ES2906216T3

ES2906216T3 - Anticuerpos de 4 similar a la angiopoyetina y métodos de uso

Info

Publication number: ES2906216T3
Application number: ES15750139T
Authority: ES
Inventors: John Trauger; Andrei Igorevich Voznesensky
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2014-08-07
Filing date: 2015-08-06
Publication date: 2022-04-13
Anticipated expiration: 2035-08-06
Also published as: AR101486A1; CL2017000212A1; AU2015300685A1; UY36262A; EA201790336A1; BR112017002173B1; MX2022002635A; KR20240056627A; US20160145326A1; MA40512A; WO2016020880A2; SG11201700473QA; SG10201805646WA; PT3177642T; JP2017529324A; DK3177642T3; TW201613978A; PL3177642T3; CN107148428A; CU20170012A7

Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a ANGPTL4 humana, que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y que comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos de 4 similar a la angiopoyetina y métodos de uso

CAMPO DE LA INVENCIÓN

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La proteína 4 similar a la angiopoyetina (ANGPTL4) es un miembro de la familia de proteínas secretadas similar a la angiopoyetina. Es una proteína homooligomérica, capaz de formar dímeros y tetrámeros, que se expresa por tipos de células que incluyen macrófagos, células adiposas, musculares y hepáticas. ANGPTL4 también se conoce como proteína relacionada con fibrinógeno hepático/angiopoyetina (HFARP)(Kim et al. (2000) Biochem. J. 346:603-610); proteína relacionada con gamma angiopoyetina PPa R (PGAR)(Yoon, et al. (2000) Mol. Cell Biol., 20:5343-5349) y factor adiposo inducido en ayunas (FIAF)(Kerten et al. (2000) J. Biol. Chem., 275:28488-28493). ANGPTL4 contiene un dominio de hélice superenrollada N-terminal y un dominio similar a fibrinógeno C-terminal (FBN) (Kim et al. (2000) Biochem. J. 346:603-610).

La lipoproteína lipasa (LPL) tiene un papel central en el metabolismo de las lipoproteínas que incluye el mantenimiento de los niveles de lipoproteínas en sangre y, a través de la regulación específica de tejido de su actividad. Se sabe que la región de la hélice superenrrollada de ANGPTL4 inhibe la eliminación de triglicéridos (TG) mediada por lipoproteína lipasa (LPL). Por lo tanto, se observa que todas las mutaciones con pérdida de función de ANGPTL4 (por ejemplo, como se observa en sujetos humanos), las deleciones genéticas (por ejemplo, como se observa en ratones transgénicos) y la inhibición de anticuerpos (por ejemplo, como se observa en ratones y macacos) disminuyen los triglicéridos en plasma. Adicionalmente, también se sabe que los anticuerpos ANGPTL4 activan la LPL. Se han descrito anticuerpos monoclonales específicos para ANGPTL4 humano que han demostrado reducir los niveles de triglicéridos circulantes en ratones que expresan ANGPTL4 humana (documento WO 2011/079257). Por el contrario, la inyección de ANGPTL4 en ratones produce un rápido aumento de los triglicéridos circulantes y esto es a una velocidad más alta que la inyección de proteína 3 similar a la angiopoyetina (ANGPTL3)(Yoshida et al. (2002) J Lipid Res 43:1770-1772).

Los anticuerpos anti-ANGPTL4 y los fragmentos de unión a antígeno descritos en esta invención inician, promueven o mejoran la activación de LPL, por ejemplo, bloqueando la inhibición de LPL por ANGPTL4, disminuyendo de esta manera los triglicéridos en plasma. Se espera que estos anticuerpos prevengan y mejoren las manifestaciones agudas y crónicas de enfermedades caracterizadas por niveles elevados de triglicéridos, por ejemplo, dislipidemia primaria, hipertrigliceridemia, síndrome metabólico, diabetes tipo II y similares.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen a la proteína 4 similar a la angiopoyetina humana (en lo sucesivo en el presente documento, a veces denominada "ANGPTL4") y a composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento que comprenden los mismos, en donde el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.

Los anticuerpos anti-ANGPTL4 aislados, o fragmentos de unión a antígeno, descritos en el presente documento, se unen a ANGPTL4, con una constante de disociación de equilibrio (K^d) de menos de o igual a 100 pM. Por ejemplo, los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento pueden unirse a ANGPTL4 humana con una K^dde menos de o igual a 150 nM, menor o igual a 50 nM, menor o igual a 10 nM, menor o igual a 750 pM, menor o igual a 600 pM, menor o igual a 500 pM, menor o igual a 400 pM, menor o igual a 300 pM, menor o igual a 200 pM, menor o igual a 100 pM, menor o igual a 75 pM, menor o igual a 65 pM, menor o igual a igual a 60 pM, menor o igual a 55 pM. Más específicamente, los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento también pueden unirse a ANGPTL4 humana con una K^dde menos de o igual a 45 pM, como se mide mediante ensayos de unión cinética ForteBio, o menor o igual a 24 pM, como se mide mediante ensayo de valoración en equilibrio de la solución (SET); y también puede unir ANGPTL4 de macaco con una K^dde menos de o igual a 87 pM, como se mide mediante ensayos de unión cinética ForteBio, o menor o igual a 22 pM, como se mide por SET.

La afinidad de unión de los anticuerpos aislados y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento puede determinarse mediante valoración en equilibrio de la solución (SET). Los métodos para SET son conocidos en la técnica y se describen con más detalle a continuación. Alternativamente, la afinidad de unión de los anticuerpos aislados, o fragmentos, descritos en el presente documento puede determinarse mediante el ensayo Biacore. Los métodos para ensayos cinéticos Biacore son conocidos en la técnica y se describen con más detalle a continuación.

Los anticuerpos anti-ANGPTL4 aislados y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento pueden usarse para inhibir la unión de ANGPTL4 a la lipoproteína lipasa (LPL) con una CE⁵⁰de menos de o igual a 100 nM, menor o igual a 50 nM, menor o igual a 35 nM, menor o igual a 25 nM, menor o igual a 10 nM o menor o igual a 3 nM.

Los anticuerpos anti-ANGPTL4 aislados, o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden usarse para reducir los niveles de triglicéridos circulantes (TG).

Los anticuerpos anti-ANGPTL4 aislados, o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, como se describen en el presente documento, pueden ser anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos o humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos F(ab')2 o fragmentos scFv y/o isotipos de IgG.

Los anticuerpos anti-ANGPTL4 aislados, o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, como se describen en el presente documento también pueden incluir un marco en el cual se ha sustituido un aminoácido en el marco del anticuerpo de las respectivas secuencias de la línea germinal VH o VL humana.

Otro aspecto de la invención incluye un anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo que tienen las secuencias completas de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos humanizados de NEG276 y NEG276-LALA.

En otro aspecto de la invención, el anticuerpo aislado o los fragmentos de unión a antígeno del mismo, que se une a ANGPTL4 puede tener una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 15 o 28. El anticuerpo aislado también puede incluir una cadena ligera que puede combinarse con la cadena pesada para formar un sitio de unión de antígeno a ANGPTL4 humana. En particular, la cadena ligera puede tener una secuencia que comprende SEQ ID NO: 25. En particular, el anticuerpo aislado o los fragmentos de unión a antígeno del mismo que se une a ANGPTL4, puede tener una cadena pesada y una cadena ligera que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 15 y 25; 28 y 25, respectivamente.

La invención se refiere además a un anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo que incluye una cadena pesada que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15 o 28, en donde dicho anticuerpo se une a ANGPTL4. En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo también incluye una cadena ligera que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 25.

La invención se refiere además a un anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo que incluye una cadena ligera que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 25, en donde dicho anticuerpo se une a ANGPTL4.

Puede proporcionarse un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno, que compite por la unión con los anticuerpos o los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento, por ejemplo, con los anticuerpos humanizados NEG276 o NEG276-LALA. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno puede ser capaz de inhibir en más del 50 % la unión de ANGPTL4 por un anticuerpo humanizado seleccionado de NEG276 o NEG276-LALA, cuando los dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno están presentes en concentraciones equimolares.

El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la invención es capaz de inhibir en más del 80 % la unión de ANGPTL4 por un anticuerpo humanizado seleccionado de NEG276 o NEG276-LALA, cuando los dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno están presentes en concentraciones equimolares. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la invención puede ser capaz de inhibir en más del 85 % (o el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 %) la unión de ANGPTL4 por un anticuerpo humanizado seleccionado de NEG276 o NEG276-LALA, cuando los dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno están presentes en concentraciones equimolares.

La invención también se refiere a composiciones que comprenden el anticuerpo aislado, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, descritos en el presente documento. Así como composiciones de anticuerpo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Específicamente, la invención incluye además composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo tales como anticuerpos humanizados NEG276 o NEG276-LALA. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una combinación de dos o más de los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

La invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica el dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 13. En particular, el ácido nucleico tiene una secuencia de al menos el 90 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14 y 27. En un aspecto adicional de la invención la secuencia es SEQ ID NO: 14 o 27.

La invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica el dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 23. En particular, el ácido nucleico tiene una secuencia de al menos el 90 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 24 y 31. En un aspecto adicional de la invención la secuencia es SEQ ID NO: 24 o 31.

La invención también se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que incluye un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con una secuencia de SEQ ID NO: 23.

La invención también se refiere a un vector que incluye una o más de las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento.

La invención también se refiere a una célula hospedadora aislada que incluye una secuencia de ADN recombinante que codifica una cadena pesada del anticuerpo descrito anteriormente y una segunda secuencia de ADN recombinante que codifica una cadena ligera del anticuerpo descrito anteriormente, en donde dichas secuencias de ADN están unidas operativamente a un promotor y son capaces de expresarse en la célula hospedadora. Se contempla que el anticuerpo pueda ser un anticuerpo humanizado. También se contempla que la célula hospedadora sea una célula de mamífero no humano.

Se contempla que la célula sea una célula humana. Se contempla además que la célula esté en un sujeto. En una realización, se contempla que la célula sea una célula endotelial. En otras realizaciones, la célula puede ser una o más de células adiposas, musculares y hepáticas. Se contempla aún además que el sujeto sea humano.

La invención también se refiere al uso de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o dicha composición farmacéutica en un método para tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado a ANGPTL4 en un paciente, en donde el método incluye la etapa de administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento. En un aspecto, el trastorno asociado a ANGPTL4 se asocia a hipertrigliceridemia (por ejemplo, hipertrigliceridemia grave (por ejemplo, con concentración de triglicéridos en plasma >500 mg/dl), hipertrigliceridemia asociada a obesidad e hipertrigliceridemia tipo V). En otros aspectos, el trastorno asociado a ANGPTL4 se asocia a dislipidemia primaria, síndrome metabólico, diabetes tipo II. Se contempla que el paciente sea humano.

Cualquiera de los anticuerpos aislados anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos puede ser un anticuerpo monoclonal o fragmentos de unión a antígeno del mismo.

DEFINICIONES

Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que los comúnmente entendidos por los expertos en la materia a la pertenece esta invención.

Las expresiones "proteína ANGPTL4" o "antígeno ANGPTL4" o "ANGPTL4" se usan indistintamente y se refieren a la proteína 4 similar a angiopoyetina (ANGPTL4) en diferentes especies. Por ejemplo, ANGPTL4 humana tiene la secuencia que se establece en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1) y se ha descrito en informes y bibliografía anteriores (Nature, Vol. 386, p. 73-77, 1997; Genomics, Vol. 54, N.° 2, p. 191-199, 1998; Biochem. J., Vol. 339, Parte 1, P. 177-184, 1999; N.° de Registro de Genbank NP 002534). ANGPTL4 contiene un dominio de hélice superenrollada N-terminal y un dominio similar a fibrinógeno C-terminal (FBN) (Kim et al. (2000) Biochem. J. 346:603-610). Es una proteína homooligomérica, capaz de formar dímeros y tetrámeros, que se expresa por tipos de células que incluyen macrófagos, células adiposas, musculares y hepáticas y se sabe que inhibe la eliminación de triglicéridos (TG) mediada por la lipoproteína lipasa (LPL).

Además, en el contexto de esta invención, el término "ANGPTL4" incluye mutantes de la proteína similar a la angiopoyetina 4 (ANGPTL4) natural, que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la de la estructura primaria nativa (secuencia de aminoácidos) descrita en los informes anteriormente mencionados. En el presente documento, la expresión "mutantes de la proteína 4 similar a angiopoyetina (ANGPTL4) humana natural que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos" se refiere a tales proteínas mutantes.

El término "anticuerpo" como se usa en el presente documento significa un anticuerpo completo y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "porción de unión a antígeno") o cadena individual del mismo. Un anticuerpo completo es una glucoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios: CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del hospedador, que incluyen diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.

La expresión "porción de unión a antígeno" o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo, como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo intacto que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno dado (por ejemplo, receptor de LDL oxidado humano (ANGPTL4)). Las funciones de unión a antígeno de un anticuerpo pueden realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro de la expresión porción de unión a antígeno o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento de anticuerpo de un solo dominio (dAb) (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH o un dominio VL; y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada.

Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador peptídico artificial que les permite fabricarse como una cadena individual de proteína en la cual las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; y Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Dichos anticuerpos monocatenarios incluyen una o más porciones de unión a antígeno o fragmentos de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia y los fragmentos se seleccionan en función de su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Los fragmentos de unión a antígeno también pueden incorporarse en anticuerpos de un solo dominio, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). Las porciones de unión a antígeno de anticuerpos pueden injertarse en estructuras basadas en polipéptidos tales como fibronectina de tipo III (Fn3) (véase la Pat. de EE.UU. N.° 6.703.199, que describe monocuerpos del polipéptido fibronectina).

Los fragmentos de unión a antígeno pueden incorporarse en moléculas monocatenarias que comprenden un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con los polipéptidos de la cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno (Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062; y la Pat. de EE.UU. N.° 5.641.870).

Como se usa en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a la fuerza de interacción entre el anticuerpo y el antígeno en sitios antigénicos individuales. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del "brazo" del anticuerpo interactúa a través de fuerzas no covalentes débiles con el antígeno en numerosos sitios; cuantas más interacciones, más fuerte es la afinidad. Como se usa en el presente documento, la expresión "alta afinidad" por un anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, un fragmento Fab) generalmente se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, que tiene una KD de 10'9 M o menos.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono alfa que se une a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas principales peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de una manera similar a un aminoácido de origen natural.

La expresión "especificidad de unión" como se usa en el presente documento se refiere a la capacidad de un sitio de combinación de anticuerpo individual de reaccionar con solamente un determinante antigénico.

La expresión "se une específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de unión a ANGPTL4) se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de un antígeno afín (por ejemplo, un ANGPTL4 humano o un ANGPTL4 de macaco) en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan indistintamente en el presente documento con la expresión "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno".

La expresión "mediado por ANGPTL4" se refiere al hecho de que se sabe que ANGPTL4 inhibe la eliminación de triglicéridos (TG) mediada por la lipoproteína lipasa (LPL) y, de esta manera, aumentan los niveles de triglicéridos.

Un "trastorno asociado a ANGPTL4", "afección asociada a ANGPTL4" o expresiones similares como se usan en el presente documento, se refieren a cualquier número de afecciones o enfermedades en las cuales ANGPTL4ANGPTL4 se busca una reducción de la inhibición de LPL mediada por ANGPTL4 y la modulación de lipoproteínas. Estas afecciones incluyen pero no se limitan a las que implican el metabolismo de los lípidos, tales como hiperlipidemia, hiperlipoproteinemia y dislipidemia, incluyendo dislipidemia aterogénica, dislipidemia diabética, hipertrigliceridemia (por ejemplo, hipertrigliceridemia grave (por ejemplo, con concentración en plasma de triglicéridos >500 mg/dl), hipertrigliceridemia asociada a obesidad e hipertrigliceridemia tipo V), hipercolesterolemia, quilomicronemia, dislipidemia mixta (obesidad, síndrome metabólico, diabetes, etc.), lipodistrofia, lipoatrofia y otras afecciones provocadas, por ejemplo, por la actividad de LPL disminuida y/o deficiencia de LPL, actividad del receptor de LDL disminuida y/o deficiencia del receptor de LDL, ApoC2 alterado, deficiencia de ApoE, aumento de ApoB, producción aumentada y/o eliminación disminuida de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), determinado tratamiento farmacológico (por ejemplo, dislipidemia inducida por el tratamiento con glucocorticoides), cualquier predisposición genética, dieta, estilo de vida y similares.

Otras enfermedades o trastornos asociados a ANGPTL4 asociados a o que resultan de hiperlipidemia, hiperlipoproteinemia y/o dislipidemia, incluyen, pero no se limitan a, enfermedades o trastornos cardiovasculares, tales como aterosclerosis, aneurisma, hipertensión, angina, accidente cerebrovascular, enfermedades cerebrovasculares, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedades de las arterias coronarias, infarto de miocardio, enfermedades vasculares periféricas y similares; pancreatitis aguda; esteatohepatitis no alcohólica (NASH); trastornos del azúcar en sangre, tales como diabetes; obesidad y similares.

La expresión "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en la cual (a) la región constante, o una parte de la misma, está alterada, remplazada o intercambiada, de tal manera que el sitio de unión a antígeno (región variable) esté enlazado a una región constante de una clase, función efectora y/o especie diferente o alterada, o una molécula completamente diferente que confiera nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una parte de la misma, está alterada, remplazada o intercambiada con una región variable que tenga una especificidad de antígeno diferente o alterada. Por ejemplo, un anticuerpo de ratón puede modificarse remplazando su región constante con la región constante de una inmunoglobulina humana. Debido al remplazo con una región constante humana, el anticuerpo quimérico puede conservar su especificidad en el reconocimiento del antígeno mientras tiene antigenicidad reducida en seres humanos en comparación con el anticuerpo de ratón original.

La expresión "variante modificada conservativamente" se aplica tanto a las secuencias de aminoácidos como a las de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácido nucleico particulares, variantes modificadas conservativamente se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición donde se especifica una alanina mediante un codón, el codón puede alterarse en cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas conservativamente. Cada secuencia de ácido nucleico en el presente documento que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina y TGG, que normalmente es el único codón para triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada una de las variaciones silenciosas de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada una de las secuencias descritas.

Para las secuencias polipeptídicas, las "variantes modificadas conservativamente" incluyen sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales a una secuencia polipeptídica que dan como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Tales variantes modificadas conservativamente son adicionales y no excluyen variantes polimórficas, homólogos interespecie y alelos de la invención. Los siguientes ocho grupos contienen aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (c ), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)). En algunas realizaciones, la expresión "modificaciones de secuencia conservativas" se usa para referirse a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos.

El término "epítopo" significa un determinante proteico capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Los epítopos consisten habitualmente en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión al primero pero no al último se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.

La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las cuales tanto la región marco como las regiones CDR derivan de secuencias de origen humano. Adicionalmente, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también deriva de dichas secuencias humanas, por ejemplo, secuencias de la línea germinal humana, o versiones mutadas de secuencias de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo).

Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo que retiene la reactividad específica de antígeno de un anticuerpo no humano, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón, aunque siendo menos inmunogénico cuando se administra como un producto terapéutico en seres humanos. Véase, por ejemplo, Robello et al., Transplantation, 68: 1417-1420. Esto puede lograrse, por ejemplo, reteniendo las regiones de unión a antígeno no humanas y reemplazando las partes restantes del anticuerpo con sus homólogos humanos (es decir, la región constante así como las porciones de la región variable que no están implicadas en la unión). Véase, por ejemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1989; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; y Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994. Otros ejemplos de tecnología de ingeniería humana incluyen, pero no se limitan a, la tecnología Xoma desvelada en el documento US 5.766.886.

