CN102753568A

CN102753568A - 用于识别具有结合配体能力的异源多聚体修饰的泛素蛋白质的方法

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Publication number: CN102753568A
Application number: CN2010800569116A
Authority: CN
Inventors: 安雅·库纳特; 约尔格·纳坎普; 阿诺德·施托伊尔纳格尔; 马库斯·菲德莱尔; 埃里克·菲德莱尔; 托马斯·戈特勒
Original assignee: Scil Proteins GmbH
Current assignee: Navigo Proteins GmbH
Priority date: 2009-12-14
Filing date: 2010-12-14
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2030-12-14
Also published as: JP2013513376A; RU2553333C2; JP5667207B2; WO2011073209A1; KR20120110171A; CN102753568B; US8748351B2; IL219755A0; US8921304B2; WO2011073208A9; US20130011334A1; EP2367843A1; WO2011073214A2; EP2379581A2; EP2513138B1; AU2010332938A1; BR112012014194A2; KR101353677B1; JP5749733B2; EP2379581B1

Abstract

本发明涉及用于识别具有结合配体能力的异源多聚体泛素的方法。此外，本发明提供编码所述异源多聚体泛素群的DNA库和由所述DNA库的表达获得的蛋白质库、包含所述DNA或蛋白质的细胞和噬菌体、编码所述融合蛋白（fusion proteins）的多聚核苷酸和包括所述多聚核苷酸的载体。进一步提供能够以高亲和力特异性地结合到所选择的配体上的基于异源多聚体泛素的新的结合蛋白质。

Description

用于识别具有结合配体能力的异源多聚体修饰的泛素蛋白质的方法

技术领域

本发明涉及识别具有结合配体能力的异源多聚体泛素的方法。此外，本发明提供编码所述异源多聚体泛素蛋白群的DNA库和由所述DNA库的表达获得的蛋白质库、包含所述DNA或蛋白质的细胞和噬菌体、编码所述融合蛋白的多聚核苷酸和包括所述多聚核苷酸的载体。进一步提供能够以高亲和力特异性地结合到所选择的配体上的以异源多聚体泛素为基础的新的结合蛋白质（binding protein）。

背景技术

对于由氨基酸组成的，但不是免疫球蛋白的结合分子的需求日益增加。迄今为止，虽然抗体代表确定的最好的结合分子，但是因为免疫球蛋白分子具有较大的缺陷，为了以高亲和力和高特异性靶向配体，仍然需要新的结合分子。尽管它们能很容易地制造且它们可指向几乎任何一个靶，它们仍然具有相当复杂的分子结构。仍然需要能够易于操作的更小的分子取代抗体。这些可替换的结合剂能有利地用于，例如诊断、预防和疾病的治疗的医疗领域。

蛋白具有相对确定的通常被称为蛋白质骨架的三维结构，且可作为用于设计所述可替换的结合剂的起始材料。这些骨架通常包含一个或多个区域，这些区域受特异的或随机的序列变化作用，且经常发生这种序列随机化，以制造蛋白质文库，从蛋白质文库中可选出特异的结合分子。预期具有比抗体更小的尺寸，且对靶抗原具有相当、甚者更好的亲和力的分子在药物动力学性能和免疫原性方面超过抗体。

先前的许多方法确实使用蛋白质骨架作为结合蛋白的起始材料。例如，在WO 99/16873中，开发对某种配体表现出结合活性的脂质运载蛋白（lipocalin）家族（所谓的Anticalin（一种抗体类似物））的修饰蛋白。利用遗传工程的方法，通过在其天然配体结合口袋（pocket）进行氨基酸置换，对脂质运载蛋白家族肽的结构进行修饰。类似免疫球蛋白，Anticalin可用于确定或结合分子结构。在某种意义上类似于抗体，柔性环形结构被修饰；这些修饰能够确定与天然配体不同的配体。

WO 01/04144描述在蛋白本身缺少结合位置β片结构中的蛋白表面上人工产生的结合域。通过这种方法重新产生人工的结合域，例如能够获得γ-晶状体球蛋白-一种眼睛晶体结构蛋白-的变体，其对配体具有高亲和力和特异性。和已经出现且由上述提及的拟抗体的柔性环形结构形成的结合位置的修饰相比，这些结合域重新在β片的表面上产生。然而，WO01/04144只描述用于产生新的结合性能的相对大的蛋白的变化。由于它们的尺寸，根据WO 01/04144蛋白仅能在遗传工程水平上通过需要某些努力的方法来修饰。此外，为了维持蛋白的整体结构，迄今为止公开的蛋白中只有总氨基酸相对小的百分数部分被修饰。因此，只有相对小的蛋白表面的区域是可用的，其能用于产生以前不存在的结合性能。而且，WO01/04144只公开对γ-晶状体球蛋白产生的结合性能。

WO 04/106368描述以泛素蛋白为基础的人工结合蛋白的产生。泛素是小的、单体的、和细胞溶质的蛋白，其序列高度保守且出现在所有已知的从原生动物到脊椎动物的真核细胞中。其在生物体的细胞蛋白的可控降解的调节中充当至关紧要的角色。为了这种目的，用于降解的蛋白在它们通往酶的级联反应期间共价地连接到泛素或多聚泛素链上，且由于这种标签选择性地降解蛋白。根据最近的结果，泛素或泛素的蛋白标签，也分别在其他细胞程序中充当重要的角色，例如几种蛋白的输入或其基因调节。

除了它的生理机能的阐明之外，由于它的结构和蛋白化学性质，泛素是主要的研究目标。泛素的多肽链由76个在非常紧密的α/β结构（Vijay-Kumar,1987）中折叠的氨基酸组成：几乎87%的多肽链涉及通过氢键的二级结构元件的形成。主要的二级结构是三个和半个α螺旋转角和由四股组成的反平行β片。这些元件的特征排列通常被认为是所谓的类泛素折叠基序（ubiquitin-like folding motif）-反平行β片暴露在后侧上的蛋白表面，其中α螺旋垂直地堆积在顶上。进一步的结构特征是蛋白内部α螺旋和β片之间标记的疏水区域。

因为它的小的尺寸，能通过化学合成和依靠生物科技的方法两种途径进行泛素的人工制备。由于有利的折叠性能，能通过遗传工程利用微生物例如埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli）以相对大的数量在细胞溶质或在外周胞质空间制造泛素。因为外周胞质中占优势的氧化条件，后面的方法通常专供分泌蛋白的制造之用。由于简易和有效的细菌制备，泛素能用作其他外源蛋白的融合伴侣，以制备难于生产的产品。依靠融合，能获得溶解性改善的泛素并因此获得提高的产量。

与抗体或其他可替换的骨架相比，以泛素蛋白（也称作载脂蛋白拟抗体

）为基础的人工结合蛋白具有的优势是小尺寸和高稳定性、高亲和力、高特异性、有效的微生物制造成本、和血清半衰期的调整。然而，按照免疫原潜在、快速和预兆的潜伏期发展轨迹和新的治疗途径，仍然需要进一步地开发这些蛋白质。为了获得人造的结合蛋白，WO 05/05730总体描述了泛素骨架蛋白的用途，为了获得结合配体如半抗原和抗原更高的和更特定的亲和力，例如，蛋白质和肽和它的抗原决定基，没有提供如何修饰和如何有效地选择这种修饰的泛素蛋白质的解决办法。

WO 05/05730中描述的方法涉及修饰的泛素蛋白的单体或涉及修饰的泛素的结合蛋白（偶联蛋白）。结合（偶联）形式是通过筛选和选择一个、两个或更多的修饰的泛素蛋白产生的，且然后通过遗传的或化学的方法连接它们，以便获得结合（偶联）的形式，例如结合（偶联）形式能够通过一个结合（偶联）泛素分子多特异性的结合不同类型的配体。一个实施例中，与单独修饰的泛素分子相比，为了增加结合亲和力，描述了两种同样的基于泛素的蛋白质（同型二聚体）的位置定向的结合（偶联）。

本发明的目标是提供如何识别具有配体高结合能力的多聚体泛素蛋白质的方法。本发明的进一步目标是提供识别新的以修饰的泛素为基础的结合蛋白质的方法且能够具有高亲和力特异性地结合选择的配体的方法。

通过随附的独立权利要求的主旨解决上述描述的目标。本发明优选的实施例包括在从属权利要求中和具体实施方式、实施例和图形中。

发明内容

更具体地，本发明提供识别具有结合配体能力的异源多聚体修饰的泛素的方法，其包括下列步骤：

a）提供来源于单体修饰的泛素蛋白质的异源多聚体修饰的泛素蛋白质的群，所述群包括异源多聚体蛋白质，其包括以头尾排列连接在一起的两种或更多不同地修饰的泛素单体或至少一种修饰的泛素单体，其中至少通过位于SEQ ID NO:1的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66和68处的至少三个氨基酸中的表面暴露的氨基酸的取代而对每一个所述异源多聚体蛋白质的所述单体的至少两个进行不同地修饰，所述修饰的单体蛋白与未修饰的泛素蛋白质具有的氨基酸序列同一性为至少80％或至少90％或至少95％；

b）为所述不同修饰的蛋白质的群提供潜在的配体；

c）使所述不同地修饰的蛋白质的群与所述配体接触；

d）通过筛选方法识别修饰的异源多聚体蛋白质，其中所述修饰的多聚体蛋白以Kd的范围是10^-7-10^-2M的特定的（特异性）结合亲和力结合所述配体，且对于所述配体表现出单价的结合活性；和可选地

e）利用所述结合亲和力分离所述异源多聚体修饰的泛素蛋白质。

用于该申请中重要的术语的定义

术语“泛素蛋白质”包括与SEQ ID NO:1一致的泛素和与下列定义一致的它的修饰。真核生物体中的泛素是高度保守的。例如，在所有迄今为止调查的哺乳动物中泛素具有同样的氨基酸序列。显著首选的是来自人类、啮齿动物、猪和灵长类的泛素分子。此外，能利用任何其他真核来源的泛素。例如酵母的泛素与SEQ ID NO:1的序列只有三个氨基酸的不同。通常，由所述术语“泛素蛋白质”包括的泛素蛋白质与SEQ ID NO:1显示超过70％的氨基酸同一性，优选地超过75％或超过80％的、超过85％、超过90％、超过95％、超过96％或达到97％的序列同一性。

为了确定泛素衍生物与SEQ ID NO:1的氨基酸序列同一性的程度，例如，能利用SIM Local类似程序（Xiaoquin Huang and Webb Miller,″Advances in Applied Mathematics,vol.12:337-357,1991）或者Clustal,W.（Thompson et al.,Nucleic Acids Res.,22(22):4673-4680,1994.）。优选地，相对于SEQ ID NO:1的全部序列，修饰蛋白与SEQ ID NO:1序列同一性的程度是确定的。

本说明书中，术语“配体”和“受体”和“结合伴侣”都是同义使用的且能互换。配体是具有此处定义的能够利用亲和力结合异源多聚体修饰的泛素蛋白的任何分子。

本发明的“异源多聚体融合蛋白”或“异源多聚体蛋白”被认为是包括一个或更多不同修饰的单体泛素蛋白的蛋白质。因此，本发明的“异源多聚体”被认为是具有两个相互作用的结合域区域的至少两个不同修饰的单体泛素蛋白的融合，其中两个结合域区域为具体的结合伴侣共同提供单价的结合性能。优选的是异源二聚物或异源三聚物。

依照本发明，至少两个不同地修饰的结合到一个配体上的泛素单体利用例如遗传方法通过首尾融合而彼此连接。不同地修饰的融合的泛素单体以单价的方式结合且如果两个结合域区域（“BDR”）共同起作用，不同修饰的泛素单体才是有效的。形成异源多聚体蛋白的修饰的和连接的泛素单体通过单个临近的结合区域结合到相同的抗原决定基上。这种异聚体的临近区域是由至少两个模块的两个结合决定区域形成的，其中两个模块是由至少两个不同地修饰的泛素单体形成的。

“首尾融合”应理解成通过依靠包含在多聚体中的大量单元以N-C-N-C-方向连接在一起的两个或更多蛋白质的融合。这种首尾融合中，泛素能够没有任何连接子而直接地连接。可替换地，能通过连接子完成泛素单体的融合，例如，具有至少氨基酸序列为GIG或具有至少氨基酸序列为SGGGG的连接子或任何其他连接子，例如GIG、SGGGG、SGGGGIG、SGGGGSGGGGIG或SGGGGSGGGG。现有技术中也已知且能够利用用于两种泛素单体的遗传融合的其他连接子。概括地，为了获得修饰的泛素单体的融合蛋白，由两个、三个或更多不同地修饰的单体泛素蛋白的融合提供异源多聚体修饰的泛素蛋白。进一步的实施例中，至少一个泛素单体是未修饰的，而其他泛素分子的至少一个是修饰的。

术语“群”涉及由异源的核酸编码的异源的多肽混合的库。库由成员组成，该成员具有由核酸序列编码的单一多肽。库成员之间的序列差异是形成库中出现的多样性的原因。库可采取多肽或核酸的单一混合的形式，或可采取生物体或细胞的形式，例如细菌、病毒、动物或植物细胞等等，利用核酸的库进行转换。优选地，每一个单独的生物体或细胞只包含库的一个成员。有利地，为了容许核酸编码的多肽的制造，将核酸并入表达载体。因此，优选的方面，库可采取宿主生物体群的形式，每一个生物体包含一个或更多表达载体的拷贝，表达载体包含核酸形式的库的单个成员，表达载体能表达以便制造它的相应的多肽成员。因此，宿主生物体的群具有潜在地编码遗传上不同的多肽变体的大量全部内容。

例如通过遗传上地融合的各自编码不同地修饰的单体蛋白的DNA库，或以可替换的方式，提供所述的异源多聚体泛素蛋白质的群，其中修饰至少一个所述单体泛素蛋白质，将DNA翻译成异源多聚体融合蛋白，展示所述蛋白质并在修饰的异源多聚体泛素蛋白存在下筛选展示的蛋白质，异源多聚体泛素蛋白包含以首尾排列连接在一起的单体泛素蛋白，其中所述修饰的异源多聚体泛素蛋白质结合所述配体具有的特定的结合亲和力Kd的范围是10^-7-10^-2M，且对于所述配体表现单价的结合活性。为了获得异源二聚体泛素蛋白质，融合各自编码或至少一个编码不同地修饰的单体蛋白的两个DNA库，为了获得异源三聚体泛素蛋白，融合各自编码或至少一个编码不同地修饰的单体蛋白的三个DNA库，等等。进一步可替换的方式可以用于提供用于筛选的库。一个实例是蛋白质的化学合成，例如，通过固态技术和在它们的氨基酸成分中引入变体。本领域技术人员可以考虑并且发现其他有用的的选项深思熟虑的。因此，本发明不能理解成是对此处描述的实例的限制。

