ver Figura 17 para a análise de TNFalfa 1041- D 11 variante.

Exemplo 6. Análise de ligação de variantes de ubiquitina em ensaios de cultura celular

A ligação de variante 1041-D11 a células de cultura celular foi testada. Diferentes células de cultura celular foram analisadas, incluindo células de fibroblasto de pulmão fetal humano normal tendo altos níveis de expressão de ED-B (células Wi38), uma linhagem de t célula de fibroblasto embriônica de camundongo (Balb 3T3); uma linhagem de célula do estroma, derivada de medula óssea de camundongo (ST-2) monócitos/macrófagos (RAW 264,7), células NHDF e células de fibroblasto murino (LM).

A 1041-D11 variante (diferentes concentrações) ou um anticorpo específico de ED- B (500 nM FV28 CH4/F1 1x PBS foram incubados (1 h, 37 °C) com células Wi38 (60.000 células/ml; de ATCC), seguido por fixação com metanol (5 min, -20 °C), bloqueio (5 % de cavalo/PBS, 1 h); incubação com rabbit-um-Strep-Etiqueta-lgG (obtido de GenScript A00875, 1:500) durante 1 h e incubação com a-rabbit-lgG*Alexa488-AK (obtido de Invitrogen Al 1008, 1:1000) durante 1 h. Os núcleos foram corados com DAPI. A primeira coluna na Figura 15A mostra o controle usando anticorpos de EDB, a segunda coluna mostra a incubação da variante a uma concentração de proteína de 58,7 nM, a terceira coluna uma concentração dez vezes mais alta de proteína 1041-D11 (587 nM), a quarta coluna é um controle negativo com PBS. Na primeira fila, células de fibroblasto Wi38 humano são mostradas no contraste de fases, a segunda fila mostra a imunofluorescência e a terceira fila uma coloração DAPI. Pode ser concluído a partir das figuras que a variante 1041-D11 se liga a células Wi38 fixas com alta especificidade a matriz extracelular contendo ED-B. O controle negativo célula tipo NHDF são células de fibroblasto normais primárias, que expressam baixos níveis de fibronectina de EDB (dados não mostrados). As variantes não se ligam a aquelas células.

A Figura 15 B mostra a análise de variante 1041-D11 em células Wi38 vitais. As células de controle negativo tipo NHDF são células de fibroblasto normais primárias, que expressam baixos níveis de fibronectina de EDB. As células foram colocadas em placas em lâminas de câmara (NUNC, 60000 células/ml). Para as análises da ligação potencial as células foram fixas com 100 % de MeOH durante 5 min a -20 °C. Para bloquear a ligação não específica, as células foram incubadas com 5 % de soro de cavalo 1 h 37 °C. As células foram testadas com a variante 1041-D11, um anticorpo específico de ED-B FV28 CH4/F1 como controle positivo ou UB_2 como controle negativo com diferentes concentrações 1 h TA. A prova ocorreu sobre uma incubação com rabbit-a-Strep-Tag-lgG (obtido de GenScript A00875, 1:500) durante 1 h e incubação com a-rabbit-lgG*Alexa488-AK (obtido de Invitrogen Al 1008, 1:1000) durante 1 h. Os núcleos foram corados com DAPI. A primeira e a terceira linha na Figura 15B mostra a variante a diferente concentração de proteína e o controle negativo. A segunda e a quarta linha mostra a incubação do controle usando anticorpos de EDB. As primeiras 2 linhas mostram a variante e controle positivo em linhagem celular Wi38. A terceira e quarta linha mostra a incubação de células NHDF. Pode ser visto a partir das figuras que a variante 1041-D11 se liga a células Wi38 vitais com alta especificidade a matriz extracelular contendo ED-B. Um controle usando células NHDF que não contêm baixo EDB foi realizado (dados não mostrados). As variantes não se ligam a aquelas células.

Experimentos similares foram realizados usando diferentes tipos de células, por exemplo, Balb3T3 (ATCC, Kat-Nr. 30-2002), Raw (Lonza, Kat-Nr. BE12-115F/U1), ST-2 (Lonza, Cat. N° BE12-115F/U1). As Figuras 15C e D mostram que a ligação a ED-B é altamente específico a células Balb3T3 e ST-2 murinas. Nenhuma ligação foi observada para monócitos/macrófagos (Raw)(dados não mostrados).

