CN101970485B - 肝素结合表皮生长因子样生长因子抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本文中提供了抗原结合蛋白，例如人和/或单克隆抗体，其具有对肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)的亲和力并且中和该生长因子的生物学功能。

Description

肝素结合表皮生长因子样生长因子抗原结合蛋白
背景
人表皮生长因子受体(HER)家族包括称为HER1(或erbB1)、HER2(或erbB2)、HER3(或erbB3)和HER4(或erbB4)的4种不同的受体酪氨酸激酶。HER1通常也称为表皮生长因子受体(EGFR)。除了HER3以外，这些受体都具有磷酸受体(phospho-acceptor)靶特异性内在蛋白酪氨酸激酶活性。HER家族的成员在大多数表皮细胞以及在许多不同的肿瘤细胞类型中表达。例如，HER家族的受体在上皮来源以及间充质来源的肿瘤细胞中表达。此外，HER受体酪氨酸激酶参与细胞增殖和血管生成，这与疾病例如癌症相关。例如，EGFR频繁在乳腺癌、肝癌、肾癌、白血病、支气管癌、胰腺癌和胃肠癌例如结肠癌、直肠癌或胃癌中过表达或被异常激活。高水平的EGF受体还与不良预后和对治疗的应答相关(Wright等人，1992，Br.J.Cancer 65：118-121)。因此，中断来往于这些激酶之间的信号转导可具有抗增殖作用，从而对许多癌症和肿瘤细胞类型具有治疗作用。
受体酪氨酸激酶的酶促活性可通过过表达和/或通过配体介导的二聚化来刺激(Heldin，1995，Cell 80：213-223)。受体同二聚体和异二聚体的激活导致受体上的酪氨酸残基的磷酸化，这反过来磷酸化其他分子(包括细胞内蛋白质)的酪氨酸残基。(Ullrich等人，1990，Cell 61：203-212)。之后细胞内信号转导途径例如牵涉丝裂原活化蛋白激酶(MAP激酶)(Dhillon等人，2007，Oncogene 26：3279-3290)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3激酶)的信号转导途径被激活。已显示此类途径的激活增加细胞增殖和抑制细胞凋亡，还已显示小分子抑制剂或单克隆抗体对由HER家族成员介导的信号转导的抑制抑制了细胞增殖和促进了细胞凋亡(Prenzel等人，2001，Endocr.Relat.Cancer 8：11-31)。
肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)是22kDa的O-糖基化蛋白质(Higahiyama等人，1992，J Biol Chem 267：6205-6212)。HB-EGF以其成熟形式结合并且激活EGF受体和HER4(Elenius等人，1997，EMBO 16：1268-1278)。HB-EGF是G蛋白偶联受体(GPCR)诱导的细胞增殖(通过称为三重膜传递信号转导(triple-membrane passingsignaling，TMPS)的过程)的至关重要的介体(Prenzel等人，1999，Nature 402：884-888，综述于Fischer等人2003，Biochem.Soc.Trans.31：1203-1208中)。已显示HB-EGF促进细胞增殖以及血管生成(Zushi等人，1997，Int J Cancer 73：917-923；Abramovitch等人，1998，FEBS letters 425：441-447)。还显示HB-EGF在许多癌症中起着至关重要的作用，即，其与卵巢肿瘤的侵袭性行为相关。(Tanaka等人，2005，Clin.Cancer Res.11：4783-4792)。此外，HB-EGF是卵巢癌细胞系异种移植物肿瘤形成所必需的。HB-EGF(野生型或分泌形式)的过表达加速了SKOV3和RMG-1细胞中的肿瘤形成。然而，使用siRNA对内源HB-EGF的抑制消除或延迟了SKOV3和RMG-1细胞的肿瘤形成。Miyamoto，2004，Cancer Res.64：5720。如由上述证据所表明的，HB-EGF表达或活性的抑制可抑制肿瘤形成。
类似地，HB-EGF在一些癌症包括人膀胱癌中是不良预后的标志物(Thogersen等人，2001，Cancer Res.61：6227-6233)。体外研究表明经工程改造表达HB-EGF(野生型，可溶性的或不可切割的)的人EJ膀胱细胞展示生长的增加、不依赖锚定的生长和VEGF的产生以及增强的迁移。当将此类表达HB-EGF的EJ膀胱细胞移植入裸小鼠时，在肿瘤中观察到增加的肿瘤形成、血管的大小和密度。(Ongusaha，2004，Cancer Res.64：5283-5290)。
概述
本文中提供了结合HB-EGF的分离的抗原结合蛋白。此类抗原结合蛋白中的一些包含A)一个或多个由下列组成的轻链互补决定区(CDRL)：(i)选自SEQ ID NO：189-217的CDRL1；(ii)选自SEQ IDNO：218-233的CDRL2；(iii)选自SEQ ID NO：234-274的CDRL3；或(iv)包含一个或多个不超过4个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的(i)、(ii)或(iii)的CDRL。备选地，HB-EGF抗原结合蛋白可包含B)一个或多个由下列组成的重链互补决定区(CDRH)：(i)选自SEQ ID NO：275-299的CDRH1；(ii)选自SEQ ID NO：300-331的CDRH2；(iii)选自SEQ ID NO：332-372的CDRH3；或(iv)包含一个或多个不超过4个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的(i)、(ii)或(iii)的CDRH。
在一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白可包含1、2或更多个上述轻链CDRL和1、2或更多个上述重链CDRH。在一个方面中，分离的抗原结合蛋白包含CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。在另一个方面，A)的分离的抗原结合蛋白(同上)选自：来自SEQ IDNO：189-217的CDRL1；来自SEQ ID NO：218-233的CDRL2；来自SEQ IDNO：234-274的CDRL3；和包含一个或多个不超过2个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的上述(i)、(ii)或(ii)的CDRL。此外B)的所述重链CDRH(同上)选自：来自SEQ ID NO：275-299的CDRH1；来自SEQ IDNO：300-331的CDRH2；来自SEQ ID NO：332-372的CDRH3和包含一个或多个不超过2个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的上述的CDRH。此外，分离的抗原结合蛋白可包含一个或多个A)的轻链CDRL(同上)；和一个或多个B)的重链CDRH(同上)。
在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含选自下列的CDRL：来自SEQ ID NO：189-217的CDRL1；来自SEQ ID NO：218-233的CDRL2；来自SEQ ID NO：234-274的CDRL3。抗原结合蛋白还可包含选自下列的CDRH：来自SEQ ID NO：275-299的CDRH1；来自SEQ ID NO：300-331的CDRH2；来自SEQ ID NO：332-372的CDRH3。备选地，分离的抗原结合蛋白可包含一个或多个A)中所列的轻链CDRL(同上)，和一个或多个B)的重链CDRH(同上)。特别地，分离的抗原结合蛋白可包含SEQ ID NO：189-217的CDRL1、SEQ ID NO：218-233的CDRL2和SEQID NO：234-274的CDRL3和/或SEQ ID NO：275-299的CDRH1、SEQ IDNO：300-331的CDRH2和SEQ ID NO：332-372的CDRH3。
在一个方面中，分离的抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID NO：94-141的氨基酸序列具有至少80％、90％或100％的序列同一性的轻链可变区(VL)。在另一个方面，分离的抗原结合蛋白包含与选自SEQ IDNO：142-186的氨基酸序列具有至少80％、90％或100％的序列同一性的重链可变区(VH)。
在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白特异性识别至少HB-EGF的包含IHGE的表位和/或EGF样结构域。
此外，本文中还提供了与如上所述的结合HB-EGF的分离的抗原结合蛋白竞争结合的分离的抗原结合蛋白。
本文中还提供了分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白结合HB-EGF并且包含A)一个或多个选自下列的轻链CDR(CDRL)：(i)与SEQID NO：189-217具有至少80％或至少90％的序列同一性的CDRL1；(ii)与SEQ ID NO：218-233具有至少80％或至少90％的序列同一性的CDRL2；和(iii)与SEQ ID NO：234-274具有至少80％或至少90％的序列同一性的CDRL 3。备选地，结合HB-EGF的分离的抗原结合蛋白包含B)一个或多个选自下列的重链CDR(CDRH)：(i)与SEQ ID NO：275-299具有至少80％或至少90％的序列同一性的CDRH1；(ii)与SEQ ID NO：300-331具有至少80％或至少90％的序列同一性的CDRH2；和(iii)与SEQ ID NO：332-372具有至少80％或至少90％的序列同一性的CDRH3。分离的抗原结合蛋白还可包含C)一个或多个A)的轻链CDRL和一个或多个B)的重链CDRH。
在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白结合HB-EGF并且包含：A)选自下列的轻链互补决定区(CDRL)：(i)选自SEQ ID NO：234-274的CDRL3；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRL3相异于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRL3；和(iii)选自下列的CDRL3氨基酸序列：
X1QX2X3X4X5PX6X7(SEQ ID NO：1089)，其中
X1是I或M，
X2是A、G或S，
X3是I或T，
X4是H或Q，
X5是F、L或W，
X6是C、I、H、L或T，
X7是S或T；
QQX1X2X3X4X5IT(SEQ ID NO：1090)，其中
X1是I或S，
X2是F或Y，
X3是F、I、S或Y，
X4是A、S或T，
X5是P或S；
X1X2X3X4X5X6X7X8T(SEQ ID NO：1091)，其中
X1是L或Q，
X2是K、N或Q，
X3是A、H、S或Y，
X4是H、N或Y，
X5是N、S或T，
X6是A、F、I、T、V或Y，
X7是P或无氨基酸，
X8是F、L或P；
QX1X2DX3LPX4X5(SEQ ID NO：1092)，其中
X1是H或Q，
X2是C或Y，
X3是D、I、N、S或Y，
X4是F、I或L，
X5是A、S或T；
QQX1X2X3X4PX5X6X7(SEQ ID NO：1093)，其中
X1是H或Y，
X2是G或N，
X3是N或S，
X4是S或W，
X5是P或无氨基酸，
X6是R或W，
X7是S或T；或
X1QYX2X3X4X5X6X7F(SEQ ID NO：1094)，其中
X1是H或Q，
X2是F或Y，
X3是G、I或S，
X4是F、I或T，
X5是M、P、S或T，
X6是F、L、R或W，
X7是S或T。
分离的抗原结合蛋白还包含B)选自下列的重链互补决定区(CDRH)：(i)选自SEQ ID NO：332-372的CDRH3；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRH3相异于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRH3；和iii)选自下列的CDRH3氨基酸序列：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11DX12(SEQ ID NO：1035)，其中
X1是E或S，
X2是D、G或无氨基酸，
X3是D、N或无氨基酸，
X4是G或无氨基酸，
X5是G或无氨基酸，
X6是W、Y或无氨基酸，
X7是I、N或Y，
X8是A或Y，
X9是G、V或Y，
X10是A、F或G
X11是F、L或M，
X12是V或Y；
QX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11YX12X13X14DX15(SEQ ID NO：1036)，其中
X1是G或无氨基酸、
X2是K、L或Y，
X3是A、G或S，
X4是S、V或Y，
X5是A或G，
X6是G或无氨基酸，
X7是T或无氨基酸，
X8是S或无氨基酸，
X9是Y或无氨基酸，
X10是W或Y，
X11是G、S或Y，
X12是F或Y，
X13是G或无氨基酸，
X14是M或无氨基酸，
X15是V或Y；
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO：1037)，其中
X1是D、G、L、S或无氨基酸，
X2是G、H、W、Y或无氨基酸，
X3是A、F、W、Y或无氨基酸，
X4是D、G、Q、T或无氨基酸，
X5是G、I、Q、S或无氨基酸，
X6是A、D、N、Q、S或无氨基酸，
X7是G、Y或无氨基酸，
X8是D、Y或无氨基酸，
X9是Y或无氨基酸，
X10是A、E、N或Y，
X11是G、P、T、V或Y，
X12是F或I，
X13是D或Q，
X14是C、H、V或Y；
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17DX18(SEQ ID NO：1038)，
其中
X1是E、D或无氨基酸，
X2是G、R或无氨基酸，
X3是I、V、Y或无氨基酸，
X4是A、G、L或N，
X5是A、G、V或W，
X6是A、N、R或T，
X7是G、N、P或无氨基酸，
X8是G、T或无氨基酸，
X9是A或无氨基酸，
X10是D、E或无氨基酸，
X11是S、Y或无氨基酸，
X12是G、Y或无氨基酸，
X13是N、Y或无氨基酸，
X14是Y或无氨基酸，
X15是D、Y或无氨基酸，
X16是A、G或无氨基酸，
X17是F或M，
X18是I、V或Y；
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23(SEQ ID NO；1039)，其中
X1是A、D、G、S或T，
X2是A、E、G、L、N、R、Y或无氨基酸，
X3是A、G、L、N、R、T、Y或无氨基酸，
X4是D、G、R、S、V、Y或无氨基酸，
X5是A、G、I、S、V、Y或无氨基酸，
X6是F、G、L、R、V或无氨基酸，
X7是L、T、Y或无氨基酸，
X8是Y或无氨基酸，
X9是Y或无氨基酸，
X10是D或无氨基酸，
X11是S或无氨基酸，
X12是S或无氨基酸，
X13是G或无氨基酸，
X14是D、L、M、S、Y或无氨基酸，
X15是H、I、P、V、W或无氨基酸，
X16是F、G、L、R、S、Y或无氨基酸，
X17是D、F、V、W、Y或无氨基酸，
X18是C、F、L、P、S或Y，
X19是D、F、G或Y，
X20是A、C、G、P、R、V或Y，
X21是F、L、M、S或无氨基酸，
X22是A、D或无氨基酸，
X23是I、L、V、Y或无氨基酸；
X1YSSGWX2X3YGX4X5DX6(SEQ ID NO：1040)，其中
X1是M或V，
X2是S或无氨基酸，
X3是F或无氨基酸，
X4是V或无氨基酸，
X5是F或M，
X6是V或Y；或
RX1X2X3PFX4Y(SEQ ID NO：1041)，其中
X1是G、H、L、N或R，
X2是E、T或W，
X3是L、N、T或V，
X4是D或E。
在另一个方面，分离的抗原结合蛋白还可包含A)选自下列的CDRL：(i)选自SEQ ID NO：189-217的CDRL1；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRH1相异于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRL1；或(iii)选自下列的CDRL1氨基酸序列：
X1SSQSLX2X3SDGX4TYLX5(SEQ ID NO：1106)，其中
X1是K或R，
X2是L或V，
X3是H或Y，
X4是K或N，
X5是N、S或Y；
RASQX1ISX2YLN(SEQ ID NO：1107)，其中
X1是R、S或T，
X2是R或S；
RASQX1IX2X3X4LX5(SEQ ID NO：1108)，其中
X1是D、G、S或T，
X2是A、R或S，
X3是H、I、N、R、S或T，
X4是D、W或Y，
X5是A、G或N；
QASQDIX1X2X3LN(SEQ ID NO：1109)，其中
X1是S或T，
X2是D或N，
X3是S或Y；
RASQX1VX2X3X4X5LA(SEQ ID NO：1110)，其中
X1是S或T，
X2是I或S，
X3是R或S，
X4是S、N或无氨基酸，
X5是Y或无氨基酸；或
KSSQX1X2LX3X4SNNKNYLX5(SEQ ID NO：1111)，其中
X1是N或S，
X2是I或V，
X3是D或Y，
X4是N、R或S，
X5是A或V；
(iv)选自SEQ ID NO：218-233的CDRL2；(v)在氨基酸序列上与(iv)的CDRL2相异于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRL2；或(vi)选自下列的CDRL2氨基酸序列：
X1X2SNX3X4S(SEQ ID NO：1112)，其中
X1是E或K、
X2是I或V，
X3是R或W，
X4是D或F；
X1X2SX3LQS(SEQ ID NO：1113)，其中
X1是A或T，
X2是A、E或V，
X3是S或T；
X1ASX2LQS(SEQ ID NO：1114)，其中
X1是A或V，
X2是S或T；
DASX1LET(SEQ ID NO：1115)，其中
X1是I或N；
GASSRAT(SEQ ID NO：223)；或
WASX1RES(SEQ ID NO：1116)，其中
X1是A或T。
分离的抗原结合蛋白还可包含B)选自下列的CDRH：(i)选自SEQID NO：275-299的CDRH1；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRH1相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRH1；(iii)选自下列的CDRH1氨基酸序列：
GYTX1TX2X3X4X5X6(SEQ ID NO：1095)，其中
X1是F或L，
X2是E、G或S，
X3是H、L或Y，
X4是G、S或Y，
X5是I或M，
X6是H或S；
GYX1FTSYWIG(SEQ ID NO：1096)，其中
X1是R或S；
GFTFX1SX2X3MH(SEQ ID NO：1097)，其中
X1是R或S，
X2是H或Y，
X3是D或G；
GFX1FSX2YX3MX4(SEQ ID NO：1098)，其中
X1是P或T，
X2是A、R或S，
X3是A或S，
X4是N或S；
GX1SX2SX3X4X5X6X7WX8(SEQ ID NO：1099)，其中
X1是D或G，
X2是F、I或V，
X3是R、S或无氨基酸，
X4是G、Y或无氨基酸，
X5是D、G、S或无氨基酸，
X6是A、S或Y，
X7是A或Y，
X8是N或S；
GFSLSNARMGVS(SEQ ID NO：279)；或
GFSLX1TGGVGVG(SEQ ID NO：1100)，其中
X1是S或N；
(iv)选自SEQ ID NO：300-331的CDRH2；(v)在氨基酸序列上与(iv)的CDRH2相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRH2；或(vi)选自下列的CDRH2氨基酸序列：
X1X2X3X4X5X6GX7TX8X9X10QKX11X12(SEQ ID NO：1101)，其中
X1是S或W，
X2是F或I，
X3是D、N或S，
X4是A或P，
X5是E、N或S，
X6是D、N或S，
X7是E、G或N，
X8是I或N，
X9是C、H或Y，
X10是A或T，
X11是F或L，
X12是D或G；
IIYPX1DSDX2RYSPSFQG(SEQ ID NO：1102)，其中
X1是D或G，
X2是A、I或T；
X1IX2X3DGSX4X5X6YX7DSVX8G(SEQ ID NO：1103)，其中
X1是F或V，
X2是S或W，
X3是D、S或Y，
X4是I、N或T，
X5是K或Q，
X6是N、R或Y，
X7是A、T或V，
X8是K或R；
X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG(SEQ ID NO：1104)，其中
X1是A、H或Y，
X2是G、R或S，
X3是G或S，
X4是G、R或S，
X5是S、T或Y，
X6是I或T；
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11YX12X13SX14KS(SEQ ID NO：1105)，其中
X1是E、R或Y，
X2是I或T，
X3是H、N或Y，
X4是C、H、S、T或Y，
X5是S或R，
X6是G或S，
X7是G、K、S或T，
X8是T或W，
X9是N或Y，
X10是N或无氨基酸，
X11是D或无氨基酸，
X12是A或N，
X13是P或V，
X14是L或V；
X1IFSNDEKSYSTSLKS(SEQ ID NO：1033)，其中
X1是H或LI；或
LIYWNX1X2KRYSPSLX3S(SEQ ID NO：1034)，其中
X1是D或V，
X2是D或E、
X3是K或R。
在另一个实施方案中，上述分离的抗原结合蛋白包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，这两个序列彼此共价连接。第一氨基酸序列还包含SEQ ID NO：234-274的CDRL 3、SEQ ID NO：218-233的CDRL2和SEQ ID NO：189-217的CDRL1，以及第二氨基酸序列包含所述SEQ IDNO：332-372的CDRH3，SEQ ID NO：300-331的CDRH2和SEQ ID NO：275-299的CDRH1。
在一个方面，分离的抗原结合蛋白可以是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。抗体片段可以是Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、双价抗体(diabody)或单链抗体分子。在一个实施方案中，本发明的分离的抗原结合蛋白是人抗体。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白是单克隆抗体。
本文中描述的分离的抗原结合蛋白，可以是下列类型的任一种：IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类型。在一个实施方案中，抗原结合蛋白是IgG2或IgG4类型。此外，可将抗原结合蛋白偶联至标记基团。此类标记基团可以是例如放射性同位素、放射性核素、荧光基团、酶基团、化学发光基团、生物素基团或预先确定的多肽基团。
在另一个实施方案中，将分离的抗原结合蛋白偶联至效应子基团例如放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗性基团或化学治疗基团。化学治疗基团可以是例如卡奇霉素、auristatin-PE、格尔德霉素、美登纳新或其衍生物。
在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白与本文中所述和请求保护的抗原结合蛋白竞争对人HB-EGF的结合。该竞争性抗原结合蛋白可以是例如单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。抗体片段可以是例如Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、双价抗体或单链抗体分子。在一个实施方案中，分离的结合蛋白是人抗体。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白是单克隆抗体。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类型。在一个实施方案中，抗原结合蛋白是IgG2或IgG4类型。在另一个实施方案中，可将本文中描述的抗原结合蛋白偶联至标记基团。标记基团的实例是放射性同位素、放射性核素、荧光基团、酶基团、化学发光基团、生物素基团或预先确定的多肽基团。在另一个实施方案中，将分离的抗原结合蛋白偶联至效应子基团例如，放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗性基团或化学治疗基团。治疗性基团或化学治疗基团的实例包括例如卡奇霉素、auristatin-PE、格尔德霉素、美登纳新或其衍生物。
在一个方面中，提供了至少部分地减少HB-EGF介导的信号转导的分离的抗原结合蛋白。
本文中还提供了编码之前所描述的分离的抗原结合蛋白的核酸分子，其中核酸分子与控制序列有效连接。在一个方面中，提供了包含上述核酸分子的载体。在另一个方面，提供了包含上述核酸分子和/或载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，提供了用于制备抗原结合蛋白的方法，其包括从分泌所述抗原结合蛋白的宿主细胞制备所述抗原结合蛋白的步骤。
在另一个实施方案中，提供了包含至少一种上述的本发明的抗原结合蛋白以及可药用的载体、稀释剂和/或佐剂的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物可包含另外的活性剂例如抗肿瘤剂。抗肿瘤剂可以是例如抗肿瘤抗体。抗肿瘤抗体的实例可以是例如抗受体酪氨酸激酶或EGFR的抗体。
在一个方面中，药物组合物用于过度增殖性疾病的诊断、预防或治疗。在另外的方面，过度增殖性疾病与HB-EGF表达相关。在另一个方面，过度增殖性疾病与被扰乱的(例如病理性增强的)生长因子受体激活相关或与其相伴，其中所述病理性增强的生长因子受体激活与G蛋白和/或G蛋白偶联受体的活性的病理性增加相关或由其引起。
在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种抗原结合蛋白和可药用的载体、稀释剂和/或佐剂，所述药物组合物用于诊断、预防或治疗癌症例如乳腺癌、胃肠癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑素瘤、其他表达或过表达HB-EGF的癌症以及肿瘤转移的形成。
在另一个实施方案中，本文中所描述的抗原结合蛋白用于制造药物组合物，所述药物组合物用于诊断、预防或治疗过度增殖性疾病。在另外的实施方案中，过度增殖性疾病与HB-EGF表达相关。
一个实施方案描述了用于诊断与HB-EGF的表达相关的病况的方法，该方法包括将样品与本文中所描述的分离的抗原结合蛋白接触，和确定HB-EGF在所述样品中的存在的步骤。在另外的实施方案中，病况是与HB-EGF表达相关的过度增殖性疾病。
另一个方面描述了用于预防或治疗患者中与HB-EGF的表达相关的病况的方法，其包括对有此需要的患者施用有效量的本文中所描述的抗原结合蛋白。在另外的方面，病况是与HB-EGF表达相关的过度增殖性疾病。在另外的方面，患者是哺乳动物患者。
在一个实施方案中，提供了包含如上所述的抗原结合蛋白、核酸分子或载体的试剂盒。在另外的实施方案中，试剂盒包含至少一种另外的活性剂，其中另外的活性剂是抗肿瘤剂。
本发明的这些和其他方面将在本文中进行更详细地描述。本发明的每一个方面可包括本发明的不同实施方案。因此预期包括一个元素或元素的组合的本发明的每一个实施方案可包括在本发明的每一个方面中。本发明的其他特征、目的和有利方面在随后的发明详述中是显然的。
附图概述
图1A-1P描述了抗原结合蛋白的不同轻链可变区。CDR1、CDR2和CDR3区标示于框中。
图2A-2O描述了抗原结合蛋白的不同重链可变区。CDR1、CDR2和CDR3区标示于框中。
图3A-3K描述了抗原结合蛋白的不同轻链的氨基酸序列。
图4A-4O描述了抗原结合蛋白的不同重链的氨基酸序列。
图5A描述了抗原结合蛋白的示例性轻链恒定区的氨基酸序列。
图5B描述了抗原结合蛋白的示例性重链恒定区的氨基酸序列。
图6A-6F描述了抗原结合蛋白的轻链可变区的不同CDR区的氨基酸序列。
图7A-7E描述了抗原结合蛋白的重链可变区的不同CDR区的氨基酸序列。
图8A-8H描述了抗原结合蛋白的轻链可变区的不同FR区的氨基酸序列。
图9A-9F描述了抗原结合蛋白的重链可变区的不同FR区的氨基酸序列。
图10A和10B描述了抗原结合蛋白的轻链可变序列的氨基酸序列的比对。CDR1、CDR2和CDR3区示于框中。
图11A和11B描述了抗原结合蛋白的重链可变序列的氨基酸序列的比对。CDR1、CDR2和CDR3区示于框中。
图12A描述了显示抗原结合蛋白的轻链可变区的亲缘关系(relatedness)的进化树。
图12B描述了显示抗原结合蛋白的轻链CDRL3区的亲缘关系的进化树。
图12C描述了显示抗原结合蛋白的重链可变区的亲缘关系的进化树。
图13A-13V描述了抗原结合蛋白的不同轻链可变区的核苷酸序列。
图14A-14C描述了抗原结合蛋白的不同重链可变区的核苷酸序列。
图15A-15M描述了抗原结合蛋白的不同轻链的核苷酸序列。
图16A-16L描述了抗原结合蛋白的不同重链的核苷酸序列。
图17A描述了抗原结合蛋白的轻链恒定区的核苷酸序列。
图17B描述了抗原结合蛋白的重链恒定区的核苷酸序列。
图18A-18F描述了抗原结合蛋白的轻链可变区的不同CDR区的核苷酸序列。
图19A-19G描述了抗原结合蛋白的重链可变区的不同CDR区的核苷酸序列。
图20A-20K描述了抗原结合蛋白的轻链可变区的不同FR区的核苷酸序列。
图21A-21K描述了抗原结合蛋白的重链可变区的不同FR区的核苷酸序列。
图22A图解说明本文中提供的不同抗HB-EGF IgG2抗体制剂抑制HB-EGF诱导的表皮生长因子受体(EGFR)的酪氨酸磷酸化所达到的程度。提供了抗体U2-1至U2-68的制剂的结果。如所说明的，单克隆抗体制剂U2-18、U2-24、U2-19和U2-42强烈地抑制EGFR的酪氨酸磷酸化。
图22B图解说明本文中提供的不同抗HB-EGF IgG4抗体制剂抑制HB-EGF诱导的表皮生长因子受体(EGFR)的酪氨酸磷酸化所达到的程度。提供了抗体U2-2至U2-66的制剂的结果。如所说明的，单克隆抗体制剂U2-39、U2-34、U2-45和U2-6强烈地抑制EGFR的酪氨酸磷酸化。
图23举例说明抗体抑制COS-7细胞中溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)诱导的EGFR的酪氨酸磷酸化。LPA是激活TMPS途径，从而导致HB-EGF的释放(进而导致EGFR的酪氨酸磷酸化)的GPCR配体。用指定的抗体预处理且用LPA刺激COS-7细胞，然后制备细胞裂解物，且通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离裂解物蛋白质。在制备印迹后，使用抗磷酸酪氨酸抗体检测磷酸化的EGFR。作为对照，如下图中所示，使用WB抗EGFR抗体检测总EGFR。如所说明的，抗HB-EGF抗体制剂U2-24、U2-19和U2-42强烈抑制LPA诱导的EGFR磷酸化。
图24图解说明本文中提供的不同抗体对HB-EGF-诱导的EGF受体的酪氨酸磷酸化的剂量依赖性抑制。在刺激SCC9鳞癌细胞之前将不同浓度的候选U2-39、U2-42和U2-45抗体制剂与HB-EGF一起预温育，然后检测EGFR的酪氨酸磷酸化的量。如所显示的，抗体U2-42和U2-39获得多达111％的抑制。对于抗体测定的IC50值分别为0.167nM(U2-39)、1nM(U2-42)和2nM(U2-45)。
图25图解说明抗HB-EGF抗体制剂对MDA-MB231细胞中经由TMPS的凝血酶诱导的EGFR磷酸化的剂量依赖性抑制。在凝血酶存在的情况下将MDA-MB231细胞与候选U2-42、U2-39和U2-45抗体制剂一起温育，然后使用实施例6中描述的方法检测EGFR的酪氨酸磷酸化的量。如所显示的，抗体U2-42和U2-39获得100％的抑制。
图26举例说明抗HB-EGF抗体制剂对PPC-1细胞中经由TMPS的LPA诱导的EGFR的酪氨酸磷酸化的剂量依赖性抑制。将PPC-1细胞与候选U2-42、U2-39和U2-45抗体制剂一起温育，然后使用实施例4中描述的方法检测LPA刺激后EGFR的酪氨酸磷酸化的量。如所显示的，抗体U2-42、U2-39和U2-45获得100％的抑制。
图27举例说明抗HB-EGF抗体制剂对鞘氨醇-1-磷酸诱导的MDA-MB231乳腺癌细胞的迁移的抑制达到100％。使用胶原I-包被的transwell(BD Falcon，8μm孔)就细胞迁移的抑制检测候选抗HB-EGF抗体制剂U2-42、U2-39和U2-45。如所显示的，抗HB-EGF抗体制剂U2-42抑制鞘氨醇-1-磷酸诱导的MDA-MB231细胞迁移大约70％，而U2-39和U2-45抗HB-EGF抗体制剂抑制MDA-MB231细胞迁移大约100％。因此，本文中提供的抗HB-EGF抗体强烈抑制MDA-MB231细胞迁移。
图28图解说明HB-EGF诱导的MCF-7乳腺癌细胞的迁移被3种抗HB-EGF抗体制剂(U2-42、U2-39和U2-45单克隆抗体制剂)抑制。
图29举例说明抗HB-EGF抗体制剂对HB-EGF诱导的HER4的酪氨酸磷酸化的剂量依赖性抑制。在刺激和检测HER4的酪氨酸磷酸化之前将U2-42.1或U2-39.1抗HB-EGF抗体制剂与HB-EGF一起温育。如所显示的，观察到对HER4的酪氨酸磷酸化的100％的抑制。注意，示于x轴的抗体的量对数减少。
图30A显示单克隆抗体制剂与来自食蟹猴(cynomolgus monkey)的HB-EGF交叉反应，如使用用表达食蟹猴HB-EGF的DNA载体转染的HEK-293细胞通过流式细胞术(FACS)所估量的。如所显示的，对于用空载体对照转染的HEK-293对照细胞观察到极低的X-平均值(1-2)。相反地，当用编码食蟹猴HB-EGF的表达盒转染HEK-293细胞时，观察到250或更高的X-平均值。