Los términos "idéntico" o "identidad" en porcentaje en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si dos secuencias tienen un porcentaje especificado de restos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos (es decir, el 60 % de identidad, opcionalmente el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 99 % de identidad sobre una región especificada o, cuando no se especifica, sobre la secuencia completa), cuando se comparan y se alinean para la máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, o región designada, como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o por alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que tiene al menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos) de longitud, o más preferentemente sobre una región que es de 100 a 500 o de 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos) de longitud.

Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si fuera necesario, y se indican los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Pueden usarse parámetros por defecto del programa, o pueden indicarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias calcula después los porcentajes de identidad de secuencia para las secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", como se usa en el presente documento, incluye referencia a un segmento de una cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en 20 a 600, habitualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de alinear óptimamente las dos secuencias. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación óptima de secuencias para comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, mediante la búsqueda por el método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)).

Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res.

25:3389-3402, 1977; y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990, respectivamente. El software para realizar los análisis BLAST está disponible al público a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica identificar, en primer lugar, las parejas de secuencias con alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. Se denomina T al umbral de puntuación de palabra cercana (Altschul et al., anteriormente citado). Estos aciertos iniciales de palabra cercana actúan como puntos de inicio para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que los contengan. Los aciertos de palabra se prolongan en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en todo lo que pueda aumentar la puntuación acumulada de alineación. Las puntuaciones acumuladas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos coincidentes; siempre > 0 ) y N (puntuación de penalización para restos de emparejamiento erróneo; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La prolongación de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación acumulada de alineación desciende en la cantidad X desde su valor máximo conseguido; la puntuación acumulada llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de alguna secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación para ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como valores predeterminados una longitud de palabra de 3 y una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se produciría por casualidad una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es de menos de aproximadamente 0,2, más preferentemente de menos de aproximadamente 0,01 y mucho más preferentemente de menos de aproximadamente 0,001.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de restos ponderados PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en la web mundial en gcg.com), usando cualquiera de una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6.

Aparte del porcentaje de identidad de secuencia indicado anteriormente, otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico tiene reacción inmunológicamente cruzada con los anticuerpos producidos contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. Por lo tanto, un polipéptido normalmente es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos polipéptidos difieren solamente por sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos hibriden entre sí en condiciones rigurosas, como se describe a continuación. Otra indicación más de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que puedan usarse los mismos cebadores para amplificar la secuencia.

La expresión "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a ANGPTL4 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de ANGPTL4). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a ANGPTL4 puede tener reactividad cruzada con otros antígenos. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente exento de otro material celular y/o productos químicos.

El término "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM, IgE, IgG tal como IgG1 o IgG4) proporcionada por los genes de la región constante de cadena pesada. El isotipo también incluye versiones modificadas de una de estas clases, donde las modificaciones se han hecho para alterar la función de Fc, por ejemplo, para potenciar o reducir las funciones efectoras o la unión a receptores de Fc.

El término "k^asoc" o "k^a", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la tasa de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular, mientras que el término "k^dis" o "k^d", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la tasa de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. El término "K^d", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociación, que se obtiene a partir de la relación de k^da k^a(es decir, k^d/k^a) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de K^dpara anticuerpos pueden determinarse usando métodos bien establecidos en la técnica. Los métodos para determinar la K^dde un anticuerpo incluyen medir la resonancia de plasmón superficial usando un sistema de biosensor tal como un sistema Biacore^®, o midiendo la afinidad en solución por valoración en equilibrio en solución (SET).

Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se usan en el presente documento se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una sola composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una sola especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular.

La expresión "ácido nucleico" se usa en el presente documento indistintamente con el término "polinucleótido" y se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma monocatenaria o bicatenaria. La expresión abarca ácidos nucleicos que contienen análogos nucleotídicos conocidos o restos de la cadena principal o enlaces modificados, que son sintéticos, de origen natural y de origen no natural, que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metil fosfonatos, metil fosfonatos quirales, 2-O-metil ribonucleótidos, ácidos peptidonucleicos (APN).

A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca de forma implícita variantes modificadas conservativamente de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, como se detalla a continuación, las sustituciones de codones degenerados pueden lograrse generando secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con restos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).

La expresión "unido operativamente" se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos polinucleotídicos (por ejemplo, ADN). Normalmente, la expresión se refiere a la relación funcional de una secuencia reguladora de la transcripción con respecto a una secuencia transcrita. Por ejemplo, una secuencia promotora o potenciadora está unida operativamente a una secuencia codificante si estimula o modula la transcripción de la secuencia codificante en una célula hospedadora apropiada u otro sistema de expresión. Generalmente, las secuencias reguladoras de la transcripción promotoras que están enlazadas operativamente a una secuencia transcrita son físicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, actúan en cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras transcripcionales, tales como los potenciadores, no necesitan ser físicamente contiguas o estar ubicadas muy próximas a las secuencias codificantes cuya transcripción potencian.

Como se usa en el presente documento, el término "optimizada" significa que una secuencia de nucleótidos se ha alterado para que codifique una secuencia de aminoácidos usando codones que se prefieren en la célula u organismo de producción, en general una célula eucariota, por ejemplo, una célula de Pichia, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada se modifica por ingeniería genética para que retenga por completo o en la mayor medida posible la secuencia de aminoácidos originalmente codificada por la secuencia de nucleótidos de partida, que también se conoce como la secuencia "parental". Las secuencias optimizadas en el presente documento se han modificado por ingeniería genética para que tengan codones que son preferidos en células de mamífero. Sin embargo, la expresión optimizada de estas secuencias en otras células eucariotas o células procariotas también se prevé en el presente documento. Las secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleótidos optimizadas también se denominan optimizadas.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para hacer referencia a un polímero de restos de aminoácidos. Las expresiones se aplican a polímeros de aminoácidos en que uno o más restos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural. Salvo que se indique de otro modo, una secuencia polipeptídica particular también engloba de forma implícita variantes modificadas conservativamente de la misma.

La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos, anticuerpos aislados a partir de una célula hospedadora transformada para que exprese el anticuerpo humano, por ejemplo, a partir de un transfectoma, anticuerpos aislados a partir de una colección combinatoria recombinante de anticuerpos humanos y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias de la totalidad o una parte de un gen de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las cuales las regiones marco y CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para las secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de las secuencias de VH y VL de la línea germinal humana y están relacionadas con ellas, puede que no existan de forma natural en el repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

La expresión "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora") se refiere a una célula en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que se pretende que dichas expresiones se refieran no solamente a la célula objeto particular, sino también la progenie de dicha célula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, una progenie tal puede no ser, de hecho, idéntica a la célula parental, pero todavía está incluida dentro del alcance de la expresión "célula hospedadora" como se usa en el presente documento.

El término "sujeto" incluye seres humanos y animales no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados (por ejemplo: mamíferos y no mamíferos) tales como primates no humanos (por ejemplo: macacos), ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios y reptiles. Excepto cuando se indique, los términos "paciente" o "sujeto" se usan en el presente documento indistintamente. Como se usa en el presente documento, el término "cyno" o "macaco" se refiere al macaco cangrejero (Macaca fascicularis).

Como se usa en el presente documento, el término "tratar" o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno (por ejemplo, trastorno asociado a ANGPTL4) se refiere, en una realización, a mejorar la enfermedad o trastorno (es decir, ralentizar o detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o al menos uno de los síntomas clínicos de la misma). En otra realización "tratar" o "tratamiento" se refiere a aliviar o mejorar al menos un parámetro físico que incluye aquellos que pueden no ser discernibles por el paciente. En otra realización más, "tratar" o "tratamiento" se refiere a modular la enfermedad o trastorno, ya sea físicamente (por ejemplo, estabilización de un síntoma discernible), fisiológicamente, (por ejemplo, estabilización de un parámetro físico), o ambos. En otra realización más, "tratar" o "tratamiento" se refiere a prevenir o retrasar el inicio o desarrollo o progresión de la enfermedad o trastorno.

"Prevención" en lo que respecta a las indicaciones descritas en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, trastorno asociado a ANGPTL4, significa cualquier acción que previene o ralentiza un empeoramiento de, por ejemplo, los parámetros de la enfermedad asociados a ANGPTL4, como se describe más adelante, en un paciente con riesgo de dicho empeoramiento.

El término "vector" pretende hacer referencia a una molécula de polinucleótido capaz de transportar otro polinucleótido al que se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, tal como un vector vírico adenoasociado (AAV o AAV2), en donde pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora, y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinante" (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente, ya que el plásmido es la forma más habitualmente usada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir otras de estas formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), que cumplen funciones equivalentes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las Figuras 1A-1D representan la inversión de la inhibición mediada por ANGPTL4 de la proteína lipoproteína lipasa humana (LPL) por anticuerpos ANGPTL4 seleccionados de la invención y divulgación.

La Figura 2 representa la unión de anticuerpos seleccionados de la invención a ANGPTL4 humana de longitud completa y al dominio de hélice superenrollada N-terminal de ANGPTL4 humana y la ausencia de unión a ANGPTL3 humana de longitud completa. ANGPTL3 Ab = anticuerpo de referencia específico de ANGPTL3.

La Figura 3A-3B representa cambios en los niveles de triglicéridos en plasma en ratones transgénicos de ANGPTL4 humana después de la administración de anticuerpos ANGPTL4 seleccionados de la invención y divulgación.

La Figura 4 representa las concentraciones totales en plasma de anticuerpos humanos en macacos obesos diabéticos después de la administración de un anticuerpo ANGPTL4 de la invención (NEG276-LALA).

La Figura 5 representa cambios en las concentraciones de triglicéridos (TG) en plasma en macacos obesos diabéticos después de la administración de un anticuerpo ANGPTL4 de la invención (NEG276-LALA).

La Figura 6 representa los cambios en la concentración total de colesterol en macacos obesos diabéticos después de la administración de un anticuerpo ANGPTL4 de la invención (NEG276-LALA).

La Figura 7 representa los cambios en la concentración de lipoproteína de alta densidad (HDL) en plasma en macacos obesos diabéticos después de la administración de un anticuerpo ANGPTL4 de la invención (NEG276-LALA).

La Figura 8 representa cambios en las concentraciones de apolipoproteína B (apoB) total en plasma en macacos obesos diabéticos después de la administración de un anticuerpo ANGPTL4 de la invención (NEG276-LALA).

La Figura 9 representa cambios en las concentraciones de apolipoproteína C-III (ApoC-III) en plasma en macacos obesos diabéticos después de la administración de un anticuerpo a Ng Pt L4 de la invención (NEG276-LALA).

La Figura 10 representa cambios en los niveles de colesterol asociados a lipoproteínas en plasma como se evalúa mediante separación por cromatografía líquida de proteínas rápidas (FPLC) de lipoproteínas plasmáticas después de la administración de un anticuerpo ANGPTL4 de la invención. Se muestran los datos de un mono (NEG276-LALA, mono n.° 6296). Abreviaturas: TRL, lipoproteínas ricas en triglicéridos; LDL, lipoproteína de baja densidad; HDL, lipoproteína de alta densidad.

La Figura 11 representa cambios en los niveles de triglicéridos (TG) asociados a lipoproteínas en plasma como se evalúa mediante separación por cromatografía líquida de proteínas rápidas (FPLC) de lipoproteínas plasmáticas después de la administración de un anticuerpo ANGPTL4 de la invención. Se muestran los datos de un mono (NEG276-LALA, mono n.° 6296). Abreviaturas: TRL, lipoproteínas ricas en triglicéridos; LDL, lipoproteína de baja densidad; HDL, lipoproteína de alta densidad.

Descripción detallada

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de moléculas de anticuerpo que se unen específicamente a ANGPTL4 e inhiben sus actividades biológicas. La invención se refiere tanto a anticuerpos en formato IgG completo (por ejemplo, anticuerpos humanizados NEG276 y NEG276-LALA) así como a fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tales como fragmentos Fab.

En consecuencia, la presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a ANGPTL4 (por ejemplo, ANGPTL4 humana), composiciones farmacéuticas, métodos de producción y métodos de uso de dichos anticuerpos y composiciones.

Proteínas ANGPTL4

La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a ANGPTL4 e inhiben sus actividades biológicas, incluyendo la capacidad de activar la lipoproteína lipasa (LPL). Por el contrario,

la proteína 4 similar a la angiopoyetina (ANGPTL4) es un miembro de la familia de proteínas secretadas de la angiopoyetina. Es una proteína homooligomérica, capaz de formar dímeros y tetrámeros, que se expresa por tipos de células que incluyen macrófagos, células adiposas, musculares y hepáticas. ANGPTL4 también se conoce como proteína relacionada con fibrinógeno hepático/angiopoyetina (HFARP)(Kim et al. (2000) Biochem. J. 346:603-610); proteína relacionada con gamma angiopoyetina PPa R (PGAR)(Yoon, et al. (2000) Mol. Cell Biol., 20:5343-5349) y factor adiposo inducido en ayunas (FIAF)(Kerten et al. (2000) J. Biol. Chem., 275:28488-28493). ANGPTL4 contiene un dominio de hélice superenrollada N-terminal y un dominio similar a fibrinógeno C-terminal (FBN) (Kim et al. (2000) Biochem. J. 346:603-610).

La lipoproteína lipasa (LPL) tiene un papel central en el metabolismo de las lipoproteínas para mantener los niveles normales de lipoproteínas en sangre y, a través de la regulación específica de tejido de su actividad, para determinar cuándo y en qué tejidos se descargan los triglicéridos (TG). Se sabe que la región de la hélice superenrrollada de ANGPTL4 inhibe la eliminación de triglicéridos (TG) mediada por lipoproteína lipasa (LPL). Por lo tanto, se observa que todas las mutaciones con pérdida de función de ANGPTL4 (por ejemplo, como se observa en sujetos humanos), las deleciones genéticas (por ejemplo, como se observa en ratones transgénicos) y la inhibición de anticuerpos (por ejemplo, como se observa en ratones y macacos) disminuyen los triglicéridos en plasma. Adicionalmente, también se sabe que los anticuerpos ANGPTL4 activan la LPL. Por el contrario, la inyección de ANGPTL4 en ratones produce un rápido aumento de los triglicéridos circulantes y esto es a una velocidad más alta que la inyección de proteína 3 similar a la angiopoyetina (ANGPTL3) (Yoshida et al. (2002) J Lipid Res 43:1770-1772).

Anticuerpos ANGPTL4 y fragmentos de unión a antígeno

La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a ANGPTL4 como se expone en las reivindicaciones. La presente divulgación proporciona además anticuerpos que se unen específicamente a ANGPTL4 humano y de macaco como se describe en los Ejemplos.

Los anticuerpos desvelados que se unen específicamente a una proteína ANGPTL4 (por ejemplo, ANGPTL4 humana y de macaco) pueden comprender un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, 38, 58, 78, 98, 118 y 138. Los anticuerpos desvelados que se unen específicamente a una proteína ANGPTL4 pueden comprender una CDR VH que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR VH enumeradas en la Tabla 1, más abajo. En particular, los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína ANGPTL4 (por ejemplo, ANGPTL4 humana y de macaco) pueden comprender (o alternativamente, consistir en) una, dos, tres o más CDR VH que tienen una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR VH enumeradas en la Tabla 1, más abajo.

Los anticuerpos desvelados que se unen específicamente a una proteína ANGPTL4 pueden comprender un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, 48, 68, 88, 108, 128 y 148. Los anticuerpos desvelados que se unen específicamente a una proteína ANGPTL4 (por ejemplo, ANGPTL4 humana y de macaco) pueden comprender una CDR VL que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR VL enumeradas en la T abla 2, más abajo. En particular, los anticuerpos desvelados que se unen específicamente a una proteína ANGPTL4 (por ejemplo, ANGPTL4 humana y de macaco) pueden comprender (o alternativamente, consistir en) una, dos, tres o más CDR VL que tienen una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR VL enumeradas en la Tabla 1, más abajo.

La presente invención también proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican VH, VL, la cadena pesada de longitud completa y la cadena ligera de longitud completa de los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína ANGPTL4 (por ejemplo, ANGPTL4 humana y de macaco). Dichas secuencias de ácidos nucleicos pueden optimizarse para la expresión en células de mamíferos (por ejemplo, la T abla 1 muestra las secuencias de ácidos nucleicos optimizadas para la cadena pesada y la cadena ligera de los anticuerpos de la invención).

T l 1. E m l n i r AN PTL4 F r ín AN PTL4

Ya que cada uno de estos anticuerpos desvelados puede unirse a ANGPTL4, las secuencias de VH, de VL, de la cadena ligera de longitud completa y de la cadena pesada de longitud completa (secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos) pueden "mezclarse y emparejarse" para crear otros anticuerpos de unión a ANGPTL4. Dichos anticuerpos de unión a ANGPTL4 "mezclados y emparejados" pueden probarse usando los ensayos de unión conocidos en la técnica (por ejemplo, ELISA y otros ensayos descritos en la sección de Ejemplos). Cuando estas cadenas se mezclan y se emparejan, una secuencia VH de un emparejamiento particular VH/VL debe reemplazarse por una secuencia VH estructuralmente similar. Igualmente, una secuencia de cadena pesada de longitud completa de un emparejamiento particular de cadena pesada de longitud completa/cadena ligera de longitud completa debe reemplazarse por una secuencia de cadena pesada de longitud completa estructuralmente similar. Igualmente, una secuencia v L de un emparejamiento VH/VL particular debe reemplazarse por una secuencia VL estructuralmente similar. Igualmente, una secuencia de cadena ligera de longitud completa de un emparejamiento particular de cadena pesada de longitud completa/cadena ligera de longitud completa debe reemplazarse por una secuencia de cadena ligera de longitud completa estructuralmente similar.

En consecuencia, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado o una región de unión a antígeno del mismo que tiene: un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, en donde el anticuerpo se une específicamente a ANGPTL4 (por ejemplo, ANGPTL4 humana).

Más específicamente, en determinados aspectos, la invención proporciona un anticuerpo aislado o una región de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprende secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y 23, respectivamente.

En otro aspecto, la invención proporciona (i) un anticuerpo aislado que tiene: una cadena pesada de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha optimizado para la expresión en una célula de mamífero seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15 y 28 y una cadena ligera de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha optimizado para la expresión en una célula de mamífero seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 25; o (ii) una proteína funcional que comprende una porción de unión a antígeno de la misma. Más específicamente, en determinados aspectos, la invención proporciona un anticuerpo aislado o una región de unión a antígeno del mismo que tiene una cadena pesada y una cadena ligera que comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO: 15 y 25; 28 y 25, respectivamente.

Las expresiones "región determinante de complementariedad" y "CDR", como se usan en el presente documento, se refieren a las secuencias de aminoácidos dentro de las regiones variables del anticuerpo que confieren especificidad antigénica y afinidad de unión. En general, hay tres CDR en cada región variable de la cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y tres CDR en cada región variable de la cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3).

Los límites precisos de la secuencia de aminoácidos de una CDR dada pueden determinarse fácilmente usando cualquiera de varios esquemas bien conocidos, incluyendo aquellos descritos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeración "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (esquema de numeración "Chothia").

Por ejemplo, según Kabat, los restos de aminoácidos de la CDR del anticuerpo FF1 en el dominio variable de la cadena pesada (VH) se numeran 31-35 (HCDR1), 50-66 (HCDR2) y 99-104 (HCDR3); y los restos de aminoácidos de la CDR en el dominio variable de cadena ligera (VL) se numeran 24-34 (LCDR1), 50-55 (Lc DR2) y 89-97 (LCDR3). Según Chothia, los aminoácidos de la CDR en la VH se numeran 26-32 (HCDR1), 52-57 (Hc DR2) y 99-104 (HCDR3); y los restos de aminoácidos en la VL se numeran 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) y 91-96 (LCDR3). Al combinar las definiciones de CDR de Kabat y Chothia, las CDR consisten en los restos de aminoácidos 26-35 (HCd R1), 50-66 (HCDR2) y 90-104 (HCDR3) en la v H humana y los restos de aminoácidos 24-34 ( LCDR1), 50-55 (LCDR2) y 89-97 (LCDR3) en la VL humana.