Como foi esboçado acima, a Figura 16 A mostra a especificidade de 1041-D11 em seções de tecido. Os tecidos tumorais F9 de sete amostras foram avaliados. A imunohistoquímica com 500 nM 1041-D11 teve como resultado a coloração vascular específica a ED-B em tumores F9 de camundongos. ED-B é um marcador altamente específico para a vasculatura tumoral. A proteína alvo EDB está localizada no lado abluminal dos vasos. 1041-D 11 especificamente decora a vasculatura em seções de tecido de tumores F9. Os resultados obtidos são comparáveis à especificidade de tecido do fragmento de anticorpo L19. Além disso, 48 tecidos foram testados; nenhuma coloração inespecífica em quaisquer dos 48 tecidos em painel relevante de FDA foi observada. A Figura 16 B mostra a acumulação de 1041-D11 em células tumorais em comparação com ubiquitina do tipo selvagem. Assim, as proteínas de fusão à base de ubiquitina modificada que se ligam especificamente a ED-B são adequadas em uma terapia direcionada à base de ED-B para o câncer.

Exemplo 7: Estudo da eficácia in vivo de 1041D11-TNFalfa

Para estabelecer a eficácia terapêutica de 1041-D 11-TNFalfa, o composto foi testado em teratoma F9 (ver Borsi et a!., 2003 Blood 102, 4384-4392) em modelos de camundongo. A expressão de ED-B em camundongos é comparável à situação in vivo humana e é adequada para uma avaliação do impacto terapêutico de 1041-D11-mTNFalfa sobre o câncer, preferivelmente em combinação com um composto citotóxico tal como Melfalano. O teratoma F9 é um tumor agressivo com alta densidade vascular. Borsi et al descreveram que o direcionamento de camundongo TNFalfa via anticorpos de EDB melhora a eficácia de Melfalano que é demonstrada pelo retardamento em crescimento tumoral. A programação experimental para o estudo de eficácia foi adaptado de Borsi, 2003.

Estágio 1 definiu a dose tolerável e farmacológica ativa com pontos finais em relação à razão de tumor vs. peso corporal, perda de peso e sobrevivência. Os inventores encontraram que 1041D11- TNFalfa é tolerado na dose mais alta (6,75 pmol/g), mas não tem efeito supressor sobre o crescimento tumoral (>10 % de peso corporal após 3, 4 e 8 dias animais foram mortos), ao passo que 1041D11-TNFalfa na dose mais baixa (0,25 pmol/g) parece retardar o crescimento tumoral. Os grupos de dosagem adicionais usados foram descendendo desde 2,25 pmol/g 1041D 11-TNFalfa.

Estágio 2 do estudo definiu a eficácia dependente de dose com Melfalano tendo como o ponto final o retardamento do crescimento tumoral (perda de peso do animal >10 %, tumor > 10 % de peso corporal, ulceração de tumor). No estudo, 1041D11/mTNFa, TNFa murino, em combinação com melfalano foram testados. 168 animais foram usados, 14 grupos de dosagem (8 camundongos por grupo recrutados ao portar tumores F9 de 300 - 400 mm3); A administração de amostra de teste i. v. seguido por injeção i. p. de Melfalano 24 h após Tabela 1 mostra a programação de dosagem:

