KR101353677B1 - 피브로넥틴의 엑스트라도메인 ｂ에 대한 특이적 결합 활성을 갖는 변형된 유비퀴틴 단백질 - Google Patents

피브로넥틴의 엑스트라도메인 ｂ에 대한 특이적 결합 활성을 갖는 변형된 유비퀴틴 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B(extradomain B)(ED-B)에 결합할 수 있고 변형된 유비퀴틴으로부터 얻어지는 신규의 헤테로-다중 결합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약제학적 및/또는 진단학적 활성 성분에 융합된 상기 헤테로-다중 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 상기 단백질의 의학적 치료 분야에서의 용도에 관한 것이다.

Description

피브로넥틴의 엑스트라도메인 Ｂ에 대한 특이적 결합 활성을 갖는 변형된 유비퀴틴 단백질{MODIFIED UBIQUITIN PROTEINS HAVING A SPECIFIC BINDING ACTIVITY FOR THE EXTRADOMAIN B OF FIBRONECTIN}
본 발명은 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B(extradomain B)(ED-B)에 결합할 수 있는 신규의 헤테로-다중 결합 단백질(hetero-multimeric proteins)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약제학적 및/또는 진단학적 활성 성분에 융합된 상기 헤테로-다중 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 이러한 헤테로-다중 결합 단백질 또는 융합 단백질의 생성 방법 및 상기 헤테로-다중 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물 및/또는 진단 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 단백질을 인코딩하는 DNA를 포함하는 라이브러리에 관한 것이다.
추가적인 예에서, 본 발명은 상기 헤테로-다중 결합 단백질 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 단백질, 융합 단백질, 벡터 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 바람직한 예에서, 상기 헤테로-다중 결합 단백질 또는 융합 단백질은 약물 또는 진단제에 포함된다. 추가로, 의학적 치료에 상기 재조합 단백질 또는 융합 단백질의 사용 뿐만 아니라 상기 재조합 단백질 또는 융합 단백질을 제조하는 방법이 기술된다.
면역글로불린이 아닌 아미노산들로 구성된 결합분자에 대한 수요가 증대되고 있다. 지금까지는 항체들이 결합분자들 중 가장 잘 체계화된 부류로 대표되고 있으나, 면역글로불린은 주요한 결함을 갖고 있기 때문에 높은 친화도와 특이도로 리간드를 타겟팅하기 위한 새로운 결합분자들에 대한 요구가 여전히 있다. 비록 항체들이 상당히 용이하게 제조될 수 있고 어떠한 타겟에 대해서도 거의 지향성을 가질 수 있지만, 복잡한 분자 구조를 갖고 있다. 간단한 방식으로 사용될 수 있는 보다 작은 분자들에 의해 항체를 대체하고자 하는 계속적인 요구가 있다. 이러한 대안 결합제는 예를 들어 진단, 예방, 질병의 치료 등의 의료 분야에서 유리하게 사용될 수 있다.
통상 단백질 스캐폴드라고 불리는 상대적으로 한정된 3차 구조를 갖는 단백질은 상기 대안 결합제의 설계를 위한 출발물질로서 사용될 수 있다. 이들 스캐폴드는 전형적으로 특이적 또는 무작위 서열 변이로 수정가능한 하나 이상의 영역을 포함하고, 이러한 서열 무작위화가 종종 수행되어 특이적 결합 분자가 선택될 수 있는 단백질 라이브러리를 생성하게 된다. 항체 보다 작은 크기를 갖고 타겟 항원에 대해 상응하는 친화도 또는 보다 양호한 친화도를 갖는 분자들은 약동학적 특성(pharmacokinetic properties) 및 면역원성의 관점에서 항체 보다 우수할 것으로 기대된다.
다수의 앞선 접근방법들이 결합 단백질의 출발물질로서 단백질 스캐폴드를 사용했다. 예를 들어, 국제공개공보 WO 99/16873호에서는 특정 리간드에 대해 결합 활성을 나타내는 리포칼린 패밀리(lipocalin family)(소위 "안티칼린")의 변형된 단백질을 개발한 것을 설명하고 있다. 리포칼린 패밀리의 펩타이드 구조는 유전 공학 기법을 이용하여 원래의 리간드 결합 포켓에서 아미노산을 치환하여 변형된다. 면역글로불린과 같이, 안티칼린은 분자 구조들을 확인하거나 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 항체와 유사한 방식으로 유연한 루프 구조가 변형되고 이러한 변형은 원래의 리간드와는 다른 리간드를 인식할 수 있도록 한다.
국제공개공보 WO 01/04144호는 본래 결합 부위가 없는 베타 시트 구조의 단백질에서 단백질 표면 상에 인공적으로 결합 도메인을 생성하는 것을 기술하고 있다. 이러한 새로이 생성된 인공 결합 도메인, 예를 들어 높은 친화도 및 특이도로 리간드와 상호작용하는 γ-크리스탈린(γ-crystallin)(수정체 구조 단백질)에서의 변이들을 얻을 수 있다. 이미 존재하고 안티칼린에 대해 앞서 언급한 바와 같은 유연한 루프 구조로부터 형성된 결합 부위의 변형과는 대조적으로 이러한 결합 도메인은 베타 시트의 구조 상에 새로이 생성된 것이다. 그러나, 국제공개공보 WO 01/04144호는 새로운 결합 특성의 생성을 위해 상대적으로 큰 단백질의 전환만을 기술하고 있다. 국제공개공보 WO 01/04144호에 따른 단백질들은 그 크기로 인하여 수고를 요하는 방법에 의해 유전 공학 수준에서 변형될 수 있다. 더욱이, 지금까지 개시된 단백질들에서는 전체 아미노산의 백분율에서 상대적으로 적은 비율만이 변형되어야 단백질의 전체 구조를 유지할 수 있다. 따라서, 단백질 표면의 상대적으로 작은 영역만이 이전에 존재하지 않은 결합 특성의 생성을 위해 사용될 수 있다. 또한, 국제공개공보 WO 01/04144호는 γ-크리스탈린에 대한 결합 특성 생성만을 개시하고 있다.
국제공개공보 WO 04/106368호는 유비퀴틴 단백질에 기초한 인공적인 결합 단백질의 생성을 기술하고 있다. 유비퀴틴은 서열에서 높은 수준으로 보존적인 작은 단량체의 사이토졸 단백질(cytosolic protein)로서 원생동물부터 척추동물에 이르기까지 모든 알려진 진핵 세포 내에 존재한다. 유기체에서, 유비퀴틴은 세포 단백질의 분해 조절에서 중요한 역할을 하고 있다. 이러한 목적을 위해 분해대상이 되는 단백질은 연속적인 효소처리 과정 중 유비퀴틴 또는 폴리유비퀴틴 체인에 공유적으로 결합되고, 유비퀴틴 표지 때문에 선택적으로 분해된다. 최근의 연구 결과에 따르면, 유비퀴틴 또는 유비퀴틴에 의한 단백질의 표지는 각각 몇몇 단백질들의 도입 또는 이들의 유전자 조절과 같은 다른 세포 과정에서도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
유비퀴틴의 생리학적 역할의 규명 이외에도 유비퀴틴은 구조적 특성 및 단백질-화학 특성 때문에 연구 대상이 되고 있다. 유비퀴틴의 폴리펩타이드 체인은 이례적으로 치밀한 α/β 구조(Vijay-Kumar, 1987) 내에 접혀져 있는 76개의 아미노산으로 구성되며, 상기 폴리펩타이드 체인의 거의 87%는 수소 결합에 의해 2차 구조 요소들의 형성에 관여한다. 2차 구조는 3과 1/2 회전의 알파 헬릭스 구조이며 4개의 가닥으로 구성된 역평행 β 시트 구조이다. 이들 요소들의 특징적인 배열 (역평행 β 시트는 알파 헬릭스가 채워진 뒤쪽으로 단백질 표면에 대해 노출되고 알파 헬릭스는 상부에서 수직으로 놓여진 배열)은 소위 유비퀴틴-유사 폴딩 모티브로서 통상 간주된다. 추가적인 구조적 특징은 알파 헬릭스와 β 시트 사이의 단백질 내부에서의 소수성 영역이다.
유비퀴틴은 크기가 작기 때문에 화학적 합성 및 바이오테크놀로지 방법 모두에 의해 인공적으로 제작될 수 있다. 유리한 폴딩 특성 때문에, 유비퀴틴은 대장균과 같은 미생물을 이용한 유전공학 기법에 의해 세포기질 또는 주변 세포질 공간 내에 상대적으로 많은 양으로 생산될 수 있다. 주변 세포질 내에서 지배적인 산화 조건 때문에 주변 세포질 공간 내에서의 유비퀴틴 생성 전략은 일반적으로 분비성 단백질 생산을 위해 유보된다. 간단하고 효율적인 세균 내 제조 때문에 유비퀴틴은 생산에 문제가 있는 다른 외부 단백질에 대한 융합 파트너로서 사용될 수 있다. 유비퀴틴에 융합하는 것은 용해도를 향상시키고 향상된 수율의 달성을 가져온다.
항체 또는 다른 대안 스캐폴드에 비해, 유비퀴틴 단백질에 기초한 인공 결합 단백질(Affilin®으로도 불림)은 작은 크기, 높은 안정성, 높은 친화도, 높은 특이도, 비용면에서 효율적인 미생물 생산 및 혈청 반감기 조정과 같은 많은 장점을 갖는다. 그러나, 특정 타겟에 대한 높은 친화도를 가지는 새로운 치료적 접근에서 이들 단백질을 추가로 개발할 필요성이 여전히 있다. 국제공개공보 WO 05/05730호는 인공 결합 단백질을 얻기 위해 유비퀴틴 스캐폴드의 사용을 일반적으로 기술하고 있으나, 피브로넥틴의 ED-B에 특이적으로 높은 친화도를 갖고 결합하도록 유비퀴틴 단백질을 어떻게 변형할 것인지에 대해서는 해결책이 제시되어 있지 않다.
국제공개공보 WO 2008/022759호는 새로운 결합 단백질을 얻기 위해 FYN 카이네이즈의 SH3(Src homology 3 domain)을 사용한 재조합 결합 단백질을 기술하고 있다. 단백질 치료제 및/또는 진단제를 개발하기 위해 RT 루프 및/또는 Src 루프를 돌연변이시킴으로써 타겟 특이도가 디자인될 수 있는 것이 확인되었다. 리포칼린에서 스캐폴드로서 사용된 것과 유사하게, 돌연변이 대상이 되는 아미노산 잔기들은 가변적이고 유연한 루프 영역에 위치하는데, 이는 항체/항원 결합 기능의 기초 원리를 모방하고 있다. 항체가 에피톱에 결합하게 하는 상호작용 부위의 전체적인 유연성은 주로 엔트로피적으로 이루어지는 과정이다. 그러나, 이러한 과정은 유연한 상보성 결정지역(CDR; complementarity determining region)의 결합시 이동성 상실에 의한 바람직하지 않은 엔트로피 분담(기여)을 유도하게 된다. 이와는 대조적으로, 본 발명자들은 스캐폴드로서 유비퀴틴을 사용하여 유연한 루프 영역 내에서 아미노산 잔기를 변경하지 않고 β 시트 영역의 단단하고 유연하지 않은 β 스트랜드들 내의 아미노산 잔기 또는 베타 가닥들에 근접한 아미노산 잔기를 변경하였다. 유비퀴틴의 유연하지 않고 단단한 β 스트랜드들 내의 아미노산 잔기 또는 β 스트랜드들에 인접한 아미노산 잔기를 ED-B에 대한 결합 영역으로 선택하는 장점은 특히 다음과 같다: 결합 파트너는 단단한 결합을 위해 적합한 상보적인 구조를 이미 제공하고 있다고 생각된다. 결론적으로, 이들 상호작용은 결합 파트너의 보다 단단한 구조의 형상, 하전 및 친수성/소수성 요소들에서의 상보성을 수반한다. 이러한 단단한 몸체의 상호작용들은 인터페이스를 최적화하고 생물학적 기능을 조정한다.
피브로넥틴(FN)은 건강한 조직과 체액에서 풍부하게 발현되는 고분자량의 세포외 기질인 당단백질의 중요한 부류이다. 이들의 주요 역할은 다수의 다른 세포외 기질에 세포의 부착을 촉진하는 것이다.
배양 중의 형질전환되지 않은 세포 표면 상에 피브로넥틴의 존재와 형질전환된 세포에서 피브로넥틴이 존재하지 않는 것은 피브로넥틴이 중요한 부착 단백질인 것을 확인시켜 준다. 피브로넥틴은 수많은 다양한 다른 분자들, 예를 들어 콜라겐, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulphate-proteoglycans) 및 피브린과 상호작용하여 세포 형상 및 세포골격 생성을 조절한다. 또한, 피브로넥틴은 세포 이동 및 배아 발생(embryogenesis) 동안에 세포 분화에 관여한다. 피브로넥틴은 상처 치유에도 중요한 역할을 담당하는데, 대식세포 및 다른 면역세포의 이동을 촉진하고 혈관의 손상된 영역에 혈소판이 부착되도록 함으로써 혈병의 생성에 중요한 역할을 담당한다.
피브로넥틴의 엑스트라도메인 B (ED-B)는 1차 RNA 전사물의 다른 방식의 스프라이싱에 의해 피브로넥틴 분자로 삽입된 작은 도메인이다. 상기 엑스트라도메인 B (ED-B)는 세포외 기질을 구성하는 피브로넥틴 분자에서 존재할 수도 있고 생략될 수도 있으며, 새로운 혈관 주위에서는 풍부하게 발현되지만 실제 모든 정상 성인 조직(자궁과 난소 제외)에서는 검출되지 않기 때문에 신생혈관생성 및 조직 리모델링과 연관된 가장 선택적인 마커들 중의 하나로 제시되고 있다. ED-B는 주로 암에 관련된 것으로 알려져 있다. ED-B의 높은 발현 수준은 유방암, 비소세포암(non-small cell lung cancer), 대장암, 췌장암, 인간 피부암, 간세포암(hepatocellular cancer), 두개 수막종(intracraneal meningeoma) 및 교모세포종(glioblastoma)을 포함하는 다수의 인간의 고형암들의 전이 부위 뿐만아니라 1차 병변 부위에서 검출된다(Menrad u. Menssen, 2005). 또한, ED-B는 진단제에 결합될 수 있어 바람직하게 진단 수단으로서 사용될 수 있다. 한가지 예로서 죽상경화판(atherosclerotic plaques)의 분자적 이미징에서의 사용과, 암환자의 면역신티그라피(immunoscintigraphy)에 의한 암검출에서의 사용이다. 많은 다른 진단학적 사용들이 사용가능하다.
피브로넥틴의 인간 엑스트라도메인(ED-B)의 91개 아미노산의 서열은 서열번호 2와 같다. 단백질 발현을 위해 개시 메티오닌이 추가되어야 한다. ED-B는 예를 들어 설치류, 소, 영장류, 육식동물, 인간 등과 같은 포유동물에서 풍부하게 존재한다. 인간의 ED-B와 100% 서열 상동성을 갖는 동물의 예로는 시궁쥐(Rattus norvegicus), 소(Bos taurus), 생쥐(Mus musculus), 말(Equus caballus), 붉은털원숭이(Macaca mulatta), 개(Canis lupus familiaris) 및 침팬지(Pan troglodytes)가 있다.
ED-B는 신생 혈관 구조에 특이적으로 축적되고 암에서의 분자적 관여에 대한 타겟으로 제시된다. 피브로넥틴 ED-B 도메인에 대한 다수의 항체 또는 항체 절편이 암과 다른 징후들에 대한 가능성 있는 치료제로서 당업계에 알려져 있다(예를 들어, WO 97/45544, WO 07/054120, WO 99/58570, WO 01/62800 등 참조). 인간의 단일 사슬 Fv 항체 절편인 ScFvL19 (L19로 호칭됨)는 피브로넥틴의 ED-B 도메인에 특이적이고 실험 종양 모델 및 암환자에서 모두 종양 신생혈관을 선택적으로 타겟팅하는 것으로 밝혀졌다. 또한, IL-12, IL-2, IL-10, IL-15, IL-24, 또는 GM-CSF와 같은 사이토카인과 항-ED-B 항체 또는 항-ED-B 항체 절편을 포함하는 컨쥬게이트는 특히 암, 신생혈관생성 또는 종양 성장을 억제하는 약제 제조를 위한 표적 약물로서 기술되어 있다(예를 들어, WO 06/119897, WO 07/128563, WO 01/62298 참조). 세포독성제 또는 면역증강제와 같은 적합한 이펙터에 접합된, 항-ED-B 항체 또는 L19와 같은 항-ED-B 항체 절편으로 고형암의 신생 혈관을 선택적으로 타겟팅하는 것은 동물실험에서 성공적인 것으로 증명되었다. 췌장암 치료를 위해, 인터루킨-2 부분(IL-2)과 항-ED-B 항체 부분을 포함하는 융합 단백질이 저분자 약물인 젬시타빈(Gemcitabine)(2'-데옥시-2',2'-디플루오로사이티딘)과 조합되었다(예를 들어, WO 07/115837 참조).
전술한 선행기술 문헌들은 새로운 ED-B 결합 단백질을 생성하기 위해 항체를 포함하는 다양한 단백질 스캐폴드의 사용을 기술하고 있다. 현재 입수가능한 화합물로 ED-B를 타겟팅하는 것은 단점들이 있다. ED-B에 대해 대등하거나 보다 높은 친화도를 갖는 작은 분자들(본 발명의 헤테로-다중결합 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합단백질)이 항체 또는 다른 결합 단백질에 비해 의미있는 장점을 가질 것으로 기대된다.
암은 전세계적으로 대표적 사망원인 중 하나이기 때문에 암을 타겟팅하는 향상된 약물에 대한 요구는 증대되고 있다. 현재의 화학치료제 및 방사선 치료는 암에 대한 선택성이 나쁜 문제가 있고 대부분의 화학치료제는 암 부위에 축적되지 못하여 종양 내에 충분한 수준으로 도입되지 못한다. 따라서, 암을 효과적으로 치료하기 위한 의학적 요구는 크다고 할 수 있다.
WO 2001/004144 A2 (2001.1.18) WO 2004/106368 A1 (2004.12.9) WO 2008/022759 A2 (2008.2.28)
본 발명의 목적은 피브로넥틴 엑스트라도메인 ED-B에 매우 높은 친화도로서 특이적으로 결합할 수 있는 유비퀴틴 기반의 헤테로-다중 결합 단백질을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 예를 들어 암치료에서의 사용을 위해 ED-B에 대해 매우 높은 결합 특이도를 갖는 새로운 결합 단백질을 확인하고 제공하는데 있다. 추가로, 본 발명은 상기 헤테로-다중 결합 분자를 제조하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
전술한 목적들은 첨부된 특허청구범위의 독립항의 기술적 사상에 의해 해결되며, 본 발명의 바람직한 실시예들은 후술하는 상세한 설명, 실시예 및 도면 뿐만아니라 특허청구범위의 종속항에 포함된다.
구체적으로, 본 발명은 인간 피브로넥틴의 ED-B에 결합할 수 있는 단백질을 제공한다.
본 발명의 인간 피브로넥틴의 ED-B에 결합할 수 있는 단백질은, 2개의 단량체 유비퀴틴(유비퀴틴 유닛)이 선단과 말단(head-to-tail)의 배열로 연결되어 있고 상기 각각의 단량체는 서열번호 1의 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 및 68 위치에서 적어도 6개의 아미노산의 치환에 의해 상이하게 변형되어 있는 변형된 헤테로-이량체 유비퀴틴 단백질을 포함하고, 상기 치환은 (1) 제1 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되고, 제2 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되며 선택적으로 아미노산 2 위치에서 추가적으로 치환되거나, (2) 제1 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되고, 제2 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되며 선택적으로 아미노산 2 위치에서 추가적으로 치환되는 것을 포함하며, 선택적으로 추가의 변형, 바람직하게는 다른 아미노산의 치환을 포함하고, 상기 변형된 단량체 유비퀴틴 유닛은 상기 서열번호 1에 대해 80% 상동성, 적어도 83% 상동성, 적어도 85% 상동성 및 적어도 90% 상동성으로 구성된 군 중 적어도 하나의 아미노산 상동성을 갖고, 상기 단백질은 상기 피브로넥틴의 ED-B 도메인에 대해 Kd = 10-7- 10-12 M의 특이적인 결합 친화도를 가지며 상기 피브로넥틴의 ED-B 도메인에 대해 1가의 결합 활성을 나타낸다.
바람직한 실시예에서, 상기 단백질은 재조합 단백질이다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 각각의 단량체 유비퀴틴 유닛에서 서열번호 1의 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 및 68 위치의 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 또는 모든 아미노산들이 변형된다. 본 발명은 각각의 단량체 유닛, 즉 제1 유닛 및 제2 유닛에서 이러한 변형들 각각의 조합을 허용하는 것을 본 발명의 기술분야의 당업자라면 이해할 것이다. 예를 들어, 제1 단량체 유닛이 6개의 변형을 포함하는 경우 제2 단량체 유닛은 7개 또는 8개 변형을 포함할 수 있고, 제1 단량체 유닛이 8개의 변형을 포함하는 경우 제2 단량체 유닛은 7개의 변형을 포함할 수 있는 것 등이다. 상기 열거된 아미노산들 각각은 제1 유닛 및 제2 유닛에서 선택될 수 있고, 그리고 나서 양 유닛은 조합될 수 있다. 바람직한 치환들은 본 명세서에서 후술된다.
본 명세서에서 사용되는 중요 용어의 정의
"피브로넥틴 엑스트라도메인 B" 또는 간략하게 "ED-B"로 표시되는 용어는 서열번호 2와 적어도 70%의 서열 상동성, 선택적으로 75%, 추가 선택으로서 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 또는 97%, 또는 그 이상, 또는 100%의 서열 상동성을 나타내고 ED-B의 앞서 정의된 기능성을 갖는 모든 단백질을 포함하는 것이다.
"결합할 수 있는 단백질" 또는 "결합 단백질"이라는 용어는 이후 추가로 정의되는 바와 같이 ED-B에 대한 결합 도메인을 포함하는 유비퀴틴 단백질을 지칭한다. 이러한 유비퀴틴에 기초한 결합 단백질은 결합 도메인이 아닌 추가 단백질 도메인을 포함할 수 있는데, 예를 들어, 다중 결합 부분(multimerization moieties), 폴리펩타이드 태그, 폴리펩타이드 링커 및/또는 비-단백질 폴리머 분자를 포함할 수 있다. 비-단백질 폴리머 분자의 예로는 히드록시에틸 전분(hydroxyethyl starch), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 등이 있다.
항체 및 항체 절편(단편)은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 결합 단백질은 항체, 또는 Fab 또는 scFv와 같은 항체 절편이 아니다. 또한, 본 발명의 결합 도메인은 항체에 존재하는 면역글로불린 접힘(fold)을 포함하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "리간드", "타겟(표적)" 및 "결합 파트너"라는 용어는 동의어로 사용되고 서로 대체되어 사용될 수 있다. 리간드는 헤테로-다중 결합 변형 유비퀴틴 단백질에 대해 본 명세서에서 정의된 바와 같은 친화도로 결합할 수 있는 분자이다.
