JP2003504081A - 特異的結合特性を有するβシートタンパク質の設計 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、特異的結合特性及び触媒特性を有する新規のβシートタンパク質並びにそれらを製造するための方法を記述している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、新規の若しくは変化させた特異的結合特性を有する、又は新規の若
しくは変化させた触媒活性を有する、又は新規の若しくは変化させた蛍光特性を
有する、新規のβシートタンパク質に関し、更に、そのように変性させたタンパ
ク質を製造するための方法に関する。

【０００２】 抗体及びそれらの誘導体は、ヒトや動物の治療、診断及びモニタリングという
多くの分野で使用されている。天然に存在する抗体を利用することの問題の一つ
は、それらの製造にある。抗体は、依然として動物細胞培養系において産生され
ており、これは非常にコストの掛かる方法である。例えば融合タンパク質の製造
や、迅速な血中クリアランスと良好な組織移行性を要求される治療への使用等、
用途によっては、天然に存在する抗体分子のサイズは、また別の問題を提起する
（Colcher et al., 1998）。scFvs（Bird et al., 1988）、ミニ抗体（Pack and
Plueckthun, 1992）又は二重特異性抗体（Holliger and Winter, 1993）等のよ
うな組換え抗体分子は、主として、抗体の抗原結合性ドメイン（VH及びVL）のみ
から構成されている。それらは、かなり小さなサイズであるため、完全な抗体に
比べて組織移行性が改善されており、また他のタンパク質との融合の目的にも一
層適している。しかしながら完全な抗体に比べ、組換え抗体フラグメントは、不
安定であることが多く、親和性が低く、そして、形成しなければならないジスル
フィド架橋のため、組換え型で製造することが困難である。組換え抗体フラグメ
ントの安定化及び親和性改善のための方法は、取り分け、種々のリンカーペプチ
ドのテスト及びジスルフィド架橋の導入を含む（Glockshuber et al., 1990, Cu
mber et al., 1992, Brinkmann, 1997）。

【０００３】 リンカーペプチドの配列と長さとは、プロテアーゼに対する安定性と抗体フラ
グメントの特異性の双方に影響を及ぼし得る（Pantoliano et al., 1991）。可
変ドメインの保存された枠領構造域中への追加のジスルフィド架橋の導入は、熱
（Young et al., 1995）及び変性剤に対する安定性増大及び異種発現の収率増大
をもたらし得る。しかしながら一般には、多くのscFvsは安定性が低く、37℃で
早くも凝集する傾向がある。この不安定性はまた、新たな不安定化変異をもたら
し得る通常のFv-フラグメントクローニングプライマーによっても引き起こされ
得る。これらの抗体フラグメントは、細菌系において、主として細胞周辺腔内へ
と輸送されることによって産生され、そして酸化還元状態に関する最適化及び折
りたたみヘルパーの同時発現がここでも可能である。

【０００４】 本発明の目的は、新規の又は変化させた結合特性を有する新規タンパク質、例
えば抗体様タンパク質、であってしかも、完全な又は組換え抗体分子の上記欠点
を示さないタンパク質を提供することである。

【０００５】 本発明の更なる目的は、新規の又は変化させた酵素的若しくは触媒的特性を示
すタンパク質を提供することである。

【０００６】 本発明の別の一目的は、上記タンパク質を製造する方法を提供することである
。

【０００７】 上記の諸目的は、請求項１に規定された特徴を有するタンパク質によって達成
される。本発明のタンパク質を製造するための方法は、請求項２１のとおりであ
る。本発明の好ましい具体例は、従属請求項及び以下の詳細な説明のとおりであ
る。

【０００８】 βシートタンパク質の表面の変性は、そのタンパク質にそれまで存在しなかっ
た新規の結合特性を生み出す。これらの結合特性は、βシート領域の突然変異に
よって生み出される。全く新しい結合特性を有するにも拘わらず、新規のβシー
トタンパク質は、構造及び安定性の点では、出発タンパク質に類似している。新
規の結合性分子を設計するための出発タンパク質は、βシート構造を主として有
するタンパク質、例えば、眼の水晶体の構造タンパク質の一つγ−クリスタリン
等である。その結晶性構造に基づいて、出発タンパク質のβシート中の、表面上
に露出していてそのため溶媒や潜在的結合相手に接近可能な領域及びアミノ酸が
、例えばコンピュータ解析によって選択される。遺伝子工学の手法を用いて、出
発タンパク質のをコードする遺伝子中において、これらの領域又はアミノ酸位置
に突然変異を誘発させる。こうして、種々のβシートタンパク質突然変異体をコ
ードする種々の突然変異遺伝子（バンク又はライブラリー）が、ＤＮＡレベルで
製造される。新規の、望ましい結合特性を有する変異体が、例えばファージディ
スプレー系（phage display system）等のような適当な選択系の助けを借りて単
離される。ファージディスプレーでは、産生された全てのタンパク質突然変異体
が、バクテリオファージの表面に露出される（ファージディスプレーライブラリ
ー：phage display library）。これらの組換えファージが、所望の標的分子に
対する結合に関して検討される。その表面上に標的分子に対する特異的結合特性
を有するβシート突然変異体を露出しているファージが、反復スクリーニングに
よって濃縮され、単離される。結合性のβシート変異体をコードしている遺伝子
がこのファージから得られ、例えばE. coli等のような適当な発現系中で発現さ
れる。記載したこの方法を用いると、驚くべきことに、何らの結合特性も有しな
いβシートタンパク質から、特異的結合性を有するタンパク質を製造することが
可能である。そして、適当なスクリーニング方法を用いることによって、所望の
特異性を有する突然変異体がこのライブラリーから単離される。出発タンパク質
の性質に依存して、記載の系を用いて産生されたβシート変異体は、サイズ、安
定性、及び異種、好ましくは細菌の系で機能的に活性な産物が得られるという点
で、例えば抗体及び組換え抗体フラグメントに比して、有利である。この新規β
シート変異体のこれら改善された特性は、例えば抗体、組換え抗体フラグメント
又は触媒性抗体に取って代わることが可能であり、全く新たな利用分野を拓くこ
とができる。

【０００９】 例えば、上述のような抗体の問題点は、本発明により、それぞれ特異的な結合
特性を有し且つ低いｐＨ、変性剤及び高温、すなわち抗体が不安定化するような
条件に対して高い安定性を有するタンパク質を設計することによって、解決する
ことができる。しかしながら、βシート構造を有し且つ抗体様の結合特性を有す
るタンパク質を作り出すことは、本発明に可能な利用分野の一つに過ぎない。例
えば、新規の触媒特性、例えば、耐性及び蛍光特性を有するβシートタンパク質
を作り出すことによって、更なる可能な用途が開かれる。その蛍光特性を変える
ことのできるタンパク質の一例として、GFPが挙げられる。本来高度に安定であ
るこの小型のタンパク質は、設計のために特に適している。本発明により例とし
て行なったそれらの表面の変性は、安定性を保持したまま、該タンパク質に新た
な特異的結合特性を生じさせた。

【００１０】 本発明によって例として選択された、可能性のあるクラスの安定なタンパク質
は、クリスタリンである。水晶体の構造タンパク質であるクリスタリンは、通常
細胞のターンオーバー（turnover）に付されることなく、従って並外れて安定で
あるという特性をも有している（Mandal et al., 1987, Rudolph et al., 1990
）。γ−クリスタリンは、脊椎動物のクリスタリンの一クラスであるが、約22ｋ
Ｄａの分子量を有するモノマータンパク質である。γ−クリスタリンの主たる構
造的モチーフは、逆平行βシートである（Hazes and Hol, 1992, Richardson et
al., 1992, Hemmingsen et al., 1994）。γ−クリスタリンは、２つの非常に
類似した球状のドメインである、Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメインからなって
おり、それらはＶ字形のリンカーペプチドによって互いに連結されている。γ−
クリスタリンに特徴的な折りたたみパターン（"グリークキー（greek-key）"モ
チーフ, Slingsby, 1985, Wistow and Piatigorsky, 1988）が、その相当な温度
安定性及び対変性剤安定性の理由であるようである（Mandal et al., 1987）。
子牛眼からのγ−II−クリスタリンは21ｋＤａのタンパク質であり、そのサイズ
に比して異常に多数（７）のシステインを、生理的条件下に還元状態で有してい
る。

【００１１】 正しく折りたたまれた状態では、γ−II−クリスタリンは、結合性を全く有し
ない。このタンパク質の、選択された溶媒暴露領域（それはβシート構造モチー
フよりなる）に加えた本発明による変更（突然変異誘発）は、驚くべきことに、
このタンパク質の表面構造及び荷電パターンの変化をもたらし、その結果、新規
な結合特性を生じさせた。この関係において、このタンパク質の構造の保持に余
り関与しないアミノ酸位置に反応を起こさせた。小型のβシートタンパク質への
突然変異誘発（Riddle et al., 1997）は、それらのタンパク質の多くが、配列
中のかなりの変更にも拘わらず天然のままのβシート構造を正しくとることがで
きることが示されている。

【００１２】 改善された又は新しい結合特性を有する分子を単離する目的で特定のタンパク
質領域に突然変異を誘発する試みは、組換え抗体フラグメントについて（Nissim
et al., 1994, de Kruif etal., 1995）、確立された結合特性を有するタンパ
ク質（受容体、阻害因子タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質）、及びペプチドラ
イブラリーについて（Cortese et al., 1995, Haaparanta and Huse 1995, McCo
nell et al., 1996）について、既に存在する。抗体の場合、ループ領域として
存在する抗原結合ドメインのみに突然変異が誘発されている。このことは、例え
ば、テンダミスタット（tendamistat）（McConell and Hoess, 1995）やチトク
ロムｂ₅₆₂（Ku and Schultz, 1995）等、他の殆どのタンパク質の場合も同様で
ある。ここでもやはり、ループ領域に突然変異が誘発されている。α−ヘリック
ス中への突然変異誘発の例としては、プロテインＡのＺドメイン（Nord et al.,
1997）及びジンクフィンガードメインCP-1（Choo and Klug, 1995）が挙げられ
る。これまでの突然変異誘発は、単に結合の特異性を変えただけであり、また常
に、既に確立された結合性を有するタンパク質から出発したものであった。結合
性のないタンパク質が用いられたことはなく、またβシート構造モチーフが特異
的に変えられたこともない。ここに記載の方法において始めて、結合性の全くな
いタンパク質の剛直なβシート領域において特異的な突然変異誘発が行なわれた
。これは、予想外にも、抗体分子に比べうる、相当な安定性及び特異的結合特性
を有するタンパク質をもたらした。

【００１３】 全く新たな結合特性を有する突然変異させたβシートタンパク質を単離するた
めに適した系は、ファージディスプレー系である。この系は、特異的な結合特性
について広範にわたるタンパク質変種を非常に効率的にスクリーニングすること
を可能にする（Smith, 1985）。それによれば、各タンパク質変種は、繊維状フ
ァージの表面に提示され、固相に固定化された標的分子と相互作用することがで
きる。標的分子に結合するタンパク質は、ファージを溶出することによって得る
ことができる。ファージＤＮＡを単離した後、その特異的結合特性を有するタン
パク質変種のＤＮＡ配列を決定することができる。ファージディスプレー系に加
えて、例えば細菌表面ディスプレー（bacterial surface display）（Stahl and
Uhlen, 1997）又はリボソームディスプレー（Hanes et al., 1997）等のような
他の選択系を適用することも可能である。

