JP2008500953A - ユビキチンタンパク質に基づく人工結合タンパク質の生成 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
a)修飾するタンパク質を選択し;
b)結合パートナーを決定し;
c)βシート領域の少なくとも1つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む前記タンパク質の少なくとも1つの表面露出領域におけるアミノ酸を選択し;
d)前記選択アミノ酸を、置換、挿入、欠失、及び/又は、化学修飾により修飾し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフを保持し;
e)前記修飾タンパク質を、工程b)で決定した前記結合パートナーと接触させ、
f)工程b)で予め定めた前記結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質を検出する。
a)修飾するタンパク質を選択する工程。
b)結合パートナーを決定する工程。
c)βシート領域の少なくとも1つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む前記タンパク質の表面露出領域におけるアミノ酸を選択する工程。
d)前記選択アミノ酸を、好ましくは、置換、挿入、欠失、及び/又は、化学修飾により修飾し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフを保持する工程。
e)前記修飾タンパク質を、工程b)で決定した前記結合パートナーと接触させる工程。
f)工程b)で予め定めた前記結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質を検出する工程。
対応する構造データ、例えば、Protein Data Bank(商標)(Berman et al., 2000; http://www.rcsb.org/pdb)から自由に入手できる構造データに基づき、開始タンパク質、例えば、ユビキチンタンパク質骨格におけるアミノ酸の位置であって、その側鎖が表面に露出している、即ち、溶媒又は予定される結合パートナーの方に向いているアミノ酸の位置は、コンピューター解析を用いて突き止めることができる。さらに、開始タンパク質、例えば、ユビキチンのアミノ酸であって、そのランダムな置換がタンパク質骨格の安定性にマイナスの効果を与えないか、与えてもわずかであると推定されるアミノ酸も、コンピューター解析により同定できる。この情報は、各単一アミノ酸の結合部位の要素としての適合性についての第一の指標とすることができ、また、その次に実験的検証を必要とする。本発明の好ましい実施態様においては、例えば、ヒトユビキチンの第2、4、6、62、63、64、65及び66番目の位置のアミノ酸が、その表面露出及びランダム置換に対する全体的構造の許容度に起因して、選択された。前述の位置は、それぞれ、アミノ末端の第1βシート鎖の始まり部分(位置2、4、6)、及び、ループ部分(位置62、63)、又は、カルボキシ末端の第4βシート鎖の始まり部分(位置64、65、66)で、互いに空間的に近接して局在し、それらのアミノ酸側鎖でユビキチン表面上に隣接する領域を形成する(図1)。解析される領域のランダムアミノ酸置換(“ランダム化”)によって、―抗体の抗原結合部位と同様の様式で―その他の点では無傷なユビキチンのタンパク質構造上に超可変表面露出領域を生成できる。
選択されたアミノ酸の修飾によりタンパク質ライブラリを確立した後、前記修飾タンパク質を、本発明に従い、予め定められた結合パートナーと接触させた。結合親和性が存在する場合には、状況に応じて、パートナーの相互の結合が容易となる。
遺伝子工学作業は、当該技術分野の当業者に公知の標準プロトコール、例えば、Sambrook et al. (2001)などのようなものにより行った。
合成ユビキチン遺伝子のアミノ及びカルボキシ末端の8コドンのランダム部位特異的突然変異生成のため、2連続のPCR反応を行った。第1増幅工程は、Pfuポリメラーゼ(Promega)を使用して10x50μLの容量で行った。この目的のため、5μLの供給された10xPfuバッファー及び4μLのdNTPミックスをサンプルごとに使用し、H2Oで満たした。さらに、各サンプルには、好ましい塩基対置換の導入のため、2.5μLの側面プライマー(配列番号10、11;10μM)を含ませた。鋳型として、非突然変異型合成ユビキチン遺伝子を含む1.0ngのpMUBI‐1を使用した。2.5UのPfuポリメラーゼ(上記参照)の添加に続き、94℃/1分、60℃/1分及び72℃/1.5分のサイクルを25サイクル、インキュベーションした。最終インキュベーションは、72℃で5分行った。採用した鋳型DNAの選択的分解のため、反応サンプルごとに10UのDpnIを付加し、37℃で1時間インキュベーションを行った。望ましいPCR産物は、調製アガロースゲル電気泳動及びQIAクイックゲル抽出キット(Qiagen)を用いて単離した。
