JP2024026226A - アンジオポエチン様４抗体および使用法 - Google Patents

アンジオポエチン様４抗体および使用法 Download PDF

Info

Publication number
JP2024026226A
JP2024026226A JP2023202489A JP2023202489A JP2024026226A JP 2024026226 A JP2024026226 A JP 2024026226A JP 2023202489 A JP2023202489 A JP 2023202489A JP 2023202489 A JP2023202489 A JP 2023202489A JP 2024026226 A JP2024026226 A JP 2024026226A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
chain variable
antibody
variable region
cdr1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023202489A
Other languages
English (en)
Inventor
トラウガー，ジョン
イゴレビッチ ボズネセンスキ，アンドレイ
スプラウスキ，イゴール
セベ，レギス
Original Assignee
ノバルティス アーゲー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ノバルティス アーゲー filed Critical ノバルティス アーゲー
Publication of JP2024026226A publication Critical patent/JP2024026226A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

【課題】ヒトアンジオポエチン様４タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）に結合する単離抗体または断片、ならびに該単離抗体または断片を含む医薬組成物を提供する。【解決手段】単離抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその断片であって、ＬＰＬのＡＮＧＰＴＬ４タンパク質への結合を遮断する、または、ＦｏｒｔｅＢｉｏ動態結合アッセイにより測定される４５ｐＭ以下のＫＤまたは溶液平衡滴定アッセイにより測定される２４ｐＭ以下のＫＤで、ヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に結合する、単離抗体または断片、ならびに、該単離抗体または断片を含む医薬組成物を提供する。【選択図】なし

Description

発明の背景
アンジオポエチン様４タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）とは、分泌タンパク質のアンジオ
ポエチン様ファミリーのメンバーである。ＡＮＧＰＴＬ４は、二量体および四量体を形成
することが可能なホモオリゴマータンパク質であって、マクロファージ、脂肪、筋肉、お
よび肝細胞を含む細胞型によって発現するホモオリゴマータンパク質である。ＡＮＧＰＴ
Ｌ４はまた、肝臓フィブリノーゲン／アンジオポエチン関連タンパク質（ＨＦＡＲＰ）（
Kim et al. (2000) Biochem. J. 346:603-610）、ＰＰＡＲガンマアンジオポエチン関連
タンパク質（ＰＧＡＲ）（Yoon, et al. (2000) Mol. Cell Biol., 20:5343-5349）、お
よび空腹誘導性脂肪細胞因子（ＦＩＡＦ）（Kerten et al. (2000) J. Biol. Chem., 275
:28488-28493）としても公知である。ＡＮＧＰＴＬ４は、Ｎ末端のコイルドコイルドメイ
ンと、Ｃ末端のフィブリノーゲン（ＦＢＮ）様ドメインとを含有する（Kim et al. (2000
) Biochem. J. 346:603-610）。
リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）は、血中のリポタンパク質レベルの維持を含み、そ
の活性の組織特異的調節を介するリポタンパク質代謝において、中心的な役割を果たす。
ＡＮＧＰＴＬ４のコイルドコイル領域は、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）に媒介され
るトリグリセリド（ＴＧ）クリアランスを阻害することが公知である。したがって、ＡＮ
ＧＰＴＬ４の機能喪失突然変異（例えば、ヒト対象において見られる）、遺伝子の欠失（
例えば、トランスジェニックマウスにおいて見られる）、および抗体による阻害（例えば
、マウスおよびカニクイザルにおいて見られる）は全て、血漿トリグリセリドを減少させ
ることが観察されている。さらに、ＡＮＧＰＴＬ４抗体はまた、ＬＰＬを活性化させるこ
とが公知でもある。逆に、ＡＮＧＰＴＬ４の、マウスへの注射は、循環トリグリセリドの
急速な増大をもたらし、この速度は、アンジオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３
）を注射した場合より大きい（Yoshida et al. (2002) J Lipid Res 43:1770-1772）。
本発明で記載される抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体および抗原結合性断片は、例えば、ＡＮＧＰ
ＴＬ４によるＬＰＬの阻害を遮断し、これにより、血漿トリグリセリドを減少させること
により、ＬＰＬの活性化を開始、促進、または増強する。これらの抗体は、トリグリセリ
ドレベルの上昇を特徴とする疾患、例えば、原発性脂質異常症（primary dyslipidemia）
、高トリグリセリド血症、メタボリックシンドローム、ＩＩ型糖尿病などの、急性症状お
よび慢性症状を防止および改善することが期待される。
発明の要旨
本発明は、ヒトアンジオポエチン様４タンパク質（以下、場合によって、「ＡＮＧＰＴ
Ｌ４」と称する）に結合するモノクローナル抗体、ならびにこれを含む医薬組成物および
処置方法に関する。
本明細書で記載される単離抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体または抗原結合性断片は、１００ｐＭ
以下の平衡解離定数（ＫＤ）で、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する。例えば、本明細書で記載さ
れる単離抗体または抗原結合性断片は、１５０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、
７５０ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、
２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、７５ｐＭ以下、６５ｐＭ以下、６０ｐＭ以下、５５ｐ
Ｍ以下のＫＤで、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合しうる。より具体的には、本明細書で記載さ
れる単離抗体または抗原結合性断片はまた、ＦｏｒｔｅＢｉｏ動態結合アッセイにより測
定される４５ｐＭ以下のＫＤ、または溶液平衡滴定アッセイ（ＳＥＴ）により測定される
２４ｐＭ以下のＫＤで、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合することも可能であり、また、Ｆｏｒ
ｔｅＢｉｏ動態結合アッセイにより測定される８７ｐＭ以下のＫＤ、またはＳＥＴにより
測定される２２ｐＭ以下のＫＤで、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４にも結合しうる。
本発明は、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片に関す
る。本発明はまた、ＡＮＧＰＴＬ４に結合し、表１に記載されている抗体との結合につい
てさらに競合する、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明はまた、表１
に記載されている抗体と同じエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片に
もさらに関する。
本明細書で記載される単離抗体および抗原結合性断片の結合アフィニティーは、溶解平
衡滴定（ＳＥＴ）により決定することができる。当技術分野では、ＳＥＴ法が知られてお
り、以下でさらに詳細に記載される。代替的に、本明細書で記載される単離抗体または断
片の結合アフィニティーは、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにより決定することもできる。当技
術分野では、Ｂｉａｃｏｒｅ反応速度アッセイ法が知られており、以下でさらに詳細に記
載される。
本明細書で記載される単離抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体および抗原結合性断片を使用して、１
００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、３５ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または３ｎ
Ｍ以下のＥＣ５０で、ＡＮＧＰＴＬ４の、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）への結合を
阻害することができる。
単離抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその抗原結合性断片を使用して、循環トリグリセリド
（ＴＧ）レベルを低減することができる。
本明細書で記載される単離抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそれらの抗原結合性断片は、モ
ノクローナル抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ
ｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはｓｃＦｖ断片、および／またはＩｇＧアイソタイプ
でありうる。
本明細書で記載される単離抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそれらの抗原結合性断片はまた
、アミノ酸が、ヒトＶＨ生殖細胞系列配列またはヒトＶＬ生殖細胞系列配列のそれぞれに
由来する抗体フレームワークへと置換されたフレームワークも含みうる。
本発明の別の態様は、表１に記載されているヒト化抗体の完全重鎖および軽鎖配列を有
する単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。より具体的には、単離抗体またはその抗
原結合性断片は、ＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０
、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、ＮＥＧ３１９の重鎖および軽鎖配列を有
しうる。
本発明のさらなる態様は、表１に記載されているヒト化抗体の重鎖および軽鎖可変ドメ
イン配列を有する単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。より具体的には、単離抗体
またはその抗原結合性断片は、ＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、
ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、ＮＥＧ３１９の重鎖および
軽鎖可変ドメイン配列を有しうる。
本発明はまた、配列番号７、３２、５２、７２、９２、１１２、および１３２からなる
群から選択される重鎖ＣＤＲ１、配列番号８、３３、５３、７３、９３、１１３、および
１３３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号９、３４、５４、７４
、９４、１１４、および１３４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含み、ヒトＡＮ
ＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。別の態様では、こ
のような単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１７、４２、６２、８２、１０
２、１２２、および１４２からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８、４３
、６３、８３、１０３、１２３、および１４３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、
ならびに配列番号１９、４４、６４、８４、１０４、１２４、および１４４からなる群か
ら選択される軽鎖ＣＤＲ３をさらに含む。
本発明はまた、配列番号１７、４２、６２、８２、１０２、１２２、および１４２から
なる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８、４３、６３、８３、１０３、１２３
、および１４３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号１９、４４、
６４、８４、１０４、１２４、および１４４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含
み、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
本発明はまた、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって
、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およ
びＬＣＤＲ３を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号７、８、
および９を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号１７、１８、および
１９を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号３２、３
３、および３４を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号４２、４３、
および４４を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号５
２、５３、および５４を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号６２、
６３、および６４を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列
番号７２、７３、および７４を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号
８２、８３、および８４を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が
、配列番号９２、９３、および９４を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配
列番号１０２、１０３、および１０４を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、および
ＨＣＤＲ３が、配列番号１１２、１１３、および１１４を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２
、ＬＣＤＲ３が、配列番号１２２、１２３、および１２４を含むか；またはＨＣＤＲ１、
ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号１３２、１３３、および１３４を含み、ＬＣ
ＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号１４２、１４３、および１４４を含む、単
離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
本発明はまた、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定される、配列番号１３、３８、５８、７８、
９８、１１８、および１３８の重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣ
ＤＲ３、ならびに配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８の軽
鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有する抗体または抗原結
合性断片にも関する。本発明の別の態様では、抗体または抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔ
により規定される、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８の重
鎖可変ドメイン配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号２
３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８の軽鎖可変ドメイン配列のＬＣＤ
Ｒ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有しうる。
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１３、３８、５
８、７８、９８、１１８、および１３８からなる群から選択される重鎖可変ドメイン配列
を含む。単離抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変ドメイン配列をさらに含むことが可
能であり、この場合、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとは、組み合わさって、ＡＮ
ＧＰＴＬ４に対する抗原結合性部位を形成する。特に、軽鎖可変ドメイン配列は、配列番
号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８から選択することができ、こ
の場合、前記単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する。
本発明はまた、配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８から
なる群から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含み、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体
またはその抗原結合性断片にも関する。単離抗体または抗原結合性断片は、重鎖可変ドメ
イン配列をさらに含むことが可能であり、この場合、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメイ
ンとは、組み合わさって、ＡＮＧＰＴＬ４に対する抗原結合性部位を形成する。
特に、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１３
および２３；３８および４８；５８および６８；７８および８８；９８および１０８；１
１８および１２８；または１３８および１４８、の配列をそれぞれ含む、重鎖および軽鎖
可変ドメインを有しうる。
本発明はさらに、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８から
なる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを
含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、ＡＮＧＰＴＬ
４に結合する。一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片はまた、配列番号２３、
４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８からなる群から選択される配列と少な
くとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインも含む。本発明のさらなる態様では
、単離抗体または抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔにより規定され、表１に記載されている
、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を
有する。
本発明はまた、配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８から
なる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを
有する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、ＡＮＧＰＴ
Ｌ４に結合する。
本発明の別の態様では、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片
は、配列番号１５、２８、４０、６０、８０、１００、１２０、および１４０の配列を含
む重鎖を有しうる。単離抗体はまた、重鎖と組み合わさって、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に対す
る抗原結合性部位を形成しうる軽鎖も含みうる。特に、軽鎖は、配列番号２５、５０、７