【００１４】 驚くべきことに、上記本発明を用いて、非結合性タンパク質から特異的結合特
性を有するタンパク質が作り出されるよう、非常に安定なβシートタンパク質で
あるγ−II−クリスタリンを、βシートの表面の、標的を定めた、部位特異的突
然変異誘発によって変更することが可能である。８個のアミノ酸位置をランダム
化することにより、比較的剛直なタンパク質領域内の骨格分子に、こうして初め
て、突然変異が誘発される。こうして、βシートタンパク質であるγ−II−クリ
スタリンから、特異的結合特性の点で「抗体様の」タンパク質種が製造される。
γ−II−クリスタリンその他の小型のβシートタンパク質は、新規の結合特性を
設計するための新規の骨格分子として、記載した方法によって一般的に使用する
ことができる。それらの設計されたβシートタンパク質は、例えば、種々の用途
において組換え抗体に取って代わることができる。それらの比較的小さなサイズ
（20ｋＤａ）のために、それらは他の機能的タンパク質のための融合相手として
適している（多機能性タンパク質の製造）。更なる可能性ある用途は、それらを
遺伝子療法ベクターの細胞特異的ターゲティングのためのモジュールとして用い
ることのできる遺伝子治療におけるものであり、また細胞内免疫化におけるもの
である。更には、触媒特性を有するβシート突然変異体は、酵素利用分野におい
て使用することができる。この新規な結合性タンパク質の安定性は、組換え抗体
を用いては現在行なうことのできない更なる用途、例えば、ヒト及び動物におけ
る診断及び治療における用途、並びにバイオセンサー及びバイオセパレーション
方法における用途を可能にする。更なる利用分野は、一般に薬剤及び化粧品産業
並びに有害物質の分析及び除去である。

【００１５】 以下に、本発明の幾つかの好ましい具体例を記述する。

【００１６】 本発明による突然変異導入のために選択されるβシート構造を有するタンパク
質は、全く結合性又は触媒ないし酵素活性又は蛍光特性を有しないものであるか
、又は、それらの活性、蛍光特性又は結合特性が変化する、特に改善されるもの
であることが望ましい。

【００１７】 βシート構造を有するタンパク質は知られている。βシートを有するタンパク
質のクラスの一例は、クリスタリンであり、特にα−、β−及びγ−クリスタリ
ンである。例えば、脊椎動物、げっ歯類、鳥類及び魚類等、あらゆる動物種から
のクリスタリンを使用することが、原理的に可能である。βシート構造であって
本発明により突然変異誘発をすることのできるタンパク質の更なる例は：スフェ
ルリン（spherulins）、熱ショックタンパク質、コールドショックタンパク質（
cold shock proteins）、βヘリックスタンパク質、リポカリン（lipocalins）
、セルチン（certins）又は転写因子、フィブロネクチン、GFP、NGF、テンダミ
スタット（tendamistat）又はリゾチームである。例えば、これらのタンパク質
例えば、βシート構造を有するクリスタリンの、個々のサブユニット又はドメイ
ンが、本発明によって突然変異誘発される。

【００１８】 クリスタリンのうち、特にγ−クリスタリンに言及しなければならない。とい
うのは、本発明によりその実施例の方法によって、例えば抗体分子と同等な新規
の特異的結合特性又は新規の触媒活性を生ずるようにそのβシート構造を変性さ
せる、即ち突然変異誘発できることを実証することとが可能だからである。γ−
クリスタリンの一例は、γ−II−クリスタリンである。

【００１９】 βヘリックスタンパク質の例は、取り分け、Jenkins J. et al., J. Struc. B
iol. 1998, 122(1-2): 236-46, Pickersgill, R. et al., J. Biol. Chem. 1998
, 273(38), 24600-4 及びRaetz C.R. et al., Science 1995, 270(5238), 997-1
000に見出すことができる。

【００２０】 βシート構造は、本質的にシート状であり殆ど完全に平らであることによって
定義される。ポリペプチド鎖の連続的部分によって形成されるαヘリックスとは
対照的に、βシートは、ポリペプチド鎖の種々の領域より構成されうる。このこ
とは、一次構造中では比較的遠く離れている領域同士が、正に隣合って位置する
ことを可能にする。β鎖は典型的には、５〜10アミノ酸の長さであり、殆ど完全
に平らである。これらのβ鎖は、相互に非常に近くにあるため、ある鎖のＣ＝Ｏ
基と別の鎖のＮＨ基との間に、相互に水素結合が形成される。βシートは、複数
の鎖から構成されることができ、シート様の構造を有する。このシート様の平面
の上方又は下方に交互に、Ｃ−α原子が位置する。アミノ酸側鎖がこのパターン
に従い、こうして交互に上方又は下方に配向される。β鎖の方向に応じて、平行
及び逆平行シートの区別が生じる。本発明によれば、何れも突然変異誘発でき、
請求項に記載のタンパク質を製造するために使用することができる。

【００２１】 βシート構造の突然変異誘発のためには、タンパク質中の、表面に近いβシー
ト領域が選択される。入手し得るＸ線結晶構造に基づいて、表面に露出したアミ
ノ酸を同定できる。結晶構造が入手できないならば、コンピュータ解析により、
表面に露出しているβシート領域及び個々のアミノ酸の位置のアクセス可能性を
、入手し得る一次構造に基づいて予測し、（www.embl-heidelberg.de/predictpr
otein/predictprotein.html）、又は３次元タンパク質構造を構築し（www.expas
y.ch/swiss/SWISS-MODEL.html）それにより、表面に露出している可能性のある
アミノ酸についての情報を得るよう試みることができる。

【００２２】 しかしながら、突然変異を誘発すべきアミノ酸位置の時間のかかる事前選択を
省くことのできるβシート突然変異誘発もまた可能である。βシート構造をコー
ドしているＤＮＡ領域をそれらのＤＮＡ環境から単離し、ランダムな突然変異誘
発に付し、その後、それらのＤＮＡを、それらを取り出した元のタンパク質をコ
ードするＤＮＡ中に再度組み込む。これに続いて、所望の結合特性及び／又は触
媒特性及び／又は蛍光特性を有する突然変異体を求めて、選択を行なう。

【００２３】 本発明の別の一具体例においては、表面に近いβシート領域が、既に上記した
ように、選択され、そして突然変異誘発すべきアミノ酸位置がこれら選択された
領域内に同定される。この方法で選択されたアミノ酸位置は、次いで、ＤＮＡレ
ベルで、ターゲティングされ、即ち特定のアミノ酸をコードするコドンが、予め
選択しておいた別の特定のアミノ酸をコードするコドンで置換されるか、又は、
この交換がランダムな突然変異誘発の枠内で、置換すべきアミノ酸位置は定まっ
ているが、新たな、まだ従って定まっていないアミノ酸をコードするコドンは定
まっていない状態で、行なわれる。

【００２４】 表面に露出しているアミノ酸には周囲の溶媒にとってアクセス可能である。も
しタンパク質中のアミノ酸のアクセス可能性がモデルとしてのトリペプチドGly-
X-Gly中のアミノ酸のアクセス可能性に比して８％を超えるなら、それらのアミ
ノ酸は、表面に露出されたアミノ酸と呼ばれる。これらのタンパク質領域又は個
々のアミノ酸位置はまた、本発明によって選択すべき潜在的結合相手に対して、
好ましい結合部位でもある。結合相手は、例えば抗原又は基質又は基質遷移状態
類似体であってよい。

【００２５】 本発明によれば、表面に位置したβシート構造を示し溶媒又は結合相手にとっ
てアクセス可能な実際上全てのタンパク質に、突然変異誘発が可能である。この
目的に向けて、好ましいタンパク質は、主として特に安定な、即ち例えば変性に
抵抗性の、又は十分に「小さい」タンパク質である。

【００２６】 本発明において「突然変異誘発」は、βシート構造を有するポリペプチド鎖に
おいてその表面に露出している１個又は２個以上のアミノ酸変更を意味する。こ
れは、例えば、極性、電荷、溶解性、疎水性又は親水性の点で特別な性質を有す
るアミノ酸が異なった性質を有するアミノ酸により置換されるようなアミノ酸置
換、即ち例えば、非極性の疎水性のアミノ酸が極性のアミノ酸により、負に荷電
したアミノ酸が正に荷電したアミノ酸により置換されること等を含む。「突然変
異誘発」の語はまた、１個又は２個以上のアミノ酸の挿入及び削除をも含む。一
つの前提条件は、表面に露出された少なくとも１つのβシートの表面に露出され
た少なくとも２本β鎖内の露出されたアミノ酸を、該突然変異が含むということ
である。突然変異は、βシート中の又はβシートの選ばれた領域中の個々のアミ
ノ酸位置に、好ましくは、特異的に導入される。突然変異誘発は、βシート構造
の一領域に又は複数の領域に起こってよい。この変更は、βシート中で、隣接し
たアミノ酸を含んでもよく、また比較的離れたアミノ酸を含んでなるものでもよ
い。この変更ははまた、種々のβシートシート、即ち１つより多くのβシート中
のアミノ酸を含んでなるものでもよい。１個又は２個以上のアミノ酸の挿入、削
除又は置換は、表面に露出した少なくとも１つのβシートの表面に露出した少な
くとも２本のβ鎖中に位置する。この点、もし表面に露出した少なくとも２本の
β鎖に突然変異が導入されるのであれば、表面に露出した１本のβ鎖中の１個又
は２個以上のアミノ酸を置換、削除又は挿入することも可能であり、即ち、表面
に露出した１本のβ鎖が複数の突然変異を有することもできる。更なる一具体例
においては、各場合に、表面に露出した少なくとも２つのβシートの表面に露出
した１本のβ鎖に突然変異が誘発される、即ち表面に露出された１つのβシート
が、各場合において、表面に露出した少なくとも１本の突然変異誘発β鎖を有す
る。本発明の別の一具体例においては、表面に露出した突然変異誘発したβシー
トは、相互に逆平行に配列されており、好ましくは、少なくとも２つの逆平行に
配置されたβシートである。

【００２７】 本発明によれば、表面に露出された２又は３本のβ鎖に突然変異誘発するのが
好ましい。本発明によれば、表面に露出された４本又はより多くのβ鎖に突然変
異誘発することも可能である。更には、少なくとも２つのβシート中の少なくと
も２つのβ鎖に突然変異誘発すること、好ましくは２つの逆平行βシート中の３
本のβ鎖の突然変異誘発も可能である。

【００２８】 本発明の一具体例においては、突然変異誘発は、アミノ酸コドンＮＮＫを有す
るＤＮＡオリゴヌクレオチドを寄せ集めることによって行なわれる。もちろん、
他のコドン（トリプレット）を用いることも可能である。

【００２９】 突然変異誘発は、βシート構造が保持されるようにして行なわれる。一般に、
突然変異誘発は、該タンパク質の表面に露出された安定なβシート領域の外側に
おいて行なわれる。それは、部位特異的な及びランダムな突然変異誘発の双方を
含む。一次構造中の比較的狭い領域（約３〜５個のアミノ酸）を含んでなる部位
特異的突然変異誘発は、Stratagene（QuickChange）又はBio-Rad（Muta-Gene フ
ァージミド・インビトロ突然変異誘発キット）から出されている商業的に入手可
能なキットを用いて実施することができる（参照：米国特許5,789,166；米国特
許4,873,192）。

