JP5685442B2 - ヘパリン結合上皮成長因子様成長因子抗原結合タンパク質 - Google Patents
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Description
X1QX2X3X4X5PX6X7(配列番号1046)、
(X1は、I又はMであり、
X2は、A、G又はSであり、
X3は、I又はTであり、
X4は、H又はQであり、
X5は、F、L又はWであり、
X6は、C、I、H、L又はTであり、
X7は、S又はTである。)
QQX1X2X3X4X5IT(配列番号1047)、
(X1は、I又はSであり、
X2は、F又はYであり、
X3は、F、I、S又はYであり、
X4は、A、S又はTであり、
X5は、P又はSである。)
X1X2X3X4X5X6X7X8T(配列番号1048)、
(X1は、L又はQであり、
X2は、K、N又はQであり、
X3は、A、H、S又はYであり、
X4は、H、N又はYであり、
X5は、N、S又はTであり、
X6は、A、F、I、T、V又はYであり、
X7は、P又はアミノ酸なしであり、
X8は、F、L又はPである。)
QX1X2DX3LPX4X5(配列番号1049)、
(X1は、H又はQであり、
X2は、C又はYであり、
X3は、D、I、N、S又はYであり、
X4は、F、I又はLであり、
X5は、A、S又はTである。)
QQX1X2X3X4PX5X6X7(配列番号1050)、
(X1は、H又はYであり、
X2は、G又はNであり、
X3は、N又はSであり、
X4は、S又はWであり、
X5は、P又はアミノ酸なしであり、
X6は、R又はWであり、
X7は、S又はTである。)
又は
X1QYX2X3X4X5X6X7F(配列番号1051)、
(X1は、H又はQであり、
X2は、F又はYであり、
X3は、G、I又はSであり、
X4は、F、I又はTであり、
X5は、M、P、S又はTであり、
X6は、F、L、R又はWであり、
X7は、S又はTである。)
から選択される、軽鎖相補性決定領域(CDRL)を含む。
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11DX12(配列番号1065)、
(X1は、E又はSであり、
X2は、D、G又はアミノ酸なしであり、
X3は、D、N又はアミノ酸なしであり、
X4は、G又はアミノ酸なしであり、
X5は、G又はアミノ酸なしであり、
X6は、W、Y又はアミノ酸なしであり、
X7は、I、N又はYであり、
X8は、A又はYであり、
X9は、G、V又はYであり、
X10は、A、F又はGであり、
X11は、F、L又はMであり、
X12は、V又はYである。)
QX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11YX12X13X14DX15(配列番号1066)、
(X1は、G又はアミノ酸なしであり、
X2は、K、L又はYであり、
X3は、A、G又はSであり、
X4は、S、V又はYであり、
X5は、A又はGであり、
X6は、G又はアミノ酸なしであり、
X7は、T又はアミノ酸なしであり、
X8は、S又はアミノ酸なしであり、
X9は、Y又はアミノ酸なしであり、
X10は、W又はYであり、
X11は、G、S又はYであり、
X12は、F又はYであり、
X13は、G又はアミノ酸なしであり、
X14は、M又はアミノ酸なしであり、
X15は、V又はYである。)
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(配列番号1067)、
(X1は、D、G、L、S又はアミノ酸なしであり、
X2は、G、H、W、Y又はアミノ酸なしであり、
X3は、A、F、W、Y又はアミノ酸なしであり、
X4は、D、G、Q、T又はアミノ酸なしであり、
X5は、G、I、Q、S又はアミノ酸なしであり、
X6は、A、D、N、Q、S又はアミノ酸なしであり、
X7は、G、Y又はアミノ酸なしであり、
X8は、D、Y又はアミノ酸なしであり、
X9は、Y又はアミノ酸なしであり、
X10は、A、E、N又はYであり、
X11は、G、P、T、V又はYであり、
X12は、F又はIであり、
X13は、D又はQであり、
X14は、C、H、V又はYである。)
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17DX18(配列番号1068)、
(X1は、E、D又はアミノ酸なしであり、
X2は、G、R又はアミノ酸なしであり、
X3は、I、V、Y又はアミノ酸なしであり、
X4は、A、G、L又はNであり、
X5は、A、G、V又はWであり、
X6は、A、N、R又はTであり、
X7は、G、N、P又はアミノ酸なしであり、
X8は、G、T又はアミノ酸なしであり、
X9は、A又はアミノ酸なしであり、
X10は、D、E又はアミノ酸なしであり、
X11は、S、Y又はアミノ酸なしであり、
X12は、G、Y又はアミノ酸なしであり、
X13は、N、Y又はアミノ酸なしであり、
X14は、Y又はアミノ酸なしであり、
X15は、D、Y又はアミノ酸なしであり、
X16は、A、G又はアミノ酸なしであり、
X17は、F又はMであり、
X18は、I、V又はYである。)
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23(配列番号1069)、
(X1は、A、D、G、S又はTであり、
X2は、A、E、G、L、N、R、Y又はアミノ酸なしであり、
X3は、A、G、L、N、R、T、Y又はアミノ酸なしであり、
X4は、D、G、R、S、V、Y又はアミノ酸なしであり、
X5は、A、G、I、S、V、Y又はアミノ酸なしであり、
X6は、F、G、L、R、V又はアミノ酸なしであり、
X7は、L、T、Y又はアミノ酸なしであり、
X8は、Y又はアミノ酸なしであり、
X9は、Y又はアミノ酸なしであり、
X10は、D又はアミノ酸なしであり、
X11は、S又はアミノ酸なしであり、
X12は、S又はアミノ酸なしであり、
X13は、G又はアミノ酸なしであり、
X14は、D、L、M、S、Y又はアミノ酸なしであり、
X15は、H、I、P、V、W又はアミノ酸なしであり、
X16は、F、G、L、R、S、Y又はアミノ酸なしであり、
X17は、D、F、V、W、Y又はアミノ酸なしであり、
X18は、C、F、L、P、S又はYであり、
X19は、D、F、G又はYであり、
X20は、A、C、G、P、R、V又はYであり、
X21は、F、L、M、S又はアミノ酸なしであり、
X22は、A、D又はアミノ酸なしであり、
X23は、I、L、V,Y又はアミノ酸なしである。)
X1YSSGWX2X3YGX4X5DX6(配列番号1070)、
(X1は、M又はVであり、
X2は、S又はアミノ酸なしであり、
X3は、F又はアミノ酸なしであり、
X4は、V又はアミノ酸なしであり、
X5は、F又はMであり、
X6は、V又はYである。)
又は
RX1X2X3PFX4Y(配列番号1071)、
(X1は、G、H、L、N又はRであり、
X2は、E、T又はWであり、
X3は、L、N、T又はVであり、
X4は、D又はEである。)
からなる群から選択される重鎖相補性決定領域(CDRH)も含む。
X1SSQSLX2X3SDGX4TYLX5(配列番号1035)、
(X1は、K又はRであり、
X2は、L又はVであり、
X3は、H又はYであり、
X4は、K又はNであり、
X5は、N、S又はYである。)
RASQX1ISX2YLN(配列番号1036)、
(X1は、R、S又はTであり、
X2は、R又はSである。)
RASQX1IX2X3X4LX5(配列番号1037)、
(X1は、D、G、S又はTであり、
X2は、A、R又はSであり、
X3は、H、I、N、R、S又はTであり、
X4は、D、W又はYであり、
X5は、A、G又はNである。)
QASQDIX1X2X3LN(配列番号1038)、
(X1は、S又はTであり、
X2は、D又はNであり、
X3は、S又はYである。)
RASQX1VX2X3X4X5LA(配列番号1039)、
(X1は、S又はTであり、
X2は、I又はSであり、
X3は、R又はSであり、
X4は、S、N又はアミノ酸なしであり、
X5は、Y又はアミノ酸なしである。)
又は
KSSQX1X2LX3X4SNNKNYLX5(配列番号1040)、
(X1は、N又はSであり、
X2は、I又はVであり、
X3は、D又はYであり、
X4は、N、R又はSであり、
X5は、A又はVである。)
(iv)配列番号218から233からなる群から得られるCDRL2;(v)2以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失若しくは置換だけ、(iv)のCDRL2とアミノ酸配列が異なるCDRL2;又は(vi)以下から得られるCDRL2アミノ酸配列:
X1X2SNX3X4S(配列番号1041)、
(X1は、E又はKであり、
X2は、I又はVであり、
X3は、R又はWであり、
X4は、D又はFである。)
X1X2SX3LQS(配列番号1042)、
(X1は、A又はTであり、
X2は、A、E又はVであり、
X3は、S又はTである。)
X1ASX2LQS(配列番号1043)、
(X1は、A又はVであり、
X2は、S又はTである。)
DASX1LET(配列番号1044)、
(X1は、I又はNである。)
GASSRAT(配列番号223);又は
WASX1RES(配列番号1045)
(X1は、A又はTである。)
から選択されるCDRLをさらに含み得る。
GYTX1TX2X3X4X5X6(配列番号1052)、
(X1は、F又はLであり、
X2は、E、G又はSであり、
X3は、H、L又はYであり、
X4は、G、S又はYであり、
X5は、I又はMであり、
X6は、H又はSである。)
GYX1FTSYWIG(配列番号1053)、
(X1は、R又はSである。)
GFTFX1SX2X3MH(配列番号1054)、
(X1は、R又はSであり、
X2は、H又はYであり、
X3は、D又はGである。)
GFX1FSX2YX3MX4(配列番号1055)、
(X1は、P又はTであり、
X2は、A、R又はSであり、
X3は、A又はSであり、
X4は、N又はSである。)
GX1SX2SX3X4X5X6X7WX8(配列番号1056)、
(X1は、D又はGであり、
X2は、F、I又はVであり、
X3は、R、S又はアミノ酸なしであり、
X4は、G、Y又はアミノ酸なしであり、
X5は、D、G、S又はアミノ酸なしであり、
X6は、A、S又はYであり、
X7は、A又はYであり、
X8は、N又はSである。)
GFSLSNARMGVS(配列番号279);又は
GFSLX1TGGVGVG(配列番号1057)、
(X1は、S又はNである。)
(iv)配列番号300から331からなる群から選択されるCDRH2;(v)2以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失若しくは置換だけ、(iv)のCDRH2とアミノ酸配列が異なるCDRH2;又は(vi)以下から得られるCDRH2アミノ酸配列:
X1X2X3X4X5X6GX7TX8X9X10QKX11X12(配列番号1058)、
(X1は、S又はWであり、
X2は、F又はIであり、
X3は、D、N又はSであり、
X4は、A又はPであり、
X5は、E、N又はSであり、
X6は、D、N又はSであり、
X7は、E、G又はNであり、
X8は、I又はNであり、
X9は、C、H又はYであり、
X10は、A又はTであり、
X11は、F又はLであり、
X12は、D又はGである。)
IIYPX1DSDX2RYSPSFQG(配列番号1059)、
(X1は、D又はGであり、
X2は、A、I又はTである。)
X1IX2X3DGSX4X5X6YX7DSVX8G(配列番号1060)、
(X1は、F又はVであり、
X2は、S又はWであり、
X3は、D、S又はYであり、
X4は、I、N又はTであり、
X5は、K又はQであり、
X6は、N、R又はYであり、
X7は、A、T又はVであり;
X8は、K又はRである。)