０、９０、１１０、１３０、および１５０を含む配列を有しうる。特に、ＡＮＧＰＴＬ４
に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１５および２５；２８および
２５；４０および５０；６０および７０；８０および９０；１００および１１０；１２０
および１３０；または１４０および１５０、のそれぞれの配列を含む重鎖および軽鎖を有
しうる。
本発明はなおさらに、配列番号１５、２８、４０、６０、８０、１００、１２０、およ
び１４０からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖を
含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、ＡＮＧＰＴＬ
４に結合する。一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片はまた、配列番号２５、
５０、７０、９０、１１０、１３０、および１５０からなる群から選択される配列と少な
くとも９０％の配列同一性を有する軽鎖も含む。
本発明はなおさらに、配列番号２５、５０、７０、９０、１１０、１３０、および１５
０からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖を含む単
離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４に結
合する。
本発明はなおさらに、結合について、本明細書で記載される抗体または抗原結合性断片
、例えば、ヒト化抗体であるＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、Ｎ
ＥＧ３１０、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、およびＮＥＧ３１９と競合す
る、単離抗体または抗原結合性断片にも関する。一実施形態では、２つの抗体または抗原
結合性断片が、等モル濃度で存在する場合、本発明の単離抗体または抗原結合性断片は、
ＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１３、
ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、およびＮＥＧ３１９から選択されるヒト化抗体によるＡＮ
ＧＰＴＬ４の結合を、５０％を超えて阻害することが可能である。
別の実施形態では、２つの抗体または抗原結合性断片が、等モル濃度で存在する場合、
本発明の単離抗体または抗原結合性断片は、ＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ、Ｎ
ＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、およびＮＥＧ
３１９から選択されるヒト化抗体によるＡＮＧＰＴＬ４の結合を、８０％を超えて阻害す
ることが可能である。さらに他の実施形態では、２つの抗体または抗原結合性断片が、等
モル濃度で存在する場合、本発明の単離抗体または抗原結合性断片は、ＮＥＧ２７６、Ｎ
ＥＧ２７６－ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、Ｎ
ＥＧ３１８、およびＮＥＧ３１９から選択されるヒト化抗体によるＡＮＧＰＴＬ４の結合
を、８５％（または９０％、９５％、９８％、または９９％）を超えて阻害することが可
能である。
本発明はまた、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物
にも関する。本発明は同様に、医薬的に許容される担体と組み合わせた抗体組成物にも関
する。具体的に、本発明はさらに、例えば、ヒト化抗体であるＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７
６－ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１
８、ＮＥＧ３１９など、表１の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物を含む。
本発明はまた、表１の単離抗体またはそれらの抗原結合性断片のうちの２つ以上の組合せ
を含む医薬組成物にも関する。
本発明はまた、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８から選
択される配列を有する、重鎖可変ドメインをコードする単離核酸配列にも関する。特に、
核酸は、配列番号１４、２７、３９、５９、７９、９９、１１９、および１３９からなる
群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性の配列（a sequence at least 90
% sequence identity）を有する。本発明のさらなる態様では、配列は、配列番号１４、
２７、３９、５９、７９、９９、１１９、または１３９である。
本発明はまた、配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８から
選択される配列を有する軽鎖可変ドメインをコードする単離核酸配列にも関する。特に、
核酸は、配列番号２４、３１、４９、６９、８９、１０９、１２９、および１４９からな
る群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性の配列（a sequence at least
90% sequence identity）を有する。本発明のさらなる態様では、配列は、配列番号２４
、３１、４９、６９、８９、１０９、１２９、または１４９である。
本発明はまた、配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８から
なる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを
含むポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸にも関する。
本発明はまた、本明細書で記載される核酸分子のうちの１つまたは複数を含むベクター
にも関する。
本発明はまた、上記で記載した抗体の重鎖をコードする組換えＤＮＡ配列と、上記で記
載した抗体の軽鎖をコードする第２の組換えＤＮＡ配列とを含む単離宿主細胞にも関し、
この場合、前記ＤＮＡ配列は、プロモーターに作動可能に連結され、宿主細胞内で発現す
ることが可能である。抗体は、ヒト化抗体でありうることが企図される。また、宿主細胞
は、非ヒト哺乳動物細胞であることも企図される。
細胞は、ヒト細胞であることが企図される。細胞は、対象中にあることがさらに企図さ
れる。一実施形態では、細胞は、内皮細胞であることが企図される。他の実施形態では、
細胞は、脂肪、筋肉、および肝細胞のうちの１つまたは複数でありうる。対象は、ヒトで
あることがなおさらに企図される。
本発明はまた、患者におけるＡＮＧＰＴＬ４関連障害を処置、改善、または防止する方
法であって、患者へと、有効量の、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片
を含む組成物を投与するステップを含む、方法にも関する。一態様では、ＡＮＧＰＴＬ４
関連障害は、高トリグリセリド血症（例えば、重度の高トリグリセリド血症（例えば、血
漿トリグリセリド濃度が＞５００ｍｇ／ｄＬである）、肥満と関連する高トリグリセリド
血症、およびＶ型高トリグリセリド血症）と関連する。他の態様では、ＡＮＧＰＴＬ４関
連障害は、原発性脂質異常症、メタボリックシンドローム、ＩＩ型糖尿病と関連する。患
者は、ヒトであることも企図される。
前出の単離抗体またはそれらの抗原結合性断片のうちのいずれも、モノクローナル抗体
またはその抗原結合性断片でありうる。
定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本
発明が関する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
「ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質」または「ＡＮＧＰＴＬ４抗原」または「ＡＮＧＰＴＬ４
」という用語は、互換的に使用され、異なる種におけるアンジオポエチン様４（ＡＮＧＰ
ＴＬ４）タンパク質を指す。例えば、ヒトＡＮＧＰＴＬ４は、表１（配列番号１）に示さ
れる配列を有し、先行の報告および文献（Nature, Vol. 386, p. 73-77, 1997；Genomics
, Vol. 54, No. 2, p. 191-199, 1998；Biochem. J., Vol. 339, Part 1, P. 177-184, 1
999；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ００２５３４）において記載されている。ＡＮＧＰ
ＴＬ４は、Ｎ末端のコイルドコイルドメインと、Ｃ末端のフィブリノーゲン（ＦＢＮ）様
ドメインとを含有する（Kim et al. (2000) Biochem. J. 346:603-610）。ＡＮＧＰＴＬ
４は、二量体および四量体を形成することが可能なホモオリゴマータンパク質であって、
マクロファージ、脂肪、筋肉、および肝細胞を含む細胞型によって発現し、リポタンパク
質リパーゼ（ＬＰＬ）に媒介されるトリグリセリド（ＴＧ）クリアランスを阻害すること
が公知の、ホモオリゴマータンパク質である。
加えて、本発明の文脈では、「ＡＮＧＰＴＬ４」という用語は、天然のアンジオポエチ
ン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）タンパク質の突然変異体であって、上述の報告において記載さ
れている、天然の一次構造（アミノ酸配列）のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列
を有する、突然変異体を含む。本明細書では、「実質的に同じアミノ酸配列を有する、天
然のヒトアンジオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）タンパク質の突然変異体」という用語
は、このような突然変異体のタンパク質を指す。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、全抗体および任意の抗原結合性断片（す
なわち、「抗原結合性部分」）またはそれらの単鎖体を意味する。全抗体は、ジスルフィ
ド結合により相互接続される少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む
糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＶＨと略記する）および
重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣ
Ｈ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＶＬと略記する）および軽鎖定常
領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬを含む。ＶＨ領域およびＶＬ領
域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称するより保存的な領域を散在させた、相補性決定
領域（ＣＤＲ）と称する超可変性の領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよび
各ＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、以下の順序で配置される３つのＣＤＲお
よび４つのＦＲ：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４から
なる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。抗
体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または免疫系の多様な細胞（例えば、エフ
ェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への結合を媒介し
うる。
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合性部分」または「抗原結合性断片」という用
語は、所与の抗原（例えば、ヒト酸化ＬＤＬ受容体（ＡＮＧＰＴＬ４））に特異的に結合
する能力を保持する、インタクトな抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合
性機能は、インタクトな抗体の断片により果たされうる。抗体の抗原結合性部分または抗
原結合性断片という用語内に包含される結合性断片の例は、Ｆａｂ断片、ＶＬドメイン、
ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片；ヒンジ領域にお
いてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ
）２断片；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームの
ＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインまたはＶＬドメインか
らなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；な
らびに単離相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬドメインおよびＶＨドメインは、個別の
遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用して、それらを単一のタンパク質鎖として
作製することを可能とする人工のペプチドリンカーにより付着することができ、この場合
、ＶＬ領域およびＶＨ領域は、対合して一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知であ
り、例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426；およびHuston et al., 1988 Pro
c. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照されたい）を形成する。このような単鎖抗体は
、抗体の１つまたは複数の抗原結合性部分または抗原結合性断片を含む。これらの抗体断
片は、当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、断片も、インタクトな抗体と同じ形
で有用性についてスクリーニングされる。
抗原結合性断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボデ
ィ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ、およびｂｉｓ－ｓｃＦｖ
（例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136を参
照されたい）へと組み込むこともできる。抗体の抗原結合性部分は、ＩＩＩ型フィブロネ
クチン（Ｆｎ３）などのポリペプチド（フィブロネクチンポリペプチドモノボディについ
て記載する米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）に基づく足場へとグ
ラフトすることができる。
抗原結合性断片は、相補的な軽鎖ポリペプチドと併せて抗原結合性領域の対を形成する
、タンデムＦｖセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）の対を含む単鎖分子へと組み
込むことができる（Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062；および米国特
許第５，６４１，８７０号明細書）。
本明細書で使用される「アフィニティー」という用語は、単一の抗原性部位における抗
体と抗原との間の相互作用の強度を指す。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変領
域は、多数の部位において、弱い非共有結合的力を介して抗原と相互作用し、相互作用が
大きいほど、アフィニティーは強くなる。抗体またはその抗原結合性断片（例えば、Ｆａ
ｂ断片）について本明細書で使用される「高アフィニティー」という用語は一般に、ＫＤ
が１０－９Ｍ以下の抗体または抗原結合性断片を指す。
「アミノ酸」という用語は、自然発生のアミノ酸および合成アミノ酸のほか、自然発生
のアミノ酸と同様の形で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体も指す。自然発生
のアミノ酸とは、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸のほか、後で修飾されたアミ
ノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、およびＯ－ホスホセ
リンでもある。アミノ酸類似体とは、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわ
ち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン
、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合したアルファ炭素を有
する化合物を指す。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾
ペプチド骨格を有するが、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ
酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、自然発生のアミノ
酸と同様の形で機能する化学化合物を指す。
本明細書で使用される「結合特異性」という用語は、１つの抗原決定基だけと反応する
個別の抗原結合部位の能力を指す。
抗体（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体）に「特異的に（または選択的に）結合する
」という語句は、タンパク質および他の生体物質の異質な集団内のコグネイト抗原（例え
ば、ヒトＡＮＧＰＴＬ４またはカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４）の存在を決定する結合反応
を指す。本明細書では、「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語
句が、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。
「ＡＮＧＰＴＬ４に媒介された」という用語は、ＡＮＧＰＴＬ４は、リポタンパク質リ
パーゼ（ＬＰＬ）に媒介されるトリグリセリド（ＴＧ）クリアランスを阻害し、これによ
り、トリグリセリドレベルを上昇させることが公知であるという事実を指す。
本明細書で使用される「ＡＮＧＰＴＬ４関連障害」、「ＡＮＧＰＴＬ４関連状態」、ま
たは類似の用語は、ＡＮＧＰＴＬ４ＡＮＧＰＴＬ４ ＡＮＧＰＴＬ４に媒介されるＬ
ＰＬの阻害の低減およびリポタンパク質のモジュレーションが求められる、任意の数の状
態または疾患を指す（any number of conditions or diseases in which ANGPTL4ANGPTL4
a reduction of ANGPTL4-mediated LPL inhibition and lipoprotein modulation is so
ught）。これらの状態は、高脂血症、高リポタンパク血症、および脂質異常症など、脂質
代謝に関与する状態であって、アテローム性脂質異常症、糖尿病性脂質異常症、高トリグ
リセリド血症（例えば、重度の高トリグリセリド血症（例えば、血漿トリグリセリド濃度
が＞５００ｍｇ／ｄＬである）、肥満と関連する高トリグリセリド血症、およびＶ型高ト
リグリセリド血症）、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、混合型脂質異常症（
肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病など）、リポジストロフィー、脂肪萎縮症、な
らびに、例えば、ＬＰＬ活性の低下および／またはＬＰＬの欠損、ＬＤＬ受容体の活性の
低下および／またはＬＤＬ受容体の欠損、ＡｐｏＣ２の改変、ＡｐｏＥの欠損、ＡｐｏＢ
の増大、極低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の産生の増大および／またはＶＬＤＬの消
失の減少、ある種の薬物処置（例えば、グルココルチコイド処置に誘導される脂質異常症
）、任意の遺伝的素因、食餌、生活様式などにより引き起こされる他の状態を含む、状態
を含むがこれらに限定されない。
高脂血症、高リポタンパク血症、および／または脂質異常症と関連するか、またはこれ
らから生じる、他のＡＮＧＰＴＬ４関連疾患または障害は、アテローム性動脈硬化、動脈
瘤、高血圧症、狭心症、脳卒中、脳血管疾患、うっ血性心不全、冠動脈疾患、心筋梗塞、
末梢血管疾患などの心血管疾患または障害；急性膵炎；非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡ
ＳＨ）；糖尿病などの血糖障害；肥満などを含むがこれらに限定されない。
「キメラ抗体」という用語は、（ａ）抗原結合性部位（可変領域）を、クラス、エフェ
クター機能、および／もしくは種が異なるか、またはクラス、エフェクター機能、および
／もしくは種を改変された定常領域、あるいはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異
なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などへと連結するように、定