【００３０】 もしもより大きな領域に部位特異的突然変異誘発を起こそうとするならば、Ｄ
ＮＡカセットを調製する必要があり、そして、突然変異させた位置及び変異のな
い位置を含んだオリゴヌクレオチドを寄せ集めることによって、突然変異誘発を
起こそうとする領域が得られる（Nord et al., 1997; McConell and Hoess, 199
5）。ランダムな突然変異誘発は、突然変異誘発系中においてＤＮＡを増殖させ
ることによって又はＰＣＲ増幅によって（エラープローンＰＣＲ（error-prone-
PCR））（例えば、Pannekoek et al., 1993）行なうことができる。この場合、
エラー率を高めたポリメラーゼが使用される。導入される突然変異の程度を高め
る又は異なった突然変異を組み合わせる目的には、ＤＮＡシャフリング（shuffl
ing）によりＰＣＲフラグメントにおける突然変異を組み合わせることが可能で
ある（Stemmer, 1994）。Kuchner及びArnoldによる総説（1997）は、酵素につい
てのこれら突然変異誘発の概論を提供している。選択したＤＮＡ領域内でそのよ
うなランダムな突然変異誘発を行なうためには、突然変異誘発のために用いるＤ
ＮＡカセットを、ここでも構築しなければならない。

【００３１】 突然変異誘発のステップで得られたＤＮＡ分子は、適当な発現系において発現
される。その後に続く、所望の結合特性及び／又は所望の触媒ないし酵素活性を
有する突然変異体の選択及び単離を容易にする発現系が好ましい。そのような発
現ベクター及び発現系は、当業者に知られており、また既に上記に一層詳細に記
述されている。もちろん、特異的な特性又は活性を有する突然変異体について本
発明の選択を許容する、他の発現系を使用することも可能である。

【００３２】 発現及び選択のためには、ＤＮＡレベルで産生された全ての突然変異体がファ
ージミド中にクローンされそしてファージ表面に発現されるものであるファージ
ディスプレー系を用いるのが好ましい。還元型システインを含んだタンパク質の
場合には、本発明の特に好ましい具体例においては、突然変異体の露出及び選択
を改善するために、ＧＳＨを添加することが可能である。

【００３３】 本発明は、突然変異誘発したタンパク質、ＤＮＡ分子、これから求められるＲ
ＮＡ分子、及びそれらの、突然変異誘発したβシート構造を有し所望の結合相手
と新たな若しくは変化した仕方で結合可能なタンパク質をコードする又は基質に
対して新たな若しくは変化した触媒活性を有しうる、又は新たな若しくは変化し
た蛍光特性を有しうるタンパク質をコードする、機能的部分を含む。「機能的部
分」の語は、本発明により突然変異誘発しそして所望の結合特性及び活性を有す
るか又は部分的にそれらを担う、βシート構造を有するタンパク質のサブユニッ
ト、ドメイン及びエピトープに関する。

【００３４】 所望の結合特性及び／又は所望の触媒活性及び／又は蛍光特性を有する突然変
異体は、それ自身既知の仕方で選択され単離される。新規の又は変化させた結合
特性及び新規の又は変化させた触媒活性を有する突然変異体の選択方法及び単離
方法の例としては次のものが挙げられる。

【００３５】 所望の結合特性について選択する場合、変異タンパク質又はその機能的部分を
、それらの結合相手と接触させる。適当な検出方法により、所望の結合特性を有
する変異体を選択する。

【００３６】 触媒活性について選択する場合、変異タンパク質又はその機能的部分を、基質
と接触させ、次いで、適当な検出方法により、その所望の酵素活性について選択
する。 触媒活性は、幾つかの方法で選択することができる。

【００３７】 １．ファージディスプレー： 固相への遷移状態類似体の結合及び該類縁体についての突然変異体ライブラリ
ーの選択。これらの物質は、基質の生成物への酵素的変換（基質−遷移状態−生
成物）に際して典型的に形成される、基質の遷移状態の類似体である。このため
には、しかしながら、基質の遷移状態が判明しなければならない。基質の結合に
ついてスクリーニングを行なうことも可能である。

【００３８】 ２．ファージディスプレー不使用： 突然変異体の細菌発現系へのクローニング、及び個々のコロニーを形成させる
ための該組換え細菌の播種。突然変異タンパク質は、誘導物質（例えばIPTG）を
栄養培地に添加することにより、細菌中で発現させることができる。栄養培地は
、変換をスクリーニングするための基質を更に含有していなければならない。基
質は、変換に際して、同定可能な、例えば着色した産物を形成するするものでな
ければならない。栄養培地中で基質の変換を行なう突然変異体を発現する細菌は
、異なった色のものでなければならない。一例は、β−ガラクトシダーゼ活性及
びX-Gal（青く染色）の変換についてのスクリーニングであろう（Zhang et al.,
1997）。

【００３９】 ３．更なる検出方法が当業者に既知である： 発色変異体とは別に、例えば、新たな抵抗性を仲介する（栄養培地への抗生物
質の添加）、又は、「正常」な細菌の増殖しない最少の栄養培地での増殖を可能
にするタンパク質突然変異体を選択することも可能である。ここにおいて、新規
のタンパク質突然変異体を有する細菌の、選択的増殖という利点を利用すること
が可能である（Crameri et al., 1997）。

【００４０】 ４．突然変異タンパク質の発現と分泌： 例えば細菌において、上清を得て、選択すべき所望の酵素活性について試験を
すること（You and Arnold, 1996）。こうして本発明は、新規の結合特性又は新
規の触媒特性を有するタンパク質を作り出すについての問題を、βシート構造を
有するタンパク質をこの構造モチーフ中において突然変異誘発することにより、
解決する。それらのタンパク質は、所望の若しくは変化させた、好ましくは改善
した結合特性、又は所望の若しくは変化させた、好ましくは改善した酵素ないし
触媒活性について、選択される。本発明の系は、何らの結合特性も何らの酵素特
性も有しないβシートタンパク質を、該βシートにおける突然変異誘発後に結合
特性又は触媒特性を獲得するように、変化させることを可能にする。

【００４１】 本発明によれば、「結合特性」は、例えば、抗体に対する抗原の特異的親和性
を意味する。本発明により突然変異誘発がなされた後は、βシートタンパク質は
こうして抗体様の特性を有し、且つ、抗体の高い結合特異性という利点と、βシ
ートタンパク質の有利な安定性とを併せ持つ。本発明により製造される抗体様の
特性を持つβシートタンパク質は、触媒機能をも有していてよい。

【００４２】 しかしながら、本発明による解決案は、新規の又は変化させた触媒活性を有す
る、βシート構造を有するタンパク質を作り出すことも可能にする。他のタンパ
ク質の性質の変更、例えばGFPの蛍光特性を変化させることも可能であろう。

【００４３】 本発明によれば、結合特性、触媒活性又は蛍光特性の変更は、これらの特性の
低下と改善の双方を含むが、改善の方がより好ましい。

【００４４】 本発明によれば、「新規の特異的特性を有するタンパク質」又は「新規の触媒
活性を有するタンパク質」は、表面に露出した少なくとも１つのβシートの表面
に露出した少なくとも２本のβ鎖中において表面に露出したアミノ酸の特異的突
然変異誘発にのために、元々は何らの特異的結合特性も触媒活性も有ないが今や
特異的結合特性又は触媒活性又は両者の組み合わせを有するものであるタンパク
質を意味する。しかしながら、これはまた、突然変異誘発前に既に特異的結合特
性又は触媒活性を有しておりβシートにおける突然変異誘発後に、別の、追加の
特異的結合特性及び／又は触媒活性を有するものであるタンパク質をも含む。特
異的結合特性を有するタンパク質が触媒活性を獲得すること又はこの逆も、もち
ろん可能である。

【００４５】 更に本発明は、既に特異的結合特性及び／又は酵素活性若しくは触媒活性及び
／又は蛍光特性を有し、表面に露出した１つ又は２つ以上のβシートの表面に露
出した少なくとも２本のβ鎖中において表面に露出したアミノ酸の突然変異誘発
後に、それらの特異的結合特性及び／又は触媒活性及び／又は蛍光特性の改善し
た、又はより一般的には変化した、タンパク質をも含む。

【００４６】 この点、βシート構造に対してでなくタンパク質全体に対して向けられるもの
であり、表面に露出した少なくとも１つのβシートの表面に露出した少なくとも
２本のβ鎖中において表面に露出した標的アミノ酸、又はそのような表面に露出
したアミノ酸に関連したアミノ酸に向けられたものでないランダムな突然変異誘
発によってβシート構造に変更が加えられるものである先行技術のタンパク質及
び方法とは、本発明の方法及びそれにより製造されるタンパク質は、異なってい
る。

【００４７】 以下に例示する本発明の好ましい一具体例においては、突然変異誘発のための
出発点として、βシート構造を有するタンパク質の一例としてのγ−クリスタリ
ンが選ばれた。この目的のため、表面に露出した最初のアミノ酸位置は、構造研
究を通して選択され、それ自身既知の突然変異誘発方法によって突然変異誘発さ
れた。得られた突然変異体は、適当な、同様に既知の発現系中で発現させた。選
択は、γ−クリスタリンのβシートにおける表面に露出したアミノ酸が抗原BSA-
エストラジオール−17−ヘミサクシネートに対する特異的結合特性を示した突然
変異体に対して向けられた。所望の結合特性を有する複数の突然変異体が単離さ
れたが、所望のアミノ酸置換を有していたのは一つだけであった。こうして、出
発タンパク質であるγ−クリスタリンに基づいた抗体様の非イムノグロブリン分
子が得られた。

【００４８】 本発明の方法は、実に夥しい数の突然変異体を得ることを可能にする。たった
８個のアミノ酸位置の突然変異誘発は、所望の結合特性及び触媒活性について分
析することのできる2.6×10¹⁰種の異なったタンパク質種を形成することを可能
にする。

【００４９】 更に、本発明によれば、βシート構造を有するタンパク質の蛍光特性を、表面
に露出したアミノ酸の突然変異誘発によって変化させることができることが示さ
れた。

【００５０】 得られた突然変異遺伝子を適当な系中で増殖させてタンパク質を発現させるこ
とができる。適当な発現系は、原核細胞又は真核細胞系である。突然変異タンパ
ク質をコードするＤＮＡは、例えば適当なベクター、例えば適当な発現ベクター
に組込まれ、形質転換、トランスフェクション又は感染により、宿主細胞に導入
される。異種の突然変異ＤＮＡの発現を特異的に調節する制御配列に連結するこ
とは、もちろん有利である。

【００５１】 使用することのできる宿主細胞は、高等真核細胞例えば哺乳類細胞、又は下等
真核細胞例えば酵母細胞、又は原核細胞例えば細菌細胞である。可能な細菌宿主
細胞の一例はE. coli又はB. subtilisである。本発明のＤＮＡから誘導されるＲ
ＮＡを用いることによりタンパク質を製造するための無細胞翻訳系も、また可能
である。適当なクローニング系及び発現系は、分子生物学、生物工学及び遺伝工
学の種々の教科書に記述されている。例として、Sambrook et al., 1989及びAus
ubel et al., 1994が挙げられる。

【００５２】 上に概略記述した本発明を、模範的具体例及び添付図面に基づいて、以下に一
層詳細に記述する。それらの例は、本発明の可能な一形態として理解すべきもの
であり、本発明は、この特定の具体例に限定されるものではない。