"유비퀴틴 단백질"이라는 용어는 서열번호 1에 따르는 유비퀴틴과 하기 정의에 따르는 유비퀴틴의 변형을 포함한다. 유비퀴틴은 진핵생물에서 높은 수준으로 보존되어 있다. 예를 들어, 현재까지 조사된 모든 포유동물에서 유비퀴틴은 동일 아미노산 서열을 갖고 있다. 특히, 사람, 설치류, 돼지 및 영장류의 유비퀴틴 분자가 바람직하다. 추가로, 다른 진행생물 자원의 유비퀴틴도 사용될 수 있다. 예를 들어, 효모의 유비퀴틴은 서열번호 1의 서열과 단지 3개의 아미노산이 다를 뿐이다. 통상, "유비퀴틴 단백질"이라는 용어에 의해 포괄되는 유비퀴틴 단백질은 서열번호 1에 대해 70% 이상의 아미노산 상동성을 나타내고, 바람직하게는 75% 이상 또는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 또는 97%까지의 서열 상동성을 나타낸다.
"변형된 유비퀴틴 단백질"은 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실 또는 이들의 조합 중 어느 하나에 해당하는 유비퀴틴 단백질의 변형을 지칭하고, 치환이 가장 바람직한 변형으로서 전술한 변형들 중 하나에 의해 보충될 수 있다. 상기 변형된 단량체 유비퀴틴 유닛은 서열번호 1에 대해 80% 상동성, 적어도 83% 상동성, 적어도 85% 상동성 및 적어도 90% 상동성으로 구성된 군 중 적어도 하나의 아미노산 상동성을 갖기 때문에 변형의 수는 엄격히 제한된다. 따라서, 단량체 유닛에서의 전체 치환수는 최대 15개 아미노산으로 제한되는데 이는 80% 아미노산 상동성에 해당된다. 헤테로-이량체 유비퀴틴 분자에서 변형된 아미노산의 전체 수는 30개 아미노산이며, 이는 헤테로-이량체 단백질에 기초로 할 때 20% 아미노산 변형에 해당된다. 서열번호 1의 기본 단량체 서열을 갖는 이량체의 변형되지 않은 유비퀴틴 단백질에 대해 이량체의 변형된 유비퀴틴 단백질의 아미노산 상동성은 80% 상동성, 적어도 83% 상동성, 적어도 85% 상동성 및 적어도 90% 상동성으로 구성된 군 중 적어도 하나의 아미노산 상동성이 선택된다.
서열번호 1의 아미노산 서열에 대한 유비퀴틴 유도체의 서열 상동성의 정도를 결정하기 위해, 예를 들어 SIM 로컬 유사도 프로그램(SIM Local similarity program) (Xiaoquin Huang and Webb Miller, Advances in Applied Mathematics, vol. 12: 337- 357, 1991) 또는 Clustal, W.가 사용될 수 있다(Thompson et al., Nucleic Acids Res., 22(22): 4673-4680, 1994.). 바람직하게는, 서열번호 1에 대한 변형된 단백질의 서열 상동성 정도는 서열번호 1의 완전한 서열에 대한 상대적인 값으로 결정된다.
본 발명의 "헤테로-이량체 융합 단백질" 또는 "헤테로-이량체 단백질"은 특이적 결합 파트너로서 ED-B에 대한 1가 결합 특성을 함께 제공하는 2개의 상호 작용하는 결합 도메인 영역(결합 도메인)을 갖는 2개의 상이하게 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질을 포함하는 단백질로 간주된다. 헤테로-이량체는 2개의 단량체 유비퀴틴 분자들을 융합하여 얻을 수 있고 이들 분자 모두 서로 상이하게 변형되어 있다.
1가 결합 활성을 갖는 헤테로-다중 결합 단백질(여기서는 헤테로-이량체 단백질)을 생성하기 위해 상이하게 변형된 유비퀴틴 단량체를 다중 결합(multimerization)시키는 장점은 ED-B에 대한 새로운 높은 친화도 결합 특성을 생성하기 위해 변형될 수 있는 아미노산 잔기들의 전체 수를 증가시킬 수 있다는 것이다. 주요 장점은 비록 보다 많은 아미노산이 변형되어도 ED-B에 대해 새롭게 생성된 결합 단백질 스캐폴드의 전체 안정성을 감소시키지 않으면서 단백질의 화학적 성질은 유지된다는 것이다. 변형된 잔기들은 2개의 단량체 유비퀴틴 단백질에 할당될 수 있기 때문에 ED-B에 대한 새로운 결합 부위를 생성하기 위해 변형될 수 있는 잔기의 전체 수는 증가한다. 따라서, 변형 수는 변형된 단량체 유비퀴틴 분자의 수에 대응하는 2개가 될 수 있다. 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 단백질의 모듈 단위 구조(modular structure)는 변형된 아미노산의 전체 수를 증가시키도록 하는데, 이는 상기 변형된 아미노산들이 2개의 단량체 유비퀴틴 분자들 상에 포함되기 때문이다. 본 발명의 방법은 ED-B에 대한 하나의 1가 특이성 (하나의 에피톱에 대해서임)을 갖는 헤테로-이량체 유비퀴틴 분자들의 확인을 위해 제공된다.
따라서, 결합 파트너에 대한 공통 결합 부위를 갖는 헤테로-이량체의 사용은 최종 결합 분자의 단백질의 화학적 성질에 대해 부적합하게 영향을 주지 않고 증가된 수의 변형된 잔기들을 도입할 수 있는 가능성을 열었는데, 이는 상기 변형된 잔기들의 전체 수가 이량체를 형성하는 2개의 단량체 유닛에 걸쳐 분포되기 때문이다. ED-B에 결합하는 상기 헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 단백질은 단백질 라이브러리로 존재한다.
"1가"(monovalent)는 변형된 이량체 유비퀴틴의 제1 단량체 유닛과 제2 단량체 유닛에서 생성된 양쪽 결합 영역들이 상호 의존적인 방식과 조합된 방식으로 ED-B에 함께 결합하는 능력, 즉 양쪽 결합 영역들이 함께 1가 결합 활성을 형성하기 위해 작용하는 능력으로서 이해되어야 한다. 상기 헤테로-이량체 분자 내의 제1 변형된 유비퀴틴 및 제2 변형된 유비퀴틴의 각각의 결합 영역을 별개로 취하면 이량체 분자 보다 훨씬 낮은 효율 및 친화도로 ED-B에 결합할 것이 명백하다. 양쪽 결합 영역은 헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 단백질의 표면 상에서 연속적인 아미노산 영역으로서 형성된 특유의 결합 영역을 형성하고 상기 변형된 유비퀴틴은 따로 떨어진 각각의 단량체 단백질 보다 ED-B에 대해 보다 높은 효율로 결합한다. 본 발명에 따르면, 2개의 단량체 단백질은 가장 강력한 결합 유비퀴틴 분자들을 스크린한 후 서로 연결되지 않지만 스크린 과정은 이미 헤테로-이량체 유비퀴틴의 존재 하에서 수행되는 것이 특히 중요하다. 가장 강력한 결합 유비퀴틴 분자들에 대한 서열 정보를 받은 후, 이들 분자들은 다른 방법, 예를 들어 화학적 합성 또는 유전공학기법, 예를 들어 2개의 이미 확인된 단량체 유비퀴틴 유닛들을 함께 연결함으로써 얻어질 수 있다.
본 발명에 따르면, 하나의 리간드에 결합하는 2개의 상이하게 변형된 유비퀴틴 단량체들은 유전공학기술 등을 이용하여 서로에 대해 선단과 말단(head-to-tail)이 융합되어 연결된다. 상이하게 변형되어 융합된 유비퀴틴 단량체들은 1가 방식으로 결합하고 양쪽 "결합 도메인 영역"("BDR")이 함께 작용하는 경우에만 효과를 나타낸다. "결합 도메인 영역"은 타겟 결합에 관여하는 서열번호 1의 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66, 68 위치 중 적어도 6개의 아미노산에서 변형된 아미노산을 갖는 유비퀴틴 단량체 상의 영역으로서 정의된다.
헤테로-이량체 단백질을 형성하는, 변형되어 연결된 유비퀴틴 단량체들은 단일 연속 결합 영역을 통해 동일한 에피톱에 결합한다. 상기 헤테로머(heteromer)의 연속 영역은 2개의 상이하게 변형된 유비퀴틴 단량체들에 의해 형성된 2개의 모듈의 양쪽 결합 결정 영역(binding determining region)에 의해 형성된다.
"선단과 말단의 융합"("head to-tail fusion")은 이량체에 포함된 유닛들의 수에 의존하여 N-C-N-C-의 방향으로 이들을 연결하여 2개의 단백질을 함께 융합하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 선단과 말단의 융합에서 유비퀴틴 단량체는 링커 없이 직접 연결될 수 있다. 대안으로, 유비퀴틴 단량체의 융합은 링커, 예를 들어 적어도 아미노산 서열 GIG를 갖는 링커, 적어도 아미노산 서열 SGGGG를 갖는 링커 또는 다른 링커, 예를 들어 GIG, SGGGG, SGGGGIG, SGGGGSGGGGIG 또는 SGGGGSGGGG를 통해 수행될 수 있다. 또한, 2개의 유비퀴틴 단량체의 유전적 융합을 위한 다른 링커들도 당업계에 알려져 있고 사용될 수 있다.
본 발명의 변형된 유비퀴틴 단백질은 ED-B 타겟 또는 리간드(본 명세서에서는 이들 표현을 교대로 사용함)에 대해 신규의 결합 친화도를 갖도록 유전공학적으로 처리된 단백질이다. "치환"이라는 용어는 원래 아미노산에 화학기 또는 잔기를 치환하거나 추가함으로써 아미노산이 화학적으로 변형된 것도 포함한다. 베타 시트 영역의 적어도 하나의 베타 시트 스트랜드에 위치한 아미노산 또는 상기 베타 시트 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 아미노산을 포함하는 상기 단백질의 적어도 하나의 표면 노출 영역에서의 아미노산 치환이 중요하다.
ED-B에 특이적인 새로운 결합 도메인의 생성을 위한 아미노산 치환은 바람직한 아미노산에 의해, 즉 ED-B에 대한 새로운 결합 특성을 생성하는 변형을 위한 아미노산에 의해 본 발명에 따라 수행될 수 있는데, 상기 아미노산의 특정 화학적 성질 또는 측쇄가 치환대상이 되는 아미노산의 특정 화학적 성질 또는 측쇄와 유사할 것을 고려할 필요가 없고 어떠한 바람직한 아미노산도 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다.
선택된 아미노산의 변형 과정은 바람직하게는 무작위 돌연변이생성에 의한 유전자 수준 상의 돌연변이, 즉 선택된 아미노산의 무작위 치환에 의해 본 발명에 따라 수행된다. 바람직하게는, 유비퀴틴의 변형은 각각의 단백질에 속하는 DNA의 전환을 위한 유전공학기법에 의해 수행된다. 바람직하기로는, 유비퀴틴 단백질의 발현은 원핵생물 또는 진핵생물에서 수행된다.
치환은 특히 베타 시트의 4개의 베타 스트랜드들의 표면 노출 아미노산 또는 유비퀴틴 단백질의 베타 시트 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 표면 노출 아미노산에서 일어난다. 각각의 베타 스트랜드는 통상 5개 내지 7개의 아미노산으로 구성된다. 서열번호 1을 참조하면, 예를 들어 베타 스트랜드는 일반적으로 아미노산 잔기 2-7, 12-16, 41-45 및 65-71을 포괄한다. 추가로 바람직하게 변형될 수 있는 영역은 베타 시트 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치(즉, 1, 2, 또는 3)를 포함한다. 특히, 추가로 바람직하게 변형될 수 있는 바람직한 영역은 특정 아미노산 잔기 8-11, 62-64 및 72-75를 포함한다. 상기 바람직한 영역은 2개의 베타 스트랜드를 함께 연결하는 베타 회전(beta turn)을 포함한다. 하나의 바람직한 베타-회전은 아미노산 잔기 62-64를 포함한다. 베타 시트 스트랜드에 가장 인접한 가장 바람직한 아미노산은 위치 8의 아미노산이다. 또한, 아미노산 치환을 위한 추가의 바람직한 예는 위치 36, 44, 70 및/또는 71이다. 예를 들어, 추가로 바람직하게 변형될 수 있는 이들 영역은 아미노산 62, 63 및 64 (3개의 아미노산), 또는 아미노산 72 및 73 (2개의 아미노산), 또는 아미노산 8 (1개의 아미노산)을 포함한다.
바람직한 실시예에서, 상기 아미노산 잔기들은 아미노산 치환에 의해 전환될 수 있다. 그러나, 결실 및 삽입도 허용가능하다. 추가되거나 결실될 수 있는 아미노산의 수는 단량체 유비퀴틴 서브 유닛에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산을 제한되고, 따라서 이량체 유비퀴틴 단백질에 대해서는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 아미노산으로 제한된다. 일실시예에서, 아미노산 삽입은 수행되지 않는다. 또 다른 실시예에서는 결실이 수행되지 않았다.
본 발명의 변형된 유비퀴틴 단백질이 청구범위에 특정되고 상세한 설명에서 설명된 상기 치환들 외에 하나 이상의 아미노산의 결실 및/또는 추가를 포함한다면, 대응하는 단백질을 서로에 대해 할당하기 위해 야생형의 인간 유비퀴틴(서열번호 1)에 대한 아미노산 위치들은 상기 변형된 유비퀴틴과 정렬시켜야 한다. 융합 단백질(이하 참조)의 경우, 각각의 단량체 유비퀴틴 서브유닛에 대한 숫자 매김(및 정렬)은 동일한 방식, 즉 예를 들어 이량체의 정렬이 각각의 서브 유닛에 대한 아미노산 위치 1에서 시작하는 방식으로 수행된다.
바람직하게는 포유동물, 예를 들어 인간의 단량체 유비퀴틴에서 베타 스트랜드에 존재하는 아미노산의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 25% 또는 상기 베타 스트랜드에 인접하는 3개의 아미노산까지의 위치들은 본 발명에 따라 변형, 바람직하게는 치환되어 이전에 존재하지 않았던 결합 특성을 생성할 수 있다. 최대한 허용가능한 범위에서 바람직하게는 베타 스트랜드에 존재하는 아미노산의 약 50%, 보다 바람직하게는 약 40% 또는 약 35%, 또는 약 30%까지 또는 약 25%까지 또는 상기 베타 스트랜드에 인접하는 3개의 아미노산까지의 위치들은 변형, 바람직하게는 치환된다. 하나의 베타 스트랜드에서 통상 1개 내지 4개의 아미노산들이 변형된다. 일실시예에 있어서, 바람직하게는 제1 베타 스트랜드 및 제4 베타 스트랜드의 6개 아미노산들 중 3개의 아미노산, 예를 들어 아미노산 잔기 2-7 또는 65-71의 영역이 변형된다.
헤테로-이량체를 위한 단위 유닛으로 사용되는 본 발명에 따른 변형된 단량체 유비퀴틴은 전체적으로 아미노산의 20%까지 이른다. 이를 고려하면, 변형된 유비퀴틴 단백질의 서열번호 1에 대한 서열 상동성은 적어도 80%이다. 본 발명의 추가 실시예에서, 아미노산 수준의 서열 상동성은 적어도 83%, 적어도 85%, 적어도 87%이고, 더욱이 서열번호 1의 아미노산 서열에 대한 서열 상동성은 적어도 90%, 적어도 92% 또는 적어도 95%이다. 본 발명은 변형된 유비퀴틴 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 97% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것도 포괄한다.
본 발명의 추가의 실시예에서, 유비퀴틴은 서열번호 1의 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 및/또는 68 위치에서 3개의 아미노산, 4개의 아미노산, 5개의 아미노산, 6개의 아미노산 또는 7개의 아미노산이 변형된다. 다른 실시예에서, 상기 위치에서 변형되는 유비퀴틴은 미리 사전에 변형된다. 예를 들어, 추가의 변형은 아미노산 74 및 75에서의 변형 또는 아미노산 45에서의 변형을 포함하여 보다 양호한 안정성 또는 단백질의 화학적 특성을 생성할 수 있다. 변형된 유비퀴틴 단량체는 전체적으로 서열번호 1의 유비퀴틴의 아미노산이 9, 10, 11, 12, 13, 14개까지 변형 그리고 최대 15개의 아미노산이 변형, 바람직하게는 치환되어 수득될 수 있다. 일례에 따르면, 변형된 단량체 유비퀴틴은 14개의 치환과 1개의 결실을 갖는 형태로 수득될 수 있다. 유비퀴틴의 아미노산 전체 수에 기초하면, 이는 약 20%에 해당한다. 이는 매우 적은 비율의 치환이 단백질의 접힘(folding)을 방해하는 것이 일반적인 것을 감안할 때 매우 이례적이며 놀라운 예상 밖의 결과이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유비퀴틴 단백질의 표면 상에 연속 영역을 형성하는 새로운 ED-B 결합 특성을 갖는 영역의 생성을 위해 상기 아미노산들이 변형된다. 이러한 방식에 있어서, 연속 영역은 ED-B에 결합 특성을 갖는 것으로 생성될 수 있다. 본 발명에 따르는 "연속영역(Contiguous region)"은 다음을 지칭한다: 측쇄의 소수성/친수성, 하전, 공간적 구조 때문에, 아미노산들이 대응하는 방식으로 그들의 환경과 상호작용하는 것을 의미한다. 환경은 용매, 통상 물 또는 다른 분자, 예를 들어 공간적으로 인접한 아미노산일 수 있다. 단백질에 대한 구조적 정보 및 각각의 소프트웨어에 의해 단백질의 표면은 특성화될 수 있다. 예를 들어, 단백질과 용매 원자들 사이의 인터페이스 영역은 이러한 인터페이스 영역이 어떻게 구조화되었지, 어느 표면 영역이 용매에 접근가능한지 또는 전하가 표면 상에 어떻게 분포되었는지에 대한 정보를 포함하는 방식으로 시각화될 수 있다. 예를 들어, 연속 영역은 적합한 소프트웨어를 사용한 상기 방식의 시각화에 의해 드러날 수 있다. 이러한 방법들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려져 있다. 본 발명에 따르면, 기본적으로 전체 표면 노출 영역 역시 새로운 결합 특성 생성을 위해 변형대상이 되는 표면 상의 연속 영역으로서 사용될 수 있다. 일실시예에 있어서, 이러한 목적을 위해 변형은 α-헬릭스 영역을 포함할 수도 있다. 헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 단백질에서 결합-결정 영역은, 하나의 결합 결정 영역 길이의 2배 길이가 되는 하나의 연속 영역을 함께 형성하는 표면-노출 영역들 중 2개를 포함한다.
베타 시트 영역의 적어도 하나의 베타 스트랜드 또는 상기 베타 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치들을 포함하는 상기 유비퀴틴 단백질의 적어도 하나의 표면-노출 영역에서의 아미노산 변형은 중요하다. "베타 시트 구조"는 필수적으로 시트-유사이고 거의 완전히 펴져 있는 것에 의해 정의된다. 폴리펩타이드 체인의 중단되지 않는 세그먼트로부터 형성된 알파 헬릭스와 대조적으로, 베타 시트는 폴리펩타이드 체인의 다른 영역들에 의해 형성될 수 있다. 이러한 방식으로, 1차 구조에서 거리를 두고 떨어진 영역들이 서로 근접하게 위치할 수 있게 된다. 베타 스트랜드는 전형적으로 5-10개의 아미노산 길이(유비퀴틴에서는 통상 5-6개 잔기)를 갖고 거의 완전히 펴져 있는 형태를 가지고 있다. 베타 스트랜드들은 서로에 대해 근접하게 되어 하나의 스트랜드의 C-O 그룹과 다른 스트랜드의 NH 그룹(또는 그 반대로) 사이의 수소결합을 형성하게 된다. 베타 시트들은 수개의 스트랜드들로 형성될 수 있고 시트-유사 구조를 갖는데, C 알파 원자 위치는 시트-유사 평면의 위 또는 아래 사이에서 번갈아 위치하게 된다. 아미노산 측쇄들은 이러한 패턴을 따르고, 따라서 교대로 상부를 향하거나 하부를 향하게 된다. 베타 스트랜드의 방향에 의존하여 시트는 평행 시트와 역평행 시트로 분류된다. 본 발명에 따르면, 이들 모두 돌연변이될 수 있고 청구된 단백질의 제조에 사용될 수 있다.
베타 스트랜드 및 베타 시트 구조의 돌연변이 생성을 위해, 베타 스트랜드 또는 상기 베타 스트랜드(베타 시트의 스트랜드임)에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치들이 유비퀴틴에서 선택되는데 표면에 근접한 것들이 선택된다. 표면-노출 아미노산들은 얻을 수 있는 X-선 결정학 구조에 대해 확인될 수 있다. 결정 구조를 얻을 수 없다면 컴퓨터 분석이 수행하여 표면-노출 베타 시트 영역 및 입수가능한 1차 구조에 대해 개개의 아미노산 위치들에 대한 접근성을 예상하거나, 3D 단백질 구조를 모델링하고 이러한 방식에서 가능한 표면-노출 아미노산들에 대한 정보를 얻을 수 있다. 이에 대한 추가 내용들은 예를 들어 J. Mol. Biol., 1987 Apr 5; 194(3):531-44. Vijay-Kumar S, Bugg C.E., Cook W.J.로부터 얻을 수 있다.
그러나, 돌연변이 대상이 되는 아미노산을 사전 선정하는 시간 소모적인 과정을 생략하고 베타 시트 내의 변형 또는 베타 시트 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치들의 변형을 수행하는 것도 가능하다. 베타 시트 구조 또는 베타 시트 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산을 인코딩하는 DNA 영역은 주변 DNA로부터 분리되어 무작위 돌연변이처리되고, 이후 유비퀴틴 단백질을 코딩하는 DNA(이로부터 베타 시트 구조 또는 베타 시트 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산을 인코딩하는 DNA 영역은 사전에 제거되었음)로 다시 삽입된다. 그리고 원하는 결합 특성을 갖는 돌연변이들에 대한 선정 과정이 수행된다.
본 발명의 다른 실시예에서, 표면에 근접한 베타 스트랜드 또는 베타 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산은 전술한 바와 같이 선택되고 이들 선택된 영역 내에서 돌연변이대상이 되는 아미노산 위치들이 확인된다. 이러한 방식으로 선택된 아미노산 위치들에 대해 위치지정돌연변이(site-directed mutagenesis), 즉 특정 아미노산을 인코딩하는 코돈이 사전에 선정된 다른 특정 아미노산을 인코딩하는 코돈에 의해 치환되는 방식에 의해 DNA 수준에서 돌연변이가 일어나도록 할 수 있고, 또는 치환되는 아미노산 위치는 정해지지만 새로운 아미노산과 이를 인코딩하는 코돈은 정해지지 않은 무작위 돌연변이가 일어나게 할 수도 있다.