表面に提示された突然変異ユビキチンのファージミドバリエーションの産生のため、100mLの2xYT/クロラムフェニコール培地に、1.0mLの実施例2で得られたグリセロール培地を植菌し、37℃、16時間、220rpmでインキュベーションした。この定常期培地の10mLを1Lの2xYT/クロラムフェニコール培地に植菌し、細胞密度がOD600=0.4となるまで37℃、220rpmで撹拌した。1013cfuのM13K07ヘルパーファージで感染を行い、37℃で撹拌することなく30分インキュベーションした。50mg/Lのカナマイシンを添加した後、前記サンプルを37℃、30分、220rpmで撹拌し、その後、培地を無水テトラサイクリン(保存溶液:DMF中2.0mg/mL)の濃度を0.2mg/Lに調整することでpMUBI‐1の遺伝子発現を誘導した。その後、インキュベーター温度を26℃に低減し、16時間、220rpmで撹拌した。最終的に、細胞を遠心分離で沈殿させ(30分、12,000g、4℃)廃棄した。上清はろ過した(0.45μm)。含まれるファージミドは、1/4容量の20%(w/v)PEG6,000、2.5M NaClを添加して沈殿させ、氷上で1時間インキュベーションし、遠心分離して沈殿させた(30分、12,000g、4℃)。その後、ファージミドを、4mLの氷冷PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4)に溶解し、氷上に30分置き、遠心分離して(30分、12,000g、4℃)保存した。前記上清を、PBS中4%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)と1:1で混合し、ローラーミキサー上で室温、30分インキュベーションし、親和性向上において直接使用した。
recGLP1‐R、FcIgM、及び、HCに対する親和性向上の第3ラウンド後に得られたクローンから、96個をランダムに選択して、各抗原又はハプテンへの結合に対する単一ファージELISAで解析した。この目的のため、単一コロニーを300μLの2xYT/クロラムフェニコール培地に植菌し、37℃、18時間、220rpmで撹拌した。この定常培養液の80μLを、4mLの2xXT/クロラムフェニコール培地に植菌し、37℃、4時間、180rpmで撹拌した。並行作業を可能とするため、4つの“ディープウェル”プレート(Qiagen、各24ウェル)を使用した。XL1Blue細胞に1011cfuのM13K07ヘルパーファージを感染させた後、37℃、30分のインキュベーションを行った。さらに、37℃、30分、180rpmの後、50mg/Lカナマイシンを添加した。その後、37℃、30分、220rpmの撹拌を続け、培地を無水テトラサイクリン(保存溶液:DMF中1.0mg/mL)の濃度を0.2mg/Lに調整することでpMUBI‐1の遺伝子発現を誘導した。その後、インキュベーター温度を22℃に低減し、16時間、180rpmで撹拌した。最終的に、細胞を遠心分離で沈殿させ(30分、5,000g、4℃)、上清を、新しい“ディープウェル”に移した。含まれるファージミドは、1容量の20%(w/v)PEG6,000、2.5M NaClを添加して沈殿させ、氷上で1時間インキュベーションし、遠心分離して沈殿させた(30分、5,000g、4℃)。その後、ファージミドを1.0mLの氷冷滅菌PBSに溶解し、6%PBSTと1:1で混合し、室温、1時間インキュベーションした。
インビトロ転写/翻訳のための発現コンストラクトの提供、及び、リボソームディスプレイを用いた結合タンパク質の選択は、Schaffitzel et al. (2001)に従って行った。しかしながら、これとは対照的に、本ケースでは、抗体断片のライブラリは使用せず、実施例2で記載したものと同様のユビキチンバリエーションのライブラリを使用した。これらのライブラリの1つは、Ile44Ala、Lys48Arg、Arg54Leu、Val70Ala、Arg72Leu、Gly75Alaの置換、及び、Gly76欠失を有する修飾ユビキチンタンパク質骨格のDNA配列(配列番号1)に基づき調製された。第2のライブラリは、Phe45Trpの置換を有する修飾ユビキチンタンパク質骨格のDNA配列(配列番号15)に基づき調製された。
ファージミドから選択され、ELISAにおいて比較的強い結合シグナルを示し、機能的なDNA配列を有するユビキチンバリエーションのタンパク質化学的特性の特徴付けを、各遺伝子を発現ベクターpET20B(−)にクローングした後に行った(上述参照)。これにより、大腸菌BL21/pUBSを用いた組換え技術による各バリエーションの調製、及び、固定化金属キレートアフィニティクロマトグラフィー(IMAC)によるカルボキシ末端融合6ヒスチジンペプチドを使用したワンステップ精製が可能となる。
各ケースで選択され、実施例6に記載のように精製されたユビキチンバリエーションのrecGLP1‐R、FcIgM及びHCへの結合を、Ni/NTAペルオキシダーゼ結合物(Qiagen)又はラビット由来ユビキチン抗血清(Sigma)を用いたELISAにより検出した。この目的のため、マイクロタイタープレートのウェルを各抗原及び非特異的結合の検出のためのBSAなどで4℃一晩満たし、残りの結合部分を飽和させるため、PBST0.5中3%BSA(w/v)を用いて2時間ブロックした。前記プレートを、PBST0.1を用いて3回リンスしタップアウトした。その後、PBST0.1中の連続濃度(無希釈から1:16希釈までの範囲)の修飾精製タンパク質溶液100μLを、プレートのウェルにピペットで取った。2時間のインキュベーションの次に、PBST0.1を用いて3回リンスした。結合した修飾タンパク質の検出のため、Ni/NTAペルオキシダーゼ結合物を1:500の比率で希釈し、又は、ユビキチン抗血清をPBST0.1中で1:10の比率で希釈し、それぞれの100μLをウェルに加えた。室温、1時間のインキュベーションの次に、直接、Ni/NTAペルオキシダーゼ複合体の検出(下記参照)、又は、ラビット抗体ペルオキシダーゼ複合体(PBST0.1中1:2,500)とインキュベーションを室温、1時間行った。検出のため、ウェルをPBST0.1で3回リンスし、次に、PBSで3回リンスした。最後に、100μLのImmunoPureキットをピペットでとり、15分後に、100mLの2M H2SO4を添加して呈色反応を止めた。吸光度は、Sunrise Remote Reader(Tecan)を用いて450nmで測定した。得られた吸収強度の値は、“シグマプロット”コンピュータプログラムにより評価した。この目的のため、各ケースで測定された吸光度を採用した対応するタンパク質濃度に対してプロットし、得られたカーブを下記式(1)を使用した非線形回帰により適合させた。