因此，本发明公开了一种方法，通过这种方法，依照由结合配体能力决定的功能性，提供多肽的所有组成成分，并且作为选择结果获得的多肽子集依照结合靶配体的能力用于进一步多轮选择，以便积聚和增加配体的结合亲和力。

本发明允许本领域的技术人员从选择的多肽的所有组成成分中，排除那些权利要求中指定的不能具有亲和力的结合到靶配体上的多肽。本发明允许本领域的技术人员为有用的且满足亲和力要求的多肽富集多肽的所选的所有组成成分。

本发明的最重要的一个关键点在于对靶分子具有单价的结合亲和力的修饰的异源多聚体泛素蛋白质的选择和后来的为结合亲和力负责的修饰的氨基酸的测定。

多聚化、优选二聚化的进一步的优势在于氨基酸残基数量的增加，氨基酸残基能被修饰以便产生新的高亲和力结合性能。优势是即使在更多氨基酸被修饰时，也维持蛋白质化学的完整性，而不减少所述的新形成结合靶分子的蛋白质的骨架的总体稳定性。一方面，为了产生特定的靶标的新的结合位置，能被修饰的残基的总数是增加的，因为能将修饰的残基分配到两个或三个或更多的单体泛素蛋白上。因此对应于修饰的单体泛素分子的数目，修饰的数目能是两倍或x-倍。总之，基于泛素的结合蛋白质的分子结构允许增加修饰的氨基酸的总数，因为所述修饰的氨基酸包括在两个或三个或更多的单体泛素分子上的。本方法提供识别具有一个单价特异性（对于一个单独的抗原决定基）的异源多聚体泛素分子。

“单价的”应该理解成修饰的二聚体（可选地三聚体或通常的多聚体）泛素的第一和第二（和可选地另外的）单体单元中形成的两种结合区域以协作的和组合的方式一起结合ED-B的能力，即，两种结合区域共同起作用以便形成单价的结合活性。所述异源二聚体分子中第一和第二修饰的泛素的每一结合区域分别地结合ED-B具有的效率和亲和力显然将低于二聚体分子。两种结合区域形成单一的（独特的）结合位点，该结合位点作为异源二聚修饰的泛素蛋白的表面上的氨基酸的临近区域形成，以致所述修饰的泛素比每一个单体蛋白单独结合到ED-B更加有效，因此所述修饰的泛素是切实可行的。依照本发明，没有在已经筛选了最有效的结合泛素分子之后连接两种单体蛋白而是在有异源二聚体泛素的情况下实施该筛选过程，这是非常重要的。在已经接收最有效的结合泛素分子之上的序列信息之后，可通过其他方法获得这些分子，例如，通过化学合成或通过遗传工程方法，例如，通过将两个已经识别的单体泛素单元连接在一起。应该理解，也可将此处提供的所有二聚体修饰的泛素蛋白的实例更改成三聚体或通常的多聚体修饰的泛素蛋白。

因此，具有用于结合伴侣的共同的结合位点的异源多聚体特别是异源二聚体的使用打开了引入增加的修饰残基数量的可能性，其中修饰的残基不能过度地影响最终结合分子的蛋白化学完整性，因为那些修饰残基的总数分布在两个或更多形成二或多聚体的单体单元上。所述异源多聚体修饰的泛素蛋白出现在蛋白质的库中。

通过在每一个单体泛素单元中不同地修饰挑选的密码子而已经建立例如至少两种不同的用于编码单体修饰的泛素蛋白质的DNA库之后，这些库遗传融合以获得编码异源多聚体修饰的泛素蛋白质的DNA分子。这些库的DNA翻译成蛋白质且依照本发明因此获得的修饰的异源多聚体蛋白与靶分子接触，以便如果确实存在结合亲和力，伴侣能够彼此结合。优选的修饰的泛素是异源二聚物。

本发明至关重要的方面是关于异源-多聚体，例如异源-二聚体的修饰的泛素蛋白质已经进行了接触和筛选方法（过程）。这个方法能够对那些提供对靶分子的单价结合活性的泛素蛋白质进行筛选。

依照本发明，单体修饰的泛素蛋白质不是在已经通过筛选最有效的结合泛素分子进行选择之后连接在一起，而是在有异源二聚体泛素的情况下实施筛选过程，这是特别重要的。然而，应该注意，在已经获得（接收）最有效的异源多聚体泛素结合分子的序列信息之后，也可通过任何其他的方法获得这些分子，例如，通过化学合成或通过遗传工程方法，例如，通过将两个已经识别的不同地修饰的单体泛素单元连接在一起，以便形成异源二聚体结合蛋白质。

依照本发明，优选地通过适当的表达和选择方法，例如噬菌体展示、核糖体展示、TAT噬菌体展示、mRNA展示或细胞表面展示、酵母表面展示或细菌表面展示方法，优选地依靠核糖体或噬菌体展示方法，来进行接触，。为了完全公开，也可以参考下列参考文献：Hoess,Curr.Opin.Struct.Biol.3(1993),572-579;Wells and Lowmann,Curr.Opin.Struct.Biol.2(1992),597-604;25 Kay et al,Phage Display of Peptides and Proteins-ALaboratory Manual(1996),Academic Press。上述提到的方法都是本领域的那些技术人员已知的且依照本发明可以使用，包括其变化/修饰方法。

依照本发明优选地通过一个或更多下列方法：酶联免疫吸附实验（ELISA）、表面等离子共振技术（surface plasmon resonance spectroscopy）、体积排阻色谱法（size exclusion chromatography）、荧光各向异性（fluorescence anisotropy）、荧光光谱（fluorescence spectroscopy）、FACS、等温滴定温量热仪（isothermal titration calorimetry）、和分析超速离心（analytical ultracentrifugation），能确定修饰的蛋白质是否具有对预定的结合伴侣的可定量的结合亲和力。通过专家的常识，也能利用本领域中可用的其他方法。

“异源多聚体”此处被认作是包括至少两个不同的单体泛素蛋白质的蛋白质。本发明的“异源二聚体”被认为是两个不同地修饰的单体泛素蛋白的融合。两者对特定的结合伴侣均表现组合的单价结合性能。强调的是本发明的修饰的多聚体（例如，二聚体）配体结合泛素蛋白质不是通过分别地筛选每一个单体泛素蛋白然后组合它们中的至少两个获得的，而是通过筛选由第一和第二或进一步的单体单元组成的多聚体（可选地二聚体）蛋白质获得的，单体单元一起表现所述配体的单价结合活性。每一个所述子单元对配体表现相当有限的结合亲和力，而只有组合的多聚体或二聚体修饰的泛素具有本文描述的极好的结合性能，这是期望的。

在一个实施例中，所述方法涉及识别修饰的异源二聚体泛素蛋白质，其中两个单体泛素单元以首尾排列的方式连接在一起，其中通过在SEQID NO:1的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66和68处至少3个、优选至少6个氨基酸（它们中每一个都是暴露在表面的）的取代，不同地修饰所述二聚体蛋白质的每一个单体，其中所述取代包括

（1）第一个单体单元中至少在氨基酸位置6、8、63、64、65和66的取代；和

在第二单体单元中至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65、和66的取代；可选地外加在氨基酸位置2的取代，或者

（2）第一个单体单元中至少在氨基酸位置2、4、6、62、63、64、65和66的取代；和

第二单体单元中至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65和66的取代；可选地外加在氨基酸位置2的取代，

和可选地进一步的修饰，优选地其他氨基酸的取代，所述修饰的单体泛素单元与SEQ ID NO:1具有的氨基酸同一性为由80％、至少83％、至少85％、至少83％和至少90％组成的组中的至少之一，所述蛋白质对于配体具有的特定的结合亲和力Kd＝10^-7-10^-2M且所述蛋白质对于所述配体表现单价的结合活性。

本发明的进一步实施例中，在每一个单体泛素单元中修饰SEQ ID NO:1的位置2、4、5、6、8、62、63、64、65、66、和68中的6、7、8、9个或所有的氨基酸。应该理解本发明允许在每一个单体单元中（例如，在第一和第二单元中）的这些变体的每一个的组合。例如第一单体单元能包括6处修饰而第二单元包括7或8处修饰，第一单元可包括8处修饰和第二单元包括7处修饰等等。上述列出的每一个氨基酸能在第一和第二单元中选出，然后两个单元组合。本文下面描述优选的取代。

具体实施方式

修饰的异源多聚体泛素蛋白的展示方法

在下文和实施例中描述了适于这个申请的噬菌体和核糖体展示程序。依照本发明，它们被描述作为选择过程的实施例，以便检测泛素的变体，其显示对此处描述的潜在的配体的结合性能。同样地，例如能利用细菌（细菌表面展示；Daugherty et al.,1998,Protein Eng.11(9):825-832）或酵母细胞（酵母表面展示；Kieke et al,1997 Protein Eng.10(11):1303-10）或无细胞选择体系（cell-free selection systems）例如核糖体展示（Hanes andPluckthun,1997 Proc Natl Acad Sci USA.94(10):4937-4942;He and Taussig,1997_Nucleic Acids Res analytical ultracentrifugation,.25(24):5132-5134）或cis展示（Odegrip et al,2004 Proc Natl Acad Sci USA.101(9):2806-2810）或mRNA展示上表现的方法。在后面的情形中，利用核糖体通过将蛋白质变体与适当的mRNA结合（偶联）获得基因型和表现型短暂的物理连接。

在此处描述的噬菌体展示程序中，泛素的重组变体出现在丝状噬菌体上，而出现的变体的译码DNA同时出现，且以单链形式包装在噬菌体包膜中。因而，在亲和力富集的结构中，能够从库中选出具有某些性能的变种且能分别通过适当的细菌感染或增加另外的富集循环扩增它们的遗传信息。通过遗传的融合到对氨基末端信号序列上-优选的PelB信号序列-和噬菌体的衣壳或表面蛋白质-优选的是羧基末端融合到衣壳蛋白pIII或它的碎片上，获得噬菌体表面上的突变的泛素的表达。此外，编码的融合蛋白能包含进一步的功能元件例如，用于通过亲和色谱法检测和/或纯化的亲和标签或抗体抗原决定基或在亲和富集期间用于融合蛋白的特定断裂的蛋白酶识别序列。此外，例如能在泛素变体的基因和噬菌体衣壳蛋白的译码区域或它的碎片之间出现琥珀终止子，部分地由于一个氨基酸的引入，在适当的抑制基因（suppressor strain）的翻译期间不能辨别琥珀终止子。

在对特定的靶标具有结合性能的泛素变体的分离的背景中，适合于选择过程（步骤）的且融合蛋白的基因表达盒（gene cassette）插入其中的细菌载体优选是噬菌粒。其中，它包含丝状噬菌体（例如M13或f1）或它的部分的基因间隔区，在依靠辅助噬菌体例如M13K07携带噬菌粒的细菌细胞的双重感染的情况下，其导致共价的环状噬菌粒DNA组装成噬菌体衣壳。以这种方式产生的噬菌体颗粒是通过细菌分泌的，且由于在它们表面上对衣壳蛋白pIII或它的碎片的融合，噬菌体颗粒提供各自在它们表面上编码的泛素变体。天然的pIII衣壳蛋白出现在噬菌体颗粒中，所以保留它重新感染适当的细菌株的能力，且因此保留扩增的相应的DNA的可能性。因而，确保泛素变体的表现型和它的基因型之间的物理连接，表现型例如，它的潜在的结合性能。

根据出现在其上的泛素变体与任何靶分子的结合，例如，ED-B、肿瘤坏死因子、MIA-2、NGF、IgG或其他靶，依靠本领域技术人员已知的方法能选择获得的噬菌体颗粒。为了这个目的，出现的泛素变体能短暂地固定在靶物质界限上，例如，微量滴定板上（microtiter plates）且在分离出非结合的变体之后能特定地洗脱。通过基础溶液优选地实行洗脱，例如100mM三乙胺。可替换地，洗脱能在酸性条件下通过蛋白质水解或感染的细菌的直接加入来实行。通过泛素变体选择和扩增的连续循环，能再次扩增和富集以这种方式获得的噬菌体颗粒，其中泛素变体具有对例如，ED-B、TNFα、MIA-2、NGF、IgG或任何其他靶分子的结合性能。

噬菌体展示的变体是Tat噬菌体展示技术（Paschke,M.and W.Hohne(2005).Gene 350(1):79-88;see also EP 1567643）。使用这种方法，由噬菌粒编码的泛素变体通过双精氨酸转运（Tat）系统分泌，双精氨酸转运系统输出折叠的蛋白质，其中已经在细胞质中已经实现这些蛋白质的天然构造（Bruser 2007 Appl Microbiol Biotechnol 76(1):35-45）。分泌的需求是融合到特定的N-末端信号肽上，其指引泛素变体朝向Tat孔。在进入外周胞质空间以后，通过信号肽酶清除N-末端信号肽。在外周胞质空间中，泛素变体然后共价地连接到衣壳蛋白pIII或它的C-末端碎片和其他噬菌体蛋白质上，其中它的C-末端碎片开始通过Sec途径从细胞质分泌。通过pIII蛋白的N-末端上的Jun亮氨酸拉链和泛素变体的C-末端上的Fos亮氨酸拉链的高亲和力相互作用，实现泛素和pIII之间的这种连接。每一个亮氨酸拉链的N-和C-末端上外加的半光氨酸能够在两种蛋白质之间共价的连接，因此它们也能够在展示的泛素和它的噬菌体颗粒内的编码基因产物之间共价的连接。

当仍然以噬菌粒的形式，例如，融合到噬菌体上，或以可溶解的蛋白形式相应的基因盒克隆到适当的表达载体上之后，能完成以这种方式获得的泛素变体的进一步特性。适当的方法是本领域技术人员已知的或著作中描述的。特征能包括例如，DNA序列的测定和因而分离的变体的主要序列。此外，例如，依靠生物化学标准方法例如ELISA或表面等离子共振技术、尺寸筛析色谱法、荧光各向异性、荧光光谱、FACS、等温滴定量热法或分析超速离心法，能检测分离的变体的亲和力和特异性。由于稳定性分析，例如与化学或物理伸展有关的分光镜方法是本领域的那些技术人员已知的。其他已知的方法是CD光谱学、蛋白质荧光光谱和NMR光谱法。