En determinadas realizaciones de la invención, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden tener las secuencias de cadena ligera y pesada de los anticuerpos humanizados descritos en la Tabla 1 como NEG276 y NEG276-LALA.

En determinadas realizaciones, la invención incluye anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a ANGPTL4 como se describe en la Tabla 1 y que son NEG276 o NEG276-LALA.

Anticuerpos homólogos

En otras realizaciones, las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de longitud completa y/o de cadena ligera de longitud completa pueden ser el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idénticas a las secuencias establecidas en la Tabla 1 para NEG276 y NEG276-LALA. Un anticuerpo que tiene una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa que tienen identidad alta (es decir, el 90 % o más) con las cadenas pesadas de longitud completa de cualquiera de SEQ ID NO: 15 o 28 y las cadenas ligeras de longitud completa de cualquiera de SEQ ID NO: 25, puede obtenerse por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos, seguido de la prueba del anticuerpo alterado codificado para determinar la función retenida usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

En otras realizaciones, las secuencias de nucleótidos de cadena pesada de longitud completa y/o de cadena ligera de longitud completa pueden ser el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idénticas a las secuencias expuestas en la Tabla 1 para NEG276 y NEG276-LALA.

En otras realizaciones, las secuencias de nucleótidos de las regiones variables de la cadena pesada y/o de las regiones variables de la cadena ligera pueden ser el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idénticas a las secuencias expuestas en la Tabla 1 para NEG276 y NEG276-LALA.

Como se usa en el presente documento, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, el % de identidad es igual al número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que tienen que introducirse para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden conseguirse usando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes a continuación.

Además, o como alternativa, las secuencias proteicas de la presente invención pueden usarse también como "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Por ejemplo, dichas búsquedas pueden realizarse usando el programa BLAST (versión 2.0) de Altschul, et al., 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10.

Anticuerpos con modificaciones conservativas

En otras realizaciones, el anticuerpo de la invención está optimizado para la expresión en una célula de mamífero que tiene una secuencia de cadena pesada de longitud completa y una secuencia de cadena ligera de longitud completa, en donde una o más de estas secuencias tienen secuencias de aminoácidos específicas basadas en los anticuerpos descritos en el presente documento o modificaciones conservativas de los mismos, y donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos de unión a ANGPTL4 de la invención. En consecuencia, la invención proporciona un anticuerpo aislado optimizado para la expresión en una célula de mamífero que consiste en una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa en donde la cadena pesada de longitud completa tiene secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NO: 15 y 28 y modificaciones conservativas de las mismas; y la cadena ligera de longitud completa tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y modificaciones conservativas de la misma; y el anticuerpo se une específicamente a ANGPTL4 (por ejemplo, ANGPTL4 humana y de macaco).

Injerto de dominios de unión a antígeno en marcos o andamios alternativos

Puede emplearse una amplia diversidad de marcos o andamios de anticuerpos/inmunoglobulinas siempre que el polipéptido resultante incluya al menos una región de unión que se una específicamente a ANGPTL4. Dichos marcos o andamios tipo incluyen los 5 idiotipos principales de inmunoglobulinas humanas, o fragmentos de las mismas, e incluyen inmunoglobulinas de otras especies animales, preferentemente que tienen aspectos humanizados. Los anticuerpos de cadena pesada sencilla tales como los identificados en camélidos son de particular interés a este respecto. Los expertos en la materia continúan descubriendo y desarrollando marcos, andamios y fragmentos novedosos.

En un aspecto, la invención pertenece a la generación de anticuerpos no basados en inmunoglobulinas usando andamios que no son de inmunoglobulina sobre los cuales pueden injertarse las CDR de la invención. Pueden emplearse marcos y andamios que no son de inmunoglobulina conocidos o futuros, siempre que comprendan una región de unión específica para la proteína ANGPTL4 diana. Los marcos o andamios que no son de inmunoglobulina conocidos incluyen, pero no se limitan a fibronectina (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zurich, Suiza), anticuerpos de dominio (Domantis, Ltd., Cambridge, MA y Ablynx nv, Zwijnaarde, Bélgica), lipocalina (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemania), productos inmuno-farmacéuticos modulares pequeños (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maxicuerpos (Avidia, Inc., Mountain View, CA), Proteína A (Affibody AG, Suecia) y afilina (gamma-cristalina o ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemania).

Las estructuras de fibronectina se basan en el dominio de fibronectina de tipo III (por ejemplo, el décimo módulo de la fibronectina de tipo III (dominio 10 Fn3)). El dominio de fibronectina de tipo III tiene 7 u 8 cadenas beta que están distribuidas entre dos hojas beta, que se empaquetan entre sí para formar el núcleo de la proteína, y además contienen bucles (análogos a las CDR) que conectan las cadenas beta entre sí y están expuestos a los disolventes. Hay al menos tres de dichos bucles en cada borde del sándwich de hojas beta, donde el borde es el límite de la proteína perpendicular a la dirección de las cadenas beta (véase el documento US 6.818.418). Estos andamios basados en fibronectina no son una inmunoglobulina, aunque el plegamiento general está estrechamente relacionado con el del fragmento de anticuerpo funcional más pequeño, la región variable de la cadena pesada, que comprende la unidad de reconocimiento del antígeno completa en IgG de camello y de llama. Debido a esta estructura, el anticuerpo que no es de inmunoglobulina imita propiedades de unión a antígeno que son similares en naturaleza y afinidad a las de los anticuerpos. Estos andamios pueden usarse en una estrategia de aleatorización y reordenamiento de bucles in vitro que es similar al proceso de maduración de la afinidad de los anticuerpos in vivo. Estas moléculas basadas en fibronectina pueden usarse como andamios donde las regiones de bucle de la molécula pueden remplazarse por CDR de la invención usando técnicas de clonación convencionales.

La tecnología de anquirina se basa en el uso de proteínas con módulos de repetición derivados de anquirina como andamios para llevar regiones variables que puedan usarse para la unión a diferentes dianas. El módulo de repetición de anquirina es un polipéptido de 33 aminoácidos que consiste en dos hélices a antiparalelas y un giro p. La unión de las regiones variables se optimiza principalmente usando la presentación de ribosomas.

Los avímeros derivan de proteínas que contienen dominio A natural tales como LRP-1. Estos dominios se usan por naturaleza para interacciones proteína-proteína y en seres humanos más de 250 proteínas se basan estructuralmente en dominios A. Los avímeros consisten en un cierto número de monómeros de "dominio A" diferentes (2-10) enlazados a través de enlazadores de aminoácidos. Pueden crearse avímeros que pueden unirse al antígeno diana usando la metodología descrita, por ejemplo, en las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 20040175756; 20050053973; 20050048512; y 20060008844.

Los ligandos de afinidad de aficuerpo son proteínas pequeñas y sencillas compuestas por un haz de tres hélices basado en el andamio de uno de los dominios de unión a IgG de la Proteína A. La Proteína A es una proteína de superficie de la bacteria Staphylococcus aureus. Este dominio de andamio consiste en 58 aminoácidos, 13 de los cuales se aleatorizan para generar bibliotecas de aficuerpos con una gran cantidad de variantes de ligando (véase, por ejemplo, el documento US 5.831.012). Las moléculas de aficuerpos imitan a los anticuerpos, tienen un peso molecular de 6 kDa, en comparación con el peso molecular de los anticuerpos, que es de 150 kDa. A pesar de su pequeño tamaño, el sitio de unión de las moléculas Affibody es similar al de un anticuerpo.

Las anticalinas son productos desarrollados por la empresa Pieris ProteoLab AG. Derivan de las lipocalinas, un grupo extenso de proteínas pequeñas y robustas que habitualmente están implicadas en el transporte o almacenamiento fisiológico de compuestos químicamente sensibles o insolubles. Varias lipocalinas naturales se encuentran en tejidos humanos o líquidos corporales. La arquitectura de la proteína recuerda a las inmunoglobulinas, con bucles hipervariables en la parte superior de una estructura rígida. Sin embargo, a diferencia de los anticuerpos o sus fragmentos recombinantes, las lipocalinas están compuestas por una única cadena polipeptídica con 160 a 180 restos de aminoácidos, que son ligeramente más grandes que un único dominio de inmunoglobulina. El conjunto de cuatro bucles, que constituye el bolsillo de unión, muestra una plasticidad estructural pronunciada y tolera una diversidad de cadenas laterales. Por lo tanto, el sitio de unión puede remodelarse en un proceso patentado para que reconozca moléculas diana indicadas de diferente forma con alta afinidad y especificidad. Una proteína de la familia de las lipocalinas, la proteína de unión a bilina (BBP) de Pieris brassicae se ha usado para desarrollar anticalinas mutagenizando el conjunto de cuatro bucles. Un ejemplo de una solicitud de patente que describe anticalinas se encuentra en la Publicación PCT N.° WO 199916873.

Las moléculas de afilina son pequeñas proteínas que no son inmunoglobulinas que están diseñadas para afinidades específicas hacia proteínas y moléculas pequeñas. Pueden seleccionarse muy rápidamente nuevas moléculas de afilina a partir de dos colecciones, cada una de las cuales se basa en una proteína de andamio de origen humano diferente. Las moléculas de afilina no muestran homología estructural alguna con las proteínas de inmunoglobulina. Actualmente, se emplean dos andamios de afilina, uno de los cuales es gamma cristalina, una proteína estructural del cristalino del ojo humano y el otro es de proteínas de la superfamilia "ubiquitina". Ambos armazones humanos son muy pequeños, muestran estabilidad a altas temperaturas y son casi resistentes a cambios de pH y agentes desnaturalizantes. Esta alta estabilidad se debe principalmente a la estructura de hoja beta expandida de las proteínas. En el documento WO200104144 se describen ejemplos de proteínas derivadas de gamma cristalina y en el documento WO2004106368 se describen ejemplos de proteínas "similares a ubiquitina".

Los miméticos de epítopos de proteínas (PEM) son moléculas de tamaño mediano, cíclicas, similares a péptidos (PM 1-2 kDa) que imitan las estructuras secundarias de las proteínas en forma de horquilla beta, la principal estructura secundaria implicada en las interacciones proteína-proteína.

La presente invención proporciona anticuerpos completamente humanos que se unen específicamente a la proteína ANGPTL4. En comparación con los anticuerpos quiméricos o humanizados, los anticuerpos de unión a ANGPTL4 humana de la invención tienen una antigenicidad más reducida cuando se administran a sujetos humanos.

Anticuerpos de camélidos

Las proteínas de anticuerpos obtenidas de miembros de la familia de los camellos y dromedarios (Camelus bactrianus y Calelus dromaderius), incluyendo los miembros del nuevo mundo, tales como especies de llamas (Lama paceos, Lama glama y Lama vicugna), se han caracterizado con respecto al tamaño, la complejidad estructural y la antigenicidad para sujetos humanos. Determinados anticuerpos IgG de esta familia de mamíferos como se encuentran en la naturaleza carecen de cadenas ligeras y, por lo tanto, son estructuralmente distintos de la estructura cuaternaria típica de cuatro cadenas que tiene dos cadenas pesadas y dos ligeras, para anticuerpos de otros animales. Véase el documento PCT/EP93/02214 (documento WO 94/04678 publicado el 3 de marzo de 1994).

Una región del anticuerpo de camélido, que es el pequeño dominio variable individual identificado como VHH, puede obtenerse mediante ingeniería genética para producir una proteína pequeña que tenga una alta afinidad por una diana, dando como resultado una proteína derivada de anticuerpos de bajo peso molecular conocida como "nanocuerpo de camélido". Véase la patente de EE.UU. número 5.759.808 presentada el 2 de junio de 1998; véase también Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; y Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520. Las bibliotecas modificadas por ingeniería genética de anticuerpos de camélidos y fragmentos de anticuerpo disponibles en el mercado, por ejemplo, de Ablynx, Gante, Bélgica. Como con otros anticuerpos de origen no humano, una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de camélido puede alterarse de forma recombinante para obtener una secuencia que se parezca más a una secuencia humana, es decir, el nanocuerpo puede "humanizarse". Por lo tanto, la baja antigenicidad natural de los anticuerpos de camélidos para seres humanos puede reducirse aún más.

El nanocuerpo de camélido tiene un peso molecular de aproximadamente una décima parte de una molécula de IgG humana y la proteína tiene un diámetro físico de solo unos pocos nanómetros. Una consecuencia del pequeño tamaño es la capacidad de los nanocuerpos de camélido de unirse a sitios antigénicos que sean funcionalmente invisibles a proteínas de anticuerpo más grandes, es decir, los nanocuerpos de camélido son útiles como reactivos para detectar antígenos que de lo contrario serían crípticos usando técnicas inmunológicas clásicas, y como posibles agentes terapéuticos. Por lo tanto, otra consecuencia más del pequeño tamaño es que un nanocuerpo de camélido puede inhibir como resultado de la unión a un sitio específico en un surco o hendidura estrecha de una proteína diana y, por tanto, puede ejercer una habilidad que se asemeja más a la función de un fármaco clásico de bajo peso molecular que a la de un anticuerpo clásico.

El bajo peso molecular y el tamaño compacto provocan además que los nanocuerpos de camélido sean extremadamente termoestables, estables a pH extremo y a digestión proteolítica y poco antigénicos. Otra consecuencia es que los nanocuerpos de camélido se mueven fácilmente desde el sistema circulatorio a los tejidos e incluso cruzan la barrera hematoencefálica y pueden tratar trastornos que afectan al tejido nervioso. Los nanocuerpos pueden facilitar aún más el transporte de fármacos a través de la barrera hematoencefálica. Véase la solicitud de patente de EE.UU.

20040161738 publicada el 19 de agosto de 2004. Estas características combinadas con la baja antigenicidad para los seres humanos indican un gran potencial terapéutico. Además, estas moléculas pueden expresarse completamente en células procariotas tales como E. co liy se expresan como proteínas de fusión con bacteriófagos y son funcionales.

En consecuencia, una característica de la presente invención es un anticuerpo o nanocuerpo de camélido que tiene una alta afinidad por ANGPTL4. En determinadas realizaciones en el presente documento, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se produce de forma natural en el animal camélido, es decir, se produce por el camélido después de la inmunización con ANGPTL4 o un fragmento peptídico de la misma, usando técnicas descritas en el presente documento para otros anticuerpos. Alternativamente, el nanocuerpo de camélido que se une a ANGPTL4 está modificado por ingeniería genética, es decir, se produce por selección, por ejemplo, de una biblioteca de fagos que exhiben proteínas de nanocuerpos de camélido mutagenizadas apropiadamente usando procedimientos de selección por afinidad con ANGPTL4 como diana, como se describe en los ejemplos en el presente documento. Los nanocuerpos modificados por ingeniería genética pueden personalizarse adicionalmente mediante ingeniería genética para que tengan una semivida en un sujeto receptor de 45 minutos a dos semanas. En una realización específica, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se obtiene injertando las secuencias de CDR de la cadena pesada o ligera de los anticuerpos humanos de la invención en secuencias marco de anticuerpo de nanocuerpo o de dominio único, como se describe, por ejemplo, en el documento PCT/EP93/02214.

Moléculas biespecíficas y anticuerpos multivalentes

En otro aspecto, la presente invención presenta moléculas biespecíficas o multiespecíficas que comprenden un anticuerpo de unión a ANGPTL4, o un fragmento del mismo, de la invención. Un anticuerpo de la invención, o regiones de unión a antígeno del mismo, pueden derivatizarse o enlazarse a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se una a al menos dos sitios de unión o moléculas diana diferentes. El anticuerpo de la invención, de hecho, puede derivatizarse o enlazarse a más de una molécula funcional diferente para generar moléculas multiespecíficas que se unan a más de dos sitios de unión y/o moléculas diana diferentes; se pretende que dichas moléculas multiespecíficas también estén abarcadas por la expresión "molécula biespecífica" como se usa en el presente documento. Para crear una molécula biespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención puede enlazarse funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro tipo) a una o más moléculas de unión diferentes, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de modo que se produzca una molécula biespecífica.

En consecuencia, la presente invención incluye moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión para ANGPTL4 y una segunda especificidad de unión para un segundo epítopo diana. Por ejemplo, el segundo epítopo diana es otro epítopo de ANGPTL4 diferente del primer epítopo diana.

Adicionalmente, para la invención en la cual la molécula biespecífica es multi-específica, la molécula puede incluir, además, una tercera especificidad de unión, además del primer y segundo epítopo diana.

En una realización, las moléculas biespecíficas de la invención comprenden como una especificidad de unión al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo incluyendo, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv o un Fv monocatenario. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o de cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo tales como un Fv o una construcción monocatenaria como se describe en Ladner et al. Patente de EE.UU. N.° 4.946.778.

Los diacuerpos son moléculas bivalentes biespecíficas en las cuales los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptídica, conectados mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Los dominios VH y VL se emparejan con dominios complementarios de otra cadena, creando de esta manera dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123). Los diacuerpos pueden producirse expresando dos cadenas polipeptídicas con la estructura VHA-VLB y VHB-VLA (configuración VH-VL) o VLA-VHB y VLB-VHA (configuración VL-VH) dentro de la misma célula. La mayoría de ellos puede expresarse en forma soluble en bacterias. Los diacuerpos monocatenarios (scDb) se producen conectando las dos cadenas polipeptídicas formadoras de diacuerpos con un enlazador de aproximadamente 15 restos de aminoácidos (véanse Holliger y Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36). scDb puede expresarse en bacterias en forma monomérica activa soluble (véanse Holliger y Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun y Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21). Un diacuerpo puede fusionarse a Fc para generar un "di-diacuerpo" (véase Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65).

Otros anticuerpos que pueden emplearse en las moléculas biespecíficas de la invención son anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados.

Las moléculas biespecíficas pueden prepararse conjugando las especificidades de unión constituyentes, usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica puede generarse por separado y después conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, puede usarse una diversidad de agentes de acoplamiento o reticulación para la conjugación covalente. Algunos ejemplos de agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y 4-(N-maleimidometil)ciclohaxan-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véanse, por ejemplo, Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82:8648). Otros métodos incluyen los descritos en Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. N.° 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), y Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, estos pueden conjugarse mediante unión sulfhidrilo de las regiones bisagra del extremo C de las dos cadenas pesadas. En una realización particular, la región bisagra se modifica para que contenga un número impar de restos sulfhidrilo, por ejemplo uno, antes de la conjugación.

Alternativamente, ambas especificidades de unión pueden codificarse en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma célula hospedadora. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula monocatenaria que comprende un anticuerpo monocatenario y un determinante de unión, o una molécula biespecífica monocatenaria que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas de cadena sencilla. Los métodos para preparar moléculas biespecíficas se describen, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Número 5.260.203; la Patente de EE.u U. Número 5.455.030; la Patente de EE.UU. Número 4.881.175; la Patente de EE.UU. Número 5.132.405; la Patente de EE.UU. Número 5.091.513; la Patente de EE.UU. Número 5.476.786; la Patente de EE.UU. Número 5.013.653; la Patente de EE.UU. Número 5.258.498; y la Patente de EE.UU. Número 5.482.858.

La unión de las moléculas biespecíficas a sus dianas específicas puede confirmarse, por ejemplo, por ensayo de inmunosorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (REA), análisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento) o ensayo de transferencia Western. Cada uno de estos ensayos detecta generalmente la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de interés particular empleando un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés.