X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG(配列番号1061)、
(X1は、A、H又はYであり、
X2は、G、R又はSであり、
X3は、G又はSであり、
X4は、G、R又はSであり、
X5は、S、T又はYであり、
X6は、I又はTである。)
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11YX12X13SX14KS(配列番号1062)、
(X1は、E、R又はYであり、
X2は、I又はTであり、
X3は、H、N又はYであり、
X4は、C、H、S、T又はYであり、
X5は、S又はRであり、
X6は、G又はSであり、
X7は、G、K、S又はTであり、
X8は、T又はWであり、
X9は、N又はYであり、
X10は、N又はアミノ酸なしであり、
X11は、D又はアミノ酸なしであり、
X12は、A又はNであり、
X13は、P又はVであり、
X14は、L又はVである。)
X1IFSNDEKSYSTSLKS(配列番号1063)、
(X1は、H又はLである。)
又はLIYWNX1X2KRYSPSLX3S(配列番号1064)、
(X1は、D又はVであり、
X2は、D又はEであり、
X3は、K又はRである。)
からなる群から得られるCDRHをさらに含み得る。
HB−EGFタンパク質、特に、ヒトHB−EGF(hHB−EGF)タンパク質を結合する抗原結合タンパク質が本明細書において提供される。提供される抗原結合タンパク質は、本明細書に記載されているように、1つ又はそれ以上の相補性決定領域(CDR)がその中に埋め込まれ及び/又は連結されているポリペプチドである。幾つかの抗原結合タンパク質において、CDRは、CDRの適切な抗原結合特性が達成されるようにCDRを配向させる「フレームワーク」領域中に埋め込まれる。一般に、提供される抗原結合タンパク質は、HB−EGFとその同族受容体(EGF−R及びHER4など)の間の相互作用を妨害し、遮断し、低下させ、又は調節することができる。
HB−EGFは、様々な腫瘍細胞によって産生され、自己分泌性腫瘍成長因子として作用する。Davis−Fleischer et al., 1998, Front Biosci.3:288−299; Iwamoto & Mekada, 2000, Cytokine Growth Factor Rev.11:335−344。HB−EGFは、HB−EGFの生物活性を増加させることができるヘパリンに対して強い親和性を有する。HB−EGFは、メタロプロテイナーゼによってタンパク分解的に切断されて成長因子の成熟可溶性形態を与える膜貫通タンパク質として産生される。
EGFRは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通領域及びチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインからなる170kDaの膜貫通糖タンパク質である。EGFRへの成長因子の結合は、リガンド−受容体複合体の内部取り込み、受容体及び他のタンパク質基質の自己リン酸化をもたらし、最終的には、DNA合成及び細胞分裂を引き起こす。外部リガンド結合ドメインは、HB−EGFによって刺激されるのみならず、EGF、TGFα及びアムフィレグリン(AR)によっても刺激される。
HB−EGFの活性を制御するのに有用な様々な選択的結合剤が提供される。これらの結合剤には、例えば、抗原結合ドメイン(例えば、一本鎖抗体、ドメイン抗体、免疫接着及び抗原結合領域を有するポリペプチド)を含有し、HB−EGFポリペプチド、特に、ヒトHB−EGFに特異的に結合する抗原結合タンパク質が含まれる。結合剤の幾つかは、例えば、HB−EGFがその受容体に結合するのを阻害する上で有用であり、従って、HB−EGFによって媒介されるシグナル伝達と関連する1つ又はそれ以上の活性を阻害し、妨害し、又は調節するために使用することができる。
提供される抗原結合タンパク質の幾つかは、天然に存在する抗体に通例付随する構造を有する。これらの抗体の構造単位は、通例、1つ又はそれ以上の四量体(それぞれ、ポリペプチド鎖の2つの同じ対から構成される。)を含むが、哺乳動物の幾つかの種は単一の重鎖のみを有する抗体も産生する。典型的な抗体において、各ペア又は対は、1つの完全長「軽」鎖(ある種の実施形態において、約25kDa)及び1つの完全長「重」鎖(ある種の実施形態において、約50から70kDa)を含む。それぞれの各免疫グロブリン鎖は、幾つかの「免疫グロブリンドメイン」(それぞれ、概ね90から110個のアミノ酸からなり、特徴的な折り畳みパターンを呈する。)から構成される。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する基本的単位である。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識のために必要とされる可変ドメインを典型的に含む。カルボキシ末端部分は鎖の他方末端より進化的に保存されており、「定常領域」又は「C領域」と称される。ヒト軽鎖は、一般に、κ及びλ軽鎖と分類され、これらの各々は1つ可変ドメイン及び1つの定常ドメインを含有する。重鎖は、典型的には、μ、δ、γ、α又はε鎖と分類され、これらは、それぞれ、IgM、IgD、IgG、IgA及びIgEとして抗体のイソタイプを定義する。IgGは、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4などの(但し、これらに限定されない。)幾つかのサブタイプを有する。IgMサブタイプは、IgM1及びIgM2を含む。IgAサブタイプは、IgA1及びIgA2を含む。ヒトにおいて、IgA及びIgDイソタイプは4つの重鎖及び4つの軽鎖を含有し、IgG及びIgEイソタイプは2つの重鎖及び2つの軽鎖を含有し、並びにIgMイソタイプは5つの重鎖及び5つの軽鎖を含有する。重鎖C領域は、エフェクター機能のために必要となり得る1つ又はそれ以上のドメインを典型的に含む。重鎖定常領域ドメインの数は、イソタイプに依存する。IgG重鎖は、例えば、CH1、CH2及びCH3として知られる3つのC領域ドメインを含有する。提供される抗体は、これらのイソタイプ及びサブタイプの何れをも有することができる。ある実施形態において、HB−EGF抗体はIgG1、IgG2又はIgG4サブタイプのものである。
それぞれ、図1Aから1P及び図2Aから2Oに示されているような、U−VL1、U−VL2、U−VL3、U−VL4、U−VL5、U−VL6、U−VL7、U−VL8、U−VL9、U−VL10、U−VL11、U−VL12、U−VL13、U−VL14、U−VL15、U−VL16、U−VL17、U−VL18、U−VL19、U−VL20、U−VL21、U−VL22、U−VL23、U−VL24、U−VL25、U−VL26、U−VL27、U−VL28、U−VL29、U−VL30、U−VL31、U−VL32、U−VL33、U−VL34、U−VL35、U−VL36、U−VL37、U−VL38、U−VL39、U−VL40、U−VL41、U−VL42、U−VL43、U−VL44、U−VL45、U−VL46、U−VL47、U−VL48、U−VL49、U−VL50、U−VL51、U−VL52、U−VL54、U−VL55、U−VL56、U−VL57、U−VL58、U−VL59、U−VL60、U−VL61、U−VL62、U−VL64及びU−VL65からなる群から選択される抗体軽鎖可変領域並びに/又はU−VH1、U−VH2、U−VH3、U−VH4、U−VH5、U−VH6、U−VH7、U−VH8、U−VH9、U−VH10、U−VH11、U−VH12、U−VH13、U−VH14、U−VH15、U−VH16、U−VH17、U−VH18、U−VH19、U−VH20、U−VH21、U−VH22、U−VH23、U−VH24、U−VH25、U−VH26、U−VH27、U−VH28、U−VH29、U−VH30、U−VH31、U−VH32、U−VH33、U−VH34、U−VH35、U−VH36、U−VH37、U−VH38、U−VH39、U−VH40、U−VH41、U−VH42、U−VH43、U−VH44、U−VH45、U−VH46、U−VH47、U−VH48、U−VH49、U−VH50、U−VH51、U−VH52、U−VH53、U−VH54、U−VH55、U−VH56、U−VH57及びU−VH58からなる群から選択される抗体軽鎖可変領域並びにこれらの軽鎖及び重鎖可変領域の免疫学的に機能的な断片、誘導体、変異タンパク質及び変形物を含有する抗原結合タンパク質も提供される。
本明細書に開示されている抗原結合タンパク質は、1つ又はそれ以上のCDRがその中に移植され、挿入され、及び/又は連結されているポリペプチドである。抗原結合タンパク質は、1、2、3、4、5又は6つのCDRを有することができる。従って、抗原結合タンパク質は、例えば、1つの軽鎖CDR1(「CDRL1」)及び/又は1つの軽鎖CDR2「CDRL2」)及び/又は1つの軽鎖CDR3(「CDRL3」)及び/又は1つの重鎖CDR1(「CDRH1」)及び/又は1つの重鎖CDR2(「CDRH2」)及び/又は1つの重鎖CDR3(「CDRH3」)を有することができる。幾つかの抗原結合タンパク質は、CDRL3及びCDRH3の両方を含む。具体的なCDRは、図6Aから6F及び図7Aから7Eに明記されている。
(X1は、K又はRであり、
X2は、L又はVであり、
X3は、H又はYであり、
X4は、K又はNであり、
X5は、N、S又はYである。)
b.一般式X1X2SNX3X4S(配列番号1041)のCDRL2
(X1は、E又はKであり、
X2は、I又はVであり、
X3は、R又はWであり、
X4は、D又はFである。)
c.一般式X1QX2X3X4X5PX6X7(配列番号1046)のCDRL3
(X1は、I又はMであり、
X2は、A、G又はSであり、
X3は、I又はTであり、
X4は、H又はQであり、
X5は、F、L又はWであり、
X6は、C、I、H、L又はTであり、
X7は、S又はTである。)
軽鎖CDRの群Bは、以下のコンセンサス集合物を含む。
(X1は、R、S又はTであり、
X2は、R又はSである。)
b.一般式X1X2SX3LQS(配列番号1042)のCDRL2
(X1は、A又はTであり、
X2は、A、E又はVであり、
X3は、S又はTである。)
c.一般式QQX1X2X3X4X5IT(配列番号1047)のCDRL3
(X1は、I又はSであり、
X2は、F又はYであり、
X3は、F、I、S又はYであり、
X4は、A、S又はTであり、
X5は、P又はSである。)
軽鎖CDRの群Cは、以下のコンセンサス集合物を含む。
(X1は、D、G、S又はTであり、
X2は、A、R又はSであり、
X3は、H、I、N、R、S又はTであり、
X4は、D、W又はYであり、
X5は、A、G又はNである。)
b.一般式X1ASX2LQS(配列番号1043)のCDRL2
(X1は、A又はVであり、
X2は、S又はTである。)
c.一般式X1X2X3X4X5X6X7X8T(配列番号1048)のCDRL3
(X1は、L又はQであり、
X2は、K、N又はQであり、
X3は、A、H、S又はYであり、
X4は、H、N又はYであり、
X5は、N、S又はTであり、
X6は、A、F、I、T、V又はYであり、
X7は、P又はアミノ酸なしであり、
X8は、F、L又はPである。)
軽鎖CDRの群Dは、以下のコンセンサス集合物を含む。
(X1は、S又はTであり、
X2は、D又はNであり、
X3は、S又はYである。)
b.一般式DASX1LET(配列番号1044)のCDRL2
(X1は、I又はNである。)
c.一般式QX1X2DX3LPX4X5(配列番号1049)のCDRL3
(X1は、H又はQであり、
X2は、C又はYであり、
X3は、D、I、N、S又はYであり、
X4は、F、I又はLであり、X5は、A、S又はTである。)
軽鎖CDRの群Eは、以下のコンセンサス集合物を含む。
(X1は、S又はTであり、
X2は、I又はSであり、
X3は、R又はSであり、
X4は、S、N又はアミノ酸なしであり、