A Figura 18 mostra o crescimento tumoral relativo durante o tempo de tratamento (7 dias). A Fig. 18a claramente mostra que o presente composto 1041-D 11-TNFalfa em combinação com Melfalano reduz o crescimento tumoral relativo mais eficientemente que mTNFalfa em combinação com Melfalano ou Melfalano em separado. A cinética de 5 crescimento tumoral 7 dias após o tratamento mostra a significativa redução de tumores por 1041-D11-mTNFa. Isto é uma clara evidência para eficácia em combinação com Melfalano. PUBLICAÇÕES 1. Birchier, M., F. Viti, L. Zardi, B. Spiess, e D. Neri. 1999. Selective targeting and photocoagulation of ocular angiogenesis mediated by a phage-derived human antibody 10 fragment. Nat Biotechnol 17:984-8. 2. Brenmoehl, J., M. Lang, M. Hausmann, S. N. Leeb, W. Falk, J. Scholmerich, M. Goke, e G. Rogler. 2007. Evidence for a differential expression of fibronectin splice forms ED-A and ED-B in Crohn's disease (CD) mucosa. Int J Colorectal Dis 22:611-23. 3. Dubin, D., J. H. Peters, L. F. Brown, B. Logan, K. C. Kent, B. Berse, S. Berven, B. Cercek, B. G. Sharifi, R. E. Pratt, e et al. 1995. Balloon catheterization induced arterial expression of embryonic fibronectins. Arterioscler Thromb Vase Biol 15:1958-67. 4. Goodsell, D. S. 2001. FUNDAMENTALS OF CANCER MEDICINE: The Molecular Perspective: Antibodies. The Oncologist 6:547-548. 5. Kaczmarek, J., P. Castellani, G. Nicolo, B. Spina, G. Allemanni, e L. Zardi. 1994. Distribution of oncofetal fibronectin isoforms in normal, hyperplastic and neoplastic human breast tissues. Int J Cancer 59:11-6. 6. Menrad, A., e H. D, Menssen. 2005. ED-B fibronectin as a target for antibody- based cancer treatments. Expert Opin Ther Targets 9:491-500. 7. Pujuguet, P., A. Hammann, M. Moutet, J. L. Samuel, F. Martin, e M. Martin. 1996. Expression of fibronectin ED-A+ and ED-B+ isoforms by human and experimental colorectal cancer. Contribution of cancer cells and tumor-associated myofibroblasts. Am J Pathol 148:579-92. 8. Trachsel, E., M. Kaspar, F. Bootz, M. Detmar, e D. Neri. 2007. A human mAb specific to oncofetal fibronectin selectively targets chronic skin inflammation in vivo. J Invest Dermatol 127:881-6. 9. Van Vliet, A., H. J. Baelde, L. J. Vleming, E. de Heer, e J. A. Bruijn. 2001. Distribution of fibronectin isoforms in human renal disease. J Pathol 193:256-62. 10. Lipovsek, D., e Pluckthun, A. (2004). In-vitro protein evolution by ribosome display and mRNA display. J. Immunol. Methods 290, 51-67. 11. Ohashi, H., Shimizu, Y., Ying, B.W., e Ueda, T. (2007). Efficient protein selection based on ribosome display system with purified components. Biochem Biophys. Res. Commun. 352, 270-276. 12. Studier, F.W. (2005). Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif 41, 207-234. 13. Zahnd, C., Amstutz, P., e Pliickthun, A. (2007). Ribosome display: selecting and evolving proteins in vitro that specifically bind to a target. Nat. Methods 4, 269-279.

Claims

1. PROTEÍNA CAPAZ DE SE LIGAR AO EXTRA-DOMÍNIO B (ED-B) DE FIBRONECTINA, caracterizada por compreender uma proteína ubiquitina hetero-dimérica modificada em que duas unidades de ubiquitina monoméricas são ligadas umas às outras em uma disposição cabeça-cauda, em que a proteína ubiquitina hetero-dimérica modificada tem uma sequência selecionada da lista que consiste em SEQ ID NO: 33 a SEQ ID NO: 47, e em que a dita proteína tem uma afinidade de ligação específica ao dito domínio ED-B de fibronectina de Kd = 10-7- 10-12M e exibe uma atividade de ligação monovalente com respeito ao dito extra-domínio B (ED-B) de fibronectina.

2. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelos monômeros de ubiquitina serem ligados diretamente ou por um ligante, preferivelmente um ligante que tem pelo menos a sequência GIG ou pelo menos SGGGG, preferivelmente ou SGGGGIG ou SGGGGSGGGGIG (SEQ ID NO: 32).

3. PROTEÍNA DE FUSÃO, caracterizada por compreender uma proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, fusionada a um componente farmaceuticamente ativo ou um componente de diagnóstico.

4. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por compreender o hetero-dímero de ubiquitina da SEQ ID NO: 33 ou 34 ou 47.

5. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por conter uma proteína capaz de se ligar ao domínio ED-B de fibronectina, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, ou uma proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, cada uma em uma quantidade farmaceuticamente eficaz, e um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

6. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por compreender ainda um ou mais agentes quimioterápicos, preferivelmente, selecionados a partir de melfalano, doxorubicina, ciclofosfamida, dactinomicina, fluorodesoxiuracila, cisplatina, paclitaxel e gencitabina; ou a partir do grupo de inibidores de quinase, ou radiofarmacêuticos.

7. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por ser na forma de uma preparação combinada ou na forma de um kit de partes.

8. POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado por codificar uma proteína recombinante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, ou proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 3 ou 4.

9. VETOR, caracterizado por compreender o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 8.

10. CÉLULA HOSPEDEIRA selecionada a partir de uma célula de bactéria ou uma célula de fungo, caracterizada por compreender uma proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, uma proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, um vetor conforme definido na reivindicação 9 e/ou um polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 8.

11. COMPOSIÇÃO DE DIAGNÓSTICO, caracterizada por compreender uma proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, ou uma proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 3 ou 4 com um veículo diagnosticamente aceitável.

12. MÉTODO PARA A GERAÇÃO DE UMA PROTEÍNA conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) proporcionar uma população de proteínas ubiquitinas diméricas diferentemente modificadas que se originam de proteínas ubiquitinas monoméricas, a dita população compreendendo proteínas ubiquitinas diméricas compreendendo dois monômeros de ubiquitina modificados ligados um ao outro em uma disposição cabeça-cauda em que cada monômero da dita proteína dimérica é diferentemente modificado pelas substituições de pelo menos 6 aminoácidos nas posições 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 e 68 da SEQ ID NO: 1, em que as ditas substituições compreendem (1) nas primeiras substituições de unidades monoméricas pelo menos nas posições de aminoácidos 6, 8, 63, 64, 65, e 66; e nas segundas substituições de unidades monoméricas pelo menos nas posições de aminoácidos 6, 8, 62, 63, 64, 65, e 66; opcionalmente adicionalmente 2; ou (2) nas primeiras substituições de unidades monoméricas pelo menos nas posições de aminoácidos 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65, e 66; e nas segundas substituições de unidades monoméricas pelo menos nas posições de aminoácidos 6, 8, 62, 63, 64, 65, e 66; opcionalmente adicionalmente 2; b) proporcionar o extra-domínio B (ED-B) de fibronectina como ligando potencial; c) colocar em contato a dita população de proteínas diferentemente modificadas com o dito extra-domínio B (ED-B) de fibronectina; d) identificar uma proteína ubiquitina dimérica modificada por um processo de rastreio em que a dita proteína ubiquitina dimérica modificada se liga ao dito extra-domínio B (ED- B) de fibronectina com uma afinidade de ligação específica de Kd em uma faixa de 10-7 - 10-12M e exibe uma atividade de ligação monovalente com respeito ao dito extra-domínio B (ED-B) de fibronectina, e opcionalmente e) isolar a dita proteína ubiquitina dimérica modificada com a dita afinidade de ligação.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela dita população de proteínas diferentemente modificadas ser obtida fusionando geneticamente duas bibliotecas de DNA que codificam cada uma das proteínas ubiquitinas monoméricas diferentemente modificadas.

14. MÉTODO DE GERAÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO conforme definida em qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, caracterizado por uma proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, ser fusionada a um componente farmaceuticamente ativo ou um componente de diagnóstico.

15. PROTEÍNA RECOMBINANTE conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 ou uma proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, caracterizada por ser para uso em um método de tratamento médico ou diagnóstico.

16. BIBLIOTECA, caracterizada por conter DNA que codifica proteínas ubiquitinas heterodiméricas modificadas conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2.

17. BIBLIOTECA DE PROTEÍNAS, caracterizada por ser obtida pela expressão das bibliotecas de DNA conforme definidas na reivindicação 16 e compreender a proteína ubiquitina heterodimérica modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2.