图30B显示单克隆抗体U2-45制剂与来自小鼠的HB-EGF交叉反应，如使用用表达小鼠HB-EGF的DNA载体转染的HEK-293细胞通过流式细胞术(FACS)所估量的。当用编码小鼠HB-EGF的表达盒转染HEK-293细胞时，观察到33.7的X-平均值。
图30C显示HB-EGF抗体与双调蛋白(amphiregulin)的交叉反应性的程度。
图31显示HB-EGF在人血管内皮细胞(HUVEC)上表达，如通过FACS分析所检测的。
图32A-32B显示HB-EGF刺激HUVEC细胞增殖，而抗HB-EGF抗体制剂抑制基础增殖大约8％至14％。HB-EGF刺激HUVEC细胞增殖大约38％(图32A)。然而，在加入抗HB-EGF抗体制剂U2-42、U2-39或U2-45后，基础细胞增殖被抑制大约8％至14％(图32B)。
图33A-33L举例说明抗HB-EGF抗体加速HUVEC管退化(tuberegression)。HUVEC管形成是内皮细胞血管生成的模式系统。图33A-33C提供了在不使用抗HB-EGF抗体的情况下进行的对照测定。如所显示的，HUVEC细胞连接形成许多环形结构或“管”。图33D-33F举例说明加入抗HB-EGF U2-39抗体制剂对管形成的作用。图33G-33I举例说明加入抗HB-EGF U2-42抗体制剂对管形成的作用。图33J-33L举例说明加入抗HB-EGF U2-45抗体制剂对管形成的作用。如所显示的，当存在U2-42、U2-39和U2-45抗HB-EGF抗体制剂时，可看到较少的HUVEC管，并且网络减少。
图33M图解说明在加入本文中提供的抗HB-EGF抗体制剂后HUVEC管形成的定量评估，其支持HB-EGF抗体抑制血管生成的用途。针对U2-42、U2-39或U2-45抗HB-EGF抗体制剂，将每显微镜视野的管或封闭的细胞结构的数目作图。如所显示的，当抗HB-EGF抗体不存在时可看到大约10个HUVEC管，而当加入U2-39抗HB-EGF抗体制剂时，每显微镜视野只观察到大约4个HUVEC管。在U2-42抗HB-EGF抗体制剂存在的情况下，只观察到大约1个HUVEC管。当U2-45抗HB-EGF抗体制剂存在时，只观察到6个HUVEC管。
图34A举例说明抗HB-EGF抗体抑制HB-EGF刺激的OVCAR-8卵巢癌细胞的集落形成。如所显示的，HB-EGF刺激OVCAR-8细胞形成比在HB-EGF不存在的情况下培养的对照OVCAR-8细胞显著更大的平均集落大小。然而，当在HB-EGF存在的情况下将OVCAR-8细胞与抗HB-EGFU2-39抗体一起培养时，平均集落大小减小至在无HB-EGF处理的情况下对于对照细胞观察到的基础大小。
图34B举例说明抗HB-EGF抗体抑制HB-EGF刺激的BM1604前列腺癌细胞在软琼脂中的集落形成。如所显示的，HB-EGF刺激BM1604细胞形成比在HB-EGF不存在的情况下培养的对照BM1604细胞更大数目的集落/孔。然而，当在HB-EGF存在的情况下将BM1604细胞与抗HB-EGF U2-39抗体一起培养时，平均集落大小减小至与在无HB-EGF处理的情况下对于对照细胞所观察到的大小相似的大小。抗HB-EGFU2-45和U2-42抗体部分地抑制集落形成，然而在该测定中，U2-39抗HB-EGF抗体完全抑制集落形成。
图34C举例说明抗HB-EGF抗体抑制HB-EGF刺激的NCI-H226肺癌细胞的集落形成。如所显示的，HB-EGF刺激NCI-H226细胞形成比在HB-EGF不存在的情况下培养的对照NCI-H226细胞显著更大的平均集落大小。然而，当在HB-EGF存在的情况下将NCI-H226细胞与抗HB-EGF U2-39抗体一起培养时，平均集落大小减小至在无HB-EGF处理的情况下对于对照细胞所观察到的基础大小。
图34D举例说明抗HB-EGF抗体抑制SkOV-3 HB-EGF克隆71细胞(来源于用HB-EGF表达载体转染以引起HB-EGF的组成型过表达的SkOV-3卵巢癌细胞)的基础集落形成。如所显示的，对照SkOV-3 HB-EGF克隆71细胞形成大量的集落。然而，当将SkOV-3 HB-EGF cl.71细胞与抗HB-EGF U2-42或U2-39抗体一起培养时，集落的数目急剧减少。
图34E举例说明抗HB-EGF抗体抑制SkOV-3 HB-EGF克隆74细胞(来源于用HB-EGF表达载体转染以引起HB-EGF的组成型过表达的SkOV-3卵巢癌细胞)的基础集落形成。如所显示的，对照SkOV-3 HB-EGF克隆74细胞形成大量的集落。然而，当将SkOV-3 HB-EGF克隆74细胞与抗HB-EGF U2-39抗体一起培养时，集落的数目急剧减少。
图34F举例说明抗HB-EGF抗体抑制培养在软琼脂中的BxPC3胰腺腺癌细胞的基础集落形成。如所显示的，对照BxPC3细胞形成大量的集落。然而，当在HB-EGF存在的情况下将BxPC3细胞与抗HB-EGF U2-42或U2-39抗体一起培养时，集落的数目急剧减少。
图35举例说明抗HB-EGF抗体抑制培养在软琼脂中的过表达HB-EGF的EFO-27 HB-EGF克隆58卵巢癌细胞的基础集落形成。如所显示的，对照细胞形成大量集落。然而，当将EFO-27 HB-EGF cl.58细胞与抗HB-EGF U2-42、U2-39或U2-45抗体一起培养时，集落的数目急剧减少。此外，抗HB-EGF抗体与抗EGFR抗体爱必要(Erbitux)的联合治疗完全抑制集落形成。
图36显示抗HB-EGF抗体抑制HB-EGF诱导的体内管生成。抗体U2-42、U2-39和U2-45可以以剂量依赖性的方式阻断小鼠基质胶塞测定(matrigel plug assay)中的血管生成性网络形成(Angiogenicnetwork formation)。
图37举例说明抗体U2-42和U2-39在小鼠异种移植物模型中对已建立的BxPC3肿瘤的生长的抑制。
图38A-38C举例说明抗体U2-42、U2-39和U2-45在小鼠异种移植物模型中对已建立的EFO-27 HB-EGF克隆58肿瘤的生长的抑制(图38A)。如图38B中所示，显示抗体U2-42和U2-39对异种移植物肿瘤生长的抑制的功效是剂量依赖性的。此外，与抗EGFR抗体爱必妥的联合治疗导致肿瘤生长的完全消失，从而显示抗HB-EGF抗体作为联合疗法的试剂的有效协同活性(图38C)。
图39A-39B举例说明人抗HB-EGF抗体用于通过免疫组织化学(图39A)和通过ELISA(图39B)检测人组织中的HB-EGF的用途。
图40A举例说明显示HB-EGF诱导的CLS354上皮鳞癌细胞(口)的迁移的抑制的划痕测定(scratch assay)。
图40B举例说明显示HB-EGF诱导的Detroit 562上皮癌细胞(咽)的迁移的抑制的移行测定(transmigration assay)。
图41举例说明显示VEGF刺激的内皮细胞出芽(sprouting)的抑制的基于球状体的(spheroid-based)细胞血管生成测定。
图42举例说明显示体内肿瘤的CD31染色的抑制的人肿瘤异种移植物样品的免疫组织化学(IHC)分析。
图43举例说明显示U2-39与顺铂和阿瓦斯丁的联合治疗的体内卵巢肿瘤异种移植物模型。
发明详述
本文中使用的章节标题仅用于组织目的而不被解释为限定所述的主题内容。
除非在本文中另外定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语将具有本领域技术人员通常理解的意义。此外，除非根据上下文需要，否则单数术语包括复数并且复数术语包括单数。
通常，本文中描述的结合细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学及杂交使用的命名法以及细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学及杂交的技术是本领域内熟知和常用的。除非另外指出，否则本申请的方法和技术通常按照本领域内熟知的和在整个本说明书中引用和论述的各种一般和更专业的参考文献中描述的常规方法来进行。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)和Ausube l等人，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Associates(1992)，以及Harlow和Lane Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)，其通过引用合并入本文。如本领域中通常实现的或如本文中所描述的，按照厂商说明书进行酶促反应和纯化技术。本文中描述的结合分析化学、合成有机化学和医学与药物化学使用的术语以及分析化学、合成有机化学和医学与药物化学的实验室方法和技术是本领域内熟知和常用的。可使用标准技术进行化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的处理。
应当理解本发明不限于本文中描述的特定方法、方案和试剂等，因为其可发生变化。本文中使用的术语只用于描述特定实施方案的目的，并且无意限定只由权利要求界定的公开的范围。
与在操作实施例中不同，或除非另外指出，否则本文中使用的表示成分或反应条件的数量的所有数值在所有情况下应当理解为由术语
“大约”进行修饰。术语“大约”，当与百分比结合使用时，可以表示±1％。
A.一般概述
本文中提供了结合HB-EGF，特别是人HB-EGF(hHB-EGF)蛋白的抗原结合蛋白。提供的抗原结合蛋白是如本文所述的一个或多个互补决定区(CDR)被包埋和/或连接入其中的多肽。在一些抗原结合蛋白中，CDR被包埋入“构架”区中，所述构架区确定CDR的方位以使获得正确的CDR的抗原结合性质。通常，提供的抗原结合蛋白可干扰、阻断、减少或调节HB-EGF与其相关受体(包括EGF-R和HER4)之间的相互作用。
本文中描述的某些抗原结合蛋白是抗体或来源于抗体。在某些实施方案中，抗原结合蛋白的多肽结构基于抗体，包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微小抗体(minibody)、结构域抗体、合成抗体(在本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合物(在本文中有时称为“抗体缀合物”)和分别地其片段。在下文中进一步描述各种结构。
已显示本文中提供的抗原结合蛋白结合HB-EGF特别地人HB-EGF的几个表位。如实施例中所显示的，HB-EGF结合其相关受体的能力减小或被抑制。因此，本文中提供的抗原结合蛋白能够抑制HB-EGF的活性。特别地，结合此类表位的抗原结合蛋白可具有一个或多个下列活性：抑制，特别地，EGF-R和HER4的自磷酸化、EGF-R和HER4信号转导途径的诱导、EGF-R和HER4诱导的细胞生长以及在HB-EGF结合后由EGF-R和HER4诱导的其他生理效应。
本文中公开的抗原结合蛋白具有多种用途。一些抗原结合蛋白例如可用于HB-EGF特别地hHB-EGF的特异性结合测定、亲和纯化和可用于筛选测定以鉴定这样的受体。此外，公开的抗原结合蛋白还可用于疾病例如增殖性病症的诊断和/或治疗。此类疾病包括但不限于各种类型的癌症。
B.肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)
HB-EGF由各种肿瘤细胞产生，并且用作自分泌肿瘤生长因子。Davis-Fleischer等人，1998，Front Biosci.3：288-299；Iwamoto &Mekada，2000，Cytokine Growth Factor Rev.11：335-344。HB-EGF对于可增加HB-EGF的生物学活性的肝素具有强亲和力。HB-EGF产生为跨膜蛋白，其被金属蛋白酶蛋白水解切割，产生生长因子的成熟可溶形式。
HB-EGF最早以可溶、分泌的形式在培养的人巨噬细胞的上清液中得到鉴定。在人细胞上，前体proHB-EGF用作白喉毒素受体。不同细胞类型，包括上皮细胞、角质形成细胞、单核细胞、系膜细胞(mesangialcell)、淋巴样细胞和骨骼肌细胞产生HB-EGF。其为上皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和各种人癌细胞的有效丝裂原和趋化因子。
HB-EGF的跨膜形式由许多细胞类型合成为208个氨基酸的跨膜前体(tm-HB-EGF)，其含有EGF结构域、发夹结合结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。细胞外结构域可通过金属蛋白酶的作用作为12至22-kDa的HB-EGF的可溶性形式(sol-HB-EGF)释放，这受不同的G蛋白偶联受体(GPCR)或肿瘤促进剂例如十四酰佛波乙酸酯(TPA)的调控。通常，显著量的跨膜HB-EGF前体在细胞表面上保持未切割状态。
tm-HB-EGF和sol-HB-EGF都具有生物学活性。sol-和tm-HB-EGF的生物学功能都由EGF受体(EGFR；HER1)和ErbB4(HER4)介导。这些受体的这些类型的激活据信作为配体诱导的受体同二聚化或异二聚化的结果而发生。活化后，EGF受体显示增加细胞生长、增加细胞运动性、抑制细胞凋亡和增加细胞转化。
在刺激G蛋白偶联受体(GPCR)后，可反式激活EGFR依赖性信号转导途径。通过与GPCR相互作用产生的异三聚体G蛋白的配体激活导致诱导跨膜金属蛋白酶的细胞外活性的细胞内信号。激活GPCR途径的配体包括LPA(溶血磷脂酸)、凝血酶、卡巴胆碱、铃蟾肽(bombesin)和内皮素。此类激活导致跨膜生长因子前体的细胞外加工和成熟因子的释放，所述成熟因子直接或通过蛋白聚糖基质与EGFR的胞外结构域相互作用，并且通过酪氨酸磷酸化激活它。参见，Prenzel等人，1999，Nature 402：884-888。因此，HB-EGF是GPCR借以激活膜结合金属蛋白酶的三重膜传递信号(TMPS)机制的成分，所述金属蛋白酶切割proHB-EGF，从而释放可溶性生长因子，该可溶性生长因子随后激活EGF受体。EGFR的反式激活与不同疾病状态例如心肌肥厚(综述于ShahBH，Catt KJ.Trends Pharmacol Sci.2003May；24(5)：239-244中)、血管重塑(综述于Eguchi等人，2003，Biochem Soc Trans.2003Dec；31(Pt 6)：1198-202中)和癌症(综述于Fischer等人，2003中，同上)相关。
HB-EGF蛋白的序列和编码此类蛋白的核酸的序列对于本领域技术人员来说是可获得的。例如，这样的HB-EGF序列可见于由NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI)提供的数据库(参见，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。HB-EGF序列的一个实例是NCBI登录号NM 001945和NP_001936(gi：4503413)下的氨基酸序列。下文中提供该序列以方便参考(SEQ ID NO：1042)：
MKLLPSVVLKLFLAAVLSALVTGESLERLRRGLAAGTSNPDPPTVSTDQLLPLGGGRDRKVRDLQEADLDLLRVTLSSKPQALATPNKEEHGKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGYHGERCHGLSLPVENRLYTYDHTTILAVVAVVLSSVCLLVIVGLLMFRYHRRG GYDVENEEKVKLGMTNSH。
注意，上文中所示的HB-EGF序列(SEQ ID NO：1042)具有19个氨基酸的信号肽(MKLLPSVVLK LFLAAVLSA，SEQ ID NO：1043)。
可溶性细胞外结构域由上述HB-EGF序列的氨基酸1-149组成。HB-EGF可溶性细胞外结构域的该序列在下文中提供为SEQ ID NO：1044：
MKLLPSVVLKLFLAAVLSALVTGESLERLRRGLAAGTSNPDPPTVSTDQLLPLGGGRDRKVRDLQEADLDLLRVTLSSKPQALATPNKEEHGKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGYHGERCHGLSLP。
在切割后，产生由氨基酸63-149(87个氨基酸)组成的成熟HB-EGF。成熟HB-EGF的该序列在下文中提供为SEQ ID NO：1045：
DLQEADLDLLRVTLSSKPQALATPNKEEHGKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGYHGERCHGLSLF。
HB-EGF与表皮生长因子受体(EGFR)相互作用并且激活其。EGFR是由细胞外配体结合结构域、跨膜区和具有酪氨酸激酶活性的细胞内结构域组成的170kDa跨膜糖蛋白。生长因子与EGFR的结合导致配体-受体复合物的内化，受体和其他蛋白质底物的自磷酸化，从而最终导致DNA合成和细胞分裂。外部配体结合结构域不仅受HB-EGF刺激，而且还受EGF、TGFα和双调蛋白(AR)刺激。
EGFR的过表达通常伴随EGF样生长因子的共表达，这表明控制生长的自分泌途径在肿瘤的进展中可能起主要作用。现在普遍认为这是肿瘤借以逃脱正常生理控制的机制。
C.HB-EGF受体抗原结合蛋白
提供了许多用于调控HB-EGF的活性的选择性结合试剂。此类试剂包括，例如，包含抗原结合结构域的抗原结合蛋白(例如，单链抗体、结构域抗体、免疫粘附素(inmmunoadhesion)和具有抗原结合区的多肽)并且特异性结合HB-EGF多肽，特别地人HB-EGF。一些试剂例如可用于抑制HB-EGF与其受体的结合，从而可用于抑制、干扰或调节与HB-EGF介导的信号转导相关的一个或多个活性。
一般地，提供的抗原结合蛋白通常包含1个或多个本文中描述的CDR(例如，1，2，3，4，5或6个)。在一些情况下，抗原结合蛋白包含(a)多肽结构和(b)一个或多个插入和/或连接至多肽结构的CDR。多肽结构可采用许多不同的形式。例如，其可以是，或包含天然发生的抗体的构架或其片段或变体，或可以是完全天然合成的。不同多肽结构的实例在下文中进一步描述。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白的多肽结构是抗体或来源于抗体，包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微小抗体、结构域抗体、合成的抗体(在本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物(有时称为“抗体缀合物”)和其各自的部分或片段。在一些情况下，抗原结合蛋白是抗体的免疫学片段(例如，Fab、Fab′、F(ab′)2或scFv)。在本文中进一步描述和定义各种结构。
本文中提供的某些抗原结合蛋白特异性结合人HB-EGF。在特定的实施方案中，抗原结合蛋白特异性结合具有SEQ ID NO：1042的氨基酸序列的人HB-EGF蛋白。
在其中抗原结合蛋白用于治疗应用的实施方案中，抗原结合蛋白可抑制、干扰或调节HB-EGF的一个或多个生物学活性。在该情况下，当过量的抗体使与其受体结合的人HB-EGF的量减少(或反之亦然)至少大约20％、40％、60％、80％、85％或更多(例如通过在体外竞争结合测定中测量结合)时，抗原结合蛋白特异性结合和/或显著抑制人HB-EGF与其受体的结合。HB-EGF具有许多不同的生物学效应，其可在许多不同的测定中在不同的细胞类型中进行测量；本文中提供了此类测定的实例。
1.天然发生的抗体结构
提供的一些抗原结合蛋白具有通常与天然发生的抗体相关的结构。这些抗体的结构单位通常包含一个或多个各自由两个相同的多肽链偶联体组成的四聚体，虽然一些哺乳动物物种也产生只具有单个重链的抗体。在经典的抗体中，各个对或偶联体包含一个全长“轻”链(在某些实施方案中，大约25kDa)和一个全长“重”链(在某些实施方案中，大约50-70kDa)。各个单独的免疫球蛋白链由几个“免疫球蛋白结构域”组成，其各自由大约90至110个氨基酸组成并且表达特征折叠模式。这些结构域是组成抗体多肽的基本单位。各链的氨基末端部分通常包括负责抗原识别的可变结构域。羧基末端部分在进化上比链的另一个末端更保守并且称为“恒定区”或“C区”。人轻链通常分类为κ和λ轻链，并且这些链的每一个包含一个可变结构域和一个恒定结构域。重链通常分类为μ、δ、Y、α或ε链，这些链分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几种亚型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM亚型包括IgM1和IgM2。IgA亚型包括IgA1和IgA2。在人中，IgA和IgD同种型包含4条重链和4条轻链；IgG和IgE同种型包含2条重链和2条轻链；IgM同种型包含5条重链和5条轻链。重链C区通常包含一个或多个可负责效应子功能的结构域。重链恒定区结构域的数目将取决于同种型。例如IgG重链包含称为CH1、CH2和CH3的3个C区结构域。提供的抗体可具有任何这些同种型和亚型。在某些实施方案中，HB-EGF抗体是IgG1、IgG2或IgG4亚型的抗体。
在全长轻链和重链中，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约10或更多个氨基酸的“D”区。参见，例如，Fundamental Immunology，第2版，Ch.7(Paul，W.，ed.)1989，New York：Raven Press(以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的)。各轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合部位。
示例性HB-EGF单克隆抗体的κ轻链恒定结构域的一个实例具有氨基酸序列：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGBC(SEQ ID NO：187)。
示例性HB-EGF单克隆抗体的IgG2重链恒定结构域的一个实例具有氨基酸序列：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：188)。
免疫球蛋白链的可变区通常展示相同的总体结构，包含通过3个高变区(更通常地称为“互补决定区”或CDR)连接的相对保守的构架区(FR)。来自各个上述重链/轻链对的两条链的CDR通常通过构架区联配(align)，从而形成特异性结合靶蛋白(例如，HB-EGF)上的特定表位的结构。从N末端至C末端，天然发生的轻链和重链可变区都通常遵从此类元件的下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。已设计编号系统用于给占据每一个此类结构域中的位点的氨基酸赋予编号。在Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(1987和1991，NIH Bethesda，MD)或Chothia & Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989，Nature 342：878-883中定义了该编号系统。
本文中提供的各种轻链和重链可变区分别描述于图1A-1P和图2A-2O。可分别将这些可变区中的每一个连接至上述重链和轻链恒定区以形成完整的抗体重链和轻链。此外，可将每一个如此产生的重链和轻链序列组合以形成完整的抗体结构。
提供的一些抗体的全长轻链和重链的特定实例和它们相应的氨基酸序列分别概述于图3A-3K和图4A-4O中。
再次地，可将图3A-3K中所列的每一个示例性轻链(UL-1，UL-2，UL-3等)与图4A-4O中显示的任一示例性重链组合以形成抗体。此类组合的实例包括UL-1与UH-1至UH-58的任一个组合；UL-2与UH-1至UH-58的任一个组合；或UL--3与UH-1至UH-58的任一个组合等。在一些情况下，抗体包括分别来自图3A-3K和图4A-4O的至少一条轻链和一条重链。在其他情况下，抗体包含两条相同的轻链和两条相同的重链。例如，抗体或免疫功能片段可包含两条UL-1轻链和两条UH-1重链，或两UL-2轻链和两条UH-2重链，或两条UL-3轻链和两条UH-3重链以及分别如图3A-3K和图4A-4O中所列的成对轻链与成对重链的其他相似组合。
提供的其他抗体是通过组合分别在图3A-3K和图4A-4O中显示的重链和轻链形成的抗体的变体，其包括各自与这些链的氨基酸序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％或99％的同一性的轻链和/或重链。在一些情况下，此类抗体包含至少一条轻链和一条重链，然而在其他情况下，变体形式包含两条相同的轻链和两条相同的重链。
2.抗体的可变结构域
还提供了包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区以及此类轻链和重链可变区的免疫功能性片段、衍生物、突变蛋白和变体的抗原结合蛋白，所述轻链可变区选自：U-VL1、U-VL2、U-VL3、U-VL4、U-VL5、U-VL6、U-VL7、U-VL8、U-VL9、U-VL10、U-VL11、U-VL12、U-VL13、U-VL14、U-VL15、U-VL16、U-VL17、U-VL18、U-VL19、U-VL20、U-VL21、U-VL22、U-VL23、U-VL24、U-VL25、U-VL26、U-VL27、U-VL28、U-VL29、U-VL30、U-VL31、U-VL32、U-VL33、U-VL34、U-VL35、U-VL36、U-VL37、U-VL38、U-VL39、U-VL40、U-VL41、U-VL42、U-VL43、U-VL44、U-VL45、U-VL46、U-VL47、U-VL48、U-VL49、U-VL50、U-VL51、U-VL52、U-VL54、U-VL55、U-VL56、U-VL57、U-VL58、U-VL59、U-VL60、U-VL61、U-VL62、U-VL64和U-VL65，所述重链可变区选自：U-VH1、U-VH2、U-VH3、U-VH4、U-VH5、U-VH6、U-VH7、U-VH8、U-VH9、U-VH10、U-VH11、U-VH12、U-VH13、U-VH14、U-VH15、U-VH16、U-VH17、U-VH18、U-VH19、U-VH20、U-VH21、U-VH22、U-VH23、U-VH24、U-VH25、U-VH26、U-VH27、U-VH28、U-VH29、U-VH30、U-VH31、U-VH32、U-VH33、U-VH34、U-VH35、U-VH36、U-VH37、U-VH38、U-VH39、U-VH40、U-VH41、U-VH42、U-VH43、U-VH44、U-VH45、U-VH46、U-VH47、U-VH48、U-VH49、U-VH50、U-VH51、U-VH52、U-VH53、U-VH54、U-VH55、U-VH56、U-VH57和U-VH58，分别如图1A-1P和图2A-2O中所示。
不同轻链和重链可变区的序列比对分别提供于图10A和10B以及图11A和11B中。
该类型的抗原结合蛋白通常可以用式“VHx/VLy”来标示，其中“x”相应于重链可变区的数目，“y”相应于轻链可变区的数目(通常，x和y各自为1或2)。
可将图1A-1P中所列的每一个轻链可变区与图2A-2O中所列的任一个重链可变区组合以形成抗原结合蛋白。此类组合的实例包括U-VL1与U-VH1、U-VH2、U-VH3、U-VH4、U-VH5、U-VH6、U-VH7、U-VH8、U-VH9、U-VH10、U-VH11、U-VH12、U-VH13、U-VH14、U-VH15、U-VH16、U-VH17、U-VH18、U-VH19、U-VH20、U-VH21、U-VH22、U-VH23、U-VH24、U-VH25、U-VH26、U-VH27、U-VH28、U-VH29、U-VH30、U-VH31、U-VH32、U-VH33、U-VH34、U-VH35、U-VH36、U-VH37、U-VH38、U-VH39、U-VH40、U-VH41、U-VH42、U-VH43、U-VH44、U-VH45、U-VH46、U-VH47、U-VH48、U-VH49、U-VH50、U-VH51、U-VH52、U-VH53、U-VH54、U-VH55、U-VH56、U-VH57或U-VH58中的任一个组合或U-VL2与U-VH1、U-VH2、U-VH3、U-VH4、U-VH5、U-VH6、U-VH7、U-VH8、U-VH9、U-VH10、U-VH11、U-VH12、U-VH13、U-VH14、U-VH15、U-VH16、U-VH17、U-VH18、U-VH19、U-VH20、U-VH21、U-VH22、U-VH23、U-VH24、U-VH25、U-VH26、U-VH27、U-VH28、U-VH29、U-VH30、U-VH31、U-VH32、U-VH33、U-VH34、U-VH35、U-VH36、U-VH37、U-VH38、U-VH39、U-VH40、U-VH41、U-VH42、U-VH43、U-VH44、U-VH45、U-VH46、U-VH47、U-VH48、U-VH49、U-VH50、U-VH51、U-VH52、U-VH53、U-VH54、U-VH55、U-VH56、U-VH57或U-VH58中的任一个组合等。
在一些情况下，抗原结合蛋白包括分别来自图1A-1P和图2A-2O中所列的那些的至少一个重链可变区和/或一个轻链可变区。在一些情况下，抗原结合蛋白包含分别来自图1A-1P和图2A-2O中所列的那些的至少两个不同的重链可变区和/或轻链可变区。这样的抗原结合蛋白的实例包含(a)一个U-VL1和(b)U-VL2、U-VL3、U-VL4、U-VL5、U-VL6、U-VL7、U-VL8、U-VL9、U-VL10、U-VL11、U-VL12、U-VL13、U-VL14、U-VL15、U-VL16、U-VL17、U-VL18、U-VL19、U-VL20、U-VL21、U-VL22、U-VL23、U-VL24、U-VL25、U-VL26、U-VL27、U-VL28、U-VL29、U-VL30、U-VL31、U-VL32、U-VL33、U-VL34、U-VL35、U-VL36、U-VL37、U-VL38、U-VL39、U-VL40、U-VL41、U-VL42、U-VL43、U-VL44、U-VL45、U-VL46、U-VL47、U-VL48、U-VL49、U-VL50、U-VL51、U-VL52、U-VL54、U-VL55、U-VL56、U-VL57、U-VL58、U-VL59、U-VL60、U-VL61、U-VL62、U-VL64和U-VL65中的一个。再次地，这样的抗原结合蛋白的另一个实例包含(a)一个U-VL2和(b)U-VL1、U-VL3、U-VL4、U-VL5、U-VL6、U-VL7、U-VL8、U-VL9、U-VL10、U-VL11、U-VL12、U-VL13、U-VL14、U-VL15、U-VL16、U-VL17、U-VL18、U-VL19、U-VL20、U-VL21、U-VL22、U-VL23、U-VL24、U-VL25、U-VL26、U-VL27、U-VL28、U-VL29、U-VL30、U-VL31、U-VL32、U-VL33、U-VL34、U-VL35、U-VL36、U-VL37、U-VL38、U-VL39、U-VL40、U-VL41、U-VL42、U-VL43、U-VL44、U-VL45、U-VL46、U-VL47、U-VL48、U-VL49、U-VL50、U-VL51、U-VL52、U-VL54、U-VL55、U-VL56、U-VL57、U-VL58、U-VL59、U-VL60、U-VL61、U-VL62、U-VL64和U-VL65中的一个。再次地，这样的抗原结合蛋白的另一个实例包含(a)一个U-VL3和(b)U-VL1、U-VL2、U-VL4、U-VL5、U-VL6、U-VL7、U-VL8、U-VL9、U-VL10、U-VL11、U-VL12、U-VL13、U-VL14、U-VL15、U-VL16、U-VL17、U-VL18、U-VL19、U-VL20、U-VL21、U-VL22、U-VL23、U-VL24、U-VL25、U-VL26、U-VL27、U-VL28、U-VL29、U-VL30、U-VL31、U-VL32、U-VL33、U-VL34、U-VL35、U-VL36、U-VL37、U-VL38、U-VL39、U-VL40、U-VL41、U-V42、U-VL43、U-VL44、U-VL45、U-VL46、U-VL47、U-VL48、U-VL49、U-VL50、U-VL51、U-VL52、U-VL54、U-VL55、U-VL56、U-VL57、U-VL58、U-VL59、U-VL60、U-VL61、U-VL62、U-VL64和U-VL65中的一个等。
再次地，这样的抗原结合蛋白的另一个实例包含(a)一个U-VH1和(b)U-VH2、U-VH3、U-VH4、U-VH5、U-VH6、U-VH7、U-VH8、U-VH9、U-VH10、U-VH11、U-VH12、U-VH13、U-VH14、U-VH15、U-VH16、U-VH17、U-VH18、U-VH19、U-VH20、U-VH21、U-VH22、U-VH23、U-VH24、U-VH25、U-VH26、U-VH27、U-VH28、U-VH29、U-VH30、U-VH31、U-VH32、U-VH33、U-VH34、U-VH35、U-VH36、U-VH37、U-VH38、U-VH39、U-VH40、U-VH41、U-VH42、U-VH43、U-VH44、U-VH45、U-VH46、U-VH47、U-VH48、U-VH49、U-VH50、U-VH51、U-VH52、U-VH53、U-VH54、U-VH55、U-VH56、U-VH57和U-VH58中的一个。另一个实例包含(a)一个U-VH2和(b)U-VH1、U-VH3、U-VH4、U-VH5、U-VH6、U-VH7、U-VH8、U-VH9、U-VH10、U-VH11、U-VH12、U-VH13、U-VH14、U-VH15、U-VH16、U-VH17、U-VH18、U-VH19、U-VH20、U-VH21、U-VH22、U-VH23、U-VH24、U-VH25、U-VH26、U-VH27、U-VH28、U-VH29、U-VH30、U-VH31、U-VH32、U-VH33、U-VH34、U-VH35、U-VH36、U-VH37、U-VH38、U-VH39、U-VH40、U-VH41、U-VH42、U-VH43、U-VH44、U-VH45、U-VH46、U-VH47、U-VH48、U-VH49、U-VH50、U-VH51、U-VH52、U-VH53、U-VH54、U-VH55、U-VH56、U-VH57和U-VH58中的一个。再次地，另一个实例包含(a)一个U-VH3和(b)U-VH1、U-VH2、U-VH4、U-VH5、U-VH6、U-VH7、U-VH8、U-VH9、U-VH10、U-VH11、U-VH12、U-VH13、U-VH14、U-VH15、U-VH16、U-VH17、U-VH18、U-VH19、U-VH20、U-VH21、U-VH22、U-VH23、U-VH24、U-VH25、U-VH26、U-VH27、U-VH28、U-VH29、U-VH30、U-VH31、U-VH32、U-VH33、U-VH34、U-VH35、U-VH36、U-VH37、U-VH38、U-VH39、U-VH40、U-VH41、U-VH42、U-VH43、U-VH44、U-VH45、U-VH46、U-VH47、U-VH48、U-VH49、U-VH50、U-VH51、U-VH52、U-VH53、U-VH54、U-VH55、U-VH56、U-VH57和U-VH58中的一个等。