X5は、Y又はアミノ酸なしである。)
b.一般式GASSRAT(配列番号223)のCDRL2
c.一般式QQX1X2X3X4PX5X6X7(配列番号1050)のCDRL3
(X1は、H又はYであり、
X2は、G又はNであり、
X3は、N又はSであり、
X4は、S又はWであり、
X5は、P又はアミノ酸なしであり、
X6は、R又はWであり、
X7は、S又はTである。)
軽鎖CDRの群Fは、以下のコンセンサス集合物を含む。
(X1は、N又はSであり、
X2は、I又はVであり、
X3は、D又はYであり、
X4は、N、R又はSであり、
X5は、A又はVである。)
b.一般式WASX1RES(配列番号1045)のCDRL2、
(X1は、A又はTである。)
c.一般式X1QYX2X3X4X5X6X7F(配列番号1051)のCDRL3
(X1は、H又はQであり、
X2は、F又はYであり、
X3は、G、I又はSであり、
X4は、F、I又はTであり、
X5は、M、P、S又はTであり、
X6は、F、L、R又はWであり、
X7は、S又はTである。)
重鎖CDRの群Aは、以下のコンセンサス集合物を含む。
(X1は、F又はIであり、
X2は、E、G又はSであり、
X3は、H、L又はYであり、
X4は、G、S又はYであり、
X5は、I又はMであり、
X6は、H又はSである。)
b.一般式X1X2X3X4X5X6GX7TX8X9X10QKX11X12(配列番号1058)のCDRH2
(X1は、S又はWであり、
X2は、F又はIであり、
X3は、D、N又はSであり、
X4は、A、Pであり、
X5は、E、N又はSであり、
X6は、D、N又はSであり、
X7は、E、G又はNであり、
X8は、I又はNであり、
X9は、C、H又はYであり、
X10は、A又はTであり、
X11は、F又はLであり、
X12は、D又はGである。)
c.一般式X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11DX12(配列番号1065)のCDRH3
(X1は、E又はSであり、
X2は、D、G又はアミノ酸なしであり、
X3は、D、N又はアミノ酸なしであり、
X4は、G又はアミノ酸なしであり、
X5は、G又はアミノ酸なしであり、
X6は、W、Y又はアミノ酸なしであり、
X7は、I、N又はYであり、
X8は、A又はYであり、
X9は、G、V又はYであり、
X10は、A、F又はGであり、
X11は、F、L又はMであり、
X12は、V又はYである。)
重鎖CDRの群Bは、以下のコンセンサス集合物を含む。
(X1は、R又はSである。)
b.一般式IIYPX1DSDX2RYSPSFQG(配列番号1059)のCDRH2
(X1は、D又はGであり、
X2は、A、I又はTである。)
c.一般式QX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11YX12X13X14DX15(配列番号1066)のCDRH3
(X1は、G又はアミノ酸なしであり、
X2は、K、L又はYであり、
X3は、A、G又はSであり、
X4は、S、V又はYであり、
X5は、A又はGであり、
X6は、G又はアミノ酸なしであり、
X7は、T又はアミノ酸なしであり、
X8は、S又はアミノ酸なしであり、
X9は、Y又はアミノ酸なしであり、
X10は、W又はYであり、
X11は、G、S又はYであり、
X12は、F又はYであり、
X13は、G又はアミノ酸なしであり、
X14は、M又はアミノ酸なしであり、
X15は、V又はYである。)
重鎖CDRの群Cは、以下のコンセンサス集合物を含む。
(X1は、R又はSであり、
X2は、H又はYであり、
X3は、D又はGである。)
b.一般式X1IX2X3DGSX4X5X6YX7DSVX8G(配列番号1060)のCDRH2
(X1は、F又はVであり、
X2は、S又はWであり、
X3は、D、S又はYであり、
X4は、I、N又はTであり、
X5は、K又はQであり、
X6は、N、R又はYであり、
X7は、A、T又はVであり、
X8は、K又はRである。)
c.一般式X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(配列番号1067)のCDRH3
(X1は、D、G、L、S又はアミノ酸なしであり、
X2は、G、H、W、Y又はアミノ酸なしであり、
X3は、A、F、W、Y又はアミノ酸なしであり、
X4は、D、G、Q、T又はアミノ酸なしであり、
X5は、G、I、Q、S又はアミノ酸なしであり、
X6は、A、D、N、Q、S又はアミノ酸なしであり、
X7は、G、Y又はアミノ酸なしであり、
X8は、D、Y又はアミノ酸なしであり、
X9は、Y又はアミノ酸なしであり、
X10は、A、E、N又はYであり、
X11は、G、P、T、V又はYであり、
X12は、F又はIであり、
X13は、D又はQであり、
X14は、C、H、V又はYである。)
重鎖CDRの群Dは、以下のコンセンサス集合物を含む。
(X1は、P又はTであり、
X2は、A、R又はSであり、
X3は、A又はSであり、
X4は、N又はSである。)
b.一般式X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG(配列番号1061)のCDRH2
(X1は、A、H又はYであり、
X2は、G、R又はSであり、
X3は、G又はSであり、
X4は、G、R又はSであり、
X5は、S、T又はYであり、
X6は、I又はTである。)
c.一般式X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16XX17DX18(配列番号1068)のCDRH3
(X1は、E、D又はアミノ酸なしであり、
X2は、G、R又はアミノ酸なしであり、
X3は、I、V、Y又はアミノ酸なしであり、
X4は、A、G、L又はNであり、
X5は、A、G、V又はWであり、
X6は、A、N、R又はTであり、
X7は、G、N、P又はアミノ酸なしであり、
X8は、G、T又はアミノ酸なしであり、
X9は、A又はアミノ酸なしであり、
X10は、D、E又はアミノ酸なしであり、
X11は、S、Y又はアミノ酸なしであり、
X12は、G、Y又はアミノ酸なしであり、
X13は、N、Y又はアミノ酸なしであり、
X14は、Y又はアミノ酸なしであり、
X15は、D、Y又はアミノ酸なしであり、
X16は、A、G又はアミノ酸なしであり、
X17は、F又はMであり、
X18は、I、V又はYである。)
重鎖CDRの群Eは、以下のコンセンサス集合物を含む。
(X1は、D又はGであり、
X2は、F、I又はVであり、
X3は、R、S又はアミノ酸なしであり、
X4は、G、Y又はアミノ酸なしであり、
X5は、D、G、S又はアミノ酸なしであり、
X6は、A、S又はYであり、
X7は、A又はYであり、
X8は、N又はSである。)
b.一般式X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11YX12XI3SX14KS(配列番号1062)のCDRH2
(X1は、E、R又はYであり、
X2は、I又はTであり、
X3は、H、N又はYであり、
X4は、C、H、S、T又はYであり、
X5は、S又はRであり、
X6は、G又はSであり、
X7は、G、K、S又はTであり、
X8は、T又はWであり、
X9は、N又はYであり、
X10は、N又はアミノ酸なしであり、
X11は、D又はアミノ酸なしであり、
X12は、A又はNであり、
X13は、P又はVであり、
X14は、L又はVである。)
c.一般式X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23(配列番号1069)のCDRH3
(X1は、A、D、G、S又はTであり、
X2は、A、E、G、L、N、R、Y又はアミノ酸なしであり、
X3は、A、G、L、N、R、T、Y又はアミノ酸なしであり、
X4は、D、G、R、S、V、Y又はアミノ酸なしであり、
X5は、A、G、I、S、V、Y又はアミノ酸なしであり、
X6は、F、G、L、R、V又はアミノ酸なしであり、
X7は、L、T、Y又はアミノ酸なしであり、
X8は、Y又はアミノ酸なしであり、
X9は、Y又はアミノ酸なしであり、
X10は、D又はアミノ酸なしであり、
X11は、S又はアミノ酸なしであり、
X12は、S又はアミノ酸なしであり、
X13は、G又はアミノ酸なしであり、
X14は、D、L、M、S、Y又はアミノ酸なしであり、
X15は、H、I、P、V、W又はアミノ酸なしであり、
X16は、F、G、L、R、S、Y又はアミノ酸なしであり、
X17は、D、F、V、W、Y又はアミノ酸なしであり、
X18は、C、F、L、P、S又はYであり、
X19は、D、F、G又はYであり、
X20は、A、C、G、P、R、V又はYであり、
X21は、F、L、M、S又はアミノ酸なしであり、
X22は、A、D又はアミノ酸なしであり、
X23は、I、L、V、Y又はアミノ酸なしである。)
重鎖CDRの群Fは、以下のコンセンサス集合物を含む。
b.一般式X1IFSNDEKSYSTSLKS(配列番号1063)のCDRH2
(X1は、H又はLである。)
c.一般式X1YSSGWX2X3YGX4X5DX6(配列番号1070)のCDRH3
(X1は、M又はVであり、
X2は、S又はアミノ酸なしであり、
X3は、F又はアミノ酸なしであり、
X4は、V又はアミノ酸なしであり、
X5は、F又はMであり、
X6は、V又はYである。)
重鎖CDRの群Gは、以下のコンセンサス集合物を含む。
(X1は、S又はNである。)
b.一般式LIYWNX1X2KRYSPSLX3S(配列番号1064)のCDRH2
(X1は、D又はVであり、
X2は、D又はEであり、
X3は、K又はRである。)
c.一般式RX1X2X3PFX4Y(配列番号1071)のCDRH3
(X1は、G、H、L、N又はRであり、
X2は、E、T又はWであり、
X3は、L、N、T又はVであり、
X4は、D又はEである。)
別のアプローチでは、U−VL又はU−VHに対応する同じ配列内にCDRを連続して保つことによって、コンセンサス配列を決定し得る。簡潔に述べると、比較用の併置及び系統発生の推定の遂行を容易にするために、このアプローチでは、U−VL又はU−VHの何れかの可変ドメイン全体に対応するアミノ酸配列をFASTAフォーマットに変換した。次に、U−VL又はU−VHに対応する同じ配列内にCDRを連続するようになお保ちながら、(例えば、共通の生殖系列フレームワーク遺伝形質を偶然共有する無関係の抗体などの)偶発的現象に起因するアミノ酸位置重み付けバイアスを一切導入することなく、CDRのみの検査が行われるように、これらの配列のフレームワーク領域を人工のリンカー配列と置換する。次いで、このフォーマットのU−VL又はU−VH配列は、標準的なClutalW様アルゴリズムを使用するプログラム(Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res.22:4673−4680参照)を用いて、配列類似性併置検査に供される。同様に、このプログラムは、分岐長の比較及びグループ分けを介して、配列群の類似性及び相違を構築及び図解するために、UPGMA(算術平均を用いた重み付けされていないペアグループ法)又は隣接連結法(Neighbor−Joining methods)(Saitou and Nei, 1987, Molecular Biology and Evolution 4:406−425参照)の何れかを用いて、配列類似性併置に基づく系統発生図(系統発生樹の図解)を生成する。両方法は、各群内のコンセンサス配列集合物を決定するために類似の結果を与える。