常領域またはその一部を、改変するか、置きかえるか、または交換した抗体分子；あるい
は（ｂ）可変領域またはその一部を、抗原特異性が異なるか、または抗原特異性を改変さ
れた可変領域により改変するか、置きかえるか、またはこれと交換した抗体分子である。
例えば、マウス抗体は、その定常領域を、ヒト免疫グロブリンに由来する定常領域で置き
かえることにより修飾することができる。ヒト定常領域による置きかえに起因して、キメ
ラ抗体は、ヒトにおける抗原性を、元のマウス抗体と比較して低減しながら、抗原の認識
におけるその特異性を保持しうる。
「保存的に修飾された変異体」という用語は、アミノ酸配列および核酸配列のいずれに
も適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一なアミノ
酸配列もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配
列をコードしない場合は、本質的に同一な配列を指す。遺伝子コードの縮重性のために、
多数の機能的に同一な核酸が、所与の任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンで
あるＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵのいずれも、アミノ酸であるアラニンをコー
ドする。したがって、アラニンがコドンにより指定されるあらゆる位置で、コードされる
ポリペプチドを改変せずに、コドンを、記載された対応するコドンのうちのいずれかへと
改変することができる。このような核酸変異は、保存的に修飾された変異のうちの１種で
ある「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書のあらゆる核酸配
列はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変異についても記載する。当業者は、核酸内
の各コドン（通常メチオニンだけのコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンだけ
のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一な分子をもたらしうることを認
識するであろう。したがって、記載される各配列内では、ポリペプチドをコードする核酸
の各サイレント変異が含意されている。
ポリペプチド配列では、「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸の、化学的に類似
するアミノ酸による置換を結果としてもたらす、ポリペプチド配列への個別の置換、欠失
、または付加を含む。当技術分野では、機能的に類似するアミノ酸を提示する保存的置換
表が周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間相
同体、および対立遺伝子に追加されるものであり、これらを除外するものではない。以下
の８つの群：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタ
ミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リ
シン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ
）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン
（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）は、互いに
対して保存的置換であるアミノ酸を含有する（例えば、Creighton, Proteins(1984)を参
照されたい）。いくつかの実施形態では、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配
列を含有する抗体の結合特徴にそれほど大きな影響を及ぼしたりこれを改変したりしない
アミノ酸修飾を指すのに使用する。
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的な結合が可能なタンパク質決定基を意味
する。エピトープは通例、アミノ酸または糖側鎖など、化学的に活性な表面分子群からな
り、通例、特異的な三次元構造特徴のほか、特異的な電荷特徴も有する。コンフォメーシ
ョナルエピトープと非コンフォメーショナルエピトープとは、前者への結合は、変性溶媒
の存在下で失われるが、後者への結合は失われないという点で区別される。
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領
域のいずれもが、ヒト由来の配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する
。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまた、このようなヒト配列、例え
ば、ヒト生殖細胞系列配列またはヒト生殖細胞系列配列の突然変異させたバージョンに由
来する。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏにおけるランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発により導
入された突然変異、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異により導入された突然
変異）を含みうる。
「ヒト化」抗体とは、例えば、マウスモノクローナル抗体、ヒトにおいて治療剤として
投与される場合の免疫原性は小さいが、非ヒト抗体の抗原特異的反応性を保持する抗体で
ある。例えば、Robello et al., Transplantation, 68: 1417-1420を参照されたい。これ
は、例えば、非ヒト抗原結合性領域を保持し、抗体の残りの部分を、それらのヒト対応物
（すなわち、定常領域、ならびに可変領域の結合に関与しない部分）で置きかえることに
より達成することができる。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
1:6851-6855, 1984；Morrison and Oi、Adv. Immunol., 44:65-92, 1989；Verhoeyen et
al., Science, 239:1534-1536, 1988；Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991；およ
びPadlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994を参照されたい。ヒト操作技術の他の例は
、米国特許第５，７６６，８８６号明細書において開示されているＸｏｍａ技術を含むが
これらに限定されない。
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「同一な」または「同一性
」パーセントという用語は、２つ以上の配列または部分配列が同じであることを指す。以
下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、または手作業のアライメントおよび
目視により測定される比較域または指定領域にわたり、最大の対応性について比較され、
配列決定された場合の、２つの配列の、指定された百分率のアミノ酸残基またはヌクレオ
チドが同じであれば（すなわち、指定される領域にわたる、または、指定されない場合は
、配列全体にわたる、６０％の同一性、任意選択で、６５％、７０％、７５％、８０％、
８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有すれば）、２つの配列は「実質的に
同一」である。任意選択で、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミ
ノ酸）の長さの領域にわたり、またはより好ましくは、１００～５００、または１０００
ヌクレオチド以上（または２０、５０、または２００アミノ酸以上）の長さの領域にわた
り存在する。
配列比較では、１つの配列が、それに照らして被験配列を比較する基準配列として働く
ことが典型的である。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列および基準配列を
コンピュータへと入力し、必要な場合は、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプロ
グラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することもでき
、代替的なパラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムにより、
プログラムパラメータに基づき、被験配列について、基準配列と比べた配列同一性パーセ
ントを計算する。
本明細書で使用される「比較域」は、２つの配列を最適に配列決定した後で、配列を、
同じ数の連続的な位置による基準配列と比較しうる、２０～６００、通例約５０～約２０
０、より通例では、約１００～約１５０からなる群から選択される連続的な位置の数のう
ちのいずれか１つによるセグメントに対する言及を含む。当技術分野では、比較のための
配列アライメント法が周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Sm
ith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cによる局所相同性アルゴリズムによ
り行うこともでき、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970による相同性ア
ライメントアルゴリズムにより行うこともでき、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Aca
d. Sci. USA 85:2444, 1988による類似性の方法の検索（search for similarity method
）により行うこともでき、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏ
ｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗ
ＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により行うこと
もでき、手作業のアライメントおよび目視（例えば、Brent et al., Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.（Ringbou ed., 2003）を参照されたい
）により行うこともできる。
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適するアルゴリズム
の２つの例は、それぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977；お
よびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990において記載されている、ＢＬ
ＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実
施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより公表されている。このアルゴリズムは、
データベース配列内の同じ長さのワードで配列決定したときに、ある正の値の閾値スコア
Ｔにマッチするかまたはこれを満たす、クエリー配列内の短いワード長Ｗを同定すること
により、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを伴う。Ｔを、隣接ワードスコア
閾値（Altschul et al.,前出）と称する。これらの初期の隣接ワードヒットが、これらを
含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとして働く。累積アライメ
ントスコアが増大しうる限りにおいて、ワードヒットを、各配列に沿っていずれの方向に
も拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列では、パラメータＭ（マッチする残基の対
についてのリウォードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルテ
ィースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列では、スコアリングマトリッ
クスを使用して、累積スコアを計算する。累積アライメントスコアが、達成されたその最
大値から量Ｘだけ低下した場合；１つまたは複数の負スコア残基のアライメントの累積の
ために、累積スコアが、ゼロ以下に低下した場合；または配列のいずれかの末端に達した
場合は、各方向へのワードヒットの拡張を停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメー
タであるＷ、Ｔ、およびＸにより、アライメントの感度および速度が決定される。ＢＬＡ
ＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）では、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待
値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。アミノ
酸配列のためのＢＬＡＳＴＰプログラムでは、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）
、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989を参照されたい）アライメント（Ｂ）、１０
の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性についての統計学的解析（例
えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993を参照さ
れたい）も実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、
２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のマッチングが偶然に生じる確率の指標
をもたらす最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、被験核酸を基準核酸に照らして比
較したときの最小合計確率が約０．２未満であり、より好ましくは、約０．０１未満であ
り、最も好ましくは、約０．００１未満であれば、核酸は基準配列と類似すると考えられ
る。
２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントはまた、ＰＡＭ１２０重みづけ残基表、１
２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用するＡＬＩＧＮプ
ログラム（バージョン２．０）へと組み込まれた、E. Meyers and W. Miller（Comput. A
ppl. Biosci., 4:11-17, 1988）によるアルゴリズムを使用しても決定することができる
。加えて、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリ
ックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６、また
は４のギャップ重みづけ、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みづけを使用す
る、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（インターネット上のgcg.comで入手可能である）内
のＧＡＰプログラムへと組み込まれた、Needleman and Wunsch（J. Mol, Biol. 48:444-4
53, 1970）によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。
上記で言及した配列同一性百分率以外の、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的
に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、第１の核酸によりコードされる
ポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に
交差反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的置換だけに
よって異なる場合、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと実質的に同一なことが典型的
である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り
、２つの分子またはそれらの相補体が、厳密な条件下で、互いとハイブリダイズすること
である。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマー
を使用して配列を増幅しうることである。
「単離抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗
体を指す（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する単離抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４以外
の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的
に結合する単離抗体は、他の抗原に対する交差反応性を有しうる。さらに、単離抗体は、
他の細胞内物質および／または化学物質を実質的に含まない場合もある。
「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によりもたらされる抗体クラス（
例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４などのＩｇＧ）を指す。アイソタイプ
はまた、これらのクラスのうちの１つの修飾バージョンも含み、その修飾は、Ｆｃ機能を
改変する、例えば、エフェクター機能またはＦｃ受容体への結合を増強または低減するよ
うに施されている。
本明細書で使用される「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」という用語が、特定の抗体－抗
原間相互作用の会合速度を指すことを意図するのに対し、本明細書で使用される「Ｋｄｉ
ｓ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体－抗原間相互作用の解離速度を指すことを
意図する。本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、ＫｄのＫａに対する比（すなわ
ち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られる解離定数を指すことを意図し、モル濃度（Ｍ）として表す
。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる
。抗体のＫＤを決定するための方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイ
オセンサーシステムを使用して表面プラズモン共鳴を測定するか、または溶液平衡滴定（
ＳＥＴ）により溶液中のアフィニティーを測定するステップを含む。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」と
いう用語は、単一の分子組成による抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物
は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性およびアフィニティーを提示する。
本明細書では、「核酸」という用語が、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使
用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖形態ま
たは二本鎖形態におけるポリマーを指す。「核酸」という用語は、公知のヌクレオチド類
似体または修飾骨格残基もしくは修飾連結を含有する核酸であって、合成の核酸、自然発
生の核酸、および非自然発生の核酸であり、基準核酸と同様の結合特性を有し、基準ヌク
レオチドと同様の形で代謝される核酸を包含する。このような類似体の例は、限定なしに
述べると、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチ
ルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
別段に指し示されない限りにおいて、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその
変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列も暗示的に包含するほか、明示的に
指し示される配列も包含する。とりわけ、下記で詳述される通り、縮重コドン置換は、１
つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が、混合塩基および／ま
たはデオキシイノシン残基で置換された配列を作り出すことにより達成することができる
（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem.