可将重链可变区的不同组合与轻链可变区的任何不同组合相组合。
在其他情况下，抗原结合蛋白包含两个相同的轻链可变区和/或两个相同的重链可变区。例如，抗原结合蛋白可以是抗体或免疫功能片段，其包括成对轻链可变区和成对重链可变区(分别如图1A-1P和图2A-2O中所列)的组合中的两个轻链可变区和两个重链可变区。
提供的一些抗原结合蛋白包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与选自U-VL1、U-VL2、U-VL3、U-VL4、U-VL5、U-VL6、U-VL7、U-VL8、U-VL9、U-VL10、U-VL11、U-VL12、U-VL13、U-VL14、U-VL15、U-VL16、U-VL17、U-VL18、U-VL19、U-VL20、U-VL21、U-VL22、U-VL23、U-VL24、U-VL25、U-VL26、U-VL27、U-VL28、U-VL29、U-VL30、U-VL31、U-VL32、U-VL33、U-VL34、U-VL35、U-VL36、U-VL37、U-VL38、U-VL39、U-VL40、U-VL41、U-VL42、U-VL43、U-VL44、U-VL45、U-VL46、U-VL47、U-VL48、U-VL49、U-VL50、U-VL51、U-VL52、U-VL54、U-VL55、U-VL56、U-VL57、U-VL58、U-VL59、U-VL60、U-VL61、U-VL62、U-VL64或U-VL65的轻链可变结构域的序列相异只在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基的氨基酸序列，其中每一个这样的序列差异独立地是一个氨基酸的缺失、插入或置换。一些抗原结合蛋白中的轻链可变区包含与U-VL1、U-VL2、U-VL3、U-VL4、U-VL5、U-VL6、U-VL7、U-VL8、U-VL9、U-VL10、U-VL11、U-VL12、U-VL13、U-VL14、U-VL15、U-VL16、U-VL17、U-VL18、U-VL19、U-VL20、U-VL21、U-VL22、U-VL23、U-VL24、U-VL25、U-VL26、U-VL27、U-VL28、U-VL29、U-VL30、U-VL31、U-VL32、U-VL33、U-VL34、U-VL35、U-VL36、U-VL37、U-VL38、U-VL39、U-VL40、U-VL41、U-VL42、U-VL43、U-VL44、U-VL45、U-VL46、U-VL47、U-VL48、U-VL49、U-VL50、U-VL51、U-VL52、U-VL54、U-VL55、U-VL56、U-VL57、U-VL58、U-VL59、U-VL60、U-VL61、U-VL62、U-VL64或U-VL65的轻链可变区的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
某些抗体包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与选自U-VH1、U-VH2、U-VH3、U-VH4、U-VH5、U-VH6、U-VH7、U-VH8、U-VH9、U-VH10、U-VH11、U-VH12、U-VH13、U-VH14、U-VH15、U-VH16、U-VH17、U-VH18、U-VH19、U-VH20、U-VH21、U-VH22、U-VH23、U-VH24、U-VH25、U-VH26、U-VH27、U-VH28、U-VH29、U-VH30、U-VH31、U-VH32、U-VH33、U-VH34、U-VH35、U-VH36、U-VH37、U-VH38、U-VH39、U-VH40、U-VH41、U-VH42、U-VH43、U-VH44、U-VH45、U-VH46、U-VH47、U-VH48、U-VH49、U-VH50、U-VH51、U-VH52、U-VH53、U-VH54、U-VH55、U-VH56、U-VH57或U-VH58的重链可变结构域的序列相异只在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基的氨基酸序列，其中每一个这样的序列差异独立地是一个氨基酸的缺失、插入或置换。一些抗原结合蛋白的重链可变区包含与U-VH1、U-VH2、U-VH3、U-VH4、U-VH5、U-VH6、U-VH7、U-VH8、U-VH9、U-VH10、U-VH11、U-VH12、U-VH13、U-VH14、U-VH15、U-VH16、U-VH17、U-VH18、U-VH19、U-VH20、U-VH21、U-VH22、U-VH23、U-VH24、U-VH25、U-VH26、U-VH27、U-VH28、U-VH29、U-VH30、U-VH31、U-VH32、U-VH33、U-VH34、U-VH35、U-VH36、U-VH37、U-VH38、U-VH39、U-VH40、U-VH41、U-VH42、U-VH43、U-VH44、U-VH45、U-VH46、U-VH47、U-VH48、U-VH49、U-VH50、U-VH51、U-VH52、U-VH53、U-VH54、U-VH55、U-VH56、U-VH57或U-VH58的重链可变区的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
其他抗原结合蛋白例如抗体或免疫功能片段包括如刚才所描述的变异轻链和变异重链的变异形式。
3.CDR
本文中公开的抗原结合蛋白是其中移植、插入和/或连接了一个或多个CDR的多肽。抗原结合蛋白可具有1、2、3、4、5或6个CDR。因此抗原结合蛋白可具有例如一个轻链CDR1(“CDRL1”)和/或一个轻链CDR2(“CDRL2”)和/或一个轻链CDR3(“CDRL3”)和/或一个重链CDR1(“CDRH1”)和/或一个重链CDR2(“CDRH2”)和/或一个重链CDR3(“CDRH3”)。一些抗原结合蛋白包含CDRL3和CDRH3。图6A-6F和图7A-7E中鉴定了特定的CDR。
可使用由Kabat等人在Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，US Dept.of Health and Human Services，PHS，NIH，NIH Publication No.91-3242，1991中描述的系统鉴定给定的抗体的互补决定区(CDR)和构架区(FR)(图8A-8H和图9A-9F中分别给出了轻链和重链FR氨基酸序列的实例)。本文中公开的某些抗体包含一个或多个与图6A-6F(CDRL)和图7A-7E(CDRH)中所示的一个或多个CDR的氨基酸序列同一或与其具有充分序列同一性的氨基酸序列。
已描述了天然发生的抗体中的CDR的结构和性质，同上。简而言之，在一般的抗体中，CDR被包埋在重链和轻链可变区的构架区中，在其中它们构成了负责抗原结合和识别的区域。可变区在构架区(被Kabat等人，1991(同上)称为构架区1-4，FR1、FR2、FR3和FR4；也参见Chothia和Lesk，1987，同上)内包含至少3个重链或轻链CDR，参见，同上(Kabat等人，1991，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Public Health Service N.I.H.，Bethesda，MD；也参见Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989，Nature 342：877-883)。然而，本文中提供的CDR不仅可用于界定常规抗体结构的抗原结合结构域，而且还可包埋在许多其他多肽结构中，如本文中所描述的。
在一个方面中，提供的CDR是(a)选自下列的CDRL：(i)选自SEQ IDNO：189-217的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO：218-233的CDRL2；(iii)选自SEQ ID NO：234-274的CDRL3；和(iv)包含一个或多个不超过5、4、3、2或1个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL；(B)选自下列的CDRH：(i)选自SEQ ID NO：275-299的CDRH1；(ii)选自SEQ ID NO：300-331的CDRH2；(iii)选自SEQ ID NO：332-372的CDRH3；和(iv)包含一个或多个不超过5、4、3、2或1个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRLH。
在另一个方面，提供了与图6A-6F和图7A-7E中所列的CDR序列具有至少80％、85％、90％或95％的序列同一性的CDR的变异形式。
在另一个方面，本文中公开的CDR包含来源于相关单克隆抗体的组的共有序列。如本文中所描述的，“共有序列”是指具有在许多序列之间共同的保守氨基酸和在给定的氨基酸序列中变化的可变氨基酸的氨基酸序列。提供的CDR共有序列包括相应于CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和CDRH3中的每一个的CDR。
使用标准系统发生分析法(phylogenic analysis approach)确定相应于抗HB-EGF抗体的U-VL和U-VH的CDR的共有序列。在该方法中，首先将相应于U-VL或U-VH的完整可变结构域的氨基酸序列转换成FASTA格式以方便处理比较比对和推断系统发生。基于该比较，分别将各轻链和重链可变区分成系统发生相关的组，即，将轻链可变区分成6个组，A、B、C、D、E和F(参见，图12A和12B)，将重链可变区分成7个组，A、B、C、D、E、F和G(参见，图12C)。然后，在这些组的每一个组中，将CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2、CDRH3区域的每一个的比较用于确定共有集合(consensus collection)。
A组轻链CDR包括下列共有集合：
a.通式为X1SSQSLX2X3SDGX4TYLX5(SEQ ID NO：1106)的CDRL1，
其中
X1是K或R，
X2是L或V，
X3是H或Y，
X4是K或N，
X5是N、S或Y。
b.通式为X1X2SNX3X4S(SEQ ID NO：1112)的CDRL2，其中
X1是E或K，
X2是I或V，
X3是R或W，
X4是D或F。
c.通式为X1QX2X3X4X5PX6X7(SEQ ID NO：1089)的CDRL3，其中
X1是I或M，
X2是A、G或S，
X3是I或T，
X4是H或Q，
X5是F、L或W，
X6是C、I、H、L或T，
X7是S或T。
B组轻链CDR包括下列共有集合：
a通式为RASQX1ISX2YLN(SEQ ID NO：1107)的CDRL1，其中
X1是R、S或T，
X2是R或S。
b.通式为X1X2SX3LQS(SEQ ID NO：1113)的CDRL2，其中
X1是A或T，
X2是A、E或V，
X3是S或T。
c.通式为QQX1X2X3X4X5IT(SEQ ID NO：1090)的CDRL3，其中
X1是I或S，
X2是F或Y，
X3是F、I、S或Y，
X4是A、S或T。
X5是P或S.
C组轻链CDR包括下列共有集合：
a.通式为RASQX1IX2X3X4LX5(SEQ ID NO：1108)的CDRL1，其中
X1是D、G、S或T，
X2是A、R或S，
X3是H、I、N、R、S或T，
X4是D、W或Y，
X5是A、G或N。
b.通式为X1ASX2LQS(SEQ ID NO：1114)的CDRL2，其中
X1是A或V，
X2是S或T。
c.通式为X1X2X3X4X5X6X7X8T(SEQ ID NO：1091)的CDRL3，其中
X1是L或Q，
X2是K、N或Q，
X3是A、H、S或Y，
X4是H、N或Y，
X5是N、S或T，
X6是A，F，I，T，V或Y，
X7是P或无氨基酸，
X8是F、L或P。
D组轻链CDR包括下列共有集合：
a.通式为QASQDIX1X2X3LN(SEQ ID NO：1109)的CDRL1，其中
X1是S或T，
X2是D或N，
X3是S或Y。
b.通式为DASX1LET(SEQ ID NO：1115)的CDRL2，其中
X1是I或N。
c.通式为QX1X2DX3LPX4X5(SEQ ID NO：1092)的CDRL3，其中
X1是H或Q，
X2是C或Y，
X3是D、I、N、S或Y，
X4是F、I或L，
X5是A、S或T。
E组轻链CDR包括下列共有集合：
a.通式为RASQX1VX2X3X4X5LA(SEQ ID NO：1110)的CDRL1，其中
X1是S或T，
X2是I或S，
X3是R或S，
X4是S、N或无氨基酸，
X5是Y或无氨基酸。
b.通式为GASSRAT(SEQ ID NO：223)的CDRL2
c.通式为QQX1X2X3X4PX5X6X7(SEQ ID NO：1093)的CDRL3，其中
X1是H或Y，
X2是G或N，
X3是N或S，
X4是S或W，
X5是P或无氨基酸，
X6是R或W，
X7是S或T。
F组轻链CDR包括下列共有集合：
a.通式为KSSQX1X2LX3X4SNNKNYLX5(SEQ ID NO：1111)的CDRL1，其中
X1是N或S，
X2是I或V，
X3是D或Y，
X4是N、R或S，
X5是A或V。
b.通式为WASX1RES(SEQ ID NO：1116)的CDRL2，其中
X1是A或T。
c.通式为X1QYX2X3X4X5X6X7F(SEQ ID NO：1094)的CDRL3，其中
X1是H或Q，
X2是F或Y，
X3是G、I或S，
X4是F、I或T，
X5是M、P、S或T，
X6是F、L、R或W，
X7是S或T。
A组重链CDR括下列共有集合：
a.通式为GYTX1TX2X3X4X5X6(SEQ ID NO：1095)的CDRH1，其中
X1是F或L，
X2是E、G或S，
X3是H、L或Y，
X4是G、S或Y，
X5是I或M，
X6是H或S。
b.通式为X1X2X3X4X5X6GX7TX8X9X10QKX11X12(SEQ ID NO：1101)的CDRH2，其中
X1是S或W，
X2是F或I，
X3是D、N或S，
X4是A、P，
X5是E、N或S，
X6是D、N或S，
X7是E、G或N，
X8是I或N，
X9是C、H或Y，
X10是A或T，
X11是F或L，
X12是D或G。
c.通式为X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11DX12(SEQ ID NO：1035)的CDRH3，其中
X1是E或S，
X2是D、G或无氨基酸，
X3是D、N或无氨基酸，
X4是G或无氨基酸，
X5是G或无氨基酸，
X6是W、Y或无氨基酸，
X7是I、N或Y，
X8是A或Y，
X9是G、V或Y，
X10是A、F或G，
X11是F、L或M，
X12是V或Y。
B组重链CDR包括下列共有集合：
a.通式为GYX1FTSYWIG(SEQ ID NO：1096)的CDRH1，其中
X1是R或S。
b.通式为I IYPX1DSDX2RYSPSFQG(SEQ ID NO：1102)的CDRH2，
其中
X1是D或G，
X2是A、I或T。
c.通式为QX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11YX12X13X14DX15(SEQ ID NO：1036)的CDRH3，其中
X1是G或无氨基酸，
X2是K、L或Y，
X3是A、G或S，
X4是S、V或Y，
X5是A或G，
X6是G或无氨基酸，
X7是T或无氨基酸，
X8是S或无氨基酸，
X9是Y或无氨基酸，
X10是W或Y，
X11是G、S或Y，
X12是F或Y，
X13是G或无氨基酸，
X14是M或无氨基酸，
X15是V或Y。
C组重链CDR包括下列共有集合：
a.通式为GFTFX1SX2X3MH(SEQ ID NO：1097)的CDRH1，其中
X1是R或S，
X2是H或Y，
X3是D或G。
b.通式为X1IX2X3DGSX4X5X6YX7DSVX8G(SEQ ID NO：1103)的CDRH2，其中
X1是F或V，
X2是S或W，
X3是D、S或Y，
X4是I、N或T，
X5是K或Q，
X6是N、R或Y，
X7是A、T或V，
X8是K或R。
c.通式为X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO：1037)的CDRH3，其中
X1是D、G、L、S或无氨基酸，
X2是G、H、W、Y或无氨基酸，
X3是A、F、W、Y或无氨基酸，
X4是D、G、Q、T或无氨基酸，
X5是G、I、Q、S或无氨基酸，
X6是A、D、N、Q、S或无氨基酸，
X7是G、Y或无氨基酸，
X8是D、Y或无氨基酸，
X9是Y或无氨基酸，
X10是A、E、N或Y，
X11是G、P、T、V或Y，
X12是F或I，
X13是D或Q，
X14是C、H、V或Y。
D组重链CDR包括下列共有集合：
a.通式为GFX1FSX2YX3MX4(SEQ ID NO：1098)的CDRH1，其中
X1是P或T，
X2是A、R或S，
X3是A或S，
X4是N或S。
b.通式为X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG(SEQ ID NO：1104)的CDRH2，其中
X1是A、H或Y，
X2是G、R或S，
X3是G或S，
X4是G、R或S，
X5是S、T或Y，
X6是I或T。
c.通式为X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17DX18(SEQ ID NO：1038)的CDRH3，其中
X1是E、D或无氨基酸，
X2是G、R或无氨基酸，
X3是I、V、Y或无氨基酸，
X4是A、G、L或N，
X5是A、G、V或W，
X6是A、N、R或T，
X7是G、N、P或无氨基酸，
X8是G、T、无氨基酸，
X9是A或无氨基酸，
X10是D、E或无氨基酸，
X11是S、Y或无氨基酸，
X12是G、Y或无氨基酸，
X13是N、Y或无氨基酸，
X14是Y或无氨基酸，
X15是D、Y或无氨基酸，
X16是A、G或无氨基酸，
X17是F或M，
X18是I、V或Y。
E组重链CDR包括下列共有集合：
a.通式为GX1SX2SX3X4X5X6X7WX8(SEQ ID NO：1099)的CDRH1，其中
X1是D或G，
X2是F、I或V，
X3是R、S或无氨基酸，
X4是G、Y或无氨基酸，
X5是D、G、S或无氨基酸，
X6是A、S或Y，
X7是A或Y，
X8是N或S。
b.通式为X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11YX12X13SX14KS(SEQ ID NO：1105)的CDRH2，其中
X1是E、R或Y，
X2是I或T，
X3是H、N或Y，
X4是C、H、S、T或Y，
X5是S或R，
X6是G或S，
X7是G、K、S或T，
X8是T或W，
X9是N或Y，
X10是N或无氨基酸，
X11是D或无氨基酸，
X12是A或N，
X13是P或V，
X14是L或V。
c.通式为X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23(SEQ ID NO：1039)的CDRH3，其中
X1是A、D、G、S或T，
X2是A、E、G、L、N、R、Y或无氨基酸，
X3是A、G、L、N、R、T、Y或无氨基酸，
X4是D、G、R、S、V、Y或无氨基酸，
X5是A、G、I、S、V、Y或无氨基酸，
X6是F、G、L、R、V或无氨基酸，
X7是L、T、Y或无氨基酸，
X8是Y或无氨基酸，
X9是Y或无氨基酸，
X10是D或无氨基酸，
X11是S或无氨基酸，
X12是S或无氨基酸，
X13是G或无氨基酸，
X14是D、L、M、S、Y或无氨基酸，
X15是H、I、P、V、W或无氨基酸，
X16是F、G、L、R、S、Y或无氨基酸，
X17是D、F、V、W、Y或无氨基酸，
X18是C、F、L、P、S或Y，
X19是D、F、G或Y，
X20是A、C、G、P、R、V或Y，
X21是F、L、M、S或无氨基酸，
X22是A、D或无氨基酸，
X23是I、L、V、Y或无氨基酸。
F组重链CDR包括下列共有集合：
a.通式为GFSLSNARMGVS(SEQ ID NO：279)的CDRH1
b.通式为X1IFSNDEKSYSTSLKS(SEQ ID NO：1033)的CDRH2，其中
X1是H或L。
c.通式为X1YSSGWX2X3YGX4X5DX6(SEQ ID NO：1040)的CDRH3，其中
X1是M或V，
X2是S或无氨基酸，
X3是F或无氨基酸，
X4是V或无氨基酸，
X5是F或M，
X6是V或Y。
G组重链CDR包括下列共有集合：
a.通式为GFSLX1TGGVGVG(SEQ ID NO：1100)的CDRH1，其中
X1是S或N。
b.通式为LIYWNX1X2KRYSPSLX3S(SEQ ID NO：1034)的CDRH2，其中
X1是D或V，
X2是D或E，
X3是K或R。
c.通式为RX1X2X3PFX4Y(SEQ ID NO：1041)的CDRH3，其中
X1是G、H、L、N或R，
X2是E、T或W，
X3是L、N、T或V，
X4是D或E。
在另一个方法中，共有序列可通过在相应于U-VL或U-VH的相同序列内保持CDR连续来确定。简而言之，在该方法中，将相应于U-VL或U-VH的完整可变结构域的氨基酸序列转换成FASTA格式以方便处理比较比对和推断系统发生。然后，将这些序列的构架区用人工接头序列替换，从而在不导入任何氨基酸位点权重偏向(weighting bias)(由于巧合的事件(coincident event)(例如，偶然地共有共同的种系构架遗传物(heritage)的不相关抗体)引起)，同时仍然在相应于U-VL或U-VH的相同序列内保持CDR连续的情况下进行单独的CDR检查。然后使用应用标准ClutalW-like算法的程序(参见，Thompson等人，1994，Nucleic Acids Res.22：4673-4680)，将该格式的U-VL或U-VH序列经历序列相似性比对查询。该程序同样地使用UPGMA(使用算术平均数的非加权成组配对法)或Neighbor-Joining法(参见，Saitou和Nei，1987，Molecular Biology and Evolution 4：406-425)基于序列相似性比对产生系统发育图(系统发生树图解)，从而通过分支长度比较和分组来构建和图解说明序列组的相似性和差异。对于确定单独的组内的共有序列集合，两种方法产生相似的结果。
在一些情况下，抗原结合蛋白包含至少一个CDRL1、CDRL2或CDRL3(所述CDRL具有上述共有序列中的一个)。在一些情况下，抗原结合蛋白包含至少一个CDRH1、CDRH2或CDRH3(所述CDRH具有上述共有序列中的一个)。在其他情况下，抗原结合蛋白包含至少两个根据上述共有序列的CDRL，和/或至少两个根据上述共有序列的CDRH。在一个方面中，CDRL和/或CDRH来源于不同的组。在其他情况下，抗原结合蛋白包含至少两个来自相同组A、B、C、D、E或F的CDRL和/或至少两个来自相同组A、B、C、D、E、F或G的CDRH。在其他方面，抗原结合蛋白包含来自相同的上述组A、B、C、D、E或F的所有3个CDRL1，CDRL2和CDRL3序列，和/或来自相同的上述组A、B、C、D、E、F或G的所有3个CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。
D.示例性抗原结合蛋白
根据一个方面，提供了结合HB-EGF的分离的抗原结合蛋白，其包含(A)选自下列的一个或多个轻链互补决定区(CDRL)：(i)选自SEQ IDNO：189-217的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO：218-233的CDRL2；(iii)选自SEQ ID NO：234-274的CDRL3；和(iv)包含一个或多个不超过5、4、3、2或1个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL；(B)选自下列的一个或多个重链互补决定区(CDRH)：(i)选自SEQ ID NO：275-299的CDRH1；(ii)选自SEQ ID NO：300-331的CDRH2；(iii)选自SEQ ID NO：332-372的CDRH3；和(iv)包含一个或多个不超过5、4、3、2或1个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的(i)、(ii)或(iii)的CDRH；或(C)一个或多个(A)的轻链CDRL；和(D)一个或多个(B)的重链CDRH。
在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白可包含(A)选自下列的CDRL：(i)选自SEQ ID NO：189-217的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO：218-233的CDRL2；和(iii)选自SEQ ID NO：234-274的CDRL3；(B)选自下列的CDRH：(i)选自SEQ ID NO：275-299的CDRH1；(ii)选自SEQ ID NO：300-331的CDRH2；和(iii)选自SEQ ID NO：332-372的CDRH3；或(C)一个或多个(A)的轻链CDRL；和(D)一个或多个(B)的重链CDRL。在一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白可包含(A)SEQ IDNO：189-217的CDRL1，SEQ ID NO：218-233的CDRL2，和SEQ ID NO：234-274的CDRL 3，和(B)SEQ ID NO：275-299的CDRH1，SEQ ID NO：300-331的CDRH2，和SEQ ID NO：332-372的CDRH3。
在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID NO：94-141的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的序列同一性的可变轻链(VL)和/或与选自SEQ ID NO：142-186的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的序列同一性的可变重链(VH)。在另外的实施方案中，VL选自SEQ ID NO：94-141和/或VH选自SEQ ID NO：142-186。
在另一方面，还提供了特异性结合含有至少一个包含I HGE的表位和/或HB-EGF的EGF样表位的表位的分离的抗原结合蛋白。
在另外的方面，提供了结合HB-EGF的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含(A)选自下列的轻链互补决定区(CDRL)：(i)选自SEQ ID NO：234-274的CDRL3，(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRL3相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRL3；(iii)选自下列的CDRL3氨基酸序列：X1QX2X3X4X5PX6X7(SEQ ID NO：1089)，其中X1选自I和M，X2选自A、G和S，X3选自I和T，X4选自H和Q、X5选自F、L和W，X6选自C、I、H、L和T，X7选自S和T；QQX1X2X3X4X5IT(SEQ ID NO：1090)，其中X1选自I和S，X2选自F和Y，X3选自F、I、S和Y，X4选自A、S和T，X5选自P和S；X1X2X3X4X5X6X7X8T(SEQ ID NO：1091)，其中X1选自L和Q，X2选自K、N和Q，X3选自A、H、S和Y，X4选自H、N和Y，X5选自N、S和T，X6选自A、F、I、T、V和Y，X7选自P和无氨基酸，X8选自F、L和P；QX1X2DX3LPX4X5(SEQ ID NO：1092)，其中X1选自H和Q，X2选自C和Y，X3选自D、I、N、S和Y，X4选自F、I和L，X5选自A、S和T；QQX1X2X3X4PX5X6X7(SEQ ID NO：1093)，其中X1选自H和Y，X2选自G和N，X3选自N和S，X4选自S和W，X5选自P和无氨基酸，X6选自R和W，X7选自S和T；和X1QYX2X3X4X5X6X7F(SEQ IDNO：1094)，其中X1选自H和Q，X2选自F和Y，X3选自G、I和S，X4选自F、I和T，X5选自M、P、S和T，X6选自F、L、R和W，X7选自S和T；和/或(B)选自下列的重链互补决定区(CDRH)：(i)选自SEQ IDNO：332-372的CDRH3，(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRH3相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRH3；和(iii)选自下列的CDRH3氨基酸序列：X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11DX12(SEQ ID NO：1035)，其中X1选自E和S，X2选自D、G和无氨基酸，X3选自D、N和无氨基酸，X4选自G和无氨基酸，X5选自G和无氨基酸，X6选自W、Y和无氨基酸，X7选自I、N和Y，X8选自A和Y，X9选自G、V和Y，X10选自A、F和G，X11选自F、L和M，X12选自V和Y；
QX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11YX12X13X14DX15(SEQ ID NO：1036)，其中X1选自G和无氨基酸，X2选自K、L和Y，X3选自A、G和S，X4选自S、V和Y，X5选自A和G，X6选自G和无氨基酸，X7选自T和无氨基酸，X8选自S和无氨基酸，X9选自Y和无氨基酸，X10选自W和Y、X11选自G、S和Y、X12选自F和Y、X13选自G和无氨基酸，X14选自M和无氨基酸，X15选自V和Y；X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO：1037)，其中X1选自D、G、L、S和无氨基酸，X2选自G、H、W、Y和无氨基酸，X3选自A、F、W、Y和无氨基酸，X4选自D、G、Q、T和无氨基酸，X5选自G、I、Q、S和无氨基酸，X6选自A、D，X8选自D、Y和无氨基酸，X9选自Y和无氨基酸，X10选自A、E、N和Y，X11选自G、P、T、V和Y，X12是se，X14选自C、H、V和Y；X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17DX18(SEQ IDNO：1038)，其中X1选自E、D和无氨基酸，X2选自G、R和无氨基酸，X3选自I、V、Y和无氨基酸，X4选自A、G、L和N，X5选自A、G、V和W，X6选自A、N、R和T，X7选自G、N、P和无氨基酸，X8选自G、T和无氨基酸，X9选自A和无氨基酸，X10选自D、E和无氨基酸，X11选自S、Y和无氨基酸，X12选自G、Y和无氨基酸，X13选自N、Y和无氨基酸，X14选自Y和无氨基酸，X15选自D、Y和无氨基酸，X16选自A、G和无氨基酸，X17选自F和M，X18选自I、V和Y；X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23(SEQ ID NO：1039)，其中X1选自A、D、G、S和T，X2选自A、E、G、L、N、R、Y和无氨基酸，X3选自A、G、L、N、R、T、Y和无氨基酸，X4选自D、G、R、S、V、Y和无氨基酸，X5选自A、G、I、S、V、Y和无氨基酸，X6选自F、G、L、R、V和无氨基酸，X7选自L、T、Y和无氨基酸，X8选自Y和无氨基酸，X9选自Y和无氨基酸，X10选自D和无氨基酸，X11选自S和无氨基酸，X12选自S和无氨基酸，X13选自G和无氨基酸，X14选自D、L、M、S、Y和无氨基酸，X15选自H、I、P、V、W和无氨基酸，X16选自F、G、L、R、S、Y和无氨基酸，X17选自D、F、V、W、Y和无氨基酸，X18选自C、F、L、P、S和Y，X19选自D、F、G和Y，X20选自A、C、G、P、R、V和Y，X21选自F、L、M、S和无氨基酸，X22选自A、D和无氨基酸，X23选自I、L、V、Y和无氨基酸；X1YSSGWX2X3YGX4X5DX6(SEQ ID NO：1040)，其中X1选自M和V，X2选自S和无氨基酸，X3选自F和无氨基酸，X4选自V和无氨基酸，X5选自F和M、X6选自V和Y；和RX1X2X3PFX4Y(SEQID NO：1041)，其中X1选自G、H、L、N和R，X2选自E、T和W，X3选自L、N、T和V，X4选自D和E。