【００５３】 実施例 ホルモンエストラジオールに対する特異的結合性のγ−クリスタリン突然変異体
の製造 ホルモンエストラジオールに特異的に結合する牛γ−Ｂ−クリスタリン（gamm
a-II）の突然変異体を単離することに基づく、抗原結合特性を有する新規のβシ
ートタンパク質の設計が示されている。表面に露出したβシートの選択されたア
ミノ酸位置の特異的特異的変更は、βシート構造と特異的結合特性とを有する新
規の安定なタンパク質を生み出した。突然変異誘発に適したβシート領域又はア
ミノ酸を選択した後、部位特異的突然変異誘発がＤＮＡレベルで行なわれ、ファ
ージミド中にβシート突然変異体ライブラリーが作られ、これは、発現及びこれ
に続く、ファージディスプレー系中での突然変異体の新規の結合特性について選
択することを可能にする。選択された突然変異体は、その新規の特性について、
出発タンパク質であるγ−II−クリスタリンと比較される。

【００５４】 γ−クリスタリンにおける突然変異誘発に適した領域の選択 γ−II−クリスタリンのＸ線構造に基づいて（Wistow et al., 1983）、γ−I
I−クリスタリンのＮ末端ドメイン（Acc. M16894）が突然変異誘発用に選択され
た。連続的な表面セグメントを形成する全部で８個のアミノ酸がそこに同定され
た。選択されたアミノ酸は、βシートの一部であり、構造保持に実質的に貢献し
てはいないはずである。それらは、溶媒にとってアクセス可能な、従ってまた結
合相手にとってもアクセス可能なアミノ酸である。それら８個のアミノ酸Lys 2,
Thr 4, Tyr 6, Cys 15, Glu 17, Ser 19, Arg 36及びAsp 38は、このタンパク
質の総表面積の約6.1％を構成している。

【００５５】 突然変異させたγ−II−クリスタリン遺伝子のＤＮＡプールの作成 これら８個のアミノ酸位置のランダム化が、部位特異的突然変異誘発によって
行なわれた。これは、2.6×10¹⁰の異なったタンパク質種を製造することを可能
にする。突然変異誘発すべき領域は、個々のオリゴヌクレオチドを組み合わせる
ことによってＤＮＡレベルで得られた。これに続いて、ファージディスプレー系
における選択のために構築されたファージミドへ中へのクローニングが行なわれ
た。

【００５６】 オリゴアセンブリング 突然変異誘発のために、８個のランダム化されたアミノ酸位置を有し且つ適当
な制限切断部位をも有する、γ−クリスタリン突然変異体の5’領域を含んだ227
塩基対が、固相上に集められた。全部で10種の個々のオリゴヌクレオチドがこの
目的に使用され、それらのうち３種は、ランダム化されたアミノ酸位置を含んで
いた（Fig.1）。プライマー合成の間、突然変異誘発すべき８個の位置において
ヌクレオチド混合物NN(T/G)が用いられ、理論的に32種の異なったコドンを一つ
の位置にもたらした（cf. Nord et al., 1997）。ビオチン化したオリゴヌクレ
オチドが、このアセンブリングの開始時に、Dynalのストレプトアビジン化磁性
ビーズ（MBs）（M-280）に取り付けられた。取り付け、ライゲーション及びポリ
マー化の幾つかのステップの後、固相上にアセンブルされたγ−クリスタリンの
突然変異誘発領域のプールを、ＰＣＲで増幅することが可能であった（Fig. 2）
。約250塩基対の長さのこのＰＣＲ産物は、5’に１個のSfi I切断部位と3’に１
個のBst EII切断部位とを含んでいた。 アセンブリングのために用いたオリゴヌクレオチドは全て、100 pmol／μｌの
濃度に濃縮された。最初にプライマーGCLIE1B及びGCLIE2Pがアセンブルされた。
このためには、36μｌの洗浄及び結合緩衝液（WB緩衝液：１Ｍ ＮａＣｌ，10ｍ
Ｍトリス塩酸、ｐＨ7.5、１ｍＭ ＥＤＴＡ）が各場合において４μｌのプライマ
ーに添加され、そして混合物が70℃にて５分間インキュベートされた。これら２
つのプライマーのアセンブリーの後、且つ更なる70℃５分間のインキュベーショ
ンの後、プライマー混合物は室温へと徐冷された。４μｌのGCLIE1B/GCLIE2Pプ
ライマーハイブリッドは、56μｌのWB緩衝液と混合され、洗浄及び結合緩衝液で
予め洗浄しておいたストレプトアビジン付加磁性ビーズ（MBs）300μｌに添加さ
れた。室温にて15分間のインキュベーションの後、磁性ビーズをWB緩衝液及びTE
緩衝液（10ｍＭトリス塩酸、ｐＨ7.5、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄した。プライマ
ーリンカーフラグメントを、第１のプライマーハイブリッドに結合した磁性ビー
ズに加えた。該フラグメントは、次のようにして作成した。すなわち：４μｌの
プライマーGCLIB4P又はGCLI5Pを、GIBCO BRLの１×ライゲーション緩衝液（50ｍ
Ｍトリス塩酸、ｐＨ7.6、10ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＤＴＴ、
５％（w/v）ポリエチレングリコール8000）36μｌと混合した。70℃で５分間イ
ンキュベーションの後、両方の混合物を合わせ、70℃で更に５分間インキュベー
トして室温にまで冷却した。12単位のT4 DNAリガーゼ（GIBCO BRL）及び８μｌ
の１×ライゲーション緩衝液を添加した後、反応混合物を室温にて１時間インキ
ュベートした。このGCLIE3P/GCLIB4P/GCLI5Pの架橋フラグメントの12μｌを、54
μｌの１×ライゲーション緩衝液及び６単位のリガーゼと混合し、混合物を、第
１のプライマーハイブリッドを含んだ洗浄済み磁性ビーズに添加し、室温にて１
時間インキュベートした。ライゲーション反応の後、TE緩衝液で磁性ビーズを２
回洗浄し、８μｌのリガーゼを含んだ１×ライゲーション緩衝液64μｌ中に入れ
た。GCLIB4P/BCLI5Pのアセンブルと同様にして予めアセンブルしておいたプライ
マー混合物GCLI6P/GCLIB7Pの８μｌを、次いで磁性ビーズに添加した。再び、ラ
イゲーションを室温で１時間行なった。磁性ビーズをTE緩衝液で２回洗浄した後
、第２の架橋フラグメントであるGCLIB8P/GCLIE9P/CGLIE10の12μｌを添加し、
混合物を１時間ライゲーションした。この第２の架橋フラグメントは、第１の架
橋フラグメントと同様にして作成され、GCLIE9P及びGCLIE10が最初にアセンブル
され次いで、第２のステップにおいてGCLI8Pとライゲートされた。固定化したプ
ライマーを有する磁性ビーズは、次いで、再度TE緩衝液で洗浄した。続くＤＮＡ
ポリメラーゼ及びリガーゼ反応が、第２の鎖中のギャップを埋めた。磁性ビーズ
を37℃にて30分間、次の緩衝剤混合物中でインキュベートした。すなわち、52.5
μｌの水、Boehringerの緩衝液Ｌ（100ｍＭトリス塩酸、ｐＨ7.5、100ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ₂、10ｍＭジチオエリスリトール）の６μｌ、0.5μｌのｄＮＴＰｓ（各ｄＮ
ＴＰ25ｍＭ）及び１μｌ（２単位）のクレノウフラグメント（Boehringer）。磁
性ビーズをTE緩衝液で２回洗浄した後、ライゲーション反応を室温にて１時間行
なった。100μｌの混合物は、10単位のリガーゼを含有した。TE緩衝液による２
回の洗浄ステップの後、40μｌの0.1Ｍ ＮａＯＨで30秒間処理することによって
、磁性ビーズに共有結合によらずに結合しているＤＮＡ鎖を除去し、磁性ビーズ
を60μｌのTE緩衝液に再懸濁させた。ライブラリーの増幅のためのＰＣＲは、こ
の磁性ビーズを鋳型として行なわれる。ＰＣＲ反応混合物（50μｌ）は、次のよ
うにして調製される。すなわち：６μｌの磁性ビーズ、Stratageneの10×ＰＣＲ
反応緩衝液（100ｍＭ ＫＣｌ、100ｍＭ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、200ｍＭトリス塩酸、
ｐＨ8.75、20ｍＭ ＭｇＳＯ₄、１％Triton X-100、１ｍｇ／ｍｌ BSA）の５μｌ
、１μｌ（2.5単位）のPfu DNA ポリメラーゼ（Stratagene）、0.5μｌのｄＮＴ
Ｐｓ（各ｄＮＴＰ25ｍＭ）、0.35μｌのGCLIE1B、0.35μｌのGCLIA11B及び36.8
μｌの水。ＰＣＲは、55℃１分のプライマーアニーリング、72℃1.5分のポリメ
ラーゼ反応、95℃１分の変性の35サイクル、及び72℃５分の最終ポリメラーゼ反
応で行った。

【００５７】 ファージミドpGCKT8-3の作成 ファージミドpCANTAB 5E（Pharmacie BiotechのPRASキット）から開始して、
γ−II−クリスタリン突然変異体バンドをクローニングするためのファージミド
誘導体をこうして構築した。γ−II−クリスタリンの3’領域全体（Ｃ末端ドメ
イン）及び非突然変異誘発5’領域を、プラスミドpGII（Mayr et al., 1994）を
鋳型とし、プライマーGCFORNOT及びGCBACKSfiBstを用いてＰＣＲにより増幅した
(Figs. 3, 4)。

【００５８】 これらのプライマーにより導入された切断部位Sfi I（GCBACKSfiBst）及びNot
I（GCFORNOT）は、ＰＣＲ産物のファージミドpCANTAB 5Eへの挿入を可能にする
。GCBACKSfiBstプライマーと共に、Bst EII切断部位が更にγ−クリスタリン遺
伝子中に組み込まれ、これは突然変異したγ−クリスタリンＤＮＡフラグメント
のクローニングを可能にした。この切断部位の全く新たな導入は、γ−II−クリ
スタリンのアミノ酸配列を変更を生じさせない。配列決定の後、ＰＣＲ産物を、
Sfi I/Not Iフラグメントとして、Sfi I/Not Iで切断したファージミドpCANTAB
5E中にクローニングした。こうして構築されたファージミドpGCKT8-3は、γ−II
−クリスタリンファージディスプレーライブラリーを作成するための出発点であ
った。