本发明的进一步实施例中，在核糖体展示程序中依靠非细胞转录/翻译系统制备泛素变体，且作为具有相应的mRNA和核糖体的复合体出现。为了这种目的，上述描述的DNA库用作基础元素，其中变体的基因以与相应的表达和蛋白质生物合成的调整序列的融合的形式出现。由于在基因文库的3’末端终止密码子的缺失和由初期的蛋白质组成的三重复合体适当的试验条件（低温、高Mg²⁺浓度），在生物体外转录/翻译期间维持mRNA和核糖体。

通过在每一个单体泛素单元中挑选的氨基酸的不同地修饰，已经建立包含异源二聚体修饰的泛素蛋白质的蛋白质库之后，如果结合亲和力确实存在，依照本发明，修饰的二聚体蛋白质与靶分子接触，以便配体能够彼此结合。这些蛋白质库可以以展示方法库的形式展示，或利用任何其他方法呈现修饰的蛋白质，修饰的蛋白质在一定程度上能够在修饰的蛋白质和靶蛋白之间接触，其中所述展示方法可选地是噬菌体展示、核糖体展示、TAT噬菌体展示、细胞表面展示、酵母展示、细菌展示或mRNA展示方法。

修饰的异源多聚体泛素蛋白的潜在的配体和靶标（target，靶分子）

在下列典型的抗原上已经成功地建立了本发明：ED-B、TNF-α、MIA-2、NGF、和IgG。应该理解，仅选择这些抗原，以便显示在接收此处提供的信息之后，通过本领域的技术人员没有过度负担下能成功地执行目前描述的方法。本发明不限于这些特定的抗原，但是能够在本领域中已知的所有或至少大多数的配体和靶分子上执行。能够通过本领域的熟练的工匠在他的常识内选出那些靶分子。下列提供配体和靶分子和抗原和半抗原的一般定义，且也提供选出的进一步潜在的靶分子的实例。

依照本发明，通过目前描述的功能比得上抗体的修饰的泛素，抗原将涉及限制物质的能力。用于此处的可替换的术语是“配体”、“结合伴侣”、或“靶分子”。本发明修饰的泛素蛋白提供结合分子，其以相似的方式担当抗体的作用，且同时避免它的缺陷。术语抗原包括半抗原、肽、蛋白质、糖、DNA等。从Roche Lexikon Medizin（第四版本；Urban&10Fischer/Elsevier GmbH）能获得下列等义的抗原和半抗原，其也能用于本描述。

抗原（AG）：通过免疫系统设计用作作为外来物质（非自身的）识别的任何物质。在大多数免疫反应情形中，开始引起免疫性（＝“免疫原”）；分别在过敏反应（＝“过敏原”）和遗传性过敏症（“遗传过敏原”）的情形中，这种免疫反应是放大的。AG诱导体液（抗原-抗体反应）和/或细胞防卫反应（见下文免疫性）。如果AG是容忍的（免疫耐受性），经过免疫系统它也被称作“耐受原”。有效的抗原是主要复合体和更高分子量的物质（蛋白体、多聚糖、核苷和许多合成的复合物），这些物质具有以化学方法可识别的功能性（决定性的），这些功能性是造成免疫反应的原因。分类为1）完整的AG，更高分子量的大部分且能够通过自身发生免疫反应，2）作为低分子质量半抗原（＝一半的抗原），在结合（偶联）到大的载体分子上之后，其只担当免疫原的作用。涉及例如作为外来地-、不同的-或同基因的、自体同源的AG；自体的、异体的、移植、抗癌病毒AG。

半抗原：简易的、低分子量的化学化合物，其分别地是造成抗原（AG）特异性的原因，或由于它的结构（决定性的）是造成抗体特异性结合能力的原因，但是与完整的AG相比，其不能产生过敏反应。在结合到称为载体的蛋白体上之后，其变成完整的抗原。

“配体”或“靶标（靶分子）”或“结合伴侣”是通过目前描述的修饰的异源多聚体泛素蛋白识别的分子。能够用于本发明的实践的配体的实例包括，但不限于，用于细胞膜受体的促效剂和拮抗剂、毒素和毒液、病毒抗原决定基、激素、激素受体、多肽、肽、酶、酶底物、辅助因子、毒品（例如麻醉剂、类固醇等）、外源凝集素、糖、核苷酸、核酸、低聚糖、蛋白质、和单克隆抗体。

总之，依照本发明，能利用作为结合伴侣的修饰的蛋白质，其提供所有生物学上和医学上积极的和有关的分子。将在下面以实例的方式描述可能的结合伴侣。然而，应注意，多数其他可能的配体能加入本列。类似于抗体和抗原之间的关系，通过进一步潜在的配体能完成潜在的结合伴侣的列。

本发明中，异源二聚体泛素的结合伴侣的实例是纤连蛋白额外域（ED-B）、细胞因子（肿瘤坏死因子α）（TNF-α）、MIA-2、免疫球蛋白或它的部分，例如完整的抗体，（例如，免疫球蛋白G），和生长因子（例如，NGF，例如，人类神经生长因子）。下面提供这些配体的简要描述。然而，强调所有这些配体是多年来本领域所熟知的且是各自技术领域中的专家所熟知的。因此，下列描述只是这些蛋白质的某些重要的参数的概要，因为其氨基酸序列也是已知的。

纤连蛋白额外域（ED-B）是小的结构域，其是通过可替换的初级RNA转录产物的片段插入到纤维蛋白分子中。已知ED-B涉及癌症和牛皮癣。显著地，在几乎所有人类固体瘤实体的原发损害和新陈代谢位置都检测到ED-B的高水平表达，包括胸腺癌、直肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、肝细胞癌、头和颈和人类皮肤癌、和颅内脑膜瘤、和神经胶母细胞瘤（intracraneal meningioma）（Menrad u.Menssen,2005）。此外，ED-B能结合到诊断试剂上且能顺利地用作诊断工具。一个实例是它在分子影像中的利用，例如，动脉粥样硬化斑块和癌症的检测，例如，通过癌症病人的免疫现象。可能用于许多进一步的诊断。

人类纤维蛋白的额外域B（ED-B）的91氨基酸的氨基酸序列在SEQID NO:2中示出。为了蛋白质的表达，已加入起始甲硫氨酸。在哺乳动物中ED-B是保守的，例如，在啮齿动物、牛、灵长类、食肉动物、人类等等中。其中与人类ED-B具有100％序列同一性的动物的实例是褐家鼠（Rattus norvegicus）、牛（Bos taurus）、小家鼠（Mus musculus）、马（Equuscaballus）、猕猴（Macaca mulatta）、家犬（Canis lupus familiaris）、和黑猩猩（Pan troglodytes）。

蛋白质MIA（“黑素瘤抑制活性”，也称作CD-RAP，“软骨源性维A酸敏感蛋白”）是在软骨细胞中表达，且由于它的体外抗增值性能其是最初被分离的。最初它是在黑素瘤细胞的细胞培养上清液（cell culturesupernatant）中检测到的且从那里分离。在蛋白质纯化和部分排序之后，在简并引物（degenerated primers）和RT-PCR（反转录聚合酶链式反应）的帮助下分离人类MIA cDNA片段。现在已知人类的、小家鼠的、牛的、褐家鼠的和斑马鱼的MIA序列。在EP1410803B1和US-2010/0212037中描述相关蛋白质MIA-2。这些文献并入此处以供参考。

主要通过巨噬细胞制造肿瘤坏死因子-α（TNF-α），一种多效性细胞因子，但是其他类型的细胞也产生它。证明TNF-α是有益的并具有病理活性。除了具有自我调节外，它具有生长刺激作用和生长抑制两种性能。TNF-α的有益功能包括通过调节机体的生理周期性维持动态平衡、对细菌、病毒、真菌和寄生的感染产生免疫反应、通过刺激纤维原细胞生长更替或改变受伤的组织和、如名字所暗示的，杀死某些肿瘤。在多种疾病中，已经暗示TNF-α作为介导媒介（媒介物）。

神经生长因子（NGF）是50年前发现的作为促进感觉和交感神经的生存和分化的分子的分泌蛋白质。NGF是已知作为神经营养素的神经营养因子家族的成员。NGF具有高亲和力的结合已知作为TrkA的原肌球蛋白受体激酶。NGF也能结合已知的受体p75，肿瘤坏死因子受体超家族的成员，NGF也与其他神经营养素相互作用。NGF的β链仅仅负责NGF的神经生长刺激活性。β链同源二聚化且并入更大的蛋白复合体中。NGF的结构和功能参考，例如，Sofroniew，M.V.et al.(2001)Annu.Rev.Neurosci.24:1217-1281;Weismann,C.and de Vos,A.M.(2001)Cell.MoT Life Sci.58:748-759;Fahnestock,M.(1991)Curr.Top.Microbiol.Immunol.165:1-26。

IgG抗体是大约150kDa由4条肽链组成的大分子。它包括2条大约50kDa的同源重链和2条大约25kDa的同源轻链，因此是四个一组结构的四聚物。两条重链彼此连接且通过二硫键与轻链连接。合成的四聚物具有两个共同形成类Y型的同源部分。分支的每一个末端包含同源的抗原结合位置。IgGs的Fc区域具有高度保守的N-糖基化位点。依附在这个位点上的N-多聚糖是复杂类型的主要的核心岩藻糖化双触角结构。此外，少量的这些N-多聚糖的也具有平分的GlcNAc和a-2,6连接的硅铝酸残基。

用于选择、富集和特征化所展示的蛋白质的方法

能依靠本领域的那些技术人员已知的方法进行异源多聚体修饰的泛素的选择，这些泛素就它们对于特定的配体的结合活性而言，具有Kd范围为10^-7-10^-12M的特定的结合亲和力。为了这个目的，出现例如在核糖体的复合体上的泛素变种能分别地短暂地固定在靶物质边缘上，例如，在微量滴定板上，或能在溶液中结合之后结合在磁性粒子上。在非结合变体的分离之后，具有结合活性的变体的遗传信息能特定地通过核糖体复合体的破坏以mRNA的形式洗脱。优选地利用EDTA完成洗脱。能分离以这种方式获得的mRNA且利用适当的方法反转录成DNA（反转录酶反应），且能再扩增以这种方式获得的DNA。

通过体外的转录/翻译、选择、和扩增的连续循环，能富集对预定的半抗原或抗原具有结合性能的泛素变体。

在相应的基因盒克隆到适当的表达载体之后，能以上述详述的可溶解蛋白质的形式进行以这种方式获得的泛素变体的进一步表征。适当的方法是本领域的那些技术人员已知的或在文献中描述的。

优选地，在具有对预定的结合伴侣的结合亲和力的蛋白质的检测步骤之后是检测的蛋白质的分离和/或富集的步骤。

在依照本发明修饰的泛素蛋白的表达之后，能通过本身已知的方法进一步纯化和富集泛素蛋白质。选择方法依赖本领域的那些技术人员本身已知的几种因素，例如，所使用的表达载体、宿主生物体、意欲使用的领域、蛋白质的大小和其他因素。为了简化纯化，依照本发明修饰的蛋白质能融合到具有增加的亲和力的其他肽序列上以分离材料。优选地，选择这种融合，其不能对泛素蛋白的功能性具有有害的影响，或者由于特定蛋白酶断裂位点的引入能够在纯化之后分离这种融合。这些方法也是本领域的那些技术人员已知的。

作为突变发生的起始点的未修饰的和修饰的泛素蛋白

术语“具有结合能力的蛋白质”或“结合蛋白质”涉及包括一个结合域（binding region,结合区域）的泛素蛋白质，这个结合域在下面进一步定义。结合域能涉及至少两个结合决定域（“BDR”）。每一个单体具有至少一个结合决定域；至少两个单体形成具有至少两个结合决定域的多聚体，其中至少两个结合决定域对一个抗原形成一个结合域。任何这种基于泛素的结合蛋白可包括不是结合结构域的附加的蛋白域，例如，多聚化部分（multimerization moieties）、多肽标签、多肽连接子和/或非蛋白质聚合体分子。非蛋白质聚合体分子的某些实例是羟乙基淀粉（hydroxyethylstarch）、聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯烃（polyoxyalkylene）。

例如通过将异源多聚体修饰的泛素蛋白质遗传翻译后地融合到具有多聚体化区域的效应分子上（例如，TNF-α），也能够进行异源多聚体修饰的泛素蛋白质的进一步多聚化。仍然进一步的实施例中，通过利用聚乙二醇（PEG）连接子实行进一步的多聚体化。仍然进一步的实施例中，所述多聚体化区域也担当药物学上的活性成分；一个实例是担当多聚体化区域和药物学成分的TNF-α。

修饰的异源多聚体的泛素蛋白

术语“修饰的泛素蛋白”涉及泛素蛋白质的修饰，这种修饰是通过氨基酸或它的组合的任何一个取代、插入或缺失实现的，而取代是最优选的修饰，其可通过上述描述的任何一个的修饰来补充。修饰的数目是严格地限制为所述修饰的单体泛素单元与SEQ ID NO:1具有的氨基酸同一性为由80％、至少83％、至少85％、至少83％和至少90％构成的组中的至少之一。因此，至多，修饰的氨基酸的总数，优选地在单体单元中的取代限制到相应到80％的氨基酸同一性的15个氨基酸。进一步可替换的是13、12、11、10、9、8、7、6、或5个修饰的氨基酸。二聚体泛素分子中修饰的氨基酸的总数，优选地取代是30个氨基酸，其相当于基于二聚体蛋白质的20％的氨基酸的修饰。进一步可替换的是二聚体泛素分子中28、26、24、22、20、18、16、14、13、12、11、10、9、9、7、6、或5个修饰的氨基酸。与由具有SEQ ID NO:1的基础单体序列的两个未修饰的单体泛素蛋白组成的二聚体泛素相比，二聚体修饰的泛素蛋白质的氨基酸同一性是选自由80％、至少83％、至少85％、至少83％和至少90％构成的组中的至少之一。

由本发明的方法获得的修饰的泛素蛋白质是重组设计的蛋白质，其对靶分子或配体或结合分子（其表达可替换地用于此处）具有新的结合亲和力。

术语“取代”也包括氨基酸的化学修饰，例如通过取代或向最初的氨基酸添加化学基团或残基。蛋白质的至少一个表面暴露的区域中的氨基酸的取代是至关紧要的，这种表面暴露区域中的氨基酸包括位于β片区域的至少一个β链上的氨基酸或放置在临近β链的多达3个氨基酸上的氨基酸。