在一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白还包含(A)选自下列的CDRL：(i)选自SEQ ID NO：189-217的CDRL1；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRL1相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRL1；(iii)选自下列的CDRL1氨基酸序列：X1SSQSLX2X3SDGX4TYLX5(SEQ ID NO：1106)，其中X1选自K和R，X2选自L和V，X3选自H和Y，X4选自K和N，X5选自N、S和Y；RASQX1ISX2YLN(SEQ ID NO：1107)，其中X1选自R、S和T，X2选自R和S；RASQX1IX2X3X4LX5(SEQ ID NO：1108)，其中X1选自D、G、S和T，X2选自A、R和S，X3选自H、I、N、R、S和T，X4选自D、W和Y，X5选自A、G和N；QASQDIX1X2X3LN(SEQ ID NO：1109)，其中X1选自S和T，X2选自D和N，X3选自S和Y；RASQX1VX2X3X4X5LA(SEQ ID NO：1110)，其中X1选自S和T，X2选自I和S，X3选自R和S，X4选自S、N和无氨基酸，X5选自Y和无氨基酸；和KSSQX1X2LX3X4SNNKNYLX5(SEQ ID NO：1111)，其中X1选自N和S，X2选自I和V，X3选自D和Y，X4选自N、R和S，X5选自A和V；或(iv)选自SEQ ID NO：218-233的CDRL2；(v)在氨基酸序列上与(iv)的CDRL2相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRH2；或(vi)选自下列的CDRL2氨基酸序列：X1X2SNX3X4S(SEQ ID NO：1112)，其中X1选自E和K，X2选自I和V，X3选自R和W，X4选自D和F；X1X2SX3LQS(SEQ ID NO：1113)，其中X1选自A和T，X2选自A、E和V，X3选自S和T；X1ASX2LQS(SEQ ID NO：1114)，其中X1选自A和V，X2选自S和T；DASX1LET(SEQ ID NO：1115)，其中X1选自I和N；GASSRAT(SEQ IDNO：223)；和WASX1RES(SEQ ID NO：1116)，其中X1选自A和T；或B)选自下列的CDRH：(i)选自SEQ ID NO：275-299的CDRH1；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRH1相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRH1；(iii)选自下列的CDRH1氨基酸序列：GYTX1TX2X3X4X5X6(SEQ ID NO：1095)，其中X1选自F和L，X2选自E、G和S，X3选自H、L和Y，X4选自G、S和Y，X5选自I和M，X6选自H和S；GYX1FTSYWIG(SEQ ID NO：1096)，其中X1选自R和S；GFTFX1SX2X3MH(SEQ ID NO：1097)，其中X1选自R和S，X2选自H和Y，X3选自D和G；GFX1FSX2YX3MX4(SEQ ID NO：1098)，其中X1选自P和T，X2选自A、R和S，X3选自A和S，X4选自N和S；GX1SX2SX3X4X5X6X7WX8(SEQ ID NO：1099)，其中X1选自D和G，X2选自F、I和V，X3选自R、S和无氨基酸，X4选自G、Y和无氨基酸，X5选自D、G、S和无氨基酸，X6选自A、S和Y，X7选自A和Y，X8选自N和S；GFSLSNARMGVS(SEQ ID NO：279)；和GFSLX1TGGVGVG(SEQ ID NO：1100)，其中X1选自S和N；(iv)选自SEQ ID NO：300-331的CDRH2；(v)在氨基酸序列上与(iv)的CDRH2相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRH2；和(vi)选自下列的CDRH2氨基酸序列：X1X2X3X4X5X6GX7TX8X9X10QKX11X12(SEQ ID NO：1101)，其中X1选自S和W，X2选自F和I，X3选自D、N和S，X4选自A和P，X5选自E、N和S、X6选自D、N和S，X7选自E、G和N，X8选自I和N，X9选自C、H和Y，X10选自A和T，X11选自F和L，X12选自D和G；IIYPX1DSDX2RYSPSFQG(SEQ ID NO：1102)，其中X1选自D和G，X2选自A、I和T；X1IX2X3DGSX4X5X6YX7DSVX8G(SEQ ID NO：1103)，其中X1选自F和V，X2选自S和W，X3选自D、S和Y，X4选自I、N和T，X5选自K和Q，X6选自N、R和Y，X7选自A、T和V，X8选自K和R；X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG(SEQ ID NO：1104)，其中X1选自A、H和Y，X2选自G、R和S，X3选自G和S，X4选自G、R和S，X5选自S、T和Y，X6选自I和T；X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11YX12X13SX14KS(SEQ ID NO：1105)，其中X1选自E、R和Y，X2选自I和T，X3选自H、N和Y，X4选自C、H、S、T和Y，X5选自S和R，X6选自G和S，X7选自G、K、S和T，X8选自T和W，X9选自N和Y，X10选自N和无氨基酸，X11选自D和无氨基酸，X12选自A和N，X13选自P和V，X14选自L和V；X1IFSNDEKSYSTSLKS(SEQ ID NO：1033)，其中X1选自H和LI；和LI YWNX1X2KRYSPSLX3S(SEQID NO：1034)，其中X1选自D和V，X2选自D和E，X3选自K和R。
在一些实施方案中，CDRL1、CDRL2和CDRL3序列中的至少2个或所有3个来源于共有序列的相同的组A、B、C、D、E或F，和/或CDRH1、CDRH2和CDRH3序列中的至少2个或所有3个来源于相同的组A、B、C、D、E、F或G。在其他情况下，将来自不同共有序列组的CDR混合和搭配。
在另一个实施方案中，上文中描述的分离的抗原结合蛋白包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，两者的序列彼此共价连接。在另外的实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包括SEQ ID NO：234-274的CDRL3、SEQ ID NO：218-233的CDRL2和SEQ ID NO：189-217的CDRL1。在另一方面，分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：332-372的CDRH3，SEQ ID NO：300-331的CDRH2和SEQ IDNO：275-299的CDRH1。
在一个方面，本文中提供的分离的抗原结合蛋白可以是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。
在另一个实施方案中，本文中提供的分离的抗原结合蛋白的抗体片段可以是Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、双价抗体或单链抗体分子。
在另外的实施方案中，本文中提供的分离的抗原结合蛋白是人抗体并且可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类型。
在另一个方面，可将本文中提供的分离的抗原结合蛋白偶联至标记基团，例如放射性同位素、放射性核素、荧光基团、酶基团、化学发光基团、生物素基团或预先确定的多肽基团，或效应子基团例如放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗性基团或化学治疗基团。治疗性基团或化学治疗基团的实例是卡奇霉素、auristatin-PE、格尔德霉素、美登纳新或其衍生物。
在另一个方面，本发明包括与任何上述抗原结合蛋白竞争的抗原结合蛋白。
如将由本领域技术人员认识到的，对于具有多于一个的来自所描述的序列的CDR的任何抗原结合蛋白，可使用独立地选自所描述的序列的CDR的任何组合。因此，可产生具有1、2、3、4、5或6个独立地选择的CDR的抗原结合蛋白。然而，如将由本领域技术人员所认识到的，特定实施方案通常使用非重复的CDR的组合，例如，抗原结合蛋白通常不由两个CDRH2区域制备，等。
在下文中更详细地论述提供的一些抗原结合蛋白。
1.抗原结合蛋白和结合表位
当认为抗原结合蛋白结合多肽例如HB-EGF的特定残基中的表位时，例如，所指的意思是抗原结合蛋白特异性结合由特定残基组成的多肽(例如，HB-EGF的特定区段)。这样的抗原结合蛋白通常并非与HB-EGF中的每一个残基接触。HB-EGF的细胞外结构域或HB-EGF内的每一个单个氨基酸置换或缺失并不一定显著影响结合亲和力。抗原结合蛋白的表位特异性可以用多种方法来测定。例如，一个方法包括检测横跨抗原的序列的并且以少量氨基酸(例如，3个氨基酸)增量相异的大约15个氨基酸的重叠肽的集合。将肽固定在微量滴定板的孔内。可通过生物素化肽的一个末端来实现固定。任选地，为了比较目的，可在氨基端和羧基端生物素化相同肽的不同样品，然后将其固定在分开的孔中。这用于鉴定末端特异性抗原结合蛋白。任选地，可通过在特定的目的氨基酸上终止来包括另外的肽。该方法可用于鉴定抗HB-EGF的内部片段的末端特异性抗原结合蛋白。就与每一个不同的肽的特异性结合筛选抗原结合蛋白或免疫功能片段。表位定义为抗原结合蛋白对其显示特异性结合的所有的肽共有的氨基酸的区段。关于界定表位的特定方法的详细内容示于实施例23中。
如实施例23中所显示的，本文中提供的抗原结合蛋白能够结合HB-EGF的至少一个含有IHGE的表位和/或EGF样结构域。
2.竞争性抗原结合蛋白
在另一个方面，提供了抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白与例举的抗体或功能性片段中的一个竞争对上述表位的结合(以特异性结合HB-EGF)。这样的抗原结合蛋白还可结合与本文中示例的抗原结合蛋白之一相同的表位或交叠表位。预期与示例的抗原结合蛋白竞争或结合与其相同的表位的抗原结合蛋白和片段显示相似的功能特性。示例的抗原结合蛋白和片段包括上文中描述的那些，包括具有图1、2、3、4、6和7中包括的重链和轻链、可变区结构域和CDR的那些。
3.人抗体和抗体的人源化
在一个实施方案中，HB-EGF抗原结合蛋白是人抗体或人源化的抗体。人抗体避免了与具有鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体相关的许多问题。此类鼠或大鼠来源的蛋白的存在可导致抗体的快速清除或可导致患者产生抗抗体的免疫应答。为了避免使用鼠或大鼠来源的抗体，已通过将功能性人抗体基因座导入啮齿类动物、其他哺乳动物或动物(从而使啮齿类动物、其他哺乳动物或动物产生完全人抗体)来产生完全人抗体。
用于产生完全人抗体的一个方法是使用小鼠的品系，其经工程改造包含多达但小于1000kb大小的人重链基因座和κ轻链基因座的种系配置的片段。参见，例如Mendez等人，1997，NatureGenetics 15：146-156，以及Green和Jakobovits，1998，J.Exp.Med.188：483-495。
Figure GSB00001007631900582
品系可从Abgenix，Inc.(Fremont，CA)获得。
小鼠的
Figure GSB00001007631900583
品系的产生论述和详细描述于1990年1月12日提交的美国专利申请系列07/466,008、1990年11月8日提交的07/610,515、1992年7月24日提交的07/919,297、1992年7月30日提交的07/922,649、1993年3月15日提交的08/031,801、1993年8月27日提交的08/112,848、1994年4月28日提交的08/234,145、1995年1月20日提交的08/376,279、1995年4月27日提交的08/430,938、1995年6月5日提交的08/464,584、1995年6月5日提交的08/464,582、1995年6月5日提交的08/463,191、1995年6月5日提交的08/462,837、1995年6月5日提交的08/486,853、1995年6月5日提交的08/486,857、1995年6月5日提交的08/486,859、1995年6月5日提交的08/462,513、1996年10月2日提交的08/724,752、1996年12月3日提交的08/759,620、2001年11月30日提交的美国公开案2003/0093820和美国专利6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598以及日本专利3 068180 B2、3 068 506 B2和3 068 507 B2中。也参见，1996年6月12日公开的欧洲专利EP 0463151 B1、1994年2月3日公开的国际专利申请案WO 94/02602、1996年10月31日公开的国际专利申请案WO96/34096、1998年6月11日公开的WO 98/24893、2000年12月21日公开的WO 00/76310。每一个上述专利、申请和参考文献的公开内容以其全文通过引用合并入本文。
在备选方法中，其他的包括GenPharm International，Inc.已利用“微小基因座(minilocus)”方法。在微小基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的片段(单独的基因)来模拟外源Ig基因座。因此，将一个或多个VH基因，一个或多个DH基因，一个或多个JH基因，μ恒定区以及通常第二恒定区(优选γ恒定区)构建入用于插入动物的构建体。该方法描述于属于Surani等人的美国专利5,545,807和各自属于Lonberg和Kay的美国专利5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299和6,255,458、属于Krimpenfort和Berns的美国专利5,591,669和6,023,010、属于Berns等人的美国专利5,612,205、5,721,367和5,789,215以及属于Choi和Dunn的美国专利5,643,763，以及1990年8月29日提交的GenPharm国际美国专利申请系列案07/574,748、1990年8月31日提交的07/575,962、1991年12月17日提交的07/810,279、1992年3月18日提交的07/853,408、1992年6月23日提交的07/904,068、1992年12月16日提交的07/990,860、1993年4月26日提交的08/053,131、1993年7月22日提交的08/096,762、1993年11月18日提交的08/155,301、1993年12月3日提交的08/161,739、1993年12月10日提交的08/165,699、1994年3月9日提交的08/209,741中，其公开内容通过引用合并入本文。也参见，欧洲专利0 546 073 B1、国际专利申请WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884以及美国专利5,981,175，其公开内容以其全文通过引用合并入本文。
Kirin也已显示从其中通过微细胞融合已导入了大的染色体片段或完整染色体的小鼠产生人抗体。参见，欧洲专利申请773 288和843961，其公开内容通过引用合并入本文。此外，已产生KMTM小鼠，其是Kirin′s Tc小鼠与Medarex′s微小基因座(Humab)小鼠杂交育种的结果。这些小鼠具有Kirin小鼠的人IgH转染色体(transchromosome)和Genpharm小鼠的κ链转基因(Ishida等人，2002，Cloning StemCells 4：91-102)。
还可通过体外方法产生人抗体。合适的实例包括但不限于噬菌体展示(CAT，Morphosys，Dyax，Biosite/Medarex，Xoma，Symphogen，Alexion(之前为Proliferon)，Affimed)，核糖体展示(CAT)、酵母展示等。
E.抗体的制备
通过使用本文中描述的
Figure GSB00001007631900601
技术制备本文中描述的抗体。此类小鼠能够产生人免疫球蛋白分子和抗体并且基本上不产生鼠免疫球蛋白分子和抗体。用于产生人抗体的技术公开于本文中公开的专利、申请和参考文献中。在一些实施方案中，如1996年12月3日提交的美国专利申请系列08/759,620和1998年6月11日公开的国际专利申请WO 98/24893和2000年12月21日公开的WO 00/76310(其公开内容通过引用合并入本文)中所公开的，进行小鼠和人抗体的转基因产生。也参见Mendez等人，1997，Nature Genetics 15：146-156，其公开内容通过引用合并入本文。
通过使用此类技术，已产生了抗许多抗原的全长人单克隆抗体。通常，用目的抗原(例如HB-EGF)免疫小鼠的
Figure GSB00001007631900602
品系，从高度免疫的小鼠回收淋巴细胞(例如B细胞)，然后将回收的淋巴细胞与骨髓型细胞系融合以制备永生化的杂交瘤细胞系。筛选和选择此类杂交瘤细胞系以鉴定产生特异于目的抗原的抗体的杂交瘤细胞系。还可就抗HB-EGF片段的免疫反应性筛选上清液，以进一步绘制结合HB-EGF上的功能目的结构域的不同抗体的图谱。还可筛选与EGFR或其家族成员的其他配体、其他相关人趋化因子结合的和抗HB-EGF的大鼠、小鼠和非人灵长类动物例如食蟹猴直系同源物的抗体，最后以确定物种交叉反应性。本文中提供了用于产生多种杂交瘤细胞系(其产生特异于HB-EGF的抗体)的方法。此外，本文中提供了由此类细胞系产生的抗体的特征，包括此类抗体的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列分析。
备选地，可直接测定B细胞，而无需融合至骨髓瘤细胞以产生杂交瘤。例如，可从高度免疫的
Figure GSB00001007631900611
小鼠分离B细胞，让其增殖并且分化成抗体分泌型浆细胞。然后通过ELISA就抗HB-EGF免疫原的反应性筛选来自细胞上清液的抗体。还可就抗HB-EGF片段的免疫反应性筛选上清液以进一步绘制结合HB-EGF上的功能目的结构域的不同抗体的图谱。还可筛选与EGF受体或其家族成员的其他配体、其他相关人趋化因子结合的和抗HB-EGF的大鼠、小鼠和非人灵长类动物例如食蟹猴直系同源物的抗体，最后以确定物种交叉反应性。可利用各种方法永生化来自包含目的抗体的孔的B细胞，所述方法包括融合以从单独的孔或从混合的孔产生杂交瘤，或用EBV感染或用已知的永生化基因转染，然后涂板在适当的培养基中。备选地，然后使用HB-EGF特异性溶血空斑测定(hemolytic plaque assay)(Babcook等人，1996，Proc.Nat1.Acad.Sci USA 93：7843-48)分离分泌具有期望的特异性的抗体的单个浆细胞。被靶向以裂解的细胞优选是包被有HB-EGF抗原的绵羊红细胞(SRBC)。
如上所述，存在许多抗体的同种型，包括但不限于下列：人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。应理解，产生的抗体最初不需要具有这样的同种型，相反地，当产生时，抗体可具有任何同种型，以及应理解可通过使用本领域内熟知的常规分子生物学技术，利用合适的表达载体中的分子克隆的V区基因或克隆的恒定区基因或cDNA，然后使用本领域内已知的技术在宿主细胞中表达抗体，来对抗体进行同种型转换。
通常，由融合的杂交瘤产生的抗体是具有完全人κ链的人IgG2重链或人IgG4重链。抗体还可以是其他人同种型，包括IgG1或IgG3。抗体具有高亲和力，通常具有大约10-6至大约10-12M或更低的KD，当通过固相和液相技术测量时。具有至少10-9M的KD的抗体优选用于抑制HB-EGF的活性。具有至少10-10M的KD的抗体也优选用于抑制HB-EGF的活性。具有至少10-11M的KD的抗体也优选用于抑制HB-EGF的活性。
如将意识到的，可在除了杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达抗HB-EGF抗体。可使用编码特定抗体的序列转染合适的哺乳动物宿主细胞。在用于转染和随后表达抗体的合适的载体的构建过程中，可将抗体从一种同种型类别转换成另一种同种型，例如可通过本领域内已知的技术将IgG4抗体类别转换成IgG2。可通过用于将多核苷酸导入宿主细胞的任何已知的方法(包括例如将多核苷酸包装入病毒中(或病毒载体中)，然后用病毒(或载体)转导宿主细胞)或通过本领域内已知的转染方法(如美国专利4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455(所述专利通过引用合并入本文)所例举的)进行转染。所使用的转化方法取决于待转化的宿主。用于将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法在本领域内是熟知的，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸在脂质体中的封装和DNA至细胞核内的直接显微注射。
可作为用于表达的宿主获得的哺乳动物细胞系在本领域内是熟知的并且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、人上皮肾293细胞和许多其他细胞系。通过确定具有高表达水平且产生大量的抗HB-EGF抗体的细胞系来选择特别优选的细胞系。
备选地，可从经基因工程改造以产生完全人抗体的动物或从在噬菌体、酵母、核糖体或大肠杆菌(E.coli)中制备的抗体展示文库制备此类抗体。参见，例如，Clackson等人，1991，Nature 352：624-628，Marks等人，1991，J.Mol.Biol.222：581-597，Feldhaus和Siegel，2004，J.Immunol.Methods.290：69-80，Groves和Osbourn，2005，Expert Opin Biol Ther.5：125-135以及Jostock和Dubel，2005，Comb Chem High Throughput Screen.8：127-133。
另一方面涉及编码HB-EGF抗原结合蛋白例如抗体的分离的核酸分子。在本文的上下文中，术语“分离的核酸分子”，如本文中所使用的，根据其来源，意指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或其一些组合，“分离的核酸分子”(1)不与在其中天然发现“分离的多核苷酸”的所有或部分多核苷酸结合，(2)与其在天然状态下不与之连接的多核苷酸有效连接，或(3)不作为更大的序列的部分天然发生。此外，术语“核酸分子”，如本文中所提及的，意指长度为至少10个碱基的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式例如具有修饰的或取代的糖基的核苷酸等)的多聚体形式。术语还包括DNA的单链和双链形式。在下文中更详细地描述编码抗原结合蛋白或其部分的示例性核酸。
在一个实施方案中，将核酸分子有效连接至控制序列。术语“控制序列”，如本文中使用的，是指实现与它们连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。取决于宿主生物，此类控制序列的性质不同。在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。在真核生物中，一般地，此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意欲包括(在最低程度上)其存在是表达和加工所必需的所有组件，并且还可包括其存在是有利的另外的组件，例如，前导序列和融合伴侣序列。此外，术语“有效连接的”，如本文中所使用的，是指处于允许它们以期望的方式发挥功能的关系中的所述组件的位置。此外，如本文中所提供的，与编码序列有效连接的表达控制序列以在与表达控制序列相容的条件下获得编码序列的表达的方式连接。
另外的方面是包含编码本文中提供的HB-EGF抗原结合蛋白的核酸分子的载体。可将核酸分子与控制序列有效连接。此外，载体可额外地包含复制起始区或选择标记基因。可使用的载体的实例是例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。
F.基于基本抗体结构的抗原结合蛋白
如上所述，已知基本抗体结构单位包含四聚体。各四聚体由两个相同的多肽链对组成，各对具有一个“轻链”(大约25kDa)和一个“重链”(大约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包括大约100至110或更多个氨基酸的可变区(主要负责抗原识别)。各链的羧基末端部分界定了负责二聚化效应子功能、循环半衰期和其他功能的恒定区。人轻链分类为κ和λ轻链。重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，对于重链还包括大约10或更多个氨基酸的“D”区。通常参见FundamentalImmunology Ch.7(Paul，W.编辑，第2版.Raven Press，N.Y.(1989))(以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的)。各轻链/重链对的可变区形成了抗体的抗原结合位点。
因此，完整的IgG抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中外，两个结合位点是相同的。
链的可变区都展示相同的一般结构：通过3个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接相对保守的构架区(FR)。来自各个对的两个可变区的CDR通过构架区联配，从而使得能够与抗原上的特定表位结合。轻链和重链的可变区从N末端至C末端都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR 3、CDR3和FR4。氨基酸至各结构域的分配遵从KabatSequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))，或Chothia&Lesk，1897，J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989，Nature 342：878-883的定义。
因此，本文中提供的抗体可包括至少一个具有式FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区多肽链，其中FR1是第一人构架区，CDR1是第一互补决定区，FR2是第二人构架区，CDR2是第二互补决定区，FR3是第三人构架区，CDR3是第三互补决定区，以及FR4是第四人构架区。CDR3通常是抗体可变区的最多样的区域。
在一些实施方案中，FR1区包括但不限于氨基酸序列SEQ IDNO：373-393，1066，1067和/或452-468的任一个；CDR1区包括但不限于氨基酸序列SEQ ID NO：189-217和/或275-299的任一个；FR2区包括但不限于氨基酸序列SEQ ID NO：394-413，1068-1074和/或469-480的任一个；CDR2区包括但不限于氨基酸序列SEQ IDNO：218-233和/或300-331的任一个；FR3区包括但不限于氨基酸序列SEQ ID NO：414-439和/或481-510，1075的任一个；CDR3区包括但不限于氨基酸序列SEQ ID NO：234-274和/或332-372的任一个；以及FR4区包括但不限于氨基酸序列SEQ ID NO：440-451和/或511-516的任一个。因此，在一些实施方案中，本文中提供的人抗体具有一个或多个本文中提供的氨基酸序列。
应理解，本文中提供的抗体的氨基酸序列不限于20种常规氨基酸(参见，Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其通过引用合并入本文)。例如，氨基酸可包括20种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸例如α-，α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸。也可以是提供的抗体的合适的组分的非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他类似的氨基酸和亚氨基酸，例如4-羟脯氨酸。
此外，预期包括SEQ ID NO：1-516，1065-1075，1033-1041和1089-1116中显示的氨基酸序列中的小变异，只要氨基酸序列中的变异保持SEQ ID NO：1-516，1065-1075，1033-1041和1089-1116中所示的序列的至少75％，更优选至少80％、90％、95％和最优选99％即可。SEQ ID NO：1-516，1065-1075，1033-1041和1089-1116中显示的氨基酸序列中的优选变异，即，至少一个氨基酸的缺失、插入和/或置换，在功能结构域的边界附近发生。可通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或私人拥有的序列数据库相比较来鉴定结构和功能结构域。可使用计算机化的比较方法来鉴定在已知结构和/或功能的其他抗体中发生的预测的蛋白质构象结构域或序列基序。鉴定折叠入已知的三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。参见，例如，Bowi e等人，1991，Science 253：164；Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze，eds.，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton等人，1991，Nature 354：105，其全都通过引用合并入本文。因此，本领域技术人员可识别可用于界定结构和功能结构域的序列基序和结构构象。
SEQ ID NO：1-516，1065-1075，1033-1041和1089-1116中所示的氨基酸序列中的特别优选的变异是导致减少的对蛋白质水解或氧化的易感性、改变糖基化模式或改变结合亲和力或赋予或改变抗体的其他物理化学或功能特性的变异。特别地，涉及保守氨基酸置换。保守置换是在其侧链相关的氨基酸的家族内发生的置换。优选的氨基酸家族如下：酸性家族＝天冬氨酸、谷氨酸；碱性家族＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；非极性家族＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和不带电荷的极性家族＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的家族是：脂肪族-羟基家族＝丝氨酸和苏氨酸；含有酰胺的家族＝天冬酰胺和谷氨酸胺；脂肪族家族＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；和芳香族家族＝苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。例如，可合理地预期，用异亮氨酸或缬氨酸对亮氨酸的分离的置换、用谷氨酸对天冬氨酸的分离的置换、用丝氨酸对苏氨酸的分离的置换或用结构上相关的氨基酸对氨基酸的相似置换将对所得抗体的结合或性质不具有重大影响，特别是如果置换不涉及构架部位内的氨基酸。然而，还包括所有其他可能的氨基酸置换。氨基酸变化是否导致功能性抗体，即，结合HB-EGF并且减小、中和或或显著抑制HB-EGF的功能的抗体，可通过在ELISA或FACS中就与HB-EGF的结合测定所得抗体的特异性活性或通过体外或体内功能测定来容易地进行确定。
可通过影响，例如减少或抑制HB-EGF与其受体例如EGFR或HER4的结合来引起HB-EGF介导的信号转导的减少、中和或显著抑制。
术语“抗体”或“抗HB-EGF抗体”，如本文中所使用的，意指单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体(Jones等人，1986，Nature 321：522-525；Riechmann等人，1988，Nature 332：323-329；和Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596)、嵌合抗体(Morrison等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.81：6851-6855)、从至少两个抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或其抗体片段。术语“抗体片段”包括上述抗体的任何部分，优选至少一个它们的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、双价抗体(Hollinger等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448)、单链抗体分子(Plückthun in：The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113，Rosenburg和Moore，EDS，Springer Verlag，N.Y.(1994)，269-315)和其他片段，只要它们展示期望的结合HB-EGF的能力。
此外，术语“抗体”或“抗HB-EGF抗体”，如本文中所使用的，可包括包含抗体或天然发生的抗体变体的经工程改造的亚结构域的抗体样分子。此类抗体样分子可以是单链结构域抗体例如来源于天然来源例如骆驼(Muyldermans等人，2001，Reviews in MolecularBiotechnology 74，277-302)的或通过来自人、骆驼或其他物种的文库的体外展示(Holt等人.，2003，Trends Biotechnol.21：484-90)产生的只有VH或只有VL的结构域。
“Fv片段”是包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在该构型中各可变结构域的3个CDR相互作用以在VH-VL二聚体的表面上界定抗原结合位点。6个CDR共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或只包含特异于抗原的3个CDR的一半的Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管通常以比完整结合位点更低的亲和力。“Fab片段”还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。“Fab片段”与“Fab′片段”相异在于在重链CH1结构域的羧基末端上添加少数几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。“F(ab′)2片段”最初产生为在它们之间具有铰链半胱氨酸的一对“Fab′片段”。制备此类抗体片段的方法，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶降解，对于本领域技术人员来说是已知的。
本文中提供的抗体可引起(fix)补体依赖性细胞毒性(CDC)或激活抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，特别是IgG1抗体、通过分子生物学从人或哺乳动物来源的IgG2或IgG4或另一个同种型类别转换的IgG1变体或从产生人IgG1的小鼠从新产生的IgG1变体。还可使用其他方法。有时可将本文中提供的抗体偶联至标记基团或效应子基团，例如毒素、化学治疗剂、报告分子或显象剂。
G.其他类型的HB-EGF结合蛋白
在另一个方面，本文中提供的HB-EGF抗原结合蛋白是具有抗体样结合活性(即结合HB-EGF)的支架蛋白(scaffold protein)。