【００５９】 γ−クリスタリン突然変異体ライブラリーの作成及び野生型γ−II−クリスタリ
ンのクローニング ファージミドpGCKT8-3を、Bst EII及びSfi I制限酵素で切断し、フォスファタ
ーゼ処理（USBの子エビフォスファターゼ）した。個々の切断の後、ＤＮＡをゲ
ル電気泳動で分画し、切断されたベター画分を切り出し、アガロースゲルから電
気溶出によって単離した。その後の何れの酵素処理の前にも、フェノール／クロ
ロフォルム抽出及びグリコーゲンによるＤＮＡ沈殿を行なった。ＰＣＲにより増
幅され且つγ−II−クリスタリンの突然変異誘発領域を含んだＤＮＡフラグメン
トプールを、Sfi I及びBest EII制限酵素で切断した。調製したpGCKT8-3ファー
ジミドへのＰＣＲ産物のライゲーションには、全部で440ｎｇのファージミド及
び110ｎｇのＰＣＲ産物を用いた。ライゲーションは、20μｌの混合物中、全部
で44単位のT4 DNAリガーゼ（GIBCO BRL）を用いて、16℃にて終夜行なった。70
℃20分でリガーゼを不活性化した後、ライゲーション反応物をドロップ透析（dr
op dialysis）により１時間脱塩した。各場合において、30μｌのエレクトロコ
ンピテントな（electrocompetent）E. coli TG 1細胞を、15μｌの透析済みのラ
イゲーション反応物で形質転換した。このエレクトロコンピテントな細胞は、PR
AS-キットのマニュアルに記載のとおりにして作成し、形質転換した。形質転換
細胞は、グルコース及びアンピシリン（100μｇ）含有SOBAGプレート（Pharmaci
a-BiotechのPRAS-キットマニュアルを参照）上につくり、30℃で終夜インキュベ
ートした。作成したGCUC-1ライブラリーは、250000個のオリジナルクローンを含
んでいた。それらのクローンを、１％グルコース及び20％グリセロールを含んだ
２×YT培地（PRAS-キットマニュアルを参照）で洗浄し、小分けして−80℃で貯
蔵した。ライブラリーの増幅係数は７×10⁶であった。GCUC-1ライブラリーのう
ち組換えクローンの割合は97％。ランダムに選んだクローンの配列決定は、ラン
ダム化したアミノ酸配置において、期待した変種のコドンが用いられていること
が判明した。ウエスタンブロッティング分析によれば、ライブラリーにおける発
現率は30〜60％であった。

【００６０】 対照実験においては、γ−II−クリスタリンＤＮＡは、プライマーGCFORNOT（
5' GAGTCATTCTGCGGCCGCATAAAAATCCATCACCCGTCTTAAAGAACC 3'）及びGCBACKSFI（5
' CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGGGAAGATCACTTTTTACGAGGAC 3'）及び増幅鋳
型としてのプラスミドpGII（Mayr et al., 1994）を用いて増幅した。Not I及び
Sfi I制限エンドヌクレアーゼによる切断の後、配列決定したＰＣＲ産物をSfi I
/Not Iで同様に切断したファージミドpCANTAB 5E中にクローニングした。

【００６１】 ファージディスプレーの設計及び新規の結合性タンパク質の選択 結合特性につきγ−クリスタリン突然変異体を選択するのには、Pharmacia-Bi
otechから商業的に入手可能なファージディスプレー系であるPRASを使用した。
用いたpCANTAB 5E（野生型γ−II−クリスタリン）ファージミド及びpGCKT8-3(
γ−クリスタリン突然変異体)ファージミド中において、γ−クリスタリンは、
Ｎ末端でG3シグナルペプチドに、そしてＣ末端でE-tagに融合しており、これは
該タンパク質の免疫学的検出を可能にする（Fig. 5）。用いた細菌株に依存して
、E-tagの後のamberストップコドンが認識されて（E. coli HB 2151）、γ−ク
リスタリンはシグナルペプチドの切除された後細胞周辺に分泌されるか、又はオ
ーバーリーディング（overreading）（E. coli TG 1）が起こりγ−クリスタリ
ンが繊維状ファージM13のマイナーコート（minor coat）タンパク質との融合タ
ンパク質として合成されて、シグナルペプチドの切除の後E. coli細胞の内側形
質膜に係留される。ヘルパーファージを添加した後、γ−II−クリスタリン変種
を表面に露出した組換えファージが形成できる。

【００６２】 GCUC-1ライブラリーの及びγ−II−クリスタリン野生型ファージの、培養条件の
最適化 PRASマニュアルに記載の培養条件の下では、何れの組換えファージにおいても
、期待した融合タンパク質（γ−II−クリスタリン／タンパク質３）をウエスタ
ンブロティング分析で検出することはできなかった。ファージ形成中の還元型グ
ルタチオン（GSH）の添加のみが、細菌細胞の細胞周辺の酸化還元状態を変化さ
せてファージのアセンブリングのためのより好ましい条件を提供した。γ−II−
クリスタリンクローンを用いるときは、融合タンパク質を有する組換えファージ
の検出は、GSHの添加によってのみ可能であった。GSH濃度を上昇させると、γ−
II−クリスタリンファージの比率も高まった。最適なGSH濃度は、８ｍＭと判定
された。GSH不存在下におけるファージ表面の乏しいγ−クリスタリン発現の理
由の一つは、γ−クリスタリン中の還元型システイン（７）の高い比率である可
能性がある。部分的に折りたたみの解かれたγ−クリスタリンが細胞周辺に入っ
たとき、そこを支配する酸化性の条件の下で、誤った折りたたみ及び、ジスルフ
ィド架橋の形成による凝集が起こり得る。これはまたファージアセンブリングを
も抑制するであろう。ファージディスプレー系において還元型システインを含ん
だタンパク質を用いるとき、一般にGSHを添加することによって組換えファージ
の形成を改善することが可能であろう。

【００６３】 GCUC1ファージディスプレーライブラリーを用いた選択プロセス GCUC-1ライブラリーをスクリーニングするためには、用いる全てのガラス器具
は220℃で４時間滅菌し、プラステック材料はHelipurを用いて１時間滅菌した。
GCUC-1ライブラリーのパンニングは、抗原としてBSA−β−エストラジオール−1
7−ヘミサクシネート（Sigma）を、固相としてマイクロタイタープレート（NUNC
のMaxisorp）を、用いて行いた。３ラウンドのパンニングの間、洗浄ステップの
厳格さを増加させた。最初の培養には、２％グルコース及びアンピシリン（100
μｇ／ｍｌ）を含有する100ｍｌの２×YT培地に、50μｌのGCUC-1ライブラリー
を播種した。細菌を37℃で、300ｒｐｍでＯＤ₆₀₀が0.4となるまで増殖させた。
この細菌培養物の10ｍｌに、800μｌのM13KO7ヘルパーファージ（１×10¹¹ pfu
／ｍｌ、GIBCO BRL）を添加した。次いで、37℃にて30分間インキュベートし更
に30分間緩やかに揺すりながら（50 ｒｐｍ）インキュベートした。室温にて150
0ｒｐｍ（Sorvall SS 34 ローター）で20分間遠心して細菌ペレットを得、８ｍ
ＭのGSH、100μｇ／ｍｌのアンピシリン及び50μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有
する100ｍｌの２×YT培地中に加えた。30℃にて300ｒｐｍの終夜培養により組換
えファージを作成した。組換えファージを含有する上清は、10800ｇで各場合15
分間２回遠心し、次いでろ過（ポアサイズ0.45μｍ）することにより得られた。
上清に1/5のPEG／NaCl溶液を（20％PEG-8000、2.5Ｍ NaCl）を加え、氷上で１時
間インキュベートしそして、４℃にて3300ｇで各場合30分間２回遠心することに
よりファージを濃縮した。得られたファージペレットを、４ｍｌのPBS（ｐＨ7.2
）に再懸濁させ、残存する細胞成分を遠心により除去した（10分、11600ｇ、室
温）。選択プロセス（パンニング）のためには、１ｍｌの濃縮ファージを、１ｍ
ｌの６％濃度のBSA溶液（６％BSA含有PBS、ｐＨ7.2）と混合し、室温にて10分間
インキュベートした。各場合において、このように処理されたファージのうち10
0μｌを、次のようにして準備した抗原被覆マイクロタイタープレートのウェル
に添加した。すなわち、NUNC-Maxisorpマイクロタイタープレートを抗原であるB
SA−β−エストラジオール−17−ヘミサクシネートで被覆した。各場合において
、100μｌに抗原溶液（ｐＨ7.6のPBS中の100μｇ／ｍｌ）を、全部で10個のウェ
ルに加えた。室温で終夜被覆したウェルを、PBS（ｐＨ7.6）で３回洗浄した。ウ
ェルを３％濃度のBSA/PBS溶液（ｐＨ7.2）で室温にて２時間満たしておくことに
より、遊離の結合部位を飽和させた。BSA処理ファージの添加に先立ち、ウェル
をPBS溶液（ｐＨ7.2）で２回洗浄した。パンニングは、マイクロタイタープレー
トを穏やか（20ｒｐｍ）に30分間揺すり、次いで揺すらずに室温にて90分間イン
キュベーションることにより行った。非特異的に結合したファージを、PBS（ｐ
Ｈ7.2／0.1％Tween-20）で10回洗浄し、次いでPBS（ｐＨ7.2）で10回洗浄するこ
とにより除去した。結合したファージを、それぞれウェルあたり100μｌの100ｍ
Ｍトリエチルアミン（直前調製）を添加し室温にて10分間インキュベートするこ
とにより、溶出した。塩基により溶出したファージ（１ｍｌ）を、500μｌの１
Ｍトリス塩酸（ｐＨ7.4）を添加することにより中和した。これらのファージ750
μｌを、最少培地プレート上で培養したＯＤ₆₀₀が0.4−0.5であるTG-1細胞９ｍ
ｌに感染させるのに用いた。このためには、細菌をファージと37℃で30分間イン
キュベートした。特別に強固に結合しトリエチルアミン処理ではマイクロタイタ
ープレートから除去されないファージを浪費しないですますことは、TG-1細胞の
直接感染により可能であった。このためには、それぞれ100μｌの培養TG-1細胞
をウェルに添加した。37℃で30分間のインキュベーションの後、感染したTG-1細
胞を除去し、溶出ファージで感染させた細胞と合わせた。感染した細菌を16×16
ｃｍのSOBAGプレート上につくり、30℃にて終夜インキュベートした。力価測定
には、それぞれ１μlの濃縮し溶出したファージを用いた。得られた細菌クロー
ンを12.5ｍｌの２×YT、20％グリセロールでSOBAGプレートから洗い出した。第
２、第３のパンニングは、次の変更を伴ったほか、最初のパンニングと同様にし
て行った。ファージの培養は、20μｌの洗い出されたライブラリーを20ｍｌの培
地中で用いて反復した。ヘルパーファージによる感染には、２ｍｌの細菌培養物
を用いた（細菌／ファージ重量比率：1/20）。第２のパンニングではマイクロタ
イタープレートを、最初に15回PBS/Tween-20で洗浄し、次いで10回PBSで洗浄し
、第３のパンニングでは、最初に20回PBS/Tween-20で洗浄し、次いで10回PBSで
洗浄した。

【００６４】 濃度及び特異的結合をチェックするためのELISA 抗原に特異的に結合するファージの濃度は、ポリクローナルファージELISAを
用いて検出した。溶出ファージに加えて、出発ライブラリのファージGCUC-1及び
野生型γ-II−クリスタリンのファージを、比較のためにアッセイした。NUNC-Ma
xisorpプレートを100μｌのBSA-エストラジオール−17−ヘミサクシネート又はB
SAで、２μｇ／ｍｌのPBS（ｐＨ7.6）濃度で室温にて終夜被覆した。ウェルをPB
S（ｐＨ7.6）で３回洗浄し、次いで３％乾燥乳粉末（Gluecksklee）／PBS（ｐＨ
7.2）で37℃にて２時間ブロックし、PBS（ｐＨ7.6）で更に３回洗浄した。ファ
ージ培養から単離した非濃縮組換えファージは、最初に室温にて１時間ブロック
した（６％濃度の乾燥乳粉末（Marvel）/PBSとの１：１混合物）。ブロックした
ファージの100μｌをウェルに加えて37℃にて１時間インキュベートした。ウェ
ルを、PBS/Tween-20及びPBSでそれぞれ３回洗浄し、次いで抗M13抗体-POD接合体
（Pharmacia-Biotech, 1:5000希釈、３％Gluecksklee/PBS）と共に37℃で１時間
インキュベートした。プレートを洗浄の後、酵素結合抗体を100μｌのImmuno-Pu
re-TMB基質（Pierce）を用いて検出した。100μｌの２Ｍ硫酸を添加して呈色反
応を停止させ、450ｎｍの吸光度を測定した。３回のパンニングの後の、BSA-エ
ストラジオール接合体に結合するファージの濃度の結果を、Fig. 6に示す。