"표면-노출 아미노산(surface-exposed amino acids)"은 주위 용매에 접근가능한 아미노산이다. 만약 유비퀴틴 단백질 내의 아미노산의 접근성이 트리펩타이드인 Gly-X-Gly 모델에서의 아미노산과 비교하여 8% 이상이면, 상기 아미노산은 "표면-노출"이라고 불린다. 이러한 단백질 영역 또는 개개의 아미노산 위치들은 각각 본 발명에 따라 수행되는 선정과정에서 가능한 결합 파트너를 위해 선호되는 결합 부위이기도 하다. 이에 대해 상세히 기술하고 있는 참고문헌(Caster et al., 1983 Science, 221, 709 - 713, and Shrake & Rupley, 1973 J. Mol. Biol. 79(2):351-371)은 본 발명의 명세서의 참고문헌으로서 통합된다.
새롭게 생성된 인공적인 결합 부위 영역에서 아미노산 치환에 의해 달라지는 유비퀴틴 단백질 스캐폴드의 변이들(원래의 단백질과 상이하고 또한 서로 상이함)은 각각의 서열 세그먼트에 대해 표적화된 돌연변이에 의해 생성될 수 있다. 이 경우, 극성, 하전, 용해도, 소수성 또는 친수성과 같은 특성들을 갖는 아미노산들은 각각 다른 특성들을 갖는 아미노산들에 의해 대체 또는 치환될 수 있다. 치환 이외에도 "돌연변이", "변형" 및 "대체" 역시 삽입과 결실을 포함한다. 단백질 수준에서 변형은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 방법에 따라 아미노산 측쇄의 화학적 변경에 의해서도 수행될 수 있다.
유비퀴틴에 대한 돌연변이생성 방법
각각의 서열 세그먼트에 대한 돌연변이 생성 출발점으로서 예를 들어 본 발명이 속하는 기술의 분야의 당업자에게 알려진 방법에 의해 준비, 변경 및 증폭이 가능한 유비퀴틴의 cDNA가 사용될 수 있다. 1차 서열의 상대적으로 작은 영역(약 1개-3개의 아미노산)에서의 위치 특이적 변경을 위해 상업적으로 구입가능한 시약과 방법이 사용가능하다("Quick Change", Stratagene; "Mutagene Phagemid in vitro Mutagenesis Kit", Biorad). 보다 큰 영역의 위치지정돌연변이를 위해서는 예를 들어 당업계에 널리 알려진 PCR(polymerase chain reaction) 등이 사용될 수 있다. 상기 목적을 위해 원하는 부위에서 축퇴된(degenerated) 염기 쌍 구성을 갖는 합성 올리고데옥시뉴클레오티드의 혼합물이 돌연변이 도입을 위해 사용될 수 있다. 게놈 DNA에서 자연적으로 존재하지 않는 염기 쌍 유사체, 예를 들어 이노신을 사용하여 상기 돌연변이 도입 과정은 달성될 수도 있다.
베타 시트 영역의 하나 이상의 베타 스트랜드 또는 베타 시트 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치들에 대한 돌연변이 생성 출발점은 예를 들어 유비퀴틴 cDNA이거나 게놈 DNA일 수 있다. 또한, 유비퀴틴 단백질을 코딩하는 유전자는 합성되어 준비될 수도 있다.
돌연변이 생성을 위해 알려지고 사용가능한 방법들로는 위치특이적 돌연변이생성법(site-specific mutagenesis), 무작위 돌연변이생성법, PCR을 이용한 돌연변이생성법 또는 이들과 유사한 방법들이 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 돌연변이대상이 되는 아미노산 위치들은 미리 결정된다. 돌연변이대상이 되는 아미노산의 선정과정은 변형되어야 하는 아미노산과 관련하여 청구항 1항의 제한을 충족하도록 수행된다. 각각의 경우, 상이한 돌연변이들의 라이브러리가 공지된 방법을 이용하여 스크린되어 확립된다. 통상 변형대상이 되는 아미노산의 사전 선정은 변형되는 유비퀴틴 단백질에 대한 구조 정보가 충분히 입수될 수 있기 때문에 용이하게 수행될 수 있다.
예를 들어, PCR, 화학적 돌연변이생성 또는 세균성 돌연변이 균주(bacterial mutator strain)에 의한 긴 서열 세그먼트의 돌연변이생성 뿐만아니라 표적화된 돌연변이생성은 종래 기술로서 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 돌연변이는 아미노산 코돈 NNK을 운반하는 DNA 올리고뉴클레오티드 어셈블리에 의해 수행된다. 그러나, 다른 코돈(트리플렛) 역시 사용될 수 있음은 물론이다. 돌연변이는 베타 시트 구조가 유지되는 것이 바람직한 방식으로 수행된다. 통상, 돌연변이는 유비퀴틴 단백질 표면 상에 노출된 안정한 베타 시트 영역의 바깥쪽에서 일어난다. 상기 돌연변이는 위치특이적 돌연변이와 무작위 돌연변이를 포함한다. 1차 구조에서 비교적 작은 영역(약 3개-5개 아미노산)을 포함하는 위치특이적 돌연변이는 상업적으로 입수가능한 Stratagene®의 키트(QuickChange®) 또는 Bio-Rad®의 키트(Mutagene® phagemid in vitro mutagenesis kit)에 의해 생성될 수 있다(미국특허 제5,789,166호; 미국특허 제4,873,192호 참조).
보다 확장된 영역이 위치특이적 돌연변이 대상인 경우, DNA 카세트가 준비되어야 하는데 여기서 돌연변이 대상이 되는 영역은 돌연변이된 위치들과 불변 위치들을 포함하는 올리고뉴클레오티드 어셈블리에 의해 얻어진다(Nord et al., 1997 Nat. Biotechnol. 8, 772-777; McConell and Hoess, 1995 J. Mol. Biol. 250, 460-470.). 무작위 돌연변이는 돌연변이 균주(mutator strain) 내 DNA의 전파 또는 PCR 증폭(오류 유발 PCR)에 의해 도입될 수 있다(예를 들어, Pannekoek et al., 1993 Gene 128, 135 140 참조). 이러한 목적을 위해, 증가된 에러율을 가진 폴리머라아제가 사용된다. 도입되는 돌연변이 생성 정도를 향상시키거나 다른 돌연변이들을 조합시키기 위해 PCR 단편들 내의 돌연변이들이 DNA 셔플링(shuffling)에 의해 조합될 수 있다(Stemmer, 1994 Nature 370, 389-391). 효소들에 대한 이러한 돌연변이 전략들은 "Kuchner and Arnold (1997) TIBTECH 15, 523-530" 문헌에 제공되어 있다. 선정된 DNA 영역에서의 무작위 돌연변이생성을 수행하기 위해, DNA 카세트는 돌연변이 생성용으로 구성되어야 한다.
무작위 변형은 당업계에 잘 알려지고 확립된 방법에 의해 수행된다. "무작위로 변형된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열"은 다수의 위치에서 삽입, 결실 또는 치환이 된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로서 그 성질은 예측할 수 없다. 많은 경우, 무작위의 뉴클레오티드(아미노산) 서열 또는 삽입 뉴클레오티드(아미노산) 서열은 완전하게 무작위로 된다(예를 들어, 무작위의 합성 또는 PCR 매개의 돌연변이의 결과임). 그러나, 무작위 서열은 공통의 기능성 특성(예를 들어, 발현 산물의 리간드와의 반응성)을 갖는 서열을 포함할 수도 있고, 또는 무작위 서열은 상이한 아미노산들이 골고루 분포하는 것과 같이 궁극적인 발현 산물이 완전히 무작위 서열인 의미에서 무작위적일 수 있다.
무작위화된 단편을 벡터에 적절하게 도입하기 위해서, 무작위 뉴클레오티드는 위치지정 PCR-매개 돌연변이 원리에 의해 발현벡터로 도입되는 것이 바람직하다. 그러나, 다른 방법들도 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어 합성된 무작위 서열 라이브러리를 벡터로 삽입하는 것 또한 가능하다.
돌연변이 또는 라이브러리를 생성하기 위해 융합 PCR, 예를 들어 3회 PCR 반응이 수행될 수 있다. 부분적으로 중첩되는 중간 단편(intermediate fragments)을 생성하기 위해 2회의 PCR 반응이 수행되고, 3번째 PCR 반응은 상기 중간 단편들을 융합시키기 위해 수행된다.
라이브러리 또는 돌연변이 변종들을 구축하는 방법은 원하는 제한 부위 주위의 제1 프라이머 세트(제한 부위 프라이머)로서 정방향 및 역방향 제한 프라이머와, 문제의 코돈 주위, 예를 들어 업스트림 및 다운스트림에 대한 제2 프라이머 세트(돌연변이 생성 프라이머)로서 정방향 및 역방향 돌연변이 생성 프라이머를 구성하는 것을 포함할 수 있다. 일실시예에 있어서, 프라이머들은 문제의 코돈에 대해 각각 업스트림과 다운스트림으로 구성된다. 제한 프라이머와 돌연변이 생성 프라이머는 제1 중간 단편과 제2 중간 단편을 구성하기 위해 사용된다. 2회의 PCR 반응은 이들 선형의 중간 단편들을 생성한다. 이들 선형의 중간 단편들 각각은 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 문제의 코돈, 주변 뉴클레오티드 서열(flanking nucleotide sequence) 및 절단 부위를 포함한다. 3차 PCR 반응은 2개의 중간 단편들과 정방향 및 역방향 제한 프라이머를 사용하여 융합된 선형 산물을 생성한다. 상기 선형 산물의 서로 대향하는 부착되지 않은 말단들은 제한 효소에 의해 절단되어 선형 산물 상에 접합 말단들이 생성된다. 상기 선형 산물의 접합 말단들은 DNA 라이게이즈의 사용에 의해 융합되어 원형의 산물, 예를 들어, 원형의 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하게 된다.
중간 단편을 구성하기 위해, 2개 세트의 정방향 및 역방향 프라이머의 설계와 합성이 수행되는데, 제1 세트의 프라이머는 제한 효소 절단 부위와 주변 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 세트의 프라이머(돌연변이 생성 프라이머)는 문제의 코돈에 대한 적어도 하나의 변이를 포함한다. 당업자라면 변종의 수는 원하는 변종 아미노산 변형의 수에 의존하는 것을 인지할 것이다. 다른 제한 효소가 본 과정에 사용된다면 절단 부위의 정확한 위치와 대응하는 정방향 및 역방향 프라이머는 이에 따라 변경된다는 것이 본 발명자들에 의해 고려되었다. 당업계에서 사용가능한 다른 방법들이 대신에 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명에 따라 스캐폴드에 무작위 발현산물의 단편이 도입되는 것과는 별도로, 적어도 하나의 융합 파트너를 인코딩하는 뉴클레오티드에 무작위 뉴클레오티드 서열을 융합시킴으로써 무작위 서열을 융합 파트너에 커플링하는 것도 종종 요구된다. 이러한 융합 파트너는 예를 들어, 발현 및/또는 발현 산물의 정제/분리 및/또는 추가 안정화를 촉진할 수 있다.
본 발명의 일례에 따른 아미노산 무작위 치환은 단량체 유비퀴틴의 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 및/또는 68 위치에서의 적어도 6개의 아미노산의 치환으로서, 이들 위치는 유비퀴틴 단백질의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 근접하여 위치하기 때문에 PCR에 의해 용이하게 치환이 이루어질 수 있다. 따라서, 조작되는 코돈들은 대응하는 cDNA 스트랜드의 5' 말단 및 3' 말단에 있게 된다. 즉, 돌연변이 생성 PCR 반응에 사용되는 제1 올리고데옥시뉴클레오티드는 돌연변이 대상이 되는 2, 4, 6 및/또는 8 위치에서의 코돈과는 떨어져 서열면에서 유비퀴틴의 아미노 말단에 대한 코딩 스트랜드에 대응한다. 또한, 제2 올리고데옥시뉴클레오티드는 돌연변이 대상이 되는 62, 63, 64, 65, 66 및/또는 68 위치의 코돈과는 떨어져 카르복시 말단의 폴리펩타이드 서열의 비-코딩 스트랜드에 적어도 부분적으로 대응한다. 양쪽 올리고데옥시뉴클레오티드에 의해 단량체 유비퀴틴을 인코딩하는 DNA를 주형으로서 사용하는 PCR 반응이 수행될 수 있다.
또한, 수득된 증폭 산물은 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제한 서열을 도입하는 주변 올리고데옥시뉴클레오티드를 이용한 다른 PCR 반응에 첨가될 수 있다. 본 발명에 따르면, 미리 결정된 합텐(hapten) 또는 항원에 대한 결합 특성을 갖는 유비퀴틴 변종들을 분리하는 후속 선정 과정에서 사용하기에 적합한 벡터 시스템에 대해 수득된 유전자 카세트를 도입하는 것이 바람직하다.
유비퀴틴에서 변형대상이 되는 영역
변형 영역들은 이들이 결합 파트너로서 ED-B에 대해 접근가능한지 여부와 유비퀴틴 단백질의 전체 구조가 변형에 대해 견딜 수 있을 것인지 여부에 따라 기본적으로 선택될 수 있다.
표면-노출 베타 스트랜드에서의 변형 이외에도 유비퀴틴 단백질의 다른 표면-노출 영역에서의 변형도 수행되는데 바람직하게는 베타 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치에서 수행된다. 이들 영역들은 ED-B에 대해 새롭게 생성된 높은 친화도를 가진 결합에 관여한다.
본 발명의 다른 선택적인 실시예에서, 유비퀴틴 단백질에서 4개의 베타 스트랜드 중 1개 또는 2개, 바람직하게는 2개의 스트랜드 내의 아미노산, 또는 상기 4개의 베타 스트랜드 중 바람직한 2개의 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치들이 변형되어 새로운 결합특성을 생성하게 된다. 또한, 상기 4개의 베타 스트랜드 중 3개 또는 4개 스트랜드 내의 변형, 또는 상기 베타 스트랜드 중 3개 또는 4개 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치들에서의 변형은 ED-B 결합 생성을 위해 선택가능하다.
아미노 말단 및 카르복시 말단 스트랜드 내의 아미노산 또는 상기 아미노 말단 및 카르복시 말단 스트랜드에 인접한 3개의 아미노산까지의 위치들에서의 아미노산들이 변형, 바람직하게는 치환되어 ED-B에 대한 새로운 결합 부위를 생성하도록 하는 것이 특히 바람직하다. 이러한 관점에서 카르복시 말단의 베타 시트 스트랜드에 인접한 4개까지의 아미노산이 변형, 바람직하게는 치환되고, 아미노 말단의 베타 시트 스트랜드에 인접한 1개까지의 아미노산이 변형, 바람직하게는 치환되는 것이 특히 바람직하다.
포유류 유비퀴틴, 바람직하게는 인간의 유비퀴틴 중 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66, 68 위치들에서 적어도 3개의 표면-노출 아미노산이 변형, 바람직하게는 치환되는 것이 특히 바람직하다. 상기 아미노산 그룹에서 적어도 4개의 아미노산들은, ED-B에 대해 이전에 존재하지 않았던 결합 친화도를 갖는 변형된 단백질을 결합 파트너로서 생성하기에 특히 적합한 것으로 판명된 유비퀴틴의 표면 상에 연속적인 표면-노출 영역을 형성한다. 이들 아미노산 잔기들 중 적어도 3개가 변형되어야 한다. 선택적으로, 상기 아미노산 잔기들 중 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 위치가 변형되되, 추가의 아미노산 잔기들과 조합하여 선택적으로 변형된다.
전술한 바와 같은 변형 후, 본 발명자들은 실시예에 기술된 아미노산이 변형된 유비퀴틴 서열들이 매우 높은 친화도(Kd 값 10-9 까지)를 갖고 ED-B와 결합하는 것을 확인하였다.
융합 단백질
다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 약제학적 또는 진단 활성 성분에 융합된 본 발명의 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
추가적 관점에서, 본 발명은 약제학적 또는 진단 활성 성분에 융합된 본 발명의 헤테로-이량체 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 융합 단백질은 비-폴리펩타이드 성분, 예를 들어 비-펩타이드 링커, 치료 또는 진단 관련 방사성 핵종(radionuclides)에 대한 비-펩타이드 리간드를 포함한다. 또한, 상기 융합 단백질은 작은 유기 화합물 또는 비-아미노산계열의 화합물, 예를 들어, 당, 올리고당 또는 다당류, 지방산 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 헤테로 결합의 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 분자는 치료 또는 진단 관련 특성을 갖는 단백질 또는 펩타이드에 공유적으로 또는 비-공유적으로 접합된다.
아래의 몇가지 예들은 ED-B 결합 능력을 갖는 유비퀴틴 기반의 융합 단백질을 어떻게 얻는지에 대해 설명하고 있다.
a) 유비퀴틴에 존재하는 리신 잔기를 통한 단백질의 접합
b) C-말단에 존재할 수 있거나 또는 다른 위치(예를 들어 아미노산 잔기 24 또는 57)에 위치할 수 있는 시스테인 잔기를 통한 헤테로-이량체 유비퀴틴 기반의 결합 단백질의 접합; 말레이미드 선택가능한 성분과의 접합;
c) 펩타이드 또는 단백질 생성 접합-유전적 융합 (바람직하기로는 C-말단 또는 N-말단);
d) "태그" 기반의 융합 - 타겟 단백질 ED-B의 C-말단 또는 N-말단에 위치한 단백질 또는 펩타이드. 융합 "태그"는 예를 들어 폴리-히스티딘(특히 방사선 표지와 관련).
지지체에 문제의 단백질을 공유적으로 부착하고 비공유적으로 부착하는 방법들은 당업계에 잘 알려진 것이므로 이에 대한 상세한 설명을 생략한다.
선택적으로, 상기 활성 성분은 사이토카인, 바람직하게는 TNF(tumor necrosis factors)(예를 들어, TNF 알파, TNF 베타), 인터루킨(예를 들어, IL-2, IL-12, IL-10, IL- 15, IL-24, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11 , IL-13, IL-8, IL-1 알파, IL-1 베타), 인터페론(예를 들어, IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마), GM-CSF, GRO (GRO 알파, GRO 베타, GRO 감마), MIP (MIP-1-알파, MIP-1 베타, MIP-3 알파, MIP-3 베타), TGF-베타 LIF1 CD80, CD-40 리간드, B70, LT-베타, Fas-리간드, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-1 알파/베타, BUNZO/STRC33, I-TAC, BLC/BCA-1, MDC, TECK, TARC, RANTES, HCC-1, HCC-4, DC-CK1, MCP-1-5, 이오탁신(Eotaxin), 이오탁신-2(Eotaxin-2), I-309, MPIF-1, 6Ckine, CTACK, MEC, 림포탁틴(Lymphotactin), 프렉탈카인(Fractalkine) 등으로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인이다.
본 발명에서 사용되는 가장 바람직한 사이토카인은 TNF 알파이다. 염증성 사이토카인 TNF는 포유동물 체내에서 다중 활성을 갖고 있는데, 인간에 있어서 유효 투여량의 수용불가능한 독성 때문에 최근 임상적으로 관련성이 없는 것으로 알려진 항-종양 효과를 포함한다. 최근, TNF는 멜파란(Melphalan)과 같은 세포증식억제 물질(cytostatic substances)과 조합하여 치료에 사용되고 있다.
추가적으로, 헤테로-다중 결합 유비퀴틴 기반의 결합 단백질에 접합될 수 있는 활성 성분은 독성 화합물, 바람직하게는 작은 유기 화합물 또는 폴리펩타이드, 선택적으로 예를 들어 사포린(saporin), 슈도모나스 외독소 A(truncated Pseudomonas exotoxin A), 재조합 겔로닌(recombinant gelonin), 리신-A 사슬(Ricin-A chain), 칼리키아미신(calicheamicin), 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin), 에스페라미신(esperamicin), 디네미신(dynemicin), 케다르시딘(kedarcidin), 마두로펩틴(maduropeptin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 아우리스타틴(auristatin), 콜레라 독소(cholera toxin), 모덱신(modeccin) 및 디프테리아 독소(diphtheria toxin)로 구성된 군으로부터 선택된 독성 화합물이다.
본 발명의 추가 실시예에서, 본 발명에 따른 헤테로-다중 결합 유비퀴틴 기반의 결합 단백질은 인공 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질의 추가 실시예에서, 상기 활성 성분은 형광 염료이고, 감마선 방출 동위원소들, 바람직하기로는 99Tc, 123I, 111In로 구성된 군, 또는 양전자 방출자들(positron emitters), 바람직하기로는 18F, 64Cu, 68Ga, 86Y, 124I로 구성된 군, 또는 베타선 방출자들, 바람직하기로는 131I, 90Y, 177Lu, 67Cu,로 구성된 군, 또는 알파선 방출자들, 바람직하기로는 213Bi, 211At로 구성된 군의 핵종; 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 또는 Cy 염료(Berlier et al., J Histochem Cytochem. 51 (12): 1699-1712, 2003); 광감작제(photosensitizer); 전 응고인자(pro-coagulant factor), 바람직하게는 조직 인자(tissue factor) (예를 들어, tTF(truncated tissue factor)); 전구 약물 활성화를 위한 효소, 바람직하게는 카르복시-펩티다아제, 클루쿠로니다아제(glucuronidases) 및 글루코시다아제(glucosidases)로 구성된 군으로부터 선택된 효소; 및/또는 기능성 Fc 도메인, 바람직하게는 인간의 기능성 Fc 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 성분이 바람직하다.
본 발명에 따른 추가의 실시예는 융합 단백질에 관한 것으로서 혈청 반감기를 조절하는 성분, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜, 알부민-결합 펩타이드 및 면역글로불린으로 구성된 군으로부터 선택된 성분이다.
결합 특이도 (해리 상수)
본 발명에 따른 융합 단백질의 결합 특이도는 비-융합 단백질에 대해 정의된 바와 같이 Kd로 표시된다. 본 발명에 따르면 "Kd"는 본 발명에서 10-7-10-12 M 범위의 특이적 결합 친화도를 정의한다. 10-5 M 이하의 값은 수량화할 수 있는 결합 친화도로 고려될 수 있다. 응용에 따라, 10-7 M 내지 10-11 M 값은 예를 들어 크로마토그래피 응용에 적합하고, 10-9 내지 10-12 M 값은 예를 들어 진단 또는 치료 응용에 적합하다. 또한, 바람직한 결합 친화도는 10-7 내지 10-10 M 범위이고, 바람직하게는 10-7 내지 10-11 M 이다.
결합 친화도를 결정하는 방법들은 당업계에 알려져 있고 예를 들어 다음과 같은 방법들 중에서 선택될 수 있다: ELISA, SPR(Surface Plasmon Resonance) 기반 기술(예를 들어, Biacore®), 형광 분광법(fluorescence spectroscopy), ITC(isothermal titration calorimetry), 분석용 초원심분리법(analytical ultracentrifugation) 및 FACS.
전술한 바와 같이 변형이 이루어 진 후, 본 발명자들은 실시예들에 기술된 아미노산 변형 유비퀴틴 서열들이 타겟과 매우 높은 친화도(Kd 값 10-10 M 까지)로 결합하는 것을 확인하였다.