通过本领域已建立的和已知的方法进行修饰。“任意修饰的核苷酸或氨基酸序列”是在许多位置中已经插入、缺失或通过核苷酸或氨基酸取代的核苷酸或氨基酸序列，其本性是不能预知的。在很多情形中，随机的核苷酸（氨基酸）或核苷酸（氨基酸）序列的插入将是“完全随机的”（例如，作为随机化合成的或PCR-介导的突变发生的结果）。然而，随机序列也能包含具有共同的功能特征的序列（例如，配体表达产物的反应）或者随机序列能随机的，表现为最终的表达产物具有例如不同氨基酸的平均分配的完全随机的序列。

为了将随机化的片段恰当地引入载体，依照本发明，按照定点PCR-介导突变的原则随机核苷酸引入表达载体，这是优选的。然而，对于技术人员其他选项是已知的，和例如将合成的随机序列库插入载体，这也是可能的。

为了通过融合PCR产生突变体或库，例如可进行三个PCR反应。进行两个PCR反应，以便产生部分地重叠的中间片段。进行第三个PCR反应以便融合中间片段。

构建库或突变体变种的方法可包括在期望的限制位点周围构建第一组引物（限制位点引物），正向和反向限制引物，和在例如感兴趣的密码子的上游和下游周围构建第二组引物（诱导有机体突变的引物），正向和反向诱导有机体突变的引物。一个实施例中，直接地在感兴趣的密码子各自的上游和下游构建引物。限制和诱导有机体突变的引物用于构建第一中间片段和第二中间片段。两个PCR反应产生这些线性中间产物片段。每一个这些线性中间产物片段包含至少一个感兴趣的密码子的突变、侧翼核苷酸序列和酶切位点。第三PCR反应使用两个中间片段和正向和反向限制引物，以便产生融合的线性产物。相反，这里利用限制酶酶切线性产物的独立末端，以便在线性产物上形成粘性末端。通过DNA连接酶的使用融合线性产物的粘性末端，以便产生环状产物，例如，环状多聚核苷酸序列。

为了构建中间片段，实行了两组正向和反向引物的设计和合成，第一组与它的侧翼核苷酸序列一起包含限制性酶酶切位点，和第二组包含至少一个感兴趣的密码子的变种（诱导有机体突变的引物）。本领域的那些技术人员将认可，许多变种将依赖许多期望的变种氨基酸的修饰。发明者设想，如果在这个方法中利用其他限制性酶，则可相应地改变这种酶切位点的精确位置和相应的正向和反向引物的序列。本领域可利用其他方法且可代替地使用其他方法。

除了依照本发明将表达产物的随机化片段引入骨架之外，还通过将随机化的核苷酸序列融合到编码至少一种融合伴侣的核苷酸序列上来将随机序列连接到融合伴侣上，这是经常必需的。例如，这种融合伴侣能促进表达和/或纯化/分离和/或表达产物的进一步的稳定性。

为了纯化的目的，融合伴侣能包括纯化标签例如His6标签、myc标签、BSP生物素靶序列、BirA、flu标签、lacZ、和GST。此外，融合伴侣可包括分选信号或靶向序列（targeting sequence）。

依照本发明，可利用任何期望的氨基酸进行用于产生对靶分子具有特异性的新的结合结构域的氨基酸的取代，即，为了产生对靶分子的新的结合性能的修饰，并不必须关注氨基酸具有特殊的化学性能或侧链，其与取代的氨基酸类似，因此任何期望的氨基酸能用于这种目的。

依照本发明，优选地通过在遗传水平上的变异发生，优选地通过随机的变异发生，即，所选择的氨基酸的随机取代，进行所选择的氨基酸的修饰的步骤。优选地，依靠遗传工程的方法执行泛素的修饰，这种遗传工程方法用于属于各自蛋白质的DNA的改变。优选地，然后在原核或真核生物体中进行泛素蛋白质的表达。

特别在β片的四个β链的表面暴露的氨基酸中或者在达到3个临近泛素蛋白的β片链的氨基酸的表面暴露氨基酸中进行取代。每一个β链通常由5-7个氨基酸组成。对于SEQ ID NO:1，例如，单体泛素的β链通常包括氨基酸残基2-7、12-16、41-45和65-71。额外地和优选地修饰的区域包括临近β片链达到3个氨基酸（例如，1、2或3）的位置。额外地和优选地修饰的优选区域特别包括氨基酸残基8-11、62-64和72-75。优选的区域包括连接两个β链的β转角。例如一个优选的β-转角包括例如氨基酸残基62-64。接近地临近β链的最优选的氨基酸是位置8的氨基酸。另外，氨基酸取代的进一步优选的实例是位置36、44、70、71和/或73。例如，那些可额外地和优选地修饰的区域包括氨基酸62、63和64（3个氨基酸），或72、73（2个氨基酸），或8（1个氨基酸）。

可添加或缺失的氨基酸的数目限于单体泛素子单元中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个或更多的氨基酸，和关于异源二聚物泛素蛋白质的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、24、26或28个氨基酸，通常是单体蛋白质中修饰的数目是X-倍。通常，单体分子中插入的数目包括1-10个氨基酸和/或1-7个氨基酸的缺失。取代的数目是每个单体分子至少6个和最多14个氨基酸的取代。二聚体分子总共包括至少12和最多28个取代，和/或总共至少一个和最多20个插入和/或至少一个和最多14个缺失。本发明能利用在中间的所有数目并涵盖在本发明中，和缺失、插入和取代数目的所有组合可能提供维持分子的全部结构完整性。本发明的一个实施例中，维持β片结构。

可选择的实施例中，通过氨基酸取代改变氨基酸残基。然而，也可允许缺失和插入。可添加或缺失的氨基酸数目限于单体泛素子单元中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，和关于二聚体泛素蛋白相应地1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个氨基酸。一个实施例中，没有进行氨基酸的插入。仍然进一步的实施例中，没有缺失。

假如本发明的修饰的泛素蛋白包括权利要求中指定的外加的所述取代和也包括此处说明的缺失和/或一个或更多氨基酸的增加，特定的野生型人类泛素（SEQ ID NO:1）的氨基酸位置必需与修饰的泛素比对，以便彼此分配相应的蛋白质。融合蛋白的情况中（见下文），以相同的方式完成每一个单体泛素子单元的编号（和比对），例如，二聚体的比对是在每一个各自的子单元的氨基酸位置1起始的。

优选地来自哺乳动物例如人类的单体泛素蛋白中，在β链中或在临近β片链达到3个氨基酸的位置至少10％的氨基酸，优选地至少20%,进一步优选地至少25％，能被修饰，优选地被取代。在β链中或临近β片链达到3个氨基酸的位置的优选地最多大约50％的氨基酸，进一步优选地最多大约40％或大约35％或高达大约30％或高达大约25％是被修饰的，优选地被取代。一个β链中，通常一个到四个氨基酸被修饰。一个实施例中，修饰β链中六个氨基酸中的两个，优选地在第一和第四β链中，例如，氨基酸残基2-7或65-71的区域。

依照本发明，修饰的单体泛素用作异源多聚物基础成分，说明了总数达到20％的氨基酸是被修饰的。考虑到这个方面，修饰的泛素蛋白与SEQID NO:1的序列同一性至少是80％。本发明的进一步实施例中，氨基酸水平上的序列同一性是至少83％、至少85％、至少87％和更进一步的至少90％、至少92％或至少95％的与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的序列同一性。与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比，本发明也包含氨基酸序列同一性超过97％的修饰的泛素蛋白质。

本发明的进一步实施例中，已经预修饰的泛素（其中已经修饰位置2、4、6、8、62、63、64、65、66中3或4或5或6或7个氨基酸和/或SEQ ID NO:1的位置68中的氨基酸）被用作进一步修饰的起始位点，以便对靶分子产生结合性能，且可获得泛素，其中总数达到SEQ ID NO:1的泛素的9、10、11、12、13、14个和最大限度的15个氨基酸被修饰，优选地被取代。例如，进一步的修饰能包括氨基酸74和75或氨基酸45上的修饰，以便产生更好的稳定性或蛋白质化学性能。依照实例，能以这种方式获得的作为异源多聚体的蛋白质基础成分的修饰的单体泛素具有14个取代和缺失。在泛素的氨基酸的总数上这对应大约20％的百分比。这是非常不可思议的且不是预期的，因为通常低得多的百分数已经足够打乱蛋白质的折叠。

本发明的一个实施例中，修饰那些氨基酸，以便具有新的结合性能的区域的产生，这些结合性能在蛋白质的表面上形成邻近区域。以这种方式，能产生邻近区域，其对目标配体具有结合性能。依照本发明，“邻近区域”涉及以下：由于电荷，立体结构和它们侧链的疏水性/亲水性，氨基酸以相应的方式与它们的环境相互作用。环境可以是溶剂，通常水，或其他分子，例如，空间地接近氨基酸。依靠蛋白质的结构信息和各自软件，能表征蛋白质的表面。例如，以这种方式能显现蛋白质的原子和溶剂之间的界面区域，其中这种方式包括如何构成这种界面区域的信息，其表面区域易接近溶剂或在表面上电荷如何分布。例如利用适当的软件通过这种类型的显像能显示邻近区域。这种方法是本领域那些技术人员已知的。依照本发明，基本上，整个表面暴露区域也能用作表面上的邻近区域，以便修饰用于新的结合性能的产生。一个实施例中，这种目的的修饰也能包括α-螺旋区域。异源二聚体修饰的泛素蛋白中，结合决定区域包括共同形成的一个邻近区域的两个表面暴露区域，一个邻近区域包括一个结合决定区域的长度的两倍。

在包括β片区域的至少一个β链或邻近β片链达到3个氨基酸的位置的蛋白质的至少一个表面暴露的区域中的氨基酸的修饰是至关紧要的。“β片结构”定义为基本上是片状的且几乎是完全伸展的。与由连续的多肽链部分形成的α螺旋相比，β片能由不同的多肽链区域形成。这种方式中，在主要的结构中进一步分离空开的区域能进入彼此亲近区域。β链代表性地具有5-10个氨基酸的长度（泛素中通常5-6个残基）且具有几乎完全伸长的构造。β链彼此如此接近因此一个链的C-O基团和另一个链的NH基团之间形成氢键，反之亦然。β片能由几条链形成且具有片状结构，其中C α原子的位置交替地在片状平面的上面或下面之间。氨基酸侧链沿着这种模式和，因此，可替换地点对着顶端或对着底部。依靠β链的方向，片可分为平行和反平行片。依照本发明，两者都能转换且用于制备需要的蛋白质。

对于β片结构的变异发生，在接近表面的泛素中选择β链区域或邻近β片链达到3个氨基酸的位置。使用相关的有用的X-射线晶体学结构能识别表面暴露的氨基酸。如果晶体学结构是不可用的，依靠计算机分析做出尝试，以便预知表面暴露的β片区域和关于有用的一级结构的个别氨基酸的可达性或者模拟3d蛋白质结构和用这种方式获得关于潜在的表面暴露的氨基酸的信息。能进一步结合它的公开，例如，J.Mol.Biol.,1987 Apr 5;194(3):531-44.Vijay-Kumar S,Bugg C.E.,Cook W.J.。

然而，在β片中或邻近β片链达到3个氨基酸的位置实行修饰也是可能的，因为能省略被诱变的氨基酸位置的消耗时间的预选。编码β片结构或邻近β片链达到3个氨基酸的那些DNA区域是从它们的DNA环境中分离的，这些DNA环境受到随意的突变发生和然后那些DNA区域再恢复成译码蛋白质的DNA，它们是先前从蛋白质中清除的。这之后跟随的是具有期望的结合性能的突变体的选择工艺。

本发明的另一个实施例中，β链区域或表面附近邻近β片链多达3个氨基酸，像上述解释过的那样被选择，且在这些选择的区域内识别将被诱变的氨基酸位置。用这种方法选取的氨基酸位置可在DNA的水平被诱变，也通过位置导向的突变，也就是说，一个特定的氨基酸密码子译码被另外一个之前选择的密码子编码氨基酸所代替，或者这种突变在随机突变的环境下执行，其中，定义即将被取代的氨基酸位置，但它不是新的密码子编码，也不是决定的氨基酸。表面暴露的氨基酸是易受周围溶剂影响的氨基酸。与三态甘氨酸-X-甘氨酸模式中的氨基酸的易受影响性相比，如果蛋白质中的氨基酸的易受影响性超过8％，则氨基酸就被称为“表面暴露的”。这些蛋白质区域或个别的氨基酸位置也分别是潜在的结合伴侣优选的结合位置，因为结合伴侣的选择将依照本发明实行。另外，参考Casteret al,1983 Science,221,709-713,和Shrake&Rupley,1973 J Mol Biol.79(2):351-371,其全部的公开包含在这个申请中以供参考。

通过各自序列片段的定向突变，能够产生泛素变体。这种变体不同于在重新产生的来自于亲本蛋白质和来自于各自的蛋白质的人造结合位置区域的氨基酸置换。在此情形下，具有某些性质，例如极性、电荷、溶解性、疏水性或亲水性的氨基酸，能分别被具有其他特性的氨基酸代替或取代。除了取代之外，术语“变异发生”与“修饰”和“代替”也包括插入和缺失。依照本领域技术人员所知的方法，也能通过氨基酸侧链的化学变化完成蛋白质水平上的修饰。

泛素变异发生的方法

作为各自序列片段突变发生的起始点，例如泛素的cDNA，其能通过利用本领域的那些技术人员已知的方法制备、改变、和扩增。对于相对小的第一序列（大约1-3个氨基酸）的区域中泛素的位置特定的改变，商业上可用的反应物和方法是现有的（“迅速的改变”，Stratagene；“诱变剂噬菌粒体外变异发生装置”，Biorad）。例如，对于聚合酶链式反应（PCR）的更大区域特定实施例的位置定向的变异发生是本领域那些技术人员可利用的。对于这种在期望的位置上合成具有退火碱基对组成的寡脱氧核苷酸的混合物的目的可被利用，例如用于突变的引入。这也能通过利用碱基对类似物获得，碱基对类似物不能自然地出现在染色体组DNA中，例如，次黄嘌呤核苷。

起始点对于β片区域的一个或更多β链或邻近β片链多达3个氨基酸的位置的变异发生可以是例如泛素的cDNA或也能是染色体组DNA。此外，用于泛素蛋白质的基因译码也能是合成制备。