En otro aspecto, la presente invención proporciona compuestos multivalentes que comprenden al menos dos porciones de unión a antígeno idénticas o diferentes de los anticuerpos de la invención que se unen a ANGPTL4. Las porciones de unión a antígeno pueden enlazarse a través de fusión de proteínas o enlace covalente o no covalente. Alternativamente, se han descrito métodos de enlace para las moléculas biespecíficas. Los compuestos tetravalentes pueden obtenerse, por ejemplo, reticulando anticuerpos de los anticuerpos de la invención con un anticuerpo que se une a las regiones constantes de los anticuerpos de la invención, por ejemplo, la región Fc o bisagra.

Los dominios de trimerización se describen, por ejemplo, en la patente de Borean EP 1012280B1. Los módulos de pentamerización se describen, por ejemplo, en el documento PCT/EP97/05897.

Anticuerpos con Semivida Prolongada

La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a la proteína ANGPTL4 que tienen una semivida prolongada in vivo.

Muchos factores pueden afectar la semivida de una proteína in vivo. Por ejemplo, la filtración renal, el metabolismo en el hígado, la degradación por enzimas proteolíticas (proteasas) y respuestas inmunogénicas (por ejemplo, neutralización de proteínas por anticuerpos y captación por macrófagos y células dendríticas). Puede usarse una diversidad de estrategias para extender la semivida de los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, mediante enlace químico con polietilenglicol (PEG), reCODE PEG, andamio de anticuerpos, ácido polisiálico (PSA), hidroxietil almidón (HES), ligandos de unión a albúmina y escudos de carbohidratos; por fusión genética a proteínas que se unen a proteínas del suero, tales como albúmina, IgG, FcRn y transferrina; mediante acoplamiento (genética o químicamente) a otros restos de unión que se unen a proteínas del suero, tales como nanocuerpos, Fab, DARPin, avímeros, aficuerpos y anticalinas; por fusión genética con rPEG, albúmina, dominio de albúmina, proteínas de unión a albúmina y Fc; o por incorporación en nanovehículos, formulaciones de liberación lenta o dispositivos médicos.

Para prolongar la circulación en suero de anticuerpos in vivo, pueden fijarse moléculas poliméricas inertes, tales como PEG de alto peso molecular, a los anticuerpos o un fragmento de los mismos con o sin un enlazador multifuncional, ya sea a través de la conjugación específica del sitio del PEG al extremo N o C de los anticuerpos o mediante grupos épsilon-amino presentes en los restos de lisina. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, se hace reaccionar normalmente con polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o derivado de aldehído de PEG, en condiciones en las cuales uno o más grupos PEG se fijan al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La pegilación puede llevarse a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero hidrosoluble reactivo análogo). Como se usa en el presente documento, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, tales como mono alcoxi o ariloxi (C1-C10)-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En determinadas realizaciones, el anticuerpo a pegilar es un anticuerpo aglucosilado. Se usará la derivatización polimérica lineal o ramificada que dé como resultado una pérdida mínima de actividad biológica. El grado de conjugación puede monitorizarse estrechamente mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas para asegurar la conjugación adecuada de moléculas de PEG con los anticuerpos. El PEG que no ha reaccionado puede separarse de los conjugados de anticuerpo-PEG por cromatografía de exclusión de tamaño o de intercambio iónico. Los anticuerpos derivatizados con PEG pueden probarse para determinar la actividad de unión así como la efectividad in vivo usando métodos bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante inmunoensayos descritos en el presente documento. Los métodos para pegilar proteínas se conocen en la técnica y pueden aplicarse a los anticuerpos de la invención. Véanse, por ejemplo, el documento EP 0154316 de Nishimura et al. y el documento EP 0401 384 de Ishikawa et al.

Otras tecnologías de pegilación modificadas incluyen la tecnología de modificación por ingeniería genética dirigida ortogonal químicamente reconstituyente (ReCODE PEG), que incorpora cadenas laterales químicamente especificadas en proteínas biosintéticas a través de un sistema reconstituido que incluye ARNt sintetasa y ARNt. Esta tecnología permite la incorporación de más de 30 aminoácidos nuevos en proteínas biosintéticas en E. coli, levaduras y células de mamífero. El ARNt incorpora un aminoácido no nativo en cualquier lugar en donde se ubica un codón ámbar, convirtiendo el codón ámbar de uno de parada en uno que señala la incorporación del aminoácido químicamente especificado.

La tecnología de pegilación recombinante (rPEG) también puede usarse para extender la semivida en suero. Esta tecnología implica fusionar genéticamente una cola de proteína no estructurada de 300-600 aminoácidos a una proteína farmacéutica existente. Debido a que el peso molecular aparente de una cadena de proteína no estructurada de este tipo es aproximadamente 15 veces más grande que su peso molecular real, la semivida en suero de la proteína aumenta grandemente. A diferencia de la PEGilación tradicional, que requiere conjugación química y repurificación, el proceso de fabricación se simplifica grandemente y el producto es homogéneo.

La polisialización es otra tecnología, que usa el polímero natural ácido polisálico (PSA) para prolongar la vida activa y mejorar la estabilidad de péptidos y proteínas terapéuticos. El PSA es un polímero de ácido siálico (un azúcar). Cuando se usa para la administración de proteínas y péptidos terapéuticos, el ácido polisálico proporciona un microentorno protector en la conjugación. Esto aumenta la vida activa de la proteína terapéutica en la circulación y evita que sea reconocida por el sistema inmunitario. El polímero de PSA se encuentra de forma natural en el cuerpo humano. Fue adoptado por determinadas bacterias que evolucionaron durante millones de años para cubrir sus paredes con él. Estas bacterias polisialiladas de forma natural pudieron, en virtud de la imitación molecular, frustrar el sistema de defensa del cuerpo. El PSA, la última tecnología sigilosa de la naturaleza, puede producirse fácilmente a partir de bacterias de este tipo en grandes cantidades y con características físicas predeterminadas. El PSA bacteriano es completamente no inmunogénico, incluso cuando está acoplado a proteínas, ya que es químicamente idéntico al PSA en el cuerpo humano.

Otra tecnología incluye el uso de derivados de hidroxietil almidón ("HES") enlazados a anticuerpos. HES es un polímero natural modificado derivado del almidón de maíz ceroso y puede ser metabolizado por las enzimas del cuerpo. Las soluciones de HES se administran habitualmente para sustituir el volumen sanguíneo deficiente y mejorar las propiedades reológicas de la sangre. La hesilación de un anticuerpo permite la prolongación de la semivida en circulación al aumentar la estabilidad de la molécula, así como al reducir el aclaramiento renal, lo que da como resultado una actividad biológica aumentada. Variando diferentes parámetros, tales como el peso molecular de HES, puede personalizarse una amplia gama de conjugados de anticuerpos HES.

También pueden generarse anticuerpos que tienen una semivida aumentada in vivo introduciendo una o más modificaciones de aminoácidos (es decir, sustituciones, inserciones o eliminaciones) en un dominio constante de IgG, o fragmento de unión a FcRn del mismo (preferentemente un fragmento de dominio Fc o Fc bisagra). Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional N.° WO 98/23289; la Publicación Internacional N.° WO 97/34631; y la patente de EE.UU. N.° 6.277.375.

Además, los anticuerpos pueden conjugarse con albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humana; HSA) para hacer que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo sea más estable in vivo o tener una semivida más larga in vivo. Las técnicas son bien conocidas en la técnica, véanse, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales N.° WO 93/15199, WO 93/15200 y WO 01/77137; y la Patente europea N.° EP 413.622. Además, en el contexto de un anticuerpo biespecífico como se describió anteriormente, las especificidades del anticuerpo pueden diseñarse de tal manera que un dominio de unión del anticuerpo se una a ANGPTL4 mientras que un segundo dominio de unión del anticuerpo se una a albúmina de suero, preferentemente HSA.

Las estrategias para aumentar la semivida son especialmente útiles en nanocuerpos, aglutinantes basados en fibronectina y otros anticuerpos o proteínas para los que se desea aumentar la semivida in vivo.

Conjugados de anticuerpos

La presente invención proporciona anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a una proteína ANGPTL4 fusionada de manera recombinante o conjugada químicamente (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) a una proteína o polipéptido heterólogo (o fragmento del mismo, preferentemente a un polipéptido de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión. En particular, la invención proporciona proteínas de fusión que comprenden un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo descrito en el presente documento (por ejemplo, un fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmento F(ab)2, un dominio VH, una CDR VH, un dominio Vl o una CDR VL) y una proteína, polipéptido o péptido heterólogo. Los métodos para fusionar o conjugar proteínas, polipéptidos o péptidos a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851 y 5.112.946; las Patentes europeas N.° EP 307.434 y EP 367.166; las Publicaciones Internacionales N.° WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; y Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:11337-11341.

Pueden generarse proteínas de fusión adicionales a través de las técnicas de reordenamiento de genes, reordenamiento de motivos, reordenamiento de exones y/o reordenamiento de codones (denominado colectivamente "reordenamiento de ADN"). El reordenamiento de ADN puede emplearse para alterar las actividades de anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos con afinidades más altas y velocidades de disociación más bajas). Véanse, en general, las Patentes de EE.UU. N.° 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252 y 5.837.458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol.

16(2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; y Lorenzo y Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308- 313. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos, o los anticuerpos codificados o fragmentos de los mismos, pueden alterarse sometiéndolos a mutagénesis aleatoria mediante PCR propensa a errores, inserción aleatoria de nucleótidos u otros métodos antes de la recombinación. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a una proteína ANGPTL4 puede recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.

Además, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden fusionarse con secuencias marcadoras, tal como un péptido, para facilitar la purificación. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles en el mercado. Como se describe en Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:821-824, por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras marcas peptídicas útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta de hemaglutinina ("HA"), que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson et al., 1984, Cell 37:767) y la etiqueta "flag".

En otras realizaciones, los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos se conjugan con un agente de diagnóstico o detectable. Dichos anticuerpos pueden ser útiles para monitorizar o pronosticar la aparición, desarrollo, progresión y/o gravedad de una enfermedad o trastorno como parte de un procedimiento de ensayo clínico, tal como determinar la efectividad de un tratamiento particular. Dicho diagnóstico y detección pueden cumplirse acoplando el anticuerpo a sustancias detectables que incluyen, pero no se limitan a, diversas enzimas, tales como, pero no limitado a peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, tales como, pero no limitados a estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero no limitados a umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, pero no limitados a luminol; materiales bioluminiscentes, tales como, pero no limitados a luciferasa, luciferina y aequorina; materiales radiactivos, tales como, pero no limitados yodo (131I, 125I, 123I y 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In y 111In), tecnecio (99Tc), talio (201 Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re,142 Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117Tin; y metales emisores de positrones utilizando diversas tomografías por emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos.

La presente invención abarca además usos de anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados con un resto terapéutico. Un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse con un resto terapéutico tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion metálico radioactivo, por ejemplo, emisores alfa. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células.

Además, un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse con un resto terapéutico o resto de fármaco que modifique una respuesta biológica dada. Los restos terapéuticos o restos de fármaco no deben interpretarse estando limitados a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína, péptido o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas, toxina colérica o toxina diftérica; una proteína tal como factor de necrosis tumoral, interferón a, interferón p, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador tisular del plasminógeno, un agente apoptótico, un agente anti-angiogénico; o un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina.

Además, un anticuerpo puede conjugarse con restos terapéuticos tales como un ion metálico radiactivo, tal como emisores alfa, tal como 213Bi o quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones de radiometales, que incluyen, pero no se limitan a 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm, a polipéptidos. En determinadas realizaciones, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N"-tetraacético (DOTA) que puede fijarse al anticuerpo mediante una molécula enlazadora. Tales moléculas enlazadoras se conocen comúnmente en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; y Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50.

Las técnicas para conjugar restos terapéuticos con anticuerpos son bien conocidos, véanse, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) y Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58.

Los anticuerpos también pueden fijarse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación del antígeno diana. Dichos soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.

Métodos para producir anticuerpos de la invención

Ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos

La invención proporciona moléculas de ácido nucleico sustancialmente purificadas que codifican polipéptidos que comprenden segmentos o dominios de las cadenas de anticuerpos de unión a ANGPTL4 descritos anteriormente. Algunos de los ácidos nucleicos de la invención comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 13 y/o la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 23. En una realización específica, las moléculas de ácido nucleico son aquellas identificadas en la Tabla 1 para NEG276 y NEG276-LALA. Algunas otras moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas (por ejemplo, al menos el 65, el 80 %, el 95 % o el 99 %) a las secuencias de nucleótidos de aquellas identificadas en la Tabla 1. Cuando se expresan a partir de vectores de expresión apropiados, los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos son capaces de exhibir capacidad de unión a antígeno ANGPTL4.

También se proporcionan en la invención polinucleótidos que codifican al menos una región CDR y habitualmente las tres regiones CDR de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de unión a ANGPTL4 expuesto anteriormente. Algunos otros polinucleótidos codifican toda o sustancialmente toda la secuencia de la región variable de la cadena pesada y/o la cadena ligera del anticuerpo de unión a ANGPTL4 expuesto anteriormente. Debido a la degeneración del código, una diversidad de secuencias de ácidos nucleicos codificarán cada una de las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden codificar tanto una región variable como una región constante del anticuerpo. Algunas de las secuencias de ácido nucleico de la invención comprenden nucleótidos que codifican una secuencia de cadena pesada que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos el 90 % o el 99 %) a la secuencia de cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 15 o 28. Algunas otras secuencias de ácido nucleico que comprenden nucleótidos que codifican una secuencia de cadena ligera que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos el 90 % o el 99 %) a la secuencia de cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 25.

Las secuencias de polinucleótidos pueden producirse mediante síntesis de ADN en fase sólida de novo o mediante mutagénesis por PCR de una secuencia existente (por ejemplo, secuencias como se describen en los Ejemplos a continuación) que codifican un anticuerpo de unión a ANGPTL4 o su fragmento de unión. Puede conseguirse síntesis química directa de ácidos nucleicos por métodos conocidos en la técnica, tal como el método de fosfotriéster de Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90; el método de fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981; y el método de soporte sólido de la Patente de EE.UU. N.° 4.458.066. Introducir mutaciones a una secuencia polinucleotídica por PCR puede realizarse como se describe en, por ejemplo, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; y Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991.

También se proporcionan en la invención los vectores de expresión y las células hospedadoras para producir los anticuerpos de unión a ANGPTL4 descritos anteriormente. Pueden emplearse diversos vectores de expresión para expresar los polinucleótidos que codifican las cadenas de anticuerpos de unión a ANGPTL4 o fragmentos de unión. Pueden usarse vectores de expresión tanto basados en virus como no víricos para producir los anticuerpos en una célula hospedadora de mamífero. Los vectores y sistemas no víricos incluyen plásmidos, vectores episómicos, normalmente con un casete de expresión para expresar una proteína o ARN y cromosomas artificiales humanos (véase, por ejemplo, Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997). Por ejemplo, los vectores no víricos útiles para la expresión de los polinucleótidos y polipéptidos de unión a ANGPTL4 en células de mamíferos (por ejemplo, humanas) incluyen pThioHis A, B y C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B y C, (Invitrogen, San Diego, CA), vectores MPSV y numerosos vectores distintos conocidos en la técnica para expresar otras proteínas. Los vectores víricos útiles incluyen vectores basados en retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, vectores basados en SV40, virus del papiloma, HBP, virus de Epstein Barr, vectores del virus vaccinia y virus del bosque Semliki (SFV). Véanse, Brent et al., anteriormente citado; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; y Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992.

La elección del vector de expresión depende de las células hospedadoras pretendidas en las cuales va a expresarse el vector. Normalmente, los vectores de expresión contienen un promotor y otras secuencias reguladoras (por ejemplo, potenciadores) que están unidos operativamente a los polinucleótidos que codifican una cadena o fragmento de anticuerpo que se une a ANGPTL4. En algunas realizaciones, se emplea un promotor inducible para prevenir la expresión de secuencias insertadas excepto en condiciones de inducción. Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo, promotor de arabinosa, de lacZ, de metalotioneína o un promotor de choque térmico. Los cultivos de organismos transformados pueden expandirse en condiciones no inductoras sin sesgar la población para codificar secuencias cuyos productos de expresión son mejor tolerados por las células hospedadoras. Además de los promotores, también pueden requerirse o desearse otros elementos reguladores para la expresión eficiente de una cadena o fragmento de anticuerpo que se une a ANGPTL4. Estos elementos incluyen normalmente un codón de iniciación ATG y un sitio de unión de ribosoma adyacente u otras secuencias. Además, la eficiencia de expresión puede potenciarse mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso (véase, por ejemplo, Scharf et al., Results Probl. Cell Differ.

20:125, 1994; y Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Por ejemplo, el potenciador de SV40 o el potenciador de CMV pueden usarse para aumentar la expresión en células hospedadoras de mamífero.

Los vectores de expresión también pueden proporcionar una posición de secuencia señal de secreción para formar una proteína de fusión con polipéptidos codificados por secuencias de anticuerpos de unión a ANGPTL4 insertadas. Más a menudo, las secuencias de anticuerpos de unión a ANGPTL4 insertadas se unen a secuencias señal antes de su inclusión en el vector. Los vectores que van a usarse para recibir secuencias que codifican los dominios variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo que se une a ANGPTL4 a veces también codifican regiones constantes o partes de las mismas. Dichos vectores permiten la expresión de las regiones variables como proteínas de fusión con las regiones constantes, dando lugar de ese modo a la producción de anticuerpos intactos o fragmentos de los mismos. Normalmente, dichas regiones constantes son humanas.

Las células hospedadoras para albergar y expresar las cadenas de anticuerpos que se unen a ANGPTL4 pueden ser procariotas o eucariotas. E. coli es un hospedador procariota útil para clonar y expresar los polinucleótidos de la presente invención. Otros hospedadores microbianos adecuados para su uso incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacteriaceae, tales como Salmonella, Serratia y diversas especies de Pseudomonas. En estos hospedadores procariotas, uno también puede preparar vectores de expresión, que contienen habitualmente secuencias de control de la expresión compatibles con la célula hospedadora (por ejemplo, un origen de replicación). Además, estará presente cualquier número de una diversidad de promotores bien conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de beta-lactamasa o un sistema promotor del fago lambda. Los promotores normalmente controlan la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tienen secuencias de sitio de unión al ribosoma y similares, para iniciar y completar la transcripción y la traducción. También pueden emplearse otros microbios, tales como levaduras, para expresar polipéptidos de unión a ANGPTL4 de la invención. También pueden usarse células de insectos en combinación con vectores de baculovirus.

En algunas realizaciones preferidas, se usan células hospedadoras de mamífero para expresar y producir los polipéptidos de unión a ANGPTL4 de la presente invención. Por ejemplo, pueden ser una línea celular de hibridoma que exprese genes de inmunoglobulina endógenos (por ejemplo, el clon de hibridoma de mieloma 1D6.C9 como se describe en los Ejemplos) o una línea celular de mamífero que alberga un vector de expresión exógeno (por ejemplo, las células de mieloma SP2/0 ejemplificadas a continuación). Estas incluyen cualquier célula animal o humana mortal normal o inmortal normal o anómala. Por ejemplo, se han desarrollado varias líneas celulares hospedadoras que pueden secretar inmunoglobulinas intactas incluyendo las líneas celulares CHO, diversas líneas celulares Cos, células HeLa, líneas celulares de mieloma, linfocitos B transformados e hibridomas. El uso de cultivo celular de tejido de mamífero para expresar polipéptidos se analiza en general en, por ejemplo, Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Los vectores de expresión para células hospedadoras de mamíferos pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor y un potenciador (véase, por ejemplo, Reina, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986) y sitios de información de procesamiento necesarios, como sitios de unión de ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Estos vectores de expresión contienen habitualmente promotores derivados de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Los promotores adecuados pueden ser constitutivos, específicos de tipo celular, específicos de fase y/o modulables o regulables. Los promotores útiles incluyen, pero no se limitan a, el promotor de la metalotioneína, el promotor tardío principal constitutivo de adenovirus, el promotor inducible por dexametasona de MMTV, el promotor de SV40, el promotor de polIII de MRP, el promotor constitutivo de MPSV, el promotor inducible por tetraciclina de CMV (tal como el promotor temprano inmediato del CMV humano), el promotor constitutivo de CMV y combinaciones de promotor-potenciador conocidas en la técnica.