260:2605-2608, 1985；およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994）
。
「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮ
Ａ）セグメントの間の機能的関係を指す。「作動可能に連結された」という用語は、転写
調節配列の、転写される配列に対する機能的関係を指すことが典型的である。例えば、プ
ロモーター配列またはエンハンサー配列は、それが、適切な宿主細胞内または他の発現系
内のコード配列の転写を刺激またはモジュレートするとき、コード配列に作動可能に連結
されている。一般に、転写される配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列
は、転写される配列と物理的に隣接する、すなわち、シス作用型である。しかし、エンハ
ンサーなど、一部の転写調節配列は、その転写をそれらが増強するコード配列に物理的に
隣接する必要も、近接して配置される必要もない。
本明細書で使用される「最適化された」という用語は、ヌクレオチド配列を、産生細胞
または産生生物、一般に、真核細胞、例えば、ピキア（Pichia）属細胞、チャイニーズハ
ムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ
酸配列をコードするように改変していることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列
は、「親」配列としてもまた公知の出発ヌクレオチド配列により本来コードされるアミノ
酸配列を、完全に、または可能な限り多く保持するように操作する。本明細書の最適化さ
れた配列は、哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように操作されている。しか
し、本明細書ではまた、他の真核細胞または原核細胞におけるこれらの配列の最適化され
た発現も企図される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列も
また、最適化されていると称する。
本明細書では、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語が、アミノ酸残基の
ポリマーを指すように互換的に使用される。「ポリペプチド」および「タンパク質」とい
う用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する自然発生のアミノ酸の人工の化学
的模倣体であるアミノ酸ポリマーのほか、自然発生のアミノ酸ポリマーおよび非自然発生
のアミノ酸ポリマーにも適用される。別段に指し示されない限りにおいて、特定のポリペ
プチド配列はまた、保存的に修飾されたその変異体も暗示的に包含する。
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン遺伝子に
ついてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス）
またはこれにより調製されるハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現させる
ように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、組
換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、およびヒト免疫グロ
ブリン遺伝子 配列の全部または一部の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う、他
の任意の手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される抗体
など、組換え手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される
、全てのヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤ
Ｒ領域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし
、ある種の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの突然変異誘
発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物を使用する場合は、ｉ
ｎ ｖｉｖｏの体細胞突然変異誘発）にかけることができ、したがって、組換え抗体のＶ
Ｈ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に
由来し、これらに関連するが、ｉｎ ｖｉｖｏのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内
で天然には存在しない可能性がある配列である。
「組換え宿主細胞」（または、簡単に、「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベク
ターを導入した細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞だけを指すことを意図す
るものではなく、このような細胞の子孫細胞も指すことを意図するものであることを理解
されたい。後続する世代では、突然変異または環境的影響に起因して、ある種の修飾が生
じうるため、このような子孫細胞は、実のところ、親細胞と同一ではない可能性もあるが
、やはり本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、非ヒト霊長動物
（例えば、カニクイザル）、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類など
、全ての脊椎動物（例えば、哺乳動物および非哺乳動物）を含む。特記される場合を除き
、本明細書では、「患者」または「対象」という用語が互換的に使用される。本明細書で
使用される「カニクイザル（cyno）」または「カニクイザル（cynomolgus）」という用語
は、カニクイザル（cynomolgus monkey）（カニクイザル（Macaca fascicularis））を指
す。
一実施形態では、本明細書で使用される、任意の疾患または障害（例えば、ＡＮＧＰＴ
Ｌ４関連障害）「～を処置すること」またはこれらの「処置」という用語は、疾患または
障害を改善すること（すなわち、疾患またはその臨床症状のうちの少なくとも１つの発症
を緩徐化するか、停止させるか、または軽減すること）を指す。別の実施形態では、「～
を処置すること」または「処置」とは、患者により識別可能でない可能性があるパラメー
タを含む少なくとも１つの物理的パラメータを緩和または改善することを指す。さらに別
の実施形態では、「～を処置すること」または「処置」とは、疾患または障害を、物理的
にモジュレートする（例えば、識別可能な症状の安定化）か、生理学的にモジュレートす
る（例えば、物理的（physical）パラメータの安定化）か、または物理的かつ生理学的に
モジュレートすることを指す。さらに別の実施形態では、「～を処置すること」または「
処置」とは、疾患または障害の発生または発症または進行を防止するかまたは遅延させる
ことを指す。
例えばＡＮＧＰＴＬ４関連障害を含む、本明細書で記載される適応に関する場合の「防
止」とは、例えば、前記悪化の危険性がある患者における、下記で記載される、ＡＮＧＰ
ＴＬ４関連疾患パラメータの悪化を防止または緩徐化する任意の作用を意味する。
「ベクター」という用語は、それが連結された別のポリヌクレオチドを輸送することが
可能なポリヌクレオチド分子を指すことを意図する。ベクターのうちの１つの種類は、さ
らなるＤＮＡセグメントをライゲーションしうる、環状の二本鎖ＤＮＡループを指す「プ
ラスミド」である。ベクターの別の種類は、さらなるＤＮＡセグメントを、ウイルスゲノ
ムへとライゲーションしうる、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶまたはＡＡＶ２）な
どのウイルスベクターである。ある種のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌
ベクターおよび哺乳動物のエピソームベクター）は、それらが導入された宿主細胞におけ
る自己複製が可能である。他のベクター（例えば、非哺乳動物のエピソームベクター）は
、宿主細胞へと導入すると、宿主細胞のゲノムへと組み込むことができ、これにより、宿
主ゲノムと共に複製する。さらに、ある種のベクターは、それらが作動的に連結された遺
伝子の発現を方向付けることが可能である。本明細書では、このようなベクターを、「組
換え発現ベクター」（または簡単に、「発現ベクター」）と称する。一般に、組換えＤＮ
Ａ法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。プラスミドは
ベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」と「
ベクター」とを互換的に使用することができる。しかし、本発明は、同等な機能をもたら
すウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ
随伴ウイルス）など、発現ベクターの他の形態も含むことを意図する。
図１Ａ～１Ｄは、本発明の、選択されたＡＮＧＰＴＬ４抗体による、ＡＮＧＰＴＬ４に媒介される、ヒトリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）タンパク質の阻害の逆転を描示する図である。 図１Ａ～１Ｄは、本発明の、選択されたＡＮＧＰＴＬ４抗体による、ＡＮＧＰＴＬ４に媒介される、ヒトリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）タンパク質の阻害の逆転を描示する図である。 図２は、本発明の、選択された抗体の、全長ヒトＡＮＧＰＴＬ４およびヒトＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端のコイルドコイルドメインへの結合と、ヒト全長ＡＮＧＰＴＬ３への結合の非存在とを描示する図である。ＡＮＧＰＴＬ３ Ａｂ＝ＡＮＧＰＴＬ３特異的基準抗体（reference antibody）である。 図３Ａ～３Ｂは、本発明の、選択されたＡＮＧＰＴＬ４抗体の投与の後の、ヒトＡＮＧＰＴＬ４トランスジェニックマウスにおける、血漿トリグリセリドレベルの変化を描示する図である。 図４は、本発明の１つのＡＮＧＰＴＬ４抗体（ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ）の投与の後の、肥満した、糖尿病のカニクイザルにおける、血漿総ヒト抗体濃度を描示する図である。 図５は、本発明の１つのＡＮＧＰＴＬ４抗体（ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ）の投与の後の、肥満した、糖尿病のカニクイザルにおける、血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度の変化を描示する図である。 図６は、本発明の１つのＡＮＧＰＴＬ４抗体（ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ）の投与の後の、肥満した、糖尿病のカニクイザルにおける、血漿総コレステロール濃度の変化を描示する図である。 図７は、本発明の１つのＡＮＧＰＴＬ４抗体（ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ）の投与の後の、肥満した、糖尿病のカニクイザルにおける、血漿高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）濃度の変化を描示する図である。 図８は、本発明の１つのＡＮＧＰＴＬ４抗体（ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ）の投与の後の、肥満した、糖尿病のカニクイザルにおける、血漿総アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）濃度の変化を描示する図である。 図９は、本発明の１つのＡＮＧＰＴＬ４抗体（ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ）の投与の後の、肥満した、糖尿病のカニクイザルにおける、血漿アポリポタンパク質Ｃ－ＩＩＩ（ＡｐｏＣ－ＩＩＩ）濃度の変化を描示する図である。 図１０は、本発明の１つのＡＮＧＰＴＬ４抗体の投与の後の、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）による血漿リポタンパク質の分離により評価される、血漿リポタンパク質関連コレステロールレベルの変化を描示する図である。１匹のサルからのデータを示す（ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ、サル６２９６）。略号：ＴＲＬ＝トリグリセリドに富むリポタンパク質；ＬＤＬ＝低密度リポタンパク質；ＨＤＬ＝高密度リポタンパク質。 図１１は、本発明の１つのＡＮＧＰＴＬ４抗体の投与の後の、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）による血漿リポタンパク質の分離により評価される、血漿リポタンパク質関連トリグリセリド（ＴＧ）レベルの変化を描示する図である。１匹のサルからのデータを示す（ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ、サル６２９６）。略号：ＴＲＬ＝トリグリセリドに富むリポタンパク質；ＬＤＬ＝低密度リポタンパク質；ＨＤＬ＝高密度リポタンパク質。
詳細な説明
本発明は部分的に、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合し、その生物学的活性を阻害する抗
体分子の発見に基づく。本発明は、完全ＩｇＧフォーマットの抗体（例えば、ヒト化抗体
であるＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３
１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、ＮＥＧ３１９）、ならびにＦａｂ断片など、これら
の抗原結合性断片の両方に関する。
したがって、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４（例えば、ヒトＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結
合する抗体、医薬組成物、このような抗体および組成物の作製法および使用法を提供する
。
ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合し、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）を活
性化する能力を含む、その生物学的活性を阻害する抗体を提供する。
逆に（conversely）、
アンジオポエチン様４タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）とは、分泌タンパク質のアンジオ
ポエチンファミリーのメンバーである。ＡＮＧＰＴＬ４は、二量体および四量体を形成す
ることが可能なホモオリゴマータンパク質であって、マクロファージ、脂肪、筋肉、およ
び肝細胞を含む細胞型によって発現するホモオリゴマータンパク質である。ＡＮＧＰＴＬ
４はまた、肝臓フィブリノーゲン／アンジオポエチン関連タンパク質（ＨＦＡＲＰ）（Ki
m et al. (2000) Biochem. J. 346:603-610）、ＰＰＡＲガンマアンジオポエチン関連タ
ンパク質（ＰＧＡＲ）（Yoon, et al. (2000) Mol. Cell Biol., 20:5343-5349）、およ
び空腹誘導性脂肪細胞因子（ＦＩＡＦ）（Kerten et al. (2000) J. Biol. Chem., 275:2
8488-28493）としても公知である。ＡＮＧＰＴＬ４は、Ｎ末端のコイルドコイルドメイン
と、Ｃ末端のフィブリノーゲン（ＦＢＮ）様ドメインとを含有する（Kim et al. (2000)
Biochem. J. 346:603-610）。
リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）は、リポタンパク質代謝において、血中の正常なリ
ポタンパク質レベルを維持し、その活性の組織特異的調節を介して、いつ、どの組織に、
トリグリセリド（ＴＧ）が取り込まれるのかを決定する、中心的な役割を果たす。ＡＮＧ
ＰＴＬ４のコイルドコイル領域は、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）に媒介されるトリ
グリセリド（ＴＧ）クリアランスを阻害することが公知である。したがって、ＡＮＧＰＴ
Ｌ４の機能喪失突然変異（例えば、ヒト対象において見られる）、遺伝子の欠失（例えば
、トランスジェニックマウスにおいて見られる）、および抗体による阻害（例えば、マウ
スおよびカニクイザルにおいて見られる）は全て、血漿トリグリセリドを減少させること
が観察されている。さらに、ＡＮＧＰＴＬ４抗体はまた、ＬＰＬを活性化させることが公
知でもある。逆に、ＡＮＧＰＴＬ４の、マウスへの注射は、循環トリグリセリドの急速な
増大をもたらし、この速度は、アンジオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）を注
射した場合より大きい（Yoshida et al. (2002) J Lipid Res 43:1770-1772）。
本発明で記載される抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体および抗原結合性断片は、例えば、ＡＮＧＰ
ＴＬ４によるＬＰＬの阻害を遮断し、これにより、血漿トリグリセリドを減少させること
により、ＬＰＬの活性化を開始、促進、または増強する。これらの抗体は、トリグリセリ
ドレベルの上昇を特徴とする疾患、例えば、原発性脂質異常症、高トリグリセリド血症、
メタボリックシンドローム、ＩＩ型糖尿病などの、急性症状および慢性症状を防止および
改善することが期待される。
本発明で記載される抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体および抗原結合性断片は、例えば、ＡＮＧＰ
ＴＬ４によるＬＰＬの阻害を遮断し、これにより、血漿トリグリセリドを減少させること
により、ＬＰＬの活性化を開始、促進、または増強する。これらの抗体は、トリグリセリ
ドレベルの上昇を特徴とする疾患、例えば、原発性脂質異常症、高トリグリセリド血症、
メタボリックシンドローム、ＩＩ型糖尿病などの、急性症状および慢性症状を防止および
改善することが期待される。
ＡＮＧＰＴＬ４抗体および抗原結合性断片
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態で
は、本発明は、ヒト、およびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４にも特異的に結合する抗体を提
供する。本発明の抗体は、実施例で記載される通りに単離されたヒト化抗体およびＦａｂ
を含むがこれらに限定されない。
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルＡＮＧＰＴ
Ｌ４）に特異的に結合する抗体であって、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１
８、および１３８のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む抗体を提供する。本発明は
また、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙さ
れるＶＨ ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む抗体
も提供する。特に、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質（例えば、ヒト、およびカニク
イザルＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶＨ
ＣＤＲのうちのいずれかのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、３つ以上のＶＨ ＣＤ
Ｒを含む（または、代替的に、これらからなる）抗体を提供する。
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に特異的に結合する抗体であって、配列番号２３
、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８のアミノ酸配列を有するＶＬドメイ
ンを含む抗体を提供する。本発明はまた、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質（例えば、ヒト、お
よびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する抗体であって、以下の表２に列挙
されるＶＬ ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む抗
体も提供する。特に、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質（例えば、ヒト、およびカニ
クイザルＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶ
Ｌ ＣＤＲのうちのいずれかのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、３つ以上のＶＬ Ｃ
ＤＲを含む（または、代替的に、これらからなる）抗体を提供する。
本発明の他の抗体は、突然変異させているが、なお、ＣＤＲ領域内で、表１に記載され
ている配列内で描示されるＣＤＲ領域と、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、ま
たは９５パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明
の他の抗体は、ＣＤＲ領域内で、表１に記載されている配列内で描示されるＣＤＲ領域と
比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下のアミノ酸を突然変異させた、突然
変異体のアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルＡＮＧ
ＰＴＬ４）に特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、全長重鎖、および全長軽鎖をコードす
る核酸配列も提供する。このような核酸配列は、哺乳動物細胞における発現について最適
化することができる（例えば、表１は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖に最適化された核
酸配列を示す）。
表１：ＡＮＧＰＴＬ４抗体、Ｆａｂ、およびＡＮＧＰＴＬ４タンパク質の例
本発明の他の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸を突然変異させている
が、表１に記載されている配列となお少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、
９０、または９５パーセントの同一性を有する抗体を含む。いくつかの実施形態は、可変
領域内で、実質的に同じ抗原結合活性を保持しながら、表１に記載されている配列内で描
示された可変領域と比較した場合に、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下のアミノ
酸を突然変異させている、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
これらの抗体の各々は、ＡＮＧＰＴＬ４に結合しうるので、ＶＨ配列、ＶＬ配列、全長
軽鎖配列、および全長重鎖配列（アミノ酸配列と、アミノ酸配列をコードするヌクレオチ
ド配列と）を「混合し、マッチさせて」、本発明の他のＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を創出
することができる。このような「混合し、マッチさせた」ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体は、
当技術分野で公知の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡおよび実施例節で記載される他の
アッセイ）を使用して調べることができる。これらの鎖を混合し、マッチさせる場合、特
定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列で置きかえるもの
とする。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長重鎖配列を、構造的に類
似する全長重鎖配列で置きかえるものとする。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来する
ＶＬ配列を、構造的に類似するＶＬ配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全長重
鎖／全長軽鎖対合に由来する全長軽鎖配列を、構造的に類似する全長軽鎖配列で置きかえ
るものとする。
したがって、一態様では、本発明は、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８
、および１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならび
に配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８からなる群から選択
されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する単離抗体またはその抗原結合性領域
を提供し、この場合、抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４（例えば、ヒトＡＮＧＰＴＬ４）に特異的
に結合する。
より具体的に、ある種の態様では、本発明は、配列番号１３および２３；３８および４
８；５８および６８；７８および８８；９８および１０８；１１８および１２８；または
１３８および１４８、のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインお
よび軽鎖可変ドメインを有する、単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。
別の態様では、本発明は、（ｉ）哺乳動物細胞における発現について最適化されたアミ
ノ酸配列であって、配列番号１５、２８、４０、６０、８０、１００、１２０、および１
４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長重鎖、ならびに哺乳動物細胞にお
ける発現について最適化されたアミノ酸配列であって、配列番号２５、５０、７０、９０
、１１０、１３０、および１５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長軽鎖
を有する単離抗体、または（ｉｉ）その抗原結合性部分を含む機能的タンパク質を提供す
る。より具体的に、ある種の態様では、本発明は、配列番号１５および２５；２８および
２５；４０および５０；６０および７０；８０および９０；１００および１１０；１２０
および１３０；または１４０および１５０、のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含
む重鎖および軽鎖を有する単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。
本明細書で使用される「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性
および抗原結合アフィニティーを付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一