在本发明的背景中，术语“支架蛋白”，如本文中所使用的，意指其折叠对修饰例如多个插入、缺失或置换具有高度耐受性的多肽构架。该固有的构象稳定性使得能够在蛋白质的确定区域内进行定向随机化和剧烈变化。因此，其获得了某些新的特性，然而，其总体结构完整性和原始物理化学行为仍然得到保持。该从新采用的特性主要但非唯一地包括对预先确定的靶分子的结合特异性。
目前，正在使用许多支架蛋白，其模拟常规抗体的结合原理至不同程度(Hey等人，2005，Trends in Biotechnol.23：514-22)。可根据本发明使用的支架蛋白的实例可细分为不同类型。抗体相关支架，其被定义为抗体的衍生物，所述抗体的衍生物在大小上天然更小并且在结构上更简单或已以这样的方式进行了工程改造。该类型包括例如所谓的纳米抗体(Nanobody)(综述于Hey等人，Trends in Biotechnol.2005；23(10)；514-522)、结构域抗体(Holt等人，2003，Trends inBiotechnol.21：484-489)或鲨鱼抗原反应性蛋白(shark antigenreactive proteins)(Holt等人.Trends in Biotechnol.2003；21；484-489)。第二种类型的支架蛋白是耐受单个环肽的插入或随机化的刚性蛋白折叠如Kunitz-型结构域(Dennis等人，1995；J.Biol.Cell.270：25411-25417)、人转铁蛋白(Ali等人，1999；J.Biol.Cell.274：24066-24074)或半胱氨酸结(cystein-knot)结构基序(Christmann等人，1999，Protein Eng.12：797-806)。共有与抗体类似的在刚性保守构架上具有多个高变环的原理的代表性蛋白是人CTLA-4(Hufton等人，2000FEBS Lett.475：225-231)、人纤连蛋白III型结构域(Koide等人，1998；J.Mol.Biol.284：1141-1151)、C型凝集素样结构域或脂质运载蛋白(Skerra，2001，J.Biotechnol.74：257-275)。具有通过部分或完全位于蛋白质的刚性二级结构内的氨基酸残基产生的结合特异性的支架是例如锚蛋白重复蛋白(Binz，2003，J.Mol.Biol.332：489-503)、蛋白A的Z结构域(Nord等人，1995，Protein Eng.8：601-608)或γ-晶体蛋白(crystalline)(Fiedler和Rudolph，2001，国际专利申请WO 01/04144)。支架蛋白和肽以及其应用综述于Hey等人，2005，Trends in Biotechnol.23：514-522；Binz等人，2005，Nature Biotechnol.23：1257-1268和Holliger等人，2005，Nature Biotechnol.23：11261136。
支架蛋白工程改造可被当作是将亲和功能移植至或整合入多肽构架(其折叠对修饰具有高度耐受性)的结构构架。亲和功能根据本发明意指蛋白质结合亲合力。支架在结构上可与赋予结合特异性的氨基酸序列分离。通常，可通过合理的或最通常地，组合蛋白质工程技术获得适合用于开发此类人工亲和试剂的蛋白质，例如，使用本领域内已知的技术(Skerra，2000，J.Mol.Recog.Jul-Aug；13(4)：167-87；Binz和Plückthun，2005，Aug；16(4)：459-69)针对抗原例如HB-EGF(纯化的蛋白质或在细胞表面上展示的蛋白质)在体外展示的人工支架文库中淘选结合剂。此外，具有抗体样结合活性的支架蛋白可来源于包含支架结构域的受体多肽，例如前述蛋白之一，所述受体多肽可移植供体多肽的结合结构域以将供体多肽的结合特异性赋予含有支架结构域的受体多肽。所述插入的结合结构域可以是例如抗体特别地HB-EGF抗体的一个或多个互补决定区(CDR)。优选CDR是CDR3。可通过本领域技术人员已知的各种方法(包括例如，多肽合成、编码氨基酸的核酸合成)以及通过本领域技术人员熟知的各种形式的重组方法进行插入。
H.HB-EGF抗原结合蛋白缀合物
在另一个实施方案中，将本文中提供的HB-EGF抗原结合蛋白例如抗体偶联至标记基团。这样的标记的抗原结合蛋白特别适合用于诊断应用。如本文中所使用的，术语“标记基团”是指可检测的标志物，例如放射性标记的氨基酸或可通过经标记的抗生物素蛋白(例如，与可通过光学法或比色法检测的荧光标志物或酶促活性结合的链霉抗生物素蛋白)检测的生物素基部分。用于标记多肽和糖蛋白例如抗体的各种方法在本领域内是已知的并且可被使用。合适的标记基团的实例包括但不限于下列：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如，FITC、罗丹明、稀土元素磷光体)、酶基团(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团或由第二报告分子识别的预先确定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在某些方面，可能期望通过各种长度的间隔臂连接标记基团以减小潜在的空间位阻。
备选地，可将本文中提供的HB-EGF抗原结合蛋白，例如抗体偶联至效应子基团。这样的效应子修饰的抗原结合蛋白特别适合于治疗性应用。如本文中使用的，术语“效应子基团”是指细胞毒性基团例如放射性同位素或放射性核素、毒素、治疗性基团或本领域内已知的其他效应子基团。合适的效应子基团的实例是放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、卡奇霉素、多拉司他汀类似物例如auristatin和化学治疗剂例如格尔德霉素和美登纳新衍生物，包括DM1。在某些方面，可期望通过各种长度的间隔臂连接效应子基团以减小潜在的空间位阻。
同样如本文中所描述的，本文中提供的许多高度有用的HB-EGF抗原结合蛋白，例如抗体制剂，识别HB-EGF的EGF样结构域内的表位，其包括蛋白质的残基106-149，例如具有下列序列：PCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGY HGERCHGLSLP(SEQ ID NO：1046)。在一些实施方案中，被本文中提供的抗原结合蛋白识别的表皮生长因子表位包括氨基酸序列IHGE。因此，提供了结合和识别HB-EGF的含有IHGE的表位和/或EGF样结构域(例如SEQ ID NO：1046)的抗体制剂。
抗HB-EGF抗原结合蛋白可用于检测患者样品中的HB-EGF，从而可用作本文中描述的疾病状态的诊断剂。此外，基于它们显著抑制HB-EGF和/或EGF受体活性的能力(如在下文的实施例中所显示的)，HB-EGF抗原结合蛋白在治疗由HB-EGF表达和/或HB-EGF活性引起的症状和病况中具有治疗效果。在特定的实施方案中，本文中的抗原结合蛋白和方法涉及由HB-EGF相关疾病、HER4-相关疾病或EGF受体相关疾病状态例如癌症病况引起的症状的治疗。另外的实施方案包括使用本文中描述的抗原结合蛋白和方法治疗不期望的血管生成、肿瘤疾病例如黑素瘤、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、甲状腺肿瘤、胃(胃部)癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌和胰腺癌。
I.编码HB-EGF抗原结合蛋白的核酸
还提供了编码本文中描述的抗原结合蛋白或其部分的核酸，包括编码抗体的一条或两条链或其片段、衍生物、突变蛋白或变体的核酸、编码重链可变区或只编码CDR的多核苷酸、足以用作杂交探针的多核苷酸、用于鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的PCR引物或测序引物、用于抑制多核苷酸的表达的反义核酸和前述的互补序列。核酸可以是任何长度。它们的长度可以是例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000或更多个核苷酸，和/或它们可包含一个或多个额外的序列，例如，调控序列和/或可以作为更大的核酸例如载体的一部分。核酸可以是单链的或双链的并且可包含RNA和/或DNA核苷酸，以及其人工变体(例如，肽核酸)。图15A-15V描述了抗原结合蛋白的不同轻链的核苷酸序列。图16A-16C描述了抗原结合蛋白的不同重链的核苷酸序列。图13A-13M描述了抗原结合蛋白的不同轻链可变区的核苷酸序列。图14A-14L描述了抗原结合蛋白的不同重链可变区的核苷酸序列。图18A-18F描述了抗原结合蛋白的轻链可变区的不同CDR区的核苷酸序列。图19A-19G描述了抗原结合蛋白的重链可变区的不同CDR区的核苷酸序列。图20A-20K描述了抗原结合蛋白的轻链可变区的不同FR区的核苷酸序列。图21A-21K描述了抗原结合蛋白的重链可变区的不同FR区的核苷酸序列。图17A描述了抗原结合蛋白的轻链恒定区的核苷酸序列。最后，图17B描述了抗原结合蛋白的重链恒定区的核苷酸序列。
可从已用HB-EGF或其免疫原性片段免疫的小鼠的B细胞分离编码某些抗原结合蛋白或其部分(例如，全长抗体、重链或轻链可变结构域或CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3)的核酸。可通过常规方法例如聚合酶链式反应(PCR)分离核酸。噬菌体展示是可籍以制备其他抗原结合蛋白和抗体的衍生物的已知技术的另一个实例。在一个方法中，在任何合适的重组表达系统中表达作为目的抗原结合蛋白的组件的多肽，并允许所表达的多肽组装以形成抗原结合蛋白分子。
一个方面还提供了在特定的杂交条件下与其他核酸(例如，包含图13至21中所述的核苷酸序列的核酸)杂交的核酸。用于杂交核酸的方法在本领域内是熟知的。参见，例如，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。如本文中所定义的，中度严格杂交条件使用含有5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的预清洗溶液，大约50％甲酰胺、6xSSC的杂交缓冲液和55℃的杂交温度(或其他相似杂交溶液，例如含有大约50％甲酰胺的溶液和42℃的杂交温度)，和60℃下于0.5x SSC、0.1％SDS中的清洗条件。严格杂交条件在45℃下于6x SSC中杂交，然后在68℃下于0.1x SSC，0.2％SDS中进行一次或多次清洗。此外，本领域技术人员可操控杂交和/或清洗条件以提高或降低杂交的严格性，以使包含彼此至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一的核苷酸序列的核酸通常保持彼此杂交。
影响杂交条件的选择的基本参数和用于设计合适的条件的指导方针示于例如Sambrook，Fritsch和Maniatis(2001，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，同上和Current Protocols inMolecular Biology，1995，Ausubel等人，eds.，John Wiley & Sons，Inc.，sections 2.10和6.3-6.4)中，并且它们可由本领域技术人员基于例如核酸的长度和/或碱基组成容易地确定。
可通过突变将变化导入核酸，从而导致其编码的多肽(例如，抗体或抗体衍生物)的氨基酸序列发生变化。可使用本领域内已知的任何技术导入突变。在一个实施方案中，使用例如定点诱变方案改变一个或多个特定的氨基酸残基。在另一个实施方案中，使用例如随机诱变方案改变一个或多个随机选择的残基。无论如何进行突变，都可表达突变的多肽，并且可就期望的性质筛选突变的多肽。
可将突变导入核酸而不显著改变其编码的多肽的生物学活性。例如，可产生导致非必需氨基酸残基上的氨基酸置换的核苷酸置换。备选地，可向核酸中导入一个或多个选择性改变核酸编码的多肽的生物学活性的突变。例如，突变可定量或定性改变生物学活性。定量改变的实例包括增加、减少或消除活性。定性改变的实例包括改变抗体的抗原特异性。
另一个方面提供了适合用作检测核酸序列的引物或杂交探针的核酸分子。核酸分子可只包含编码全长多肽的核酸序列的一部分，例如，可用作探针或引物的片段或编码多肽的活性部分(例如，HB-EGF结合部分)的片段。
基于核酸序列的探针可用于检测核酸或相似的核酸，例如编码多肽的转录物。探针可包含标记基团，例如放射性核素、荧光化合物、酶或酶辅因子(co-factor)。此类探针可用于鉴定表达多肽的细胞。
另一个方面提供了包含编码多肽或其部分(例如，包含一个或多个CDR或一个或多个可变区结构域的片段)的核酸的载体。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体、非附加型(non-episomal)哺乳动物载体和表达载体，例如重组表达载体。重组表达载体可以以适合于核酸在宿主细胞中表达的形式包含核酸。重组表达载体包含一个或多个与待表达的核酸序列有效连接的调控序列(其基于用于表达的宿主细胞进行选择)。调控序列包括在多种类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的调控序列(例如，SV40早期基因增强子、Rous肉瘤病毒启动子和巨细胞病毒启动子)、只在某些宿主细胞中指导核苷酸序列的表达的调控序列(例如，组织特异性调控序列，参见，Voss等人，1986 Trends Biochem.Sci.11：287，Maniatis等人，1987，Science 236：1237，以其全文通过引用合并入本文)，以及响应特定处理或条件而指导核苷酸序列的诱导型表达的调控序列(例如，哺乳动物细胞中的金属硫蛋白启动子以及原核和真核系统中的tet-响应和/或链霉素响应启动子(参见，同前)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于这样的因素如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等。可将表达载体导入宿主细胞，从而产生蛋白质或肽，包括由本文中所述的核酸编码的融合蛋白或肽。
另一个方面提供了已向其中导入了重组表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任何原核细胞(例如，大肠杆菌)或真核细胞(例如，酵母、昆虫或哺乳动物细胞(例如，CHO细胞))。可通过常规转化或转染技术将载体DNA导入原核或真核细胞。对于哺乳动物的稳定转染，已知，取决于所使用的表达载体和转染技术，只有小部分细胞可将外源DNA整合入它们的基因组。为了鉴定和选择此类整合体，通常将编码选择标记(例如，赋予对抗生素的抗性)的基因连同目的基因一起导入宿主细胞。优选的选择标记包括赋予对药物例如G418、潮霉素和甲氨蝶呤的抗性的选择标记。特别地，可通过药物选择鉴定用导入的核酸稳定转染的细胞(例如，已整合了选择标记基因的细胞将存活，而其他细胞将死亡)。
J.HB-EGF抗原结合蛋白用于诊断和治疗目的的用途
1.适应症(Indication)
本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白可用于检测或治疗许多疾病和病症，包括牵涉过度细胞增殖、不期望的细胞迁移和/或异常的血管生成的疾病。例如，此类HB-EGF抗原结合蛋白可抑制癌细胞中HB-EGF诱导的EGFR和/或HER4的酪氨酸磷酸化(图22-29)。这样的抑制可中断驱动细胞增殖和迁移以及血管生成的信号转导事件的级联。此外，HB-EGF抗原结合蛋白可干扰EGFR的反式激活。此外，此类抗原结合蛋白抑制基础HUVEC细胞增殖(图32B)、内皮细胞管形成(图33)和体内基质胶塞测定中HB-EGF诱导的血管形成(图36)。这些结果表明本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白在体外和体内抑制血管生成。此外，此类抗原结合蛋白还抑制不依赖于锚定的细胞生长(图34和图35)以及小鼠中异种移植物肿瘤的生长(图37和图38)。HB-EGF抗原结合蛋白还显著抑制MCF-7和MDA-MB231癌细胞的迁移(参见，图27和27)。因此，本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白攻击肿瘤和其他癌性病况的发展中的几个步骤，包括控制细胞增殖的信号转导事件、血管生成和与转移癌的扩散和发展相关的细胞迁移。这样的多方面干预对于控制和抑制癌症籍以发展的过程大有益处。此外，可治疗处于任何进展期的癌症(例如，早期癌症、转移癌和复发性癌症)。
除了HB-EGF抗原结合蛋白在检测和治疗处于不同进展期的癌症中的用途外，此类抗原结合蛋白还可用于检测许多不同类型的癌症。例如，HB-EGF以非常低的水平在正常乳腺和胰腺组织中表达。然而，HB-EGF在大约55％的胰腺癌细胞和大约70％的乳腺癌细胞中以高水平表达。此外，如实施例中所描述的，在不同的癌细胞系中检测到HB-EGF表达，这表明本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白可用于检测多种癌症类型。
例如，可通过所请求保护的抗原结合蛋白检测或治疗的癌症包括实体哺乳动物肿瘤以及血液恶性肿瘤。实体哺乳动物肿瘤包括儿童中的癌症，例如生殖细胞肿瘤、软组织肉瘤、原发性脑肿瘤、神经母细胞瘤、肾母细胞瘤和癌、特别是鳞癌(squamous carcinoma)和上皮癌。实体哺乳动物肿瘤还可包括成人癌症，例如未知来源的肿瘤，成人中的原发性脑癌，脑下垂体、嘴唇、口腔、鼻咽、喉、上颌窦、筛窦、唾液腺、甲状腺(包括甲状旁腺和类癌)、食道、胃、胰腺、小肠、结肠、直肠、肛管、肝脏、胆囊、肝外胆管(extra hepatic bile duct)、Vater壶腹(ampulla of vater)的肿瘤，类癌，胃-肠-肝系统的内分泌肿瘤，嗜铬细胞瘤和副神经节瘤，肾上腺、肺、胸膜、纵隔、胸腺，骨及软组织的肿瘤，嘴唇、眼睑、外耳、脸的其他未指明的部分、头皮和颈、躯干、上肢和肩、下肢和臀、阴户、阴茎、阴囊的皮肤肿瘤，乳腺肿瘤，阴户、阴道、子宫颈、子宫体、卵巢、输卵管的妇科肿瘤，妊娠和滋养层肿瘤，阴茎、前列腺、睾丸、肾、肾盂和输尿管、膀胱、尿道，眼睑、结膜、葡萄膜、视网膜、眼眶和泪腺的眼科肿瘤。血液恶性肿瘤包括儿童的肿瘤，例如，白血病和淋巴瘤、急性和慢性白血病(AML、ANLL、ALL、CML、MDS)、何杰金氏病、B细胞、T细胞、大细胞、滤泡、淋巴细胞和皮肤来源的惰性/低级、侵袭性/高级淋巴瘤、浆细胞肿瘤和与AI DS相关的癌症。
此外，本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白还可用于检测或治疗癌性病况或肿瘤性病症，其包括例如腺瘤、管状绒毛状腺瘤、绒毛状腺瘤、血管纤维瘤、非典型增殖性粘液性肿瘤(mucinous neoplasia)、勃勒纳肿瘤(Brenner tumor)、类癌、海绵状血管瘤、富细胞型平滑肌瘤、绒毛膜血管瘤、先天性中胚层肾瘤、粘液性囊腺瘤、浆液性囊腺瘤、皮样瘤、硬纤维瘤、纤维腺瘤、纤维瘤、纤维卵泡膜细胞瘤、滤泡腺瘤、神经节瘤、巨细胞瘤、颗粒细胞瘤、粒层细胞瘤、血管瘤、导管内乳头状瘤、胰岛细胞瘤、平滑肌瘤、脂肪瘤、黄体瘤、脑膜瘤、胎块(mole)、髓脂瘤、粘液瘤、神经纤维瘤、痣、骨软骨瘤、嗜铬细胞瘤、息肉、神经鞘瘤、浆液性囊腺瘤、卵巢甲状腺肿、滑膜软骨瘤病(synovial chrondromatosis)、良性胸腺瘤。
可用本文中描述的HB-EGF蛋白进行检测或治疗的癌症类型的另外的实例可见于例如美国癌症学会(www.cancer.org)或Wilson等人(1991)Harrison′s Principles of Internal Medicine，第12版，McGraw-Hill，Inc。
因此，本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白可用于治疗和/或预防癌症、癌性病况、肿瘤生长、癌细胞的转移、血管生成过程和/或肿瘤性病症。因此，此类抗原结合蛋白提供了治疗或预防受试者中的癌症的方法，该方法包括对受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含本文中描述的人和/或单克隆HB-EGF抗原结合蛋白制剂中的一种或其组合。
高比例的实体瘤疾病通常表征为由生长因子(即，VEGF)和其他因子(即，HB-EGF)介导的肿瘤血管生成、肿瘤组织中(异常)血管的过度生长。通过HB-EGF特异性抗原结合蛋白靶向HB-EGF可阻止新血管的形成，从而限制现有肿瘤的扩展和新肿瘤的发生(即，转移)。
HB-EGF除了作为促有丝分裂和促侵入(pro-invasive)配体外，几个研究已证实其可作为癌症中血管生成过程的重要调节剂。如实施例中所举例说明的，显示了HB-EGF在体内血管生成的调控中的功能。因此，本文中描述的抗原结合蛋白可用于治疗与血管生成相关或由其引起的疾病，例如癌性或非癌性疾病。
例如本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白可干扰平滑肌细胞(SMC)与内皮细胞之间的通讯(血管生成例如肿瘤血管生成中血管的发育和功能性中的基本过程)。
此外，此类抗原结合蛋白可以至少部分地抑制HB-EGF诱导的VEGF的表达和从SMC的释放(所述VEGF随后用作强效的内皮丝裂原)。类似地，VEGF增加内皮细胞中的HB-EGF产量，这从而构成了由这两个重要配体组成的促血管生成反馈回路(该回路可通过施用本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白来中断)。最近，除了VEGF外，还鉴定了另外的至关重要的促血管生成组分例如促血管生成素(angiopoetin)1和2(Ang-1&2)和它们的受体TIE-2以及有效的平滑肌细胞GPCR刺激物血管紧张素II(ATII)。有趣地，HB-EGF是内皮细胞中ATII诱导的EGFR反式激活以及VEGF和Ang-2的下游上调的至关重要的介体。在体内，ATII以HB-EGF依赖性方式诱导血管生成并且增强VEGF的血管生成活性。这些发现支持，平行于VEGF，HB-EGF能够通过Ang2激活另外的血管生成途径。因此，可通过施用有效量的本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白来治疗哺乳动物中的异常血管生成或癌症。
除了其作为癌症中血管生成过程的重要调节剂的作用外，具有激活的血管生成途径和需要侧枝血流的各种非癌适应症是HB-EGF抗原结合蛋白治疗的推定疾病。
慢性炎性疾病(例如，肾炎、COPD、炎性肠病)，包括免疫系统介导的“炎性反应”(例如，移植物抗宿主病、移植排斥、再狭窄)、代谢疾病(例如，糖尿病)或慢性缺氧性病况，通常以过度血管形成和/或新血管形成(例如，慢性溃疡)为特征。所述HB-EGF抗原结合蛋白可以至少部分地抑制血管生成的必需过程--由HB-EGF(由炎性细胞产生或被缺氧上调)诱导的内皮细胞对血管平滑肌细胞的招募--从而代表用于过度/病理性血管形成的介入治疗的吸引人的途径。
在肥胖受试者中，来源于积累的脂肪的增加的水平的HB-EGF(其促成肥胖症中血管疾病的更高发病率)可用本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白来中和。使用HB-EGF抗原结合蛋白的治疗性干预从而可在中断脂肪血管轴(adipovascular axis)中直接用作抗脂肪细胞因子。
在成纤维细胞中，HB-EGF通过激活表皮生长因子受体而显著下调弹性蛋白mRNA。该效应在肺纤维化的发展中提供了干预的途径。
此外，HB-EGF是参与炎性疾病的发病机制的角质形成细胞的丝裂原。此外，HB-EGF的表达和与EGFR的共定位可在银屑病的早期发病机制中起重要作用，这在皮肤炎性疾病的治疗中和特别地在银屑病的早期治疗中(使用请求保护的抗原结合蛋白)打开了潜在的治疗窗口。
使用所述抗原结合蛋白靶向HB-EGF还可导致用于患增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的患者的治疗选择，因为PVR的发展伴随PVR视网膜中HB-EGF的显著上调。此外，纤维增生组织中的HB-EGF表达和其对神经胶质细胞增殖、趋化性和VEGF分泌的刺激作用表明HB-EGF可能是PVR期间介导神经胶质细胞应答的因子。这些原理还可用于其他血管生成依赖性眼病例如年龄相关和非年龄相关黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、rubeotic青光眼、间质性角膜炎、早产儿视网膜病变和角膜移植失败(corneal graft failure)。
由于GPCR的血管收缩和生长促进能力，已将GPCR例如肾上腺受体和血管紧张素受体与高血压的发病机制联系在一起。因为HB-EGF是此类途径的至关重要的介体，因此中和性抗原结合蛋白适用于高血压病症例如心肌肥厚和充血性心力衰竭、肾衰竭或中风中的靶向干预。
在具有内膜增厚的冠状动脉的粥样硬化斑块中检测到HB-EGF(平滑肌细胞(SMC)的强效丝裂原和化学引诱物)，其由SMC和巨噬细胞产生。进一步显示残粒脂蛋白(Remnant lipoprotein)(其为动脉粥样硬化的已知致病因子)通过HB-EGF介导的EGFR反式激活诱导SMC增殖。因此，本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白代表通过阻断至关重要的平滑肌细胞功能靶向动脉粥样硬化的具有选择性且有效的试剂。此外，以平滑肌细胞的增殖为特征的经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention)后的再狭窄可能也通过HB-EGF功能的特异性中和而被阻止。
因此，本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白可用于治疗多种疾病，包括非恶性增殖性疾病例如异常血管生成、平滑肌瘤(子宫纤维化)、良性平滑肌细胞肿瘤、肾小球硬化(系膜细胞的过度增殖)、平滑肌细胞增生、动脉粥样硬化(血管平滑肌细胞的过度增殖)、红变、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性失明、黄斑变性、风湿性关节炎、心肌肥厚、银屑病等。
在另外的方面，此类HB-EGF抗原结合蛋白可用于治疗与扰乱的例如，病理性增强的生长因子受体激活相关的或与其相伴的病症。
在另一个方面，该增强的生长因子受体激活可与G蛋白和/或G蛋白偶联受体的活性的病理性增加相关或由其引起。应当指出，与扰乱的例如病理性增强的生长因子受体激活相关或与其相伴的以及可能与G蛋白和/或G蛋白偶联受体的活性的病理性增加相关或由其引起的病症可以与特征在于增强的生长因子受体激活活性的其他病症区分开，因为发生了经由G蛋白偶联受体的生长因子受体的反式激活。
2.诊断方法
本文中描述的HB-EGF抗原结合分子可用于检测测试样品中的癌细胞的方法中，其包括将测试样品与抗原结合分子接触和检测抗体是否结合样品中的表达proHB-EGF或HB-EGF分子的细胞。结合发生的程度可通过使用对照样品来估量。测试和对照样品可以例如是血液、血清、腹水、胸腔积液、脑脊髓液、组织、细胞、尿液、淋巴、唾液、乳汁或其他样品。这样的对照样品可以是非癌性的体液或组织或细胞类型的样品。在一些实施方案中，对照样品是获自与测试样品相同的受试者的非癌性样品。“受试者”或“患者”是指需要治疗或检测病况、病症或疾病的哺乳动物，优选人。
抗体与测试样品的组分的结合可通过检测结合至或可选择性结合至本文中描述的抗原结合蛋白的报告分子、显象剂或标记来检测。此类HB-EGF抗原结合蛋白可具有一个或多个报告分子、标记或显象剂。报告分子定义为可使用测定法检测的任何部分。已被缀合至抗体的报告分子的非限定性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、生色团、发光分子、光亲和分子、有色颗粒或配体例如生物素。报告分子可提供可检测的信号。例如，可检测的信号可以是荧光、磷光、化学发光、电化学发光、电化学、颜色变化或酶的信号。本文中提供的抗HB-EGF抗体可用作捕获抗体，其用于生长因子的基于ELISA的检测或组织样品的免疫组织化学分析，如图39中所示。
在一些实施方案中，将报告分子共价连接至本文中描述的抗原结合蛋白。在其他实施方案中，可将报告分子选择性地结合至本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白。报告分子与所述抗原结合蛋白的此类选择性结合可通过具有共价连接的标记的二抗来进行，其中二抗选择性结合本文中描述的HB-EGB抗原结合蛋白。
3.治疗方法：药物制剂、施用的途径
癌症的治疗或治疗癌症意欲包括至少一种通常与疾病相关的症状的缓和或减轻。治疗还包括一种以上的相关症状的缓和或减轻。治疗可治愈癌症，例如，其可基本上消除癌细胞和/或停止癌性肿瘤的生长。备选地，治疗可减缓癌症的进展。
可使用本领域技术人员可获得的方法来评估抗多种癌症或癌细胞的抗癌活性。抗癌活性，例如，可通过测定本文中描述的抗原结合蛋白的制剂的LD100或ED50来测定，所述抗原结合蛋白的制剂阻止癌症的生长。在一个实施方案中，抗癌活性是当使用标准剂量应答方法测量时杀死50％或100％的癌细胞的抗体的量。
本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白可单独施用，或与抗体、化学治疗药物或放射疗法联合施用。根据本发明的药物组合物可以作为单一疗法施用或与另一种药物组合物(优选包含另一种抗肿瘤剂，特别是顺铂或阿瓦斯丁)联合施用。例如，可将所述HB-EGF抗原结合蛋白与抗肿瘤抗体(例如，嵌合、人源化或人抗肿瘤抗体)，与特异性结合VEGF以进一步抑制肿瘤血管生成的抗体或与特异性结合受体酪氨酸激酶例如HER2、HER4或EGFR并从而进一步抑制肿瘤细胞增殖的抗体共施用。在图38中，对于测试的两个治疗性抗HB-EGF抗体，可显示抗EGFR抗体和抗HB-EGF抗体的协同作用。此外，可将本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白与其他抗肿瘤剂共施用。可与本文中提供的抗体共施用的抗肿瘤剂的特定实例包括，例如，吉非替尼、拉帕替尼、舒尼替尼、培美曲塞、贝伐单抗(bevacisumab)、西妥昔单抗、伊马替尼、曲妥珠单抗、阿仑珠单抗、利妥昔单抗、厄洛替尼、硼替佐米等。可抑制癌症或肿瘤细胞增殖的任何其他抗癌剂或药物也可用于本文描述和请求保护的组合物中。例如，请求保护的组合物可包括化学治疗剂例如卡培他滨、柔红霉素、道诺霉素、放线菌素D、多柔比星、表柔比星、伊达比星、依索比星、博来霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、氯乙亚硝脲(bis-chloroethylnitrosurea)、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、普卡霉素、泼尼松、羟孕酮、睾酮、他莫昔芬、达卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝基脲、氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧考福霉素、4-hydroxyperoxycyclophosphor-amide、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙碱、泰素、长春新碱、长春碱、依托泊苷、三甲曲沙、替尼泊苷、顺铂、阿瓦斯丁和己烯雌酚(DES)。通常参见，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第15版，1987，pp.1206-1228，Berkow等人，eds.，Rahway，N.J。当与所述HB-EGF抗原结合蛋白一起使用时，此类化学治疗剂可分别地(例如，5-FU和抗体)、相继地(例如，5-FU和抗体，一段时间后，MTX和抗体)或与一种或多种其他此类化学治疗剂联合(例如，5-FU、MTX和抗体，或5-FU、放射治疗和抗体)使用。
还提供了评估使用具有本文中公开的氨基酸序列的抗体治疗癌症的治疗有效剂量的方法，该方法包括测定HB-EGF抗原结合蛋白制剂在体内或体外的LD100或ED50。这样的方法允许计算抑制癌细胞生长或转移大约10％至100％，或大约20％至100％，或大约25％至100％，或大约30％至100％，或大约40％至100％，或大约50％至100％的每体积所需的抗原结合蛋白的近似量。在一些实施方案中，观察到低于100％的癌细胞生长或转移的抑制。例如，癌细胞生长和/或转移被抑制大约90％、80％、70％、60％或50％。可以例如通过对本领域可获得的SCID或nu/nu小鼠(其中已导入了肿瘤细胞)施用抗原结合蛋白制剂和/或通过标准方法，使用培养的癌细胞(参见，图38B)来测定百分比抑制。在实施例中描述了几种方法。
还包括的是本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白的无菌药物制剂，其可用作用于疾病包括例如癌症和/或异常血管生成的疗法。这样的制剂可抑制HB-EGF与其受体例如EGFR或与HER4的结合，从而有效地治疗其中例如血清、细胞或组织HB-EGF异常升高或其中其受体例如，EGFR或HER4，异常活跃的病理状况。如本文中所举例说明的，HB-EGF抗原结合蛋白具有足够的亲和力来有效地中和HB-EGF以及调节与HB-EGF受体相关的信号转导事件。
本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白优选是人源化抗原结合蛋白。此类人源化抗原结合蛋白的施用减小了负面作用的可能性。此外，此类抗原结合蛋白例如在体内是稳定的，因为它们被识别为正常人产物，从而使免疫系统应答的风险降至最低。此外，此类抗原结合蛋白不易被蛋白水解破坏，从而提高了它们的循环半衰期。因此，本文中描述的HB-EGF制剂具有优良的体内半衰期，从而使得人中的施用相对不频繁。这样的延长的作用持续时间可允许进行较不频繁的和更方便的给药方案(通过可选的胃肠外途径例如皮下或肌内注射)。
可以例如通过在抗体的冷冻干燥和重构之前或之后通过无菌滤膜过滤来产生无菌制剂。通常将本文中描述的抗原结合蛋白以冻干的形式贮存或贮存在溶液中。通常将治疗性抗体组合物置于具有无菌存取口的容器(例如，静脉内注射溶液袋或具有允许抽取制剂的适配器(adapter)例如可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)内。
可按照已知的方法施用HB-EGF抗原结合蛋白，例如，通过静脉内、皮下、真皮内、腹膜内、大脑内、肌内、眼内、动脉内、鞘内、膀胱内、海绵体内途径进行的注射或输注、吸入、损伤内途径或通过持续释放系统(如下文中指出的)。在一些实施方案中，通过输注或通过团注连续施用本文中描述的抗原结合蛋白。