一態様に従えば、A)(i)配列番号189から217からなる群から選択されるCDRL1;(ii)配列番号218から233からなる群から選択されるCDRL2;(iii)配列番号234から274からなる群から選択されるCDRL3及び(iv)1つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、5、4、3、4、2若しくは1つ以下のアミノ酸の欠失若しくは挿入を含有する(i)、(ii)若しくは(iii)のCDRLからなる群から選択される1つ若しくはそれ以上の軽鎖相補性決定領域(CDRL)、又はB)(i)配列番号275から299からなる群から選択されるCDRH1;(ii)配列番号300から331からなる群から選択されるCDRH2;(iii)配列番号332から372からなる群から選択されるCDRH3並びに(iv)アミノ酸の1つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、5、4、3、4、2若しくは1つ以下のアミノ酸の欠失若しくは挿入を含有する(i)、(ii)及び(iii)のCDRHからなる群から選択される1つ若しくはそれ以上の重鎖相補性決定領域(CDRH)、又は(C)(A)の1つ若しくはそれ以上の軽鎖CDRL;並びに(D)(B)の1つ又はそれ以上の重鎖CDRHを含む、HB−EGFを結合する単離された抗原結合タンパク質が提供される。
からなる群から選択される、軽鎖相補性決定領域(CDRL)並びに/又は(B)(i)配列番号332から372からなる群から選択されるCDRH3;(ii)2以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失若しくは置換だけ、(i)のCDRH3とアミノ酸配列が異なるCDRH3;及び(iii)以下からなる群から選択されるCDRH3アミノ酸配列:
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11DX12(配列番号1065)(X1は、E及びSからなる群から選択され、X2は、D、G及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X3は、D、N及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X4は、G及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X5は、G及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X6は、W、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X7は、I、N及びYからなる群から選択され、X8は、A及びYからなる群から選択され、X9は、G、V及びYからなる群から選択され、X10は、A、F及びGからなる群から選択され、X11は、F、L及びMからなる群から選択され、X12は、V及びYからなる群から選択される。);QX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11YX12X13X14DX15(配列番号1066)(X1は、G及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X2は、K、L及びYからなる群から選択され、X3は、A、G及びSからなる群から選択され、X4は、S、V及びYからなる群から選択され、X5は、A及びGからなる群から選択され、X6は、G及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X7は、T及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X8は、S及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X9は、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X10は、W及びYからなる群から選択され、X11は、G、S及びYからなる群から選択され、X12は、F及びYからなる群から選択され、X13は、G及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X14は、M及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X15は、V及びYからなる群から選択される。);X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(配列番号1067)(X1は、D、G、L、S及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X2は、G、H、W、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X3は、A、F、W、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X4は、D、G、Q、T及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X5は、G、I、Q、S及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X6は、A、Dからなる群から選択され、X8は、D、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X9は、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X10は、A、E、N及びYからなる群から選択され、X11は、G、P、T、V及びYからなる群から選択され、X12は、X14は、C、H、V及びYからなる群から選択される。);X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17DX18(配列番号1068)(X1は、E、D及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X2は、G、R及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X3は、I、V、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X4は、A、G、L及びNからなる群から選択され、X5は、A、G、V及びWからなる群から選択され、X6は、A、N、R及びTからなる群から選択され、X7は、G、N、P及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X8は、G、T及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X9は、A及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X10は、D、E及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X11は、S、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X12は、G、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X13は、N、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X14は、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X15は、D、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X16は、A、G及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X17は、F及びMからなる群から選択され、X18は、I、V及びYからなる群から選択される。);X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23(配列番号1069)(X1は、A、D、G、S及びTからなる群から選択され、X2は、A、E、G、L、N、R、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X3は、A、G、L、N、R、T、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X4は、D、G、R、S、V、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X5は、A、G、I、S、V、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X6は、F、G、L、R、V及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X7は、L、T、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X8は、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X9は、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X10は、D及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X11は、S及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X12は、S及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X13は、G及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X14は、D、L、M、S、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X15は、H、I、P、V、W及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X16は、F、G、L、R、S、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X17は、D、F、V、W、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X18は、C、F、L、P、S及びYからなる群から選択され、X19は、D、F、G及びYからなる群から選択され、X20は、A、C、G、P、R、V及びYからなる群から選択され、X21は、F、L、M、S及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X22は、A、D及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X23は、I、L、V、Y及びアミノ酸なしからなる群から選択される。);X1YSSGWX2X3YGX4X5DX6(配列番号1070)(X1は、M及びVからなる群から選択され、X2は、S及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X3は、F及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X4は、V及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X5は、F及びMからなる群から選択され、X6は、V及びYからなる群から選択される。)及びRX1X2X3PFX4Y(配列番号1071)(X1は、G、H、L、N及びRからなる群から選択され、X2は、E、T及びWからなる群から選択され、X3は、L、N、T及びVからなる群から選択され、X4は、D及びEからなる群から選択される。)からなる群から選択される重鎖相補性決定領域(CDRH)を含む。