般に、各重鎖可変領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）内には、３つのＣＤＲが
あり、各軽鎖可変領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）内には、３つのＣＤＲが
ある。
所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al.,（1991）, "Sequences of
Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National In
stitutes of Health、Bethesda, MD（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikani
et al.,（1997） JMB 273, 927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）により記載
されているスキームを含む、周知の多数のスキームのうちのいずれかを使用して、たやす
く決定することができる。
例えば、Ｋａｂａｔによれば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）内の抗体であるＦＦ１のＣＤ
Ｒアミノ酸残基は、３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６６（ＨＣＤＲ２）、および９９
～１０４（ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）内のＣＤＲア
ミノ酸残基は、２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５５（ＬＣＤＲ２）、および８９～９
７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。Ｃｈｏｔｈｉａによれば、ＶＨ内のＣＤＲアミ
ノ酸は、２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５２～５７（ＨＣＤＲ２）、および９９～１０４（
ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、ＶＬ内のアミノ酸残基は、２６～３２（ＬＣＤＲ１
）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）、および９１～９６（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている
。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、ＣＤＲ
は、ヒトＶＨ内のアミノ酸残基２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６６（ＨＣＤＲ２）、
および９０～１０４（ＨＣＤＲ３）、ならびにヒトＶＬ内のアミノ酸残基２４～３４（Ｌ
ＣＤＲ１）、５０～５５（ＬＣＤＲ２）、および８９～９７（ＬＣＤＲ３）からなる。
別の態様では、本発明は、表１に記載されている重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２
、およびＣＤＲ３、またはこれらの組合せを含むＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を提供する。
抗体のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号７、３２、５２、７２、９２、１１２
、および１３２に示されている。抗体のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８、
３３、５３、７３、９３、１１３、および１３３に示されている。抗体のＶＨ ＣＤＲ３
のアミノ酸配列は、配列番号９、３４、５４、７４、９４、１１４、および１３４に示さ
れている。抗体のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１７、４２、６２、８２、
１０２、１２２、および１４２に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は
、配列番号１８、４３、６３、８３、１０３、１２３、および１４３に示されている。抗
体のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１９、４４、６４、８４、１０４、１２
４、および１４４に示されている。これらのＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステムを使用し
て表される。
代替的に、Ｃｈｏｔｈｉａシステム（Al-Lazikani et al.,（1997）, JMB 273 927-948
）を使用して規定される通り、抗体のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１０、
３５、５５、７５、９５、１１５、および１３５に示されている。抗体のＶＨ ＣＤＲ２
のアミノ酸配列は、配列番号１１、３６、５６、７６、９６、１１６、および１３６に示
されている。抗体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１２、３７、５７、７７
、９７、１１７、および１３７に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は
、配列番号２０、４５、６５、８５、１０５、１２５、および１４５に示されている。抗
体のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２１、４６、６６、８６、１０６、１２
６、および１４６に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号２
２、４７、６７、８７、１０７、１２７、および１４７に示されている。
これらの抗体の各々は、ＡＮＧＰＴＬ４に結合することが可能であり、抗原結合特異性
は主に、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域によりもたらされることを踏
まえれば、各抗体は、本発明の他のＡＮＧＰＴＬ４結合性分子を創出するのに、ＶＨ Ｃ
ＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤ
Ｒ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含有することが好ましいが、ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ
ＣＤＲ２配列、およびＶＨ ＣＤＲ３配列、ならびにＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ
２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列を、「混合し、マッチさせる」ことができる（すなわ
ち、異なる抗体に由来するＣＤＲを、混合し、マッチさせることができる）。このような
「混合し、マッチさせた」ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体は、当技術分野で公知の結合アッセ
イおよび実施例で記載される結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＥＴ、Ｂｉａｃｏｒ
ｅ）を使用して調べることができる。ＶＨ ＣＤＲ配列を混合し、マッチさせる場合は、
特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を
、構造的に類似するＣＤＲ配列で置きかえるものとする。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列を混
合し、マッチさせる場合は、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、お
よび／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列で置きかえるものとする。当
業者には、新規のＶＨ配列およびＶＬ配列を、１つまたは複数のＶＨ ＣＤＲ領域配列お
よび／またはＶＬ ＣＤＲ領域配列を、本発明のモノクローナル抗体のための、本明細書
で示されるＣＤＲ配列に由来する、構造的に類似する配列で置換することにより創出しう
ることがたやすく明らかであろう。前出に加えて、一実施形態では、本明細書で記載され
る抗体の抗原結合性断片は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３、
またはＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含むことが可能であり
、この場合、断片は、ＡＮＧＰＴＬ４に、単一の可変ドメインとして結合する。
本発明のある種の実施形態では、抗体またはそれらの抗原結合性断片は、表１に記載さ
れているヒト化抗体の重鎖および軽鎖配列を有しうる。より具体的には、抗体またはその
抗原結合性断片は、ＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１
０、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、およびＮＥＧ３１９の重鎖および軽鎖
配列を有しうる。
本発明の他の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体または抗原結合性
断片は、Ｋａｂａｔにより規定され、表１に記載されている、重鎖可変領域のＣＤＲ１、
重鎖可変領域のＣＤＲ２、重鎖可変領域のＣＤＲ３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、軽鎖可変
領域のＣＤＲ２、および軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。本発明のさらに他の実施形態で
は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、Ｃｈｏｔｈｉａに
より規定され、表１に記載されている、重鎖可変領域のＣＤＲ１、重鎖可変領域のＣＤＲ
２、重鎖可変領域のＣＤＲ３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、軽鎖可変領域のＣＤＲ２、およ
び軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であって、
配列番号７の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号８の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号
９の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１８の
軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１９の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含
む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であっ
て、配列番号３２の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖可変領域のＣＤＲ２、
配列番号３４の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号４２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列
番号４３の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号４４の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含
む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であっ
て、配列番号５２の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号５３の重鎖可変領域のＣＤＲ２、
配列番号５４の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号６２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列
番号６３の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号６４の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含
む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であっ
て、配列番号７２の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号７３の重鎖可変領域のＣＤＲ２、
配列番号７４の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号８２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列
番号８３の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号８４の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含
む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であっ
て、配列番号９２の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号９３の重鎖可変領域のＣＤＲ２、
配列番号９４の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１０２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配
列番号１０３の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１０４の軽鎖可変領域のＣＤＲ
３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であっ
て、配列番号１１２の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１１３の重鎖可変領域のＣＤＲ
２、配列番号１１４の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１２２の軽鎖可変領域のＣＤＲ
１、配列番号１２３の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１２４の軽鎖可変領域の
ＣＤＲ３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であっ
て、配列番号１３２の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１３３の重鎖可変領域のＣＤＲ
２、配列番号１３４の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１４２の軽鎖可変領域のＣＤＲ
１、配列番号１４３の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１４４の軽鎖可変領域の
ＣＤＲ３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であっ
て、配列番号１０の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ２、
配列番号１２の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号２０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列
番号２１の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号２２の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含
む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であっ
て、配列番号３５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号３６の重鎖可変領域のＣＤＲ２、
配列番号３７の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号４５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列
番号４６の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号４７の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含
む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であっ
て、配列番号５５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号５６の重鎖可変領域のＣＤＲ２、
配列番号５７の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号６５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列
番号６６の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号６７の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含
む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であっ
て、配列番号７５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号７６の重鎖可変領域のＣＤＲ２、
配列番号７７の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号８５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列
番号８６の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号８７の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含
む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であっ
て、配列番号９５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号９６の重鎖可変領域のＣＤＲ２、
配列番号９７の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１０５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配
列番号１０６の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１０７の軽鎖可変領域のＣＤＲ
３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であっ
て、配列番号１１５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１１６の重鎖可変領域のＣＤＲ
２、配列番号１１７の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１２５の軽鎖可変領域のＣＤＲ
１、配列番号１２６の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１２７の軽鎖可変領域の
ＣＤＲ３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であっ
て、配列番号１３５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１３６の重鎖可変領域のＣＤＲ
２、配列番号１３７の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１４５の軽鎖可変領域のＣＤＲ
１、配列番号１４６の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１４７の軽鎖可変領域の
ＣＤＲ３を含む抗体を含む。
ある種の実施形態では、本発明は、表１に記載されている、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に
結合する抗体または抗原結合性断片を含む。好ましい実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４に結
合する抗体または抗原結合性断片は、ＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２
７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、ＮＥＧ３１９である
。
相同抗体
さらに別の実施形態では、本発明は、表１に記載されている配列と相同なアミノ酸配列
を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供するが、抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク
質（例えば、ヒト、およびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４）に結合し、表１に記載されてい
る抗体の所望の機能的特性を保持する。
例えば、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、単離抗体または
その機能的抗原結合性断片を提供し、この場合、重鎖可変ドメインは、配列番号１３、３
８、５８、７８、９８、１１８、および１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と
少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含
み；軽鎖可変ドメインは、配列番号２３、２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、１
４８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、ま
たは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み；抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４（例えば、ヒ
ト、およびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する。本発明のある種の態様で
は、重鎖および軽鎖配列は、Ｋａｂａｔにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２
配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例え
ば、それぞれ、配列番号７、８、９、１７、１８、および１９をさらに含む。本発明のあ
る種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定される、ＨＣＤ
Ｒ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、および
ＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号１０、１１、１２、２０、２１、および２
２をさらに含む。
他の実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／またはＶＬアミノ酸配列は、表１に示さ
れる配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８
％、または９９％同一でありうる。他の実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／または
ＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４、または５カ所以下のアミノ酸位置におけるアミノ
酸置換を除き同一でありうる。表１に記載されている抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域と大
きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨ領域およびＶＬ領域を有する抗体は
、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、１１８、または１３８、および配列
番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、または１４８、のそれぞれをコードする
核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘
発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機
能の保持について調べることにより得ることができる。
他の実施形態では、全長重鎖アミノ酸配列および／または全長軽鎖アミノ酸配列は、表
１に示される配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％、または９９％同一でありうる。配列番号１５、２８、４０、６０、８０、１
００、１２０、または１４０のうちのいずれかの全長重鎖、および配列番号２５、２５、
５０、７０、９０、１１０、１３０、または１５０、のうちのいずれかの全長軽鎖と大き
な（すなわち、８０％以上の）同一性を有する全長重鎖および全長軽鎖を有する抗体は、
このようなポリペプチドをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然
変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使
用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができ
る。
他の実施形態では、全長重鎖ヌクレオチド配列および／または全長軽鎖ヌクレオチド配
列は、表１に示される配列と、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％、または９９％同一でありうる。
他の実施形態では、重鎖可変領域のヌクレオチド配列および／または軽鎖可変領域のヌ
クレオチド配列は、表１に示される配列と、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、
９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
本明細書で使用される、２つの配列の間の同一性パーセントとは、２つの配列の最適な
アライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮
する配列により共有される、同一な位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一な位置の
数／位置の総数×１００）である。２つの配列の間の配列の比較および同一性パーセント
の決定は、下記の非限定的な例で記載されている、数学的アルゴリズムを使用して達成す
ることができる。
加えて、または代替的に、本発明のタンパク質配列は、公表されたデータベースに照ら
して検索を実施する、例えば、関連の配列を同定するための「クエリー配列」としてさら
に使用することもできる。例えば、このような検索は、Altschul et al., 1990 J. Mol.