유비퀴틴의 이량체화
"이량체"는 본 발명에서는 2개의 단량체 유비퀴틴 단백질을 포함하는 단백질로서 간주된다. 이량체가 2개의 상이하게 변형된 단량체를 포함하는 경우, 이는 "헤테로 결합-이량체" 또는 "헤테로-이량체"로 불린다. 따라서, 본 발명의 "헤테로-이량체"는 2개의 상이하게 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질로서 특이적 결합 파트너인 ED-B에 대한 조합된 1가 결합 특성을 나타낸다. 본 발명의 변형된 헤테로-이량체 ED-B 결합 유비퀴틴 단백질은 각각의 단량체 유비퀴틴 단백질을 별개로 스크린하고 이들 2개의 단량체를 이후에 조합하여서는 수득될 수 없고, 상기 ED-B 리간드에 대한 1가 결합 활성을 함께 나타내는 제1 단량체 유닛과 제2 단량체 유닛으로 구성된 헤테로-이량체 단백질을 스크린해야만 수득될 수 있다는 점에 주목해야 한다. 각각의 서브 유닛은 ED-B에 대해 아주 제한된 결합 친화도를 나타내는 반면에 조합된 이량체의 변형 유비퀴틴 단백질은 우수한 결합 특성을 나타낸다(도 4 참조).
본 발명에 따르면, 2개의 상이하게 변형된 유비퀴틴 단량체는 일반적으로 선단과 말단(head-to-tail) 융합에 의해 연결되어 ED-B의 동일 에피톱에 결합하고 양쪽 결합 도메인 영역이 함께 작용하는 경우에만 효과를 나타낸다. 단량체의 BDRs는 단일의 연속 결합 영역을 형성한다.
따라서, 본 발명에 따라 ED-B에 효율적으로 결합하도록 변형된 유비퀴틴 단백질은 이량체화된다. 단량체는 앞서 논의된 바와 같이 직접 연결되거나 링커를 통해 연결될 수 있다. 많은 가능한 링커들이 사용될 수 있다.
각각의 단량체 유비퀴틴은 아미노산 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66, 68 위치들 중 적어도 6개에서 변형을 나타낸다. 단량체 단백질은 유전학적으로 상호 융합된다. 표적에 대한 결합은 협력 방식으로 상기 BDRs에 의해 매개된다. 즉, BDRs는 상호 협력하여 1가 방식으로 피브로넥틴의 ED-B 도메인에 결합할 수 있는 단일의 공통 결합 영역을 형성한다.
ED-B에 결합하는 변형된 유비퀴틴 헤테로-이량체
Kd= 10-7-10-12 M의 결합 친화도로 ED-B에 결합하고 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B (ED-B)에 대해 1가 결합 활성을 나타내는 본 발명에 따른 유비퀴틴의 헤테로-이량체는 다음의 2가지 대안 중 선택된다.
(1) 제1 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되고, 제2 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되며 선택적으로 아미노산 2 위치에서 추가적으로 치환된 것; 그리고
(2) 제1 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되고, 제2 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되며 선택적으로 아미노산 2 위치에서 추가적으로 치환된 것.
일실시예에서, 융합 단백질은 상기 유비퀴틴 단량체의 유전적으로 융합된 헤테로 이량체로서, 제1 유비퀴틴 단량체의 6, 8, 63-66 위치에서 아미노산이 치환되고, 제2 유비퀴틴 단량체의 6, 8, 62-66 위치에서 아미노산이 치환되며 선택적으로 제2 유비퀴틴 단량체의 2 위치에서 추가적으로 아미노산이 치환되고, 바람직하기로는 다음과 같은 것이 바람직하다.
- 제1 유비퀴틴 단량체의 치환
위치 6에서 리신(K) → 트립토판(W) 또는 페닐알라닌(F),
위치 8에서 류신(L) → 트립토판 또는 페닐알라닌(W, F),
위치 63에서 리신(K) → 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H),
위치 64에서 글루탐산(E) → 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H),
위치 65에서 세린(S) → 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W), 및
위치 66에서 트레오닌(T) → 프롤린(P);
- 제2 유비퀴틴 단량체의 치환
위치 6에서 리신(K) → 트레오닌(T), 아스파라긴(N), 세린(S) 또는 글루타민(Q),
위치 8에서 류신(L) → 글루타민(Q), 트레오닌(T), 아스파라긴(N) 또는 세린(S),
위치 62에서 글루타민(Q) → 트립토판(W) 또는 페닐알라닌(F),
위치 63에서 리신(K) → 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N) 또는 글루타민(Q),
위치 64에서 글루탐산(E) → 아스파라긴(N), 세린(S), 트레오닌(T) 또는 글루타민(Q),
위치 65에서 세린(S) → 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W), 및
위치 66에서 트레오닌(T) → 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D).
그리고, 선택적으로 위치 2에서 글루타민(Q)이 아르기닌(R), 히스티딘(H) 또는 리신(K)으로 치환되는 것이 바람직하다.
각각의 단량체에서 이러한 대안적인 치환들은, 생성된 변형 유비퀴틴 헤테로-이량체가 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B (ED-B)에 대해 Kd =10-7-10-12 M의 특이적 결합 친화도를 보이고 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B (ED-B)에 대해 1가 결합 활성을 나타내며 유비퀴틴 단백질의 구조적 안정성이 파괴되거나 방해되지 않는 경우에 제한없이 조합될 수 있다.
가장 바람직한 치환은 다음과 같다:
(1) 제1 단량체 유닛에서 적어도 - K6W, L8W, K63R, E64K, S65F, 및 T66P;
제2 단량체 유닛에서 적어도 - K6T, L8Q, Q62W, K63S, E64N, S65W, 및 T66E이고, 선택적으로 추가로 Q2R이거나,
(2) 제1 단량체 유닛에서 적어도 - Q2T, F4W, K6H, Q62N, K63F, E64K, S65L, 및 T66S;
제2 단량체 유닛에서 적어도 - K6X, L8X, Q62X, K63X, E64X, S65X, 및 T66X이고, 선택적으로 추가로 Q2X이며, 상기 X는 어떠한 아미노산도 가능하다(도 2 참조).
ED-B에 대한 결합 단백질을 생성하기 위해 제1 유비퀴틴 단량체에서 특히 바람직한 치환들은 다음과 같다: 2:Q→T, 4:F→W, 6:K→H, 62:Q→N, 63:K→F, 64:E→K, 65:S→L, 66:T→S
2개의 단량체를 선단과 말단 방식으로 연결하기 위해 링커가 사용되지 않을 수도 있고 어떠한 링커도 사용할 수도 있다. 바람직한 링커는 서열번호 32의 링커 또는 서열 GIG, SGGGGIG 또는 SGGGGSGGGGIG의 링커이다.
바람직한 실시예에서, ED-B 결합을 위해 함께 작용하는 2개의 결합 결정 영역(BDR)을 갖는 유비퀴틴 헤테로-이량체는 서열번호 33 또는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 단백질은 아래의 서열에 의해 제공되며, 여기서 XXXX는 임의의 아미노산일 수 있다(서열번호 47).
Figure 112011062490681-pct00001
여기서 SGGGGSGGGGIG 서열은 링커로서 사용되었다. 다른 종류의 링커가 사용될 수 있으며 링커를 사용하지 않는 것도 가능한 것임은 물론이다.
이들 서열을 갖는 단백질 예들에 대한 컨센서스 서열(consensus sequences)은 도 2에 도시되어 있다.
약제학적으로 활성 성분으로서 TNF-알파를 포함하는 본 발명의 바람직한 융합 단백질은 서열번호 35 또는 서열번호 36의 서열을 갖는다.
본 발명의 추가의 관점에서, 본 발명은 전술한 단백질 또는 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 역시 포괄한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터도 본 발명에 의해 포괄된다.
본 발명의 추가적 관점에서, 본 발명의 전술한 단백질 또는 융합 단백질 및/또는 재조합 단백질 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 포함하는 숙주 세포도 본 발명에 의해 포괄된다.
TNF 알파와 같은 이펙터에 융합되고 ED-B에 특이적으로 결합하는 본 발명의 단백질, 예를 들어 헤테로-이량체 유비퀴틴 기반의 결합 단백질의 용도
본 발명의 변형된 유비퀴틴 ED-B 결합 단백질은 예를 들어 치료 수단 뿐만아니라 시험관 내 또는 생체내 진단 수단 제조에 사용된다. 본 발명에 따르는 단백질은 예를 들어 직접적인 에펙터 분자(조절인자, 길항제, 애고니스트(agonist)) 또는 항원-인지 도메인으로서 사용될 수 있다. ED-B 항원이 풍부하게 나타나는 종양의 예가 도 1의 표에 도시되어 있다.
선택된 융합 파트너에 따라 본 발명의 약제학적 조성물은 암 치료, 예를 들어, 유방암 및 대장암, 또는 ED-B가 풍부한 다른 종양 질환(도 1에 열거된 예 참조)의 치료 목적으로 적용될 수 있다.
상기 조성물은 치료학적 유효 투여량을 포함하도록 적용된다. 투여되는 용량은 치료대상이 되는 생물체, 질환의 종류, 환자의 나이 및 몸무게 그리고 현재 알려진 여러 요인들에 따라 다르다.
상기 조성물은 약제학적으로 또는 진단학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 선택적으로 알려진 추가의 보조제 및 부형제를 포함할 수 있다. 이들은 예를 들어 안정화제, 계면활성제(surface-active agent), 염, 완충용액, 착색제(colouring agent) 등을 포함하며, 본 발명이 이에 제한되는 것이 아님은 물론이다.
약제학적 조성물은 국소 도포를 위한 로션, 액체 제형, 크림, 에어로졸, 파우더, 과립, 태블릿, 좌약, 캡슐, 에멀션, 또는 리포좀 형태일 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고 비-발열성이며 등장성인 것이 바람직하고, 약제학적으로 통상 사용되고 허용가능한 알려진 첨가제를 포함한다(이에 대한 참고문헌: the regulations of the U.S. Pharmacopoeia or Remington's Pharmaceutical Sciences, Mac Publishing Company (1990)).
인간과 가축의 의학적 치료 및 예방 분야에서, 본 발명에 따라 변형된 적어도 하나의 헤테로 결합성 ED-B 결합 유비퀴틴 단백질을 포함하는 약제학적으로 유효한 의약은 당업계에 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 제제 방식에 따라, 상기 조성물은 주사 또는 주입에 의한 비경구 방식 투여, 전신 투여, 직장 투여, 복막내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 경피 투여되거나 또는 종래의 다른 알려진 적용 방법들에 의해 투여될 수 있다. 약제학적 제제의 형태는 치료대상이 되는 질환의 종류, 병의 경중, 치료대상 환자 및 의료분야에서 당업자에게 알려진 다른 요인들에 의해 결정된다.
일실시예에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 단백질 또는 융합 단백질, 또는 이들의 조합을 포함하고, 추가로 하나 이상의 화학치료제, 바람직하기로는 하기 표 1로부터 선택되는 화학치료제를 포함한다.
물질 부류 예
알킬화제(ATC L01A) 멜파란, 시클로포스파미드
항대사물질 (ATC L01B) 5-플루오로우라실, 젬시타빈
탁산 (ATC L01CD) 파클리탁셀
세포독성 항생제 (ATC L01D) 독소루비신, 리포좀 독소루비신
플라티늄 화합물(ATC L01XA) 시스플라틴
바람직한 실시예에서, 상기 화학치료제는 멜파란, 독소루비신, 시클로포스파미드, 닥티노마이신, 플루오로데옥시우라실, 시스플라틴, 파클리탁셀 및 젬시타빈에서 선택되거나, 카이네이즈 저해제 그룹에서 선택된다.
본 발명에 따른 "약제학적 조성물"은 조성물 형태로 존재할 수 있는데, 다른 활성 성분들과 희석제 및/또는 담체가 서로 혼합될 수 있거나, 조합된 제제 형태를 취할 수 있고, 활성 성분들은 부분적으로 또는 전체적으로 별개 형태로 존재한다. 이러한 조합 또는 조합된 제제의 예가 "부분별 키트 (kit-of-parts)"이다.
본 발명에 따른 "조성물"은 적어도 2개의 약리학적으로 활성인 화합물을 포함한다. 이들 화합물은 동시에 투여되거나 1분 내지 수일에 걸쳐 시간 간격을 두고 별개로 투여될 수 있다. 이들 화합물은 동일한 경로를 통해 투여되거나 다른 경로를 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나의 활성 화합물은 경구투여되고 다른 활성 화합물은 비경구 투여방식으로 투여될 수 있다. 또한, 일실시예에서 양쪽 활성 화합물들은 예를 들어 하나의 주입 용액 내에 제형화될 수 있고, 또는 서로 개별적으로 제형화된 화합물을 포함하는 키트로서 제조될 수 있다. 또한, 양쪽 화합물은 2개 이상의 패키지에 존재하는 것이 가능하다.
특히 바람직한 조합은 본 발명에 따른 융합 단백질과, 멜파란 및/또는 (리포좀) 독소루비신이다. ATC 클래스 L01의 항종양제(antineoplastic agent)와는 별개로, 본 발명의 TNF-융합 단백질은 사이토카인 및 이의 유도체, 방사선 의약, 세포 기반 치료제, 및 나노입자를 포함하는 다른 항종양 물질과 조합될 수 있다.
종양 침투(permeabilisation) 활성 때문에 본 발명의 TNF-융합 단백질(또한, 본 발명의 다른 재조합 단백질/융합 단백질)은 WHO(World Health Organisation)에 의해 제공되는 ATC(Anatomical Therapeutic Chemical Classification System)의 L01에 열거된 모든 항종양제와 조합될 수 있다.
놀랍게도 TNF-알파에 융합된 유비퀴틴 헤테로-이량체의 융합 단백질(바람직하게는 서열번호 35 또는 서열번호 36의 서열을 가짐)은 치료에 유리하게 적용될 수 있음이 입증되었다. TNF-알파는 독성이 매우 강하여 낮은 용량으로만 투여될 수 있는데, 이러한 경우 최소 치료 문턱치 아래의 용량이 되어 치료학적으로 활성이 없게 된다. 이러한 TNF-알파의 독성 때문에 TNF-알파를 사용할 때 분리된 사지 관류(isolated limb perfusion) 방식이 선택되어 치료적으로 유효한 농도에 도달하도록 하고 있다. 사지 관류(Limb perfusion)는 팔이나 다리에 직접 항종양 약제를 전달하는데 사용되는 의료 기술이다. 사지로부터 그리고 사지로의 혈류는 압박대에 의해 일시적으로 정지되고, 항종양 약제가 사지의 혈류로 직접 주입된다. 이는 환자로 하여금 종양이 발생한 영역에서 TNF-알파의 높은 투여량을 받아들일 수 있게 한다.
그러나, 본 발명의 TNF-알파 융합 단백질을 적용하면 독성이 없지만 여전히 치료학적으로 유효한 농도로 TNF-알파를 투여하는 것이 가능하다. TNF-알파는 본 발명의 (결합) 융합 단백질에 커플링되어 있기 때문에 병변 부위(예를 들어, 종양 부위)에서 직접 활성을 나타낼 수 있고 "자유로운" TNF-알파의 양이 급격하게 감소될 수 있다.
TNF-알파의 신체 부작용은 본 발명에 따른 융합 단백질에 의해 TNF-알파를 투여함으로써 현저하게 감소될 수 있다. 본 발명의 TNF-알파 융합 단백질을 사용하면 치료 효과를 나타내는 TNF-알파의 전체 용량을 대폭 줄일 수 있으며, 사지 관류를 할 필요가 없고 이에 따라 제한없이 특히 상기 화학치료제와 조합하여 전신 종양 치료에 사용할 수 있는 장점이 있다.
추가의 실시예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 부분별 키트 형태로서, 본 발명의 재조합 유비퀴틴 단백질/융합 단백질과 하나의 이상의 화학치료제가 분리된 성분으로서 제공된다.
본 발명의 헤테로-이량체 ED-B 결합단백질의 제조방법
본 발명에 따른 ED-B 결합 단백질은 보통의 유기 합성법, 고상-보조 합성(solid phase-assisted synthesis) 기술 또는 상업적으로 입수가능한 자동화 합성기와 같은 많은 종래의 공지기술들에 의해 제조될 수 있다. 한편, 상기 ED-B 결합 단백질은 종래의 재조합 기술 단독으로 또는 종래의 합성기술과 조합하여 제조될 수도 있다.
본 발명의 다른 관점에서, 재조합 변형 유비퀴틴 단백질의 생성 방법이 제공된다. 이 방법은 적어도 다음의 단계들을 포함한다:
a) 단량체 유비퀴틴 단백질로부터 유래한 상이하게 변형된 이량체 유비퀴틴 단백질들의 집단을 제공하는 단계로서, 상기 집단은 선단과 말단(head-to-tail)의 배열로 연결된 2개의 변형된 유비퀴틴 단량체를 포함하는 이량체 유비퀴틴 단백질을 포함하고, 상기 이량체 단백질의 각각의 단량체는 서열번호 1의 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 및 68 위치에서 적어도 6개의 아미노산의 치환에 의해 상이하게 변형되어 있으며, 상기 치환은 (1) 제1 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되고, 제2 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되며 선택적으로 아미노산 2 위치에서 추가적으로 치환되거나, (2) 제1 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되고, 제2 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되며 선택적으로 아미노산 2 위치에서 추가적으로 치환되는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 상이하게 변형된 이량체 유비퀴틴 단백질들의 집단을 제공하는 단계와,
b) 가능한 리간드로서 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B (ED-B)를 제공하는 단계와,
c) 상기 상이하게 변형된 단백질들의 집단을 상기 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B (ED-B)와 접촉시키는 단계와,
d) 스크린 과정에 의해 변형된 이량체 유비퀴틴 단백질을 확인하는 단계로서, 10-7- 10-12 M 범위의 Kd를 갖는 특이적인 결합 친화도로 상기 피브로넥틴의 ED-B 도메인에 결합하고 상기 피브로넥틴의 ED-B 도메인에 대해 1가의 결합 활성을 나타내는 변형된 이량체 유비퀴틴 단백질을 확인하는 단계와, 선택적으로
e) 상기 결합 친화도를 갖는 상기 변형된 이량체 유비퀴틴 단백질을 분리하는 단계.
선택적으로, 상기 변형은 DNA 수준에서의 유전공학기술과, 원핵생물, 진핵생물 또는 시험관 내에서 상기 변형된 단백질의 발현에 의해 수행될 수 있다.
추가의 실시예에서, 상기 변형 단계는 화학적 합성 단계를 포함한다.
본 발명의 하나의 관점에서, 상이하게 변형된 단백질들의 집단은 상이하게 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질 각각을 인코딩하는 2개의 DNA 라이브러리를 유전적으로 융합함으로써 수득된다.
또 다른 추가의 관점에서, 상기 방법은 상기 변형된 헤테로-이량체 유비퀴틴 단백질이 약제학적으로 활성 성분, 선택적으로 사이토카인, 바람직하게는 TNF-알파 또는 진단 성분과 융합되도록 구성되거나, 상기 재조합 변형 헤테로-이량체 유비퀴틴 단백질이 상기 약제학적으로 활성 성분, 선택적으로 TNF-알파를 통해 또는 상기 진단 성분을 통해 형성되도록 구성된다.
본 발명에 따르면, 변형된 단백질은 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 실시예에서는 청구항 1항의 c) 단계 및 d) 단계가 하나의 단계로 수행된다.
추가의 관점에서, 본 발명은 전술한 바와 같이 정의된 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질을 인코딩하는 DNA를 포함하는 라이브리리에 관한 것으로서, 이는 본 발명의 헤테로-이량체 유비퀴틴 단백질 제공을 위한 기초가 된다.
본 발명의 또 다른 관점에서, 전술한 바와 같이 특정된 2개의 라이브러리를 융합하여 얻은 DNA를 포함하는 융합 라이브러리가 제공되는데, 헤테로-이량체 유비퀴틴 융합 단백질을 얻기 위해 각각의 라이브러리는 상이하게 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질 유닛을 인코딩하고, 단량체 유닛들은 선단과 말단 배열로 연결되며, 헤테로-이량체 유비퀴틴 융합 단백질을 인코딩하는 상기 융합 라이브러리는 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B (ED-B)에 대해 1가 결합 활성을 나타낸다. 상기 단량체 유닛들의 연결은 당업자에게 알려진 임의의 링커 또는 본 명세서에 기술된 링커를 사용하여 수행된다. 본 발명의 일실시예에서, TNF-알파는 약제학적으로 활성 화합물로 작용하는 동시에 링커로서 사용된다.
실시예 1은 복합 라이브러리의 생성 개요를 설명하고 있다. 그러나, 이러한 라이브러리의 질과 관련된 주의가 필요하다. 스캐폴드 기술에서 라이브러리의 질은 복잡성(개개의 변종의 수)과 기능성(결과 후보군의 구조적 특성과 단백질-화학적 특성)에 의존적인 요소이다. 그러나 양 특성들은 서로에 대해 부정적인 영향을 줄 수 있다. 스캐폴드 상에 변형된 위치들의 수를 증가시켜 라이브러리의 복잡성을 증대하면 변종들의 단백질-화학적 특성이 나빠지는 결과를 초래한다. 이는 감소된 용해도, 뭉침 현상 및/또는 낮은 수율을 낳게 할 수 있다. 이는 에너지적으로 바람직한 단백질 패키징을 갖는 원래의 스캐폴드로부터 너무 많이 벗어났기 때문이다.
따라서, 스캐폴드 라이브러리를 구성할 때에는 균형을 맞추는 것이 필요한데, 타겟에 대한 최적화를 위해 원래 서열에 가능한 많은 변이들을 도입하는 극단적인 방식과, 부정적인 단백질-화학적 영향을 피하기 위해 가능한 원래의 1차 서열을 유지하는 것 사이에 적절한 균형이 필요하다.
이러한 기술내용은 본 발명의 실시예 또는 관점에서 본 명세서에 기술된 특성들의 각각 가능한 조합을 포괄하는 것임을 주목해야 한다.
타겟 ED-B에 대해 결합 친화도를 갖는 변형된 유비퀴틴 단백질의 선택 및 결합 친화도와 관련된 변형된 아미노산의 결정
예를 들어 헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 단백질을 인코딩하는 적어도 2개의 서로 상이한 DNA 라이브러리가 단량체 유비퀴틴 유닛들 각각에서 선택된 아미노산들을 상이하게 변형함으로써 구축된 후, 이들 라이브러리는 헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 단백질을 인코딩하는 DNA를 얻기 위해 예를 들어 링커 기술에 의해 유전적으로 융합된다. 이들 라이브러리의 DNA는 단백질로 발현되고 이로써 얻어진 변형된 이량체 단백질은 본 발명에 따라 ED-B에 접촉되는데 결합 친화도가 존재한다면 결합 파트너와의 결합을 선택적으로 가능하게 한다.