可将本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白与可药用载体一起制备于混合物中。可以优选以液体或粉末气雾剂(冷冻干燥的)的形式静脉内或经鼻或肺施用该治疗性组合物。还可如所期望地胃肠外或皮下施用组合物。当全身性施用时，治疗性组合物应当是无菌的、无热源的并且在胃肠外可接受的溶液(对此要考虑的是生理上可接受的pH值、等渗性和稳定性)中。这些条件对于本领域技术人员来说是已知的。简而言之，通过将具有期望的纯度的化合物与生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备用于贮存或施用的本文中描述的化合物的剂量制剂。这样的材料在使用的剂量和浓度上对受者是无毒的，并且其包括缓冲剂例如TRIS HCl、磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、和其他有机酸盐；抗氧化剂例如抗坏血酸；低分子量(少于大约10个残基)肽例如聚精氨酸、蛋白质例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidinone)；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨醇；抗衡离子例如钠离子和/或非离子型表面活性剂例如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇。
可按照Remington：The Science and Practice of Pharmacy(第20版，Lippincott Williams & Wilkens Publishers(2003))中所描述的常规药学实践配制用于注射的无菌组合物。例如，可期望将活性化合物溶解或悬浮于媒介物例如水或天然产生的植物油如芝麻油、花生油或棉籽油或合成的脂肪媒介物如油酸乙酯等。可按照可接受的药学实践包含缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等。
持续释放制剂的合适的实例包括含有多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质以成形的制品、膜或微胶囊的形式存在。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(如Langer等人，1981，J.Biomed Mater.Res.15：167-277和Langer，1982，Chem.Tech.12：98-105所描述的)，或聚(乙烯醇)、聚乳酸(美国专利3,773,919、EP 58,481)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人，1983，Biopolymers 22：547-556)、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯(Langer等人，同上)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133，988)。
虽然聚合物例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使分子能够释放100多天，但某些水凝胶释放蛋白质较短的时间。当封装的蛋白质在体内长时间保持时，它们可变性或聚集(由于在37℃下暴露于潮湿)，从而导致生物学活性的丧失和免疫原性的可能变化。取决于牵涉的机制，设计用于蛋白质稳定的合理策略。例如，如果发现聚集机制是经由二硫互换的分子间S-S键形成，则可通过修饰巯基残基，从酸性溶液冷冻干燥，控制含湿量，使用合适的添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。
持续释放组合物还包括悬浮于合适的制剂中的能够在悬浮液中保持结晶的抗原结合蛋白的晶体制剂。此类制剂，当皮下或腹膜内注射时，可产生持续释放效果。其他组合物还包括脂质体捕获的抗体。通过本身已知的方法制备含有此类抗体的脂质体：美国专利DE3,218,121；Epstein等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci USA 82：3688-3692；Hwang等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030-4034；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；142,641；日本专利申请83-118008；美国专利4,485,045和4,544,545；以及EP 102,324。
用于给定的患者的抗原结合蛋白制剂的剂量可由主治医师通过考虑已知修饰药物的作用的各种因素(包括疾病的严重度和类型、体重、性别、饮食、施用的时间和途径、其他用药和其他相关临床因素)来确定。治疗有效剂量可通过体外或体内方法来确定。
待治疗性使用的本文中描述的抗原结合蛋白的有效量将取决于例如治疗目的、施用途径和患者的状况。因此，优选，治疗学家滴定剂量和根据需要改变施用途径以获得最佳治疗效果。典型的日剂量可在大约0.001mg/kg至多达100mg/kg或更大的范围内，这取决于上述因素。通常，临床医师将施用治疗性抗原结合蛋白直至达到获得期望的效果的剂量。该治疗的进程可通过本文中描述的常规测定容易地监控。
应理解，根据本文中的组合物和方法的治疗实体(therapeuticentity)可与合适的载体、赋形剂和其他试剂(其掺入制剂中以提供提高的转移、递送、耐受性等)一起施用。此类制剂包括例如粉剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子或阴离子的)的载体(例如LipofectinTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂(anhydrousabsorption paste)、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(emulsionscarbowax)(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。上述混合物的任一种可适用于包括本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白的治疗和疗法，只要制剂中的活性成分不被制剂灭活并且制剂对于施用途径在生理上是相容的和可耐受的。也参见BaldrickP.″Pharmaceutical excipient development：the need forpreclinical guidance，″2000，Regul.Toxicol.Pharmacol.32：210-218；Wang，″Lyophilization and development of solid proteinpharmaceuticals，″2000，Int.J.Pharm.203：1-60；Charman WN″Lipids，lipophilic drugs，and oral drug delivery-some emergingconcepts，″J.Pharm.Sci.89：967-978；Powell等人，1998，″Compendium of excipients for parenteral formulations，″PDA J.Pharm.Sci.Technol.52：238-311以及其中关于与药物化学家熟知的制剂、赋形剂和载体相关的另外的信息的引文。
下列实施例，包括进行的实验和获得的结果仅仅用于举例说明目的，而不被解释为对本文中的教导的限定。
实施例
K.实施例1：免疫原的产生
从pcDNA3-VSV-HB-EGF表达构建体(Prenzel等人，1999，同上)扩增含有EGF样结构域(氨基酸1-149)的HB-EGF，然后将其克隆入在羧基末端提供符合读框的6His标签的表达载体(pcDNA 3.1myc-his，InVitrogen)。在HEK293细胞中表达该具有C末端myc(HIS)6标签的HB-EGF免疫原，在Ni-NTA琼脂糖凝胶(Amersham Pharmacia)和肝素琼脂糖凝胶(Sigma)上通过两步纯化法对其进行纯化。
免疫原的HB-EGF部分具有下列序列(SEQ ID NO：1047)。
1MKLLPSVVLK LFLAAVLSAL VTGESLERLR RGLAAGTSNP
41DPPTVSTDQL LPLGGGRDRK VRDLQEADLD LLRVTLSSKP
81QALATPNKEE HGKRKKKGKG LGKKRDPCLR KYKDFCIHGE
121CKYVKELRAP SCICHPGYHG ERCHGLSLP
B.实施例2：Xenomouse小鼠的免疫和观察到的滴度
通过连续地免疫
Figure GSB00001007631900861
小鼠(XenoMouse品系：XMG2(产生人IgG2)和XM3C-1(产生人IgG4)，Abgenix，Inc.Fremont，CA)产生抗HB-EGF的单克隆抗体。
1.免疫
经足垫进行所有注射以免疫XenoMouse动物。各注射的总体积为50μl/小鼠，25μl/足垫。
对于组群1(10只XMG2小鼠)和组群2(10只XM3C-1)，初次免疫为每只小鼠使用与
Figure GSB00001007631900871
(Sigma，Oakville，ON)以1∶1(v/v)混合的10μg HB-EGF蛋白。用与无热原的D-PBS中的100μg铝胶(alumgel)(Sigma，Oakville，ON)以1∶1(v/v)混合的10μg HB-EGF蛋白进行随后的4次增强。第5次增强由与TITERMAX
Figure GSB00001007631900872
以1∶1(v/v)混合的10μg HB-EGF蛋白组成。第6和第7次注射由与100μg铝胶以1∶1(v/v)混合的10μg HB-EGF蛋白组成。最终的加强用无热原的DPBS中的10μg HB-EGF蛋白(不含佐剂)来进行。对于该方案，在第0、4、8、14、18、21、25和28天免疫XenoMouse小鼠，在第32天进行融合。在第4次增强后16天，第6次增强后23天通过眼眶后放血(Retro-Orbital Bleed)法进行两次放血。
2.通过滴定选择用于收获的动物
通过ELISA测定来自免疫的XenoMouse小鼠的血清中抗HB-EGF抗体的滴度。简而言之，在4℃下在抗原包被缓冲液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6NaHCO3(MW 84)8.4g/L)中将HB-EGF蛋白(2μg/ml)过夜包被至Costar Labcoat Universal Binding Polystyrene 96孔板(Corning，Acton，MA)上。第二天，使用Biotek洗板机用清洗缓冲液(1x PBS中的0.05％Tween 20)清洗板一次。然后用200μl/孔的封闭缓冲液(1x PBS中的0.5％BSA，0.1％Tween 20，0.01％的硫柳汞)封闭板，并且在室温下温育1小时。在1小时的封闭后，使用Biotek洗板机用清洗缓冲液清洗板一次。在0.5％BSA/PBS缓冲液中以1∶3的稀释度(从1∶100的初始稀释度开始)以一式两份滴定来自HB-EGF蛋白免疫的XenoMouse小鼠的或首次用于实验的XenoMouse小鼠动物的血清。最后的孔留作空白对照。将这些板在室温下温育2小时，然后使用Biotek洗板机用清洗缓冲液清洗板3次。以1∶2000的终浓度将山羊抗人IgG Fc-特异性辣根过氧化物酶(CALTAG，产品编号，H10507)缀合的抗体加入封闭缓冲液中，并在室温下温育1小时。使用Biotek洗板机用清洗缓冲液清洗板3次。在清洗后，通过加入TMB显色底物(BioFx BSTP-0100-01)并进行10-20分钟或直至阴性对照孔开始显色来对板进行显色。然后通过加入终止液(650nM用于TMB(BioFxBSTP-0100-01)的终止试剂，用100ml水/瓶进行重构)来终止ELISA。根据650nm处的光密度来测定各XenoMouse动物的具体滴度，并将其示于下面的表1中。滴度值是具有2倍于背景的OD读数的血清的最大稀释度的倒数。因此，数值越高，对HB-EGF的体液免疫应答越大。
表1
Figure GSB00001007631900881
C.实施例3：杂交瘤的产生和结合剂的初步筛选
杀死免疫的小鼠，收集淋巴节，将来自各组群的淋巴节混合在一起。通过在DMEM中研磨以从组织释放细胞来分离淋巴细胞，将细胞悬浮于DMEM中。计数细胞，将0.9ml DMEM(每1亿个淋巴细胞)加入至细胞沉淀以轻轻但完全地重悬浮细胞。使用100μl CD90+磁珠(每1亿个细胞)，通过在4℃下将细胞与磁珠一起温育15分钟来标记细胞。将包含多至108个阳性细胞(或多至2x109个总细胞)的磁性标记的细胞悬浮液装载到LS+柱上，然后用DMEM洗涤柱子。收集总流出物作为CD90-阴性级分(预期大多数此类细胞为B细胞)。
通过将来自上述方法的清洗的富集的B细胞与购自ATCC，cat.#CRL 1580的没有分泌作用的骨髓瘤P3X63Ag 8.653细胞(Kearney等人，1979，J.Immunol.123：1548-1550)以1∶1的比例混合来进行融合。以800g轻轻地离心细胞混合物。在完全除去上清液后，用2-4ml的链霉蛋白酶溶液(CalBiochem，cat.#53702；0.5mg/ml于PBS中)处理细胞沉淀不超过2分钟。然后，加入3-5ml FBS来终止酶活性，使用电细胞融合液ECFS(0.3M蔗糖，Sigma，Cat#S7903，0.1mM醋酸镁，Sigma，Cat#M2545，0.1mM醋酸钙，Sigma，Cat#C4705)将悬浮液调整至40ml的总体积。在离心后除去上清液，将细胞重悬浮于40ml ECFS中。重复该清洗步骤，再次将细胞重悬浮于ECFS至2x106个细胞/ml的浓度。
使用融合发生器(fusion generator)(ECM2001型，Genetronic，Inc.，San Diego，CA)进行电细胞融合。使用的融合杯(fusionchamber)大小为2.0ml，使用下列仪器设置：Alignment条件：电压：50V，时间：50秒；膜破裂于：电压：3000V，时间：30微秒；融合后保持时间：3秒。
在电细胞融合后，在无菌条件下小心地从融合杯中取出细胞悬浮液，将其转移至装有相同体积的杂交瘤培养基(DMEM(JRHBiosciences)、15％FBS(Hyclone)、补充有L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、OPI(草酰乙酸盐、丙酮酸盐、牛胰岛素)(全都来自Sigma)和IL-6(Boehringer Mannheim))的无菌试管内。在37℃下将细胞温育15至30分钟，然后以400g离心5分钟。轻轻地将细胞重悬浮于小体积的杂交瘤选择培养基(补充有0.5x HA(Sigma，cat.#A9666)的杂交瘤培养基)，然后基于5x106个B细胞(总共)/96孔板和200μL/孔的终涂板，用更多的杂交瘤选择培养基适当的调整体积。将细胞轻轻地混合，然后转移入96孔板中，让其生长。在第7或10天，除去一半的培养基，用杂交瘤选择培养基再饲养细胞。
在14天的培养后，通过ELISA就HB-EGF特异性单克隆抗体筛选来自组群#1和组群#2的杂交瘤上清液。在初步筛选中，用50μl/孔的包被缓冲液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6，NaHCO3 8.4g/L)中的HB-EGF蛋白(2μg/ml)包被ELISA板(Fisher，产品编号12-565-136)，然后在4℃下温育过夜。温育后，用清洗缓冲液(0.05％Tween 20于PBS中)清洗板一次。加入200μl/孔的封闭缓冲液(1x PBS中的0.5％BSA，0.1％Tween 20，0.01％硫柳汞)，然后将板在室温下温育1小时。温育后，用清洗缓冲液清洗板1次。加入杂交瘤上清液以及阳性和阴性对照的等分(50μl/孔)，然后将板在室温下温育2小时。整个过程中使用的阳性对照是相关HB-EGF蛋白免疫的XenoMouse小鼠的血清，阴性对照是KLH免疫的相关品系的XenoMouse小鼠的血清。在温育后，用清洗缓冲液清洗板3次。加入100μl/孔的检测抗体山羊抗huIgGFc-HRP(Caltag Inc.，产品编号H10507，使用的浓度为1∶2000的稀释度)，然后将板在室温下温育1小时。温育后，用清洗缓冲液清洗板3次，并加入100μl/孔的TMB(BioFX Lab.产品编号TMSK-0100-01)。然后让板显色大约10分钟(直至阴性对照孔刚开始显色)。然后加入50μl/孔的终止液(TMB终止液(BioFX Lab.产品编号STPR-0100-01)，在ELISA板读数器上在450nm的波长处读取板。
除去来自阳性杂交瘤细胞培养孔(基于初次筛选)的旧培养上清液，将HB-EGF阳性杂交瘤细胞重悬浮于新鲜杂交瘤培养基中，然后转移至24孔板。培养2天后，这些上清液准备用于二次确认筛选。在二次确认筛选中，通过ELISA(如上所述)，用两组检测抗体：山羊抗huIgGFc-HRP(Caltag Inc.，产品编号H10507，使用的浓度为1∶2000的稀释度)(用于人γ链检测)和山羊抗hIg κ-HRP(SouthernBiotechnology，产品编号2060-05)(用于人κ轻链检测)筛选第一次筛选中的阳性，以证明抗体制剂是HB-EGF特异性的并且在其组成上是完全人的。两组ELISA方法与上文中描述的相同，除了分别使用两种不同的检测抗体外。
与二次确认筛选平行地，进行相反ELISA筛选(counter ELISAscreen)以排除与myc(his)6标签反应的抗体。ELISA方法与上文中描述的相同，除了用无关myc(his)6标签蛋白(ML-myc(his)6蛋白)包被而非用HB-EGF myc(his)6蛋白包被外。
在二次确认和相反ELISA筛选后，从组群1和2鉴定了49个完全人IgG/κHB-EGF特异性单克隆抗体。
D.实施例4：功能测定中抗体的放大(Scale-Up)和检测
本实施例描述了产生对于HB-EGF具有亲和力的抗HB-EGF抗体的杂交瘤细胞系的鉴定。
1.结合至表达HB-EGF的细胞系的杂交瘤产生的抗HB-EGF抗体的FACS检测
通过FACS分析确定细胞系上的HB-EGF表达。为了进行该分析，用PBS中的10mM EDTA收获2x105个选择的表达HB-EGF的细胞，将其重悬浮于FACS缓冲液(PBS，3％FCS，0.4％叠氮化物)中，然后接种至96孔圆底板上。在以1000rpm离心3分钟以除去上清液后，将细胞重悬浮于杂交瘤来源的抗HB-EGF抗体稀释液(100μl/孔)中，并在4℃下温育45分钟。用FACS缓冲液清洗细胞2次，并用以1∶100稀释于FACS缓冲液中的二抗(100μl/孔)驴抗人PE(Jackson)重悬浮细胞。在4℃下将细胞悬浮液于黑暗中温育30分钟，用FACS缓冲液清洗2次，然后进行分析(FACS，Beckman Coulter)。
这些测定的结果提供于下面的表2和3中，其提供了各FACS测定的荧光平均值。如表3和4中所举例说明的，在不表达HB-EGF的CHO对照细胞中基本上检测不到HB-EGF的表达。然而，当HB-EGF在CHO细胞中重组过表达时，几种单克隆抗体制剂展示了显著的对表达HB-EGF的细胞的结合。对MDA-MB231、SCC-9和COS-7细胞的结合在一定程度上是可变的，但结合一种表达HB-EGF的细胞类型的抗体制剂通常结合另一种细胞类型。如表2中所示，几种抗体制剂，包括例如U2-24、U2-5、U2-19、U2-21、U2-15和U2-42抗体制剂展示了对表达HB-EGF的CHO细胞的强结合。类似地，抗体制剂U2-39、U2-26、U2-44、U2-45和U2-48也展示了良好的对表达HB-EGF的CHO细胞的结合。
表2抗HB-EGF抗体上清液的FACS分析(组群1)
表3抗HB-EGF抗体上清液的FACS分析(组群2)
Figure GSB00001007631900931
2.HB-EGF诱导的EGFR酪氨酸磷酸化的抑制
使用下列方案鉴定抑制HB-EGF诱导的表皮生长因子受体酪氨酸磷酸化的抗HB-EGF抗体制剂。此类实验进一步表征抗体并且帮助鉴定产生抑制HB-EGF活性的抗体，从而应当被克隆和扩增的杂交瘤细胞系。
将40000个SCC9人鳞癌细胞于100μl培养基中接种在96孔板上。在60μl无血清培养基中饥饿细胞24小时。在4℃下用100μl抗EGFR抗体(2μg/ml)包被黑色Maxisorp 96孔板过夜。在不清洗的情况下用300μl封闭溶液(PBS+0.5％BSA)替换包被液，然后在室温下温育2小时。将10μg/ml的IgG2-对照(Sigma)或抗HB-EGF杂交瘤来源的抗体加入至20ng/ml HB-EGF(R&D Systems)，并在37℃下预温育30分钟(体积：40μl)。在37℃下用培养基单独或与抗体/配体溶液一起处理细胞3分钟。除去培养基，在冰上用100μl基于Triton-X-100的裂解缓冲液(包含1mM PMSF，10μg/ml抑肽酶，10mM NaF和2mM正钒酸钠)裂解细胞。用PBS+0.05％Tween-20清洗封闭的Maxisorp板6次。将80μl的细胞裂解物直接转移至已清洗的Maxisorp板，然后在轻轻摇动的条件下在4℃下温育过夜。用PBS+0.05％Tween-20清洗板6次，然后向各孔中加入100μl以1∶4000稀释于稀释缓冲液(PBS+0.5％BSA+0，05％Tween-20+5mM EDTA)中的4G10-生物素(UBI)，并在室温下温育2小时。用PBS+0.05％Tween20清洗板6次，然后向各孔中加入100μl以1∶20000稀释于稀释缓冲液(PBS+0.5％BSA+0，05％Tween20+5mM EDTA)中的缀合有AP的链霉抗生物素(UBI)，在室温下进行30分钟。用PBS+0.05％Tween-20清洗板6次，向各孔中加入100μl AttoPhos底物。将板在黑暗处在室温下温育达到3小时，在第30、90和180分钟监测产生的荧光(激发：430nm，发射：580nm)。
通过观察到的各杂交瘤来源的抗HB-EGF抗体制剂相对于IgG2-对照(Sigma)的磷酸化的量的减少来计算HB-EGF诱导的EGFR酪氨酸磷酸化的百分比抑制。
不同抗HB-EGF抗体制剂的结果提供于图23A和23B中。如所说明的，单克隆抗体制剂U2-18、U2-24、U2-19、U2-42、U2-39、U2-34、U2-45和U2-6强烈抑制EGFR的酪氨酸磷酸化。
3.抗HB-EGF抗体制剂抑制LPA诱导的EGFR磷酸化。
可通过刺激G蛋白偶联受体(GPCR)来活化EGFR依赖性信号转导途径。通过与GPCR相互作用产生的异三聚体G-蛋白的配体激活导致诱导跨膜金属蛋白酶的细胞外活性的细胞内信号。可活化GPCR途径的配体包括LPA(溶血磷脂酸)、凝血酶、卡巴胆碱、铃蟾肽和内皮素。这样的激活导致跨膜生长因子前体的细胞外加工和成熟因子的释放，所述成熟因子直接或通过蛋白聚糖基质与EGFR的胞外结构域相互作用并通过磷酸化激活其。参见，Prenzel等人，1999，Nature 402：884-888。
使用下列方法检测本文中提供的抗HB-EGF抗体制剂，以确定它们是否可在COS-7细胞中抑制由GPCR配体LPA诱导的EGFR酪氨酸磷酸化。
将250,000个COS-7细胞于2ml培养基中接种在6孔板上，然后培养过夜。在1ml无血清培养基中使细胞饥饿24小时。在用抗体预温育(37℃，1小时)后，用10μM LPA刺激细胞(37℃，3分钟)，然后在冰上用400μl基于Triton-X-100的裂解缓冲液(包含1mM PMSF，10μ/ml抑肽酶，10mM NaF和2mM正钒酸钠)裂解细胞。在冷室中免疫沉淀EGFR(340μl裂解物，340μl HNTG，30μl Prot.ASepharose，1.5μl αEGFR(108.1，Prenzel等人，1999，同上))4小时后，用500μl HNTG缓冲液清洗沉淀3次，然后在7.5％SDS PAGE上进行电泳。在转移至硝酸纤维素膜(Schleicher & Schuell)上后，用识别磷酸酪氨酸残基的抗体(一抗4G10(1∶2000，Upstatebiotechnology)；二抗，抗小鼠Ab1∶10000，Jackson laboratories)探测印迹。在剥离后，用绵羊抗EGFR(Upstate technology)进行的再印迹法(reblot)显示在各泳道中等量的受体被沉淀。
图24提供了举例说明哪些抗HB-EGF抗体制剂抑制LPA诱导的EGFR酪氨酸磷酸化的western印迹。如图24中所示的，U2-19和U2-42抗HB-EGF抗体制剂强烈地抑制LPA诱导的EGFR磷酸化。U2-24抗HB-EGF抗体制剂抑制LPA诱导的EGFR磷酸化至稍微较低的程度。
E.实施例5：产生单克隆抗体的杂交瘤克隆
基于从前述实施例中描述的实验观察到的49个原始分离株的测试结果，选择43个杂交瘤细胞系，用于通过有限稀释法进行克隆，并进一步表征它们的单克隆抗体。选择用于克隆的细胞系结合表达HB-EGF的细胞系(如通过FACS分析所展示的)并且抑制HB-EGF刺激的EGF受体酪氨酸磷酸化。对于一些杂交瘤，未产生足够的抗体以进行所有初步筛选测定。同样将该亚组的杂交瘤继续进行杂交瘤克隆。
F.实施例6：GPCR诱导的EGFR酪氨酸磷酸化的抗体相关抑制的进一步表征
该实施例进一步提供了数据，其显示本文中提供的几种抗HB-EGF抗体制剂展示对GPCR诱导的EGF受体酪氨酸磷酸化的剂量依赖性抑制。
使用不同浓度的此类抗体制剂和下列方法检查候选抗体制剂U2-42、U2-39和U2-45产生的抑制。
将150,000个细胞(MDA-MB231，PPC1)于1ml培养基中接种在12孔板上。在500μl无血清培养基中饥饿细胞24小时。在4℃下用100μl抗EGFR抗体(2μg/ml)包被黑色Maxisorp 96孔板过夜。在不清洗的情况用300μl封闭溶液(PBS+0.5％BSA)替换包被溶液，并让其在室温下温育2小时。在37℃下用10μg/ml抗HB-EGF Ab预温育细胞30分钟，然后在37℃下用GPCR配体LPA(10μM，PPC1细胞)或凝血酶(1U/ml，MDA-MB231细胞)处理细胞3分钟。除去培养基，在冰上用200μl基于Triton-X-100的裂解缓冲液(含有1mM PMSF，10μg/ml抑肽酶，10mM NaF和2mM正钒酸钠)裂解细胞。用PBS+0.05％Tween-20清洗封闭的Maxisorp板6次。将细胞裂解物直接转移至已清洗的Maxisorp板并且在轻轻摇动的条件下于4℃下温育过夜。
用PBS+0.05％Tween-20清洗板6次，然后向各孔中加入100μl以1∶4000稀释于稀释缓冲液(PBS+0.5％BSA+0.05％Tween-20+5mM EDTA)中的4G10-生物素(UBI)，并在室温下温育2小时。用PBS+0.05％Tween-20清洗板6次，向各孔中加入100μl以1∶20000稀释于稀释缓冲液(PBS+0.5％BSA+0.05％Tween-20+5mM EDTA)中的缀合有AP的链霉抗生物素(UBI)，在室温下进行30分钟。用PBS+0.05％Tween-20清洗板6次，向各孔中加入100μl Attophos底物。在室温下将板于黑暗中温育3小时，在第30、90和180分钟监测产生的荧光(激发：430nm，发射：580nm)。
如图26中所示，LPA诱导的EGFR酪氨酸磷酸化的抑制是剂量依赖性的，当抗HB-EGF抗体的量增加时，观察到更大的EGFR酪氨酸磷酸化的抑制。
图25举例说明候选抗体制剂U2-42、U2-39和U2-45还有效地抑制MDA-MB231细胞中凝血酶诱导的EGFR磷酸化。观察到剂量依赖性抑制，当加入更多抗HB-EGF抗体时，抑制增加。图26举例说明本文中提供的抗HB-EGF抗体制剂在PPC-1细胞中对LPA诱导的EGFR酪氨酸磷酸化的抑制是剂量依赖性的。如所显示的，当抗HB-EGF抗体的量增加时，检测到更大的EGFR酪氨酸磷酸化的抑制。
G.实施例7：人抗HB-EGF抗体对GPCR诱导的MDA-MB231细胞迁移的抑制
为了研究本文中提供的抗体是否阻止GPCR配体鞘氨醇-1-磷酸诱导的细胞迁移，进行移行实验。
在37℃下用指定的抗体在细胞悬浮液中预温育经血清饥饿的人乳腺癌MDA-MB231细胞45分钟。此后，将500ml细胞悬浮液(50,000个细胞)置于I型胶原包被的transwell(BD Falcon，8μm的孔径)的顶部小室中。将750ml单独的培养基(MEM、氨基酸、丙酮酸钠、青霉素-链霉素、0.1％BSA)或含有GPCR配体鞘氨醇-1-磷酸(R&D Systems)的所述培养基用于底部小室。在37℃下进行迁移8小时后，固定细胞，用DAPI染色，并计数细胞核以进行统计评估。
使用候选抗HB-EGF抗体制剂U2-42、U2-39和U2-45的MDA-MB231细胞迁移测定的结果提供于图27中。如所显示的，抗HB-EGF抗体制剂U2-42抑制MDA-MB231细胞迁移大约70％；抗HB-EGF抗体制剂U2-45抑制MDA-MB231细胞迁移大约100％；以及抗HB-EGF抗体制剂U2-39抑制MDA-MB231细胞迁移大约100％。因此，此类抗HB-EGF抗体抑制MDA-MB231细胞迁移的能力是显著的。
H.实施例8：人抗HB-EGF抗体对HB-EGF诱导的MCF-7细胞迁移的抑制
为了研究本文中提供的抗体是否阻止直接由HB-EGF诱导的细胞迁移，进行移行实验。这些测试的结果突出了可用于开发抗转移癌试剂的抗体制剂。
将500ml经血清饥饿的人乳腺癌MCF7细胞的细胞悬浮液(50,000个细胞)置于I型胶原包被的transwell(BD Falcon，8μm的孔径)的顶部小室中。在10μg/ml HB-EGF抗体存在或不存在的情况下将750ml单独的培养基(MEM，氨基酸，丙酮酸钠，青霉素-链霉素，0，1％BSA)或含有20ng/ml HB-EGF(R&D Systems)的所述培养基的等分置于底部小室中。在37℃下温育和迁移8小时后，固定细胞，用DAPI染色，并计数细胞核以进行统计评估。
使用候选抗HB-EGF抗体制剂U2-42、U2-39和U2-45的迁移测定的结果提供于图28中。如所显示的，抗HB-EGF抗体制剂U2-42抑制MCF-7细胞迁移大约55％；抗HB-EGF抗体制剂U2-45抑制MCF-7细胞迁移大约93％；以及抗HB-EGF抗体制剂U2-39抑制MCF-7细胞迁移大约98％。因此，此类抗HB-EGF抗体抑制MCF-7细胞迁移的能力是显著的。
I.实施例9：前10种抗HB-EGF抗体的特征
GPCR诱导的三重膜传递信号(TMPS)实验中的前10种杂交瘤来源的抗体制剂的结果的概述提供于表4中(下文)。TMPS实验包括SCC9细胞中的LPA刺激、MDA-MB231细胞中的凝血酶刺激、SkOV-8细胞的LPA刺激和MDA-MB231细胞的鞘氨醇-1-磷酸迁移。提供的数据代表了当将抗体制剂用于测定中时，与不存在抗体时的相同测定相比，观察到的TMPS反式激活信号的百分比抑制。各实验中的前3种抗体以粗体字母突出显示。
表4TMPS反式激活信号的百分比抑制
J.实施例10：人抗HB-EGF抗体对HB-EGF诱导的HER4酪氨酸磷酸化的抑制
本实施例显示，抗HB-EGF抗体制剂抑制HB-EGF诱导的HER4酪氨酸磷酸化。下列方法用于评估抗HB-EGF抗体对HER4酪氨酸磷酸化的作用。
将125,000个细胞T47D人乳腺癌细胞于500μl培养基中接种在24孔板上。在200μl无血清培养基中饥饿细胞24小时。将R&D SystemsHuman Phospho-ErbB4 ELISA-试剂盒用于检测HER4的酪氨酸磷酸化。在室温下用100μl小鼠抗人-ErbB4抗体(捕获抗体1μg/ml)包被透明的Maxisorp 96孔板过夜。用PBS+0.05％Tween-20清洗包被的Maxisorp板6次，用300μl封闭溶液(PBS+0.5％BSA)替换清洗液，然后在室温下温育2小时。在37℃下将50μl无血清培养基(具有5倍浓度的抗HB-EGF Ab(10μg/ml))与5倍浓度的HB-EGF(20ng/ml)一起温育30分钟，然后加至各孔(以一式两份)。除去培养基，在冰上用200μl基于Triton-X-100的裂解缓冲液(含有1mM PMSF，10μg/ml抑肽酶，10mM NaF和2mM正钒酸钠)裂解细胞。用PBS+0.05％Tween-20清洗封闭的Maxisorp板3次。将细胞裂解物直接转移至经清洗的Maxisorp板，在摇动的条件下在4℃下温育过夜。用PBS+0.05％Tween-20清洗板6次，然后向各孔中加入100μl在稀释缓冲液(PBS+0.5％BSA+0.05％Tween-20+5mM EDTA)中稀释的抗磷酸-酪氨酸-HRP(检测抗体600ng/ml)，并在室温下温育2小时。用PBS+0.05％Tween20清洗板6次，向各孔中加入100μl四甲基联苯胺(TMB，Calbiochem)，在室温下进行20分钟。通过加入50μl的1M H2SO4终止反应，在450nm处读取吸光度(Thermo Lab Systems板读数器)。
结果示于图29中。如所说明的，增加U2-42.1或U2-39.1抗HB-EGF抗体制剂的浓度导致增加的对HB-EGF诱导的HER4磷酸化的抑制。
K.实施例11：单克隆抗体的交叉反应性
本实施例提供了进一步数据，其显示抗HB-EGF抗体制剂对于cynoHB-EGF、小鼠HB-EGF和相关EGF样生长因子双调蛋白的交叉反应性。在克隆HB-EGF的猴和小鼠形式后，将各表达构建体转染入HEK293细胞中，然后在FACS实验中就它们结合此类蛋白的能力检测抗HB-EGF抗体。通过ELISA形式的测定检测双调蛋白的交叉反应性。
1.克隆Cyno HB-EGF
在本研究中，制备cyno HB-EGF质粒。使用基于cyno HB-EGF的序列的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)从cyno肾cDNA克隆cynoHB-EGF cDNA。
用于扩增cyno HB-EGF的引物如下：
正向引物：5′-GGG TTA ACG CCA CCA TGA AGC TGC TGC CGT CG-3′(SEQ ID NO：1048)
反向引物：5′-CCG CTC GAG GTG GGA ATT AGT CAT GCC C-3′(SEQID NO：1049)
用Hpa1和Xho1降解PCR产物，然后将其连接入用Hind3降解的pCDNA3.1。在纯化后，将cyno HB-EGF质粒转化入DH5α细菌细胞，并且在氨苄青霉素选择下进行扩增。然后通过使用单个转化的菌落，在氨苄青霉素选择培养基中高表达质粒。在使用可商购获得的DNA纯化试剂盒纯化后，将cyno HB-EGF质粒瞬时转染入HEK293T细胞中。
2.克隆小鼠HB-EGF
在本研究中，制备小鼠HB-EGF质粒。使用基于小鼠HB-EGF的序列的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)从小鼠肺cDNA克隆小鼠HB-EGFcDNA。
用于扩增小鼠HB-EGF的引物如下：
正向引物：5′-GGA ATT CGC CAC CAT GAA GCT GCT GCC GTC G-3′(SEQID NO：1050)
反向引物：5′-CCG CTC GAG GTG GGA GCT AGC AGC CAC GCC-3′(SEQID NO：1051)