x=採用した修飾タンパク質濃度、
y=抗原/修飾タンパク質複合体濃度(リポーター酵素の酵素活性により間接的に測定したもの)、
a=固定化した抗原の総濃度、
b=解離定数(KD)である。
FcIgMに対して新規な結合特性を示すユビキチンバリエーションSPU‐2‐A7に基づき、親和性成熟についての一般的に適用可能な戦略を確立した。これは、まず、DNAレベルの結合部位内で選択した位置の新しくランダムに生成された新規置換、及び、後に続く、96個のバリエーションの並行した発現、精製、結合分析を含む。この“96フォーマット”を使用して、前記戦略を実験室のロボットに移行でき、そして、高い生産性で、バリエーションの解析ができる。
2つの同一のユビキチンバリエーションの結合を、この目的のために特異的に導入したシステイン残基を介して、ビス‐マレイミドヘキサン(BMH、Pirce)を用いて行った。まず、プロリンが後に続くシステインの適当なコドンをこの目的のために、3'末端の読み枠に、即ち、6ヒスチジンペプチドの後のタンパク質のカルボキシ末端に導入した。このように、最後のプロリン残基は、結果として得られるタンパク質を産生及び精製中のタンパク質分解から保護する。対応する塩基対のpET20B(−)への挿入は、クイックチェンジ(商標)部位特異的突然変異導入キット(Stratagene)を用いて製造業者の取扱説明書に従って、配列番号27及び28のオリゴデオキシヌクレオチド及び鋳型としてユビキチンバリエーションの遺伝子(配列番号15)を使用して行った。結果として得られたクローンをDNAシーケンシングにより解析し、望ましい挿入部分を持つ発現プラスミドを有するコロニーを実施例6における組換え体の産生と精製に使用した。
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配列番号2〜7:鋳型
配列番号8〜14:プライマー:
配列番号15:ライブラリの基礎としての修飾ユビキチン配列
配列番号16〜26:プライマー
配列番号27、28:オリゴデオキシヌクレオチド
配列番号29〜34:ユビキチン変異体ライブラリの構築
Claims (41)
- “ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリー、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質、及び、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するその断片又は融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質であって、前記タンパク質の少なくとも1つの表面露出領域であってβシート領域の少なくとも1つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む領域における1以上のアミノ酸の修飾に起因して、以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を有し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフが維持されているタンパク質。
- 前記修飾のために選択されるタンパク質が、ヒトユビキチンと少なくとも30%のアミノ酸配列の同一性及びユビキチン様折り畳みモチーフを有し、かつ/又は、“ユビキチン関連タンパク質”のタンパク質ファミリーに属する請求項1記載のタンパク質。
- 前記修飾のために選択されるタンパク質が、ユビキチン様折り畳みモチーフを有し、好ましくは、SUMO‐1、FAU、NEDD‐8、UBL‐1、Rub1、APG8、ISG15、URM1、HUB1、GDX、elonginB、PLIC2(N末ドメイン)、ヒトparkin(N末ドメイン)からなる群から選択される請求項1又は2に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質が、ヒトユビキチン又はその他の哺乳類のユビキチンである前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- 前記修飾が、前記タンパク質の表面の5から10アミノ酸、好ましくは6から8アミノ酸の隣接する領域を含み、好ましくはその2から4アミノ酸が表面露出βシートにある前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- 第1及び第4βシート鎖の表面露出アミノ酸が修飾され、必要に応じて、さらに、哺乳類ユビキチンの非βシート領域の第62から65番目の領域が修飾された前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- 前記修飾が、置換、挿入、欠失、化学修飾又はこれらの組み合わせであり、一次配列で直接隣接した又は直接隣接していないアミノ酸を少なくとも部分的に1以上、好ましくは、置換を含み、好ましくは、一次配列において隣接していない修飾されたアミノ酸が、二次構造において隣接した結合パートナーに対する結合領域を形成する前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- 修飾、好ましくは、置換される一次配列において直接隣接したアミノ酸の数が、2から8の直接隣接したアミノ酸であり、より好ましくは、3から7、又は、4から6、又は、2から4の直接隣接したアミノ酸である前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- 