접촉 및 스크린 과정은 헤테로-이량체 유비퀴틴 단백질에 대해 미리 수행되는 것이 본 발명에서 중요한 점이다. 상기 과정은 ED-B에 1가 결합 활성을 제공하는 유비퀴틴 단백질에 대한 스크린을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 접촉은 파지 디스플레이, 리보좀 디스플레이, mRNA 디스플레이 또는 세포 표면 디스플레이, 효모 표면 디스플레이 또는 세균 표면 디스플레이 방법들, 바람직하게는 파지 디스플레이 방법과 같은 적합한 표시 및 선택 방법에 의해 수행되는 것이 바람직하다. 완전한 개시를 위해 참고문헌들을 참고한다(Hoess, Curr. Opin. Struct. Biol.. 3 (1993), 572-579; Wells and Lowmann, Curr. Opin. Struct. Biol. 2 (1992), 597-604; Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins-A Laboratory Manual (1996), Academic Press). 전술한 방법들은 당업자에게 알려져 있으며 이들의 변형을 포함하여 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
변형된 단백질이 미리 결정된 결합 파트너에 대해 수량화할 수 있는 결합 친화도를 갖는지 여부는 다음과 같은 방법들 중 하나 이상의 방법에 따라 수행될 수 있다: ELISA, 표면 플라즈몬 공명 분광법(plasmon surface resonance spectroscopy), 형광 분광법(fluorescence spectroscopy), FACS, ITC(isothermal titration calorimetry) 및 분석용 초원심분리법(analytical ultracentrifugation).
파지 디스플레이 선택법(Phage display selection method)
본 출원에 적용되는 한가지 형태의 파지 디스플레이 과정이 결합 특성을 보이는 유비퀴틴의 변이들에 대한 본 발명에 따른 선택과정을 위한 예시로서 후술된다. 동일한 방식으로, 예를 들어, 세균에 대한 표시 방법(bacterial surface display; Daugherty et al., 1998, Protein Eng. 11(9):825-832) 또는 효모 세포 디스플레이(yeast surface display; Kieke et al., 1997 Protein Eng. 10(11):1303-10) 또는 리보좀 디스플레이와 같은 세포없는 선택 시스템 (Hanes and Pluckthun, 1997 Proc Natl Acad Sci U S A. 94(10):4937-4942; He and Taussig, 1997 Nucleic Acids Res. 25(24):5132-5134) 또는 시스(cis) 디스플레이 (Odegrip et al., 2004 Proc Natl Acad Sci U S A. 101(9):2806-2810) 또는 mRNA 디스플레이가 적용될 수 있다. 후자의 경우, 리보좀을 통해 단백질 변이체가 적합한 mRNA에 커플링됨으로써 유전자형과 표현형의 일시적인 물리적 연결이 달성된다.
본 명세서에서 기술된 파지 디스플레이 과정에서, 유비퀴틴의 재조합 변종들은 사상 파지(filamentous phage) 상에 나타나며 상기 변종들의 코딩 DNA는 동시에 파지 외피 내에 단일 가닥 형태로 패키징되어 존재한다. 따라서, 특정 특성들을 갖는 친화도가 풍부한 변종들이 라이브러리로부터 선택되고, 이들의 유전 정보는 적합한 세균 감염에 의해 증폭되거나 다른 증폭 사이클에 추가될 수 있다. 파지 표면 상에 돌연변이된 유비퀴틴이 나타나는 것은 아미노 말단 신호 서열, 바람직하게는 PelB 신호 서열에 대한 유전적 융합에 의해 달성되는데, 바람직하게 파지의 캡시드 또는 표면 단백질은 캡시드 단백질 pIII 또는 이의 단편에 대한 카르복시 말단 융합이다. 또한, 인코딩된 융합 단백질은 예를 들어 친화 크로마토그래피에 의한 검출 및/또는 정제를 위한 친화 태그 또는 항체 에피톱, 또는 친화도 향상 과정에서 융합 단백질의 특이적 절단을 위한 프로테아제 인지 서열과 같은 기능적 요소들을 포함한다. 그리고, 예를 들어 유비퀴틴 변종 유전자와 파지 캡시드 단백질 또는 이의 단편의 코딩 영역과의 사이에 앰버 정지 코돈(amber stop codon)이 존재할 수 있는데 파지 캡시드 단백질 또는 이의 단편의 코딩 영역은 하나의 아미노산 도입에 부분적으로 기인하여, 적합한 억제균주(suppressor strain)에서의 해독 동안 인지되지 않는다.
ED-B에 대한 결합 특정을 갖는 유비퀴틴 변종의 분리 관점에서 선택 과정에 적합하고 융합 단백질의 유전자 카세트가 삽입되는 세균 벡터는 파지미드(phagemid)라고 지칭된다. 무엇보다는 이는 사상 파지(예를 들어 M13 또는 f1)의 인터제닉 영역(intergenic region) 또는 그 일부를 포함하는데, M13K07과 같은 헬퍼 파지에 의해 파지미드를 운반하는 세균 세포의 중복감염(superinfection)이 나타나는 경우 파지 캡시드로의 파지미드 DNA의 폐쇄형 가닥(closed strand)의 패키징이 일어난다. 이러한 방식으로 생성된 파지미드는 세균에 의해 분비되고 각각의 인코딩된 유비퀴틴 변종들이 나타나게 되는데 이는 파지미드 표면 상에서 캡시드 단백질 pIII 또는 이의 단편에 대한 융합에 기인한다. 원래의 pIII 캡시드 단백질은 파지미드 내에 존재하여 적합한 세균 균주를 재감염시키는 능력과 이에 따른 대응 DNA를 증폭하는 능력이 보유된다. 따라서, 유비퀴틴 변종의 표현형, 즉 잠재적 결합 특성과 유전자형 사이의 물리적 연결이 보장된다.
수득된 파지미드들은 그 위에 존재하는 유비퀴틴 변종의 결합과 관련하여 당업자에게 알려진 방법들에 의해 선별될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 유비퀴틴 변종들은 예를 들어 미세적정(microtiter) 플레이트 상에 결합된 물질을 표적화하기 위해 일시적으로 고정될 수 있고 비-결합 변종들이 분리된 후 특이적으로 용리될 수 있다. 이러한 용리는 예를 들어 100 mM 트리에틸아민과 같은 기본 용액에 의해 수행되는 것이 바람직하다. 대안으로, 상기 용리는 산성 조건, 단백질 가수분해 또는 감염된 세균의 직접 첨가에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방식으로 수득된 파지미드들은 ED-B에 대한 결합 특성을 갖는 유비퀴틴의 선별 및 증폭의 연속적인 사이클을 수행함으로써 재증폭되어 증량될 수 있다.
상기 방식으로 수득된 유비퀴틴 변종들에 대한 추가 특성화가 파지미드 형태, 즉 파지에 융합된 형태, 또는 대응하는 유전자를 적합한 발현 벡터로 클론닝한 후 얻은 가용성 단백질 형태에서 수행될 수 있다. 적절한 방법은 당업자나 문헌에 기술된 바와 같이 공지된 것이다. 특성화는 예를 들어 DNA 서열의 결정과 이에 따른 분리된 변종의 1차 서열의 결정을 포함할 수 있다. 또한, 분리된 변종들의 친화도 및 특이도는 ELISA, 표면 플라즈몬 공명 분광법(plasmon surface resonance spectroscopy), 형광 분광법, FACS, ITC(isothermal titration calorimetry) 또는 분석용 초원심분리법 등과 같은 생화학적 표준 방법들에 의해 검출될 수 있다. 안정성 분석의 관점에서, 예를 들어 화학적 또는 물리적 풀림(unfolding)과 관련한 분광법들이 당업자에게 알려져 있다.
리보좀 디스플레이 선택법(Ribosomal display selection method)
본 발명의 추가 실시예인 리보좀 디스플레이 과정에서, 유비퀴틴의 변종들은 세포 없는 전사/해독 시스템에 의해 준비되고 리보좀 뿐만아니라 대응하는 mRNA와의 복합체로서 제공된다. 이러한 목적을 위해 전술한 바와 같은 DNA 라이브러리가 기반이 되며 여기서 변종들의 유전자들은 발현 및 단백질 생합성을 위한 대응 조절 서열들과 융합된 형태로 존재한다. 유전자 라이브러리의 3' 말단에서의 정지코돈의 결실과 적합한 실험 조건들(낮은 온도, 높은 Mg2+ 농도) 때문에, 초기 단백질, mRNA 및 리보좀으로 구성된 3원 복합체(ternary complex)는 시험관내 전사/해독 기간 동안에 유지된다.
헤테로-이량체 변형 유비퀴틴 단백질을 포함하는 단백질 라이브러리가 단량체 유비퀴틴 유닛들 각각에서 선택된 아미노산들을 상이하게 변형함으로써 구축된 후, 상기 변형 이량체 단백질은 본 발명에 따라 ED-B와 접촉되고 결합 친화도가 존재한다면 결합 파트너와의 결합이 가능하게 된다. 이러한 단백질 라이브러리는 변형된 단백질과 ED-B 표적 단백질 사이의 접촉을 가능하게 하는 방식에서 변형된 단백질을 디스플레이하는 디스플레이 방식의 라이브러리 형태로 존재하거나 변형된 단백질을 나타내는 다른 방법을 이용하는 라이브러리 형태로 존재할 수 있다. 상기 디스플레이 방식은 선택적으로 파지 디스플레이, 리보좀 디스플레이, TAT 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 세균 디스플레이 또는 mRNA 디스플레이 방법이다.
10-7- 10-12 M 범위의 Kd 값의 특이적 결합 친화도를 갖는 ED-B에 대한 결합 활성을 보이는 변형 유비퀴틴 변종들의 선별은 당업자에게 알려진 방법들에 의해 수행될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 예를 들어 리보좀 복합체 상에 존재하는 유비퀴틴 변종들은 예를 들어 미세적정 플레이트 상에 결합된 물질을 표적화하기 위해 일시적으로 고정되거나, 용액 내 결합 후 자성입자에 결합될 수 있다. 비-결합 변종들의 분리 후, 결합 활성을 갖는 변종들에 대한 유전 정보는 리보좀 복합체의 파괴에 의해 mRNA 형태로 특이적으로 용리될 수 있다. 상기 용리는 50 mM EDTA로 수행되는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로 얻어진 mRNA는 분리되고 적합한 방법들(역전사효소 반응)에 의해 DNA로 역전사되며, 역전사되어 얻어진 DNA는 재증폭될 수 있다.
시험관내 전사/해독, 선별 및 증폭의 연속적인 사이클에 의해 미리 정해진 합텐 또는 항원에 대해 결합 특성을 갖는 유비퀴틴 변종들은 증량될 수 있다.
ED-B 결합 단백질의 특성화
전술한 방식으로 얻어진 유비퀴틴 변종들에 대한 추가 특성화는 대응되는 유전자 카세트를 적합한 발현 벡터로 클로닝한 후 앞서 상세히 기술한 바와 같이 가용성 단백질 형태에서 수행될 수 있다. 적합한 방법들은 당업자에 알려져 있거나 본 명세서에 언급된 문헌들에 기술되어 있다.
미리 정해진 결합 파트너에 대해 결합 친화도를 갖는 단백질 검출 단계 이후 검출된 단백질의 분리 및/또는 증량 단계가 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라 변형된 유비퀴틴 단백질 발현 이후 당업계에 공지된 방법들에 의해 상기 변형된 유비퀴틴 단백질은 추가로 정제 및 증량될 수 있다. 선별 방법들은 당업자에게 알려진 몇가지 인자에 의해 좌우되는데, 예를 들어, 사용된 발현 벡터, 숙주 생물, 의도된 사용 분야, 단백질의 크기 및 기타 다른 요소들을 들 수 있다. 단순화된 정제를 위해 본 발명에 따라 변형된 단백질은 분리 물질에 대해 증가된 친화도를 갖는 다른 펩타이드 서열에 융합될 수 있다. 이러한 융합은 유비퀴틴 단백질의 기능에 악영향을 주지 않고 특이적 프로테아제 절단 부위의 도입에 의해 정제 후 분리될 수 있도록 선정되는 것이 바람직하다. 이러한 방법들은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에 따르면, 피브로넥틴 엑스트라도메인 ED-B에 매우 높은 친화도로서 특이적으로 결합할 수 있는 유비퀴틴 기반의 헤테로-다중 결합 단백질을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면 암치료에서의 사용을 위해 ED-B에 대해 매우 높은 결합 특이도를 갖는 새로운 결합 단백질을 확인하고 제공할 수 있으며, 헤테로-다중 결합 분자를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
특히, 본 발명의 유비퀴틴 기반의 헤테로-다중 결합 단백질(예를 들어, 1041-D11-TNF 알파)를 화학적 치료제(예를 들어, 멜파란)와 조합하면 화학적 치료제 단독으로 사용한 경우나 사이토카인과 화학적 치료제를 조합하여 사용한 경우 보다 종양 성장 감소를 보다 효과적으로 할 수 있다.
도 1은 다양한 종양에서 ED-B가 나타내는 것을 목록화한 표이다.
도 2는 ED-B에 대한 강한 결합 친화도를 갖는 것으로 확인된 추가 16개 서열들의 컨센서스 위치와 아미노산 치환을 도시하고 있다. 컨센서스 아미노산 위치들은 제1 단량체 BDR(binding determining region)의 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65, 66에 위치하고 컨센서스 아미노산 치환은 Q2T, F4W, K6H, Q62N, K63F, E64K, S65L, 및 T66S이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 4개 패밀리의 서열들은 강화될 수 있다 (컨센서스 서열, 문자의 크기는 아미노산의 발생빈도에 대응). 위치 85 및 87은 헤테로-이량체 단백질 내의 위치이고, 제2 단량체를 참조하면 대응 위치는 6과 8이며 141 - 145는 위치 62 - 66에 대응한다. 어두운 청색으로 묘사된 TWH NFKLS는 1071-C12에서 유래한다. 적색으로 표시된 잔기들은 상기 4개 패밀리 서열들 중 하나에 속한다. 적색으로 표시된 잔기들은 우세하게 강화되어 있고(178/457 서열들) HIT ELISA에 따르면 가장 강력한 결합 분자들을 포함한다.
도 3은 4량체화가 친화도 증가를 가져오는 것을 도시하고 있다. 도 3의 표는 변형된 유비퀴틴 단량체들로 구성된 4량체와 비교하여 변형된 유비퀴틴 단량체의 Kd 값을 나타내고 있다. 도시된 바와 같이, 유비퀴틴 변종 5E1 및 1H4이 예시되었다. ED-B 결합은 c-FN (세포 피브로넥틴)에 대한 결합과 비교된다. 도표 및 그래프들은 4량체 변종들(예를 들어, 5E1의 경우 56 nM, 1H4의 경우 1.4 nM)이 단량체(5E1의 경우 4.51 μM, 1H4의 경우 9.98 μM)에 비해 타겟 ED-B에 대해 유의적으로 높은 결합 친화도를 나타내고 있다.
도 4는 전방 (제1의) 변형 유비퀴틴 단량체(BDR1 가짐)와 다른 후방 (제2의) 변형 유비퀴틴 단량체 (BDR2 가짐)의 재조합이 특이도 뿐만아니라 친화도의 유의적인 증가를 나타내는 헤테로-이량체를 생성하는 것을 도시하고 있다. 변형된 유비퀴틴 분자들은 Biacore를 이용한 형광 이방성(fluorescence anisotropy) 분석을 통해 세포 및 조직 상의 결합이 분석된다. 인간 ED-B에 대한 몇개의 변종들의 결합과 관련하여 농도 의존적인 ELISAs (conc.-ELISA)가 도시되어 있다.
도 4a는 단량체 41B10에 대한 결합 친화도가 Kd = 9.45 μM인 것을 도시하고 있으며, 도 4b는 단량체 41B10이 다른 제2 단량체와 조합되어 생성된 46H9에 대한 결합 친화도가 Kd = 131 nM인 것을 도시하고 있다.
도 5는 사이토카인(예를 들어 TNF-알파)에 융합된 특정 변종을 도시하고 있다. 융합 단백질은 변형된 유비퀴틴 단량체를 3량체화한 것으로서 생물학적 활성 분자이다.
도 5a는 변형된 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합-이펙터(effector)-융합 단백질의 개략도이며, 녹색 부분(상부 구조)은 이펙터, 예를 들어 사이토카인, 바람직하게는 TNF-알파이고, 갈색 및 연한 갈색 부분은 변형된 유비퀴틴 단량체(Affilin®) 구조이다.
도 5b는 변형된 유비퀴틴 이펙터 컨쥬게이트인 5E1-TNF-컨쥬게이트가 세포사멸을 이끄는 활성을 가진 것을 도시하고 있다(L929 세포사멸 분석으로 측정). 도 5c는 1H4-TNF 알파-융합 단백질이 ED-B에 대한 높은 결합 친화도(Kd=15.1 nM)를 나타내고(조정 라인에 의해 연결된 검정원) BSA에 대한 결합은 대조군으로서 플롯팅된 것을 나타낸다(라인에 의해 연결되지 않은 검정원).
도 6은 사이토카인, 예를 들어 TNF 알파에 융합된 변형 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 헤테로-이량체 분자의 친화도 및 활성을 나타낸다. 변형 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 사이토카인 융합 단백질의 세포사멸 유도 활성(Apotosis inducing activity)은 EC50 0.78±0.24 pM이고, 자유로운 사이토카인의 세포사멸 유도 활성은 EC50 3.14±3.59 pM이다.
도 6a는 변형된 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 헤테로-이량체인 24H12의 친화도가 Kd = 50.7 nM인 것을 도시하고 있고, 도 6b는 사이토카인 TNF 알파에 유전적으로 융합된 변형 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 헤테로-이량체인 24H12가 헤테로-이량체인 24H12의 다중 결합을 유도하여 친화도가 증가한 것을 도시하고 있다(Kd = 5.6 nM).
도 6c는 헤테로 이량체 변형 유비퀴틴 라이브러리 선정에 의한 예시적인 후보들, 예를 들어, 헤테로-이량체 클론 9E12, 22D1, 24H12, 41B10에 대한 분석결과를 도시하고 있다. Kd ELISA 값은 대조군으로 사용된 사이토졸 피브로넥틴에 비해 타겟인 ED-B에 대해 그 값이 증가하여 상기 타겟에 대한 특이적 결합을 확인할 수 있다.
도 6d는 Biacore®를 이용한 표지없는 상호작용 분석을 통해 변형된 헤테로-이량체 유비퀴틴 분자인 9E12를 분석한 결과를 도시하고 있다. 칩(Biacore) 상에 고정된 ED-B에 대해 상이한 농도로 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종들을 분석하였고(0-15μM의 9E12), 헤테로-이량체 변종 9E12와 ED-B 사이의 상호작용을 분석하였다. Kd 값은 결합 및 해리 곡선의 분석으로부터 결정될 수 없었다. 도 6e는 Biacore®를 이용한 표지없는 상호작용 분석을 통해 변형된 헤테로-이량체 유비퀴틴 분자인 41B10을 분석한 결과를 도시하고 있다. 칩(Biacore) 상에 고정된 ED-B에 대해 상이한 농도로 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종들을 분석하였고(0-15μM의 41B10), 헤테로-이량체 변종 41B10과 ED-B 사이의 상호작용을 분석하였다. 결합 및 해리 곡선의 분석 결과 Kd는 623 nM (623 x 10-9 M, 6.2 x 10-7 M)이었다.
도 7은 상이하게 변형된 유비퀴틴 기반의 변종들이 친화도 및 특이도에 기여하는 것을 도시하고 있다. 상이한 변종들은 소문자로 표시된 공통의 서열 모듈을 공유하고 있다. 변종들은 ED-B 결합에 대해 분석되었다. 도 7은 단량체들의 상이한 조합들에 의한 변형 유비퀴틴 헤테로-이량체를 나타내고 있다. 헤테로-이량체 변종들인 46-A5, 50-G11 및 46-H4는 모두 BDR1을 가진 동일한 제1의 (전방) 변형 단량체(도면에서 영문자 "a"로 표시됨)를 갖고, BDR2를 가진 상이한 위치에서 변형된 제2의 (후방) 유비퀴틴 단량체를 갖는다. 변종 52-D10 및 52-B3는 BDR1을 갖는 46-H9에 비해 상이한 제1의 (전방) 변형 단량체를 갖고, BDR2를 갖는 동일한 제2의 (후방) 유비퀴틴 단량체(도면에서 영문자 "e"로 표시됨)를 갖는다.
변형된 유비퀴틴 헤테로-이량체는 하기의 서열을 갖는다:
46-H4: 서열번호 25, 45-H9: 서열번호 26, 46-A5: 서열번호 27, 50-G11: 서열번호 28, 52-B3: 서열번호 29, 52-D10: 서열번호 30.
전술한 서열은 서열 LEHHHHHH (His-Tag 31)을 갖는 His-태그를 추가함으로써 실험 과정에서 변형되었다.
도 7에서 확인되는 바와 같이, 46-H4는 ED-B에 대한 탁월한 결합 친화도를 갖고(Kd=189nM), 46-A5 및 52-D10은 결합 활성을 나타내지 않으며, 다른 변형 유비퀴틴 단백질들은 ED-B에 대한 46-H4의 활성에 비해 약한 결합 활성을 나타낸다. 따라서, 헤테로-이량체 변종에서의 양쪽 단량체는 타겟에 대한 높은 친화도 결합이 필요하고, 양쪽 단량체는 타겟에 대한 1가 결합을 나타낸다고 결론지을 수 있다.
높은 ED-B 결합 활성을 갖는 변형된 유비퀴틴 헤테로-이량체인 46 H9는 야생형 유비퀴틴 단량체에 비해 2개의 단량체의 양 결합 도메인 영역에서 다음과 같은 아미노산 치환이 있는 것이 확인된다:
제1 모듈 (BDR1)(a) Q2G, F4V, K6R, Q62P, K63H, E64A, S65T, T66L
제2 모듈 (BDR2) (e) K6H, L8M, Q62K, K63P, E64I, S65A, T66E
50G11
제1 모듈 (46H9)(a)　 Q2G, F4V, K6R, Q62P, K63H, E64P, S65T, T66L
제2 모듈 (c) K6M L8R, Q62M, K63N, E64A, S65R, T66L
46H4
제1 모듈 (46H9)(a)　 Q2G, F4V, K6R, Q62P, K63H, E64P, S65T, T66L
제2 모듈 (d) K6G, L8W, Q62T, K63Q, E64Q, S65T, T66R
52B3
제1 모듈 (g) Q2R, F4P, K6Y, Q62P, K63P, E64F, S65A, T66R
제2 모듈 (46H9) K6H, L8M, Q62K, K63P, E64I, S65A, T66E
52D10　　(ED-B에 대한 결합 활성 없음)
제1 모듈 Q2V, F4C, K6R, Q62T, K63A, E64P, S65G, T66D
제2 모듈 (46H9)(e)　K6H, L8M, Q62K, K63P, E64I, S65A, T66E
46A5 (ED-B에 대한 결합 활성 없음)
제1 모듈 (46H9)(a)　Q2G, F4V, K6R, Q62P, K63H, E64P, S65T, T66L
제2 모듈 (b)　K6L, L8M, Q62L, K63A, E64F, S65A.