抗原結合タンパク質がHB−EGFなどのポリペプチドの指定された残基内のエピトープを結合すると称される場合、例えば、意味されるのは、抗原結合タンパク質は指定された残基(例えば、HB−EGFの指定されたセグメント)からなるポリペプチドに特異的に結合する。このような抗原結合タンパク質は、通例、HB−EGF内の全ての残基と接触するわけではない。HB−EGF内のあらゆる単一のアミノ酸置換若しくは欠失又はHB−EGFの細胞外ドメインは、結合親和性に必ずしも著しい影響を与えるわけではない。抗原結合タンパク質のエピトープ特異性は、様々な様式で測定することができる。1つのアプローチは、例えば、抗原の配列を包含し、アミノ酸の少数(例えば、3つのアミノ酸)の増加分が異なる約15アミノ酸の重複するペプチドの集合物を検査することを含む。ペプチドは、マイクロタイター皿のウェル内に固定化される。固定化は、ペプチドの1つの末端をビオチン化することによって実施することができる。場合によって、同じペプチドの異なる試料は、アミノ及びカルボキシ末端においてビオチン化され、比較のために、別々のウェル中に固定化することができる。これは末端特異的な抗原結合タンパク質を同定するために有用である。場合によって、目的のアミノ酸で終結させることによって、追加のペプチドを含めることができる。このアプローチは、HB−EGFの内部断片に対する末端特異的抗原結合タンパク質を同定するのに有用である。抗原結合タンパク質又は免疫学的に機能的な断片は、様々なペプチドの各々への特異的結合に関してスクリーニングされる。エピトープは、抗原結合タンパク質が特異的結合を示す全てのペプチドに共通するアミノ酸のセグメントとともに存在するものと定義される。エピトープを定義するための特異的アプローチに関する詳細は、実施例23に記載されている。
別の態様において、HB−EGFへの特異的結合に関して、上記エピトープに結合する例示されている抗体又は機能的断片の1つと競合する抗原結合タンパク質が提供される。このような抗原結合タンパク質は、本明細書に例示されている抗原結合タンパク質又は重複するエピトープの1つと同じエピトープにも結合し得る。例示されている抗原結合タンパク質と同じエピトープと競合し、又は例示されている抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質及び断片は、類似の機能的特性を示すものと予想される。例示される抗原結合タンパク質及び断片は、図1、2、3、4、6及び7に含まれる重鎖及び軽鎖、可変領域ドメイン並びにCDRを有するものなど、上記のものが含まれる。
一実施形態において、HB−EGF抗原結合タンパク質は、ヒト又はヒト化抗体である。ヒト抗体は、マウス又はラットの可変及び/又は定常領域を有する抗体に伴う問題の多くを回避する。このようなマウス又はラット由来のタンパク質の存在は、抗体の迅速な排除をもたらすことができ、又は患者による抗体に対する免疫応答の生成をもたらし得る。マウス又はラット由来の抗体の使用を回避するために、げっ歯類、他の哺乳動物又は動物が完全ヒト抗体を産生するように、げっ歯類、他の哺乳動物又は動物中に機能的なヒト抗体遺伝子坐を導入することを通じて、完全ヒト抗体が作製されている。
本明細書に記載されている抗体は、本明細書に記載されているようなXenoMouse(R)技術の使用を通じて調製された。このようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子及び抗体を産生することができ、マウス免疫グロブリン分子及び抗体の産生を実質的に欠失している。ヒト抗体を産生するために使用される技術は、本明細書に開示されている特許、出願及び参考文献に開示されている。幾つかの実施形態において、マウス及びヒト抗体のトランスジェニック生産は、1996年12月3日に出願された米国特許出願08/759,620号及び1998年6月11日公開された国際特許公開WO/24893及び2000年12月21日に公開されたWO00/76310(これらの開示は、参照により、本明細書に組み込まれる。)に開示されているように実施される。「Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146−156」(この開示は、参照により、本明細書に組み込まれる。)を参照されたい。
上述されているように、基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の2つの同じ対から構成され、各対は1つの「軽」(約25kDa)及び1つの「重」鎖(約50から70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識のために主として必要とされる約100から110又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、二量体化エフェクター機能、循環半減期及び他の機能に必要とされる定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、κ及びλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α又はεとして分類され、それぞれ、IgM、IgD、IgG、IgA及びIgEとして抗体のイソタイプを規定する。軽鎖及び重鎖内において、可変及び定常領域は、約12又はそれ以上のアミノ酸の「J」領域によって連結され、重鎖は約10アミノ酸の「D」領域も含む。全般に、「Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,2nd ed.,Raven Press,N.Y.(1989)」(参照により、あらゆる目的のために、その全体が組み込まれる。)を参照されたい。各軽鎖/重鎖対の可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。
別の態様において、本明細書に提供されるHB−EGF抗原結合タンパク質は、抗体様結合活性を有する(すなわち、HB−EGFに結合する)足場タンパク質である。
別の実施形態において、HB−EGF抗原結合タンパク質、例えば、本明細書に提供されている抗体は、標識基に連結される。このような標識された抗原結合タンパク質は、診断用途に特に適している。本明細書において使用される「標識基」という用語は、検出可能なマーカー、例えば、放射性標識されたアミノ酸又は標識されたアビジン(例えば、光学的又は比色分析法によって検出することができる蛍光マーカー又は酵素活性に結合されたストラプトアビジン)によって検出することができるビオチン部分を表す。抗体等のポリペプチド及び糖タンパク質を標識するための様々な方法が本分野において公知であり、使用され得る。適切な標識基の例には、以下のもの、放射性同位体若しくは放射性核種(例えば、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、1251、131I)、蛍光性基(例えば、FITC、ローダミン、ランタニドリン光体)、酵素基(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、化学発光基、ビオチン基又は二次レポーター(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)によって認識される所定のポリペプチドエピトープが含まれるが、これらに限定されない。ある態様において、立体的な妨害の可能性を低下させるために、標識基は様々な長さのスペーサーアームによって付着されることが望ましい場合があり得る。
抗体の一方若しくは両方の鎖又はその断片、誘導体、変異タンパク質若しくは変形物をコードする核酸、重鎖可変領域又はCDRのみをコードするポリヌクレオチド、ハイブリッド形成プローブとして使用するのに十分なポリヌクレオチド、PCRプライマー若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定し、分析し、変異し、又は増幅するための配列決定プライマー、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸及び前記の相補的配列など、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質又はその一部をコードする核酸も提供される。核酸は、あらゆる長さであり得る。核酸は、例えば、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000ヌクレオチド長若しくはそれ以上であり得、及び/又は1つ若しくはそれ以上の追加の配列、例えば、制御配列を含むことができ、及び/又は、より大きな核酸(例えばベクター)の一部であり得る。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、RNA及び/又はDNAヌクレオチド並びにこれらの人工変形物(例えば、ペプチド核酸)を含み得る。図15Aから15Vは、抗原結合タンパク質の様々な軽鎖に対するヌクレオチド配列を図示する。図16Aから16ACは、抗原結合タンパク質の様々な重鎖に対するヌクレオチド配列を図示する。図13Aから13Mは、抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。図14Aから14Lは、抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。図18Aから18Fは、抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なCDR領域に対するヌクレオチド配列を図示する。図19Aから19Gは、抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なCDR領域に対するヌクレオチド配列を図示する。図20Aから20Kは、抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なFR領域に対するヌクレオチド配列を図示する。図21Aから21Kは、抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なFR領域に対するヌクレオチド配列を図示する。図17Aは、抗原結合タンパク質の軽鎖定常領域のヌクレオチド配列を図示する。最後に、図17Bは、抗原結合タンパク質の重鎖定常領域のヌクレオチド配列を図示する。
1.適応症
本明細書に記載されているHB−EGF抗原結合タンパク質は、過剰な細胞増殖、望ましくない細胞遊走及び/又は異常な血管新生を伴うものなど、多数の疾病及び疾患を検出又は治療するために使用することができる。例えば、これらのHB−EGF抗原結合タンパク質は、癌細胞中でのHB−EGF誘導性EGFR及び/又はHER4チロシンリン酸化を阻害することができる(図22から29)。このような阻害は、細胞増殖及び遊走並びに血管新生を誘導するシグナル伝達現象のカスケードを妨害することができる。さらに、HB−EGF抗原結合タンパク質は、EGFRのトランス活性化を妨害することができる。さらに、これらの抗原結合タンパク質は、基底HUVEC細胞増殖(図32B)、内皮細胞管形成(図33)及びインビボでのマトリゲルプラグアッセイにおけるHB−EGF誘導性血管形成(図36)を阻害する。これらの結果は、本明細書に記載されているHB−EGF抗原結合タンパク質がインビトロ及びインイボで血管新生を阻害することを示唆する。さらに、これらの抗原結合タンパク質は、足場非依存性細胞増殖(図34及び図35)及びマウス中での異種移植腫瘍増殖(図37及び図38)も阻害する。重要なことに、HB−EGF抗原結合タンパク質は、MCF−7及びMDA−MB231癌細胞の遊走も阻害する(図27及び27参照)。従って、本明細書に記載されているHB−EGF抗原結合タンパク質は、転移性癌の伝播及び発達と関連する細胞増殖、血管新生及び細胞遊走を調節するシグナル伝達現象など、腫瘍及び他の癌性症状の発達における幾つかの工程を攻撃する。このような多面的介入は、癌が発達するプロセスを調節及び阻害するのに高度に有益である。さらに、進行のあらゆる段階にある癌(例えば、原発性、転移性及び再発性の癌)を治療することができる。