Los métodos para introducir vectores de expresión que contengan las secuencias polinucleotídicas de interés varían dependiendo del tipo de hospedador celular. Por ejemplo, se utiliza normalmente transfección con cloruro de calcio para células procariotas, mientras que puede usarse tratamiento con fosfato de calcio o electroporación para otros hospedadores celulares. (Véase en general Sambrook, et al., anteriormente citado). Otros métodos incluyen, por ejemplo, electroporación, tratamiento con fosfato de calcio, transformación mediada por liposomas, inyección y microinyección, métodos balísticos, virosomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión:ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales, fusión a la proteína estructural VP22 del virus del herpes (Elliot y O'Hare, Cell 88:223, 1997), captación potenciada por agente de ADN y transducción ex vivo. Para producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, a menudo se deseará expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable cadenas de anticuerpos de unión a ANGPTL4 o fragmentos de unión pueden prepararse usando vectores de expresión de la invención que contienen orígenes víricos de replicación o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable. Después de la introducción del vector, puede permitirse que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a un medio selectivo. El fin del marcador de selección es conferir resistencia a la selección y su presencia permite el crecimiento de células que expresan satisfactoriamente las secuencias introducidas en medio selectivo. Las células resistentes, transfectadas de forma estable pueden hacerse proliferar usando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para el tipo celular.

Generación de anticuerpos monoclonales de la invención

Pueden producirse anticuerpos monoclonales (mAb) mediante una diversidad de técnicas, incluyendo metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica convencional de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, 1975 Nature 256: 495. Pueden emplearse muchas técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación vírica u oncogénica de linfocitos B.

Los sistemas animales para preparar hibridomas incluyen los sistemas murino, de rata y de conejo. La producción de hibridoma en el ratón es un proceso bien establecido. Los protocolos de inmunización y las técnicas para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión se conocen en la técnica. Los compañeros de fusión (por ejemplo, células de mieloma murinas) y procedimientos de fusión también son conocidos.

Pueden prepararse anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente invención basándose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparado como se describe anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera puede obtenerse del hibridoma murino de interés y modificarse por ingeniería genética para que contenga secuencias de inmunoglobulina no murina (por ejemplo, humana) usando técnicas convencionales de biología molecular. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables murinas pueden unirse a regiones constantes humanas usando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 4.816.567 de Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, pueden insertarse regiones CDR murinas en una región flanqueante humana usando métodos conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 5225539 de Winter y las Patentes de EE.UU. N.° 5530101; 5585089; 5693762 y 6180370 de Queen et al.

En una determinada realización, los anticuerpos de la invención son anticuerpos humanizados. Dichos anticuerpos humanizados dirigidos contra ANGPTL4 pueden generarse usando ratones transgénicos o transcromosómicos que llevan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema del ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones a los que se hace referencia en el presente documento como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y se denominan colectivamente en el presente documento "ratones Ig humanos".

El ratón HuMAb® (Medarex, Inc.) contiene miniloci de genes de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina de la cadena pesada (|j y y) y ligera k humanas no reordenadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci de la cadena j y k endógenos (véase, por ejemplo, Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859). En consecuencia, los ratones muestran expresión reducida de IgM de ratón o k y, en respuesta a inmunización, los transgenes introducidos de la cadena pesada y ligera humanas experimentan cambios de clase y mutación somática para generar IgGK monoclonal humana de alta afinidad (Lonberg, N. et al., 1994 anteriormente citado; revisado en Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. y Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 y Harding, F. y Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y el uso de ratones HuMAb y las modificaciones genómicas que llevan dichos ratones, se describen adicionalmente en Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; y Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851. Véanse además, las Patentes de EE.UU. N.° 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas de Lonberg y Kay; la Patente de EE.UU. N.° 5.545.807 de Surani et al.; las Publicaciones PCT N.° WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay; y la Publicación PCT N.° WO 01/14424 de Korman et al.

En otra realización, los anticuerpos humanos de la invención pueden generarse usando un ratón que lleva secuencias de inmunoglobulinas humanas en transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que lleva un transgén de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Dichos ratones, denominados en el presente documento "ratones KM", se describen en detalle en la Publicación PCT WO 02/43478 de Ishida. et al.

Aún más, están disponibles en la técnica sistemas de animales transgénicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana y pueden usarse para generar anticuerpos de unión a ANGPTL4 de la invención. Por ejemplo, puede usarse un sistema transgénico alternativo denominado Xenomouse (Abgenix, Inc.). Tales ratones se describen en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6, 150.584 y 6.162.963 de Kucherlapati et al.

Además, están disponibles en la técnica sistemas animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana y pueden usarse para generar anticuerpos de unión a ANGPTL4 de la invención. Por ejemplo, pueden usarse ratones que llevan tanto un transcromosoma de cadena pesada humana como un transcromosoma de cadena ligera humana, denominados "ratones TC"; tales ratones se describen en Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 97:722-727. Además, se han descrito en la técnica vacas que llevan transcromosomas humanos de cadena pesada y ligera (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894) y puede usarse para generar anticuerpos de unión a ANGPTL4 de la invención.

Los anticuerpos humanizados de la invención también pueden prepararse usando métodos de presentación en fagos para seleccionar bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Dichos métodos de expresión en fagos para aislar anticuerpos humanos están establecidos en la técnica o se describen en los ejemplos a continuación. Véanse, por ejemplo: las Patentes de EE.UU. N.° 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 de Ladner et al.; las Patentes de EE.UU. N.° 5.427.908 y 5.580.717 de Dower et al.; las Patentes de EE.UU. N.° 5.969.108 y 6.172.197 de McCafferty et al.; y las Patentes de EE.UU. N.° 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 de Griffiths et al.

Los anticuerpos humanizados de la invención también pueden prepararse usando ratones SCID en los cuales se han reconstituido células inmunitarias humanas de tal manera que pueda generarse una respuesta de anticuerpos humanos tras la inmunización. Dichos ratones se describen en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 5.476.996 y 5.698.767 de Wilson et al.

Modificación por ingeniería genética de marco o Fc

Los anticuerpos modificados por ingeniería genética de la invención incluyen aquellos en los que se han realizado modificaciones en los restos del marco dentro de VH y/o VL, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente tales modificaciones del marco se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque consiste en "retromutar" uno o más restos del marco a la secuencia de la línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha sufrido una mutación somática puede contener restos del marco que difieren de la secuencia de la línea germinal de la que deriva el anticuerpo. Tales restos pueden identificarse comparando las secuencias del marco del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de las que deriva el anticuerpo. Para devolver las secuencias de la región marco a su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas pueden "retromutarse" a la secuencia de la línea germinal mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio. También se pretende que tales anticuerpos "retromutados" estén abarcados por la invención.

Otro tipo de modificación en la región flanqueante implica mutar uno o más restos dentro de la región marco, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para retirar los epítopos de células T para reducir de ese modo la posible inmunogenicidad del anticuerpo. Esta estrategia también se denomina "desinmunización" y se describe en mayor detalle en la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 20030153043 por Carr et al.

Además o como alternativa a las modificaciones realizadas dentro de las regiones marco o CDR, los anticuerpos de la invención pueden modificarse por ingeniería genética para que incluyan modificaciones dentro de la región Fc, normalmente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la semivida en suero, la fijación del complemento, la unión al receptor de Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Adicionalmente, un anticuerpo de la invención puede modificarse químicamente (por ejemplo, pueden fijarse uno o más restos químicos al anticuerpo) o modificarse para alterar su glucosilación, de nuevo para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con mayor detalle a continuación. La numeración de los restos en la región Fc es la del índice EU de Kabat.

En una realización, la región bisagra de CH1 se modifica de tal manera que el número de restos de cisteína en la región de bisagra se altera, por ejemplo, se aumenta o se disminuye. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de EE.UU. N.° 5.677.425 por Bodmer et al. El número de restos de cisteína en la región bisagra de CH1 se modifica para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otra realización, la región bisagra Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento bisagra Fc de tal manera que el anticuerpo tiene la unión de proteína A estafilocócica (SpA) alterada con respecto a la unión de SpA del dominio bisagra Fc nativo. Esta estrategia se describe en mayor detalle en la Patente de EE.UU. N.° 6.165.745 por Ward et al.

En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biológica. Son posibles diversas estrategias. Por ejemplo, pueden introducirse una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la Patente de EE.UU. N.° 6.277.375 de Ward. Alternativamente, para aumentar la semivida biológica, el anticuerpo puede alterarse dentro de la región CH1 o CL para que contenga un epítopo de unión al receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las Patentes de EE.UU. N.° 5.869.046 y 6.121.022 por Presta et al.

En aún otras realizaciones, la región Fc se altera reemplazando al menos un resto de aminoácido por un resto de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos pueden reemplazarse por un resto de aminoácido diferente, de tal manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector, pero conserve la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo parental. El ligando efector al que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc o el componente C1 del complemento. Esta estrategia se describe en mayor detalle en las Patentes de EE.UU. N.° 5.624.821 y 5.648.260, ambas por Winter et al.

En otra realización, pueden remplazarse uno o más aminoácidos seleccionados de restos de aminoácidos por un resto de aminoácido diferente de tal manera que el anticuerpo tenga unión alterada a C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o anulada. Esta estrategia se describe en mayor detalle en la Patente de EE.UU. N.° 6.194.551 por Idusogie et al.

En otra realización, se altera uno o más restos de aminoácidos para alterar de ese modo la capacidad del anticuerpo de fijar el complemento. Esta estrategia se describe adicionalmente en la publicación PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.

En otra realización más, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo de mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor de Fcy modificando uno o más aminoácidos. Esta estrategia se describe adicionalmente en la publicación PCT WO 00/42072 de Presta. Además, los sitios de unión en IgG1 humana para FcyRI, FcyRN, FcyRIII y FcRn se han mapeado y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604).

En aún otra realización, se modifica la glucosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, puede prepararse un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilación). La glucosilación puede alterarse, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo por el "antígeno". Dichas modificaciones de carbohidratos pueden lograrse, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glucosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, pueden realizarse una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glucosilación de la región flanqueante de la región variable para eliminar de esta manera la glucosilación en ese sitio. Dicha aglucosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dicha estrategia se describe en mayor detalle en las Patentes de EE.UU. N.° 5.714.350 y 6.350.861 por Co et al.

Adicionalmente o como alternativa, puede prepararse un anticuerpo que tenga un tipo alterado de glucosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de restos de fucosilo o un anticuerpo que tenga un aumento en las estructuras de GlcNac bisecantes. Se ha demostrado que dichos patrones de glucosilación alterados aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones de carbohidratos pueden conseguirse, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula hospedadora con una maquinaria de glucosilación alterada. Se han descrito en la técnica células con maquinaria de glucosilación alterada y pueden usarse como células hospedadoras en las cuales expresar anticuerpos recombinantes de la invención para producir de esta manera un anticuerpo con glucosilación alterada. Por ejemplo, el documento EP 1.176.195 de Hang et al. describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosil transferasa, de tal manera que los anticuerpos expresados en una línea celular tal muestran hipofucosilación. La publicación PCT WO 03/035835 de Presta describe una línea celular CHO variante, células Lecl3, con capacidad reducida de fijar fucosa a glúcidos ligados a Asn(297), lo que también provoca hipofucosilación de los anticuerpos expresados en esa célula hospedadora (véase también Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La Publicación PCT WO 99/54342 por Umana et al. describe líneas celulares modificadas por ingeniería genética para expresar glucosil transferasas modificadoras de glucoproteína (por ejemplo, beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de tal manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares modificadas por ingeniería genética exhiban estructuras de GlcNac bisecantes aumentadas lo que da como resultado la actividad ADCC aumentada de los anticuerpos (véase también Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180).

Métodos de modificación por ingeniería genética de anticuerpos alterados

Como se analizó anteriormente, los anticuerpos que se unen a ANGPTL4 que tienen secuencias VH y VL o secuencias de cadena ligera y pesada de longitud completa que se muestran en el presente documento pueden usarse para crear nuevos anticuerpos de unión a ANGPTL4 modificando las secuencias de cadena pesada y/o cadena ligera de longitud completa, las secuencias VH y/o VL o la región o regiones constantes unidas a las mismas. Por lo tanto, en otro aspecto de la invención, las características estructurales de un anticuerpo de unión a ANGPTL4 de la invención se usan para crear anticuerpos de unión a ANGPTL4 estructuralmente relacionados que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como la unión a ANGPTL4 humana, y también para inhibir una o más propiedades funcionales de ANGPTL4 (por ejemplo, inhibir la unión de ANGPTL4 al receptor de ANGPTL4, inhibir la proliferación celular dependiente de ANGPTL4).

Por ejemplo, una o más regiones CDR de los anticuerpos de la presente invención, o mutaciones de los mismos, pueden combinarse recombinantemente con regiones marco conocidas y/u otras CDR para crear anticuerpos adicionales de la invención que se unen a ANGPTL4, recombinantemente modificados por ingeniería genética, como se analizó anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen aquellas descritas en la sección anterior. El material de partida para el método de modificación por ingeniería genética es una o más de las secuencias VH y/o VL proporcionadas en el presente documento, o una o más regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo modificado por ingeniería genética, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias VH y/o VL proporcionadas en el presente documento, o una o más regiones CDR de las mismas. En su lugar, la información contenida en la secuencia o secuencias se usa como material de partida para crear una secuencia o secuencias de "segunda generación" derivadas de la secuencia o secuencias originales y después se prepara la secuencia o secuencias de "segunda generación" y se expresa como una proteína.

En consecuencia, en otra realización, la invención proporciona un método para preparar un anticuerpo de unión a ANGPTL4 optimizado para la expresión en una célula de mamífero que consiste en: una secuencia de anticuerpo de cadena pesada de longitud completa que tiene una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 15 y 28; y una secuencia de anticuerpo de cadena ligera de longitud completa que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 25; alterar al menos un resto de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de cadena pesada de longitud completa y/o la secuencia de anticuerpo de cadena ligera de longitud completa para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia del anticuerpo alterada como una proteína. En una realización, la alteración de la cadena pesada o ligera está en la región marco de la cadena pesada o ligera.

La secuencia de anticuerpos alterada también puede prepararse explorando colecciones de anticuerpos que tienen secuencias de CDR3 fijas o determinantes de unión esenciales mínimos tal como se describe en el documento US2005/0255552 y diversidad en secuencias de CDR1 y CDR2. La exploración puede realizarse de acuerdo con cualquier tecnología de cribado apropiada para cribar anticuerpos de colecciones de anticuerpos tales como la tecnología de visualización de fagos.

Pueden usarse técnicas convencionales de biología molecular para preparar y expresar la secuencia de anticuerpos alterados. El anticuerpo codificado por la secuencia o secuencias del anticuerpo alterado es uno que retiene una, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos de unión a ANGPTL4 descritos en el presente documento, cuyas propiedades funcionales incluyen, pero no se limitan a, unión específica a ANGPTL4 humana, de macaco, de rata y/o de ratón; y el anticuerpo inhibe la proliferación de células dependientes de ANGPTL4 en un ensayo de proliferación de células F36E y/o Ba/F3-ANGPTL4R.

En determinadas realizaciones de los métodos de modificación por ingeniería genética de anticuerpos de la invención, las mutaciones pueden introducirse de forma aleatoria o selectiva a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de anticuerpo de unión a ANGPTL4 y los anticuerpos de unión a ANGPTL4 modificados resultantes pueden cribarse para la actividad de unión y/u otras propiedades funcionales como se describe en el presente documento. Se han descrito en la técnica métodos mutacionales. Por ejemplo, la Publicación PCT WO 02/092780 por Short describe métodos para crear y rastrear mutaciones de anticuerpos usando mutagénesis de saturación, ensamblaje de ligación sintético o una combinación de los mismos. Como alternativa, la publicación PCT WO 03/074679 por Lazar et al. describe métodos de uso de métodos de cribado informatizados para optimizar las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos.

En determinadas realizaciones de la invención, los anticuerpos se han modificado por ingeniería genética para retirar sitios de desamidación. Se sabe que la desamidación provoca cambios estructurales y funcionales en un péptido o proteína. La desamidación puede dar como resultado una disminución de la bioactividad, así como alteraciones en la farmacocinética y antigenicidad de la proteína farmacéutica. (Anal Chem. 1 de marzo de 2005;77(5):1432-9).

En determinadas realizaciones de la invención los anticuerpos se han diseñado para aumentar el pI y mejorar sus propiedades similares a las de un fármaco. El pI de una proteína es un determinante clave de las propiedades biofísicas globales de una molécula. Se ha sabido que los anticuerpos que tienen bajos pI son menos solubles, menos estables y propensos a agregación. Además, la purificación de anticuerpos con bajo pI es difícil y puede ser problemática especialmente durante el aumento de escala para uso clínico. El aumento del pI de los anticuerpos anti-ANGPTL4 o los Fab de la invención mejoró su solubilidad, permitiendo formular los anticuerpos a concentraciones más altas (>100 mg/ml). La formulación de anticuerpos a altas concentraciones (por ejemplo, >100 mg/ml) ofrece la ventaja de ser capaz de administrar dosis más altas de los anticuerpos en los ojos de los pacientes a través de inyecciones intravítreas, lo que a su vez puede permitir una frecuencia de dosificación reducida, una ventaja significativa para el tratamiento de enfermedades crónicas que incluyen trastornos cardiovasculares. Los pI más altos también pueden aumentar el reciclado mediado por FcRn de la versión de IgG del anticuerpo posibilitando, por lo tanto, que el fármaco persista en el organismo durante un tiempo más largo, lo que requiere menos inyecciones. Finalmente, la estabilidad global de los anticuerpos se mejora significativamente debido al pI más alto que provoca una semivida más larga y bioactividad in vivo. Preferentemente, el pI es mayor que o igual a 8,2.

Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados pueden evaluarse usando ensayos convencionales disponibles en la técnica y/o descritos en el presente documento, tales como los expuestos en los Ejemplos (por ejemplo, ELISA).

Usos profilácticos y terapéuticos

La presente invención proporciona los anticuerpos de la invención para su uso en un método de tratamiento de trastornos asociados a ANGPTL4 seleccionados de uno o más de los siguientes: hipertrigliceridemia grave (con concentración de triglicéridos en plasma >500 mg/dl), hipertrigliceridemia asociada a obesidad, hipertrigliceridemia de tipo V, quilomicronemia, dislipidemia primaria, síndrome metabólico y diabetes tipo 2 administrando a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de los anticuerpos de la invención.

Generalmente, pueden usarse los anticuerpos de la invención, entre otros, para prevenir, tratar, prevenir y mejorar afecciones o trastornos asociados a ANGPTL4, que incluyen, pero no se limitan a, cualquier número de afecciones o enfermedades en las cuales los niveles de proteína ANGPTL4 son aberrantemente altos y/o en las cuales se busca una reducción de los niveles de proteína ANGPTL4. Estas afecciones incluyen pero no se limitan a las que implican el metabolismo de los lípidos, tales como hiperlipidemia, hiperlipoproteinemia y dislipidemia, incluyendo dislipidemia aterogénica, dislipidemia diabética, hipertrigliceridemia (por ejemplo, hipertrigliceridemia grave (por ejemplo, con TG >1000 mg/dl), hipertrigliceridemia asociada a obesidad e hipertrigliceridemia tipo V), hipercolesterolemia, quilomicronemia, dislipidemia mixta (obesidad, síndrome metabólico, diabetes, etc.), lipodistrofia, lipoatrofia y otras afecciones provocadas, por ejemplo, por la actividad de LPL disminuida y/o deficiencia de LPL, actividad del receptor de LDL disminuida y/o deficiencia del receptor de LDL, ApoC2 alterado, deficiencia de ApoE, aumento de ApoB, producción aumentada y/o eliminación disminuida de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), determinado tratamiento farmacológico (por ejemplo, dislipidemia inducida por el tratamiento con glucocorticoides), cualquier predisposición genética, dieta, estilo de vida y similares.