도 8은 서열 배열을 도시하고 있다. 라인 1: 야생형 유비퀴틴 단백질(첫번째 라인)의 2개의 단량체는 위치 77에서 시작하고 위치 88에서 끝나는 12개의 아미노산 링커 SGGGGSGGGGIG로 연결된다. BDR2를 가진 제2 단량체는 메티오닌을 가진 위치 89에서 시작한다. 이러한 이량체의 야생형 유비퀴틴 단백질은 제1 단량체 및 제2 단량체에서 상이한 변형을 가진 변형 유비퀴틴 헤테로-이량체 변종 46-H9 (2번째 라인)과 정렬되어 2개의 BDR이 위치하게 된다. 양쪽 BDRs은 타겟에 대한 1가 결합 때문에 타겟 결합에 있어 함께 작용한다.
도 9는 변형된 유비퀴틴 헤테로-이량체 변종 1041-D11 (첫번째 라인)을 "Ub2_Tsx9"(양쪽 단량체의 위치 45에서 트립토판으로 변형된 유비퀴틴으로서, 2개의 단량체 사이에 링커 GIG(위치 77 내지 위치 79)가 위치하고, 제2 단량체는 위치 80에서 메티오닌으로 시작됨)에 서열을 정렬시킨 것과, 2번째 단량체의 마지막 C-말단 아미노산이 글리신에서 알라닌으로 치환된 것을 도시하고 있다. 3번째 라인은 이량체의 야생형 유비퀴틴인 "Ubi-Dimer wt"를 나타내며 링커 정렬이 없는 것(따라서, 제2 단량체는 메티오닌을 가진 위치 77에서 시작)을 나타내고 있다. 4번째 라인은 인간의 야생형 유비퀴틴인 "Ubi-Monomer wt"를 나타낸다.
도 10은 인간의 ED-B에 대한 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 1041-D11의 결합에 대한 농도 의존적인 ELISA를 도시한다. 변종 1041-D11는 ED-B에 대해 매우 높은 친화도 결합을 나타낸다(Kd = 6.9 nM = 6.9 x 10-9 M). 검정색 점은 피브로넥틴 단편을 포함하는 ED-B (67B89-t0로 칭함)에 대한 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 1041-D11의 결합 친화도를 나타내는데, 상기 변종이 흰색 점의 음성대조군 (6789-t0로 칭함)에 대해 결합하지 않는 것과 대조된다.
도 11은 자유로운 타겟의 양을 증가시키는 조건에서 피브로넥틴 단편을 포함하는 고정된 ED-B (67B89)에 대한 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 1041-D11의 결합에 대한 경쟁적인 농도 의존적 ELISA를 도시한다. 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 1041-D11는 ED-B에 대해 매우 높은 친화도 결합을 나타낸다(IC50 =140 nM).
도 12는 Biacore®를 이용한 표지없는 상호작용 분석을 통해 변형된 헤테로-이량체 유비퀴틴 분자인 1041-D11을 분석한 결과를 도시하고 있다. SA-칩 (Biacore)상에 고정된 피브로넥틴 단편을 포함하는 ED-B(67B89로 칭함)에 대한 결합에 대해 상이한 농도로 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종들을 분석하였다(0-200 nM 의 1041-D11). 결합 및 해리 곡선의 분석 결과 Kd는 1 nM (1 x 10-9 M)이고 7.7 x 10-4 s-1의 koff 레이트(rate)는 1041-D11과 ED-B 복합체의 긴 반감기를 나타낸다.
도 13은 결합 활성의 혈청-안정성을 동시에 분석하는 농도의존적인 ELISA에서 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 1041-D11의 ED-B에 대한 결합을 도시하고 있다. 마우스 또는 래트 혈청에서 변종을 37℃에서 1시간 동안 사전 인큐베이션하고, 대조군으로서 PBST에서 사전 인큐베이션하는 상이한 조건들이 도시되어 있다. Kd 값은 모두 10 nM과 20 nM 사이이다. 따라서, ED-B에 대한 헤테로-이량체 1041-D11은 혈청에 의해 유의적으로 영향받지 않는다고 결론지을 수 있다.
도 14는 피브로넥틴 단편과 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 1041-D11의 복합체 형성을 SE-HPLC에 의해 분석한 것을 도시하고 있다.
도 14a는 ED-B와 1041-D11의 복합체 형성을 도시한다. 3개의 HPLC 수행결과가 함께 나타나 있다. SE-HPLC 결과, 21.651분의 보유시간을 갖는 피크(파란색)는 순수한 1041-D11에서 유래한 것이고, 26.289분의 보유시간을 갖는 피크(검정색)는 피브로넥틴 단편 67B89를 나타내며, 1041-D11 및 67B89의 혼합물은 21.407분의 보유시간을 갖는 피크(적색)로 나타난다. 67B89 피크의 사라짐과 1041-D11 피크의 짧은 보유 시간으로의 이동은 1041-D11과 용해성 ED-B의 복합체 형성을 나타낸다.
도 14b는 3개의 SE-HPLC 수행결과를 함께 도시하는데, 1041-D11 (21.944분에서의 피크, 파란색), ED-B가 없는 피브로넥틴 단편 6789 (26.289분에서의 피크, 검정색) 그리고 1041-D11과 6789의 혼합물(21.929분과 26.289분에서의 피크, 적색)에 대한 결과가 나타나 있다. 1041-D11 피크 이동이 거의 관찰되지 않는다. 이는 6789 피크의 사라짐이 없는 것과 함께 ED-B가 없는 피브로넥틴 단편 6789에 대한 유의적인 결합이 없음을 나타낸다.
도 15는 배양된 세포에 대한 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 1041-D11의 결합을 나타낸다.
도 15a는 고정된 인간 태아 폐의 섬유아세포 세포(Wi38) 상에서 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 1041-D11의 결합을 도시한다. 도 15a의 첫번째 컬럼은 항-ED-B 항체를 이용한 대조군을 나타내고, 두번째 컬럼은 58.7 nM의 단백질 농도에서의 변종의 인큐베이션을 나타내며, 세번째 컬럼은 1041-D11 단백질 농도가 10배 더 높은 경우(587 nM), 그리고 네번째 컬럼은 PBS에서의 음성대조군을 나타낸다. 첫번째 행에서 인간의 Wi38 섬유아세포는 위상 대조로 나타나 있고, 두번째 행에서는 면역형광으로 나타나 있으며, 세번째 행에서는 핵을 염색하는 DAPI로 나타나 있다. 변종 1041-D11은 세포외 기질을 포함하는 ED-B에 대해 높은 특이도를 갖고 Wi38에 결합하는 것으로 결론지을 수 있다. ED-B를 낮은 수준으로 발현하는 NHDF 세포를 이용한 대조군 실험이 수행되었다(데이터 미도시). 변종은 상기 세포에 결합하지 않는다.
도 15b는 살아있는 인간의 태아 폐의 섬유아세포(Wi38) 상에서의 결합을 도시한다. 음성 대조군 세포인 NHDF는 ED-B-피브로넥틴을 낮은 수준으로 발현하는 1차 정상 섬유아세포이다. 첫번째 라인과 세번째 라인은 서로 다른 단백질 농도에서의 변종 및 음성 대조군을 나타낸다. 두번째 라인과 네번째 라인은 ED-B 항체를 이용한 대조군의 인큐베이션을 나타낸다. 처음 2개의 라인들은 Wi38 세포주 상에서의 변종과 양성 대조군을 나타낸다. 세번째 라인과 네번째 라인은 NHDF 세포의 인큐베이션을 나타낸다. 변종 1041-D11은 세포외 기질을 포함하는 ED-B에 대한 높은 특이도를 가지며 Wi38에 결합하는 것을 확인할 수 있다.
도 15c는 고정된 쥐의 Balb 3T3 세포 상의 결합을 도시한다. 변종에 대해 3개의 서로 다른 단백질 농도(1, 10, 50nM)가 테스트되었다. 첫번째 행은 세포 상의 변종(SPVF-28-1041-411-TsX9)을 나타내고, 두번째 행은 양성 대조군(Fv28-EDB-항체), 세번째 행은 음성 대조군에 의한 인큐베이션을 나타낸다(UB2_TsS9; 서열번호 1에 대응하는 변형되지 않은 유비퀴틴). 변종 1041-D11은 세포외 기질을 포함하는 ED-B에 대한 높은 특이도를 가지며 쥐의 Balb 3T3 세포에 결합하는 것을 확인할 수 있다.
도 15d는 고정된 쥐의 ST-2 세포 상의 결합을 도시한다. 변종에 대해 3개의 서로 다른 단백질 농도(1, 10, 50nM)가 테스트되었다. 첫번째 행은 세포 상의 변종(SPVF-28-1041-411-TsX9)을 나타내고, 두번째 행은 양성 대조군(Fv28-EDB-항체), 세번째 행은 음성 대조군에 의한 인큐베이션을 나타낸다(UB2_TsS9; 서열번호 1에 대응하는 변형되지 않은 유비퀴틴). 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 1041-D11은 세포외 기질을 포함하는 ED-B에 대한 높은 특이도를 가지며 쥐의 Balb ST-2 세포에 결합하는 것을 확인할 수 있다.
도 16a는 포유류 조직 섹션에서의 타겟에 대한 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 1041-D11의 특이도를 도시한다. 7개 샘플로부터의 F9 종양 세포가 평가되었다. 헤테로-이량체 유비퀴틴 변종 1041-D11을 10 nM과 100 nM 사이의 상이한 농도로 면역조직화학적 분석을 하면 마우스의 F9 종양 상에 ED-B 특이적인 관상 염색(vascular staining)이 나타났다. ED-B는 종양 맥관계(vasculature)에 대해 높은 특이도를 갖는 마커이다. 표적 단백질 ED-B는 혈관의 내강밖 쪽(abluminal side)에 위치한다. 변종 1041-D11은 F9 종양의 조직 섹션에서 맥관계에 특이적으로 결합한다. 이렇게 얻은 결과들은 항체 절편 L19와 비교된다. 또한 48개의 조직들이 테스트되었다. FDA 관련 패널에서 48개의 조직들 어디에서도 비특이적인 염색은 관찰되지 않았다.
도 16b는 야생형 유비퀴틴(Ub2 (NCP2))에 비해 1041-D11은 종양 조직에서 축적되는 것을 보여준다. F9 종양 조직은 30분과 16시간 사이의 상이한 시점에서 1041-D11과 야생형 유비퀴틴의 존재시 분석되었다. 종양 조직에서 1041-D11가 가장 많이 축적되는 것은 투여 후 30분과 16시간이 되는 시점인 반면에, 야생형 유비퀴틴은 F9 종양 조직에서 적게 축적되었다. 변종은 야생형 유비퀴틴에 비교하였을 때 ED-B를 발현하는 종양에서 풍부하다. 이는 종양 조직에서 1041-D11의 지향된 표적화에 대한 증거이다. 또한, 종양 모델에서 1041-D11의 종양 대 혈액비율은 동물에서의 1041-D11 변종의 생체내 활성을 보여준다(데이터는 미도시).
도 17은 ED-B에 대한 1041-D11-TNF-알파 융합 단백질의 높은 선택성과 특이도를 도시하고 있다.
도 17a 및 도 17b는 1041-D11-TNF-알파 융합 단백질의 세포사멸 유도 TNF-알파 활성이 세포기반 분석(L929 세포)에서 테스트되었다. 본 도면들은 1041-D11-TNF-알파 융합 단백질이 세포 배양액에서 자유로운 TNF-알파와 같이 활성을 나타내는 것을 명백히 보여준다(도 17b).
도 17c는 헤테로-이량체 유비퀴틴 1041-D11-TNF-알파 융합 단백질의 타겟 ED-B에 대한 높은 선택성을 보여준다. 인간의 ED-B 피브로넥틴 도메인 67B89는 변종 1041-D11에 대해 1.8 nM의 명백한 Kd 값으로 결합되어(검정색 원) 타겟에 대한 높은 친화도를 나타낸다. ED-B 도메인이 결여된 인간의 피브로넥틴(h6789)은 1041-D11-TNF-알파에 의해 결합되지 않는다(흰색 원).
도 17d, 도 17e는 변형된 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 1041-D11-TNF-알파 융합 단백질에 대한 결합 분석을 Biacore 어세이에 의해 수행한 결과를 도시한다. 이들 결과는 1041-D11-TNF-알파 융합 단백질이 1.13 nM의 Kd 값으로 높은 친화도를 갖는 것을 보여준다.
도 17f는 1041-D11가 TNF-알파에 융합되었을 때 세포 배양액에서 변종 1041-D11에 의해 관찰되는 높은 결합 친화도가 유지되는 것을 도시한다. 융합 단백질은 ED-B 발현 세포에 특이적으로 결합한다. 따라서, 1041-D11-TNF-알파 융합 단백질은 타겟 ED-B ("타겟(+)")에 대해 매우 높은 친화도 및 특이도로 결합한다. ED-B가 없는 혈청("타겟(-)")에서 교차 반응은 관찰되지 않았다.
도 18은 TNF-알파에 융합된 변종 1041-D11을 멜파란과 조합하여 7일간 마우스를 처치하는 동안에 생체내의 상대적 종양 성장을 도시하고 있다. 이들 데이터는 1041-D11-TNF 알파를 세포정지제(cytostatic agent)인 멜파란과 조합한 경우가 mTNF-알파를 멜파란과 조합한 경우나 멜파란 단독의 경우 보다 더 효과적으로 상대적 종양 성장을 감소시킴을 명백히 보여준다. 처치 후 7일간 종양 성장 카이네틱스는 1041-D11-mTNF 알파에 의해 종양의 효율적인 감소를 보여준다. 이는 융합 단백질 1041-D11-TNF-알파와 멜파란의 조합이 종양 치료에 효과적인 것에 대한 명백한 증거이다. ED-B는 마우스와 인간을 포함한 몇개의 포유동물 종에서 동일하고, 따라서, 이들 결과는 인간에서 변종 1041-D11-TNF 알파의 기능을 예측가능하게 해 준다.
하기 실시예들은 본 발명의 추가 설명을 위해 제공된다. 본 발명은 예시로서의 유비퀴틴의 변형에 대해 설명된다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 하기 실시예들은 상기 기술된 기초 내용에 근거한 본 발명의 실행을 단지 보여주기 위한 것이다. 본 발명의 완전한 개시를 위해 본 명세서에 언급된 문헌들이 참조되고 상세한 설명 마지막에 첨부된 참고문헌들은 그 전체가 본 발명의 명세서에 참고로서 통합된다.
실시예 1. 변형된 유비퀴틴 단백질에 기초한 헤테로-이량체 ED-B 결합 단백질 확인
라이브러리 구축 및 클로닝
다르게 언급되지 않는 한, 이미 구축된 유전자 재조합 방법, 예를 들어 Sambrook et al.에 기술된 바와 같은 방법이 사용되었다. 높은 복잡성을 갖는 인간의 유비퀴틴 헤테로-이량체의 무작위 라이브러리는 전체 15개의 선택된 아미노산 위치에 대한 잘 조정된 돌연변이 생성에 의해 준비되었다. NNK 트리플렛에 의해 치환된 변형 아미노산들은 전방 (제1의) 유비퀴틴 단량체 내의 위치 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66, 68로부터 선택된 적어도 3개의 아미노산들과, 후방 (제2의) 유비퀴틴 단량체 내의 위치 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66, 68로부터 선택된 적어도 3개의 아미노산들을 포함한다. 양쪽 유비퀴틴 단량체는 적어도 서열 GIG를 갖는 글리신/세린 링커 또는 적어도 서열 SGGGG, 예를 들어 GIG, SGGGG, SGGGGIG, SGGGGSGGGGIG (서열번호 32) 또는 SGGGGSGGGG를 갖는 글리신/세린 링커에 의해 유전적으로 연결되었다. 그러나, 다른 링커의 사용도 가능함은 물론이다.
TAT 파지 디스플레이 선택
헤테로 이량체 유비퀴틴은 예를 들어 선택 시스템으로서 TAT 파지 디스플레이를 이용하여 타겟에 대해 증량되었다. 당업계에 알려진 다른 선택 방법들도 사용될 수 있다. 타겟이 단백질 결합 표면 상에 비특이적으로 고정화되거나 상기 단백질에 공유적으로 결합된 비오틴화된 잔기를 통해 고정될 수 있다. 스트렙타비딘 비드 또는 뉴트라비딘 스트립에 대해 비오틴을 통한 고정화가 선호된다. 타겟-결합 파지들이 용액 내에서 또는 고정화된 타겟 상에서 선택된다. 예를 들어, 파지와 함께 비오틴화되고 고정화된 타겟이 인큐베이션되고 매트릭스에 결합된 파지를 세척하고 매트릭스-결합 파지를 용리시켰다. 타겟 인큐베이션 이후 각 사이클에서, 비드들은 용액에서 자기적으로 분리되었고 수차례 세척되었다. 첫번째 선택 사이클에서, 비오틴화된 타겟은 뉴트라비딘 스트립에 고정화되는 반면에, 용액 내에서의 2회부터 4회 선택에서는 타겟-파지 복합체가 스트렙타비딘이 코팅된 다이나비드(Dynabeads®)(Invitrogen) 상에서 고정화된다. 첫번째 2회 선택 사이클에서 세척 후 타겟-결합 변형 유비퀴틴 분자의 파지들이 산성 용액에 의한 용리에 의해 방출되었다. 선택 사이클에서 파지들에 대한 3회 및 4회 용리가 과량의 타겟에 의한 경쟁적 용리에 의해 수행되었다. 용리된 파지들은 재증폭되었다. 결합제의 특이도를 유도하기 위해, 타겟과 유사한 단백질이 선택과정 동안 포함될 수 있다.
TAT 파지 디스플레이 선택에 대한 대안: 리보좀 디스플레이 선택
유비퀴틴 라이브러리는 예를 들어 선택 시스템으로서 리보좀 디스플레이를 사용하여 타겟에 대해 증량되었다(Zahnd et al., 2007; Ohashi et al., 2007). 당업계에 알려진 다른 선택 방법들도 사용될 수 있다. 표준 방법에 따라 타겟은 비오틴화되었고 스트렙타비딘이 코팅된 다이나비드(Dynabeads?)(Invitrogen) 상에 고정화되었다. 리보좀, mRNA 및 초기 유비퀴틴 폴리펩타이드로 구성된 3원 복합체는 시험관내 단백질 합성키트인 PURExpressTM(NEB)를 이용하여 구성되었다. 1차 선택을 위해 2회 반복되었는데, 3원 복합체는 인큐베이션된 후 2회의 유사한 선택과정이 수행되었다. 타겟 인큐베이션 후 각각의 사이클에서, 비드들은 용액에서 자기적으로 분리되었고, 점차 엄격한 조건 하에서 리보좀 디스플레이 완충용액으로 세척되었다. 첫번째 2번의 사이클에서 세척 후 비드들은 다시 용액으로부터 자기적으로 분리되었고, 타겟-결합 변형 유비퀴틴 분자의 mRNA는 50 mM EDTA를 추가하여 리보좀으로부터 방출되었다. 선택 사이클에 있어서, mRNA에 대한 3회 및 4회 용리는 과량의 타겟에 의한 경쟁적 용리에 의해 수행되었다(Lipovsek and Pluckthun, 2004). 각각의 사이클 이후, RNA 정제 및 cDNA 합성이 RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen, Germany), Turbo DNA-free Kit(Applied Biosystems, USA) 및 Transcriptor Reverse Transcriptase (Roche, Germany)를 이용하여 수행되었다.
증량된 풀에 대한 클로닝
4번째 선택 사이클 이후 합성된 cDNA는 프라이머 F1 (GGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG) (서열번호 9) 및 프라이머 WUBI(co)RD_xho (AAAAAAAAACTCGAGACCGCCACGCAGACGCAGAACCAG) (서열번호 10)을 이용한 PCR에 의해 증폭되었고, 제한 뉴클레아제(restriction nucleases) NdeI 및 XhoI (Promega, USA)를 이용하여 절단된 후 양립되는 접합 말말단들을 통해 발현 벡터 pET-20b(+)(Merck, Germany)로 라이게이션되었다.
단일 콜로니 히트 분석 (Single Colony Hit Analysis)
NovaBlue(DE3) 세포(Merck, Germany)로의 형질전환 후, 앰피실린 내성 콜로니들이 200 ㎕ SOBAG 배지(100 ㎍/ml 앰피실린 및 20 g/l 글루코오스를 함유하는 SOB 배지)에서 37℃에서 6시간 동안 생장되었다. ED-B-결합 변형 유비퀴틴의 발현은 500 ㎕ 자동 유도 배지(auto induction medium) ZYM-5052 (Studier, 2005)을 이용하여 96-웰 플레이트(깊은 웰)(Genetix, UK)에서 16시간 동안 37℃에서 배양함으로써 달성되었다. 세포들은 3600g로 15분간 4℃에서 원심분리하여 수확되었고, 웰 당 300 ㎕ 세포파쇄 완충용액(lysis buffer)으로 30분간 37 ℃에서 인큐베이션하여 파쇄되었는데, 상기 세포파쇄 완충용액은 50 mM NaH2PO4 및 300 mM NaCl(pH8) 내에 0.2×BugBuster®(Merck, Germany), 0.3 mg/ml 리소자임(VWR, Germany), 0.2 mM PMSF(Roth, Germany), 3 mM MgCl2 및 0.2 U/ml 벤조나아제(Benzonase)(VWR, Germany)를 함유한다. 3600g로 30분간 4℃에서 원심분리한 후 얻어진 상등액을, 4 ㎍/ml의 ED-B 및 HRP(horseradish peroxidase)에 접합된 유비퀴틴-특이적인 Fab 단편으로 코팅된 Nunc MediSorp 플레이트(Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 ELISA에 의해 스크린하였다. 검출시약으로서 TMB-Plus (Biotrend, Germany)가 사용되었고, 50 ㎕/웰의 0.2 M H2SO4 용액을 이용하여 노란색을 발색시켜 450 nm 대 620 nm 파장에서 플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다.
통상, 여러번, 예를 들어 ED-B에 대한 4회의 선택 디스플레이가 수행되었다. 마지막 2회의 선택 사이클에서 결합 분자들이 자유로운 과량의 ED-B에 의해 용리되었다. 이들 ED-B 결합 변종들이 다른 것들 사이에서 확인되었다:
46H9의 서열
MGIVVRTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIPHPTLLHLVLRLRGGSGGGGSGGGGIGMQIFVHTMTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIKPIAELHLVLRLRGG (서열번호 6)
9E12의 서열
MRIPVYTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIPPFARLHLVLRLRGGSGGGGSGGGGIGMQIFVMTRTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIMNARLLHLVLRLRGG (서열번호 7)
22D1의 서열
MLILVRTLTDKTITLEVEPSDTIGNVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNISVGAMLHLVLRLRGGSGGGGSGGGGIGMQIFVLTWTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIRRLPPLHLVLRLRGG (서열번호 8)
야생형 유비퀴틴 단량체 (Ubi monomer wt)를 야생형 유비퀴틴 이량체 (ubi dimer wt)와 서열 정렬한 것과, 야생형 유비퀴틴 단백질(도 9에 Ub2-TsX로 표시된 것으로서, 각 단량체의 위치 45에서 치환이 있고 C-말단에서 2개의 치환이 있는 것)을 변형된 유비퀴틴 헤테로-이량체 변종 1041-D11과 서열 정렬한 것이 도 9에 도시되어 있다. Ub2-TsX에서 단량체의 C-말단에서의 치환(GG → AA)은 혈청에서의 안정성을 증가시키는데, 이는 GG 뒤에 탈유비퀴틴화 효소(deubiquitinases) 절단 위치가 있고 AA 뒤에 없기 때문이다. C-말단에서의 치환을 갖는 유비퀴틴과 비교하여 야생형 유비퀴틴의 2차 구조는 거의 동일하다.