本明細書中に記載されているHB−EGF抗原結合分子は、検査試料を抗原結合分子と接触させること、及び抗体が試料中のプロHB−EGF又はHB−EGF分子を発現する細胞に結合するかどうかを検出することを含む、検査試料中の癌細胞を検出する方法において使用され得る。結合が起こる程度は、対照試料の使用によって評価することができる。検査試料及び対照試料は、例えば、血液、血清、腹水、胸水、脳脊髄液、組織、細胞、尿、リンパ、唾液、乳又は他の試料であり得る。このような対照試料は、液体又は組織又は細胞種の非癌性試料であり得る。幾つかの実施形態において、対照試料は、検査試料として同じ対象から得られた非癌性試料である。「対象」又は「患者」は、症状、疾患又は疾病の治療又は検出を必要としている哺乳動物、好ましくはヒトを表す。
癌の治療又は癌を治療することには、疾病に通例伴われる少なくとも1つの症候を緩和又は軽減することが含まれるものとする。治療には、付随する症候の2以上を緩和又は軽減することも含まれる。治療は、癌を治癒させ得る。例えば、治療は、癌細胞を実質的に除去し、及び/又は癌性腫瘍の増殖を停止させ得る。あるいは、治療は、癌の進行を遅らせ得る。
(実施例1)
免疫原の作製
pcDNA3−VSV−HB−EGF発現構築物(Prenzel et al., 1999、上記)からEGF様ドメイン(アミノ酸1から149)を含むHB−EGFを増幅し、カルボキシル末端にインフレームの6Hisタグを与える発現ベクター中にクローニングした(pcDNA 3.1 myc−his, InVitrogen)。C末端myc(HIS)6タグを有するHB−EGF免疫原をHEk293細胞中で発現させ、Ni−NTAセファロース(Amersham Pharmacia)及びヘパリンセファロース(Sigma)上での二段階精製によって精製した。
41 DPPTVSTDQL LPLGGGRDRK VRDLQEADLD LLRVTLSSKP
81 QALATPNKEE HGKRKKKGKG LGKKRDPCLR KYKDFCIHGE
121 CKYVKELRAP SCICHPGYHG ERCHGLSLP
(実施例2)
Xenomouseマウスの免疫化及び観察された力価
XenoMouse(R)マウス(XenoMouse系統:XMG2(ヒトIgG2産生)及びXM3C−1(ヒトIgG4産生)、Abgenix,Inc.Fremont,CA)を順次免疫化することによって、HB−EGFに対するモノクローナル抗体を開発した。
全ての注射に対して、足蹠を介してXenoMouse動物を免疫化した。各注射の総容量は、50μL/マウス、25μL/足蹠であった。コホート1(XMG2マウス10匹)及びコホート2(XM3C−1、10匹)の両方に関して、最初の免疫化は、1:1(v/v)でTITERMAXGOLD(R)(Sigma, Oakville, ON)と混合されたHB−EGFタンパク質10μg/マウスを用いて行った。その後、発熱物質を含まないD−PBS中のalumゲル100μg(Sigma, Oakville, ON)とともに1:1(v/v)混合されたHB−EGFタンパク質10μgを用いて、4回の強化免疫を行った。5回目の強化免疫は、1:1(v/v)でTITERMAXGOLD(R)と混合されたHB−EGFタンパク質10μgからなった。6回目及び7回目の注射は、alumゲル100μgと1:1v/v混合されたHB−EGFタンパク質10μgからなった。最終強化免疫は、アジュバントなしに、無発熱物質DPBS中のHB−EGFタンパク質10μgを用いて行った。このプロトコールのために、0、4、8、14、18、21、25及び28日目にXenoMouseマウスを免疫化し、32日目に融合を行った。4回目の強化免疫から16日後、6回目の強化免疫から23日後に、後眼窩採血手法を通じて、2回の採血を行った。
免疫化されたXenoMouseマウスから得た血清中の抗HB−EGF抗体力価をELISAによって測定した。簡潔に述べれば、抗原コーティング緩衝液(0.1M炭酸緩衝液、pH9.6NaHCO3(MW84)8.4g/L)中において、4℃で一晩、Costar Labcoat Universal Binding Polystyrene 96−well plates (Corning, Acton, MA)上に、HB−EGFタンパク質(2μg/mL)をコートした。翌日、Biotekプレート洗浄装置を用いて、洗浄緩衝液(1×PBS中の0.05%Tween20)でプレートを1回洗浄した。次いで、200μL/ウェルのブロッキング緩衝液(1×PBS中の0.5%BSA、0.1%Tween20、0.01%チメロサール)を用いてプレートをブロックし、室温で1時間温置した。1時間のブロッキングの後、Biotekプレート洗浄装置を用いて、洗浄緩衝液でプレートを1回洗浄した。1:100の当初希釈から2つ組みで1:3希釈して、0.5%BSA/PBS緩衝液中に、HB−EGFタンパク質によって免疫化されたXenoMouseマウス又は非免疫化XenoMouse動物から得た血清を滴定した。最後のウェルは、ブランクとして残した。これらのプレートを室温で2時間温置し、次いで、Biotekプレート洗浄装置を用いて、洗浄緩衝液でプレートを3回洗浄した。ヤギ抗ヒトIgGFc特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ(CALTAG、カタログ番号H10507)連結抗体を、ブロッキング緩衝液中に1:2000の最終濃度で添加し、室温で1時間温置した。Biotekプレート洗浄装置を用いて、洗浄緩衝液でプレートを3回洗浄した。洗浄後、TMB発色性基質(BioFxBSTP−0100−01)を添加して10から20分間又は陰性対照ウェルが発色を示し始めるまで、プレートを展開した。次いで、停止溶液(100mLH2O/瓶を用いて再構成されたTMB(BioFxBSTP−0100−01)用の650nM停止試薬)の添加によって、ELISAを停止させた。650nmでの光学密度から各XenoMouse動物の特異的力価を測定し、下表1に示す。力価の値は、バックグラウンドの2倍のOD読み取りを有する血清の最大希釈の逆数である。従って、数字が大きいほど、HB−EGFに対する液性免疫応答は大きかった。
ハイブリドーマの作製及び結合物質に対する一次スクリーニング
免疫化されたマウスを屠殺し、各コホートからリンパ節を採集し、プールした。組織から細胞を放出させるために、DMEM中で磨り潰すことによってリンパ細胞を解離させ、DMEM中に細胞を懸濁した。細胞を計数し、細胞を穏やかに、但し、完全に再懸濁するために、リンパ球1億当り0.9mLDMEMを細胞沈降物に添加した。細胞1億当りCD90+磁気ビーズ100μLを用いて、4℃で15分間、磁気ビーズとともに細胞を温置することによって細胞を標識した。最大108の陽性細胞(又は最大2×109の全細胞)を含有する磁気標識された細胞懸濁物をLS+カラム上に搭載し、DEMEを用いてカラムを洗浄した。CD90陰性画分(これらの細胞の多くは、B細胞であると予想された。)として、全流出液を収集した。
機能的アッセイでの大規模化及び抗体の検査
本実施例は、HB−EGFに対して親和性を有する抗HB−EGF抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の同定を記載する。
細胞株上でのHB−EGF発現をFACS分析によって測定した。この分析を実施するために、PBS中の10mMEDTAを用いて、2×105の選択されたHB−EGF発現細胞を採集し、FACS緩衝液(PBS、3%FCS、0.4%アジ化物)中に再懸濁し、96ウェルの丸底プレート上に播種した。上清を除去するための1000rpmでの3分間の遠心後、ハイブリドーマに由来する抗HB−EGF抗体希釈(100μL/ウェル)中に細胞を再懸濁し、4℃で45分間温置した。FACS緩衝液で細胞を2回洗浄し、FACS緩衝液中に1:100希釈された二次抗体(100μL/ウェル)ロバ抗ヒト−PE(Jackson)とともに再懸濁した。4℃、暗所で30分間、細胞懸濁物を温置し、FACS緩衝液で2回洗浄し、分析した(FACS,Beckman Coulter)。
何れの抗HB−EGF抗体調製物がHB−EGF誘導性上皮成長因子受容体チロシンのリン酸化を阻害するかを同定するために、以下のプロトコールを使用した。このような実験は、抗体をさらに性質決定し、何れのハイブリドーマ細胞株がHB−EGF活性を阻害し、その後、クローニング及び増殖させるべき抗体を産生するかを同定するのに役立つ。
EGFR依存性シグナル伝達経路は、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)の刺激に際して活性化され得る。GPCRとの相互作用によるヘテロ三量体Gタンパク質のリガンド活性化は、膜貫通メタロプロテイナーゼの細胞外活性を誘導する細胞内シグナルをもたらす。GPCR経路を活性化し得るリガンドは、LPA(リゾホスファチジン酸)、トロンビン、カルバコール、ボンベシン及びエンドセリンが含まれる。このような活性化は、膜貫通成長因子前駆体の細胞外プロセッシング及びEGFRの外部ドメインと直接又はプロテオグリカンマトリックスを通じて相互作用し、リン酸化を通じてEGFRの外部ドメインを活性化する成熟した因子の放出をもたらす。「Prenzel et al., 1999, Nature 402:884−888」を参照されたい。
モノクローナル抗体を作製するためのハイブリドーマのクローニング
前実施例中に記載されている実験から観察された試験結果に基づいて、49の当初単離株のうち、限界希釈及びモノクローナル抗体のさらなる性質決定によって、43個のハイブリドーマ細胞株をクローニングのために選択した。クローニングのために選択された株は、FACS分析によって示されたように、HB−EGF発現細胞株に結合し、EGF受容体チロシンリン酸化のHB−EGF刺激を阻害した。幾つかのハイブリドーマに関して、全ての一次スクリーニングアッセイを実施するのに十分な抗体が作製されなかった。ハイブリドーマのこの一部も、ハイブリドーマクローニングに進んだ。
EGFRのGPCR誘導性チロシンリン酸化の抗体関連阻害のさらなる性質決定
本実施例は、本明細書に提供される幾つかの抗HB−EGF抗体調製物がGPCR誘導性EGF受容体チロシンリン酸化の用量依存性阻害を呈することを示すさらなるデータを提供する。
ヒト抗HB−EGF抗体によるGPCR誘導性MDA−MB231細胞遊走の阻害
本明細書に提供されている抗体がGPCRリガンドであるスフィンゴシン−1−リン酸によって誘導される細胞遊走を遮断するかどうかを調べるために、遊出実験を行った。
ヒト抗HB−EGF抗体によるMCF−7細胞のHB−EGF誘導性遊走の阻害
本明細書に提供されている抗体が、抗体がなければHB−EGFによって直接誘導される細胞遊走を遮断するかどうかを調べるために、遊出実験を行った。これらの試験の結果は、抗転移性癌の薬剤として開発するために、何れの抗体調製物を使用し得るかを明らかにする。
上位10個の抗HB−EGF抗体の特徴
GPCR誘導性三重膜通過シグナル(TMPS)実験における上位10個のハイブリドーマ由来抗体調製物に対する結果の要約が、下記表4に提供されている。TMPS実験は、SCC9細胞中でのLPA刺激、MDA−MB231細胞中でのトロンビン刺激、SkOV−8細胞のLPA刺激及びMDA−MB231細胞のスフィンゴシン−1−リン酸遊走を含んだ。提供されているデータは、抗体が存在しないときの同じアッセイと比較された、アッセイ中で抗体調製物を使用したときに観察されたTMPSトランス活性化シグナルの%阻害を表す。各実験の上位3つの抗体は、太字で強調表示されている。
ヒト抗HB−EGF抗体によるHB−EGF誘導性HER4チロシンリン酸化の阻害
本実施例は、抗HB−EGF抗体調製物がHER4のHB−EGF誘導性チロシンリン酸化を阻害することを示す。HER4チロシンリン酸化に対する抗HB−EGF抗体の効果を評価するために、以下の手法を使用した。
モノクローナル抗体の交叉反応性