本发明的一个实施例中，变异发生是通过携带氨基酸密码子NNK的DNA寡核苷酸的装配来完成的。然而，应该理解，也能利用其他密码子（三联密码）。突变是在β片结构优选地维持的方式中执行的。通常，变异形成发生在暴露在蛋白质表面上的稳定的β片区域的外面上。它包括位置指定变异和随意变异两种。位置特定的变异在原始结构中包括相对小的区域（大约3-5个氨基酸），此种变异能利用商业上可用的装置Stratagene

(QuickChange

)或Bio-Rad

Mutagene

phagemid in vitro mutagenesiskit)(cf.US 5,789,166;US 4,873,192)产生。

如果更多的延伸区域隶属于位置特定的变异，则必需制备DNA盒，其中，诱变的区域是通过包含突变和未改变位置的寡核苷酸的装配获得(Nord et al,1997 Nat.Biotechnol.8,772-777;McConell and Hoess,1995 J.Mol.Biol.250,460-470.)。通过在致突变菌株中DNA的繁殖或通过PCR扩增（易错PCR）能引起随机变异的发生（例如，Pannekoek et al.,1993 Gene128,135 140）。为了这个目的，使用具有增加错误率的聚合酶。为了分别增强引入的变异形成的程度或联合不同的突变，通过DNA改组的方法，组合PCR片段中的突变（Stemmer,1994 Nature 370,10 389-391）。这些关于酶的变异形成的策略的评论是在Kuchner和Arnold（1997）TIBTECH15,523-530的评论中提供的。为了在选择的DNA区域完成随机变异形成，也必需构建用于变异形成的DNA盒。

已知本质上用于变异发生的不同的程序是用于位置特定的突变发生的方法、用于随机变异发生的方法、利用PCR或类似的方法的变异。

本发明的优选的实施例中，诱变的氨基酸位置是预先确定的。完成要修饰的氨基酸的选择，以便满足本权利要求1关于那些必需要修饰的氨基酸的限制。每一个情形中，通常建立不同突变异种的库，其是利用本质上已知的方法进行筛选的。通常，要修饰的氨基酸的预选能特别容易地执行，因为对于要修饰的泛素蛋白质而言，有足够的结构信息可用。

对于定向变异和更长序列片段变异发生的方法，例如，依靠PCR，通过化学的变异发生或利用细菌突变菌株，属于以前的技术，依据本发明，这些方法也是可以用的。

本发明的一个实施例中，变异发生是通过携带氨基酸密码子NNK的DNA寡核苷酸的装配来完成的。然而，应该理解，也能利用其他密码子（三联密码）。突变是在β片结构优选地维持的方式中执行的。通常，变异形成发生在暴露在蛋白质表面上的稳定的β片区域的外面上。它包括位置指定变异和随意变异两种。位置特定的变异在原始结构中包括相对小的区域（大约3-5个氨基酸），此种变异能利用商业上可用的装置Stratagene(QuickChange

)或Bio-Rad

Mutagene

phagemid in vitro mutagenesiskit)(cf.US 5,789,166;US 4,873,192)产生。

依照本发明的一个实例，能特别容易地依靠PCR执行在单体泛素的位置2、4、6、8、62、62、64、65、66和/或68上的至少3个，更优的是至少6个氨基酸的随机取代，因为提及的位置是局部化接近蛋白质的氨基或羧基末端。相应地，要处理的密码子是在相对应的cDNA链的5’和3’端。因而，用作诱变的PCR反应的第一寡核苷酸——远离要变异的位置2、4、6、和/或8上的密码子——与泛素的氨基末端的译码链的序列一致。因此，第二寡核苷酸——远离要变异的位置62、63、64、65、66和/或68的密码子——至少部分地对应非译码链的多肽序列的羧基末端。利用作为模板的编码单体泛素蛋白的DNA序列，通过两种寡核苷酸，可完成聚合酶链式反应。

此外，利用侧面寡核苷酸能将获得的扩增产物添加到另一个聚合酶链式反应中，其中寡核苷酸为限制性核酸内切酶引入识别序列。依照本发明，首选的是将获得的基因盒引入到载体系统，载体系统适用于后来的选择过程，选择过程用于对预定的半抗原或抗原具有结合性能的泛素变体的分离。

依照本发明，可使用任何例如用于修饰的氨基酸实行氨基酸的取代，其用于对靶分子特定的新的结合区域的产生，以便对靶分子产生新的结合性能，注意氨基酸分别具有具体的化学性能或侧链，这不是强制性的，这类似于氨基酸的取代酸，因此任何期望的氨基酸能被用于这种目的。

依照本发明，优选地通过遗传水平上变异发生通过随机的变异发生，实行选择的氨基酸的修饰步骤，例如，选择的氨基酸的随机取代。优选地，依靠遗传工程的方法执行泛素的修饰，其中遗传工程方法用于属于各自蛋白质的DNA的改变。优选地，然后在原核或真核生物体中执行泛素蛋白的表达。

依照本发明，通过化学合成能进一步优选地制备修饰的泛素蛋白质。优选的实施例中，通过氨基酸取代改变氨基酸残基。然而，也允许缺失和插入。可选地，要插入或缺失的氨基酸的数目是1比10，1比5，2，3或4个氨基酸。一个实施例中，没有做出氨基酸的插入。一个仍然进一步的实施例中，没有实行缺失。

在做出上述的修饰之后，发明家已发现实施例中描述的氨基酸修饰的泛素序列，这些泛素序列结合它们的靶分子具有很高的亲和力（Kd值达到10^-10M）。

泛素中要修饰的区域

根据它们是否是选择的结合伴侣有用的和蛋白质的总体结构是否可能忍受修饰，从根本上选择修饰的区域。

除了表面暴露β链中的修饰之外，也能在蛋白质的其他表面暴露的区域中进行修饰，优选地在邻近β链高达3个氨基酸的位置中。这些修饰区域都涉及对靶分子重新产生的具有高亲和力的结合。

依照本发明另一个优选的实施例，能在单体泛素中修饰泛素、优选地哺乳动物或人类泛素的至少3或4或6个，可选地至少8、10、12个和最大15个表面暴露的氨基酸，其中优选的取代作为修饰。这包括泛素的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个表面暴露的氨基酸的修饰。这些至少3个和最大15个表面暴露的修饰的氨基酸然后形成对预先确定的结合伴侣具有结合亲和力的区域。此处这个区域被定义为“结合域区域”（“BDR”）。这个方面中，至少2个，可选地至少4个，进一步可选地至少6、8、10、12个和最大15个表面暴露的氨基酸是在β片区域中，例如，β片链中或分布在几个β链上或邻近β片链高达3个氨基酸的位置上，这是显著地优选的。所有修饰、优选地取代的氨基酸中的至少3个氨基酸是在初始序列中彼此直接地邻近，这是进一步优选的。

本发明的另一个可选择的实施例中，蛋白质中四个β链的一个或两个，优选地两个中的氨基酸或邻近优选地四个β链中的两个的高达3个氨基酸的位置上的氨基酸进行修饰，以便产生新的结合性能。可选择的是四个β链的三个或四个中的氨基酸或临近β链的三个或四个的高达3个氨基酸的位置的氨基酸的用于产生对选择的靶分子或配体的结合的修饰。

对氨基末端和羧基末端链或者邻近氨基末端和羧基末端链的高达3个氨基酸的位置中的氨基酸进行修饰，优选地取代，以便对配体或靶分子产生新的结合位置，这是显著地优选的。这个方面中，显著地优选的是，邻近羧基末端β片链的高达3个氨基酸被修饰，优选地取代，和修饰邻近氨基末端β片链达到1个氨基酸，优选地取代。

依照本发明，在它的氨基酸中修饰泛素，优选地通过取代，在哺乳动物泛素的下列位置的至少三个氨基酸中，优选地人类泛素：2、4、6、8、62、63、64、65、66、68。这些所述氨基酸的组中的至少三个氨基酸在泛素表面上形成邻近的表面暴露区域，其中发现泛素显著地适于具有结合亲和力的修饰的蛋白质的产生，对于特定的结合伴侣，例如，ED-B,TNFα,NGF,IgG,MIA-2,或者任何其他靶分子，结合亲和力是先前不存在的。必需修饰这些氨基酸残基中的至少三个。可选地修饰所述氨基酸残基的3、4、5、6、7、8、9或10位，优选地取代，可选地与附加的氨基酸残基结合。

为了确定泛素衍生物与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的序列同一性的程度的目的，例如，能利用SIM Local类似地程序（Xiaoquin Huang andWebb Miller,″Advances in Applied Mathematics,20 vol.12:337-357,1991），能自由的使用作者和他们的协会有用的多重联合分析（Thompson etal.,Nucleic Acids Res.,22(22):4673-4680,1994.）。优选地，相对于SEQ IDNO:1的完整序列，衍生物与SEQ ID NO:1的序列同一性的程度是确定的。

决定结合亲和力的方法是本身已知的，且能从下列方法中选出：ELISA、表面等离子共振技术（SPR）基础技术、例如通过Biacore

提供的、尺寸筛析色谱法、荧光各向异性、荧光光谱和等温滴定量热仪（ITC）。

仍然进一步方法，本发明涉及包括本发明的异源多聚体结合蛋白的融合蛋白，这种融合蛋白融合到药学上和/或诊断上的有效部分上；做出参考，例如US 7,838,629，其全部内容包括在此以供参考。

本发明的融合蛋白可包括非多肽成分，例如，非肽连接子、非肽配体，例如用于治疗学上或诊断上相关的放射性核素。它也可包括小的有机的或非氨基酸基础的混合物，例如，糖、寡聚或多聚糖、脂肪酸，等等。本发明的一个优选的实施例中，以泛素为基础的结合分子连接到肽、以氨基酸基础的连接子或配体或蛋白质上，其中蛋白质具有治疗学上或诊断上相关的性能。

结合特异性（分离常数）

依照本发明，融合蛋白的结合特异性是如上定义的对于非融合蛋白的Kd定义。依照本发明，术语“Kd”定义特定的结合亲和力，其根据本发明在范围10^-7-10^-12M之内。10^-5M和以下的值能够被认为是可定量的结合亲和力。依照本申请，10^-7到10^-11M的值优选的用于例如色析法应用，或者10-9到10^-12M是用于例如诊断或治疗的应用。进一步优选的结合亲和力范围为10^-7到10^-10M，优选地到10^-11M。

泛素的多聚化

依照本发明，遗传上通过首尾融合连接的至少两个不同地修饰的泛素单体结合到靶分子的相同抗原决定基上，例如，ED-B、TNFα、IgG、Mia-2、NGF或者任何其他靶分子上，且只有当两个结合域区域共同起作用则两个不同地修饰的泛素单体是有效的。或者换句话说，他们通过单个邻近的结合区域结合到相同的抗原决定基上，其中单个邻近的结合区域是由两个分子的两个结合区域的共同作用形成的。

单体能直接地连接或通过连接子连接。适当优选的连接子是SEQ IDNO:32的那些，或具有至少序列GIG，或者具有至少序列SGGGG或任何其他连接子，例如GIG、SGGGG、SGGGGIG、SGGGGSGGGGIG或者SGGGGSGGGG。然而，有很多可能用于替代的连接子。

库

进一步的方面，本发明涉及在包含编码上述描述的修饰的单体泛素蛋白的DNA库，其形成提供本发明的异源多聚体、优选地异源二聚体泛素蛋白质的基础。

本发明仍然进一步的方面中，提供包括DNA的融合库，其中DNA是通过如上述详述的两个库融合获得的；为了获得异源二聚体泛素融合蛋白，每一个库编码不同地修饰的单体泛素蛋白单元，它的单体单元以首尾排列连接在一起。所述编码泛素的异源二聚体的融合蛋白的库对特定的靶分子表现单价的结合活性。通过利用任何一个本领域技术人员已知的连接子或者此处描述的连接子实行所述的连接。“不同地修饰”也包括异源二聚体蛋白质中出现的一个可替换的未修饰分子。

实施例1略述复合体库的产物。然而，必需当心关于这种库的质量。骨架技术中库的质量是首先依靠它的复杂性（单独变体的数目）和功能性（合成的候选物的结构和蛋白质化学整体性）。然而，两种特征可彼此表现负面影响：通过骨架上修饰的位置的数目的增加增强库的复杂性，可导致变体的蛋白质化学特征的退化。这可能导致减少的溶解性、聚集和/或低产量。这样的原因是天然的骨架更大的反常，天然的骨架具有积极地有利的蛋白质包装。

因此，原始序列中引入尽可能多的变体以便为靶分子最优化它，另一方面，尽可能保存原始的最初序列以便避免蛋白质化学的负面效果，在这两者之间适当地构建这种骨架库，这是平衡操作。

异源二聚泛素蛋白中特定的修饰

依照本发明，泛素的异源二聚体对配体结合具有的Kd＝10^-7-10^-12M，且关于所述配体表现单价的结合活性，从下列两个可替换方案中选出泛素的异源二聚体：

（1）第一单体单元中至少在氨基酸位置6、8、63、64、65、和、66的取代；和

在第二单体单元中至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65、和66的取代；可选地另加在位置2的取代，和

（2）第一单体单元中至少在氨基酸位置2、4、6、62、63、64、65和66的取代；和

第二单体单元中至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65和66，可选地另加位置2的取代。

一个实施例中，融合蛋白是所述泛素蛋白质的遗传上的融合二聚物，其中泛素蛋白在第一泛素单体的位置6、8、63-66的氨基酸取代和在第二泛素单体的位置6、8、62-66、和可选地位置2的氨基酸残基取代，优选地

-第一泛素单体中的取代

位置6上的赖氨酸（K）到色氨酸（W）或苯丙氨酸（F），

位置8上的亮氨酸（L）到色氨酸或苯丙氨酸（W，F），

位置63，25上的赖氨酸（K）到精氨酸（R）或组氨酸（H），

位置64上的谷氨酸（E）到赖氨酸（K）、精氨酸（R）或组氨酸（H），

位置65上的丝氨酸（S）到苯丙氨酸（F）或色氨酸（W）和位置66中的苏氨酸（T）脯氨酸（P）；

-第二泛素单体中，优选的取代是

位置6上的赖氨酸（K）到苏氨酸（T）、天冬酰胺（N）、丝氨酸（S）或谷酰胺（Q），

位置8上的亮氨酸（L）到谷酰胺（Q）或苏氨酸（T）或天冬酰胺（N）或丝氨酸（S），

位置62上的谷酰胺（Q）到色氨酸（W）或苯丙氨酸（F），

位置63上的赖氨酸（K）到丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、天冬酰胺（N）或谷酰胺（Q），