1041-D11로 지칭되는 우수한 ED-B 결합 활성을 갖는 변형 유비퀴틴(도 9에 도시된 것으로서 서열번호 36) 또는 1045-D10은 야생형에 비해 다음과 같은 아미노산 치환이 있는 것으로 확인된다. 즉, 제1 모듈에서 K6W, L8W, K63R, E64K, S65F, T66P이고, 제2 모듈에서 K6T, L8Q, Q62W, K63S, E64N, S65W, T66E이며, 선택적으로 Q2R (변종 1041-D11에는 있으나 변종 1045-D10에는 없음)이다. 융합 단백질에 대한 적합한 링커는 서열번호 32 또는 서열 GIG를 포함하는 것이다. 그러나, 이 대신에 다수의 가능한 링커들이 사용될 수 있음은 물론이다.
추가의 바람직한 단백질은 아래의 서열에 의해 제공되며, 여기서 XXXX는 임의의 아미노산일 수 있다(서열번호 47).
Figure 112011062490681-pct00002
여기서 SGGGGSGGGGIG 서열은 링커로서 사용되었다. 다른 종류의 링커가 사용될 수 있으며 링커를 사용하지 않는 것도 가능한 것임은 물론이다.
이들 서열을 갖는 단백질 예들에 대한 컨센서스 서열(consensus sequences)은 도 2에 도시되어 있다.
실시예 2. ED-B-결합 변형 유비퀴틴 변종과 인간의 TNF 알파(hTNFa)로부터 융합 단백질의 생산
변종들은 변형된 유비퀴틴, 예를 들어, 헤테로-이량체 변종 1041-D11과, 마우스 또는 인간의 TNF 알파 사이의 융합 단백질로서 대장균에서 발현된다. 용합 단백질의 단백질 분석은 다음과 같은 것을 포함한다: 단백질 발현 및 순도, 모이는 가능성 없을 것, 세포 배양액에서의 TNF 알파 활성, 타겟 단백질 ED-B에 대한 친화도, 세포 배양액에서의 선택성 및 특이적 결합. F9 종양을 가진 마우스에서 종양의 수축을 유도하기 위한 동물실험을 위해 마우스 TNF 알파를 가진 융합 단백질이 사전에 요구된다.
단계 1: 융합 단백질 클로닝을 위한 벡터(pETSUMO-TNFα)의 제조
"pETSUMOadapt"는 변형된 pETSUMO 벡터이며(Invitrogen), 이는 다중 클로닝 부위(MCS)의 추가 삽입에 의해 변형된 것이다. pETSUMOadapt에 클로닝된 TNF 알파로부터 출발하여, ED-B와 결합하는 변형된 유비퀴틴 변종의 삽입을 위한 제한 부위들이 삽입되었다. 얻어진 구조물은 다음의 DNA 서열 (서열번호 11)을 갖는 His6-SUMO-TNFα 구조를 갖는다:
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACGGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCGCTAGCATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGCCAGAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCTTTAAGAAGGCTGATGGAAGCGTTCGCTAAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACGACGGTATTAGAATTCAAGCTGATCAGACCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATTATTGAGGCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTGTGCGTAGCAGCAGCCGTACCCCGAGCGATAAACCGGTGGCGCATGTGGTGGCGAATCCGCAGGCGGAAGGCCAGCTGCAGTGGCTGAACCGTCGTGCGAATGCGCTGCTGGCCAACGGCGTGGAACTGCGTGATAATCAGCTGGTTGTGCCGAGCGAAGGCCTGTATCTGATTTATAGCCAGGTGCTGTTTAAAGGCCAGGGCTGCCCGAGCACCCATGTGCTGCTGACCCATACCATTAGCCGTATTGCGGTGAGCTATCAGACCAAAGTGAACCTGCTGTCTGCGATTAAAAGCCCGTGCCAGCGTGAAACCCCGGAAGGCGCGGAAGCGAAACCGTGGTATGAACCGATTTATCTGGGCGGCGTGTTTCAGCTGGAAAAAGGCGATCGTCTGAGCGCGGAAATTAACCGTCCGGATTATCTGGATTTTGCGGAAAGCGGCCAGGTGTATTTTGGCATTATTGCGCTGTAATAA.
BamHI 및 XhoI 부위를 도입하여 PCR을 수행함으로써 TNF 알파 서열이 증폭되었다.
사용된 프라이머는 다음과 같다:
SUMO-EDB-TNFα-fw (서열번호 12): TTT TTT GGA TCC GTG CGT AGC AGC AGC
SUMO-EDB-TNFα-rev (서열번호 13): CTT GTC TCT CGA GGC GGC CGC TTA TTA C
상기 포워드 프라이머 (서열번호 12)는 TNFα의 최초 15개 염기쌍(밑줄로 표시)을 인지하고 BamHI 서열(굵은 글씨로 표시)을 갖는다. 상기 리버스 프라이머(서열번호 13)는 TNFα의 마지막 염기쌍, 정지 코돈(밑줄로 표시), 및 XhoI-제한 부위 (굵은 글씨로 표시)를 포함한다.
PCR 반응 혼합물 (100 ㎕):
84.5 ㎕ H2O; 10 ㎕ 10x Pwo 버퍼 + Mg; 2 ㎕의 10 mM dNTPs (=200 μM); 각각의 프라이머(포워드 및 리버스 프라이머)의 용량 0.5 ㎕, 농도는 100 μM (= 각각의 프라이머 최종 농도 0.5 μM); 2 ㎕ DNA (=0.25 ㎍); 0.5 ㎕ Pwo 폴리머라아제 (=2.5 U; Roche)
PCR-프로그램:
94℃에서 3분, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 2 분(단계 2부터 단계 4까지: 30 사이클), 72℃에서 5분, 그리고 이후 4℃. PCR 산물을 Qiagen-MinElute-Kit로 정제한다(10 ㎕ EB에서 용리). PCR 산물은 BamHI-XhoI 부위 제한효소 절단 및 라이게이션을 통해 pETSUMOadapt 벡터의 MCS로 도입된다.
제한효소 절단 혼합물(100 ㎕):
벡터: 83 ㎕ H2O; 10 ㎕ 10x NE 버퍼 3; 1 ㎕ 100x BSA; 3 ㎕ BamHI (=30 U; NEB), 1.5 ㎕ XhoI (=30 U; NEB); 1.65 ㎕ 벡터; 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션.
PCR 산물: 76.5 ㎕ H2O; 10 ㎕ 10x NE 버퍼 3; 1 ㎕ 100x BSA; 3 ㎕ BamHI (=30 U; NEB), 1,5 ㎕ XhoI (=30 U; NEB); 8 ㎕ 인서트(insert); 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션.
1% 아가로스 겔에서 절단물 분리(100 V에서 60분 동안 수행); 절단 벡터 단편(5659 bp) 및 인서트(insert)(491 bp); Qiagen 겔 추출키트(Qiagen gel extraction kit)로 정제(30 ㎕ EB에서 용리).
라이게이션 (20 ㎕):
15.2 ㎕ H2O; 2 ㎕ 10x T4-DNA 라이게이즈 버퍼; 2.26 ㎕ 벡터 (200 ng); 0.54 ㎕ 인서트 (40 ng).
5분 동안 65℃에서 인큐베이션; 16℃까지 냉각; 1 ㎕ T4-DNA 라이게이즈 (=3 U; NEB) 첨가; 16시간 동안 16℃에서 인큐베이션.
NaAc/이소프로판올-침전:
라이게이션-혼합물(20 ㎕)+ 2.2 ㎕ 3M NaAc(pH 5.0) + 22.2 ㎕ 이소프로판올; -20℃에서 30분; 4℃에서 15분, 13000 Upm; 500 ㎕ 70% 에탄올에서 펠릿 재현탁; 스핀; 10 ㎕ H2O에서 펠릿 재현탁.
형질전환:
전기반응(electro-competent)하는 Novablue(DE3)-세포(40 ㎕-분취량)를 10 ㎕의 라이게이션 산물과 혼합; 0.1-cm-일렉트로포레이션 큐벳으로 옮김; 일렉트로포레이터에서 펄스 발생(1.8 kV, 50 μF, 100 Ohm); 45분 동안 37℃에서 1 ml SOC-배지로 용액 인큐베이션, 220 Upm; LB-플레이트 상에서 100㎕ 카나마이신; 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션.
단계 2: 변형된 유비퀴틴 기반의 ED-B 융합 단백질 클로닝
ED-B 결합 변형 유비퀴틴 기반의 변종과 TNFα의 융합체 생성을 위해, 문제의 ED-B 결합 변형 유비퀴틴 기반 서열을 PCR을 통해 pET20b-벡터로부터 증폭한다. BsaI-제한 부위 및 BamHI-제한 부위가 도입된다. 이 방법은 단량체 또는 이량체 ED-B 결합 변형 유비퀴틴 기반의 변종을 위해 적합하다. 단량체 야생형 유비퀴틴(WT-Ubiquitin) (Wubi)을 위한 프라이머는 다음과 같다:
SUMO-EDB-WUBI-fw (서열번호 14): GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG CAG ATC TTC GTG
SUMO-EDB-Linker-rev (서열번호 15): GTG GTG GGA TCC ACC GCC ACC ACC AGA ACC GCC ACG CAG ACG
상기 포워드 프라이머 (서열번호 14)는 변형된 유비퀴틴의 첫번째 15개의 염기 쌍(밑줄친 부분)을 인지하고 BsaI-서열(굵은 글씨로 표시)을 갖는다. 상기 리버스 프라이머(서열번호 15)는 변형된 유비퀴틴의 마지막 15개의 염기 쌍을 인지하고 아미노산 링커(서열 SGGGG) 및 BamHI-제한 부위(굵은 글씨로 표시)가 삽입되어 있다. 각각의 변형된 유비퀴틴 기반의 변종의 경우 특이적인 포워드 프라이머가 사용된다. 단량체 ED-B 결합 변형 유비퀴틴 기반의 변종들인 1H4, 5E1 및 4B10에 대한 프라이머는 다음과 같다:
1H4 (MWIKV…): 프라이머(SUMO-EDB-1H4-fw) (서열번호 16): GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG TGG ATC AAG GTG
4B10 (MLILV): 프라이머 (SUMO-EDB-4B10-fw) (서열번호 17): GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG TTG ATC CTG GTG
5E1 (MVINV…): 프라이머 (SUMO-EDB-5E1-fw) (서열번호 18): GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG GTT ATC AAT GTG
상기 리버스 프라이머는 모든 단량체 변형 유비퀴틴 기반의 변종을 위해 사용된다. 이량체 변형 유비퀴틴 기반 변종들을 위한 리버스 프라이머는 다음과 같다:
Dimer-t0a-rev (서열번호 19): GTG GTG GGA TCC ACC GCC ACC ACC AGA ACC ACC ACG TAA ACG
이량체 야생형 유비퀴틴(WT-ubiquitins)(WubiHubi) 및 이량체 ED-B 결합 변형 유비퀴틴 기반의 변종을 위한 포워드 프라이머는 다음과 같다:
WT (MQIFV…) 프라이머 (SUMO-EDB-WUBI-fw) (서열번호 20): GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG CAG ATC TTC GTG
(이량체 야생형 유비퀴틴을 위한 포워드 프라이머는 단량체 야생형 유비퀴틴을 위한 포워드 프라이머와 동일함)
9E12 (MRIPV…): 프라이머(9E12-t0a-fw) (서열번호 21): GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG CGT ATC CCT GTG
24H12 (MVIKV…): 프라이머 (24H12-t0a-fw) (서열번호 22):GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG GTT ATC AAG GTG
15G7 (MEIGV…): 프라이머 (15G7-t0a-fw) (서열번호 23): GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG GAG ATC GGT GTG
22D1 (MLILV…): 프라이머 (22D1-t0a-fw) (서열번호 24): GTT CCA AGG TCT CAT GGT ATG CTT ATC TTG GTG
PCR 반응 혼합물 (100 ㎕):
84.5 ㎕ H2O; 10 ㎕ 10x Pwo 버퍼 + Mg; 2 ㎕의 10 mM dNTPs (=200 μM); 각각의 프라이머(포워드 및 리버스 프라이머)의 용량 0.5 ㎕, 농도는 100 μM (= 각각의 프라이머 최종 농도 0.5 μM); 2 ㎕ DNA (변종에 의존함); 0.5 ㎕ Pwo 폴리머라아제 (=2.5 U; Roche)
PCR-프로그램:
1. 94℃에서 3분
2. 94℃에서 30초
3. 60℃에서 30초
4. 72℃에서 2 분(단계 2부터 단계 4까지: 30 사이클)
5. 72℃에서 5분, 그리고 이후 4℃.
PCR 산물을 아가로스 겔에서 정제, 필요한 밴드 절단 후 Qiagen 겔 추출키트(Qiagen gel extraction kit)로 정제. PCR 산물을 BsaI-BamHI-제한 부위를 통해 pETSUMO-TNFα 벡터로 클로닝.
제한효소 절단 혼합물(100 ㎕):
75 ㎕ H2O; 10 ㎕ 10x NE 버퍼 3; 1 ㎕ 100x BSA; 3 ㎕ BsaI (=30 U; NEB); 8 ㎕ DNA (벡터 또는 PCR 산물) 2시간 동안 50℃에서 인큐베이션, 10분 동안 65℃에서 인큐베이션, 3 ㎕ BamHI (=30 U; NEB)을 첨가하고 2시간 동안 37℃에서 1% 아가로스 겔에서 절단물 분리; 절단 벡터 단편 및 인서트; Qiagen 겔 추출키트(Qiagen gel extraction kit)로 정제(30 ㎕ EB에서 용리)
라이게이션 (20 ㎕):
12.5 ㎕ H2O; 2 ㎕ 10x T4-DNA 라이게이션 버퍼; 5 ㎕ 벡터 (66 ng); 0.5 ㎕ 인서트 (가변적임).
5분 동안 65℃에서 인큐베이션; 16℃까지 냉각; 1 ㎕ T4-DNA 라이게이즈 (=3 U; NEB) 첨가; 16시간 동안 16℃에서 인큐베이션.
NaAc/이소프로판올 침전 (단계 1 참조)
형질전환
전술한 바와 같이 전기반응(electro-competent)하는 Novablue(DE3) 세포에서 수행한다. 그 결과로 얻어진 융합 구조물은 His6-SUMO-변형 유비퀴틴-SGGGG-TNFα에 의한 pETSUMOadapt 내의 ED-B 결합 변형 유비퀴틴과 TNFα(단량체 변형 유비퀴틴을 가진 359개의 아미노산, 이량체 변형 유비퀴틴을 가진 447개의 아미노산)
실시예 3. 유비퀴틴 기반의 TNF 알파 융합 단백질의 발현 및 정제
DNA 서열 분석은 SUMO-TNFα 융합 단백질의 정확한 서열을 보여준다. 변종들의 발현을 위해 클론들은 LB/카나마이신으로 1:100으로 희석하여 쉐이커 플라스크에서 배양되었고, 배양물을 37℃에서 200 rpm으로 교반하여 600 nm (OD600)에서의 광학밀도(optical density)가 0.5에 도달하도록 하였다. 발현은 IPTG (최종 농도 1 mM)를 첨가하여 유도되었다. 배양은 30℃, 200rpm에서 4시간 동안 계속되었다. 4℃에서 6000 x g로 20분 동안 원심분리하여 세균 세포들을 수집하였다. 세포 펠릿은 벤조나아제와 리조자임을 포함하는 30ml의 NPI-20 완충용액에서 현탁되었다. 세포들은 얼음 위에서 초음파 (3x20 초)에 의해 파쇄되었다. 4℃에서 40000　x g로 30분 동안 원심분리하여 가용성 단백질을 포함하는 상등액이 얻어졌다. 양쪽 단백질이 실온에서 친화 크로마토그래피에 의해 정제되었다. Ni-아가로스(5 ml, GE Healthcare)의 하나의 컬럼이 50 ml의 NPI-20으로 평형화되었다. 가용성 단백질을 포함하는 상등액이 컬럼에 가해지고 NPI-20에 의해 세척단계가 수행되었다. 결합된 단백질은 100 ml의 50% NPI-500에 대한 선형 구배로 용리되었다. 분획물들이 순도와 관련하여 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 적합한 분획들이 모아졌고 SUMO-가수분해효소 절단 버퍼(50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8.0)로 평형화된 겔 여과 컬럼(Superdex 75, 1.6 x 60 cm, GE Healthcare)에 대해 1ml/분의 유량으로 적용되었다.
절단 반응은 제조사 지침(Invitrogen)에 따라 행해졌다. 절단 후 단백질은 Ni-아가로스 컬럼(5ml, GE Healthcare)에 적용되었다. His-태그된 SUMO-가수분해효소 및 His-태그된 SUMO은 컬럼에 결합되었고 올바른 융합 단백질이 컬럼을 통과하였다(His-태그 없음). 단백질의 순도는 rpHPLC 분석 및 겔 전기영동에 의해 검증되었다. TNFα를 통한 3량체의 올바른 분자량은 분석적인 SEC 분석 (10/30 Superdex G75, GE Healthcare)을 이용하여 확인되었다.
실시예 4. 인간의 ED-B에 대한 변형 유비퀴틴 기반 ED-B 결합 변종들의 결합 분석
실시예 4A. 농도 의존적인 ELISA에 의한 변형 유비퀴틴 기반 ED-B 결합 변종들에 대한 결합 분석
인간의 ED-B에 대한 유비퀴틴 기반 변종들의 결합은 농도의존적인 ELISA에 의해 분석되었다. 인간의 ED-B, BSA 및 세포 피브로넥틴(cFN)으로 코팅된 NUNC-메디소프 플레이트에 정제된 단백질을 증량시키면서 가하였다. 웰 당 50 ㎕ (10 ㎍/ml)로 항원 코팅을 4℃에서 하룻밤 동안 수행하였다. PBS, 0.1 % 트윈 20(Tween 20)(pH 7.4)(PBST)로 플레이트를 세척한 후, 웰들을 블로킹 용액(PBS pH 7.4; 3 % BSA; 0.5% Tween 20)을 이용하여 37℃에서 2시간 동안 블로킹시켰다. 웰들을 다시 PBST로 3회 세척하였다. 변형된 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 단백질의 농도를 달리하면서 웰내에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다(50 ㎕ 부피)(도 10에 도시된 바와 같이 시작 농도로서 1041-D11 단백질 500 nM이 사용되었음). PBST로 웰들을 세척한 후, 항-Ubi fab 단편 (AbyD) POD 컨쥬케이트가 PBST에 적절히 희석되어 가해졌다(예를 들어, 1:2000 또는 1:6500). 상기 플레이트가 웰당 300 ㎕의 버퍼 PBST로 3회 세척되었다. 50 ㎕의 TMB 기질 용액 (KEM-EN-Tec)이 각각의 웰에 첨가되어 15분간 인큐베이션되었다. 반응은 웰 당 50 ㎕ 0.2 M H2SO4를 첨가하여 정지되었다. ELISA 플레이터는 TECAN Sunrise ELISA-리더를 이용하여 판독되었다. 광학 흡광도 측정은 참조 파장(reference wavelength)으로 620 nm 파장을 사용하여 450 nm 파장에서 수행되었다. 관련 도면은 11 nM의 명확한 Kd 값으로 1H4가 ED-B에 특이적으로 결합하는 것을 명확하게 도시하고 있다. 변종 5E1과 4B10은 각각 7.7 μM과 280 nM의 Kd 값을 나타낸다. 도 10은 변종 1041-D11이 ED-B에 대한 매우 높은 친화도로 결합하는 것을 나타낸다(Kd=6.9 nM). 따라서, 유비퀴틴 야생형에서 단지 소수의 변형만(각각의 단량체에서 8개 치환까지)이 ED-B에 대한 매우 높은 친화도 결합을 갖게 된다.
실시예 4B. 경쟁적 농도의존적인 ELISA에 의한 변형된 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 변종에 대한 결합 분석
자유로운 타겟의 양을 증가시키는 조건 하에서 경쟁적 농도의존적인 ELISA에 의해 피브로넥틴 단편(67B89)을 포함하는 고정화된 ED-B에 대한 유비퀴틴 변종 1041-D11에 대한 결합을 분석하였다. ELISA의 조건은 1041-D11 단백질이 1시간 동안 ED-B (67B89)(0 μM - 10 μM) 또는 음성 대조군 6789 (0 μM - 10 μM)에 의해 미리 인큐베이션되는 것을 제외하고는 실시예 4A에 기술된 바와 같으며, 이후 혼합물은 메디소프-플레이트 상에 위치하는 타겟 67B89에 가해지고 이어서 변종은 대응하는 항체(항-유비퀴틴-Fab-POD; 1:6500 희석)에 의해 검출되었다.
도 11은 변종 1041-D11이 ED-B에 대한 매우 높은 친화도 결합을 갖는 것을 나타낸다(IC50 =140 nM). 도 10에 도시된 결과, 즉 유비퀴틴 야생형에서 단지 소수의 변형만(각각의 단량체에서 8개 치환까지)이 ED-B에 대한 매우 높은 친화도 결합을 갖게 된다는 사실이 확인된다.
실시예 4C. 결합 활성의 혈청 안정성을 동시에 분석하는 농도의존적인 ELISA에 의한 변형 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 변종에 대한 결합 분석
ELISA는 당업계에서 잘 알려진 과정, 실시예 4A 및 4B에 기술된 바와 같은 과정을 이용하여 수행되었다. ED-B(여기서는 67B89로 지칭됨)는 미세적정 플레이트에 코팅되고, 변종은 ED-B에 결합되며 특이적 유비퀴틴-항체(항-Ubi-Fab-POD)에 의해 검출된다. 본 분석에서 변종은 다른 방식으로 처리된다: 변종은 37℃에서 1시간 동안 마우스 혈청에서 인큐베이션되거나(도 13의 파란색 원); 37℃에서 1시간 동안 래트 혈청에서 인큐베이션되거나(도 13의 적색 원); 37℃에서 1시간 동안 PBS에서 인큐베이션된다(도 13의 검정색 원). 도 13은 변종 1041-D11의 전체 Kd 값이 10.3 nM (PBS에서)에서 20.74 nM (마우스 혈청에서)까지의 범위에 있는 것을 도시하고 있다.