一次配列において互いに直接隣接した修飾されたアミノ酸の部分が、βシート鎖の開始又は終結部分であって、前記部分が、2以上のアミノ酸長、好ましくは、2又は3のアミノ酸長である前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- 一次配列において互いに直接隣接する5以上のアミノ酸が修飾、好ましくは、置換され、そのうちの1、2以上、好ましくは、2又は3の直接隣接したアミノ酸が、βシート鎖領域の開始又は終結部分を形成する前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- 前記修飾が、前記タンパク質表面上で隣接する領域を形成するアミノ酸において行われる前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- 請求項1の野生型タンパク質において、ユビキチンの天然結合パートナーへの結合に関与する領域に属さない位置のアミノ酸が修飾されている前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質、好ましくは、ユビキチンのβ鎖に存在する少なくとも25%のアミノ酸が修飾されている前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- さらに、前記タンパク質のループ領域のアミノ酸が修飾されている前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- ヒトユビキチン又はそれに相同なタンパク質であって、少なくとも8個のユビキチンの表面露出アミノ酸が修飾、好ましくは、置換されており、前記修飾アミノ酸が結合パートナーに対する結合親和性を有する領域を含む前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- 前記8個の表面露出アミノ酸のうち少なくとも6個が、前記タンパク質のβシート領域に指定される領域内に存在する請求項15記載のタンパク質。
- 修飾、好ましくは、置換された少なくとも5個のアミノ酸が、一次配列において互いに直接隣接している請求項15又は16に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質のアミノ末端βシート鎖及び/又はカルボキシ末端βシート鎖に位置するアミノ酸が修飾されている前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- さらに、カルボキシ末端βシート鎖に続くループに位置するアミノ酸が修飾されている前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- 前記修飾タンパク質が、第2、4、6、62、63、64、65及び66番目の位置で、置換、欠失、挿入、及び/又は、化学修飾、好ましくは、置換されたヒトユビキチンである前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- 修飾のために選択されるタンパク質が、既に挿入、欠失、置換及び/又は化学修飾され、前記タンパク質の生物学的及び/又はタンパク質化学的機能が、廃棄され又は新規に生成された前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- 修飾の後に、合計して少なくとも10、好ましくは、少なくとも15のユビキチンのアミノ酸が置換された請求項21記載のタンパク質。
- 置換、挿入及び/又は欠失による改変のために選択されるタンパク質が、第44、48、54、70、72及び75番目の位置の1以上においてアミノ酸が置換され、第76番目のアミノ酸が欠失されたヒトユビキチンであって、本質的に天然の結合パートナーとの相互作用を示さないユビキチンである請求項21又は22記載のタンパク質。
- 前記タンパク質が、第45番目の位置においてフェニルアラニンからトリプトファンへの置換を含むヒトユビキチンである前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- ランダム突然変異生成により選択されたアミノ酸のランダム置換が行われた前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- 前記結合パートナーが、抗原又はハプテンである前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- 予め定められた結合パートナーに対するKDで表される結合親和性が、10-6Mから10-12M、さらにより好ましくは、10-8Mから10-12M、又は、10-9Mから10-12Mである前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- “ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリー、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質、及び、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するその断片又は融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質であって、1以上のアミノ酸の修飾に起因して、以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を有し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフが維持されているタンパク質であり、下記方法により得ることができるタンパク質。