Biol. 215:403-10によるＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施する
ことができる。
保存的修飾を伴う抗体
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ
３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列
を含む軽鎖可変領域を有し、この場合、これらのＣＤＲ配列のうちの１つまたは複数は、
本明細書で記載される抗体またはそれらの保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を
有し、抗体は、本発明のＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。
したがって、本発明は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖
可変領域、ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領
域からなる単離抗体またはその抗原結合性断片であって、重鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ
酸配列が、配列番号７、３２、５２、７２、９２、１１２、および１３２、ならびにそれ
らの保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域のＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列
番号８、３３、５３、７３、９３、１１３、および１３３、ならびにそれらの保存的修飾
からなる群から選択され、重鎖可変領域のＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号９、３４、
５４、７４、９４、１１４、および１３４、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から
選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号１７、４２、６２、８２、
１０２、１２２、および１４２、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、
軽鎖可変領域のＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号１８、４３、６３、８３、１０３、１
２３、および１４３、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領
域のＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号１９、４４、６４、８４、１０４、１２４、およ
び１４４、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、ＡＮＧＰＴＬ４に特異
的に結合する、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
他の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物細胞における発現について最適化されて
おり、全長重鎖配列および全長軽鎖配列を有し、これらの配列のうちの１つまたは複数は
、本明細書で記載される抗体またはそれらの保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列
を有し、抗体は、本発明のＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。し
たがって、本発明は、全長重鎖および全長軽鎖からなる、哺乳動物細胞における発現につ
いて最適化された単離抗体であって、全長重鎖が、配列番号１５、２８、４０、６０、８
０、１００、１２０、および１４０、ならびにそれらの保存的修飾の群から選択されるア
ミノ酸配列を有し、全長軽鎖が、配列番号２５、５０、７０、９０、１１０、１３０、お
よび１５０、ならびにそれらの保存的修飾の群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＡＮ
ＧＰＴＬ４（例えば、ヒト、およびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する抗
体を提供する。
同じエピトープに結合する抗体
本発明は、表１に記載されているＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体と同じエピトープに結合す
る抗体を提供する。したがって、ＡＮＧＰＴＬ４結合アッセイ（実施例で記載されるＡＮ
ＧＰＴＬ４結合アッセイなど）において、本発明の他の抗体と競合する（例えば、本発明
の他の抗体の結合を、統計学的に有意な形で競合的に阻害する）それらの能力に基づき、
さらなる抗体を同定することができる。本発明の抗体の、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質への
結合を阻害する被験抗体の能力により、被験抗体が、その抗体と、ＡＮＧＰＴＬ４への結
合について競合することが可能であり、このような抗体は、非限定的な理論によれば、Ａ
ＮＧＰＴＬ４タンパク質上の、それが競合する抗体と同じであるかまたは関連の（例えば
、構造的に類似するか、または空間的に近接した）エピトープに結合しうることが裏付け
られる。ある種の実施形態では、本発明の抗体と同じＡＮＧＰＴＬ４上のエピトープに結
合する抗体は、ヒト化抗体である。このようなヒト化抗体は、本明細書で記載される通り
に、調製および単離することができる。本明細書で使用される通り、等モル濃度の競合抗
体の存在下で、競合抗体が、本発明の抗体または抗原結合性断片のＡＮＧＰＴＬ４との結
合を、５０％を超えて（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９
％）阻害するとき、抗体は、結合について「競合する」。
他の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片は、ＡＮＧＰＴＬ４の１つまた
は複数のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、本抗体または本抗原結合性断
片が結合するエピトープは、直鎖状エピトープである。他の実施形態では、本抗体または
本抗原結合性断片が結合するエピトープは、非直鎖状のコンフォメーショナルエピトープ
である。
操作抗体および修飾抗体
出発抗体から特性を改変した修飾抗体を操作する出発材料として、本明細書で示される
ＶＨ配列および／またはＶＬ配列のうちの１つまたは複数を有する抗体を使用して、本発
明の抗体をさらに調製することができる。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち
、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内、および／ま
たは１つもしくは複数のフレームワーク領域内の１つまたは複数の残基を修飾することに
より操作することができる。加えて、または代替的に、抗体は、定常領域内の残基を修飾
して、例えば、抗体のエフェクター機能を改変することによっても操作することができる
。
実施しうる可変領域操作のうちの１つの種類は、ＣＤＲグラフティングである。抗体は
、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介し
て、標的抗原と相互作用する。この理由で、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個別の抗体の間
の多様性が、ＣＤＲの外部の配列より大きい。ＣＤＲ配列は、大半の抗体－抗原間相互作
用の一因となるため、異なる特性を伴う異なる抗体に由来するフレームワーク配列へとグ
ラフトされた特異的自然発生抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築するこ
とにより、特異的自然発生抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能であ
る（例えば、Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327；Jones, P. et al., 198
6 Nature 321:522-525；Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. U.S.A. 86:10029-1
0033；Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号明細書、ならびにＱｕｅｅｎ
らによる米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同
第５，６９３，７６２号明細書；および同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい
）。
したがって、本発明の別の実施形態は、配列番号７、３２、５２、７２、９２、１１２
、および１３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号
８、３３、５３、７３、９３、１１３、および１３３からなる群から選択されるアミノ酸
配列を有するＣＤＲ２配列、配列番号９、３４、５４、７４、９４、１１４、および１３
４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列のそれぞれを含む重鎖可
変領域と、配列番号１７、４２、６２、８２、１０２、１２２、および１４２からなる群
から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号１８、４３、６３、８３、
１０３、１２３、および１４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２
配列、ならびに配列番号１９、４４、６４、８４、１０４、１２４、および１４４からな
る群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３配列のそれぞれを有する軽鎖可変領域
とを含む単離抗体またはその抗原結合性断片に関する。したがって、このような抗体は、
モノクローナル抗体のＶＨ ＣＤＲ配列およびＶＬ ＣＤＲ配列を含有するが、これらの
抗体に由来する異なるフレームワーク配列を含有しうる。
このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む公表されたＤ
ＮＡデータベースまたは公表された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖お
よび軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、ヒト生殖細胞系列の配列データベ
ースである「ＶＢａｓｅ」（インターネットのmrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能であ
る）のほか、それらの各々の内容が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Kaba
t, E. A. et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edi
tion, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242
；Tomlinson, I. M. et al., 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798；およびCox, J. P. L. e
t al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836においても見出すことができる。
本発明の抗体における使用のためのフレームワーク配列の例は、本発明の選択された抗
体により使用されるフレームワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体により使
用されるコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列と構造的に類似するフレー
ムワーク配列である。ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、およびＶＨ ＣＤＲ３
配列、ならびにＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列は
、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子内で見出される配
列と同一の配列を有するフレームワーク領域へとグラフトすることもでき、ＣＤＲ配列は
、生殖細胞系列配列と比較して、１つまたは複数の突然変異を含有するフレームワーク領
域へとグラフトすることもできる。例えば、ある種の場合には、フレームワーク領域内の
残基を突然変異させて、抗体の抗原結合能力を維持または増強することが有益であると見
出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同
第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；および同第６，１８
０，３７０号明細書を参照されたい）。本明細書で記載される抗体および抗原結合性断片
をその上に構築する足場として活用されうるフレームワークは、ＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、Ｖ
Ｈ３、Ｖｋ１、Ｖｌ２、およびＶｋ２を含むがこれらに限定されない。当技術分野では、
さらなるフレームワークが知られており、例えば、インターネットのvbase.mrc-cpe.cam.
ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1上のｖＢａｓｅデータベースにおいて見出すことが
できる。
したがって、本発明の実施形態は、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、
および１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはこのような配列のフレーム
ワーク領域内に１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしく
はアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号２３、４８、
６８、８８、１０８、１２８、および１４８からなる群から選択されるアミノ酸配列、ま
たはこのような配列のフレームワーク領域内に１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ
酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領
域をさらに含む、単離ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片に関する
。
可変領域修飾の別の種類は、「アフィニティー成熟」として公知の、ＶＨ ＣＤＲ１領
域内、ＶＨ ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＨ ＣＤＲ３領域内、ならびに／また
はＶＬ ＣＤＲ１領域内、ＶＬ ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＬ ＣＤＲ３領域
内のアミノ酸残基を突然変異させて、これにより、対象の抗体の１つまたは複数の結合特
性（例えば、アフィニティー）を改善することである。部位特異的突然変異誘発またはＰ
ＣＲ媒介突然変異誘発を実施して、突然変異を導入することができ、本明細書で記載され
、実施例でも提示される、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイにお
いて、抗体結合性または他の対象の機能的特性に対する効果を査定することができる。保
存的修飾（上記で論じた）を導入することができる。突然変異は、アミノ酸の置換の場合
もあり、付加の場合もあり、欠失の場合もある。さらに、ＣＤＲ領域内の、典型的には１
つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下の残基も改変する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号７、３２、５２、７２、９２、１
１２、および１３２を有する群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号７、３２、
５２、７２、９２、１１２、１１２、および１３２と比較して、１、２、３、４、もしく
は５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列か
らなるＶＨ ＣＤＲ１領域、配列番号８、３３、５３、７３、９３、１１３、および１３
３からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号８、３３、５３、７３、９３
、１１３、および１３３と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、
アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２領域
、配列番号９、３４、５４、７４、９４、１１４、１１４、および１３４からなる群から
選択されるアミノ酸配列、または配列番号９、３４、５４、７４、９４、１１４、および
１３４と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、も
しくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３領域、配列番号１７、
４２、６２、８２、１０２、１２２、および１４２からなる群から選択されるアミノ酸配
列、または配列番号１７、４２、６２、８２、１０２、１２２、および１４２と比較して
、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付
加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１領域、配列番号１８、４３、６３、８３
、１０３、１２３、および１４３からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番
号１８、４３、６３、８３、１０３、１２３、および１４３と比較して、１、２、３、４
、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ
酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２領域、ならびに配列番号１９、４４、６４、８４、１０４
、１２４、および１４４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１９、
４４、６４、８４、１０４、１２４、および１４４と比較して、１、２、３、４、もしく
は５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を
有するＶＬ ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域からなる単離ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体
またはそれらの抗原結合性断片を提供する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号１０、３５、５５、７５、９５、