本実施例は、カニクイザルHB−EGF、マウスHB−EGF及び関連するEGF様成長因子アムフィレグリンに対する抗HB−EGF抗体調製物の交叉反応性を示すさらなるデータを提供する。HB−EGFのサル及びマウス形態のクローニングに続いて、HEK293細胞中に各発現構築物を形質移入し、FACS実験中でこれらのタンパク質を結合する能力に関して、抗HB−EGF抗体を検査した。ELISAフォーマットアッセイによって、アムフィレグリンの交叉反応性を検査した。
本研究では、カニクイザルHB−EGFプラスミドを調製した。カニクイザルHB−EGFの配列に基づくプライマーを用いて、カニクイザル腎臓cDNAから、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってカニクイザルHB−EGFcDNAをクローニングした。
リバースプライマー:5’−CCG CTC GAG GTG GGA ATT AGT CAT GCC C −3’(配列番号1079)
Hpa1及びXho1を用いてPCR産物を消化し、Hind3で消化されたpCDNA3.1中に連結した。精製後、DH5α細菌細胞中にカニクイザルHB−EGFプラスミドを形質転換し、アンピシリン選択下で複製した。次いで、単一の形質転換されたコロニーを用いて、アンピシリン選択培地中でプラスミドを高度に発現させた。市販のDNA精製キットを用いて精製した後、HEK293T細胞中にカニクイザルHB−EGFプラスミドを一過性に形質移入した。
本研究では、マウスHB−EGFプラスミドを調製した。マウスHB−EGFの配列に基づくプライマーを用いて、マウス肺cDNAから、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってマウスHB−EGFcDNAをクローニングした。
リバースプライマー:5’−CCG CTC GAG GTG GGA GCT AGC AGC CAC GCC−3’(配列番号1081)
EcoR1及びXho1を用いてPCR産物及びpCDNA3.1ベクターDNAを消化し、連結した。精製後、Dh5α細菌細胞中にマウスHB−EGFプラスミドを形質転換し、アンピシリン選択下で複製した。次いで、単一の形質転換されたコロニーを用いて、アンピシリン選択培地中でプラスミドを高度に発現させた。市販のDNA精製キットを用いて精製した後、HEK293T細胞中にマウスHB−EGFプラスミドを一過性に形質移入した。
本明細書に記載されている抗体の交叉反応性をスクリーニングするために、リン酸カルシウム法を用いてカニクイザル又はマウスHE−EGFプラスミドの何れかでHEK293T細胞を一過性に形質移入し、その後、FACS分析によって分析した。
従って、PBS中の10mMEDTAを用いて、2×105の形質移入された細胞を採集し、FACS緩衝液(PBS、3%FCS、0.4%アジ化物)中に再懸濁し、96ウェルの丸底プレート上に播種した。上清を除去するための1000rpmでの3分間の遠心後、抗HB−EGF抗体希釈(100μL/ウェル)中に細胞を再懸濁し、4℃で45分間温置した。FACS緩衝液で細胞を2回洗浄し、FACS緩衝液中に1:100希釈された二次抗体(100μL/ウェル)ロバ抗ヒト−PE(Jackson)とともに再懸濁した。4℃、暗所で30分間、細胞懸濁物を温置し、FACS緩衝液で2回洗浄し、分析した(FACS, Beckman Coulter)。
アムフィレギュリン(R & D systems, 濃度PBS中1ng/mL, 10ng/mL, 100ng/mL)の異なる濃度を、96ウェルプレート(Nunc, Maxisorp)中にて、4℃で一晩被覆した。洗浄緩衝液(PBS+0.05%Tween20;150μL/ウェル)でプレートを洗浄した後(6回)、室温で4時間、ブロッキング緩衝液(PBS+0.5%BSA、100μL/ウェル)とともにプレートを温置した。プレートを洗浄緩衝液で6回洗浄した。一次抗体として、抗体希釈緩衝液(0.5%BSA、0.05%Tween20、5mMEDTAを含有するPBS)中の5μg/mLの精製ヒト抗HB−EGF抗体を使用し、室温で90分間温置した。洗浄緩衝液でプレートを6回洗浄し、二次抗ヒト−POD(Dianova)抗体を添加し(PBS、0.5%BSA、0.05%Tween20、5mMEDTA中の1:10000)、室温で60分間温置した。
抗HB−EGFMabU2−42.2、U2−39.1、U2−45.3、U2−26.2及びU2−34.1に対するKd値の速度論的排除アッセイ分析
KinExA技術を用いて、ヒトHB−EGFへのmAbU2−42.2、U2−39.1、U2−45.3及びU2−26.2及びU2−34.1の結合のKDを測定した。この目的のために、KinExA3000装置を使用した。全てのmAb滴定に関して、4℃で一晩、50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.0中のHB−EGF(約29μg)とアズラクトンビーズ50mg結合した。ビーズへのHB−EGFの連結後、ビーズを遠心し、ブロッキング緩衝液(1MTris緩衝液、pH8.3、10mg/mLBSA)を用いて1回洗浄し、再び遠心し、次いで、ビーズの表面上に存在する残存する反応性アズラクトン基を全て遮断するために、約23℃で1から2時間、ブロッキング緩衝液中で温置した。ブロッキングの後、標準的なKinExAビーズ容器にビーズを移し、装置上に配置した。
抗体親和性スキャッチャード分析の測定
間接的FACSスキャッチャード分析によって、本明細書に提供されている抗体の親和性測定を行った。この分析を実施するために、PBS中の10mMEDTAを用いて、目的の2×105細胞を採集し、FACS緩衝液(PBS、3%FCS、0.4%アジ化物)中に再懸濁し、96ウェル丸底プレート上に播種した。上清を除去するために、1000rpmで3分間遠心した後、20μg/mLから開始し、1:2希釈工程で希釈された抗HB−EGF抗体希釈(100μL/ウェル)中に細胞を再懸濁した。細胞懸濁物を4℃で45分間温置し、FACS緩衝液で2回洗浄し、FACS緩衝液中に1:100希釈された二次抗体(100μL/ウェル)ロバ抗ヒト−PE(Jackson)とともに再懸濁した。4℃、暗所で30分間、細胞懸濁物を温置し、FACS緩衝液で2回洗浄し、分析した(FACS, Beckman Coulter)。
アムフィレギュリンへの抗HB−EGFMabU245.3結合に対するKd値の速度論的排除アッセイ分析
KDを求めるために、KD調節された滴定曲線を実施した。4.4nMの名目mAb結合部位濃度を含有する12の溶液をアムフィレギュリンの漸増濃度で滴定した。各溶液は10mLの合計容量を有し、約23℃で30から36時間平衡化させた。容積測定用ガラス製品を用いて、滴定用の全ての溶液を調製し、アムフィレギュリン濃度を1.23μMから24pMまで変動させた。これらの溶液の分析のために使用される装置法は、ガラス毛細管中にビーズを充填し、3つ組みで、1分間(0.25mL)、0.25mL/分でビーズカラムを通して、平衡化された溶液を流すビーズ充填工程からなった。続いて、ビーズ上に捕捉された遊離のmAb結合部位を標識するために、0.5mL/分で2分間、ビーズパックを通して、684pMの蛍光標識されたcy−5ヤギ抗ヒト(Fc特異的)ポリクローナル抗体を流した。ビーズパックからの蛍光発光を670nmで、620nmの励起を用いて測定した。
上位の抗体調製物に対する選択基準
上位の抗体調製物を同定するために、以下の基準を使用した。TMPSを阻害する強度、抗体がEGF受容体及びHER4のチロシンリン酸化を阻害する程度を観察することによって測定されたHB−EGFを直接阻害する強度、HB−EGFに対する抗体の親和性、他の分子に対する抗体の交叉反応性及びエピトープの特徴。
抗Hb−Egf抗体はHuvec細胞増殖及び管形成のHB−EGF刺激を阻害する
本実施例は、HB−EGFがヒト血管内皮細胞(HUVEC)増殖を刺激するのに対して、本明細書に提供されている抗HB−EGF抗体は基底HUVEC細胞増殖を阻害することを示す。また、本実施例によって示されているように、抗HB−EGF抗体は、新血管新生に対するインビトロモデルであるHUVEC管形成を阻害する。HUVEC増殖及び/又は血管新生を阻害する抗体調製物は、癌を治療するために有用であるのみならず、望ましくない血管新生(例えば、糖尿病性網膜症)を伴う非癌性症状を治療するためにも有用である。
FACS分析によって、ヒト内皮細胞上のHB−EGF発現を測定した。従って、PBS中の10mMEDTAを用いて目的の2×105細胞を採集し、FACS緩衝液(PBS、3%FCS、0.4%アジ化物)中に再懸濁し、96ウェル丸底プレート上に播種した。1000rpmで3分間遠心した後、上清を除去し、抗HB−EGF抗体希釈物(100μL/ウェル、10μg/mL抗HB−EGF抗体)中に細胞を再懸濁し、4℃で45分間温置した。FACS緩衝液で細胞を2回洗浄し、FACS緩衝液中に1:100希釈された二次抗体(100μL/ウェル)抗ヒト−PE(Jackson)とともに再懸濁した。4℃、暗所で30分間、細胞懸濁物を温置し、FACS緩衝液で2回洗浄し、分析した(FACS, Beckman Coulter)。
図30中のFACS分析によって示されているように、HUVEC上にHB−EGFが発現される。細胞増殖検査の結果が、図32AからBに提供されている。図32Aに示されているように、HB−EGFは、HUVEC細胞増殖を約38%刺激する。しかしながら、抗HB−EGF抗体調製物U2−42、U2−39又はU2−45を添加すると、細胞増殖のこのような刺激は、約8%から14%阻害される(図31B)。このアッセイにおいて、U2−39抗HB−EGF抗体調製物が、阻害の最も高いレベルを与えた。
抗HB−EGF抗体はHB−EGFによって刺激されるコロニー形成及び基底コロニー形成を阻害する
本明細書中に提供されている抗体が足場非依存性細胞増殖を阻害する能力を調べるために、軟寒天アッセイを実施した。軟寒天コロニー形成アッセイは、形質転換された細胞のみが軟寒天中で増殖することができるので、このような形質転換された細胞を検査するための標準的なインビトロアッセイである。
抗HB−EGF抗体はインビボで腫瘍増殖を阻害する
図37は、SCIDマウスを用いた異種移植実験において形成された膵臓のBxPC3腫瘍の平均容積を図示している。図示されているように、ビヒクル対照と比較した場合に、確立された腫瘍増殖は、抗体調製物U2−42及び/又はU2−39の存在下において著しく阻害される。図38Aにおいて、抗HB−EGF抗体U2−42、U2−39及びU2−45は、EFO−27HB−EGFクローン58細胞の確立された増殖をインビボで阻害することが示されている。腫瘍増殖阻害の効果は用量依存的であることが示され得、25mg/kgが高度に有効な処理であったのに対して、1又は5mg/kgなど、より用量が低いほど効率性は低くなった(図38B)。
抗egfr抗体であるErbituxを用いた併用療法における抗HB−EGF抗体
図35は、抗HB−EGF抗体を用いたEFO−27HB−EGFcl.58細胞の単一薬剤阻害が中度から強度であることを示している。しかしながら、抗HB−EGF及び抗EGFR抗体の用量調節された組み合わせにおいて、コロニー形成の阻害は極めて効果的である。さらに、インビボ異種移植片増殖は、抗HB−EGF及び抗EGFR抗体の組み合わせによって強く阻害され、卵巣癌腫瘍増殖の完全な退行がもたらされる(図38C)。
様々な癌細胞種上でのHB−EGF発現
ヒト細胞株上でのHB−EGF発現をFACS分析によって測定した。この分析を実施するために、PBS中の10mMEDTAを用いて、2×105細胞を採集し、FACS緩衝液(PBS、3%FCS、0.4%アジ化物)中に再懸濁し、96ウェルの丸底プレート上に移した。上清を除去するための1000rpmでの3分間の遠心後、抗HB−EGF抗体希釈(100μL/ウェル)中に細胞を再懸濁し、4℃で45分間温置した。FACS緩衝液で細胞を2回洗浄し、FACS緩衝液中に1:100希釈された二次抗体(100μL/ウェル)ロバ抗ヒト−PE(Jackson)とともに再懸濁した。4℃、暗所で30分間、細胞懸濁物を温置し、FACS緩衝液で2回洗浄し、分析した(FACS, Beckman Coulter)。