【００６５】 接合体への特異的結合性を有する個々のファージの単離及び特徴決定 第３回目のパンニングで得られた細菌クローンから80の個々のクローンを選択
した。そられのクローンからファージを単離し、抗原結合性についてモノクロー
ナルファージELISAで個々にアッセイした。個々の細菌クローンは、ポリプロピ
レンマイクロタイタープレート（NUNC）中で、穏やかに揺すりながら（100ｒｐ
ｍ）、２％グルコース及び100μｇ／ｍｌアンピシリンを含んだ100μｌの２×YT
培地中で終夜培養した。これらの細菌培養物の２μｌを、同じ培地で１：100に
希釈し、100ｒｐｍで37℃にてＯＤ₆₀₀が0.4となるまで培養した。選択方法につ
いて記述したのと同様にしてファージを得た。ファージの培養には、TECANの深
ウェルのポリプロピレンマイクロタイタープレートを使用した。ELISAには、遠
心して得られたファージ上清（濃縮せず）200μｌを、40μｌの６×PBS/18％に
より室温にて１時間ブロックした。アッセイした80のクローンのうち30において
、組換えファージはBSA-エストラジオール−17へ有意に結合し、平行してアッセ
イしたBSAには結合しないことが示された。野生型γ−II−クリスタリンを有す
るファージは、対照実験において、BSA-エストラジオール−17への結合性を全く
示さなかった。14の選択された結合性ファージを、IRD800標識プライマーpCANR1
LAB（5' CCATGATTACGCC-AAGCTTTGGAGCC 3'）及びGCLISEQ（5' CTGAAAGTGCCGGTGT
GTTGC 3'）を用いて配列決定した。配列決定は、８つのランダム化されたアミノ
酸位置にのみ突然変異を起こしたγ−クリスタリン変種（Mu 12A）がただ１例の
み存在することを明らかにした。多くのクローンは、リーディングフレームのシ
フトを示し、理論的には機能的なタンパク質をコードして入るが、予想したγ−
クリスタリン領域に限定されない変異を有していた。これらの枠シフト突然変異
体については、それ以上検討しなかった。

【００６６】 βシート突然変異12Aの特徴決定 融合タンパク質であるMu 12A−マイナーコートタンパク質３の組換えファージ
表面における発現、及びE. coli株HB 2151におけるMu 12Aの発現は、それぞれ抗
G3P抗体及び抗E-Tag抗体（Pharmacia-Biotech）を用いて、ウエスタンブロッテ
ィング解析により検出された。ファージミドpGCKT8-3における突然変異体12Aの
、及びγ−II−クリスタリン野生型のＤＮＡ配列決定は、Fig. 7に記載されてい
る。そのＤＮＡ配列は、出発ファージミドpCANTAB 5E中に既に存在していたもの
であるSfi I切断部位に始まり、そして、pGCKT8-3の場合には、γ−II−クリス
タリン遺伝子に新しく導入された、そしてγ−II−クリスタリン野生型遺伝子の
場合には元の配列中に存在していた、Bst EII部位に終わる。Fig. 8は、それら
から求められたアミノ酸配列を示す。アミノ酸位置36におけるコドンのランダム
化は、当該部位のアミノ酸であるアルギニンを変更しない。突然変異体12Aのコ
ンピュータモデリングは、これらのアミノ酸変更は、出発タンパク質と比べたと
き、タンパク質構造に大きな変化を引き起こさないことを示している。しかしな
がら、正味の電荷はより陽性となる。

【００６７】 pET-20b中における突然変異体12Aの発現 突然変異体12Aを詳細に特徴決定するため、ＤＮＡをプラスミドpET-20b（Nova
gen）に再クローニングした。このプラスミドは、E. coli株BL 21中における組
換えＤＮＡの高発現と、外来タンパク質の簡単な精製とを可能にする。これにお
いては、遺伝子はシグナルペプチドなしでそしてＣ末端に６個のヒスチジン残基
が融合した形で発現される。突然変異体12Aとγ−II−クリスタリン野生型のＤ
ＮＡをＰＣＲで、適当なファージミドＤＮＡとプライマー対、即ち突然変異体12
AについてはGC 20bback12A/GC for 20b、野生型についてはGC 20bbackWT/GC for
20bを用いて、増幅した（Fig. 9）。ＰＣＲフラグメントを制限酵素Nde I及びB
am HIで切断し、Nde I/Bam HIで切断したベクターpET 20bにクローニングした。
Fig. 10は、pET-20b中で発現させた後の、突然変異体12A及びγ-II−クリスタリ
ンそれぞれについての、理論的アミノ酸配列を示している。突然変異体12AのＮ
末端の最初の10個のアミノ酸は、Ｎ末端タンパク質配列決定により確認された。

【００６８】 pET-20b中での突然変異体及び野生型の培養及び精製 突然変異体の結合特性と安定性とを詳細に検討するため、突然変異体12Aタン
パク質及び野生型タンパク質を大量に製造した。BL 21細胞を、プラスミドpET-2
0b/Mu 12Aで及びpET-20b/γ-II−クリスタリンで、それぞれ形質転換した。LB培
地／100μｇアンピシリンで、予備培養物を1:100に希釈し、培養物を200ｒｐｍ
で揺すりながら、37℃で、ＯＤ₆₀₀が0.5となるまで、クローンを培養した。γ−
クリスタリンの発現を、IPTG（最終濃度１ｍＭ）の添加によって誘導した。終夜
30℃及び200ｒｐｍで培養を続けた。４℃、6000ｒｐｍ（Sorvall GS3ローター）
10分間の遠心により細菌細胞を収穫した。細胞ペレットを、150μlの200ｍＭ PM
SF及び10μｌのDNAse（Boehringer）を添加した30ｍｌの２×PBSに懸濁させた。
細胞をGaulinプレスを用いて800-1000 PSIGで２回破壊した。細胞懸濁液を４℃
で20000ｒｐｍ（Sorvall SS 34ローター）で１時間遠心し、可溶性タンパク質を
含有する上清を得た。６個のヒスチジン残基に融合したγ−クリスタリンを、４
℃にてアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。８ｍｌのNi-NTAを50ｍ
ｌの２×PBS／10ｍＭイミダゾールで平衡化した。次いで、可溶性タンパク質を
含有する上清を、平衡化したカラム材料と共に、バッチプロセスでローラーシェ
イカー上でゆっくりと終夜撹拌した。クロマトグラフィーカラムへの懸濁物の導
入の後、２×PBS／10ｍＭイミダゾール／300ｍＭ NaClで洗浄した。結合してい
るタンパク質を、２×PBS／250ｍＭイミダゾールで溶出した。溶出タンパク質に
DDT（最終濃度10ｍＭ）を添加した。次いで、４℃にて各８時間の透析ステップ
を２回、最初は100ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.0／１ｍＭ EDTA／１ｍ
Ｍ DTT）で、そして２回目は10ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.0／１ｍＭ
EDTA）で行った。最終の遠心（Sorvall SS 34ローター中、４℃、30℃、20000ｒ
ｐｍ）で得られた上清は、精製タンパク質（Mu 12A又はγ−II−クリスタリン）
を含有しており、それらを結合性研究及び安定性研究に用いた。

【００６９】 突然変異体12AのBSA−エストラジオール−17−ヘミサクシネート接合体への特
異的結合を、精製突然変異体12A-His-タグタンパク質の濃度を上昇させつつ、EL
ISAにより行なった。γ−II−クリスタリン野生型（同様にHig-タグ）の量の増
大を、対照として用い、両精製タンパク質のBSAへの結合をアッセイした。この
濃度依存性のELISAは、NUNC-Tmプレートを用いて行った。抗原であるBSA−エス
トラジオール−17−ヘミサクシネート接合体又はBSAによる被覆を、室温にて終
夜行なった。被覆には、それぞれ、20μｇ／ｍｌPBS（ｐＨ7.6）の濃度の抗原10
0μｌを用いた。プレートを洗浄（２×PBS、ｐＨ7.6）しそしてブロック（３％M
arvel／PBS、37℃にて２時間）した後、精製したMu 12又はγ−II−クリスタリ
ンのタンパク質原液（濃度0.63ｍｇ／ｍｌ）１〜13μｌを、全100μｌとなるよ
うにした反応液（PBS、３％Marvel、ｘμｌのタンパク質）に加え、ウェル中で3
7℃にて２時間インキュベートした。使用した二次抗体は、1:3000に希釈したQia
genのテトラHis抗体及び1:2000に希釈した抗マウスPOD抗体（Sigma）である。こ
れらの抗体は、３％濃度のMarvel/PBS溶液で希釈し、それぞれ100μｌをウェル
に加え、そして37℃にて１時間インキュベートした。基質の反応は、ポリクロー
ナルファージELISAについて記載したのと同様にして行なった。Fig.11中のこのE
LISAの結果は、突然変異体12Aの濃度の増加と共にのみ吸光度の増加が測定され
ることを、明瞭に示している。γ−II−クリスタリンを用いては何らの増加も検
出されなかった。同様に、BSAとの反応は全く観察されなかった。これらのこと
は、出発タンパク質との対比で、突然変異体12Aの特異的結合を示している。

【００７０】 突然変異体12A及びγ−II−クリスタリンの安定性は、グアニジン変性によっ
て検討した。この目的のためには、精製タンパク質を最終濃度20μｇ／ｍｌの濃
度で、グアニジニウムの濃度を増大させながら、20℃にて１日及び３日間インキ
ュベートした。全部で15通りのグアニジニウム濃度は、１ｍＭ DTT／0.1Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.0）中、範囲０〜5.5Ｍに調整した。１日及び３日の
後、それぞれ、各混合物の300〜400ｎｍの蛍光発光スペクトルを記録した。励起
波長は280ｎｍとした。Fig. 12は、グアニジニウム濃度の関数として測定した発
光ピーク波長を示している。γ−II−クリスタリンの安定性は、１日後及び３日
後の何れも、突然変異体12Aより高い。しかしながら、突然変異12Aの安定性は、
抗体分子に比べると遥かに高い。

【００７１】 突然変異体12Aの蛍光特性の変化 野生型タンパク質に対して突然変異体12Aの蛍光特性が変化したかを調べるた
めに、蛍光スペクトルを記録した。この目的のために、100μｇ／ｍｌの野生型
タンパク質又は突然変異体12A（50ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ6.0中）を、光路
長１ｃｍのキュベット中で、280ｎｍで励起し、蛍光を300〜400ｎｍの範囲で測
定した。励起及び発光ともに、スリット幅は５ｎｍであった。

【００７２】 野生型についてもまた突然変異体12Aについても共に、検出された蛍光シグナ
ルは329ｎｍにピークを有していた。しかしながら、突然変異12Aの蛍光強度は、
シグナル強度が86％しかなく、γ−クリスタリン野生型（100％）に比べて明ら
かに低かった（Fig. 13Aを参照）。 突然変異12A及び野生型は、蛍光団（fluorophores）の総数については同一で
あった。しかしながら、突然変異体に生じている配列の変化（第８位におけるY
→K、及び第15位におけるC→Y ）は、蛍光シグナルに、ある変化を生じさせてい
る。蛍光強度における差は、第８位及び第15位にそれぞれ位置するチロシン残基
が異なった蛍光特性を有するという事実に起因する可能性がある。

【００７３】 参考文献： Bird, R. E., Hardman, K.D., Jacobson, J. W., Johnson, S., Kaufman, B. M.
, Lee, S.-M., Lee, T., Pope, H. S., Riordan, G. S. and Whitlow, M. (1988
): Single-chain antigen-binding proteins. Science 242, 423-426.