Los anticuerpos de la invención también pueden usarse en combinación con otros agentes para la prevención, el tratamiento o la mejora de los trastornos asociados a ANGPTL4. Por ejemplo, pueden usarse terapias con estatinas en combinación con los anticuerpos ANGPTL4 y los fragmentos de unión a antígeno de la invención para el tratamiento de pacientes con trastornos relacionados con los triglicéridos.

Composiciones farmacéuticas

La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos de unión a ANGPTL4 (fragmentos intactos o de unión) formulados junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener adicionalmente uno o más de otros agentes terapéuticos que sean adecuados para tratar o prevenir, por ejemplo, trastornos cardiovasculares. Los vehículos farmacéuticamente aceptables potencian o estabilizan la composición, o pueden usarse para facilitar la preparación de la composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción y similares que son fisiológicamente compatibles.

Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica. La vía y/o el modo de administración varían dependiendo de los resultados deseados. Se prefiere que la administración sea intravítrea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, o se administre proximal al sitio de la diana. El vehículo farmacéuticamente aceptable debe ser adecuado para administración intravítrea, intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, medular o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, la molécula de anticuerpo, biespecífica y multiespecífica, puede recubrirse en un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

La composición debe ser estéril y fluida. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio en la composición. La absorción a largo plazo de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse de acuerdo con métodos bien conocidos y puestos en práctica de forma rutinaria en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20a ed., 2000; y Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978. Las composiciones farmacéuticas se fabrican preferentemente en condiciones GMP. Normalmente, en las composiciones farmacéuticas de la invención se emplea una dosis terapéuticamente eficaz o una dosis efectiva del anticuerpo de unión a ANGPTL4. Los anticuerpos que se unen a ANGPTL4 se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse una única inyección intravenosa rápida, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o puede reducirse o aumentarse de forma proporcional la dosis según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de principio activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el soporte farmacéutico requerido.

Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin que sean tóxicos para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado depende de una diversidad de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o el éster, sal o amida de las mismas, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, estado, salud general y antecedentes médicos previos del paciente que se está tratando, y factores similares.

Un médico o veterinario puede comenzar con dosis de los anticuerpos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles menores de los necesarios para conseguir el efecto terapéutico deseado y aumentar la dosis gradualmente hasta que se consiga el efecto deseado. En general, las dosis eficaces de las composiciones de la presente invención para el tratamiento de trastornos cardiovasculares descritos en el presente documento varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Las dosis de tratamiento deben ajustarse para optimizar la seguridad y la efectividad. Para la administración sistémica con un anticuerpo, la dosificación varía de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 15 mg/kg, del peso corporal del hospedador. Para la administración intravítrea con un anticuerpo, la dosificación puede variar de 0,1 mg/ojo a 5 mg/ojo. Por ejemplo, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml, 1,0 mg/ml, 1,1 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,3 mg/ml, 1,4 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1,6 mg/ml, 1.7 mg/ml, 1,8 mg/ml, 1,9 mg/ml, 2,0 mg/ml, 2,1 mg/ml, 2,2 mg/ml, 2,3 mg/ml, 2,4 mg/ml, 2,5 mg/ml, 2,6 mg/ml, 2,7 mg/ml, 2.8 mg/ml, 2,9 mg/ml, 3,0 mg/ml, 3,1 mg/ml, 3,2 mg/ml,

3,3 mg/ml, 3,4 mg/ml, 3,5 mg/ml, 3,6 mg/ml, 3,7 mg/ml, 3,8 mg/ml, 3.9 mg/ml, 4,0 mg/ml, 4,1 mg/ml, 4,2 mg/ml, 4,3 mg/ml, 4,4 mg/ml, 4,5 mg/ml, 4,6 mg/ml, 4,7 mg/ml, 4,8 mg/ml, 4,9 mg/ml o 5,0 mg/ml. Un régimen de tratamiento ilustrativo implica la administración sistémica una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Un régimen de tratamiento ilustrativo implica la administración sistémica una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses, o según sea necesario (PRN).

El anticuerpo se administra generalmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis únicas pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, como se indica midiendo los niveles en sangre del anticuerpo de unión a ANGPTL4 en el paciente. Además, un médico puede determinar intervalos de dosificación alternativos y administrarlos mensualmente o según sea necesario para que sean efectivos. En algunos métodos de administración sistémica, la dosificación se ajusta para lograr una concentración de anticuerpos en plasma de 1-1000 |jg/ml y en algunos métodos de 25-500 |jg/ml. Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanizados muestran una semivida más larga que la de los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos no humanos. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja con intervalos relativamente poco frecuentes durante un periodo de tiempo largo. Algunos pacientes siguen recibiendo el tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, en ocasiones se requiere una dosificación relativamente elevada a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduzca o termine, y preferentemente hasta que el paciente muestre una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Después de ello, puede administrarse al paciente un régimen profiláctico.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente la invención, pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención resultarán fácilmente evidentes para un experto en la materia y están abarcadas por las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1: Preparación de ANGPTL4 humana recombinante purificado para su uso como antígeno y en experimentos de caracterización de anticuerpos

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido ANGPTL4 humano de longitud completa (aminoácidos 26-406, secuencia NCBI NM_139314.2 coincidente) con el péptido señal N-terminal de IgG-kappa humana (MKTFILLLWVLLLWVIFLLPGATA) (SEQ ID NO: 152) y el epítopo FLAG C-terminal (DYKDDDDKH) (SEQ ID NO: 153), etiqueta de purificación de hexahistidina (HHHHHH) (s Eq ID NO: 154) y etiqueta Avi (es decir, secuencia de biotinilación BirA GGGLNDIFEAQKIEWHE) (SEQ ID NO: 155) se subclonó en el vector de expresión de células de mamífero pRS5a para generar el plásmido pRS-Ikk-hANGPTL4 (26-406)-FLAG-6HIS-Avi que contenía una secuencia señal IKK de 20 aminoácidos seguida de los aminoácidos 26-406 de ANGPTL4 humano con etiquetas carboxilo-terminales Flag, 6HIS y Avi (Tabla 2, SEQ ID NO: 156).

Para algunas preparaciones, se usaron los siguientes procedimientos para expresar, purificar y biotinilar la proteína ANGPTL4 humana (Método 1): Se cultivaron células HEK293T adaptadas en suspensión en medio de expresión FreeStyle 293 sin suero (Life Technologies, número de catálogo 12338-018) y se transfectaron con el plásmido pRS-IkkhANGPTL4 (26-406)-FLAG-His6-Avi usando reactivo de transfección de polietilenimina (Polysciences, número de catálogo 23966). Cinco horas después de la transfección, se añadió heparina (Alfa Aesar, número de catálogo A16198) al medio de cultivo hasta una concentración final de 0,5 mg/ml. Las células se cultivaron después durante 72-96 horas y el sobrenadante del cultivo celular se recogió por centrifugación a 4 °C y se esterilizó por filtración usando un filtro de 0.22 jm (Thermo, número de catálogo 567-0010). El sobrenadante del cultivo celular filtrado se concentró después hasta aproximadamente 100 ml mediante filtración de flujo tangencial. El sobrenadante concentrado se diluyó hasta un volumen de 1 litro con tampón TBS-glicerol (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM y glicerol al 15 %, pH 7,4) y la muestra se concentró hasta aproximadamente 200 ml mediante filtración de flujo tangencial. Después se añadió a la muestra resina de agarosa Anti-Flag M2 (Sigma, número de catálogo 220102-177) preequilibrada con tampón TBS-glicerol, y la solución resultante se mezcló suavemente durante 1 hora a 4 °C. La resina de agarosa se lavó después 5 veces con 25 ml de TBS-glicerol y la proteína ANGPTL4 unida se eluyó con 20 ml de TBS-glicerol que contenía 0.2 mg/ml de péptido Flag (Sigma, número de catálogo 220176-317). Se añadió Tween-20 sin peróxido (AppliChem, número de catálogo A1284,0025 a la solución de proteína eluida hasta una concentración final del 0.1 % y la solución resultante se cargó en una columna de heparina HiTrap de 5 ml (GE Lifesciences, número de catálogo 17-0407-01) que se preequilibró en TBS-glicerol que contenía Tween-20 al 0,1 % (Tampón A). La columna se lavó con 50 ml de Tampón A, seguido de 50 ml de Tampón A que contenía NaCl 300 mM. Después se eluyó la proteína ANGPTL4 con 20 ml de Tampón A que contenía NaCl 600 mM. La proteína eluida se concentró usando un concentrador centrífugo con un límite de peso molecular de 30 kDa (Amicon Ultra, número de catálogo UFC903024). La pureza de la proteína ANGPTL4 purificada evaluada por SDS-PAGE fue >90 %.

Para algunas aplicaciones, las proteínas ANGPTL4 se biotinilaron de manera específica de sitio en la etiqueta Avi C-terminal usando 10 |jg de biotina-proteína ligasa purificada (BirA) (Avidity) por mg de ANGPTL4. El tampón se suplementó con concentraciones finales de ATP 10 mM, acetato de magnesio 10 mM y d-biotina 0,5 M. La mezcla de reacción se incubó durante 2 horas a 30 °C y después durante la noche a 4 °C, después se cargó en una columna HiLoad Superdex 200 (26 mm x 600 mm) (GE Lifesciences, número de catálogo 28-9893-36) que se equilibró en Tampón A. Las fracciones de la columna Superdex 200 se analizaron usando SDS-PAGE y las fracciones que contenían ANGPTL4 se agruparon y se concentraron usando un concentrador centrífugo.

Para otras preparaciones, se usaron los siguientes procedimientos para expresar, purificar y biotinilar la proteína ANGPTL4 humana (Método 2). El plásmido pRS-Ikk-hANGPTL4(26-406)C-Flag6HisAvi se transfectó transitoriamente en células HEK293T usando métodos convencionales de transfección de polietilenimina (PEI). Las células se propagaron en cultivo en suspensión en medio de expresión Freestyle 293 y la transfección se llevó a cabo a 1 x 106 células/ml concentración celular final en 4 litros de medio usando matraces de 1 litro. Cinco horas después de la transfección, se añadió heparina a una concentración final de 500 jg/ml. Las células se cultivaron a 37 °C y CO2 al 5 % durante 72 h. Después las células se sedimentaron mediante centrifugación y el sobrenadante se pasó a través de un filtro estéril de 0,22 jm . El sobrenadante clarificado se concentró y se cambió el tampón por Tampón B (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, glicerol al 10 %, imidazol 10 mM, pH 7,4) usando filtración de flujo tangencial (TFF). La muestra concentrada se pasó después por una columna de afinidad Ni-NTA de 5 ml equilibrada con Tampón C (Tris.HCl 50 mM, NaCl 150 mM, glicerol al 10 %, imidazol 10 mM, n-octil-p-maltósido al 0,1 %, pH 7,4). Después de cargar la muestra, la columna se lavó con el mismo tampón hasta que se alcanzó la absorbancia inicial a 280 nm. La proteína ANGPTL4 unida se eluyó después usando un gradiente de imidazol (10 mM a 500 mM). Las fracciones de elución que contenían ANGPTL4 humano se combinaron, se concentraron usando un concentrador Amicon (corte de peso molecular 10 kD), se intercambiaron con tampón usando columnas PD-10 en tampón de almacenamiento (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, glicerol al 15 %, pH 7,4), en alícuotas, se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C. La pureza de la proteína ANGPTL4 humana purificada evaluada por SDS-PAGE fue >90 %.

Para algunas aplicaciones, la proteína ANGPTL4 purificada preparada como se describió anteriormente se biotiniló específicamente en el sitio de la siguiente manera: proteína purificada en Bicina 50 mM, tampón a pH 8,3 a una concentración final de aproximadamente 1 mg/ml se incubó en presencia de ATP 10 mM, acetato de magnesio 10 mM, biotina 0,1 mM y biotina ligasa BirA (Avidity) a 30 °C durante 1 hora y después a 4 °C durante la noche. Después la proteína se concentró usando un concentrador Amicon (corte de peso molecular de 10 kD), se intercambió el tampón usando columnas PD-10 en un tampón de almacenamiento (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, glicerol al 15 %, pH 7,4), en alícuotas, se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C.

Ejemplo 2: Preparación de la proteína de dominio de hélice superenrollada N-terminal de ANGPTL4 humana recombinante purificada para su uso como antígeno y en experimentos de caracterización de anticuerpos

La expresión, purificación y biotinilación del dominio de hélice superenrollada N-terminal de ANGPTL4 humana (aminoácidos 26-161) se llevó a cabo usando esencialmente los mismos métodos descritos para ANGPTL4 humana de longitud completa en el Ejemplo 1, Método 2. La secuencia de la proteína del dominio N-terminal de ANGPTL4 humana purificada se muestra en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 157).

Tabla 2. Secuencias de aminoácidos de ANGPTL4 (26-406)-FLAG-His6-Avi humana (el péptido señal está resaltado subrayando, y la secuencia QP N-terminal después del péptido señal y las secuencias C-terminales FLAG-His6-Avi están resaltadas en cursiva

Ejemplo 3: Preparación y detección de anticuerpos monoclonales

La proteína ANGPTL4 humana recombinante se preparó internamente como se describe en el Ejemplo 1 y se usó como inmunógeno para la generación de clones de hibridoma anti-ANGPTL4. Se inmunizaron ratones transgénicos Bcl-2 con ANGPTL4 humana recombinante de acuerdo con un protocolo convencional de inmunización rápida. Los hibridomas se generaron usando un método convencional basado en electrofusión.

Se generaron células CHO-K1PD que expresaban de forma estable ANGPTL4 humana fusionada a un dominio transmembrana usando métodos convencionales. Debido a la presencia del dominio transmembrana, estas células muestran ANGPTL4 en la superficie celular. Por lo tanto, la unión de anticuerpos a ANGPTL4 en la superficie de estas células puede detectarse usando citometría de flujo.

Los sobrenadantes de hibridoma se cribaron detectando la unión de los anticuerpos presentes en el sobrenadante a ANGPTL4 humano expresado en la superficie de las células CHO-K1PD. La unión de anticuerpos a las células se detectó usando un anticuerpo secundario anti-ratón marcado con fluorescencia y citometría de flujo. Las células parentales CHO-K1PD que no expresan ANGPTL4 se usaron como un control negativo. Para los hibridomas que se unían a ANGPTL4, los anticuerpos se purificaron a partir de sobrenadantes celulares usando métodos convencionales y el sobrenadante enriquecido resultante se probó en el ensayo de citometría de flujo con células CHO-K1PD/ANGPTL4 y CHO-K1 PD-Parentales.

Los títulos de anticuerpos ANGPTL4 en sobrenadantes de hibridoma se determinaron usando un ensayo ELISA directo convencional, en el cual se inmovilizó proteína ANGPTL4 humana recombinante sobre la superficie de la placa ELISA. Se subclonaron hibridomas positivos confirmados y se determinaron las secuencias de los anticuerpos monoclonales producidos por estos hibridomas usando métodos convencionales.

Posteriormente se demostró que los anticuerpos monoclonales 14P18, 17B1, 19C16 y 37P1 inhiben la inhibición de la lipoproteína lipasa humana mediada por ANGPTL4 humana usando los métodos descritos en el Ejemplo 7 a continuación. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera y pesada de 14P18, 17B1, 19C16 y 37P1 se determinaron usando métodos convencionales.

Ejemplo 4: Humanización de anticuerpos monoclonales

El proceso de humanización está bien descrito en la técnica (Jones, et al. 1986, Queen, et al. 1989, Riechmann, et al. 1988, Verhoeyen, Milstein y Winter 1988). El término humanización se describe como la transferencia del sitio de unión a antígeno de un anticuerpo no humano, por ejemplo, un anticuerpo derivado murino, a un marco aceptor humano, por ejemplo, una secuencia de la línea germinal humana (Retter, et al. 2005). La razón principal para humanizar un anticuerpo es minimizar el riesgo de desarrollar una respuesta inmunogénica hacia el anticuerpo cuando el anticuerpo se administra como producto terapéutico en seres humanos (Rebello, et al. 1999).

El sitio de unión a antígeno comprende las regiones determinantes complementarias (CDR) (Chothia y Lesk 1987, Kabat, et al. 1991) y posiciones en la región marco de los dominios variables (VL y VH) que afectan directa o indirectamente a la unión. Los restos del marco que pueden afectar directamente a la unión pueden encontrarse, por ejemplo, en la denominada región del bucle "externo" ubicada entre CDR2 y CDR3. Los restos que afectan indirectamente a la unión se encuentran, por ejemplo, en las llamadas Zonas Vernier (Foote y Winter 1992). Se cree que soportan la conformación de CDR. Esas posiciones fuera de las CDR se tienen en cuenta al elegir un marco aceptor adecuado para minimizar el número de desviaciones del anticuerpo humanizado final con respecto a la secuencia aceptora de la línea germinal humana en las regiones marco.

Ejemplo 5: Optimización de la secuencia de anticuerpos y maduración de la afinidad

Se sabe que determinados motivos de la secuencia de aminoácidos sufren una modificación postraduccional (PTM) tales como glucosilación (por ejemplo, NxS/T, donde x es cualquier aminoácido excepto P), oxidación de cisteínas libres, desamidación (por ejemplo, desamidación de N en secuencias de NG) o isomerización (por ejemplo, en secuencias DG). Si están presentes en las regiones CDR, esos motivos se eliminan idealmente mediante mutagénesis dirigida al sitio para aumentar la homogeneidad del producto.

El proceso de maduración por afinidad está bien descrito en la técnica. Entre muchos sistemas de visualización, la visualización de fagos (Smith 1985) y la visualización en células eucariotas tales como levaduras (Boder y Wittrup 1997) son los sistemas más comúnmente aplicados para seleccionar la interacción anticuerpo-antígeno. Las ventajas de estos sistemas de visualización son que son adecuados para una amplia gama de antígenos y que la rigurosidad de la selección se puede ajustar fácilmente. En la visualización de fagos, pueden mostrarse fragmentos scFv o Fab y en la visualización de levaduras pueden mostrarse scFv, Fab o IgG de longitud completa. Estos métodos comúnmente aplicados permiten la selección de variantes de anticuerpos deseadas de bibliotecas más grandes con diversidades de más de 1 x 107 Las bibliotecas con menor diversidad (por ejemplo, 1000) pueden cribarse mediante micro-expresión y ELISA.

Pueden generarse bibliotecas de variantes de anticuerpos aleatorias o no dirigidas, por ejemplo, mediante PCR propensa a errores (Cadwell y Joyce 1994) y proporcionan una estrategia muy sencilla, pero a veces limitada. Otra estrategia es la diversificación dirigida por CDR de un anticuerpo candidato. Una o más posiciones en una o más CDR pueden marcarse como diana específicamente usando, por ejemplo, oligonucleótidos degenerados (Thompson, et al.

1996), mutagénesis de trinucleótidos (TRIM) (Kayushin, et al. 1996), o cualquier otro enfoque conocido en la técnica.