位置64上的谷氨酸（E）到天冬酰胺（N）、丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、或谷酰胺（Q），

位置65上的丝氨酸（S）到苯丙氨酸（F）或色氨酸（W），

和位置66上的苏氨酸（T）到谷氨酸（E）或天冬氨酸（D），

和位置2上可选地谷氨酰胺（Q）到精氨酸（R）、组氨酸（H）或赖氨酸（K）。

这些每个单体中可替换的取代能彼此没有任何限制的结合，假设合成的修饰的泛素异源二聚体对所述配体显示特定的结合亲和力Kd＝10^-7-10^-12M，且关于所述配体表现单价的结合活性，条件是没有破坏或妨碍泛素蛋白的结构稳定性。

最优选的是下列取代：

（1）第一单体单元中至少K6W、L8W、K63R、E64K、S65F、和T66P；

和第二单体单元中至少K6T、L8Q、Q62W、K63S、E64N、S65、和T66E；

可选地另加Q2R，或者

（2）第一单体单元中至少Q2T、F4W、K6H、Q62N、K63F、E64K、S65L、和T66S；

和第二单体单元至少位置6、8、62、63、64、65、和66中的修饰，进一步可选地

第二单体单元中至少K6X、L8X、Q62X、K63X、E64X、S65X、和T66X；可选地另加Q2X，其中X能是任何氨基酸。

显著地优选的是下列第一泛素单体中的取代，以便产生对ED-B的结合蛋白：

2：Q→T、4：F→W、6：K→H、62：Q→N、63：K→F、64：E→K、65：S→L、66：T→S。

没有使用连接子或能使用任何连接子来连接两个单体的首尾。优选地连接子是SEQ ID NO:32的那些或者序列GIG或者SGGGGIG或者SGGGGSGGGGIG。

一个优选的实施例中，具有两个共同起作用的结合决定区域的、结合配体ED-B的泛素异源二聚物包括SEQ ID NO:33或34的氨基酸序列。本发明优选的包括作为药学上有效部分的TNF-α的融合蛋白具有SEQ IDNO:35或36的序列。另一个实施例中，具有两个共同起作用的结合决定区域的、结合配体ED-B的泛素异源二聚物包括图11的氨基酸序列，与SEQ ID NO:XX对应。

由下列序列提供进一步优选的蛋白质，其中XXXX可以是任何氨基酸（SEQ ID NO:47）。

MTIWVHTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNINFKLSLH

LVLRLRGGSGGGGSGGGGIG

MQTFVXTXTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNTXXXXXLH

LVLRLRGG

图11中示出具有这些序列的蛋白质的实例。作为连接子，SGGGGSGGGGIG用于此处：应该理解，其他类型的连接子或没有连接子也是切实可行的可替换方案。

本发明的多聚核苷酸、宿主细胞载体

本发明进一步的方面中，本发明也包括多聚核苷酸，其编码之前描述的蛋白质或融合蛋白质。此外，本发明包含包括所述多聚核苷酸的载体。

本发明的另外的方面中，宿主细胞包括此处描述的蛋白质或融合蛋白质和/或编码所述重组蛋白的多聚核苷酸或本发明的融合蛋白或包含所述多聚核苷酸的载体。

修饰的异源多聚体的泛素分子的用途

本发明具有以高亲和力结合配体的能力的修饰的泛素蛋白用于例如制备用于体内或体外使用的诊断工具和治疗工具。依照本发明，例如，蛋白质能用作直接的效应分子（解调剂、拮抗剂、促效剂）或抗原识别域。

人类和兽医领域中，能通过本身已知的方法制备医学治疗和预防药学上有效的药物，其包含至少一个根据本发明修饰的异源二聚体泛素蛋白。依靠草本制剂的制备，这些组合物能通过注射或灌输、全身给药、直肠给药、腹膜给药、肌肉给药、皮下给药、皮肤给药或通过其他按照惯例上使用的应用方法肠胃外给予。药物的制备的类型依赖要治疗的疾病的类型、疾病的严重程度、要治疗的病人和其他药学领域那些技术人员已知的因素。

取决于挑选的融合伴侣，本发明的药学的组合物适于指导疾病的治疗，其中靶分子是丰富的。

组合物适于包含治疗学上的有效剂量。要执行的剂量的质量依赖要治疗的有机体、疾病的类型、病人的年龄和体重和本身已知的进一步的因素。

组合物包含药学上或诊断上可接收的载体且能可选地包含进一步的辅助剂和本身已知的赋形剂。这些包括但不限于，例如，稳定剂、表面活性剂、盐、缓冲液、着色剂等等。

药物组合物能以液体制备、乳剂、用于局部滴旋的洗剂、气雾剂形式，以粉末、颗粒、药片、栓剂或者胶囊的形式，以乳剂或脂质体（liposomal）制备的形式。组合物优选的是无菌的、非高温和等张的，且包含药学上传统的和可接收的本身已知的添加剂。此外，已做出参考美国药典或Remington′s药物科学（Mac Publishing Company(1990)）的规则。

依照本发明，“药物组合物”可以组合物的形式出现，其中不同的有效成分和稀释剂和/或载体是彼此混合的，或者采取组合制备的形式，其中有效成分以部分地或完全地不同的形式出现。这种组合或组合制备的实例是多部分的试剂盒（kit-of-parts）。

依照本发明，“组合物”包括至少两种制药学上的活性化合物。这些化合物能利用一分钟到几天的时间间隔同时地或个别地给予。化合物能通过相同的途径或不同地途径给予；例如，一种活性化合物的口服给予和另外的肠胃外给药都是可能的。活性化合物也可以配制在一种药物中，例如，在一种输注溶液中或作为包括分别配制的两种化合物的试剂盒中配制。两种化合物在两个或更多包装中出现，这也是可能的。

进一步的实施例中，制物组合物是以多部分的试剂盒的形式，为本发明的组合的泛素蛋白质/融合蛋白质和为一个或更多化学治疗药提供分离的实体。

依照本发明，可通过很多传统的和已知的技术中的任何一个，例如普通的有机合成策略，固相合成技术（solid phase-assisted synthesistechniques）或者通过商业上可用的自动化的合成器制备修饰的泛素蛋白。另一方面，也可单独通过传统的重组技术或与传统的合成技术组合来制备修饰的泛素蛋白。

可选地，可通过遗传工程在DNA水平上进行修饰，且在原核或真核生物体中或体外表达修饰的蛋白质。

进一步的实施例中，所述修饰步骤包括化学合成步骤。

本发明的一个方面，通过遗传上融合两个DNA库获得所述不同地修饰的蛋白质的群，其中这两个DNA库各自编码不同地修饰的单体泛素蛋白。

附图说明

图1显示具有结合决定区域（称为BDR1）的前面（第一）修饰的泛素单体与一个具有结合决定区域的不同修改的后面（第二）泛素单体（称为BDR2）的结合（recombination，重组），以便产生异源二聚体，导致对ED-B亲和力的显著增加和结合特异性的增加。通过Biacore荧光各向异性、细胞上的结合、和组织切片方法分析修饰的泛素分子。显示几种异源二聚体泛素变体与人类ED-B结合的浓度依赖ELISAs（con.-ELISA）。

图1A显示结合亲和力Kd＝9.4μM＝9.45×10^-6M的单体41B10（这里：SPWF28-41B10th）。封闭的环显示第一单体41B10与碎片67B89的结合，碎片67B89代表纤连蛋白的额外域-B。对照组碎片6789不包含ED-B且以空心环示出。

图1B显示异源二聚体泛素的结合亲和力。异源二聚体包含与不同的第二单体结合导致变体46H9的第一单体41B10（这里：SPWF28-46H9th）。与图1A中示出的单体相比，由于两种单体与靶分子ED-B的单价结合（Kd＝131nM＝1.3×10^-7M；这里封闭环示出的67B89），46H9的结合亲和力是大量增加的。对照组碎片6789不包含ED-B且以空心环示出。

图2显示融合到细胞因子上的以修饰的泛素为基础的（或称“修饰的基于泛素的”）结合ED-B的异源二聚体分子的亲和力和活性。

图2A显示以修饰的泛素为基础的结合ED-B的异源二聚体24H12的高亲和力（Kd50.7nM＝5×10^-8M）。封闭环显示24H12与EDB的结合；利用24H12与BSA（牛血清蛋白）的结合（空心环）作为阴性对照。

图2B显示融合到细胞因子TNFα上的以修饰的泛素为基础的结合ED-B的异源二聚体24H12的亲和力提高，导致异源二聚体24H12的多聚化（Kd＝5.6nM＝5.6×10^-9M）。

图2C显示选自异源二聚体修饰的泛素库选择的典型的候选物的分析，例如异源二聚物变体9E12、22D1、24H12、和41B10。与用作对照组的胞液纤连蛋白（c-FN）相比，靶分子ED-B的ELISA Kd值是增加的，证实对靶分子的特异性结合。

图2D显示利用Biacore

通过非标记相互作用技术（label-freeinteraction assays），修饰的异源二聚体泛素分子9E12的分析的结果。针对结合固定在芯片（Biacore）上的ED-B，分析（察看图例：9E12的0-15微M）异源二聚体泛素变体的不同浓度，以便分析异源二聚体变体9E12和ED-B之间的相互作用。不能通过分析联合和分离的曲线来决定Kd。

图2E显示利用Biacore通过非标记相互作用技术（label-freeinteraction assays）对修饰的异源二聚体泛素分子41B10进行分析的结果。针对结合固定在芯片（Biocore）上的ED-B，分析异源二聚体泛素变体的不同浓度（参见图例：0-15μM的41B10），以便分析异源二聚体变体41B10和ED-B之间的相互作用。分析联合和分离的曲线形成623nM（6.2×10^-7M）的Kd。

图3显示不同修饰的基于泛素的变体对结合亲和力和特异性的贡献。不同的变体共有共同的序列模块，其用下面的框中字母标出。针对变体的ED-B结合来分析变体。图3显示导致修饰的泛素异源二聚体的单体的不同组合。异源二聚体变体46-A5、50-G11和46-H4具有所有相同的带有BDR1（图中用字母“a”标注）的第一（前面）修饰的单体，但是第二（后面）泛素单体在不同的位置修饰，具有BDR2。与具有BDR1的46-H9相比，变体52-D和52-B3具有不同的第一（前面）修饰的单体，但是具有相同的带有BDR2（用字母“e”标注）第二（后面）泛素单体。

修饰的泛素异源二聚体具有下列序列：46-H4:SEQ ID NO:25、45-H9:SEQ ID NO:26、46-A5:SEQ ID NO:27、50-G11:SEQ ID NO:28、52-B3:SEQ ID NO:29、52-D10:SEQ ID NO:30

通过添加具有序列LEHHHHHH（SEQ ID NO:31）的His-标签在实验期间修饰上述描述的序列。

如能从图3看出，46-H4对ED-B具有极好的结合亲和力（Kd＝189nM）；与46-H4对ED-B相比，46-A5和52-D没有结合活性，而其他修饰的泛素蛋白提供较小的结合活性。因此能推论在异源二聚体变体中的两种单体要求以高亲和力结合靶分子；两种单体均显示对靶分子的单价结合。

正如与野生型泛素单体相比，通过下列两种单体中的两个结合域区域中的氨基酸置换，识别命名为46H9的具有高ED-B结合活性的修饰的泛素异源二聚物：

第一模块中（BDR1）（a）Q2G、F4V、K6R、Q62P、K63H、E64A、S65T、T66L

第二模块中（BDR2）（e）K6H、L8M、Q62K、K63P、E64I、S65A、T66E

50G11

第一模块中（46H9）（a）Q2G、F4V、K6R、Q62P、K63H、E64P、S65T、T66L

第二模块中（c）K6M、L8R、Q62M、K63N、E64A、S65R、T66L

46H4

第二模块中（d）K6G、L8W、Q62T、K63Q、E64Q、S65T、T66R

52B3

第一模块中（g）Q2R、F4P、K6Y、Q62P、K63P、E64F、S65A、T66R

第二模块中（46H9）K6H、L8M、Q62K、K63P、E64I、S65A、T66E

52D10（非-ED-B结合物）

第一模块中Q2V、F4C、K6R、Q62T、K63A、E64P、S65G、T66D

第二模块中（46H9）（e）K6H、L8M、Q62K、K63P、E64I、S65A、T66E

46A5（非-ED-B结合物）

第二模块中（b）K6L、L8M、Q62L、K63A、E64F、S65A,

图4显示序列比对（alignment）。行1：野生型泛素蛋白的两个单体（第一行）是从位置77起始并在位置88终止与12-氨基酸连接子SGGGGSGGGGIG连接在一起；具有BDR2的第二单体在位置89上以甲硫氨酸开始。这种二聚物野生型泛素蛋白与修饰的泛素异源二聚物变体46-H9（第二行）比对，变体46-H9在第二和第二单体中具有不同的修饰，产生两个BDRs。由于对靶的单价结合，两个BDRs在靶的结合中共同起作用。

图5显示修饰的泛素异源二聚物变体1041-D11（第一行）与“Ub2-TsX9”（在两种单体与位置45对色氨酸修饰的泛素）的序列比对，显示两种单体之间连接子GIG（位置77到79；第二单体在位置88上以甲硫氨酸开始），和在第二单体最后的c-末端氨基酸上甘氨酸到丙氨酸的交换。第三行显示“Ubi-Dimer wt”，作为二聚物的野生型泛素；显示没有连接子对齐（从而，第二单体在位置77上以甲硫氨酸开始）。第四行显示人类野生型泛素“Ubi-Monomer wt”。

图6显示异源二聚物泛素变体1041-D11与人类ED-B的结合的浓度依赖的ELISA。变体1041-D11对结合ED-B显示非常高的亲和力（Kd＝6.9nM＝6.9×10^-9M）。与这种变体对阴性对照的没有结合相比（涉及6789-t0）（空心环），封闭的圆点显示异源二聚物泛素变体1041-D11对包含纤连蛋白碎片（涉及67B89-t0）的ED-B的结合的亲和力。

图7显示在自由靶分子数量渐增的情况下，异源二聚体泛素变体1041-D11与包含纤连蛋白碎片（67B89）的固定的ED-B的结合的竞争性浓度依赖的ELISAs。从具有IC50为140nM的可溶67B89的固定的67B89分离的1041-D11表明：由于固定到用于conc-ELISA设备的疏水表面上，1041-D11的结合不是ED-B结构破坏的人为现象（artefact）。