【００７４】 Brinkmann, U., di Carlo A., Vasmatzis, G., Kurochkina, N., Beers, R., By
ungkook, L. and Pastan, I., (1997): Stabilization of a recombinant Fv fr
agment by base-loop interconnection and VH-VL permutation. J. Mol. Biol.
268, 107-117.

【００７５】 Choo, Y. and Klug, A. (1995): Designing DNA-binding proteins on the surf
ace of filamentous phage. Curr. Opin. Biotechnol. 6, 431-436.

【００７６】 Cortese R., Monaci, P., Luzzago, A., Santini, C., Bartoli, F., Cortese,
I., Fortugno, P., Galfre, G., Nicosia, A., and Felici, F. (1995): Select
ion of biologically active peptides by phage display of random peptide l
ibraries. Curr. Opin. Biotechnol., 6, 73-80.

【００７７】 Cumber, J. A., Ward, E. S., Winter, G., Parnell, G. D. and Wawrzynczak,
E. J. (1992): Comparative stabilities in vitro and in vivo of a recombin
ant mouse antibody FvCys fragment and a bisFvCys conjugate. J. of Immuno
logy 149, 120-126.

【００７８】 Glockshuber, R., Malia, M., Pfitzinger I. and Plueckthun, A. (1990): A c
omparison of strategies to stabilize immunoglobulin Fv-fragments. Bioche
mistry 29, 1362-1367.

【００７９】 Haaparanta T. and Huse W. D. (1995): A combinatorial method for construc
ting libraries of long peptides displayed by filamentous phage. Mol. Div
ersity 1, 39-52.

【００８０】 Hanes, J. et al. (1997): In vitro selection and evolution of functional
proteins by using ribosome display. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 4937
-42.

【００８１】 Hazes, B. and Hol, W. G. J. (1992): Comparison of the hemocyaninβ-barre
l with other greek key β-barrels: possible importance of the "β-zipper
" in protein structure and folding. Proteins: Struct., Funct. Gen. 12, 2
78-298.

【００８２】 Hemmingsen, J. M., Gernert, K. M., Richardson, J. S. and Richardson, D.
C. (1994): The tyrosine corner: a feature of most greek key β-barrel pr
oteins. Prot. Science 3, 1927-1937.

【００８３】 Holliger, H. and Winter G. (1993): Engineering bispecific antibodies. Cu
rr. Opin. Biotech. 4, 446-449.

【００８４】 de Kruif, J. Boel, E. and Logtenberg, T. (1995): Selection and applicati
on of human single chain Fv antibody fragments from a semi-synthetic pha
ge antibody display library with designed CDR3 regions. J. Mol. Biol. 24
8, 97-105.

【００８５】 Ku, J. and Schultz, P. G. (1995): Alternate protein frameworks for molec
ular recognition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6552-6556.

【００８６】 Mayr, E.-M., Jaenicke, R. and Glockshuber, R. (1994): Domain interaction
s and connecting peptides in lens crystallins. J. Mol. Biol. 235, 84-88.

【００８７】 Mandal, K., Chakrabart, B., Thomson, J. and Siezen, R. J. (1987): Struct
ure and stability of β-crystallins. Denaturation and proteolysis behavi
our. J. Biol. Chem. 262, 8096-8102.

【００８８】 McConell S. and Hoess R. H. (1995): Tendamistat as a scaffold for confor
mationally constrained phage peptide libraries. J. Mol. Biol. 250, 460-4
70.

【００８９】 McConell, S. J., Uveges, A. J., Fowlkes, D. M. and Spinella, D. G. (1996
): Construction and screening of M13 phage libraries displaying long ran
dom peptides. Mol Diversity 1, 165-176.

【００９０】 Nissim, A., Hoogenboom, H. R., Tomlinson, I. M., Flynn, G., Midgley, C.,
Lane, D., and Winter, G. (1994): Antibody fragments from a 'single pot'
phage display library as immunochemical reagents. EMBO J. 13, 692-698.

【００９１】 Nord K., Gunneriusson, E., Ringdahl, J., Stahl, S., Uhlen, M. and Nygren
, P. A. (1997): Binding proteins selected from combinatorial libraries o
f an β-helical bacterial receptor domain. Nat. Biotechnol. 8, 772-777.

【００９２】 Pack, P. and Plueckthun, A. (1992): Miniantibodies: use of amphipathic h
elices to produce functional, flexibly linked dimeric Fv fragments with
high avidity in Escherichia coli. Biochemistry 31, 1579-1584.

【００９３】 Pantoliano, M. W., Bird, R. E., Johnson, S., Asel, E. D., Dodd, S. W., W
ood, J. F. and Hardman, K. D. (1991): Conformational stability, folding
and ligand-binding affinity of single-chain Fv immunoglobulin fragments
expressed in Escherichia coli. Biochemistry 30, 10117-10125.

【００９４】 Richardson, J. S., Richardson, D. C., Tweedy, N. B., Gernert, K. M., Qui
nn, T. P., Hecht, M. H., Erickson, B. W., Yan, Y., McClain, R. D., Donla
n, M. E. and Surles, M. C. (1992): Looking at proteins: representations,
folding, packing and design. Biophys. J. 63, 1186-1209.

【００９５】 Riddle, D. S., Santiago, J. V., Bray-Hall, S. T., Doshi, N., Grantcharov
a, Q. Y and Baker, D. (1997): Functional rapidly folding proteins from s
implified amino acid sequences. Nature structural biology 4, 805-809.

【００９６】 Rudolph, R., Siebendritt, R., Nesslauer, G., Sharma, A. and Jaenicke, R.
(1990): Folding of an all-β protein: independent domain folding in Gam
maBII-crystallin from calf eye lens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4625
-4629.

【００９７】 Slingsby, C. (1985): Structural variation in lens crystallins. TIBS 10,
281-284.

【００９８】 Smith, G. P (1985): Filamentous Fusion Phage: Novel expression vectors t
hat display cloned antigens on the virion surface. Science 228, 1315-131
7.

【００９９】 Stahl, S. and Uhlen, M. (1997): Bacterial surface display: trends and pr
ogress. TIBTECH 15, 185-192.

【０１００】 Wistow, G. J. and Piatigorsky, J. (1988): Lens crystallins: the evolutio
n and expression of proteins for a highly specialized tissue. Ann. Rev.
Biochem. 57, 479-504.

【０１０１】 Wistow, G. J., Turnell, B., Summers, L., Slingsby, C. Moss, D., Miller,
L., Lindley, P. and Blundell, T. (1983): X-ray analysis of the eye lens
protein y-II-crystallin at 1.9 A°resolution. J. Mol. Biol. 170, 175-202
.

【０１０２】 Young, N. M., MacKenzie, C. R., Narang, S. A., Oomen, R. P. and Baenzige
r, J. E. (1995): Thermal stabilization of a single-chain Fv antibody fra
gment by introduction of a disulphide bond. FEBS Lett. 377, 135-139.

【０１０３】 Ausbel, F.M., Brent, R., Kinston, R.E., Moore, D.D., Seidmann, J.G., Smi
th, J.A., and Struhl, K. (1994): Current protocols in molecular biology.
John Wiley & Sons, Inc.

【０１０４】 Crameri, A., Dawes, G., Rodriguez, E., Jr., Silver, S. and Stemmer, W.P.
(1997): Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DN
A shuffling. Nat. Biotechnol. t, 436-438.

【０１０５】 Kuchner, O. and Arnold, F.H. (1997): Directed evolution of enzyme cataly
sts. TIBTECH 15, 523-530.

【０１０６】 Pannekoek, H., van Meijer M., Schleef, R.R., Loskutoff, d.j. and Barbas,
C.F. (1993): Functional display of human plasminogen-activator inhibito
r 1 (PAI-1) on phages: Novel perspectives for structure-function analysi
s by error-prone DNA synthesis. Gene 128, 135-140.

【０１０７】 Sambrook, J., Maniatis, T. and Fritsch, E.F. (1989): Molecular Cloning:
A laboratory manual. Cold spring Harbor. Cold Spring Harbour Laboratory
Press, New York.

【０１０８】 Stemmer, W.P.C. (1944): Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shu
ffling. Nature 370, 389-391.

【０１０９】 You, L. and Arnold, F.H. (1996): Directed evolution of subtilisin E in B
acillus subtilis to enhance total activity in aqueous dimethylformamide.
Protein Eng. 1, 77-83.

【０１１０】 Zhang, J.H., Dawas, G. and Stemmer, W-P. (1997): Directed evolution of a
fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening. Proc. N
atl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4504-4509.

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Fig. 1 γ−クリスタリン突然変異体をアセンブルするためのオリゴ
ヌクレオチド。

【図２】 Fig. 3 オリゴヌクレオチドによるアセンブリングとそれに続くスト
レプトアビジン付加磁性ビーズ（MB）上でのＰＣＲの概念図。Ｘで印をつけた位
置は、ランダム化したアミノ酸位置を示す。

【図３】 Fig. 2 γ−II−クリスタリンの非突然変異誘発領域の増幅の概念図
。

【図４】 Fig. 4 γ−II−クリスタリンの非突然変異誘発領域を増幅するため
のオリゴヌクレオチド。

【図５】 Fig. 5 pCANTAB 5E-γ−II−クリスタリン発現カセットの概念図。g
3-SS：ファージタンパク質のG3のグナルペプチド配列； E-tag：免疫検出のた
めの11個のアミノ酸； fd Gen 3：繊維状ファージM13のマイナーコート（minor
coat）タンパク質３。

【図６】 Fig. 6 第３回のパンニング法の後に濃縮されたファージを用いたポ
リクローナルファージELISA。マイクロタイタープレートは、BSA-β-エストラジ
オール−17−ヘミサクシネート接合体又は対照として単にBSAでコーティングし
た。並べて示されているのは、γ−II−クリスタリン野生型ファージ（GC-WT）
の、出発ライブラリーからのファージ（GCUC-1）の、及びパンニング法の反復に
よって濃縮したファージ（E-17ファージ）の、特定の抗原への結合を示す。

【図７】 Fig. 7 ファージミドpGCKT 8-3中のBSA-エストラジオール-17-ヘミ
サクシネート結合γ−II−クリスタリン突然変異体12A（Mu 12A）の、及び、pCA
NTAB 5E中のγ−II−クリスタリン野生型（WT）の、それぞれ部分ＤＮＡ配列。
導入された切断部位Sfi I（5'）及びBst EII（3'）は、イタリック体及び下線で
示されている。ランダム化したアミノ酸の位置は太字で示されている。