a)修飾するタンパク質を選択し;
b)結合パートナーを決定し;
c)βシート領域の少なくとも1つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む前記タンパク質の少なくとも1つの表面露出領域におけるアミノ酸を選択し;
d)前記選択アミノ酸を、好ましくは、置換、挿入、欠失、及び/又は、化学修飾により修飾し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフを維持し;
e)前記修飾タンパク質を、工程b)で決定した結合パートナーと接触させ、
f)工程b)で予め定めた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質を検出する。 - 前記タンパク質が、部位特異的な共有結合により、同じ又は異なる特異性のタンパク質に結合されており、二価又は二重特異的な結合特性を示す前請求項の1以上に記載のタンパク質。
- 前請求項の1以上に記載のタンパク質の製造方法であって、前記タンパク質が、“ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリー、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質、及び、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するその断片又は融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質であって、前記タンパク質の少なくとも1つの表面露出領域であってβシート領域の少なくとも1つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む領域における1以上のアミノ酸の修飾に起因して、以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を有し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフが保持されているタンパク質であって、下記工程を含む製造方法。
a)修飾するタンパク質を選択する工程。
b)結合パートナーを決定する工程。
c)βシート領域の少なくとも1つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む前記タンパク質の表面露出領域におけるアミノ酸を選択する工程。
d)前記選択アミノ酸を、置換、挿入、欠失、及び/又は、化学修飾により修飾し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフを維持する工程。
e)前記修飾タンパク質を、工程b)で決定した結合パートナーと接触させる工程。
f)工程b)で予め定めた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質を検出する工程。 - 工程c)からd)が、前記修飾タンパク質の化学合成により行われる請求項30記載の製造方法。
- 工程d)における修飾が、対応する修飾タンパク質に属するDNAを改変する遺伝子工学により行われ、前記タンパク質の発現が、原核若しくは真核生物宿主又はインビトロで行われる請求項31記載の製造方法。
- 工程d)において、遺伝子ライブラリが確立される請求項30記載の製造方法。
- 工程d)において、ランダム突然変異生成により選択されたアミノ酸のランダム置換が行われる前請求項の1以上に記載の製造方法。
- 工程e)において、予め定められた結合パートナーとの接触が、適切な選択方法、好ましくは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、CISディスプレイ、又は、細胞表面ディスプレイ法、酵母表面ディスプレイ、バクテリア表面ディスプレイ、特に好ましくは、ファージディスプレイ法により行われる前請求項の1以上に記載の製造方法。
- 工程f)において、予め定められた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質の検出が、ELISA、プラズモン表面共鳴分光法、蛍光分光法、FACS、等温滴定熱量計、又は、分析的超遠心分離法の1以上の方法により行われる前請求項の1以上に記載の製造方法。
- 工程f)の後に、検出された予め定められた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質の単離及び/又は質向上の工程が続く前請求項の1以上に記載の製造方法。
- 前記タンパク質が、それ自体公知の方法により、その結合親和性、その結合特異性、及び/又は、安定性、溶解度、若しくは、収率などのその他のタンパク質特性が成熟される前請求項の1以上に記載の製造方法。
- 前記タンパク質が、部位特異的な共有結合により同じ又は異なる特異性のタンパク質に結合され、それにより、二価又は二重特異的タンパク質が得られる前請求項の1以上に記載の製造方法。
- 前請求項の1以上に記載のタンパク質の使用であって、それ自体公知の方法、例えば、クロマトグラフィー又は吸収技術における、対応する結合パートナーの検出、定量、分離、及び/又は対応する結合パートナーの単離のための使用。
- 前請求項の1以上に記載のタンパク質の使用であって、対応する結合パートナーが直接又は間接的に関与する疾病の診断、予防及び治療のための使用。
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