用EcoR1和Xho1降解PCR产物和pCDNA3.1载体DNA，然后进行连接。在纯化后，将小鼠HB-EGF质粒转化入DH5α细菌细胞，并且在氨苄青霉素选择下进行扩增。然后通过使用单个转化的菌落，在氨苄青霉素选择培养基中高表达质粒。在使用可商购获得的DNA纯化试剂盒纯化后，将小鼠HB-EGF质粒瞬时转染入HEK293T细胞中。
3.Cyno和小鼠HB-EGF的转染和表达
为了筛选本文中提供的抗体的交叉反应性，使用磷酸钙法用cyno或小鼠HB-EGF质粒瞬时转染HEK293T细胞，随后通过FACS分析来对其进行分析。
因此，在转染前30小时，将3x106个HEK293T细胞于16ml中接种至15cm-细胞培养板上，然后在7％CO2和37℃下进行温育。将720μlddH2O中的32μg的cyno或小鼠HB-EGF DNA或空载体DNA与2.5M CaCl2和2x BBS(pH6.96)混合，然后在室温下温育10分钟。温育后，将溶液逐滴加入至细胞上，然后在3％CO2和37℃下温育8小时。在吸收培养基后，在7％CO2和37℃下用新鲜生长培养基温育细胞24小时。
4.进行FACS分析以筛选抗体的交叉反应性
因此，使用PBS中的10mM EDTA收获2x105个转染的细胞，将其重悬浮于FACS缓冲液(PBS，3％FCS，0.4％叠氮化物)中，然后接种在96孔圆底板中。在以1000rpm离心3分钟以除去上清液后，将细胞重悬浮于抗HB-EGF抗体稀释液(100μl/孔)中，并在4℃下温育45分钟。用FACS缓冲液清洗细胞两次，用以1∶100稀释于FACS缓冲液中的二抗(100μl/孔)驴抗人PE(Jackson)重悬浮细胞。在4℃下将细胞悬浮液于黑暗中温育30分钟，用FACS缓冲液清洗2次，然后进行分析(FACS，Beckman Coulter)。
图30A显示，3种mAb制剂与来自食蟹猴的pro-HB-EGF交叉反应。
图30B显示，U2-45mAb制剂与小鼠HB-EGF交叉反应，如通过FACS分析所检测的。进一步检测显示，抗体U2-46和U2-51也可检测小鼠HB-EGF。然而，抗体U2-45.1只能非常微弱地(5-10％)中和小鼠HB-EGF诱导的EGFR酪氨酸磷酸化。
5.用于双调蛋白交叉反应性ELISA测定的方案
在4℃下将不同浓度的双调蛋白(R&D systems，浓度1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml于PBS中)于96孔板(Nunc，Maxisorp)中包被过夜。在用清洗缓冲液(PBS+0.05％Tween 20；150μl/孔)清洗板(6次)后，在室温下用封闭缓冲液(PBS+0.5％BSA，100μl/孔)温育板4小时。用清洗缓冲液清洗板6次。使用5μg/ml在抗体稀释缓冲液(含有0.5％BSA，0.05％Tween 20，5mM EDTA的PBS)中的纯化的人抗HB-EGF抗体作为一抗，并且在室温下温育90分钟。用清洗缓冲液清洗板6次，加入抗人POD二抗(Dianova)(以1∶10000稀释于PBS，0.5％BSA，0.05％Tween 20，5mM EDTA中)，在室温下温育60分钟。
用清洗缓冲液清洗板6次，加入TMB底物(Merck Biosciences)，在室温下进行15分钟。在通过加入100μl的250mM HCl终止蓝色的显色后，用板读数器(Thermo labsystems)在450nm处测量吸光度。
图30C显示，抗体U2-45和抗体U2-46(微弱地)结合双调蛋白，如通过EL I SA形式的测定检测的。U2-45mAb结合双调蛋白，但U2-45.1对于双调蛋白的KD只有8nM(与对于HB-EGF的0.043nM相比)。U2-45.1mAb也不中和AR。
L.实施例12：抗HB-EGF Mab U2-42.2、U2-39.1、U2-45.3、U2-26.2和U2-34.1的Kd值的动力学排除测定分析(KineticExclusion Assay Analysis)
使用Ki nExA技术测定mAb U2-42.2、U2-39.1、U2-45.3和U2-26.2以及U2-34.1结合人HB-EGF的KD。为此目的，使用KinExA 3000仪器。为了进行所有mAb的滴定，在4℃下在50mM碳酸钠缓冲液，pH9.0中将50mg吖内酯(azlactone)珠粒与HB-EGF(大约29μg)偶联过夜。在将HB-EGF缀合至珠粒后，将珠粒离心，用封闭缓冲液(1M Tris缓冲液，pH8.3，10mg/ml BSA)清洗一次，再次离心，然后在大约23℃下于封闭缓冲液中温育1至2小时，以封闭存在于珠粒的表面上的任何剩余的反应性吖内酯基团。在封闭后，将珠粒转移至标准KinExA珠粒瓶，并置于仪器上。
MAb U2-42.2：进行对偶曲线(dual curve)分析以测定KD。用浓度不断增加的HB-EGF滴定含有额定的(nominal)mAb结合部位浓度(37pM)的12个溶液以进行KD-受控的滴定(KD-controlledtitration)，并在mAb-受控的滴定曲线中滴定1110pM结合部位。各溶液具有10ml(KD-受控的)或2ml(mAb-受控的)的总体积，并且让其在大约23℃下平衡30-36小时(KD-受控的)或6小时(mAb-受控的)。使用定容玻璃器皿制备用于滴定的所有溶液，HB-EGF的浓度在10.5nM至205fM之间变化。用于分析这些溶液的仪器方法包括其中将珠粒填充入玻璃毛细管的珠粒填充步骤，以一式三份重复将平衡的溶液以0.25ml/分钟流过珠粒柱进行10分钟(2.5ml，KD-受控的)或1分钟(0.25ml，mAb-受控的)。随后，将3.4nM(KD-受控的)或1.1nM(mAb-受控的)的荧光标记的cy-5山羊抗人(Fc特异性的)多克隆抗体以0.5ml/分钟流过珠粒群(bead pack)，进行2分钟，以标记被捕获在珠粒上的游离mAb结合部位。使用620nm的激发光，在670nm处测量来自珠粒群的荧光发射。
将所得的荧光测量结果转换成游离mAb结合部位对总抗原浓度的百分比，如使用所附KinExA软件包(版本1.0.3)标准地进行的。使用KinExA软件拟合双滴定曲线(dual titration curve)至1∶1的平衡等温线(包括漂移校正因子(drift correction factor))。
最佳拟合数据的KD的值为53pM，且低和高95％置信度极限分别为34pM和81pM。
MAb U2-39.1：进行KD-受控的滴定曲线分析以测定KD。用浓度不断增加的HB-EGF滴定含有额定的mAb结合部位浓度(55pM)的12个溶液。各溶液具有10ml的总体积，并且让其在大约23℃下平衡30-36小时。使用定容玻璃器皿制备用于滴定的所有溶液，HB-EGF的浓度在10.5nM至205fM之间变化。用于分析这些溶液的仪器方法包括其中将珠粒填充入玻璃毛细管的珠粒填充步骤，以一式三份重复将平衡的溶液以0.25ml/分钟流过珠粒柱，进行10分钟(2.5ml)。随后，将3.4nM的荧光标记的cy-5山羊抗人(Fc特异性的)多克隆抗体以0.5ml/分钟流过珠粒群，进行2分钟，以标记被捕获在珠粒上的游离mAb结合部位。使用620nm的激发光，在670nm处测量来自珠粒群的荧光发射。使用所附KinExA软件包(版本1.0.3)将所得的荧光测量结果转换成游离mAb结合部位对总抗原浓度的百分比。由于配体非特异性结合珠粒群，因此使用KinExA软件拟合滴定曲线至1∶1的平衡等温线(包括配体非特异性结合的项)。
最佳拟合数据的KD的值为7.8pM，且低和高95％置信度极限分别为5.6pM和11pM。
MAb U2-45.3：进行对偶曲线分析以测定KD。用浓度不断增加的HB-EGF滴定含有额定的mAb结合部位浓度(40pM)的12个溶液以进行KD-受控的滴定，并在mAb-受控的滴定曲线中滴定1060pM结合。各溶液具有10ml(KD-受控的)或2ml(mAb-受控的)的总体积，并且让其在大约23℃下平衡30-36小时(KD-受控的)或6小时(mAb-受控的)。使用定容玻璃器皿制备用于滴定的所有溶液，HB-EGF的浓度在5.25nM至102fM之间变化。用于分析这些溶液的仪器方法包括其中将珠粒填充入玻璃毛细管的珠粒填充步骤，以一式三份重复将平衡的溶液以0.25ml/分钟流过珠粒柱，进行10分钟(2.5ml，KD-受控的)或1分钟(0.25ml，mAb-受控的)。随后，将3.4nM(KD-受控的)或1.1nM(mAb-受控的)的荧光标记的cy-5山羊抗人(Fc特异性的)多克隆抗体以0.5ml/分钟流过珠粒群，进行2分钟，以标记被捕获在珠粒上的游离mAb结合部位。使用620nm的激发光，在670nm处测量来自珠粒群的荧光发射。将所得的荧光测量结果转换成游离mAb结合部位对总抗原浓度的百分比，如使用所附KinExA软件包(版本1.0.3)标准地进行的。使用KinExA软件拟合双滴定曲线至1∶1的平衡等温线(包括漂移校正因子)。
最佳拟合数据的KD的值为43pM，且低和高95％置信度极限分别为27pM和65pM。
MAb U2-26.2：进行对偶曲线分析以测定KD。用浓度不断增加的HB-EGF滴定含有额定的mAb结合部位浓度(41pM)的12个溶液以进行KD-受控的滴定，并在mAb-受控的滴定曲线中滴定1060pM结合部位。各溶液具有10ml(KD-受控的)或2ml(mAb-受控的)的总体积，并且让其在大约23℃下平衡30-36小时(KD-受控的)或6小时(mAb-受控的)。使用定容玻璃器皿制备用于滴定的所有溶液，HB-EGF的浓度在2.63nM至51.4fM之间(KD-受控的)和5.26nM至103fM之间(mAb-受控的)变化。用于分析这些溶液的仪器方法包括其中将珠粒填充入玻璃毛细管的珠粒填充步骤，以一式三份重复将平衡的溶液以0.25ml/分钟流过珠粒柱，进行10分钟(2.5ml，KD-受控的)或1分钟(0.25ml，mAb-受控的)。随后，将3.4nM(KD-受控的)或1.1nM(mAb-受控的)的荧光标记的cy-5山羊抗人(Fc特异性的)多克隆抗体以0.5ml/分钟流过珠粒群，进行2分钟，以标记被捕获在珠粒上的游离mAb结合部位。使用620nm的激发光，在670nm处测量来自珠粒群的荧光发射。将所得的荧光测量结果转换成游离mAb结合部位对总抗原浓度的百分比，如使用所附KinExA软件包(版本1.0.3)标准地进行的。使用KinExA软件拟合双滴定曲线至1∶1的平衡等温线(包括漂移校正因子)。
最佳拟合数据的KD的值为61pM，且低和高95％置信度极限分别为37pM和100pM。
MAb U2-34.1：进行KD-受控的滴定曲线分析以测定KD。用浓度不断增加的HB-EGF滴定含有额定的mAb结合部位浓度(40pM)的12个溶液。各溶液具有10ml的总体积，并且让其在大约23℃下平衡30-36小时。使用定容玻璃器皿制备用于滴定的所有溶液，HB-EGF的浓度在5.26nM至103fM之间变化。用于分析这些溶液的仪器方法包括其中将珠粒填充入玻璃毛细管的珠粒填充步骤，以一式三份重复将平衡的溶液以0.25ml/分钟流过珠粒柱，进行10分钟(2.5ml)。随后，将5.1nM的荧光标记的cy-5山羊抗人(Fc特异性的)多克隆抗体以0.5ml/分钟流过珠粒群，进行2分钟，以标记被捕获在珠粒上的游离mAb结合部位。使用620nm的激发光，在670nm处测量来自珠粒群的荧光发射。将所得的荧光测量结果转换成游离mAb结合部位对总抗原浓度的百分比，如使用所附KinExA软件包(版本1.0.3)标准地进行的。由于配体非特异性结合珠粒群，因此使用KinExA软件拟合滴定曲线至1∶1的平衡等温线(包括配体非特异性结合的项)。
最佳拟合数据的KD的值为59pM，且低和高95％置信度极限分别为32pM和87pM。
M.实施例13：抗体亲和力Scatchard分析的测定
通过间接FACS Scatchard分析进行本文中提供的抗体的亲和力测量。为了进行该分析，用PBS中的10mM EDTA收获2x105个目的细胞，将其重悬浮于FACS缓冲液(PBS，3％FCS，0.4％叠氮化物)中，然后接种至96孔圆底板上。在以1000rpm离心3分钟以除去上清液后，将细胞重悬浮于抗HB-EGF抗体稀释液(100μl/孔)(始于20μg/ml，以1∶2稀释幅度稀释)中。将细胞悬浮液在4℃下温育45分钟，用FACS缓冲液清洗2次，然后用以1∶100稀释于FACS缓冲液中的二抗(100μl/孔)驴抗人PE(Jackson)重悬浮细胞。在4℃下将细胞悬浮液于黑暗中温育30分钟，用FACS缓冲液清洗2次，然后对其进行分析(FACS，Beckman Coulter)。
根据FACS Scatchard分析，计算各测量的荧光平均值。从各荧光平均值中减去无HB-EGF抗体的细胞的背景荧光。产生Scatchard曲线，x-值＝荧光平均值，y-值＝荧光平均值/mAb的浓度(nM)。KD为线性方程的1/m的绝对值。
表5
FACS Scatchard测定的抗体U2-42和U2-39
对3种不同人癌细胞系的亲和力
Figure GSB00001007631901071
N.实施例14：抗HB-EGF Mab U2-45.3结合双调蛋白的Kd值的动力学排除测定分析
进行KD-受控的滴定曲线分析以测定KD。用浓度不断增加的双调蛋白滴定含有额定的mAb结合部位浓度(4.4nM)的12个溶液。各溶液具有10ml的总体积，并且让其在大约23℃下平衡30-36小时。使用定容玻璃器皿制备用于滴定的所有溶液，双调蛋白的浓度在1.23μM至24pM之间变化。用于分析这些溶液的仪器方法包括其中将珠粒填充入玻璃毛细管的珠粒填充步骤，以一式三份重复将平衡的溶液以0.25ml/分钟流过珠粒柱，进行1分钟(0.25ml)。随后，将684pM的荧光标记的cy-5山羊抗人(Fc特异性的)多克隆抗体以0.5ml/分钟流过珠粒群，进行2分钟，以标记被捕获在珠粒上的游离mAb结合部位。使用620nm的激发光，在670nm处测量来自珠粒群的荧光发射。将所得的荧光测量结果转换成游离mAb结合部位对总抗原浓度的百分比，如使用所附KinExA软件包(版本1.0.3)标准地进行的。由于配体非特异性结合珠粒群，因此，在各浓度下收集的三个重复中只有一个重复(将最高的3个2倍的双调蛋白浓度从分析中排除)可进行分析，使用KinExA软件使其拟合至1∶1的平衡等温线。
最佳拟合数据的KD的值为5.0nM，且低和高95％置信度极限分别为3.1nM和7.7nM。
O.实施例15：最佳抗体制剂的选择标准
下列标准用于鉴定最佳抗体制剂：抑制TMPS的潜能、直接抑制HB-EGF的潜能(如通过观察抗体抑制EGF受体和HER4的酪氨酸磷酸化的程度测量的)、抗体对HB-EGF的亲和力、抗体对于其他分子的交叉反应性和表位的特征。
P.实施例16：抗Hb-Egf抗体抑制HB-EGF刺激的Huvec细胞增殖和管形成
本实施例举例说明，虽然HB-EGF刺激人血管内皮细胞(HUVEC)增殖，但本文中提供的抗HB-EGF抗体抑制基础HUVEC细胞增殖。同样，如本实施例所显示的，抗HB-EGF抗体抑制HUVEC的管形成，所述管形成是新血管生成的体外模型。抑制HUVEC增殖和/或血管生成的抗体制剂不仅可用于治疗癌症而且可用于治疗牵涉不期望的血管生成的非癌病况(例如，糖尿病性视网膜病变)。
1.方法：通过流式细胞术测定HUVEC细胞上的HB-EGF表达
通过FACS分析测定人内皮细胞上的HB-EGF表达。因此，用PBS中的10mM EDTA收获2x105个目的细胞，将其重悬浮于FACS缓冲液(PBS，3％FCS，0.4％叠氮化物)中，然后接种至96孔圆底板上。在以1000rpm离心3分钟后，除去上清液，将细胞重悬浮于抗HB-EGF抗体稀释液(100μl/孔，10μg/ml抗HB-EGF抗体)中并且在4℃下温育45分钟。用FACS缓冲液清洗细胞2次，然后用以1∶100稀释于FACS缓冲液中的二抗(100μl/孔)抗人PE(Jackson)重悬浮细胞。在4℃下将细胞悬浮液于黑暗中温育30分钟，用FACS缓冲液清洗2次，然后对其进行分析(FACS，Beckman Coulter)。
为了检测抗HB-EGF抗体对HUVEC增殖的作用，将大约5000个HUVEC细胞接种入48孔板中，每孔装有含有EGM-2、氢化可的松、抗坏血酸、庆大霉素-两性霉素和2％FCS(含有bFGF、VEGF、EGF和IGF-1)(Cambrex)的培养基。在将细胞于37C下温育过夜后，用含有0.5％FCS的PBS清洗细胞2次。然后将细胞在EGM-2，0.5％FCS(未补充生长因子)中饥饿8小时。将HB-EGF或抗HB-EGF抗体制剂加入500μl的饥饿培养基中。
然后将细胞再培养另外60小时，然后经历胰蛋白酶处理并计数。
为了检测抗HB-EGF抗体对HUVEC的管形成的作用，将200μl生长因子减少的(reduced)基质胶(BD biosciences)涂铺在48个孔中。每孔加入250μl HUVEC培养基(EBM-2+氢化可的松+抗坏血酸庆大霉素-两性霉素+0.25％FCS(来自Cambrex))。在预温育20分钟后，加入20,000个HUVEC细胞(于50μl培养基+0.25％FCS(含有HB-EGF(10ng/ml)或U2-42、U2-39或U2-45抗HB-EGF抗体(10μg/ml))中)。通过获得培养孔的代表性区域的显微照片监控管形成。为了进行定量分析，计数HUVEC管的封闭区域。
2.结果
如通过图30中的FACS分析所显示的，HB-EGF在HUVEC上表达。细胞增殖测试的结果提供于图32A-B中。如图32A中所示，HB-EGF刺激HUVEC细胞增殖大约38％。然而，在加入抗HB-EGF抗体制剂U2-42、U2-39或U2-45后，这样的细胞增殖的刺激被抑制大约8％至14％(图31B)。在该测定中，U2-39抗HB-EGF抗体制剂提供了最高水平的抑制。
管形成测试的结果提供于图33A-M中。图34A-C中所示的不使用抗HB-EGF抗体的对照测定显示，HUVEC细胞连接形成环形结构或“管”。然而，在加入抗HB-EGF抗体制剂U2-42、U2-39或U2-45后，这样的管形成被抑制。观察到的管的数目的概述提供于图33M中。如图33M中所示，U2-42抗HB-EGF抗体制剂提供了最高的管消退加速度，其次是U2-39抗HB-EGF抗体制剂。
Q.实施例17：抗HB-EGF抗体抑制HB-EGF刺激的集落形成和基础集落形成
为了研究本文中提供的抗体抑制不依赖于锚定的细胞生长的能力，进行软琼脂测定。软琼脂集落形成测定是检测转化的细胞的标准体外测定，因为只有此类转化的细胞才可在软琼脂上生长。
为了进行该测定，将OVCAR-8、BM-1640和NCI-H226细胞与10ng/ml HB-EGF和与IMDM培养基(Gibco)中的20μg/ml的抗HB-EGF抗体或IgG2(SIGMA)(作为阴性对照)一起温育，然后重悬浮于0.2％Difco诺布尔琼脂中。将细胞悬浮液以一式四份涂铺在96孔板中的0.4％琼脂底层上，然后用IMDM培养基进行覆盖。让集落形成，进行大约14天，然后用40μl MTT(Sigma，1mg/ml于PBS中)染色4小时。通过HTSBonit(LemnaTec)集落形成软件定量HB-EGF的刺激作用和抗HB-EGF抗体的抑制作用。
在另一个测定中，在37℃下用20μg/ml的IMDM培养基(Gibco)中的抗HB-EGF抗体或IgG2(SIGMA)(作为阴性对照)预温育750或1000个细胞(取决于SkOV-3克隆71或74，图34D和E)，进行30分钟，然后将细胞重悬浮于0.4％Difco诺布尔琼脂(或0.2％，对于克隆74)中。将细胞悬浮液以一式四份涂铺在96孔板中的0.75％琼脂底层(0.4％，对于克隆74)上，然后用IMDM培养基进行覆盖。在类似的测定中，在37℃下用在含有20％的FCS的IMDM培养基(Gibco)中的20μg/ml抗HB-EGF抗体或20μg/ml IgG2(SIGMA)(作为阴性对照)预温育2000个BxPC-3细胞30分钟(图34F)。将细胞重悬浮于0.4％Difco诺布尔琼脂中，并将细胞悬浮液以一式四份涂铺在96孔板中的0.75％琼脂底层上。用IMDM培养基覆盖孔。两层都包含20％的FCS。
让集落形成，进行大约14天，然后用40μl MTT(Sigma，1mg/ml于PBS中)染色4小时。结果示于图34A-F中，所述图举例说明，HB-EGF刺激的集落形成(图34A-C)和基础集落形成(图34D-F)被抗HB-EGF抗体显著减少。如例如图34A中所示的，HB-EGF刺激OVCAR-8细胞形成比在HB-EGF不存在的情况下培养的对照OVCER-8细胞显著更大的平均集落大小。然而，当在HB-EGF存在的情况下将OVCAR-8细胞与抗HB-EGF U2-39抗体一起培养时，平均集落大小减小至与对于无HB-EGF处理的对照细胞观察到的大小相似的大小(图34A)。对于BM1604细胞(来源于前列腺癌组织)观察到相似的结果(参见，图34B)。抗HB-EGFU2-45和U2-42抗体也抑制BM1604的集落形成。
抗HB-EGF抗体也抑制HB-EGF刺激的NCI-H226肺癌细胞的集落形成(图34C)。如图36C中所示，当在HB-EGF存在的情况下将NCI-H226细胞与抗HB-EGF U2-39抗体一起培养时，平均集落大小减小至与对于无HB-EGF处理的对照细胞观察到的大小相似的大小。
使用本发明的抗HB-EGF抗体的处理减少集落的数目以及集落大小(图34D-F)。因此，图34D举例说明，抗HB-EGF抗体减少由SkOV-3HB-EGF克隆71细胞(来源于用proHB-EGF表达构建体稳定地转染的SkOV-3卵巢癌细胞)形成的基础集落的数目。如所显示的，过表达HB-EGF的对照SkOV-3细胞形成大量的集落。然而，当在HB-EGF存在的情况下将SkOV-3HB-EGF cl.71细胞与抗HB-EGF U2-42或U2-39抗体一起培养时，集落的数目急剧减少。类似地，抗HB-EGF抗体抑制SkOV-3(克隆74)细胞(来源于卵巢癌组织)和BxPC3细胞(来源于胰腺腺癌组织)的集落形成(图34E-F)。
这些数据表明由多种癌细胞类型产生的集落形成和肿瘤可被本发明的抗HB-EGF抗体(包括本文中提供的U2-42、U2-39和U2-45抗体制剂)抑制。
R.实施例18：抗HB-EGF抗体在体内抑制肿瘤生长
图37举例说明使用SCID小鼠的异种移植物实验中形成的胰腺BxPC3肿瘤的平均体积。如所显示的，当与媒介物对照相比较时，在抗体制剂U2-42和/或U2-39存在的情况下，已建立的肿瘤的生长被显著抑制。在图38A中显示，抗HB-EGF抗体U2-42、U2-39和U2-45体内抑制已建立的EFO-27HB-EGF克隆58细胞的生长。经显示，肿瘤生长抑制作用是剂量依赖性的，25mg/kg为高度有效的处理，而较低的剂量例如1或5mg/kg效率较低(图38B)。
S.实施例19：抗HB-EGF抗体与抗egfr抗体爱必妥的联合疗法
图35显示抗HB-EGF抗体对EFO-27HB-EGF cl.58细胞的单试剂抑制是中等至强的程度。然而，在抗HB-EGF和抗EGFR抗体的剂量受控组合中，集落形成的抑制极其有效。此外，体内异种移植物的生长受到抗HB-EGF和抗EGFR抗体组合的强烈抑制，从而导致卵巢癌肿瘤生长的完全消退(图38C)。
T.实施例20：多种癌细胞类型上的HB-EGF表达
通过FACS分析确定人癌细胞系上的HB-EGF表达。为了进行该分析，用PBS中的10mM EDTA收获2x105个细胞，将其重悬浮于FACS缓冲液(PBS，3％FCS，0.4％叠氮化物)中，然后转移至96孔圆底板。在以1000rpm离心3分钟以除去上清液后，将细胞重悬浮于抗HB-EGF抗体稀释液(100μl/孔)中并且在4℃下温育45分钟。用FACS缓冲液清洗细胞2次，然后用以1∶100稀释于FACS缓冲液中的二抗(100μl/孔)驴抗人PE(Jackson)重悬浮细胞。在4℃下将细胞悬浮液于黑暗中温育30分钟，然后用FACS缓冲液清洗2次，并对其进行分析(FACS，Beckman Coulter)。
这些测定的结果示于下面的表6中。
表6癌细胞中的HB-EGF表达
Figure GSB00001007631901131
U.实施例21：用于通过免疫组织化学和ELISA检测组织和体液中的HB-EGF的抗HB-EGF抗体
就它们对人固定的样品中表达的HB-EGF进行染色的能力检测抗HB-EGF抗体U2-42和U2-39。如图39A中所示，两种抗体都显示显著的人肾小管细胞的膜和细胞质染色，而对照不显示任何染色。除了免疫组织化学检测患者组织样品中的HB-EGF外，HB-EGF作为生长因子释放入不同体液中。基于将人抗HB-EGF抗体作为包被试剂，建立检测液体样品中低至低于40pg/ml的水平的HB-EGF的ELISA(图39B)。
V.实施例22：抗体的典范类(Canonical Classes)
如最后一个实施例中所述的，对编码最佳抗体的基因进行测序。该序列数据用于将抗体分配至典范类。
Chothia等人已根据各免疫球蛋白链的高变区的“典范类”描述了抗体结构(Chothia等人，1987，J.Mol.Biol，196(4)：901-17)。分析多种免疫球蛋白的Fab和VL片段的原子结构以确定它们的氨基酸序列与它们的抗原结合部位的三维结构之间的关系。Chothia等人发现，存在相对少的残基，其通过它们的堆积(packing)、氢键合或采取稀有的Ф、Ψ或ω构象的能力，主要负责高变区的主链构象。发现此类残基在高变区内的和保守的α-折叠构架中的位点出现。通过检查具有未知的结构的免疫球蛋白的序列，Chothia等人显示许多免疫球蛋白具有大小与已知结构的高变区相似的高变区并且在负责观察到的构象的位点上额外地包含相同的残基。
他们的发现表明此类高变区具有与已知结构中的构象接近的构象。对于高变区中的5个高变区，构象库似乎限定于相对少数的分离的结构类型。高变区的这些共同发生的主链构象称为“典范结构”。由Chothia等人，1989；Nature 342：877-83)和其他人(Martin等人，1996；J.Mol.Biol.263：800-15)进行的进一步工作确认，对于抗体6个高变区中的至少5个，存在小型的主链构象库。
分析各抗体制剂的互补决定区(CDR)以确定它们的典范类。如所已知的，只对抗体重链的CDR1和CDR2以及抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3分配典范类。下表概述了分析的结果。典范类数据的形式为HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3(H1-H2-L1-L2-L3)，其中“HCDR”是指重链CDR，“LCDR”是指轻链CDR。因此，例如，1-3-2-1-1的典范类是指具有落入典范类1的HCDR1、落入典范类3的HCDR2、落入典范类的2的LCDR1、落入典范类1的LCDR2和落入典范类1的LCDR3的抗体。
分配至特定典范类，其中抗体中的氨基酸与各典范类定义的氨基酸匹配。可例如在Chothia等人的论文(上文中提及的)中发现各典范类定义的氨基酸。表7和表8报导了每一个HB-EGF抗体的典范类分配。在不存在匹配的典范类的情况下，典范类分配用字母s和数字，来标记，例如“s18”意指CDR为18型(size 18)。
表7
Figure GSB00001007631901151
Figure GSB00001007631901161
表8
H1-H2-L1-L2-L3
Figure GSB00001007631901171
Figure GSB00001007631901181
表9是每类抗体的数目的分析。具有左栏中指定的特定典范类的抗体的数目示于右栏中。
最常见的结构是1-3-2-1-1。总共40个mAb中有8个具有该组合。
表9各典范类组合中的抗HB-EGF抗体的数目
W.实施例23：抗HB-EGF抗体的表位作图
本实施例描述了被抗体制剂识别的表位的作图。
测试的抗体：分析了能够中和HB-EGF的活性的5种XenoMouse来源的人单克隆抗体制剂：U2-39、U2-42、U2-45、U2-26和U2-19。这些单克隆抗体制剂中有4种显示特异于人HB-EGF，然而抗体制剂U2-45展示与小鼠HB-EGF和人双调蛋白的一些交叉反应性。将所有这些中和抗体制剂针对MCAB Bins 7 & 8作图(参见下面)。
1.表位作图
通过PCR扩增从HeLa mRNA分离人HB-EGF cDNA，使用Ig κ信号肽序列，将成熟的HB-EGF序列克隆入pSecTAg载体作为myc-His融合蛋白。在293T细胞中表达成熟HB-EGF多肽，其分泌入培养基中。
通过定点诱变突变HB-EGF的白喉毒素结合位点以及EGF受体结合位点。
还克隆了短形式的HB-EGF，其丧失了EGF样结构域的第三个二硫键(Loukianov等人，Gene 195：81-86)。
将具有SEQ ID NO：1052(DPCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGYHGERCHGLSLP)的HB-EGF的EGF样结构域克隆入pSecTag，并表达和分泌为Myc-His融合蛋白。
2.结果
所有U2-39、U2-42、U2-45、U2-26和U2-19抗体制剂识别非连续表位。没有一种抗体识别短形式的HB-EGF。
所有5种抗体制剂的结合部位在EGF样结构域内，其包括具有下列序列的成熟蛋白的残基44-86：DPCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGYHGERCHGLSLP(SEQ ID NO：1052)。EGF样结构域中的第三个二硫键是所有U2-39、U2-42、U2-45、U2-26和U2-19抗体制剂的结合所必需的。
3.通过定点诱变进行的抗体结合部位的结构-功能分析
通过用在小鼠pro-HB-EGF中天然发现的相应氨基酸残基替代人pro-HB-EGF的EGF样结构域中的1至4个残基来在HB-EGF中产生12个独立的突变。
假定许多本发明的抗体制剂是种选择性的，在人HB-EGF蛋白与来自不同物种的相关蛋白之间的已知差异上进行用于鉴定HB-EGF表位的定点诱变。特别地，人和小鼠HB-EGF之间的氨基酸差异如下：K122R、V124L、K125Q、I133K和H135L。
用于表位作图的HB-EGF突变体多肽序列的完全清单提供于表10中。编码期望的突变体蛋白的突变体HB-EGF核酸在293T细胞中瞬时表达，并通过ELISA测量单克隆抗体的结合。
因此，制备具有此类突变的HB-EGF突变体多肽，检测这样的突变体多肽以确定本发明的抗体制剂是否仍然结合HB-EGF突变体多肽。如果不结合，那么突变的氨基酸对于抗体结合可能是特别重要的，从而构成了表位的重要部分。
表11概述了获得的结合结果，其中“是”表示无论指定的突变是什么，都发生结合，“否”表示结合基本上被指定的突变消除，以及“减少”表示当突变存在时，发生减少的结合。
表10
Figure GSB00001007631901211
表11.结合结果
Figure GSB00001007631901221
这些结合研究表明U2-42和U2-39抗体制剂识别白喉毒素结合结构域并且F115、L127和E141残基对于白喉毒素结合是很重要的。
此外，当F115Y或E141H突变存在于HB-EGF上时，U2-42抗体制剂的结合基本上被消除。因此，Phe-115和Glu-141对于U2-42抗体结合是很重要的。U2-45抗体制剂也表现需要Phe-115，因为当Phe-115被突变时，该抗体制剂的结合减少。
U2-39抗体制剂需要Phe-115和Leu-127以结合HB-EGF，因为这两个残基中的任一个的突变都基本上消除了抗体结合。
U2-19、U2-26和U2-45抗体制剂结合残基117至120(IHGE)之间保守区域。如表11中所示，抗体制剂U2-19和U2-26也识别在Ile-133和/或His-135上的表位，因为这些残基的至少一个对于它们的结合是至关重要的。
基于它们的结合性质，将抗体置于表12中所列的关系“堆栈(bin)”中。
堆栈划分(Binning)是基于它们竞争对抗原的结合来分类抗体的方法(参见，Jia等人，2004，J.Immunol.Methods 288：91-98)。
堆栈的分配取决于对于所有测试抗体观察到的结合模式的差异程度。因此，堆栈并不总是与通过其他方法确定的表位相关并且只可用于粗略地界定表位。
表12.抗体关系堆栈
Figure GSB00001007631901231
通常，U2-45抗体制剂的表位作图显示堆栈7抗体制剂与小鼠HB-EGF和人双调蛋白交叉反应。
F115至Ala或Tyr的突变影响U2-45抗体的结合亲和力。然而，U2-45抗体结合不受I133和H135的突变影响，所述突变确实影响一些其他的堆栈7抗体制剂。当IHGE人HB-EGF序列改变成LHDGV(其存在于小鼠HB-EGF和人双调蛋白中)时，所有堆栈7抗体制剂不能结合。因此，IHGE残基(117-120)可能形成了堆栈7抗体制剂的表位。
另外的牵涉HB-EGF突变体与EGFR的结合的定点诱变研究显示，残基包括Asp-106和Pro-107都是HB-EGF与EGF受体最佳结合所必需的。此外，HB-EGF与EGF受体结合所必需的Leu-148似乎不参与任何抗HB-EGF抗体制剂的结合。
HH.实施例24：抗HB-EGF抗体的关键元件的序列
本实施例在图1-21中提供了抗体制剂的序列。
实施例25A：划痕测定--HB-EGF诱导的CLS354上皮鳞癌细胞(口)的迁移的抑制。
为了研究本发明的抗体是否阻止由HB-EGF直接诱导的细胞迁移，进行划痕实验。
将1x106个CLS354细胞于1ml培养基(含有10％FCS的RPMI培养基)中接种至12孔板上，然后血清饥饿(含有05％FCS的培养基)过夜。在细胞已达到汇合后，用无菌塑料尖在孔的中间划痕。用PBS清洗细胞，在10μg/ml U2-39、爱必妥或人IgG存在或不存在的情况下单独地或用20ng/ml HB-EGF处理经划痕的CLS354细胞。在于37℃下温育12小时后终止实验。撤走培养基，细胞用PBS进行清洗，然后用100％冰冷甲醇在-20℃下进行固定，用结晶紫染色，清洗，然后干燥过夜。照相以进行记录。
图40A显示HB-EGF处理刺激刮痕的封闭，并且本发明的抗体U2-39抑制HB-EGF介导的CLS354上皮鳞癌细胞迁移进入刮痕。
实施例25B：移行测定--HB-EGF诱导的Detroit 562上皮癌细胞(咽)的迁移的抑制
为了研究本发明的抗体是否阻止由HB-EGF直接诱导的细胞迁移，进行移行实验。
将500ml经血清饥饿的人上皮癌细胞的细胞悬浮液(50,000个细胞)置于纤连蛋白包被的transwell(BD Falcon，8μm的孔径)的顶部小室中。在37℃下预温育30分钟后，在10μg/ml人IgG、U2-39或爱必妥抗体存在或不存在的情况下，将750ml单独的培养基(具有非必需氨基酸、丙酮酸钠(1mM)和乳清蛋白水解产物(0.1％)的Earle′sBSS中的最低基础培养基(Eagle)，90％；胎牛血清10％，青霉素-链霉素，0.1％BSA)或含有20ng/ml HB-EGF(R&D Systems)的所述培养基的等分置于底部小室中。在37℃下进行温育和迁移6小时后，固定细胞，用DAPI染色，并对transwell照相以进行评估。
结果证明，与爱必妥处理对HB-EGF介导的细胞迁移的抑制相比较，HB-EGF抗体U2-39有效地抑制HB-EGF诱导的Detroit 562上皮癌细胞的迁移。
实施例26：基于球状体的细胞血管生成测定--VEGF刺激的内皮细胞出芽的抑制