１１５、および１３５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１０、３
５、５５、７５、９５、１１５、および１３５と比較して、１、２、３、４、もしくは５
カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有す
るＶＨ ＣＤＲ１領域、配列番号１１、３６、５６、７６、９６、１１６、および１３６
からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１１、３６、５６、７６、９６
、１１６、および１３６と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、
アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２領域
、ならびに配列番号１２、３７、５７、７７、９７、１１７、および１３７からなる群か
ら選択されるアミノ酸配列、または配列番号１２、３７、５７、７７、９７、１１７、お
よび１３７と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失
、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３領域を有する重鎖
可変領域と、配列番号２０、４５、６５、８５、１０５、１２５、および１４５からなる
群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２０、４５、６５、８５、１０５、１２
５、および１４５と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ
酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１領域、配列
番号２１、４６、６６、８６、１０６、１２６、および１４６からなる群から選択される
アミノ酸配列、または配列番号２１、４６、６６、８６、１０６、１２６、および１４６
と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくは
アミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２領域、ならびに配列番号２２
、４７、６７、８７、１０７、１２７、および１４７からなる群から選択されるアミノ酸
配列、または配列番号２２、４７、６７、８７、１０７、１２７、および１４７と比較し
て、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸
付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域とからなる
単離ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片を提供する。
抗原結合性ドメインの、代替的なフレームワークまたは足場へのグラフティング
結果として得られるポリペプチドが、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する少なくとも１
つの結合性領域を含む限りにおいて、多種多様な抗体／免疫グロブリンのフレームワーク
または足場を援用することができる。このようなフレームワークまたは足場は、ヒト免疫
グロブリンまたはそれらの断片の５つの主要なイディオタイプを含み、好ましくはヒト化
側面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。この点で、ラクダ科動物において同定
される単一重鎖抗体などの単一重鎖抗体は、特に対象である。当業者により、新規のフレ
ームワーク、足場、および断片が、発見および開発され続けている。
一態様では、本発明は、本発明のＣＤＲをグラフトしうる非免疫グロブリン足場を使用
して、非免疫グロブリンベースの抗体を作り出すことに関する。それらが、標的のＡＮＧ
ＰＴＬ４タンパク質に特異的な結合性領域を含む限りにおいて、公知または将来の非免疫
グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場を援用することができる。公知の
非免疫グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場は、フィブロネクチン（Ｃ
ｏｍｐｏｕｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、アン
キリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒ
ｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；
およびＡｂｌｙｎｘ ｎｖ、Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（Ｐ
ｉｅｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、低分子
モジュラー免疫医薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｓ
ｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖ
ｉｅｗ、ＣＡ）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＧ、Ｓｗｅｄｅｎ）、およびアフ
ィリン（ガンマ－クリスタリンまたはユビキチン）（Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｇｍ
ｂＨ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むがこれらに限定されない。
フィブロネクチン足場は、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン（例えば、ＩＩＩ型フィ
ブロネクチンの第１０モジュール（１０ Ｆｎ３ドメイン））に基づく。ＩＩＩ型フィブ
ロネクチンドメインは、それら自体が互いに対してパックされてタンパク質のコアを形成
し、ベータ鎖を互いへと接続し、溶媒へと露出されるループもさらに含有する（ＣＤＲと
類似する）、２つのベータシートの間に分配された、７つまたは８つのベータ鎖を有する
。ベータシートサンドイッチの各エッジには、少なくとも３つのこのようなループがあり
、エッジは、ベータ鎖の方向に対して垂直なタンパク質の境界である（米国特許第６，８
１８，４１８号明細書を参照されたい）。全体的なフォールドは、ラクダおよびラマＩｇ
Ｇ内の抗原認識単位全体を含む最小の機能的抗体断片である重鎖可変領域のフォールドと
密接に関連するが、これらのフィブロネクチンベースの足場は、免疫グロブリンではない
。この構造のために、非免疫グロブリン抗体は、性質およびアフィニティーが抗体の性質
およびアフィニティーと類似する抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、ｉｎ ｖｉ
ｖｏにおける抗体のアフィニティー成熟の工程と類似する、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるル
ープのランダム化戦略およびシャフリング戦略において使用することができる。これらの
フィブロネクチンベースの分子は、標準的なクローニング法を使用して、分子のループ領
域を本発明のＣＤＲで置きかえうる、足場として使用することができる。
アンキリン技術は、アンキリンに由来するリピートモジュールを伴うタンパク質を、異
なる標的への結合に使用しうる可変領域を保有する足場として使用することに基づく。ア
ンキリンリピートモジュールとは、２つのアンチパラレルのα－ヘリックスおよびβ－タ
ーンからなる、３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソームディ
スプレイを使用することにより大部分が最適化される。
アビマーは、ＬＲＰ－１など、天然のＡドメイン含有タンパク質に由来する。これらの
ドメインは、本来、タンパク質間相互作用に使用され、ヒトでは、２５０を超えるタンパ
ク質が、構造的にＡドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して連結され
た多数の（２つ～１０の）異なる「Ａドメイン」単量体からなる。標的抗原に結合しうる
アビマーは、例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号明細書；同第２００
５００５３９７３号明細書；同第２００５００４８５１２号明細書；および同第２００６
０００８８４４号明細書において記載されている方法を使用して創出することができる。
アフィニティーリガンドであるアフィボディとは、プロテインＡのＩｇＧ結合性ドメイ
ンのうちの１つの足場に基づく３ヘリックスバンドルからなる、低分子の単純なタンパク
質である。プロテインＡとは、細菌である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に
由来する表面タンパク質である。この足場ドメインは、それらのうちの１３が、多数のリ
ガンド変異体を伴うアフィボディライブラリーを作り出す、ランダム化されている５８ア
ミノ酸からなる（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号明細書を参照されたい）。ア
フィボディ分子は、抗体を模倣し、１５０ｋＤａである抗体の分子量と比較して、分子量
が６ｋＤａである。その小サイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は、抗体
の結合部位と同様である。
アンチカリンとは、Ｐｉｅｒｉｓ ＰｒｏｔｅｏＬａｂ ＡＧ社により開発された生成
物である。アンチカリンは、通例、化学的に感受性の化合物または不溶性の化合物の生理
学的輸送または貯蔵に関与する、広範にわたる低分子の頑健なタンパク質群であるリポカ
リンに由来する。いくつかの天然リポカリンは、ヒト組織内またはヒト体液中で生じる。
タンパク質のアーキテクチャーは、リジッドフレームワークの上部の超可変ループを伴う
免疫グロブリンを連想させる。しかし、抗体またはそれらの組換え断片とは対照的に、リ
ポカリンは、単一の免疫グロブリンドメインよりかろうじて大きい、１６０～１８０アミ
ノ酸残基を伴う単一のポリペプチド鎖からなる。結合性ポケットを構成する４つのループ
のセットは、顕著な構造可塑性を示し、様々な側鎖を許容する。したがって、異なる形状
の規定の標的分子を、高度なアフィニティーおよび特異性で認識するために、結合性部位
を独自の工程で再形成することができる。４つのループのセットを突然変異誘発すること
によりアンチカリンを開発するのには、リポカリンファミリーの１つのタンパク質である
、オオモンシロチョウ（Pieris Brassicae）のビリン結合性タンパク質（ＢＢＰ）が使用
されている。アンチカリンについて記載する特許出願の１つの例は、ＰＣＴ国際公開第１
９９９１６８７３号パンフレットにある。
アフィリン分子とは、タンパク質および低分子に対する特異的なアフィニティーのため
にデザインされた低分子非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン分子は、
それらの各々が、異なるヒト由来の足場タンパク質に基づく２つのライブラリーから非常
に迅速に選択することができる。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質に対する
いかなる構造相同性も示さない。現在、２つのアフィリン足場が援用されており、それら
のうちの一方は、ヒト水晶体の構造タンパク質であるガンマクリスタリンであり、他方は
、「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。いずれのヒト足場も非常に小型
で、高度な熱安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤に対してほぼ耐性である。この高度な
安定性は主に、タンパク質のベータシート構造の展開に起因する。ガンマクリスタリンに
由来するタンパク質の例は、国際公開第２００１０４１４４号パンフレットにおいて記載
されており、「ユビキチン様」タンパク質の例は、国際公開第２００４１０６３６８号パ
ンフレットにおいて記載されている。
タンパク質エピトープ模倣体（ＰＥＭ）とは、タンパク質間相互作用に関与する主要な
二次構造である、タンパク質のベータ－ヘアピン二次構造を模倣する、中程度のサイズの
環状ペプチド様分子（分子量：１～２ｋＤａ）である。
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に特異的に結合する完全ヒト抗体を提供する。キ
メラ抗体またはヒト化抗体と比較して、本発明のヒトＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体は、ヒト
対象へと投与された場合の抗原性がさらに低減されている。
ラクダ科動物抗体
ラマ種（アルパカ（Lama paccos）、ラマ（Lama glama）、およびビクーニャ（Lama vi
cugna））などの新世界メンバー含む、ラクダおよびヒトコブラクダ（dromedary）（フタ
コブラクダ（Camelus bactrianus）およびヒトコブラクダ（Calelus dromaderius））フ
ァミリーのメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性、およびヒト
対象に対する抗原性に関して特徴付けられている。天然で見出されるこのファミリーの哺
乳動物に由来するある種のＩｇＧ抗体は、軽鎖を欠き、したがって、他の動物に由来する
抗体の場合の、２つの重鎖および２つの軽鎖を有する、典型的な４つの鎖の四次構造とは
構造的に異なっている。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４（１９９４年３月３日に公表され
た国際公開第９４／０４６７８号パンフレット）を参照されたい。
ＶＨＨとして同定される小型の単一の可変ドメインである、ラクダ科動物抗体の領域は
、標的に対して高いアフィニティーを有する低分子タンパク質をもたらすことから、「ラ
クダ科動物ナノボディ」として公知の低分子量抗体由来タンパク質を結果としてもたらす
遺伝子操作により得ることができる。１９９８年６月２日に取得された米国特許第５，７
５９，８０８号明細書を参照されたい。また、Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Che
m 279:1256-1261；Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424:783-788；Pleschberger, M.
et al., 2003 Bioconjugate Chem 14:440-448；Cortez-Retamozo, V. et al., 2002 Int
J Cancer 89:456-62；およびLauwereys, M. et al., 1998 EMBO J 17:3512-3520も参照さ
れたい。ラクダ科動物抗体および抗体断片の操作ライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ
、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト由来の他の抗体と同様に、ラ
クダ科動物抗体のアミノ酸配列は、ヒト配列により酷似する配列を得るように、組換えに
より改変することができる、すなわち、ナノボディは、「ヒト化」することができる。し
たがって、ヒトに対するラクダ科動物抗体の天然の小さな抗原性を、さらに低減すること
ができる。
ラクダ科動物ナノボディの分子量は、ヒトＩｇＧ分子の分子量の約１０分の１で、タン
パク質の物理的直径は、数ナノメートルに過ぎない。サイズが小さいことの１つの帰結は
、大型の抗体タンパク質には機能的に不可視である抗原性部位に結合するラクダ科動物ナ
ノボディの能力である、すなわち、ラクダ科動物ナノボディは、古典的な免疫学的技法を
使用するこれ以外の形では隠蔽されたままの抗原を検出する試薬として有用であり、可能
な治療剤として有用である。したがって、サイズが小さいことのさらに別の帰結は、ラク
ダ科動物ナノボディが、標的タンパク質のグルーブ内または狭小なクレフト内の特異的部
位に結合することの結果として、標的タンパク質を阻害することが可能であり、よって、
古典的な抗体の機能よりも、古典的な低分子量の薬物の機能により酷似する能力において
用いられうることである。
低分子量およびコンパクトなサイズはさらに、熱安定性が極めて大きく、極端なｐＨお
よびタンパク質分解性消化に対して安定的であり、抗原性が小さいラクダ科動物ナノボデ
ィを結果としてもたらす。別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、循環系から組織へと
たやすく移動し、血液脳関門もなお越え、神経組織に影響を及ぼす障害も処置しうること
である。ナノボディはさらに、血液脳関門を越える薬物輸送も容易としうる。２００４年
８月１９日に公表された米国特許出願公開第２００４０１６１７３８号明細書を参照され
たい。これらの特色を、ヒトに対する抗原性が小さいことと組み合わせることにより、大
きな治療的可能性が指し示される。さらに、これらの分子は、大腸菌（E. coli）などの
原核細胞内で完全に発現させることができ、バクテリオファージとの融合タンパク質とし
て発現させ、機能的である。
したがって、本発明の特色は、ＡＮＧＰＴＬ４に対して高いアフィニティーを有するラ
クダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディである。本明細書のある種の実施形態では
、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディは、天然ではラクダ科動物において産
生される、すなわち、他の抗体について本明細書で記載される技法を使用する、ＡＮＧＰ
ＴＬ４またはそのペプチド断片による免疫化の後で、ラクダ科動物により産生される。代
替的に、ＡＮＧＰＴＬ４結合性ラクダ科動物ナノボディは、操作もされる、すなわち、例
えば、本明細書の実施例において記載されている、標的としてのＡＮＧＰＴＬ４を伴うパ
ニング手順を使用する、適切に突然変異誘発されたラクダ科動物ナノボディタンパク質を
提示するファージライブラリーからの選択によっても作製される。操作されたナノボディ
はさらに、遺伝子操作により、レシピエント対象における半減期が、４５分間～２週間と
なるようにカスタマイズすることもできる。具体的な実施形態では、ラクダ科動物抗体ま
たはラクダ科動物ナノボディを、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４において記載さ
れている通り、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列を、ナノボディまたは単
一ドメイン抗体フレームワーク配列へとグラフトすることにより得る。
二特異性分子および多価抗体
別の態様では、本発明は、本発明のＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体またはその断片を含む二
特異性分子または多特異性分子を特色とする。本発明の抗体またはその抗原結合性領域は
、少なくとも２つの異なる結合性部位または標的分子に結合する二特異性分子を作り出す
ように誘導体化することもでき、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク
質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）へと連結することもできる。本発
明の抗体は実際、３つ以上の異なる結合性部位および／または標的分子に結合する多特異
性分子を作り出すように誘導体化することもでき、他の２つ以上の機能的分子へと連結す