Ejemplo 6: Expresión y purificación de anticuerpos humanizados

Las secuencias de ADN que codifican los dominios VL y VH humanizados se solicitaron en GeneArt (Life Technologies, Inc., Regensburg, Alemania) incluyendo la optimización de codones para Homo sapiens. Las secuencias que codifican los dominios VL y VH se subclonaron cortando y pegando de los vectores derivados de GeneArt en vectores de expresión adecuados para la expresión y secreción por células de mamífero. Las cadenas pesada y ligera se clonaron en vectores de expresión individuales para permitir la co-transfección. Los elementos del vector de expresión incluyen un promotor (potenciador-promotor del citomegalovirus (CMV)), una secuencia señal para facilitar la secreción, una señal de poliadenilación y un terminador de la transcripción (del gen de la hormona de crecimiento bovino (BGH)), un elemento que permite la replicación episómica y la replicación en procariotas (por ejemplo, origen SV40 y ColE1 u otros conocidos en la técnica) y elementos para permitir la selección (gen de resistencia a ampicilina y marcador de zeocina).

Las células de riñón embrionario humano que expresan constitutivamente el antígeno T grande de SV40 (HEK293-T ATCC11268) son una de las líneas de células hospedadoras preferidas para la expresión transitoria de proteínas IgG humanizadas y/u optimizadas. La transfección se realiza usando PEI (polietilenimina, PM lineal 25.000, Polysciences, EE.UU., número de catálogo 23966) como reactivo de transfección. La solución madre de PEI se prepara disolviendo cuidadosamente 1 g de PEI en 900 ml de agua de grado de cultivo celular a temperatura ambiente (TA). Para facilitar la disolución de PEI, la solución se acidifica mediante la adición de HCl a pH 3-5, seguido de neutralización con NaOH hasta un pH final de 7,05. Finalmente, el volumen se ajusta a 1 l y la solución se filtra a través de un filtro de 0,22 |jm, se toman alícuotas y se congelan a -80 °C hasta su uso adicional. Las células HEK 293T se cultivan utilizando un medio de cultivo sin suero patentado por Novartis para la transfección y propagación de las células, y un medio de cultivo sin suero ExCell VPRO (SAFC Biosciences, EE.UU., N.° de cat. 24561C) como medio de producción/alimentación. Las células preparadas para transfecciones transitorias se cultivan en cultivo en suspensión. Para las transfecciones a pequeña escala (<5 l), las células se cultivan en matraces de agitación Corning (Corning, Tewksbury, MA) en un agitador orbital (100-120 rpm) en una incubadora humidificada al 5 % de CO2 (frascos de semillas). Las células en los cultivos de semillas deben mantenerse en la fase de crecimiento exponencial (densidades celulares entre 5 x 105/ml y 3 x 106/ml) y presentan una viabilidad de >90 % para la transfección. Para la transfección a pequeña escala (<5 l), se extrae una alícuota de células de los cultivos de semillas y se ajusta a 1,4 x 106 células/ml en el 36 % del volumen final con medio de cultivo sin suero de Novartis. La solución de ADN (Solución 1: 0,5 mg de plásmido de expresión de cadena pesada y 0,5 mg de cadena ligera para una transfección de 1 l) se prepara diluyendo el ADN a 1 mg/l (volumen final) en el 7 % del volumen de cultivo final seguido de una mezcla suave. Para evitar la contaminación bacteriana, esta solución se filtra usando un filtro de 0,22 jm (por ejemplo, Millipore Stericup). Después 3 mg/l (volumen final) de solución de PEI también se diluyen en el 7 % del volumen de cultivo final y se mezclan suavemente (Solución 2). Ambas soluciones se incuban durante 5-10 min a temperatura ambiente (TA). En lo sucesivo, se añade la solución 2 a la solución 1 con una suave mezcla y se incuba durante otros 5-15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de transfección se añade después a las células y se prosigue el cultivo de las células durante 4 a 6 horas. Finalmente, el 50 % restante del volumen de producción total se logra mediante la adición de medio de cultivo exento de suero ExCell® VPRO. El cultivo celular continúa durante once días después de la transfección.

El cultivo se recolecta por centrifugación a 4500 rpm durante 20 minutos a 4 °C (Heraeus®, Multifuge 3 S-R, Thermo Scientific, Rockford, IL). El sobrenadante celular recuperado se esteriliza por filtración a través de un filtro stericup (0,22 |jm) y se almacena a 4 °C hasta su procesamiento adicional. La purificación se realizó en un sistema de cromatografía "ÁKTA 100 Explorer Air" a 4 °C en una cabina de enfriamiento, usando una columna HiTrap de 5 ml de Proteína A MabSelect®SuRe recién desinfectada (NaOH 0,25 M). La columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de solución salina tamponada con fosfato (PBS, Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) y después se cargó el sobrenadante filtrado de forma estéril a 4,0 ml/min. La columna se lavó con 13 volúmenes de columna de PBS. Después se eluyó el anticuerpo con 5 volúmenes de columna de citrato 50 mM, NaCl 70 mM, pH 3,2. El eluido se recogió en fracciones de 3 ml y se ajustó a pH 7 con Tris-HCl 1 M, pH 10. Las fracciones que contenían el anticuerpo se combinaron y se esterilizaron por filtración (Millipore Steriflip, 0,22 um), la DO a 280 nm se midió usando un espectrofotómetro (NanoDrop ND-1000) y la concentración de proteína se calculó basándose en la DO a 280 y el coeficiente de extinción molar que se calculó basándose en la secuencia de proteínas. Se probó la agregación del eluido mediante cromatografía de exclusión por tamaño con detector de dispersión de luz de múltiples ángulos (SEC-MALS) y se evaluó la pureza mediante electroforesis en gel (SDS-PAGE), ensayo de endotoxina (LAL) y espectrometría de masas (EM). Para la segunda etapa de purificación, si fuera necesaria, el anticuerpo de la primera purificación se cargó en una columna de filtración en gel recién desinfectada (NaOH 0,5 M) (Hi Load 16/60 Superdex 200, 120 ml, GE-Healthcare). La columna se equilibró con PBS y la ejecución se realizó con tampón PBS a un caudal de 1 ml/min. El eluido se recogió en fracciones de 1,2 ml. Las proteínas que contenían el anticuerpo se agruparon y el anticuerpo purificado resultante se analizó como se describe para la primera etapa de purificación.

Usando los métodos descritos anteriormente, los siguientes anticuerpos humanizados se prepararon, se expresaron y se purificaron: NEG276, NEG276-LALA, NEG278, NEG310, NEG318, NEG318-LALA, NEG319, NEG313 y NEG315. El marco y los anticuerpos parentales para estos anticuerpos humanizados se muestran en la Tabla 3 y las secuencias de nucleótidos y aminoácidos se muestran en la Tabla 1. Todos los anticuerpos humanizados se prepararon como anticuerpos IgG1 humanos, excepto NEG276-LALA y NEG318-LALA, que se prepararon usando una región Fc modificada (IgG1-LALA humana) en la cual la secuencia Leu234-Leu235 en la cadena pesada se reemplaza por Ala234-Ala235. Se sabe que los anticuerpos IgG1-LALA humanos tienen una función efectora de anticuerpos reducida en comparación con los anticuerpos IgG1 humanos de tipo silvestre.

Tabla 3. Anticuerpos ANGPTL4 humanizados de la invención (NEG276 y NEG276-LALA) y otros anticuerpos ANGPTL4 desvelados.

Ejemplo 7: Ensayo de lipoproteína lipasa humana

Se transfectaron células HEK 293T cultivadas en medio de expresión FreeStyle (Invitrogen) con un plásmido de expresión de mamífero que codifica el polipéptido de lipoproteína lipasa (LPL) humana de longitud completa (secuencia NCBI coincidente NM_000237.2) usando un método de transfección de polietilenimina (PEI) convencional. A las 24 horas después de la transfección, se añadió heparina al medio de cultivo hasta una concentración final de 3 U/ml, para potenciar la liberación de hLPL secretada desde la superficie celular. A las 60 horas después de la transfección, se recogió el medio de cultivo, se filtró usando un filtro de 0,2 |jm y se añadió glicerol hasta una concentración final del 10 % v/v. La solución resultante se cargó en una columna Heparin Sepharose HiTrap (GE) de 5 ml que se había pre-equilibrado con Tampón A (Tris-HCl 50 mM, NaCl 200 mM, glicerol al 10 % v/v, pH 7,2). La columna se lavó con Tampón A y después se eluyó la proteína LPL humana con gradientes por etapas de NaCl 500 mM, NaCl 1 M y NaCl 2 M en Tampón A. La LPL humana más pura y más catalíticamente activa se eluyó en NaCl 2 M. Las alícuotas de LPL humana purificada se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

El siguiente protocolo se usó para evaluar la capacidad de los anticuerpos de bloquear la inhibición de la lipoproteína lipasa humana por ANGPTL4. La placa de ensayo de 384 pocillos (Corning, número de catálogo 3573) y la placa de muestras (Greiner Bio-one, número de catálogo 781201) se lavaron con albúmina de suero bovino (BSA) al 1 % (0,1 ml por pocillo) durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron dos veces con una solución de Tween-20 al 0,05 %.

Se añadió a la placa de muestra anticuerpo ANGPTL4 en HEPES 100 mM, pH 7,0 (20 j l por pocillo, dilución en serie con concentraciones de ensayo finales que varían de 0,02 a 500 nM), seguido de 20 j l de proteína ANGPTL4 humana (concentración de ensayo final 10 nM) en Tampón de ensayo (HEPES 100 mM, MgCh 2 mM, pH 7,0) y la placa se incubó durante 20 min a temperatura ambiente con agitación suave. A continuación, se añadió lipoproteína lipasa diluida en tampón de ensayo (20 j l) y la placa se incubó durante 10 min a temperatura ambiente con agitación suave.

Se preparó una mezcla de enzimas de acoplamiento que contiene acil-coenzima A oxidasa (Sekisui Diagnostics, número de catálogo T-17), acil-coenzima A sintetasa (Sekisui Diagnostics, número de catálogo T-16) y peroxidasa de rábano picante (Sekisui Diagnostics), ATP (Sigma, catálogo número A7699) y coenzima A (MP Biomedicals, número de catálogo 100493) en Tampón de ensayo. Se añadieron perlas de catalasa agarosa (Sigma, número de catálogo C9284) a la mezcla de enzimas de acoplamiento y la mezcla se incubó a 4 °C durante 30 min con agitación y después se retiraron las perlas de catalasa agarosa por centrifugación.

Se diluyó VLDL humana (Millipore, número de catálogo LP1) en tampón de ensayo, se trató con perlas de agarosa catalasa durante 30 min y se retiraron las perlas de la solución por centrifugación. Se añadió rojo Amplex (Invitrogen, número de catálogo A12222) en tampón de ensayo a una concentración de 33 jM .

A la solución en la placa de muestra que contenía LPL, ANGPTL4 y anticuerpo ANGPTL4, se añadió Mezcla enzimática de acoplamiento (20 j l) y se transfirieron 54 j l de la solución resultante a la placa de ensayo. Para iniciar la reacción de lipoproteína lipasa, se añadió una solución de VLDL/Rojo Amplex (18 j l) y se controló continuamente la fluorescencia de la resorufina durante 30 minutos usando un lector de placas de múltiples pocillos EnVision (Perkin Elmer). Las concentraciones finales del ensayo fueron: ANGPTL4 9,4 nM, lipoproteína lipasa humana ~4 nM, VLDL humana 2,3 jg/ml, ATP 0,75 mM, coenzima A 90 jM , ACO 0,5 U/ml, ACS 1,25 U/ml, HRP 1,2 U/ml y Rojo Amplex 10 jM .

Los datos de fluorescencia de resorufina resultante frente al tiempo se usaron para determinar la actividad de la enzima lipoproteína lipasa (velocidad inicial) para cada muestra. Se usaron muestras de control sin LPL (control de fondo) o sin ANGPTL4 o anticuerpos ANGPTL4 (control de actividad de LPL) para normalizar la actividad enzimática, que se expresó como un porcentaje de la actividad de control de LPL. Los datos de la actividad enzimática para diferentes concentraciones de anticuerpo ANGPTL4 se representaron usando el software GraphPad Prism, y los datos se ajustaron para generar un valor de CE50 para el aumento mediado por anticuerpos ANGPTL4 en la actividad de la enzima lipoproteína lipasa. En este ensayo, ANGPTL4 humana a una concentración de 10 nM inhibió normalmente la actividad de LPL en un 70-95 %. Los anticuerpos ANGPTL4 invirtieron de manera dependiente de la dosis la inhibición de LPL por ANGPTL4. Los resultados de CE50 de este ensayo se muestran en la Tabla 4. Los datos representativos de los anticuerpos seleccionados de la invención se muestran en la Figura 1.

Tabla 4. Los anticuerpos ANGPTL4 de la invención (NEG276 y NEG276-LALA) y, como se desvela, bloquean la inhibición d l li r ín li LPL r AN PTL4 h m n .

Ejemplo 8: Preparación de proteínas ANGPTL4 de macaco, de ratón y de rata y ANGPTL3 humana para su uso en la caracterización de anticuerpos

La secuencia de ANGPTL4 de macaco se determinó amplificando la secuencia génica de una biblioteca de ADNc de hígado de macaco (Biochain, número de catálogo C1534149-Cy, lote n.° B409051). Los cebadores 5-UT-Cyno 5'-ATCCCCGCTCCCAGGCTAC-3' (SEQ ID NO: 158) y 3-UT-cyno 5-CAGCAAGGAGTGAAG-CTCCATGCC-3' (SEQ ID NO: 159) se diseñaron basándose en las regiones no traducidas 5' y 3' del ADNc de ANGPTL4 humana (secuencia NCBI NM_139314.2). El producto de PCR purificado en gel se ligó en pCR4-Blunt-TOPO (Life Technologies, número de catálogo K2875-40) y se secuenció. El ADNc de ANGPTL4 de macaco clonado codificaba una proteína de 406 aminoácidos con una homología del 95 % con la ANGPTL4 humana. La secuencia de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 26-406 de ANGPTL4 de macaco se subclonó en el vector de expresión de mamíferos pRS5, para producir el plásmido pRS-IkkcynoANGPTL4(26-406)-FLAG-6HIS-Avi, que tiene una secuencia señal Ikk de 20 aminoácidos, los aminoácidos 26-406 de ANGPTL4 cyno y las etiquetas FLAG, 6h IS y Avi carboxilo-terminales (SEQ ID NO: 160 en la Tabla 5).

La proteína ANGPTL4(26-406)-FLAG-6HIS-Avi de macaco se expresó y se purificó usando métodos similares a los descritos para la proteína ANGPTL4(26-406)-FLAG-6HIS-Avi humana en el Ejemplo 1. Para algunas aplicaciones, la proteína ANGPTL4 de macaco purificada se biotiniló de manera específica de sitio usando una proteína similar a la descrita para la proteína ANGPTL4 humana en el Ejemplo 1. La pureza de la proteína ANGPTL4 de macaco purificada evaluada por SDS-PAGE fue >90 %.

La proteína ANGPTL4(26-161)-FLAG-6HIS-Avi de macaco se preparó usando métodos similares. La secuencia de la proteína ANGPTL4(26-161) cyno codificada por su correspondiente construcción de expresión se muestra en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 161).

La expresión, purificación y biotinilación de ANGPTL4 de ratón (aminoácidos 26-410) y de ANGPTL4 de rata (aminoácidos 24-405) se llevó a cabo usando esencialmente los mismos métodos como se describen para ANGPTL4 humana en el Ejemplo 1, Método 2. Las secuencias de las proteínas ANGPTL4 de ratón y de rata codificadas por las correspondientes construcciones de expresión se muestran en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 162 y 163, respectivamente). La pureza de las proteínas ANGPTL4 de ratón y ANGPTL4 de rata purificadas evaluadas por s Ds -PAGE fue >90 %.

ANGPTL3 (SEQ ID NO: 5, Tabla 1) es una proteína humana que está estrechamente relacionada con ANGPTL4. Para permitir la evaluación de la posible unión de anticuerpos seleccionados a ANGPTL3, una proteína ANGPTL3(14-460)-FLAG-His-Avi humana (SEQ ID NO: 164, Tabla 5), se purificó y se biotiniló usando métodos similares como se describen para ANGPTL4 humana en el Ejemplo 1, Método 2.

Tabla 5. Secuencias de aminoácidos de ANGPTL4(26-406)-FLAG-His6-Avi de macaco, ANGPTL4(26-410)-FLAG-His6-Avi de ratón, ANGPTL4(24-405)-FLAG-His6-Avi de rata y ANGPTL3(17-460)-FLAG-His-Avi humana (los péptidos señal están resaltados subrayando, y la secuencia QP N-terminal después del péptido señal y las secuencias C-terminales FLAG-His6-Avi están resaltadas en cursiva

Ejemplo 9: Caracterización de la especificidad de unión de anticuerpos mediante ensayos ELISA directos

Se realizaron ensayos ELISA directos para caracterizar la especificidad de unión de anticuerpos de anticuerpos seleccionados. El ensayo se realizó como sigue. Se bloqueó una placa Meso Scale Discovery (MSD) recubierta con estreptavidina de 384 pocillos incubando la placa con 50 j l de tampón de bloqueo (PBS, pH 7,4, albúmina de suero bovino al 5 % p/v) por pocillo a 22 °C durante 1 hora con agitación constante (600 rpm). La placa MSD bloqueada se lavó después 3 veces con tampón de lavado (PBS, pH 7,4 y Tween-20 al 0,05 % v/v) usando un lavador de placas (BioTek). Después del lavado, las proteínas ANGPTL4 humanas biotiniladas diluidas en tampón de ensayo (PBS, pH 7,4 sin CaCl2 o MgCh, albúmina de suero bovino al 0,5 % p/v libre de ácidos grasos y Tween-20 al 0,02 % v/v) se inmovilizaron en la superficie mediante incubación a una concentración de 1 nM (15 j l por pocillo) a 22 °C durante una hora: ANGPTL4 humana de longitud completa (hANGPTL4), dominio de hélice superenrollada de ANGPTL4 humana (hANGPTL4-CCD) y ANGPTL3 humana de longitud completa (hANGPTL3). La placa se lavó después 3 veces como se describió anteriormente. Se aplicó después anticuerpo diluido a concentración 1 nM en tampón de ensayo a la placa MSD (15 j l por pocillo) y la placa se incubó durante 1 hora a 22 °C con agitación constante (600 rpm). Los anticuerpos unidos se detectaron añadiendo 15 j l por pocillo de una dilución 1:500 de anti-IgG humana de cabra etiquetada con sulfo. La placa se incubó después durante una hora con agitación constante (600 rpm). La placa se lavó 3 veces y después se añadieron 15 jl/pocillo de tampón de lectura T 1x MSD y la placa se desarrolló usando un Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery). Los datos se transfirieron a Microsoft Excel para su análisis y se representaron usando GraphPad Prism v6. Estos experimentos mostraron que todos los anticuerpos probados en este ensayo se unen a ANGPTL4 humana de longitud completa y al dominio N-terminal de ANGPTL4 humana, y no se unen a ANGPTL3 humana de longitud completa. Se usó un anticuerpo de referencia específico de ANGPTL3 como control positivo para el ensayo de unión de ANGPTL3 (Figura 2).

Ejemplo 10: Determinación de las constantes de disociación de anticuerpos mediante el ensayo de valoración de equilibrio en solución (SET)

Los ensayos SET se realizaron como sigue. En una placa de polipropileno de 96 pocillos, se mezcló una concentración constante de anticuerpo ANGPTL4 (10 pM) con diferentes concentraciones de proteína ANGPTL4 de longitud completa humana, cyno, de ratón o de rata no biotinilada, o proteína de dominio N-terminal de ANGPTL4 humana (dilución en serie de 5 veces que varía de 0,01 pM a 100 nM) en tampón SET (PBS, pH 7,4 sin CaCl2 o MgCh, albúmina de suero bovino al 0,5 % p/v (libre de ácidos grasos) y Tween-20 al 0,02 % v/v). El volumen de reacción final fue de 80 jl. La placa se selló usando una película adhesiva y se incubó a 22 °C durante 14 horas con agitación constante (300 rpm). Durante el mismo período de tiempo, se bloqueó una placa Meso Scale Discovery (MSD) recubierta con estreptavidina de 384 pocillos incubando la placa con 50 j l de tampón de bloqueo (PBS, pH 7,4, albúmina de suero bovino al 5 % p/v) por pocillo a 4 °C. La placa MSD bloqueada se lavó 3 veces con tampón de lavado (PBS, pH 7,4 y Tween-20 al 0,05 % v/v) usando un lavador de placas (BioTek). Se inmovilizó la proteína ANGPTL4 biotinilada (ANGPTL4 humana, cyno, de ratón o de rata de longitud completa, o dominio N-terminal de ANGPTL4 humana) (1 nM, 15 j l por pocillo) en la superficie de la placa MSD recubierta con estreptavidina mediante incubación a 22 °C durante una hora con agitación constante (600 rpm). La placa se lavó después 3 veces como se describió anteriormente.