【図８】 Fig. 8 ファージミド中での発現とシグナルペプチドの除去後の、BS
A-エストラジオール-17-ヘミサクシネート結合γ−II−クリスタリン突然変異体
12A（Mu 12A）及びγ−II−クリスタリン野生型（WT）の、求められたアミノ酸
配列。ランダム化したアミノ酸の位置は太字で、そして実際に置換されたアミノ
酸は太字及び下線で示されている。Sfi I 切断部位を介してＮ末端に、及びＣ末
端E-tag融合により付加的に導入されたアミノ酸は、イタリック体及び下線で示
されている。

【図９】 Fig. 9 Mu 12A及びγ−II−クリスタリンのベクターpET-20b中への
クローニングに用いたプライマーの配列。

【図１０】 Fig. 10 pET-20b中での発現後のBSA-エストラジオール-17-結合
突然変異体12A及びγ−II−クリスタリンの、求められたタンパク質配列。ラン
ダム化したアミノ酸位置は太字で、そして実際に置換されたアミノ酸は太字及び
下線で示されている。６個のヒスチジンを含むクローニングで付加されたＣ末端
アミノ酸は太字及び下線で示されている。

【図１１】 Fig. 11 BSA-エストラジオール-17-ヘミサクシネート接合体への
、突然変異体12Aの濃度依存性の結合。突然変異体（12A）及びγ−II−クリスタ
リン（WT）の、接合体（BSA-エストラジオール−17）及び対照としてのBSAへの
結合が解析された。

【図１２】 Fig. 12 変性剤グアニジンに対する突然変異体12Aの安定性。数値
は、精製した突然変異体12A及びγ−II−クリスタリンタンパク質を種々の濃度
のグアニジンと種々の時間にわたってインキュベートした後の発光のピーク波長
を示す。

【図１３】 Fig. 13 50ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ6.5）中における、野生型
のγ−クリスタリン及び突然変異体12Aの蛍光発光スペクトル。蛍光シグナル（F
ig. 13A）は、励起波長280ｎｍで測定された。タンパク質濃度は100μｇ／ｍｌ
であった。

【図１４】 Fig. 13Bは、蛍光測定に用いたタンパク質サンプルの吸収スペクト
ルを示す。吸収は、光路長１ｃｍのキュベット中において測定した。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年９月１４日（２００１．９．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項１７】 先行の請求項の何れかタンパク質をコードするＤＮＡ。

【請求項１８】 請求項１７のＤＮＡから導かれるＲＮＡ。

【請求項１９】 請求項１７若しくは１８のＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はそれらの部分であってタ
ンパク質の機能的領域をコードする部分を含んだ、原核又は真核のベクター又は
細胞。

【請求項２０】 先行の請求項の何れかのタンパク質を製造するための方法であって、 ａ．表面に露出したβシートの表面に露出した少なくとも２本のβ鎖をコード
する領域において、βシート構造を有するタンパク質をコードするＤＮＡに突然
変異誘発を行なうステップと、 ｂ．ステップ（ａ）で得られた突然変異体を適当な発現系で発現させるステッ
プと、そして ｃ．所望の結合特性及び／又は所望の触媒活性を有する突然変異体を選択して
単離するステップと、所望により ｄ．該βシート突然変異体タンパク質を発現させ単離するステップと を含むことを特徴とする方法。

【請求項２１】 請求項２０の方法であって、突然変異誘発が、βシート中の特定のアミノ酸位
置の（部位特異的突然変異誘発）又はβシート中の不特定のアミノ酸位置の（ラ
ンダム突然変異誘発）置換、削除又は挿入を含むものである方法。

【請求項２２】 先行の請求項の何れかの方法であって、ステップｂ）の突然変異体が、原核細
胞又は真核細胞中に、無細胞系においてリボソームとの複合体として、又は、植
物若しくは動物細胞、酵母細胞若しくはファージ、ウイルス若しくは細菌の表面
に、発現されることを特徴とする方法。

【請求項２３】 先行の請求項の何れかの方法であって、所望の結合特性を有する突然変異体が
、該突然変異体をそれらの結合相手と接触させ、そして所望の結合特性を有する
突然変異体を単離することによって選択されるものであることを特徴とする方法
。

【請求項２４】 先行の請求項の何れかの方法であって、所望の触媒特性を有する突然変異体が
、該突然変異体をそれらの基質と接触させ、そして所望の触媒活性を有する突然
変異体を単離することによって選択されるものであることを特徴とする方法。

【請求項２５】 診断及び治療、化粧品、バイオセパレーション及びバイオセンサー及び有害物
質の削減における、先行の請求項の何れかのタンパク質の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ (72)発明者 ルドルフ，ライナー ドイツ連邦共和国Ｄ−06120ハレ、ドクト ル・ハンス・リッテン・シュトラーセ28 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA04 DA06 EA03 EA04 GA11 HA12 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 4B065 AA26X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA24 4H045 AA10 AA20 CA40 CA52 FA74

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 βシート構造を有するタンパク質であって、該タンパク質が新規の若しくは変
   化した特異的結合特性又は新規の若しくは変化した触媒活性又は新規の若しくは
   変化した蛍光特性を有するように、表面に露出した少なくとも１つのβシートの
   表面に露出した少なくとも２本のβ鎖中の表面に露出したアミノ酸が特異的に突
   然変異誘発されたものであることを特徴とするタンパク質。
2. 【請求項２】 請求項１のタンパク質であって、クリスタリン、スフェルリン、熱ショックタ
   ンパク質、コールドショックタンパク質、βヘリックスタンパク質、リポカリン
   、セルチン、フィブロネクチン又は転写因子よりなる群に含まれるか、又はGFP
   、NGF、テンダミスタット又はリゾチームであることを特徴とするタンパク質。
3. 【請求項３】 請求項１又は２のタンパク質であって、表面に露出した３本のβ鎖が突然変異
   誘発されたものであることを特徴とするタンパク質。
4. 【請求項４】 請求項１又は２のタンパク質であって、表面に露出した４本又はより多くのβ
   鎖が突然変異誘発されたものであることを特徴とするタンパク質。
5. 【請求項５】 先行の請求項の何れかのタンパク質であって、少なくも２つのβシート中の少
   なくとも２本のβ鎖が突然変異誘発されたものであることを特徴とするタンパク
   質。
6. 【請求項６】 先行の請求項の何れかのタンパク質であって、２つの逆平行βシート中の３本
   のβ鎖が突然変異誘発されたものであることを特徴とするタンパク質。
7. 【請求項７】 先行の請求項の何れかのタンパク質であって、脊椎動物、げっ歯類、鳥類又は
   魚類のクリスタリンであることを特徴とするタンパク質。
8. 【請求項８】 先行の請求項の何れかのタンパク質であって、α−、β−又はγ−クリスタリ
   ンであることを特徴とするタンパク質。
9. 【請求項９】 先行の請求項の何れかのタンパク質であって、γ−II−クリスタリンであるこ
   とを特徴とするタンパク質。
10. 【請求項１０】 先行の請求項の何れかのタンパク質であって、溶媒又は結合相手にとってアク
    セス可能なβシート領域の領域において、該タンパク質が突然変異誘発されたも
    のであることを特徴とするタンパク質。
11. 【請求項１１】 先行の請求項の何れかのタンパク質であって、タンパク質のドメイン又はサブ
    ユニットのβシート構造において突然変異誘発されたものであることを特徴とす
    るタンパク質。
12. 【請求項１２】 先行の請求項の何れかのタンパク質であって、γ−II−クリスタリンのアミノ
    酸Lys 2、Thy4、Tyr6、Cys15、Glu17、Ser19、Arg36及びAsp38のうち１つ又はよ
    り多くの突然変異誘発によって得られたγ−II−クリスタリンであることを特徴
    とするタンパク質。
13. 【請求項１３】 先行の請求項の何れかのタンパク質であって、抗体様結合特性又は酵素（触媒
    ）活性を有するように、該タンパク質が突然変異誘発されたものであることを特
    徴とするタンパク質。
14. 【請求項１４】 請求項１２又は１３のタンパク質であって、エストラジオール又はその接合体
    であるBSA−β−エストラジオール−17−ヘミサクシネートに対する結合特異性
    を有するものであることを特徴とするタンパク質。
15. 【請求項１５】 先行の請求項の何れかのタンパク質であって、エストラジオール又はその接合
    体であるBSA−β−エストラジオール−17−ヘミサクシネートに対する結合特異
    性を有し且つ次のアミノ酸配列を有するものであるタンパク質： Figs. 8及び10を参照。
16. 【請求項１６】 先行の請求項の何れかのタンパク質であって、他のタンパク質又は非タンパク
    質と組み合わさったものであることを特徴とするタンパク質。
17. 【請求項１７】 先行の請求項の何れかのタンパク質であって、改善された結合特性及び／又は
    改善された触媒活性及び／又は改善された蛍光特性を有することを特徴とするタ
    ンパク質。
18. 【請求項１８】 先行の請求項の何れかタンパク質をコードするＤＮＡ。
19. 【請求項１９】 請求項１８のＤＮＡから導かれるＲＮＡ。
20. 【請求項２０】 請求項１８若しくは１９のＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はそれらの部分であってタ
    ンパク質の機能的領域をコードする部分を含んだ、原核又は真核のベクター又は
    細胞。
21. 【請求項２１】 先行の請求項の何れかのタンパク質を製造するための方法であって、 ａ．表面に露出したβシートの表面に露出した少なくとも２本のβ鎖をコード
    する領域において、βシート構造を有するタンパク質をコードするＤＮＡに突然
    変異誘発を行なうステップと、 ｂ．ステップ（ａ）で得られた突然変異体を適当な発現系で発現させるステッ
    プと、そして ｃ．所望の結合特性及び／又は所望の触媒活性を有する突然変異体を選択して
    単離するステップと、所望により ｄ．該βシート突然変異体タンパク質を発現させ単離するステップと を含むことを特徴とする方法。
22. 【請求項２２】 請求項２１の方法であって、突然変異誘発が、βシート中の特定のアミノ酸位
    置の（部位特異的突然変異誘発）又はβシート中の不特定のアミノ酸位置の（ラ
    ンダム突然変異誘発）突然変異誘発を含むものである方法。
23. 【請求項２３】 先行の請求項の何れかの方法であって、ステップｂ）の突然変異体が、原核細
    胞又は真核細胞中に、無細胞系においてリボソームとの複合体として、又は、植
    物若しくは動物細胞、酵母細胞若しくはファージ、ウイルス若しくは細菌の表面
    に、発現されることを特徴とする方法。
24. 【請求項２４】 先行の請求項の何れかの方法であって、所望の結合特性を有する突然変異体が
    、該突然変異体をそれらの結合相手と接触させ、そして所望の結合特性を有する
    突然変異体を単離することによって選択されるものであることを特徴とする方法
    。
25. 【請求項２５】 先行の請求項の何れかの方法であって、所望の触媒特性を有する突然変異体が
    、該突然変異体をそれらの基質と接触させ、そして所望の触媒活性を有する突然
    変異体を単離することによって選択されるものであることを特徴とする方法。
26. 【請求項２６】 診断及び治療、化粧品、バイオセパレーション及びバイオセンサー及び有害物
    質の削減における、先行の請求項の何れかのタンパク質の使用。