图8显示利用Biacore

在非标记相互作用技术中修饰的异源二聚体泛素分子1041-D11的分析结果。对于结合包含固定在SA-芯片（Biacore）上的纤连蛋白碎片（涉及67B89）的ED-B，分析（参见图例：0-200nM的1041-D11）不同浓度的异源二聚物泛素变体。分析结合和分离曲线，产生1nM的Kd（1×10^-9M）和7.7×10^-4s^-1的k_0ff速率，这指示10411-D11和ED-B复合体的长的半衰期。

图9显示浓度依赖ELISA中异源二聚物泛素变体1041-D11对ED-B的结合，同时地分析结合活性的血清稳定性。示出不同的条件，例如在鼠或鼠血清中或在作为对照的PBST中变体在37℃预孵育1h。所有的Kd值都在10和20nM之间。因此，能推论异源二聚物1041-D11对ED-B的结合没有受到血清的显著影响。

图10显示通过SE-HPLC分析异源二聚体泛素变体1041-D11与纤连蛋白碎片的复合体（complex）形成。

图10A显示1041-D11与ED-B的复合体形成。三种HPLC类型覆盖：具有21.651min的保留时间的蓝色峰来源于纯1041-D11；具有26.289min的保留时间的黑色峰代表纤连蛋白碎片67B89；在SE-HPLC之后，1041-D11和67B89的混合物产生红色峰具有27.407min的保留时间。1041-D11峰到较低保留时间的移动和67B89峰的消失指示1041-D11和可溶解的ED-B的复合体的形成。

图10B显示三种SE-HPLC类型的覆盖图，1041-D11（蓝色，21.944min）、没有ED-B的纤连蛋白碎片6789（黑色，26.289min）以及1041-D11和6789的混合物（在21.929min和26.289min上具有峰的红线）。观察到1041-D11峰几乎没有移动。这个事实与6789峰没有消失一起指示不含ED-B的纤连蛋白碎片6789没有明显的结合。

图11显示ED-B结合变体的保守位置（consensus positions）和氨基酸取代。16个代表性的异源二聚体序列示出，已经发现其对ED-B具有意外地强烈的结合亲和力。保守氨基酸位置是在第一单体结合决定区域2、4、6、62、63、64、65、66中而保守氨基酸取代是Q2T、F4W、K6H、Q62N、K63F、E64K、S65L、和T66S。

图12显示六个基于泛素的异源二聚体MIA2结合蛋白质的序列比对。第二泛素单体以在位置89（1111-B4、1111-C9）或位置80（1111-E10、1111-F6、1111-H12、1111-H2）的甲硫氨酸开始。

图13显示图12的基于泛素的异源二聚体MIA2结合蛋白质的结合决定区域BDR1和BDR2的比对（排序）和连接子的比对（排序）。也示出泛素序列中另外的氨基酸的交换。

图14显示与生物素化的MIA-2（biot.MIA2）结合的图12的变体1111-E10的浓度依赖的ELISA，Kd＝2.6microM（封闭的环）；对照组人类血清蛋白（HSA）（空心环）。

图15A.在第一和第二单体泛素单元的一系列分子中的氨基酸残基中进行修饰，且进行序列排序以便评价最有效的结合位点/位置。部分A显示第一单体修饰的泛素单元的序列信息和部分B显示第二单体修饰的泛素单元的序列信息。

图15B.修饰是在第一泛素单体的位置2、4、6、62-66、68中和第二单体中的位置6、8、62-66。两种泛素单体之间的连接子：SGGGGSGGGGIG。

图15C.显示异源二聚物泛素变体SPWF-15-6-A12与人类肿瘤坏死因子（人类TNFα）的结合的浓度依赖的ELISA。结合蛋白质SPWF-15_6-A12显示以很高的亲和力结合肿瘤坏死因子（Kd＝12nM＝1.2×10^-8M）。图显示高亲和力结合人类肿瘤坏死因子（封闭的环）；对照组BSA（空心环）。

图15D.对于肿瘤坏死因子具有特异性的异源二聚体泛素结合蛋白质SPWF-15_16-D4_Th的序列。修饰是在第一泛素单体的位置2、4、6、62-66和第二单体中的位置6、8、62-66。两种泛素单体之间的连接子：SGGGGSGGGGIG。

图15E.显示异源二聚体泛素变体SPWF-15_16-D4_Th与人类肿瘤坏死因子的结合的浓度依赖的ELISA。结合蛋白质SPWF-15_16-D4_Th显示以很高的亲和力结合肿瘤坏死因子（Kd＝1.7nM＝1.7×10^-9M）。图显示对人类肿瘤坏死因子的结合（封闭的环）；对照组：牛血清蛋白（BSA）（空心环）。

图16显示修饰的基于泛素的异源二聚物的NGF结合。

图16A.对NGF具有特异性的异源二聚物泛素结合蛋白SPWF9-1B7-th的序列。修饰是在第一泛素单体的位置2、4、6、62-66和在位置51以及在第二单体的位置6、8、62-66。两种泛素单体之间的连接子：SGGGGSGGGGIG。

图16B.浓度依赖的ELISA确定/决定对NGF的高亲和力的结合Kd为0.9μM（＝9×10^-7M）。图示出对重组人类NGF的结合（rhNGF；封闭的环）；对照组BSA（空心环）。

图16C.对NGF具有特异性的异源二聚体泛素结合蛋白SPWF9-6A2-th的序列。修饰是在第一泛素单体的位置2、4、6、62-66中和在第二单体的位置6、8、62、64-66中。两种泛素单体之间的连接子：SGGGGSGGGGIG。

图16D.浓度依赖的ELISA确定对NGF的高亲和力的结合Kd为180nM（＝1.8×10^-7M）。图示出对重组人类NGF的结合（rhNGF；封闭的环）；对照组BSA（空心环）。

图17异源二聚体IgG结合蛋白质。

图17A.对IgG具有特异性的异源二聚物泛素结合蛋白SPVF4-16B2-ts的序列。修饰是在第一泛素单体的位置6、62、63、65、66中和在第二单体的位置6、62-66中。两种泛素单体之间的连接子：SGGGGSGGGGIG。

图17B.浓度依赖的ELISA确定对IgG的Kd为3.8μM的亲和力的结合。图示出对IgG的结合（封闭的黑色环）；对照组为BSA-1、BSA-2和依那西普（Enbrel）（没有拟合线的红色、绿色和蓝色环）。依那西普（Enbrel）具有人类IgG1的Fc片段。对依那西普（Enbrel）的微弱的结合指示SPVF4-16B2-ts与IgG的Fab片段的结合。

图17C.对IgG具有特异性的异源二聚物泛素结合蛋白SPVF4-9C6-ts的序列。修饰是在第一泛素单体的位置6、8、62-66中和在第二单体的位置6、8、62-66中。两种泛素单体之间的连接子：SGGGGSGGGGIG。

图17D.浓度依赖的ELISA确定对IgG的Kd为4.1μM的亲和力的结合。图示出对IgG的结合（封闭的黑色环）；对照组BSA（空心环）和依那西普（Etanercept）（商品名为Enbrel）（红色环，没有拟合线）。依那西普（Enbrel）具有人类IgG1的Fc片段（moiety）。对依那西普（Enbrel）的微弱的结合指示SPVF4-9C6-ts与IgG的Fab片段的结合。

实施例

下列实例提供本发明的进一步说明。本发明关于泛素的修饰作为实施例部分地论证。然而，本发明不受实施例限制，且下列实施例仅以上述描述为基础显示本发明的实用性。用于本发明全部的公开，参考了在申请中和附件中引证的文献，其全部内容结合在本申请中以供参考。

实施例1.以修饰的泛素蛋白为基础的异源二聚体ED-B结合蛋白的识别

库的构建和克隆

除非有另外的说明，都使用如Sambrook等人描述的已知的重组遗传方法。

通过在总数15个挑选的氨基酸位置的协同的变异发生，制备具有高度复杂性的人类泛素异源二聚物的随机库。修饰的氨基酸，其是通过NNK三联密码（triplet）被取代的，包括选自第一泛素单体内位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、68上的至少3个氨基酸和选自第二泛素单体内的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、68上的至少3个氨基酸。两个泛素单体都是通过至少具有序列GIG的甘氨酸/丝氨酸连接子或通过至少具有序列为SGGGG的甘氨酸/丝氨酸连接子，例如，GIG、SGGGG、SGGGGIG、SGGGGSGGGGIG(SEQ ID NO:32)或SGGGGSGGGG而遗传上连接的（首到尾），但是也可能是任何其他连接子。

TAT噬菌体展示选择

利用例如作为选择系统的TAT噬菌体展示，针对靶分子富集异源二聚体泛素库。能利用本领域已知的其他选择方法。靶分子能非特异性地固定在蛋白质结合表面，或通过共价地连接到蛋白质上的生物素化残基。优选的是通过生物素固定到链霉亲和素磁珠（streptavidin beads）或亲和素带（neutravidin strips）上。在溶液中或在固定的靶上选择靶分子结合噬菌体；例如，对生物素化和固定的具有噬菌体的靶进行孵育，接着对结合到基体上的噬菌体洗涤并洗脱基质束缚的噬菌体。在每一个循环中在靶分子孵育之后，从溶液中磁性分离珠子且洗涤几次。在第一到三个的选择循环中，洗涤固定在靶分子负载的磁性珠上的三重复合体。第四次的选择循环中，洗涤实行几次。第一次的选择循环中，生物素化的靶分子固定到亲和素带上，然而在第二到四个循环中，在溶液中进行选择，紧跟其后的是将靶分子噬菌体复合体固定到Streptavidin-coated Dynabeads

（Invitrogen）上。在洗涤之后，在前两个选择循环中，珠子再一次从溶液中磁性分离，且利用酸性溶液通过洗脱释放靶分子结合的修饰的泛素分子的噬菌体。在第三和第四选择循环中，利用过量的靶分子通过竞争性洗脱执行噬菌体的洗脱。重新扩增洗脱的噬菌体。为了指导结合体的特异性，在选择期间，能包括相似于靶分子的蛋白质。

对于TAT噬菌体展示选择的可替换方式：核糖体展示选择

利用例如，作为选择系统的核糖体展示（Zahnd et al.,2007,Ohashi etal.,2007）针对靶分子富集泛素库。也能利用其他本领域已知的选择方法。依照标准的方法生物素化靶分子且固定在Streptavidin-coated Dynabeads

（Invitrogen）上。利用PURExpress在体外蛋白质合成装置中（NEB）组装包括核糖体、mRNA和初始形成的泛素多肽的三重复合体。实行两个初级的选择循环（rounds），其中孵育三重复合体，接着的是两个相似的选择循环。在每一个循环中在靶分子孵育后，从溶液中磁性分离珠子，并以增加的严格性利用核糖体展示缓冲液洗涤。在第一到三个选择循环中，洗涤固定在靶分子负载的磁性珠上的三重复合体。在第四个选择循环中，再一次从溶液中磁性地分离珠子，且通过加入50mM的EDTA从核糖体上释放靶分子结合修饰的泛素分子的mRNA。在第三和四个选择循环中，利用过量的靶分子通过竞争性洗脱执行mRNA的洗脱（Lipovsek and Pluckthun,2004）。在每一个循环之后，利用RNeasy MinElute Cleanup Kit（RNA回收和浓缩小体积洗脱试剂盒）（Qiagen,Germany）、Turbo DNA-free Kit（核酸抽提试剂盒）（Applied Biosystems,USA）和Transcriptor ReverseTranscriptase（反转录cDNA合成试剂盒）（Roche,Germany）实行RNA纯化和cDNA合成。

富集库的克隆

在第四个选择循环之后，依照本领域中已知的方法，通过PCR扩增合成的cDNA，使用适当的限制性核酸酶切割且通过兼容的粘性末端连接到表达载体pET-20b（＋）上（Merck,Germany）。

单克隆Hit分析

在转入NovaBlue(DE3)细胞(Merck,Germany)之后，青霉素抗性的单克隆生长，通过在96孔深孔板中（Genetix,UK）利用自诱导培养基（Studier,2005）培养获得靶分子结合修饰的泛素的表达。收集细胞并随后裂解细胞。在离心之后，通过涂上靶分子的ELISA筛选合成的上清液，且泛素特异性的Fab片段结合到辣根过氧化物酶上（POD）。因为使用检测试剂TMB-Plus（Biotrend,Germany），利用0.2MH₂SO₄溶液显示黄色，且在450nm与620nm的下检测板中的读数。

执行对靶分子的几个选择展示循环。最后两个选择的循环中，使用过量的自由靶分子洗脱结合分子。

例如，识别对靶ED-B的异源二聚体修饰的泛素结合蛋白，例如46H9(SEQ ID NO:6)，9E12(SEQ ID NO:7)，22D1(SEQ ID NO:8)，1041-D11图5(SEQ ID NO:33)，1045-D10(SEQ ID NO:34)。例如，识别对其他靶的异源二聚体修饰的泛素结合蛋白，例如图12的对靶MIA-2的结合蛋白1111-E10（SEQ ID NO:53），图15B的对靶TNF α的结合蛋白SPWF-156-A12（SEQ ID NO:57）和图15D的SPWF-1516-D4（SEQ ID NO:90），图16A的对靶NGF的结合蛋白SPWF9-lB7-th（SEQ ID NO:91）和图16C的SPWF9-6A2-th（SEQ ID NO:92）和图17A的对靶IgG的结合蛋白SPVF4-16B2-ts（SEQ ID NO:93）和图17C的SPVF4-9C6-ts（SEQ IDNO:94）。

图5中示出野生型泛素单体（Ubi单体wt），与野生型泛素二聚体（ubi二聚体wt）和具有修饰的泛素异源二聚体变种1041-D11的野生型泛素蛋白（图5中的Ub2-TsX9，每一个单体的位置45中具有交换和在C-末端上具有两处取代）。Ub2-TsX中在单体的C-末端（GG到AA）上的取代增加血清的稳定性，因为去泛素化酶（deubiquitinases）分解是在泛素的GG之后，而不是在AA之后。野生型泛素的二级结构与在C-末端具有的这些取代的泛素相比，几乎是相同的。