免疫組織化学及びELISAによる組織及び体液中のHB−EGFを検出するための抗HB−EGF
抗HB−EGF抗体U2−42及びU2−39がヒトの固定された試料中に発現されたHB−EGFを染色する能力に関して、抗HB−EGF抗体U2−42及びU2−39を検査した。図39Aに示されているように、両抗体は、ヒト腎臓尿細管細胞の顕著な膜及び細胞質染色を示すのに対して、対照は一切の染色を示さない。患者組織試料中でのHB−EGFの免疫組織化学的検出に加えて、HB−EGFは様々な体液中に成長因子として放出される。コーティング試薬としてのヒト抗HB−EGF抗体に基づいて、40pg/mLを下回るレベルまで、液体試料中のHB−EGFを検出するELISAが確立された(図39B)。
抗体の正準クラス
最後の実施例に記載されているように、上位抗体をコードする遺伝子の配列決定を行った。抗体を正準クラスに割り当てるために、この配列データを使用した。
抗HB−EGF抗体のエピトープマッピング
本実施例は、抗体調製物によって認識されるエピトープのマッピングを記載する。
PCR増幅によって、HeLamRNAからヒトHB−EGFcDNAを単離し、Igκシグナルペプチド配列を用いて、myc−His融合タンパク質として、pSecTAgベクター中に成熟HB−EGF配列をクローニングした。成熟HB−EGFポリペプチドを293T細胞中に発現させ、培地中に分泌した。
U2−39、U2−42、U2−45、U2−26及びU2−19抗体調製物の全てが不連続なエピトープを認識する。抗体の何れもが、HB−EGFの短縮形態を認識しない。
ヒトプロHB−EGFのEGF様ドメイン内の1から4つの残基をマウスプロHB−EGF中に本来見出される対応するアミノ酸残基と置換することによって、12の独立した変異をHB−EGF中に作製した。
抗HB−EGF抗体の中心的要素の配列
本実施例は、図1から21中の抗体調製物の配列を提供する。
引っ掻きアッセイ−CLS354上皮扁平上皮癌細胞(口)のHB−EGF誘導性遊走の阻害
本発明の抗体がなければHB−EGFによって直接誘導される細胞の遊走を、本発明の抗体が遮断するかどうかを調べるために、引っ掻き実験を行った。
遊出アッセイ−デトロイト562上皮癌細胞(咽頭)のHB−EGF誘導性遊走の阻害
本発明の抗体がなければHB−EGFによって直接誘導される細胞遊走を、本発明の抗体が遮断するかどうかを調べるために、遊出実験を行った。
球状体を基礎とする細胞血管新生アッセイ−VEGFによって刺激された上皮細胞出芽の阻害
本発明の抗体がコラーゲンマトリックス中でのVEGF誘導性内皮細胞(EC)の出芽を阻害することができるかどうかを調べるために、球状体を基礎とする細胞血管新生アッセイを行った。球状体を一晩凝集させるために、プラスチック皿の上での懸滴中に、500細胞で、一次ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を播種した。コラーゲン溶液0.9mL(2mg/mL)中に50ECの球状体を播種し、重合させるために、24ウェルプレートの各ウェル中にピペット操作で添加した。重合前のコラーゲン溶液(異なる濃度)中に、本発明の抗体U2−39を直接混合し、重合されたゲルの上部に10倍濃縮された作業希釈液100μLをピペット操作で添加することによって、成長因子VEGF−A(25ng/mL)を30分後に添加した。37℃で24時間、プレートを温置し、4%パラホルムアルデヒドを添加することによって固定した。倒立顕微鏡及びデジタル画像化ソフトウェアAnalysis3.2を用いて、球状体当りの累積出芽長を測定する画像解析システムによって、EC球状体の出芽強度を定量した。
ヒト腫瘍異種移植試料の免疫組織化学(IHC)分析−インビボでの腫瘍のCD31染色の阻害
インビボでの血管新生の阻害に対する本発明の抗体U2−39の効力を調べるために、免疫組織化学分析によって、U2−39又はErbituxで処理されたヒト腫瘍異種移植片を分析した。
インビボ卵巣癌異種移植モデル−シスプラチン及びアバスチンとのU2−39の組み合わせ治療
単独療法として、又はシスプラチン若しくはアバスチンと組み合わせて投与された本発明の抗体の抗腫瘍効率を評価するために、卵巣癌異種移植研究を行った。
7週齢の雌のC.B−17SCIDマウスの左脇腹中に、PBS/Matrigel(1:1)100μL中の3×106EFO27−CI58細胞を皮下注射した。75と175mm3の間の平均腫瘍容積の腫瘍を有するマウスを、10匹の動物を含むグループへ無作為に振り分けた。25mg/kgのU2−39、25mg/kgアバスチン又は5mg/kgのシスプラチン又は対照ビヒクルPBSの毎週投薬により動物の腹腔内を処理した。アバスチンとのU2−39の組み合わせはそれぞれ12.5mg/kgで与えられ、シスプラチンとのU2−39の組み合わせは5mg/kgシスプラチンとともに25mg/kg抗体で与えられた。原発性腫瘍サイズを週3回測定した。カリパスでの測定後、W2×L/2(L=長さ及びW=腫瘍の垂直幅)に従って、腫瘍のサイズを計算した。500mm3に進行するための時間を確定するために、Kaplan−Meier対数ランク法を使用した(統計学的理由のために、「事象」として定義した。)。
Claims (38)
- (a)配列番号207のCDRL1、配列番号225のCDRL2、配列番号257のCDRL3、配列番号292のCDRH1、配列番号323のCDRH2、配列番号361のCDRH3を含むか、又は
(b)配列番号210のCDRL1、配列番号221のCDRL2、配列番号260のCDRL3、配列番号292のCDRH1、配列番号320のCDRH2、配列番号362のCDRH3を含むか、又は
(c)配列番号213のCDRL1、配列番号230のCDRL2、配列番号263のCDRL3、配列番号293のCDRH1、配列番号324のCDRH2、配列番号364のCDRH3を含む、HB−EGFに特異的に結合する単離された抗体又は該抗体の抗体断片。 - a)配列番号121のV L および配列番号172のV H 、又は
b)配列番号124のV L および配列番号175のV H 、又は
c)配列番号127のV L および配列番号178のV H
を含む、請求項1に記載の単離された抗体又は抗体断片。 - 前記抗体又は抗体断片がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異的抗体又はこれらの抗体断片である請求項1又は2に記載の単離された抗体又は抗体断片。
- 前記抗体断片がFab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、Fv断片、ダイアボディ又は一本鎖抗体分子である請求項3に記載の単離された抗体又は抗体断片。
- 前記抗体がヒト抗体である請求項3に記載の単離された抗体又は抗体断片。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項3に記載の単離された抗体又は抗体断片。
- 前記抗体又は抗体断片がIgG1型、IgG2型、IgG3型又はIgG4型である請求項1又は2に記載の単離された抗体又は抗体断片。
- 前記抗体がIgG2型又はIgG4型である請求項7に記載の単離された抗体又は抗体断片。
- 前記抗体又は抗体断片が標識基に連結されている、請求項1から8の何れかに記載の単離された抗体又は抗体断片。
- 前記標識基が放射性同位体、放射性核種、蛍光性基、酵素基、化学発光性基又はビオチニル基である請求項9に記載の単離された抗体又は抗体断片。
- 前記抗体又は抗体断片がエフェクター基に連結されており、前記エフェクター基が放射性同位体、放射性核種、毒素、治療性基又は化学療法基である請求項1から8の何れかに記載の単離された抗体又は抗体断片。
- 前記治療基又は化学療法基がカルケアマイシン、アウリスタチン−PE、ゲルダナマイシン又はマイタナシンである請求項11に記載の単離された抗体又は抗体断片。
- 前記抗体又は抗体断片がHB−EGFによって媒介されるシグナル伝達を少なくとも部分的に低下させる請求項1から8の一項に記載の単離された抗体又は抗体断片。
- 請求項1から8の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片をコードする核酸分子。
- 前記核酸分子が調節配列へ作用可能に連結されている請求項14に記載の核酸分子。
- 請求項14又は15に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項14もしくは15に記載の核酸分子、又は請求項16に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1から8の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片をインビトロで作製する方法であって、前記抗体又は抗体断片を分泌する宿主細胞から前記抗体又は抗体断片を調製する工程を含む、方法。
- 請求項1から8の何れか一項に記載の少なくとも1つの抗体又は抗体断片と、医薬として許容される、担体及び/又は希釈剤及び/又は佐剤を含む医薬組成物。
- さらなる活性因子をさらに含む請求項19に記載の医薬組成物。
- 少なくとも1つのさらなる活性因子が抗新生物剤である請求項20に記載の医薬組成物。
- 抗新生物剤が抗腫瘍抗体であるか、又は抗新生物剤がシスプラチンもしくはアバスチンである請求項21に記載の医薬組成物。
- 抗腫瘍抗体が受容体チロシンキナーゼもしくはEGFRに対する抗体である請求項22に記載の医薬組成物。
- 過剰増殖性疾患の診断、予防又は治療に用いるための、請求項19から23の何れかに記載の医薬組成物。
- 前記過剰増殖性疾患が癌である請求項24に記載の医薬組成物。
- 前記過剰増殖性疾患がHB−EGF発現を伴うか、又は前記過剰増殖性疾患がかく乱された成長因子受容体の活性化を伴うかもしくは該活性化に付随して起こる請求項24又は25に記載の医薬組成物。
- 前記かく乱された成長因子受容体の活性化が、病的に増大した成長因子受容体の活性化である請求項26に記載の医薬組成物。
- 前記病的に増大した成長因子受容体の活性化が、Gタンパク質及び/もしくはGタンパク質共役型受容体の活性の病的増加を伴うか、又は該病的増加によって引き起こされる請求項27に記載の医薬組成物。
- 前記癌が、乳癌、胃腸癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎臓癌、大腸癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膀胱癌、神経膠腫、悪性黒色腫、癌腫、他のHB−EGF発現又は過剰発現癌及び腫瘍転移の形成からなる群から選択される、請求項25に記載の医薬組成物。
- 前記癌腫が上皮又は扁平上皮腫である請求項29に記載の医薬組成物。
- 過剰増殖性疾患の診断、予防又は治療用医薬組成物の製造のための、請求項1から8に記載の少なくとも1つの抗体又は抗体断片の使用。
- 前記過剰増殖性疾患が請求項25、26、29又は30に記載されている過剰増殖性疾患である請求項31に記載の使用。
- 請求項1から8に記載の抗体、請求項14もしくは15に記載の核酸又は請求項16に記載のベクターを含むキット。
- 少なくとも1つのさらなる活性因子を含む請求項33に記載のキット。
- さらなる活性因子が抗新生物剤である請求項34に記載のキット。
- 単独療法として、又はさらなる医薬組成物と組み合わせて投与されるべき、請求項24から30の何れかに記載の医薬組成物。
- さらなる医薬組成物が抗新生物剤を含む請求項36に記載の医薬組成物。
- 抗新生物剤がシスプラチン又はアバスチンである請求項37に記載の医薬組成物。
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