실시예 4D. Biacore 어세이에 의한 변형 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 변종에 대한 결합 분석
변종의 농도를 달리하면서(예를 들어 변종, 바람직한 변종으로서 1041-D11의 농도를 0-200 nM으로 함), CM5-칩(Biacore) 상에 고정화된 피브로넥틴 단편을 포함하는 ED-B(67B89로 지칭됨)에 대한 결합을 당업자에 알려진 방법들을 사용하여 분석하였다. BIA 평가 소프트웨어(BIA evaluation software) 및 1:1 랭뮤어 맞춤(Langmuir-fitting)을 통해 얻어진 데이터들이 처리되었다. 변종 1041-D11의 KD는 도 12에 도시된 바와 같이 1.0 nM이었다. 결합 반응 속도 상수(kinetic binding constant)는 kon=7.6*105 M-1s-1; koff= 7.7*10-4s-1 이었다. 융합 단백질 1041-D11 TNF 알파의 KD는 도 17d에 도시된 바와 같이 1.13 nM이었다. 결합 반응 속도 상수(kinetic binding constant)는 kon= 4.5*105 M-1s-1; koff= 5.0*10-4s-1이었다.
실시예 4E. SE-HPLC에 의한 변형 유비퀴틴 기반 ED-B 결합 변종에 대한 복합체 형성 분석
복합체 형성 분석을 위해, Tricorn Superdex 75 5/150 GL 컬럼(GE-Healthcare) (V = 3 ml)이 사용되었고 50 ㎕의 단백질이 가해졌다. 추가의 조건들은 다음과 같다: 버퍼: 1x PBS, pH 7.3, 유량(flow-rate): 0.3 ml/분, 런닝시간: 45분 (샘플 주입: 15분 후).
조건: 0.72 nmol 1041-D11 단백질 + 0.72 nmol ED-B (여기서는 67B89로 지칭되고, 음성대조군은 6789)가 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되고 복합체 형성 분석을 위해 칼럼에 가해졌다. 도 14에서, 변종만이 검정색으로 도시되고, 타겟 ED-B만이 파란색으로 도시되며, ED-B와 복합체를 만드는 변종은 분홍색으로 도시된다. 도 14a는 변종과 ED-B, 도 14b는 ED-B가 없는 변종을 도시한다. 이 도면은 변종 1041-D11가 ED-B (67B89)와는 복합체를 구성하지만 6789와는 복합체를 구성하지 않는 것을 도시한다.
실시예 5. TNF 알파의 생물학적 어세이
TNF-알파와 변형된 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 단백질의 융합 단백질에 대한 생리학적 TNF 알파 활성이 L929 세포사멸 어세이에 의해 결정되었다(Flick et al., 1984 J. Immunol. Methods. 68:167-175). 이러한 어세이에서, TNF-알파는 액티노마이신 D로 감작된 세포의 세포사멸을 촉진하는데, EC50 값에서 피코몰 범위를 갖는다.
세포들은 FBS와 항생제를 포함하는 배지에 재현탁되었다. 3.5x105 세포/ml 밀도의 100 ㎕ 세포 현탁액을 96 웰 표준 세포 배양 플레이트로 파종하고 습도가 조절된 CO2 인큐베이터에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 배양 배지가 제거되었고 FBS, 액티노마이신 D 및 항생제를 포함하는 50 ㎕의 배지가 각각의 웰에 첨가되었으며 추가 30분 동안 인큐베이션되었다. 그리고, 50 ㎕의 테스트 아이템인 TNF-알파와 변형 유비퀴틴 기반 ED-B 결합 단백질의 융합 단백질, 또는 인간의 재조합 TNF-알파 대조준이 10-7 내지 10-18M의 적절한 농도 범위에서 첨가되었다. 추가의 48시간 인큐베이션 이후에 세포 활성 척도로서의 대사 활성이 WST-1 시약 (Roche)을 이용하여 결정되었다.
테스트 아이템에 대해 적어도 3번의 독립적인 시험이 수행되어 3배수 시험이 수행되었다. TNF-알파와 변형 유비퀴틴 기반 ED-B 결합 단백질의 융합 단백질에 대한 각각의 시험은 인간의 재조합 TNF-알파의 투여량 범위를 시험하여 비교됨으로써 어세이 간 변수에 대한 정보를 얻었다.
정량적 평가는 EC50-값, 즉 세포 절반의 생존을 촉진하는 테스트 아이템의 농도에 따른 값에 기초한다.
TNF-알파-mub-융합 EC 50 값
mub®-TNF-알파 융합 TNF-알파에 대응
Wubi-TNF-알파 5.18±2.84 pM 7.97±12.18 pM
Wubi-Hubi-TNF-알파 32.58±11.26 pM 5.02±3.70 pM
SPWF-28_22-D1_TNF-알파 26.15±14.41 pM 2.32±2.07 pM
SPWF-28_24-H12_TNF-알파 0.78±0.24 pM 3.01±4.18 pM
상기 표 2에서 mub는 변형된 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 단백질을 의미한다.
TNF-알파와 변형 유비퀴틴 기반 ED-B 결합 단백질의 융합 단백질 중 하나의 유비퀴틴 단량체(Wubi)와 3개의 유비퀴틴 이량체 구조물이 분석되었다. TNF-알파 부분에 커플링된 변형 유비퀴틴 기반의 ED-B 결합 변종에 의존하여 TNF-알파 연관 활성의 크기가 대략 1개 차수 만큼 증가하거나(SPWF-28_24-H12_TNF-알파), 감소하였다(SPWF-28_22-D1_TNF-알파, Wubi-Hubi-TNF-알파). 도 17에는 변종 1041-D11에 대한 TNF 알파 분석이 도시되어 있다.
실시예 6. 세포 배양 어세이에 있어서 유비퀴틴 변종의 결합 분석
세포 배양액에 대한 변종 1041-D11의 결합이 테스트되었다. 상이한 세포 배양액에 대해 분석되었는데, 예를 들어, ED-B 발현 수준이 높은 정상적인 인간 태아 폐의 섬유아세포 (Wi38 세포), 마우스 배아 섬유아세포주(Balb 3T3), 마우스 골수의 단핵세포에서 유래한 간질 세포주(ST-2)/마우스 대식세포에서 유래한 간질 세포주(RAW 264.7), NHDF 세포 및 쥐의 섬유아세포(LM)에 대해 분석되었다.
변종 1041-D11 (상이한 농도) 또는 ED-B 특이적 항체 (500nM FV28 CH4/F1 1x PBS)가 Wi38 세포 (60,000 세포/ml; ATCC로부터 입수)와 함께 인큐베이션되었고 (1시간, 37℃), 메탄올로 고정 과정 (5분, -20℃), 블로킹 과정(5% Horse/PBS, 1시간)이 수행된 후, 토끼(rabbit)-a-Strep-Tag-IgG (GenScript로부터 입수된 A00875, 1:500)에 의한 1시간 동안의 인큐베이션과, a-토끼(rabbit)-IgG*Alexa488-AK (Invitrogen으로부터 입수된 A11008, 1:1000)에 의한 1시간 동안의 인큐베이션이 수행되었다. 핵은 DAPI로 염색되었다. 도 15a의 첫번째 컬럼은 ED-B 항체를 이용한 대조군을 나타내고, 두번째 칼럼은 58.7 nM의 단백질 농도로 변종을 인큐베이션한 것을 나타내며, 세번째 컬럼은 1041-D11 단백질의 농도가 10배 높은 경우(587 nM), 네번째 컬럼은 PBS에 의한 음성 대조군을 나타낸다. 첫번째 행에서 인간의 Wi38 섬유아세포는 위상 대조로 나타나 있고, 두번째 행에서는 면역형광으로 나타나 있으며, 세번째 행에서는 DAPI 염색으로 나타나 있다. 이들 사진으로부터 변종 1041-D11은 세포외 기질을 포함하는 ED-B에 대해 높은 특이도를 갖고 고정된 Wi38에 결합하는 것으로 결론지을 수 있다. 음성 대조군 세포형인 NHDF 세포는 ED-B 피브로넥틴을 낮은 수준으로 발현하는 1차 정상 섬유아세포이다(데이터 미도시). 변종은 상기 세포에 결합하지 않는다.
도 15b는 살아있는 Wi38 상에서의 변종 1041-D11에 대한 분석을 도시한다. 음성 대조군 세포형인 NHDF는 ED-B-피브로넥틴을 낮은 수준으로 발현하는 1차 정상 섬유아세포이다. 세포들은 챔버-슬라이드(NUNC, 60000 세포/ml)에 플레이팅되었다. 결합 능력을 분석하기 위해 세포들은 -20℃에서 5분 동안 100% MeOH로 고정되었다. 비특이적인 결합을 막기 위해, 세포들은 37℃에서 1시간 동안 5% 말 혈청에서 인큐베이션되었다. 세포들은 변종 1041-D11, 양성 대조군인 ED-B 특이적 항체 FV28 CH4/F1 또는 음성 대조군인 UB_2로 농도를 달리하면서 실온에서 1시간 동안 테스트되었다. 토끼(rabbit)-a-Strep-Tag-IgG(GenScript로부터 입수된 것, A00875, 1:500)로 1시간 동안 인큐베이션하고 a-토끼(rabbit)-IgG*Alexa488-AK(Invitrogen으로부터 입수된 것, A11008, 1:1000)로 1시간 동안 인큐베이션함으로써 반응결과가 나타났다. 핵은 DAPI로 염색되었다. 도 15b의 첫번째 라인과 세번째 라인은 서로 다른 단백질 농도에서의 변종 및 음성 대조군을 나타낸다. 두번째 라인과 네번째 라인은 ED-B 항체를 이용한 대조군의 인큐베이션을 나타낸다. 처음 2개의 라인들은 Wi38 세포주 상에서의 변종과 양성 대조군을 나타낸다. 세번째 라인과 네번째 라인은 NHDF 세포의 인큐베이션을 나타낸다. 이들 사진으로부터 변종 1041-D11은 세포외 기질을 포함하는 ED-B에 대한 높은 특이도를 가지며 Wi38에 결합하는 것을 확인할 수 있다. ED-B를 포함하지 않는 NHDF 세포를 이용한 대조군 실험도 수행되었다(데이터 미도시). 변종은 상기 세포에 결합하지 않는다.
유사한 실험들이 다른 세포형, 예를 들어 Balb3T3 (ATCC, Kat-Nr. 30-2002), Raw(Lonza, Kat-Nr. BE12-115F/U1), ST-2(Lonza, Kat-Nr. BE12-115F/U1)를 이용하여 수행되었다. 도 15c 및 도 15d는 ED-B에 대한 결합이 쥐의 Balb3T3 세포 및 ST-2 세포에 높은 수준으로 특이적임을 도시하고 있다. 단핵백혈구/대식세포(Raw)에 대한 결합은 관찰되지 않았다(데이터 미도시).
앞서 요약한 바와 같이, 도 16a는 조직 섹션에서의 1041-D11의 특이도를 도시한다. 7개 샘플로부터의 F9 종양 조직이 평가되었다. 500 nM의 1041-D11로 면역조직화학적 분석을 하면 마우스의 F9 종양 상에 ED-B 특이적인 관상 염색(vascular staining)이 나타났다. ED-B는 종양 맥관계(vasculature)에 대해 높은 특이도를 갖는 마커이다. 표적 단백질 ED-B는 혈관의 내강밖 쪽(abluminal side)에 위치한다. 1041-D11은 F9 종양의 조직 섹션에서 맥관계에 특이적으로 결합한다. 이렇게 얻은 결과들은 항체 단편 L19의 조직 특이도와 비교된다. 또한 48개의 조직들이 테스트되었다. FDA 패널에서 48개의 조직들 어디에서도 비특이적인 염색은 관찰되지 않았다. 도 16b는 야생형 유비퀴틴(Ub2 (NCP2))에 비해 1041-D11이 종양 조직에서 축적되는 것을 보여준다. 따라서, ED-B에 특이적으로 결합하는 변형 유비퀴틴에 기초한 융합 단백질은 암에 대한 ED-B 기반 표적화 치료에 적합하다.
실시예 7. 1041-D11-TNF 알파에 대한 생체내 연구의 유효성
1041-D11-TNF 알파의 치료적 유효성을 확립하기 위해, 이 화합물은 마우스 모델에서의 F9 테라토마(teratoma)에 대해 테스트되었다(Borsi et al., 2003 Blood 102, 4384-4392 참조). 마우스에서의 ED-B 발현은 생체내 환경에서 인간에 견줄만하고, 암에 대한 1041-D11-mTNF 알파의 치료적 영향력, 바람직하게는 멜파란과 같은 세포독성 화합물과 조합하였을 때의 치료적 영향력을 평가하는데 적합하다. F9 테라토마는 높은 맥관(혈관) 밀도를 갖는 공격적인 종양이다. Borsi 등은 ED-B-항체를 통한 마우스 TNF 알파의 표적화가 종양 성장 지연에 의해 증명된 멜파란의 효과를 향상시킨다고 보고하고 있다. 본 유효성(효과) 실험 계획은 상기 Borsi 등의 논문을 변형한 것이다.
본 연구의 1단계에서는 종양 대(對) 체중, 체중 감소 및 생존과 관련한 종말점까지 약리학적 활성 투여량 및 허용가능한 투여량을 한정하였다. 본 발명자들은 1041-D11-TNF 알파는 최고 투여량 6.75 pmol/g이 허용가능한 투여량이었지만 종양 성장에 대한 억제 효과는 갖지 않았다 (투여 후 3, 4 및 8일째에 체중의 10 % 초과, 동물은 사망). 반면에, 1041-D11-TNF 알파는 최하 투여량 0.25 pmol/g에서 종양 성장을 지연시키는 것으로 보인다. 추가로 사용된 투여 그룹들은 1041-D11-TNF 알파 2.25 pmol/g으로부터 내려갔다.
본 연구의 2단계에서는 종양 성장 지연의 종말점까지 멜파란으로 투여량 의존적인 유효성(효과)을 한정하였다(동물 체중 감소 > 10 %, 종양 > 10 % 체중, 종양의 궤양화). 본 연구에서 멜파란과 조합된 1041-D11/mTNFα 및 쥐의 TNFα가 테스트되었다. 168마리의 동물이 사용되었다. 14개의 투여 그룹들(그룹당 8마리의 마우스로, 300 - 400 mm3 용적의 F9 종양을 가질 때 실험에 사용)에 테스트 샘플을 정맥내 주사를 한 후, 24시간 후에 멜파란을 복강내 주사를 하였다. 아래의 표는 투여량 스케쥴을 보여준다.
Figure 112011062490681-pct00003
도 18은 7일간 처치하는 동안에 상대적 종양 성장을 도시하고 있다. 도 18은 본 발명의 화합물 1041-D11-TNF 알파를 멜파란과 조합한 경우가 mTNF-알파를 멜파란과 조합한 경우나 멜파란 단독의 경우 보다 더 효과적으로 상대적 종양 성장을 감소시킴을 명백히 보여준다. 처치 후 7일간 종양 성장 카이네틱스는 1041-D11-mTNF 알파에 의해 종양의 유의적인 감소를 보여준다. 이는 융합 단백질 1041-D11-TNF-알파와 멜파란의 조합의 유효성(효과)에 대한 명백한 증거이다.
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Claims (28)

  1. 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B에 결합할 수 있는 단백질에 있어서,
    2개의 단량체 유비퀴틴 유닛이 선단과 말단(head-to-tail)의 배열로 연결되어 있고 상기 각각의 단량체는 서열번호 1의 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 적어도 6개의 아미노산의 치환에 의해 상이하게 변형되어 있는 변형된 헤테로-이량체 유비퀴틴 단백질을 포함하고,
    상기 치환은,
    제1 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 4, 6, 62, 64, 65 및 66 위치에서의 치환을 포함하되 아미노산 4 위치에서는 F가 W로, 아미노산 6 위치에서는 K가 H, W 또는 F로, 아미노산 62 위치에서는 Q가 N으로, 아미노산 64 위치에서는 E가 K, R 또는 H로, 아미노산 65 위치에서는 S가 L, F 또는 W로, 아미노산 66 위치에서는 T가 S 또는 P로 치환되는 것을 특징으로 하고,
    제2 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서의 치환을 포함하되 아미노산 6 위치에서는 K가 H, T, N, S 또는 Q로, 아미노산 8 위치에서는 L이 Q, T, N 또는 S로, 아미노산 62 위치에서는 Q가 G, W 또는 F로, 아미노산 63 위치에서는 K가 W, S, T, N 또는 Q로, 아미노산 64 위치에서는 E가 N, S, T 또는 Q로, 아미노산 65 위치에서는 S가 A, F 또는 W로, 아미노산 66 위치에서는 T가 P, E 또는 D로 치환되는 것을 특징으로 하며,
    상기 단백질은 상기 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B에 대해 Kd = 10-7- 10-12 M의 특이적인 결합 친화도를 가지며 상기 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B(ED-B)에 대해 1가의 결합 활성을 나타내는, 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B에 결합할 수 있는 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 치환은,
    제1 단량체 유닛에서 적어도 K6W, L8W, K63R, E64K, S65F 및 T66P의 치환, 그리고 제2 단량체 유닛에서 적어도 K6T, L8Q, Q62W, K63S, E64N, S65W 및 T66E의 치환을 포함하는, 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B에 결합할 수 있는 단백질.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    양쪽 유비퀴틴 단량체는 직접 연결되거나 링커에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B에 결합할 수 있는 단백질.
  5. 제1항에 따르는 단백질에 약제학적으로 활성인 성분 또는 진단 성분이 융합되고, 상기 약제학적으로 활성인 성분은 사이토카인, 케모카인(chemokine), 세포독성 화합물, 또는 효소이고, 상기 진단 성분은 형광 화합물, 광감작제 또는 핵종인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서,
    서열번호 33, 서열번호 34 또는 서열번호 47의 유비퀴틴 헤테로-이량체를 포함하는 융합 단백질.
  7. 삭제
  8. 제5항에 있어서,
    상기 약제학적으로 활성인 성분은 TNF-알파 또는 그 유도체인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  9. 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항에 따르는 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B에 결합할 수 있는 단백질, 또는 제5항, 제6항 또는 제8항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 약제학적으로 유효량 포함하고 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 암질환 치료를 위한 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    하나 이상의 화학치료제를 더 포함하는 암질환 치료를 위한 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    조합된 제제 형태이거나, 부분별 키트 형태인 암질환 치료를 위한 약제학적 조성물.
  12. 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항에 따르는 재조합 단백질 또는 제5항, 제6항 또는 제8항 중 어느 한 항에 따르는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  14. 제12항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  15. 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항에 따르는 단백질 또는 제5항, 제6항 또는 제8항 중 어느 한 항에 따르는 융합 단백질과 진단학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암질환 진단을 위한 진단 조성물.
  16. a) 단량체 유비퀴틴 단백질로부터 유래한 상이하게 변형된 이량체 유비퀴틴 단백질들의 집단을 제공하는 단계로서, 상기 집단은 선단과 말단(head-to-tail)의 배열로 연결된 2개의 변형된 유비퀴틴 단량체를 포함하는 이량체 유비퀴틴 단백질을 포함하고, 상기 이량체 단백질의 각각의 단량체는 서열번호 1의 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 및 68 위치에서 적어도 6개의 아미노산의 치환에 의해 상이하게 변형되어 있으며, 상기 치환은 (1) 제1 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되고 제2 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되거나, (2) 제1 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되고 제2 단량체 유닛에서 적어도 아미노산 6, 8, 62, 63, 64, 65 및 66 위치에서 치환되는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 상이하게 변형된 이량체 유비퀴틴 단백질들의 집단을 제공하는 단계와,
    b) 가능한 리간드로서 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B (ED-B)를 제공하는 단계와,
    c) 상기 상이하게 변형된 단백질들의 집단을 상기 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B (ED-B)와 접촉시키는 단계와,
    d) 스크린 과정에 의해 변형된 이량체 유비퀴틴 단백질을 확인하는 단계로서, 10-7- 10-12 M 범위의 Kd를 갖는 특이적인 결합 친화도로 상기 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B (ED-B)에 결합하고 상기 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B (ED-B)에 대해 1가의 결합 활성을 나타내는 변형된 이량체 유비퀴틴 단백질을 확인하는 단계를 포함하는, 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B에 결합할 수 있는 단백질의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 상이하게 변형된 이량체 유비퀴틴 단백질들의 집단은 상이하게 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질 각각을 인코딩하는 DNA 라이브러리 2개를 유전적으로 융합함으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B에 결합할 수 있는 단백질의 제조방법.
  18. 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항에 따르는 단백질이 약제학적으로 활성인 성분 또는 진단 성분에 융합된 것을 특징으로 하는 제5항, 제6항 또는 제8항 중 어느 한 항에 따르는 융합 단백질의 제조방법.
  19. 암질환의 치료 및 진단을 위한, 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항에 따르는 재조합 단백질 또는 제5항, 제6항 또는 제8항 중 어느 한 항에 따르는 융합 단백질.
  20. 제1항에 정의된 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질을 인코딩하는 DNA를 포함하는 라이브러리.
  21. 제20항에 따르는 2개의 라이브러리를 융합하여 얻은 DNA를 포함하는 융합 라이브러리에 있어서,
    헤테로-이량체 유비퀴틴 융합 단백질을 얻기 위해 각각의 라이브러리는 상이하게 변형된 단량체 유비퀴틴 단백질 유닛을 인코딩하고, 단량체 유닛들은 선단과 말단 배열로 연결되며, 헤테로-이량체 유비퀴틴 융합 단백질을 인코딩하는 상기 융합 라이브러리는 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B (ED-B)에 대해 1가 결합 활성을 나타내는 융합 라이브러리.
  22. 제20항 또는 제21항의 DNA 라이브러리 발현에 의해 얻어진 단백질 라이브러리.
  23. 제4항에 있어서,
    상기 링커는 적어도 서열 GIG 또는 적어도 SGGGG를 갖는 것을 특징으로 하는 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B에 결합할 수 있는 단백질.
  24. 제4항 또는 제23항에 있어서,
    상기 링커는 서열 SGGGGIG 또는 SGGGGSGGGGIG (서열번호 32)를 갖는 것을 특징으로 하는 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B에 결합할 수 있는 단백질.
  25. 제8항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 서열번호 35 또는 서열번호 36의 서열을 갖거나, 서열번호 47은 TNF-알파 또는 그 유도체에 융합되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  26. 제10항에 있어서,
    상기 화학치료제는 멜파란, 독소루비신, 시클로포스파미드, 닥티노마이신, 플루오로데옥시우라실, 시스플라틴, 파클리탁셀 및 젬시타빈에서 선택되거나, 카이네이즈 저해제 그룹에서 선택되거나, 또는 방사성 의약품인 것을 특징으로 하는 암질환 치료를 위한 약제학적 조성물.
  27. 제16항에 있어서,
    상기 치환은 제2 단량체 유닛에서 아미노산 2 위치에서의 추가 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B에 결합할 수 있는 단백질의 제조방법.
  28. 제16항에 있어서,
    e) 상기 결합 친화도를 갖는 상기 변형된 이량체 유비퀴틴 단백질을 분리하는 단계를 더 포함하는, 피브로넥틴의 엑스트라도메인 B에 결합할 수 있는 단백질의 제조방법.
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