Las reacciones de unión en equilibrio (15 j l por pocillo) se aplicaron a la placa MSD con ANGPTL4 inmovilizada y se incubaron durante 20 min a 22 °C. El material no unido se retiró lavando la placa 3 veces con tampón de lavado y el anticuerpo capturado se detectó añadiendo 15 j l por pocillo de una dilución 1:500 de IgG antihumana de cabra etiquetada con sulfo (Meso Scale Discovery). La placa se incubó después durante una hora con agitación constante (600 rpm). La placa se lavó 3 veces y después se añadieron 15 jl/pocillo de tampón de lectura T 1x MSD y la placa se desarrolló usando un Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery). Los datos se transfirieron a Microsoft Excel para su análisis y se representaron usando GraphPad Prism v6. Los valores de K^dse determinaron ajustando los datos a la siguiente ecuación:

y = (B^máx/(C^Ab/2))*((C^Ab/2)-((((((C^Ag+C^Ab) K^D)/2)-((((((C^Ag+C^Ab)+K^D)A2)/4)-(C^Ag*C^Ab))A0,5))A2)/(2*C^Ab))),

donde B^máxes la señal cuando no hay proteína ANGPTL4 presente en solución, C^Abes la concentración constante de anticuerpo ANGPTL4 en solución, C^Ages la concentración de ANGPTL4 en solución y K^des la constante de disociación de equilibrio. Las constantes de disociación de equilibrio determinadas usando este método se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Constantes de disociación (Kd) para los anticuerpos de la invención (NEG276 y NEG276-LALA) y, como se des n (SET)

*No se detectó señal de unión con las condiciones experimentales utilizadas, lo que indica un valor de K^d>500 pM. Se determinó un valor de K^dde 517 pM para la unión de un anticuerpo de referencia de ANGPTL4 a ANGPTL4 de rata.

Ejemplo 11: Cinética de unión de anticuerpos y constantes de disociación determinadas por el ensayo de unión cinética de Octet

Las constantes de disociación (K^d) se determinaron para anticuerpos seleccionados usando un ensayo de unión cinética Octet (ForteBio). El tampón cinético ForteBio 10X (ForteBio, número de catálogo 18-5032) se diluyó l0 veces con DPBS (Life Technologies, número de catálogo 14190-136) y la solución resultante se añadió (0,2 ml por pocillo) a una placa de 96 pocillos (Greiner, número de catálogo 65520). Los sensores de estreptavidina (ForteBio, número de catálogo 18-5020) se sumergieron en la solución y se equilibraron durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente. En una segunda placa de 96 pocillos (Greiner, número de catálogo 65520), los sensores se lavaron en tampón cinético 1X y después se sumergieron en 200 ul de ANGPTL4 humana biotinilado 25 nM o una proteína de referencia biotinilada (para sustracción de fondo) durante 1000 s en segundos a temperatura ambiente. Los sensores se lavaron después en tampón cinético 1X durante 120 s y se sumergieron en 200 ul de anticuerpo ANGPTL4 diluido en tampón cinético 1X a diversas concentraciones (diluciones en serie de 2 veces; las concentraciones más altas fueron 12,5 nM o 25 nM; las concentraciones más bajas variaron de 0,8 a 3,1 nM; se usaron 4-6 concentraciones de anticuerpos diferentes para cada determinación de K^d) y la asociación de anticuerpos se monitorizó durante 480 segundos. Los sensores se transfirieron después a un pocillo que contenía 200 ul de tampón cinético 1X y se controló la disociación del anticuerpo durante 1200 segundos. Las curvas de asociación y disociación con corrección de fondo fueron ajustadas globalmente por Octet Software (ForteBio) para generar constantes de velocidad de asociación (k^a) y disociación (k^d), que a su vez se usaron para calcular las constantes de disociación de equilibrio (K^d). Los datos resultantes para los anticuerpos seleccionados se muestran en la Tabla 7 y la Tabla 8.

Tabla 7. Constantes de disociación (Kd) de anticuerpos ANGPTL4(26-406) humanos determinadas por el ensayo de unión cinética ForteBio

*Límite superior informado porque la velocidad de desactivación es más lenta que el límite de detección, que es aproximadamente 5 x 10-6 s-1.

Tabl . n n i i i n K NE 27 -LALA rmin r n ni n in i F r Bio

*Límite superior informado porque la velocidad de disociación es más lenta que el límite de detección, que es aproximadamente 5 x 10-6 s-1. **No se detectó unión a la concentración más alta de anticuerpo probado, 25 nM.

Ejemplo 12: Mapeo de epítopos por intercambio de hidrógeno-deuterio/espectrometría de masas

Se usó intercambio de hidrógeno-deuterio (HDx) en combinación con espectrometría de masas (MS) (Woods, 2001) para mapear el sitio de unión de los anticuerpos NEG276 y NEG318 en el dominio N-terminal de ANGPTL4. En HDx, los hidrógenos de amida intercambiables de las proteínas se reemplazan por deuterio. Este proceso es sensible a la estructura/dinámica de la proteína y la accesibilidad a los disolventes y, por lo tanto, puede informar sobre la unión del ligando. El objetivo de estos experimentos fue la identificación de los epítopos de NEG276 y NEG318 sobre ANGPTL4.

Se realizaron experimentos automatizados de HDx/EM usando métodos similares a los descritos en la bibliografía (Chalmers, 2006). Los experimentos se realizaron en una plataforma Waters HDx-MS, que incluye un automuestreador LEAP, un sistema nanoACQUITY UPLC y un espectrómetro de masas Synapt G2. El tampón de deuterio usado para marcar la estructura de la proteína con deuterio fue D-Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 500 mM, glicerol al 15 % y n-octil p-D-maltósido al 0,1 %; el porcentaje total de deuterio en la solución fue del 82,5 %. Para los experimentos de marcado de deuterio de ANGPTL4(26-161) humana en ausencia de anticuerpo de ANGPTL4, se diluyeron 300 pmol de ANGPTL4(26-161) humana (1,3 |jl) usando 100 |jl de tampón de deuterio en un tubo refrigerado y se incubaron durante 25 minutos en un rotor a 4 °C. A continuación, la reacción de marcado se inactivó con 100 j l de tampón de inactivación enfriado en hielo durante tres minutos. Después de tres minutos, la solución inactivada se inyectó en el sistema CL-EM para la digestión automatizada de pepsina y el análisis de péptidos. Para experimentos de marcaje de deuterio de ANGPTL4(26-161) humana en presencia de anticuerpo ANGPTL4 unido, primero se inmovilizaron 300 pmol del anticuerpo ANGPTL4 en perlas Thermo Protein G Plus y se reticularon usando suberato de disuccinimidilo (DSS). Para realizar los experimentos de marcaje, las perlas de anticuerpo (que contenían 300 pmol de anticuerpo) se incubaron con 300 pmol de ANGPTL4(26-161) humana durante 30 minutos a 4 °C. Después de 30 minutos las perlas se lavaron con 200 j l de tampón Tris. Después se añadieron 200 j l de tampón de deuterio enfriado y el complejo se incubó durante 25 minutos a 4 °C. Después de 25 minutos, la reacción de marcado se inactivó con 125 j l de tampón de inactivación enfriado en hielo durante 2,5 minutos. Después de centrifugar la muestra durante 30 segundos en una centrifugadora, la solución inactivada se inyectó en el sistema CL-EM para la digestión automatizada de pepsina y el análisis de péptidos.

Todas las mediciones se llevaron a cabo usando un mínimo de tres triplicados analíticos. Todos los experimentos de intercambio de deuterio se inactivaron usando TCEP 0,5 M y urea 3 M (pH = 2,5). Después de inactivar, el antígeno intercambiado se sometió a digestión con pepsina en línea usando una columna de pepsina inmovilizada de Poroszyme (2,1 x 30 mm) a 12 °C seguido de captura en una columna de captura Waters Vanguard HSS T3. Los péptidos se eluyeron de la columna de captura y se separaron en una columna Waters CSH C18 1 x 100 mm (mantenida a 1 °C) a un caudal de 40 jl/m in usando un gradiente binario de ocho minutos del 2 al 35 % de B (la fase móvil A era agua al 99,9 % y ácido fórmico al 0,1 %; la fase móvil B era acetonitrilo al 99,9 % y ácido fórmico al 0,1 %).

En estos experimentos de intercambio de deuterio, se detectaron péptidos que cubren el 87 % de la secuencia del dominio N-terminal de ANGPTL4. Los péptidos detectados y la reducción en la incorporación de deuterio para cada péptido se indican en la Tabla 9. El experimento de mapeo HDxMS identificó tres regiones del dominio N-terminal de ANGPTL4 que estaban significativamente protegidas por NEG276 y NEG318: aminoácidos 26-35 (G26PVQSKSPRF35) (SEQ ID NO: 165), aminoácidos 42-68 (N42VLAHGLLQLGQGLREHAERTRSQLSA68) (SEQ ID NO: 174) y aminoácidos 69-95 (L69ERRLSACGSACQTEGSTDLPLAPES95) (SEQ ID NO: 190). La observación de que NEG276 y NEG318 protegen múltiples regiones del dominio N-terminal de ANGPTL4 de la incorporación de deuterio es consistente con los resultados del mapeo de epítopos de péptidos lineales que sugieren que NEG276 y NEG318 tienen epítopos conformacionales en lugar de lineales (véase el Ejemplo 13).

Tabla 9: Efecto de la unión de NEG276 y NEG318 sobre la incorporación de deuterio en ANGPTL4(26-161) humana. Para cada péptido detectado por espectrometría de masas, se muestra la reducción en la incorporación de deuteri n D l n r l m l n i r AN PTL4 n r l i n n AN PTL4 l .

Ejemplo 13: Mapeo de epítopos por unión de péptidos lineales

Se ensayó la capacidad de los anticuerpos seleccionados, a saber, NEG276 y NEG318, de unirse a péptidos lineales de 15 aminoácidos derivados del dominio de hélice superenrollada N-terminal de ANGPTL4 humana. Se sintetizaron y se purificaron un total de 43 péptidos usando métodos convencionales; la secuencia de los péptidos se muestra en la Tabla 10. Los péptidos se inmovilizaron sobre una superficie de vidrio y se evaluó la capacidad de NEG276 y NEG318 de unirse a los péptidos inmovilizados usando métodos experimentales optimizados para el mapeo de epítopos de péptidos lineales en j Pt Peptide Technologies (Berlín, Alemania). Se usó un anticuerpo que no se une a ANGPTL4 como control para la unión no específica. En estos experimentos no se observó unión específica de NEG276 o NEG318 a ninguno de los 43 péptidos de 15-meros. Estos resultados sugieren fuertemente que los epítopos de NEG276 y NEG318 no son péptidos ANGPTL4 lineales, sino que son epítopos conformacionales.

Tabla 10. Secuencias de péptidos lineales derivados de ANGPTL4 usados para experimentos de unión de péptidos.

Ejemplo 14: Efecto de los anticuerpos de ANGPTL4 de la invención (NEG276 y NEG276-LALA) y como se desvela sobre las concentraciones de triglicéridos en plasma en ratones transgénicos de ANGPTL4 humana

Se fabricó una construcción para expresar ANGPTL4 humana transgénica en ratones insertando la secuencia de ADNc de ANGPTL4 humana de longitud completa en la región polienlazadora del vector pLIVLE6, que contiene el promotor del gen de la apolipoproteína E humana y su región de control hepático. Se generaron ratones transgénicos ANGPTL4 sobre un fondo C57BL/6J y se criaron en Novartis (East Hanover, NJ). Se cortó la cola de los ratones transgénicos a los 7 días de edad y se extrajo el ADN de las colas usando un kit de PCR de tejido REDExtract-N-Amp (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO; n.° de cat XNATR). El transgén de ANGPTL4 humana se detectó usando pares de cebadores que se dirigen al vector pLIVLE6 y que se dirigen al ADNc de ANGPTL4. Los ratones se alojaron en jaulas de fondo sólido en una rejilla equipada para proporcionar automáticamente agua a discreción, se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (6 am a 6 pm) y se les dio pienso convencional para roedores (Harlan-Teklad; Frederick, MD; n.° de cat 8604). El terrario se mantuvo entre 20-24,4 °C (68-76 °F) con 30-70 % de humedad. Los ratones se alojaron con compañeros de camada y recibieron comida y agua a discreción durante el estudio, excepto por ayunos de 4 horas antes de la recolección de la muestra.

Los animales se mantuvieron en ayunas durante 4 horas y se anestesiaron brevemente para la extracción de sangre submandibular a fin de medir las concentraciones de triglicéridos plasmáticos iniciales. A continuación, se inyectaron los ratones por vía intraperitoneal (i.p.) con 30 mg/kg de anticuerpo diluido en PBS (volumen de inyección de 10 ml/kg). Se recogió sangre después de 4 horas de ayuno en los días 1, 2 y 5 después de la dosis para medir los triglicéridos en plasma y las concentraciones de IgG humana total. La sangre se recogió en tubos colectores/separadores BD Microtainer con e Dt A (Becton, Dickinson, and Company; Franklin Lakes, NJ, número de catálogo 365973). Las muestras se centrifugaron durante 10 min a 20.817 x g y el plasma se transfirió a un tubo Thermo-strip de 0,2 ml (Thermo-Scientific; Pittsburg, PA; n.° de cat AB 0451) y se congeló y se almacenó a -80 °C.

Las concentraciones de triglicéridos en plasma se midieron usando el conjunto de reactivos líquidos de triglicéridos (GPO) (Pointe Scientific, Canton, MI, número de catálogo T7532-500). En resumen, se añadieron 300 |jl de reactivo de ensayo, precalentado a 37 °C, a 5 j l de plasma en una placa transparente de 96 pocillos de fondo plano (Thermo Scientific, número de catálogo 269620). La placa se mezcló en un agitador de placas durante 30 segundos y después se colocó en una incubadora a 37 °C durante 5 min. Después de una mezcla de 20 s, se midió la absorbancia a 500 nm usando un lector de placas Molecular Devices SPECTRAmax PLUS. Las concentraciones de triglicéridos se calcularon usando una curva de calibrado generada usando cantidades conocidas de un patrón de triglicéridos (Pointe Scientific, número de catálogo T7531-STD).

Los anticuerpos NEG276 y NEG318 redujeron ambos los niveles de triglicéridos en plasma cuando se administraron a ratones transgénicos de ANGPTL4 humana (Figura 3).

Ejemplo 15: Efectos de la administración de uno de los anticuerpos ANGPTL4 de la invención (NEG276 y NEG276-LALA) y, como se desvela, a macacos obesos, diabéticos, hipertrigliceridémicos

Para evaluar el perfil farmacocinético y los efectos farmacológicos de NEG276-LALA, los presentes inventores administraron una dosis única subcutánea de 3 mg/kg a cuatro macacos hipertrigliceridémicos. Los monos usados en este estudio tenían niveles basales de triglicéridos en plasma que variaban de 207 mg/dl a 2438 mg/dl. En diversos puntos de tiempo durante 5 semanas después de la dosificación de NEG276-LALA, se recolectaron muestras de plasma (se extrajeron muestras de sangre de los animales antes de la alimentación matutina, pero los animales no se mantuvieron en ayunas durante la noche).

Las concentraciones en plasma totales de NEG276-LALA se determinaron mediante métodos convencionales. NEG276-LALA alcanzó una concentración en plasma máxima promedio (Cmáx) de 15.536 ± 2281 ng/ml 3 días después de la dosis. El día 21 después de la dosis, la concentración en plasma promedio de NEG276-LALA fue de 2663 ng/ml (Figura 4).

Las concentraciones en plasma de TG, colesterol total, colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL), apolipoproteína B total (apoB) y apolipoproteína CIII (apoCIII) se determinaron usando kits de ensayo disponibles en el mercado (TG: Conjunto de reactivos líquidos de triglicéridos (GPO), Pointe Scientific, número de catálogo T7532-500; colesterol total: Conjunto de reactivos de colesterol, Pointe Scientific, número de catálogo C7510-500; HDL: Reactivo de precipitación de colesterol del kit de reactivos HDL manual, Wako, número de catálogo 431-52501; ApoB total: K-Assay Apo B, Kamiya Biomedical Company, número de catálogo KAI-004; ApoC-III: Reactivo de ensayo ApoC-III, Randox, número de catálogo LP-3865).

La administración de NEG276-LALA dio como resultado una marcada disminución de los niveles de triglicéridos (TG) en plasma. Se observó una disminución máxima de los TG en plasma el día 7 después de la dosificación; en este momento, las concentraciones de TG en plasma eran un 58 % más bajas que los niveles basales de TG en plasma.

Después de que se produjera la disminución máxima de TG en el día 7 posterior a la dosis, las concentraciones de TG en plasma permanecieron suprimidas en más del 40 % en relación con las concentraciones iniciales hasta el día 21 posterior a la dosis, después regresaron al valor inicial (Figura 5). Además de su efecto sobre los TG en plasma, la administración de NEG276-LALA redujo las concentraciones de colesterol total en plasma en aproximadamente un 30 % con respecto al valor inicial (Figura 6) y aumentó las concentraciones de colestero1HDL en más del 20 % desde el valor inicial en los días 7 a 21 posteriores a la dosificación (Figura 7). Además, se observó una disminución de aproximadamente un 30 % en las concentraciones de apoB total en plasma en los días 7 a 21 posteriores a la dosis (Figura 8) y una disminución de aproximadamente un 25 % en las concentraciones de apoC-III en plasma con respecto al valor inicial los días 7 a 21 (Figura 9). Los presentes inventores también evaluaron el efecto de la administración de NEG276-LALA sobre los niveles de colesterol y triglicéridos asociados a las lipoproteínas mediante la separación de los componentes de las lipoproteínas mediante métodos convencionales de cromatografía de exclusión por tamaño. La comparación de los datos del perfil de lipoproteínas para las muestras antes de la dosis (día 0) y el día 7 después de la dosis mostró que la administración de NEG276-LALA dio como resultado una marcada disminución en las concentraciones de colesterol y triglicéridos asociados a las lipoproteínas ricas en triglicéridos (TRL) (los resultados de un mono se muestran en la Figura 10 y la Figura 11).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a ANGPTL4 humana, que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y que comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.

2. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 28.

3. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 25.

4. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, que tiene una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 28 y que tiene una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 25.

5. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 28.

6. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.

7. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 28 y que tiene una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.

8. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8 para su uso en un método de tratamiento de un trastorno de ANGPTL4 seleccionado de uno o más de los siguientes hipertrigliceridemia grave con concentración de triglicéridos en plasma >500 mg/dl, hipertrigliceridemia asociada a obesidad, hipertrigliceridemia tipo V, quilomicronemia, dislipidemia primaria, síndrome metabólico y diabetes tipo 2.

10. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica uno cualquiera de los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

11. Un vector de expresión que comprende una o más secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Una célula hospedadora que comprende uno o más vectores de expresión de acuerdo con la reivindicación 11.