为了研究本发明的抗体是否能够抑制VEGF诱导的内皮细胞(EC)在胶原基质中的出芽，进行基于球状体的细胞血管生成测定。原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)以500个细胞接种在塑料皿上的悬滴中以允许过夜球状体聚集。将50个EC球状体接种在0.9ml胶原溶液(2mg/ml)中，并转移入24孔板的单独的孔中以允许聚合。在聚合前将本发明的抗体U2-39(不同浓度)与胶原溶液直接混合，30分钟后，通过将100μl 10倍浓缩的工作稀释液转移至聚合的凝胶的顶部来加入生长因子VEGF-A(25ng/ml)。将板在37℃下温育24小时，然后通过加入4％多聚甲醛进行固定。通过使用倒置显微镜和数字成像软件Analysis 3.2测定每个球状体的累积出芽长度的图象分析系统定量EC球状体的出芽强度。
图41A描述了每个数据点的10个随机选择的球状体的累积出芽长度的平均值。图41B显示U2-39对每个数据点的10个随机选择的球状体的累积出芽长度的相对抑制。使用GraphPad Prism 4.03进行IC50曲线的拟合与IC50值的计算。
实施例26的结果显示，本发明的抗体U2-39在使用胶原基质的基于球状体的测定中以剂量依赖性方式抑制VEGF-A刺激的人脐静脉内皮细胞的出芽。HUVEC出芽被抑制，IC50值为5.2x10-8Molar。
实施例27：人肿瘤异种移植物样品的免疫组织化学(IHC)分析--体内肿瘤的CD31染色的抑制
为了研究本发明的抗体U2-39体内抑制血管生成的功效，通过免疫组织化学分析来分析用U2-39或爱必妥处理的人肿瘤异种移植物。
基因工程改造人卵巢腺癌细胞系EFO27以过表达HB-EGF，选择克隆EFO27-C158用于在SCID小鼠中进行异种移植物研究。将3x106个EFO27-C158细胞(于100μl PBS/基质胶(1∶1)中)皮下注射入7周龄雌性C.B-17 SCID小鼠的左肋腹。将具有250mm3的平均肿瘤体积的荷瘤小鼠随机分组(每组含有10只动物)。用25mg/kg U2-39或25mg/kg爱必妥或对照媒介物PBS的周剂量腹膜内处理小鼠，进行3周。28天后，杀死小鼠，收集原代肿瘤组织，将一半的肿瘤在液氮中进行快速冷冻(snap-frozen)，然后于-80℃下贮存。
将在腔室玻片(glass chamber slide)上制备的5至8μm肿瘤切片在4℃下于100％丙酮中固定10分钟，然后彻底干燥。为了封闭非特异性结部位，用抗生物素D封闭剂(15分钟)、生物素封闭剂(15分钟)和1.25％BSA溶液(1小时)处理具有固定的肿瘤切片的玻片。在各处理步骤之间，用PBS清洗玻片2次。为了进行肿瘤脉管系统的免疫组织化学检查，通过用2μg/ml抗CD31抗体(稀释于1.25％BSA溶液中并且在室温下在湿室中温育2小时)处理玻片来分析典型内皮细胞标志物CD31(也称为PECAM-1，血小板内皮细胞粘附分子-1)的表达。通过使用生物素化的山羊抗大鼠IgG抗体(在室温下进行30分钟)和Alexa 546链霉抗生物素(于黑暗中进行15分钟)来进行检测。在各处理步骤之间进行PBS清洗步骤。用含有DAPI的VECTASHIELD封固剂在黑暗中进行封片，拍照(荧光显微镜)以进行记录，然后在4℃下保存。
图42证实，用U2-39处理的人肿瘤异种移植物与爱必妥处理或对照处理的肿瘤异种移植物相比较，显示减少的内皮细胞标志物染色(CD31染色)。该结果证明了本发明的抗体的体内抗血管生成功效。
实施例28：体内卵巢肿瘤异种移植物模型--U2-39与顺铂和阿瓦斯丁的联合治疗
为了评估本发明的抗体作为单一疗法或与顺铂或阿瓦斯丁联合施用的抗肿瘤功效，进行卵巢癌异种移植物研究。
基因工程改造人卵巢腺癌细胞系EFO27以过表达HB-EGF。选择克隆EFO27-C158用于在SCID小鼠中进行异种移植物研究。将3x106个EFO27-C158细胞(于100μl PBS/基质胶(1∶1)中)皮下注射入7周龄雌性C.B-17 SCID小鼠的左肋腹。将具有75至175mm3的平均肿瘤体积的荷瘤小鼠随机分组(每组含有10只动物)。用25mg/kg U2-39，25mg/kg阿瓦斯丁或5mg/kg顺铂或对照媒介物PBS的周剂量腹膜内处理动物。以各自12.5mg/kg给予U2-39与阿瓦斯丁的组合，以25mg/kg抗体与5mg/kg顺铂给予U2-39与顺铂的组合。每周测定原代肿瘤的大小3次。在测径器测量后，按照公式W2xL/2(L＝肿瘤的长度和W＝肿瘤的垂直宽度)计算肿瘤大小。Kaplan-Meier时序法(log-rankmethod)用于确定进展至500mm3(因统计原因定义为“事件”)的时间。
图43A显示，U2-39与顺铂的组合在施用期间导致比单独使用顺铂的处理更强的肿瘤减小。此外，与U2-39单一疗法相比较，U2-39与顺铂的组合延迟了中等肿瘤大小进展至500mm3的时间。
图43B中的结果显示，U2-39与阿瓦斯丁的组合，虽然只施用了一半的单试剂剂量，但与使用阿瓦斯丁作为单一疗法的治疗相比较，显著延迟了进展至500mm3肿瘤体积的时间。
本文中引用或提及的所有专利和公开案表示本发明所属领域的技术人员的能力水平，并且每一个这样的引用的专利或公开案通过引用合并入本文，其引用程度就如同将其单独地以其全文通过引用合并入本文或以其全文示于本文。申请人保留将来自任何这样引用的专利或公开案的任何和所有材料及信息物理合并入本说明书的权利。
本文中描述的特定方法和组合物代表了优选的实施方案并且是示例性的，无意作为对本发明的范围的限定。对于本领域技术人员来说，在考虑了本说明书后，其他目的、方面和实施方案可被想到，并且包括在由权利要求的范围所界定的本发明的精神内。对于本领域技术人员显然的是，可对本文中公开的发明进行许多置换和修饰而不背离本发明的范围和精神。可在任何元素或限制(其在本文中未明确地公开为必需的)不存在的情况下实施本文中适当地说明性地描述的发明。可以以不同的步骤顺序实施本文中适当地说明性地描述的方法和过程，并且它们不必限定于本文中或权利要求中指定的步骤顺序。如本文中和所附权利要求中使用的，除非上下文中明确地指出，否则单数形式“a”、“an”和“the”包括复数所指物。因此，例如，“an antibody”包括复数个(例如，抗体溶液或一系列抗体制剂)这样的抗体等。无论在什么情况下，本专利都不可解释为限定于本文中明确公开的特定实施例或实施方案或方法。无论在什么情况下，本专利都不可解释为限定于由专利商标局的任何审查员或任何其他工作人员或雇员发表的任何声明，除非申请人的书面答复中明确且无条件或有保留地采纳了这样的声明。
已使用的术语和表述用作描述性而非限定性的术语，在此类术语和表述的使用中无意排除所显示和描述的特征或其部分的任何等价物，而应理解，在所请求保护的本发明的范围内各种变动是可能的。因此，应理解，虽然本发明已通过优选实施方案和选择的特征明确地公开，但本领域技术人员可采取本文中公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被认为在由所述权利要求界定的本发明的范围内。
本文中已广泛地和一般地描述了本发明。每一个落在属类(generic)公开内容中的较窄的种类和亚属类也构成本发明的部分。这包括本发明的属类描述，前提或负面限制是从属中除去任何主题物质，无论除去的物质是否在本文中被明确地提及。

Claims (36)

1.特异性结合HB-EGF的分离的抗体或其抗体片段，其包含： 
A)SEQ ID N0：207的CDRL1，SEQ ID N0：225的CDRL2，和SEQ ID N0：257的CDRL3， 
SEQ ID N0：292的CDRH1，SEQ I D N0：323的CDRH2，和SEQ ID NO：361的CDRH3；或者 
B)SEQ ID NO：210的CDRL1，SEQ I D N0：221的CDRL2，和SEQ ID NO：260的CDRL3， 
SEQ ID N0：292的CDRH1，SEQ ID NO：320的CDRH2，和SEQ ID NO：362的CDRH3；或者 
C)SEQ ID N0：213的CDRL1，SEQ ID NO：230的CDRL2，和SEQ ID NO：263的CDRL3， 
SEQ ID N0：293的CDRH1，SEQ ID NO：324的CDRH2，和SEQ ID NO：364的CDRH3； 
其中所述抗体片段是Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、双价抗体或单链抗体分子。 
2.权利要求1的抗体或抗体片段，其包含： 
a)SEQ ID NO：121的VL和SEQ ID NO：172的VH，或者 
b)SEQ ID N0：124的VL和SEQ ID N0：175的VH，或者 
c)SEQ ID NO：127的VL和SEQ ID NO：178的VH。 
3.权利要求1或2的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体，或其抗体片段。 
4.权利要求3的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体是人抗体。 
5.权利要求3的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体是单克隆抗体。 
6.权利要求1或2的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类型。 
7.权利要求6的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是IgG2或IgG4类型。 
8.权利要求1或2的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段偶联至标记基团。 
9.权利要求8的分离的抗体或抗体片段，其中所述标记基团是放射性核素、荧光基团、酶基团、化学发光基团、或生物素基团。 
10.权利要求1或2的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段偶联至效应子基团，其中所述效应子基团是放射性核素、毒素或治疗性基团。 
11.权利要求10的分离的抗体或抗体片段，其中所述效应子基团是化学治疗基团。 
12.权利要求10的分离的抗体或抗体片段，其中所述治疗性基团是卡奇霉素、auristatin-PE、格尔德霉素、或美登纳新。 
13.权利要求1或2的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段至少部分地减少HB-EGF介导的信号转导。 
14.编码权利要求1-7的任一项的抗体或抗体片段的核酸分子。 
15.权利要求14的核酸分子，其中所述核酸分子与控制序列有效连接。 
16.包含权利要求14或15的核酸分子的载体。 
17.包含权利要求14或15的核酸分子或权利要求16的载体的宿主细胞。 
18.制备权利要求1-7的任一项的抗体或抗体片段的方法，其包括从分泌所述抗体或抗体片段的宿主细胞制备所述抗体或抗体片段的步骤。 
19.包含至少一种权利要求1-7的任一项的抗体或抗体片段以及可药用的载体、稀释剂和/或佐剂的药物组合物。 
20.权利要求19的药物组合物，其还包含另外的活性剂。 
21.权利要求20的药物组合物，其中所述另外的活性剂是抗肿瘤剂。 
22.权利要求21的药物组合物，其中所述抗肿瘤剂是抗肿瘤抗体。 
23.权利要求21的药物组合物，其中所述抗肿瘤剂是顺铂或阿瓦斯丁。 
24.权利要求22的药物组合物，其中所述抗肿瘤抗体是抗受体酪氨酸激酶或抗EGFR的抗体。 
25.权利要求19的药物组合物，其用于过度增殖性疾病的预防或治疗。 
26.权利要求25的药物组合物，其中所述过度增殖性疾病与HB-EGF表达相关，或其中所述过度增殖性疾病与被扰乱的生长因子受体激活相关。 
27.权利要求26的药物组合物，其中所述过度增殖性疾病与病理性增强的生长因子受体激活相关。 
28.权利要求27的药物组合物，其中所述病理性增强的生长因子受体激活与G蛋白和/或G蛋白偶联受体的活性的病理性增加相关或由其引起。 
29.权利要求25的药物组合物，其中所述过度增殖性疾病是癌症。 
30.权利要求29的药物组合物，其中所述癌症选自乳腺癌、胃肠癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑素瘤、以及其他表达或过表达HB-EGF的癌症。 
31.权利要求29的药物组合物，其中所述癌症选自上皮癌或鳞癌。 
32.至少一种权利要求1-7任一项的抗体或抗体片段用于制造药物组合物的用途，所述药物组合物用于诊断、预防或治疗过度增殖性疾病。 
33.权利要求32的用途，其中所述过度增殖性疾病是如权利要求26-31中任一项所定义的过度增殖性疾病。 
34.包含权利要求1-7任一项的抗体或抗体片段、权利要求14或15的核酸分子或权利要求16的载体的试剂盒。 
35.权利要求34的试剂盒，其包含至少一种另外的活性剂。 
36.权利要求35的试剂盒，其中所述另外的活性剂是抗肿瘤剂。 
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109580959A (zh) * 2018-12-17 2019-04-05 江苏莱森生物科技研究院有限公司 一种检测肝素结合性表皮生长因子的elisa试剂盒

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101589059A (zh) * 2006-10-20 2009-11-25 株式会社未来创药研究所 包含抗hb-egf抗体作为活性成分的药物组合物
US8975374B2 (en) 2006-10-20 2015-03-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition comprising anti-HB-EGF antibody as active ingredient
EP2078731A4 (en) * 2006-10-20 2012-08-01 Forerunner Pharma Res Co Ltd PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING ANTI-HB-EGF ANTIBODY AS ACTIVE INGREDIENT
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
EP2261254A3 (en) * 2007-12-21 2011-04-13 Amgen, Inc Anti-amyloid antibodies and uses thereof
GB0807018D0 (en) * 2008-04-17 2008-05-21 Fusion Antibodies Ltd Antibodies and treatment
PL2949666T3 (pl) 2008-12-19 2019-07-31 Biogen International Neuroscience Gmbh Ludzkie przeciwciała przeciwko alfa-synukleinie
US8399625B1 (en) * 2009-06-25 2013-03-19 ESBATech, an Alcon Biomedical Research Unit, LLC Acceptor framework for CDR grafting
JP5806935B2 (ja) * 2009-08-17 2015-11-10 中外製薬株式会社 抗ｈｂ−ｅｇｆ抗体を有効成分として含む医薬組成物
CN102574917A (zh) * 2009-08-17 2012-07-11 株式会社未来创药研究所 含有抗hb-egf抗体作为有效成分的药物组合物
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
US20130011406A1 (en) * 2010-03-26 2013-01-10 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-kit antibodies and uses thereof
SI2723379T1 (sl) 2011-06-23 2019-03-29 Biogen International Neuroscience Gmbh Molekule, ki se vežejo ma anti alfa-sinuklein
US20150037336A1 (en) * 2012-02-22 2015-02-05 U3 Pharma Gmbh Combination of hb-egf binding protein and egfr inhibitor
FR2988393B1 (fr) 2012-03-20 2014-05-09 Commissariat Energie Atomique Inhibiteur de l'hb-egf derive du domaine r de la toxine diphterique pour le traitement des maladies associees a l'activation de la voie hb-egf/egfr
PE20152004A1 (es) * 2013-03-13 2016-02-07 Prothena Biosciences Ltd Inmunoterapia tau
WO2014151649A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Alper Biotech, Llc Monoclonal antibodies to egfr, and uses therefor
JP5838427B2 (ja) * 2013-04-23 2016-01-06 株式会社医学生物学研究所 ヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子に対する機能性モノクローナル抗体
WO2014174596A1 (ja) 2013-04-23 2014-10-30 株式会社医学生物学研究所 ヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子に対する機能性モノクローナル抗体
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
MA48579A (fr) 2015-09-01 2020-03-18 Agenus Inc Anticorps anti-pd1 et méthodes d'utilisation de ceux-ci
TWI754622B (zh) 2015-11-18 2022-02-11 美商默沙東藥廠 Ctla4結合劑
AR107505A1 (es) 2016-01-22 2018-05-09 Merck Sharp & Dohme Anticuerpos anti-factor de la coagulación xi
KR102506091B1 (ko) 2016-05-02 2023-03-07 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 타우 면역요법
CU24537B1 (es) 2016-05-02 2021-07-02 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos monoclonales que compiten por unirse a tau humano con el anticuerpo 3d6
PE20190208A1 (es) 2016-05-02 2019-02-07 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau
TN2018000417A1 (en) 2016-06-14 2020-06-15 Adimab Llc Anti-coagulation factor xi antibodies.
AU2018263935A1 (en) 2017-05-02 2019-12-19 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
EA202090555A1 (ru) 2017-08-22 2020-06-08 Байоджен Ма Инк. Фармацевтические композиции, содержащие антитела к бета-амилоиду
US11525002B2 (en) 2017-10-11 2022-12-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Human PD-L1 antibodies and methods of use therefor
EP3737365A4 (en) * 2018-01-08 2021-11-03 Susavion Biosciences, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF CANCER WITH GLYCOMIMETIC PEPTIDES
US11976128B2 (en) 2018-03-23 2024-05-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Human PD-L2 antibodies and methods of use therefor
CN109535252B (zh) * 2018-12-17 2020-04-21 江苏莱森生物科技研究院有限公司 一种抗hb-egf单克隆抗体及其制备方法
JP2022524588A (ja) 2019-03-03 2022-05-09 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド タウ認識抗体
EP3946452A1 (en) * 2019-04-04 2022-02-09 Janssen Biotech, Inc. Anti-hla-c antibodies and uses thereof
KR20230135575A (ko) * 2020-12-09 2023-09-25 재눅스 테라퓨틱스 인크. Psma 및 이펙터 세포 항원을 표적화하는 종양 활성화항체와 관련된 조성물 및 방법
WO2022150660A1 (en) * 2021-01-08 2022-07-14 10X Genomics, Inc. Antigen-binding polypeptides specific for coronaviruses and uses thereof
WO2023150797A2 (en) * 2022-02-07 2023-08-10 Stiles Brendon M Targeting art1 for cancer immunotherapy

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3180193A (en) 1963-02-25 1965-04-27 Benedict David Machines for cutting lengths of strip material
GB1047304A (zh) 1963-07-05
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
EP0052322B1 (de) 1980-11-10 1985-03-27 Gersonde, Klaus, Prof. Dr. Verfahren zur Herstellung von Lipid-Vesikeln durch Ultraschallbehandlung, Anwendung des Verfahrens und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
JPS58118008A (ja) 1982-01-06 1983-07-13 Nec Corp デ−タ処理装置
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
JPS58166633A (ja) 1982-03-29 1983-10-01 Toshiba Corp 有機溶媒電池用正極
JPS58166634A (ja) 1982-03-29 1983-10-01 Toshiba Corp 有機溶媒電池用正極
DE3218121A1 (de) 1982-05-14 1983-11-17 Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München Arzneimittel zur tumorbehandlung
EP0102324A3 (de) 1982-07-29 1984-11-07 Ciba-Geigy Ag Lipide und Tenside in wässriger Phase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
ATE59966T1 (de) 1983-09-26 1991-02-15 Ehrenfeld Udo Mittel und erzeugnis fuer die diagnose und therapie von tumoren sowie zur behandlung von schwaechen der zelligen und humoralen immunabwehr.
US4615885A (en) 1983-11-01 1986-10-07 Terumo Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition containing urokinase
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
JPS62170639A (ja) 1986-01-22 1987-07-27 株式会社システムメンテナンス 防蟻板の取付け工法
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
FR2664073A1 (fr) 1990-06-29 1992-01-03 Thomson Csf Moyens de marquage d'objets, procede de realisation et dispositif de lecture.
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69133557D1 (de) 1990-08-29 2007-03-15 Pharming Intellectual Pty Bv Homologe rekombination in säugetier-zellen
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
NZ253943A (en) 1992-06-18 1997-01-29 Genpharm Int Transfering polynucleotides into eukaryotic cells using co-lipofection complexes of a cationic lipid and the polynucleotide
CA2140638C (en) 1992-07-24 2010-05-04 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
US5981175A (en) 1993-01-07 1999-11-09 Genpharm Internation, Inc. Methods for producing recombinant mammalian cells harboring a yeast artificial chromosome
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
DK0843961T3 (da) 1995-08-29 2007-05-21 Kirin Brewery Kimærisk mus og fremgangsmåde til at producere samme
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
FR2828104B1 (fr) * 2001-08-01 2005-06-24 Chu Montpellier Utilisation d'inhibiteurs du facteur de croissance epidermique liant l'heparine ou d'inhibiteurs de ses recepteurs pour la preparation de medicaments utiles pour traiter le myelome
GB0201284D0 (en) * 2002-01-21 2002-03-06 Isis Innovation Screening methods for contraceptive and fertility agents
AU2004259398A1 (en) * 2003-06-27 2005-02-03 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to the deletion mutants of epidermal growth factor receptor and uses thereof
CN1946741B (zh) * 2004-03-31 2012-09-05 佳能株式会社 金结合蛋白及其用途
US20050227289A1 (en) * 2004-04-09 2005-10-13 Reilly Edward B Antibodies to erythropoietin receptor and uses thereof
EP2284194A1 (en) * 2004-12-21 2011-02-16 AstraZeneca AB Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
CA2654572A1 (en) * 2006-06-06 2007-12-13 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Monoclonal antibody capable of binding to heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor
EP2078731A4 (en) * 2006-10-20 2012-08-01 Forerunner Pharma Res Co Ltd PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING ANTI-HB-EGF ANTIBODY AS ACTIVE INGREDIENT
CN101589059A (zh) * 2006-10-20 2009-11-25 株式会社未来创药研究所 包含抗hb-egf抗体作为活性成分的药物组合物
JP6071725B2 (ja) 2013-04-23 2017-02-01 カルソニックカンセイ株式会社 電気自動車の駆動力制御装置
US11284893B2 (en) 2019-04-02 2022-03-29 Covidien Lp Stapling device with articulating tool assembly

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor stimulates mitogenic signaling and is highly expressed in human malignant gliomas;Kazuhiko Mishima et al.;《Acta Neuropathol》;19981231;第96卷(第4期);322-328 *
IL-13对小鼠气道平滑肌细胞的促增殖作用;曹卫军 等;《第二军医大学学报》;20040731;第25卷(第7期);716页左栏第一段 *
IL-8 promotes cell proliferation and migration through metalloproteinase-cleavage proHB-EGF in human colon carcinoma cells;Yusuke Itoh et al.;《Cytokine》;20050321;第29卷(第6期);275-282 *
Kazuhiko Mishima et al..Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor stimulates mitogenic signaling and is highly expressed in human malignant gliomas.《Acta Neuropathol》.1998,第96卷(第4期),322-328.
Yusuke Itoh et al..IL-8 promotes cell proliferation and migration through metalloproteinase-cleavage proHB-EGF in human colon carcinoma cells.《Cytokine》.2005,第29卷(第6期),275-282.
曹卫军 等.IL-13对小鼠气道平滑肌细胞的促增殖作用.《第二军医大学学报》.2004,第25卷(第7期),716页左栏第一段.

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109580959A (zh) * 2018-12-17 2019-04-05 江苏莱森生物科技研究院有限公司 一种检测肝素结合性表皮生长因子的elisa试剂盒
CN109580959B (zh) * 2018-12-17 2020-03-31 江苏莱森生物科技研究院有限公司 一种检测肝素结合性表皮生长因子的elisa试剂盒

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Publication number Publication date
HRP20130903T1 (hr) 2013-11-08
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AU2008303796A1 (en) 2009-04-02

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