通过与野生型相比的下列氨基酸置换来识别具有较高的ED-B结合活性的修饰的泛素被称作1041-D11（图X中显示；SEQ ID NO:36）或1045-D10：第一模块中：K6W,L8W,K63R,E64K,S65F,T66P；第二模块中：K6T,L8Q,Q62W,K63S,E64N,S65W,T66E；可选地Q2R（变体1041-D11中，但不在变体1045-D10中）。融合蛋白适当优选的连接子是具有至少序列为GIG或具有至少序列为SGGGG的连接子，或任何其他连接子，例如GIG,SGGGG,SGGGGIG,SGGGGSGGGGIG或SGGGGSGGGG。然而，有很多能用于代替的可能的连接子。图11中显示在第一单体结合决定区域中另外的具有他们的保守序列的EDB结合体。

图12-14示出具有较高的MIA-2结合活性的修饰的泛素。

图16示出具有较高的NGF结合活性的修饰的泛。

图15示出具有较高的TNF-α结合活性的修饰的泛素。

在图17示出具有较高的IgG结合活性的修饰的泛素。

实施例2：将变体结合到人类靶分子上的基于修饰的泛素的ED-B的结合分析

实施例2A.通过浓度依赖的ELISA方法进行基于修饰的泛素的结合变体的结合分析

通过浓度依赖的ELISA检验以泛素为基础的变体和人类靶分子的结合。如果ED-B被用作靶分子，则渐增数量的纯化蛋白适用于涂上人类靶分子，BSA或HAS和可能的进一步的对照，例如细胞纤连蛋白（cFN）（如果ED-B用作靶分子）的腔室玻片板（NUNC-medisorp plate）。每孔抗原涂上50μl蛋白质溶液（10μg/ml），4℃过夜。在用PBS，0.1％吐温20pH7.4（PBST）洗涤板之后，孔利用封闭液（PBS pH7.4；3％BSA；0.5％吐温20）在室温RT下封闭2h。孔再次用PBST洗涤三次，然后用PBS洗涤三次。用不用浓度的靶结合蛋白在RT下孵育涂覆的孔1h。在PBST洗涤孔之后，将anti-Ubi fab片段（AbyD）POD的结合物加到PBST的适当的稀释液中。板用PBST洗涤三次。每一个孔中加入50μlTMB基础溶液（KEM-EN-Tec）且孵育15min。通过加入0.2M H₂SO₄终止反应。利用TECAN Sunrise ELISA-Reader读出ELISA板。在450nm下利用620nm作为参考波长完成吸光度测量。图6显示变体1041-D11与ED-B的结合的很高的亲和力（Kd＝6.9nM）。关于其他靶分子MIA-2、TNFα、NGF和IgG，分别由图14、15、16和17中描述的结果证实（高的亲和力）。因此，泛素野生型中只有很少的修饰（每一个单体中高达8个取代），结果对特定的靶分子的亲和力在很低的微摩尔范围。

实施例2B.通过竞争性的浓度依赖的ELISA方法进行基于修饰的泛素的结合变体的结合分析

这里描述的是对于靶分子ED-B的结合分析，但是没有进一步的实验，它能用于任何其他的靶分子。在有增加数量的自由靶分子的情况下，利用竞争性浓度依赖的ELISAs分析泛素变体1041-D11与包含纤连蛋白片段（67B89）的固定的ED-B的结合。ELISA的条件如实施例2A中描述的，除了1041-D11蛋白质是与ED-B（67B89）（0μM-10μM）或者也与阴性对照6789（0μM-10μM）预孵育1h，且随后混合物提供给放置在酶标板上的靶分子67B89；之后，通过相应的抗体（anti-Ubiquitin-Fab-POD；1：6500稀释）检测变体。

图7显示变体1041-D11具有很高的亲和力结合ED-B（IC50=140nM）。证实了图6中显示的结果；泛素野生型中只有少数的修饰（每一个单体中高达8个取代），产生更高亲和力结合ED-B。

实施例2C.通过浓度依赖ELISA方法进行基于修饰的泛素的ED-B结合变体的结合分析，同时分析结合活性的血清稳定性。

利用本领域已知的且如上述描述的程序实行ELISA（实施例2A和2B）。将ED-B（这里被称作67B89）涂在微量滴定板上，变体结合到ED-B上且通过特定的泛素抗体检测（Anti-Ubi-Fab-POD）。这种实验中以不同的方式处理变体；变体在鼠血清中在37℃孵育1h（察看图9，蓝色环）；变体在褐家鼠血清中在37℃孵育1h（察看图13X，红色环）；或者变体在PBS中在37℃孵育1h（察看图9、10，黑色环）。图13显示所有变体1041-D11的Kd在10.3μM（PBS中）到20.74μM（鼠血清中）之间。

实施例2D.通过Biacore实验进行基于修饰的泛素的ED-B结合变体的结合分析

利用本领域的那些技术人员已知的方法，分析变体的不同浓度（例如，0-20μM的变体，优选地1041-D11）对结合ED-B的影响，ED-B包含固定在CM5-芯片（Biacore）上的纤连蛋白片段（被称作67B89）。通过模型分析软件（BIA evaluation software）和1：1-Langmuir-装置处理获得的数据。如图8中示出的，变体1041-D11的Kd是1.0μM。动力学结合常数是k_on=7.6×10⁵M^-1S^-1；k_off=7.7×10^-4s^-1。融合蛋白1041-D11-TNFα的K_D是1.13μM。动力学结合常数k_on=4.5×10⁵M^-1S^-1；k_off=5.0×10^-4s^-1。

实施例2E.通过SE-HPLC进行基于修饰的泛素的ED-B结合变体的复合体形成的分析

对于复合体形成的分析，利用Tricorn Superdex 755/150GL柱（GE-Healthcare）（V=3ml）且应用50μl量的蛋白质。进一步的条件：缓冲液：1×PBS，pH7.3，流量：0.3ml/min，运行：45min（样品的加入：15min之后）。条件：0.72nmol 1041-D11蛋白质＋0.72nmol ED-B（这里涉及67B89）或者作为阴性对照的纤连蛋白（此处被称为6789）在RT下孵育1h；然后应用于柱用于复合体形成的分析。图14中，只有变体用黑色示出，只有靶分子ED-B用蓝色示出，用粉红示出变体与ED-B结合组成的复合体。图10A示出包含ED-B的纤连蛋白（67B89）与变体；图10B是不具有ED-B的纤连蛋白的变体（6789）。图显示变体1041-D11与ED-B（67B89）一起组成复合体，但是与纤连蛋白（6789）没有组成复合体，这证实了它的特异性。

实施例3：对TNF-α具有改善的结合的基于泛素的异源二聚体的结合蛋白

依照本发明的方法，选出对TNF-α特异性的基于泛素的异源二聚体的结合蛋白，即建立噬菌体库，其包括修饰的异源二聚体的泛素的结合蛋白的群，在它们与TNF-α潜在的结合蛋白上筛选群。实行下列的修饰：

第一单体中：在位置2、4、6、62-66上的一个或更多的氨基酸中，可选地另外在位置68、70、72-74的一个或更多的位置上，可选地另外的位置上。

第二单体中：位置6、8、62-66上的一个或更多的氨基酸的修饰。

作为连接子，除了对于1144-D11（SEQ ID NO:79)）和1144-E9（SEQ ID NO:80）之外，SGGGGSGGGGIG用于大多数情形中。在第一和第二泛素单体之间1144-D11和1144-E9没有利用连接子。位置75和76是AA或GG。图15的A部分中示出连接子。图15B-E中示出结合亲和力。

实施例4：具有改善的结合MIA-2的基于泛素的异源二聚体的结合蛋白的产生

MIA-2是在例如肝的硬化、纤维化和癌变的情形中诊断和治疗的标记。能在US2004076965中发现这种标记的详细信息。

本发明的修饰的泛素的结合蛋白质的靶蛋白是MIA-2的稳定的101个氨基酸核心区域，此处被称作SPR30-3。SPR30-3是MIA-2的结构部分。除了信号肽之外，它类似于MIA（CD-RAP），OTOR、TANGO。它的分子量是11569，198Da。

MIA-2的氨基酸的核心区域如下（SEQ ID NO:95）：

MLESTKLLADLKKCGDLECEALINRVSAMRDYRGPDCRYLNFTKGEEISVYVKLAGEREDLWAGSKGKEFGYFPRDAVQIEEVFISEEIQMSTKESDFLCL

依照本发明的方法，选出对于MIA-2特异性的基于泛素的异源二聚体的结合蛋白，即建立噬菌体库，其包括修饰的异源二聚体泛素的结合蛋白质的群，在它们与MIA-2潜在的结合上筛选群。结果如下：

图13显示基于泛素的异源二聚体的MIA-2结合蛋白质的比对

变体1111-E10显示对生物素化的靶分子的在微摩尔范围中的亲和力和在尺寸筛析色谱法中显示复合体的形成。最有效（potent）的结合体指定是在第一单体泛素单元（BDR1）中位置6、8、62、63、64、65、66处具有氨基酸取代的1111-E10和在第二单体泛素单元（BDR2）的位置6、8、62、63、64、65、66处的不同的取代。

第一单体泛素单元（BDR1）显示与1111-H2和1111-H12相同的取代。因此，变体1111-H2和1111-H12能被看作BDR1和BDR2的结合，只通过一个取代的氨基酸区别BDR1和BDR2。

已经评价下列进一步有效的结合分子：1111-C9,1111-B4和1111-F6。在ELISA中和SEC上，这些结合体是不可溶解的或对MIA-2的SPR30-3不显示任何结合。分别地富集变体1111-E10和1111-C9和1111-B4（1111-B4中出现几次额外的取代T9A）。1111-F6没有富集，但是由于在Hit-ELISA中它的高信号，它似乎是令人感兴趣的候选物；然而，这个结合体好像是不可溶解的。

图14显示结合生物素化的MIA-2（biot.MIA2）的变体1111-E10的浓度依赖的ELISA，Kd＝2.6微摩尔（封闭的环）；对照组HAS（空心环）。已经证明这些变体111 1-E10作为MIA2最好的结合分子。序列如下：MQIFVETFTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIGWHPELHLVLRLRGGGIGMQIFVRTETGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNILMGYVLHLVLRLRAA(SEQ ID NO:53)

附在所附的序列表中的使用的连接子如下：

1111-B4_21231 sggggsggggig SEQ ID NO:96

1111-C9_21265 sggggsggggig SEQ ID NO:96

1111-E10_21315 gig

1111-F6_21331 gig

1111-H12_21391 eig

1111-H2_21371 gig

出版物

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15.Briiser 2007 Appl Microbiol Biotechnol 76(1):35-45。

Claims

1.一种用于识别具有结合配体能力的异源多聚体修饰的泛素的方法，包括下列步骤：

a）提供来源于单体修饰的泛素蛋白质的异源多聚体修饰的泛素的群，所述群包括异源多聚体蛋白质，所述异源多聚体蛋白质包括两个或更多以首尾排列的方式连接在一起的泛素单体，其中所述异源多聚体蛋白质的至少一个所述单体是至少通过定位在SEQ IDNO:1的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66和68处的至少三个氨基酸中的表面暴露的氨基酸的取代而不同地修饰的，所述修饰的单体蛋白质与未修饰的泛素蛋白质具有至少80％或至少90％或至少95％的氨基酸序列同一性；

b）为所述不同地修饰的泛素蛋白质的群提供潜在的配体；

c）使所述不同地修饰的蛋白质的群与所述配体接触；

d）通过筛选方法识别异源多聚体修饰的蛋白质，其中所述修饰的异源多聚体蛋白质以Kd范围是10^-7-10^-12M的特定的结合亲和力结合于所述配体并且对于所述配体表现单价的结合活性；和可选地

e）利用所述结合亲和力分离所述异源多聚体修饰的泛素。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述异源多聚体蛋白质是异源二聚体或异源三聚体蛋白质。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述修饰的单体蛋白质包括总共1至10个氨基酸中一个或更多的插入和/或总共1至7个氨基酸中一个或更多的缺失，进一步可选地其中所述修饰的单体泛素蛋白包括至少6个和最多14个氨基酸的取代，并且其中所述修饰的异源二聚体的泛素蛋白包括总共至少12个和最多28个取代，和/或包括总共至少1个和最多20个插入和/或至少1个和最多14个缺失。

4.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述修饰的单体泛素蛋白是通过编码泛素的DNA的遗传工程，并且在原核或真核生物体内或体外表达所述蛋白而获得的。

5.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中通过体外选择方法提供所述多聚体蛋白质，所述体外选择方法优选地是展示方法，可选地为噬菌体展示、核糖体展示、TAT噬菌体展示、酵母菌展示、细菌展示、细胞表面展示或mRNA展示方法。

6.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述配体是抗原或半抗原。

7.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中进一步地在至少一个所述单体泛素蛋白中的1至7个另外的氨基酸被取代，其可选地选自在位置36、44、70、71的一个或更多的氨基酸，和可选地附加地SEQ ID NO:1的位置62、63和64或72和73或8的氨基酸。

8.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述泛素的异源多聚体融合蛋白的群通过以下方式提供：遗传上融合两个DNA库，所述DNA库每一个编码不同地修饰的单体蛋白质，将所述DNA翻译成异源多聚体融合蛋白质，展示所述蛋白质并在修饰的异源多聚体泛素蛋白存在下筛选展示的蛋白质，所述修饰的异源多聚体泛素蛋白包括以首尾排列连接在一起的单体泛素蛋白，其中所述修饰的异源多聚体泛素蛋白以Kd范围是10^-7-10^-12M的特定的结合亲和力结合所述配体并且对于所述配体表现出单价的结合活性，或者其中通过蛋白质的化学合成提供所述泛素的异源多聚体的融合蛋白质的群。

9.一种DNA库，包含编码来源于单体泛素的异源多聚体泛素融合蛋白的群的DNA，每一个多聚体蛋白质包括两个或更多以首尾排列的方式连接在一起的修饰的泛素单体，其中每个所述多聚体蛋白质的所述单体的至少两个被不同地修饰，这种修饰至少通过在位于SEQ IDNO:1的位置2、4、、6、8、62、63、64、65、66和68处的至少三个氨基酸中的表面暴露的氨基酸的取代而实现，所述修饰的单体蛋白质与未修饰的蛋白质具有的氨基酸序列同一性为至少80％或至少90％或至少95％。

10.一种通过权利要求9所述的DNA库的表达获得的蛋白质库。

11.一种包含根据权利要求9或10所述的DNA或蛋白质库的原核的或真核的细胞或噬菌体的群。

12.一种多聚核苷酸，编码权利要求10所述的蛋白质库的融合蛋白质。

13.一种载体，包括根据权利要求12的多聚核苷酸。