ることもでき、このような多特異性分子はまた、本明細書で使用される「二特異性分子」
という用語により包含されることも意図される。本発明の二特異性分子を創出するには、
本発明の抗体を、二特異性分子が結果として得られるように、別の抗体、抗体断片、ペプ
チド、または結合性模倣体など、１つまたは複数の他の結合性分子へと機能的に連結する
（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合により、またはこれら以
外の形で）ことができる。
したがって、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に対する少なくとも１つの第１の結合特異性お
よび第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二特異性分子を含む。例えば
、第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープと異なる、ＡＮＧＰＴＬ４の別のエピ
トープである。
加えて、二特異性分子が多特異性である本発明では、分子は、第１の標的エピトープお
よび第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性もさらに含みうる。
一実施形態では、本発明の二特異性分子は、結合特異性として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａ
ｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体またはその
抗体断片を含む。抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖の二量体、またはＬａｄｎｅｒら、米国
特許第４，９４６，７７８号明細書において記載されている、Ｆｖもしくは単鎖構築物な
ど、その任意の最小断片でありうる。
ダイアボディとは、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには短すぎるリ
ンカーにより接続されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを単一のポリペプチド鎖上で発
現させた、二価の二特異性分子である。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別の鎖の相
補的なドメインと対合し、これにより、２つの抗原結合性部位を創出する（例えば、Holl
iger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak et al., 1994 S
tructure 2:1121-1123を参照されたい）。ダイアボディは、ＶＨＡ－ＶＬＢおよびＶＨＢ
－ＶＬＡ構造（ＶＨ－ＶＬ立体配置）、またはＶＬＡ－ＶＨＢおよびＶＬＢ－ＶＨＡ構造
（ＶＬ－ＶＨ立体配置）を伴う２つのポリペプチド鎖を、同じ細胞内で発現させることに
より作製することができる。ダイアボディの大半は、細菌内の可溶性形態で発現させるこ
とができる。単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、２つのダイアボディ形成ポリペプチド鎖
を、約１５アミノ酸残基のリンカーで接続することにより作製する（Holliger and Winte
r, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45（3～4）:128～30；Wu et al., 1996 Immunot
echnology, 2（1）:21-36を参照されたい）。ｓｃＤｂは、細菌内の可溶性で活性の単量
体形態で発現させることができる（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immuno
ther., 45（34）:128-30；Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2（1）:21-36；Pluckthu
n and Pack, 1997 Immunotechnology, 3（2）:83-105；Ridgway et al.,、1996 Protein
Eng., 9（7）:617-21を参照されたい）。ダイアボディをＦｃへと融合させて、「ジダイ
アボディ」を作り出すことができる（Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279（4）:2856-
65を参照されたい）。
本発明の二特異性分子内で援用しうる他の抗体は、マウスモノクローナル抗体、キメラ
モノクローナル抗体、およびヒト化モノクローナル抗体である。
二特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、構成要素である結合特異性をコ
ンジュゲートさせることにより調製することができる。例えば、二特異性分子の各結合特
異性は、個別に作り出し、次いで、互いとコンジュゲートさせることができる。結合特異
性がタンパク質またはペプチドである場合は、様々なカップリング剤または架橋剤を、共
有結合的コンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カ
ルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５
，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド
（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン
－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovsky et al., 1984
J. Exp. Med. 160:1686；Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648
を参照されたい）。他の方法は、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78、118-132；B
rennan et al., 1985 Science 229:81-83；およびGlennie et al., 1987 J. Immunol. 13
9:2367-2375において記載されている方法を含む。コンジュゲート剤は、ＳＡＴＡおよび
スルホ－ＳＭＣＣであり、いずれも、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃ
ｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手可能である。
結合特異性が、抗体である場合、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域をスルフヒ
ドリル結合させることによりコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態では、
コンジュゲーションの前に、奇数のスルフヒドリル残基、例えば、１つのスルフヒドリル
残基を含有するように、ヒンジ領域を修飾する。
代替的に、いずれの結合特異性も、同じベクター内でコードさせ、同じ宿主細胞内で発
現およびアセンブルさせることができる。この方法は、二特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ
融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク
質、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に、特に有用である。本発明の二
特異性分子は、１つの単鎖抗体および結合決定基を含む単鎖分子の場合もあり、２つの結
合決定基を含む単鎖二特異性分子の場合もある。二特異性分子は、少なくとも２つの単鎖
分子を含みうる。二特異性分子を調製する方法については、例えば、米国特許第５，２６
０，２０３号明細書；米国特許第５，４５５，０３０号明細書；米国特許第４，８８１，
１７５号明細書；米国特許第５，１３２，４０５号明細書；米国特許第５，０９１，５１
３号明細書；米国特許第５，４７６，７８６号明細書；米国特許第５，０１３，６５３号
明細書；米国特許第５，２５８，４９８号明細書；および米国特許第５，４８２，８５８
号明細書において記載されている。
それらの特異的な標的に対する二特異性分子の結合は、例えば、酵素免疫測定アッセイ
（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（例
えば、成長阻害アッセイ）、またはウェスタンブロットアッセイにより確認することがで
きる。これらのアッセイの各々では一般に、対象の複合体に特異的な、標識された試薬（
例えば、抗体）を援用することにより、特に対象となるタンパク質－抗体間複合体の存在
が検出される。
別の態様では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する、本発明の抗体の少なくとも２つ
の同一であるかまたは異なる抗原結合性部分を含む、多価化合物を提供する。抗原結合性
部分は、タンパク質の融合または共有結合的連結もしくは非共有結合的連結を介して、併
せて連結することができる。代替的に、二特異性分子のための連結法も記載されている。
四価化合物は、例えば、本発明の抗体（antibodies of the antibodies of the inventio
n）を、本発明の抗体の定常領域に結合する抗体、例えば、Ｆｃ領域またはヒンジ領域と
架橋することにより得ることができる。
三量体化ドメインについては、例えば、Ｂｏｒｅａｎによる特許である欧州特許第１０
１２２８０号明細書において記載されている。五量体化モジュールについては、例えば、
ＰＣＴ／ＥＰ９７／０５８９７において記載されている。
半減期を延長した抗体
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長した、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に特
異的に結合する抗体を提供する。
多くの因子が、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるタンパク質の半減期に影響を及ぼしうる。例え
ば、腎臓における濾過、肝臓における代謝、タンパク質分解性酵素（プロテアーゼ）によ
る分解、および免疫原性応答（例えば、抗体によるタンパク質の中和およびマクロファー
ジおよび樹状細胞による取込み）。様々な戦略を使用して、本発明の抗体の半減期を延長
することができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥ ＰＥＧ
、抗体足場、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミ
ン結合性リガンド、および炭水化物シールドとの化学的連結により、アルブミン、ＩｇＧ
、ＦｃＲｎ、およびトランスフェリン（transferring）などの血清タンパク質に結合する
タンパク質との遺伝子融合により、ナノボディ、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、アフ
ィボディ、およびアンチカリンなど、血清タンパク質に結合する他の結合部分とカップリ
ングする（遺伝子的または化学的に）ことにより、ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンの
ドメイン、アルブミン結合性タンパク質、およびＦｃとの遺伝子融合により、またはナノ
担体、徐放製剤、もしくは医療デバイスへの組込みにより、本発明の抗体の半減期を延長
することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体の血清中循環を延長するため、高分子量のＰＥＧなど、不
活性のポリマー分子を、ＰＥＧの、抗体のＮ末端もしくはＣ末端への部位特異的コンジュ
ゲーションを介して、またはリシン残基上に存在するイプシロン－アミノ基を介して、多
官能性リンカーを伴うかまたは多官能性リンカーを伴わない、抗体またはそれらの断片へ
と付着することができる。抗体をＰＥＧ化するには、抗体またはその断片を、ポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのＰＥＧと、１つ
または複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着する条件下で反応させることが典型的
である。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似する反応性の水溶性ポリマー）との
アシル化反応またはアルキル化反応により実行することができる。本明細書で使用される
「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシ－ポリエチ
レングリコールもしくはアリールオキシ－ポリエチレングリコールまたはポリエチレング
リコール－マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するのに使用されているＰＥＧの
形態のうちのいずれかを包含することを意図するものである。ある種の実施形態では、Ｐ
ＥＧ化される抗体は、脱グリコシル化抗体である。直鎖状ポリマーまたは分枝状ポリマー
の誘導体化であって、生物学的活性の喪失を結果として最小とする誘導体化が、使用され
るであろう。コンジュゲーションの程度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび質量分析により緊密
にモニタリングして、ＰＥＧ分子の抗体への適正なコンジュゲーションを確認することが
できる。反応しなかったＰＥＧは、サイズ除外クロマトグラフィーまたはイオン交換クロ
マトグラフィーにより、抗体－ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。ＰＥＧ
誘導体化抗体は、当業者に周知の方法を使用して、例えば、本明細書で記載されるイムノ
アッセイにより、結合活性ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性について調べることが
できる。当技術分野では、タンパク質をＰＥＧ化する方法が知られており、本発明の抗体
に適用することができる。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらによる欧州特許第０１５４３１
６号明細書およびＩｓｈｉｋａｗａらによる欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照さ
れたい。
他の改変されたＰＥＧ化技術は、ｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡを含む再構成系
を介して、化学的に特定された側鎖を、生合成タンパク質へと組み込む、再構成化学的直
交性直接操作技術（reconstituting chemically orthogonal directed engineering）（
ＲｅＣＯＤＥ ＰＥＧ）を含む。この技術は、３０を超える新たなアミノ酸の、大腸菌（
E. coli）細胞内、酵母細胞内、および哺乳動物細胞内の生合成タンパク質への組込みを
可能とする。ｔＲＮＡは、非天然アミノ酸を、アンバーコドンが配置される任意の位置へ
と組み込み、終止コドンから、化学的に特定されたアミノ酸の組込みをシグナル伝達する
コドンへとアンバーを転換する。
組換えＰＥＧ化技術（ｒＰＥＧ）はまた、血清半減期の延長にも使用することができる
。この技術は、３００～６００アミノ酸の非構造化タンパク質テールを、既存の医薬用タ
ンパク質へと遺伝子融合させることを伴う。このような非構造化タンパク質鎖の見かけの
分子量は、その実際の分子量の約１５倍であるため、タンパク質の血清半減期は、大きく
増大する。化学的コンジュゲーションおよび再精製を要求する従来のＰＥＧ化とは対照的
に、製造工程は大きく簡略化され、生成物は、均質である。
ポリシアリル化は、天然のポリマーであるポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用して、活性寿
命を延長し、治療用ペプチドおよび治療用タンパク質の安定性を改善する、別の技術であ
る。ＰＳＡとは、シアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質および治療用ペプチドの
薬物送達に使用される場合、コンジュゲーション時に、ポリシアル酸は、保護的微小環境
をもたらす。これは、循環内の治療用タンパク質の活性寿命を延長し、それが免疫系によ
り認識されることを防止する。ＰＳＡポリマーは、天然では、ヒト体内で見出される。Ｐ
ＳＡは、数百万年にわたり、それらの壁をＰＳＡでコーティングするように進化したある
種の細菌により採用された。次いで、これらの天然でポリシアリル化した細菌は、分子的
模倣により、体内の防御系を失効化することが可能となった。自然の究極のステルス技術
であるＰＳＡは、このような細菌から、大量に、かつ、所定の物理的特徴を伴って、容易
に作製することができる。細菌ＰＳＡは、ヒト体内ではＰＳＡと化学的に同一であるので
、タンパク質へとカップリングさせた場合でもなお、完全に非免疫原性である。
別の技術は、抗体に連結されたヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）誘導体の使用
を含む。ＨＥＳとは、蝋状トウモロコシデンプンに由来する、修飾された天然ポリマーで
あり、体内の酵素により代謝されうる。ＨＥＳ溶液は通例、血液量不足を補い、血液のレ
オロジー特性を改善するために投与される。抗体のＨＥＳ化は、分子の安定性を増大させ
ることのほか、腎クリアランスを低減することによっても、循環半減期の延長を可能とし
、生物学的活性の増大を結果としてもたらす。ＨＥＳの分子量など、異なるパラメータを
改変することにより、広範にわたるＨＥＳ抗体コンジュゲートをカスタマイズすることが
できる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体はまた、１つまたは複数のアミノ酸修飾
（すなわち、置換、挿入、または欠失）を、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのＦｃＲｎ結合
性断片（好ましくはＦｃドメイン断片またはヒンジＦｃドメイン断片）へと導入しても作
り出すことができる。例えば、国際公開第９８／２３２８９号パンフレット、国際公開第
９７／３４６３１号パンフレット；および米国特許第６，２７７，３７５号明細書を参照
されたい。
さらに、抗体または抗体断片を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてより安定的とするか、または
ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長するために、抗体を、アルブミン（例えば、ヒト血
清アルブミン；ＨＳＡ）へとコンジュゲートさせることもできる。当技術分野では、技法
が周知であり、例えば、国際公開第９３／１５１９９号パンフレット、同第９３／１５２
００号パンフレット、および同第０１／７７１３７号パンフレット；ならびに欧州特許第
４１３，６２２号明細書を参照されたい。加えて、上記で記載した二特異性抗体の文脈で
は、抗体の特異性は、抗体の１つの結合性ドメインが、ＡＮＧＰＴＬ４に結合するのに対
し、抗体の第２の結合性ドメインは、血清アルブミン、好ましくは、ＨＳＡに結合するよ
うにデザインすることもできる。
半減期を延長するための戦略は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期の延長が所望される、
ナノボディ、フィブロネクチンベースの結合剤、および他の抗体またはタンパク質におい
てとりわけ有用である。
抗体コンジュゲート
本発明は、融合タンパク質を作り出すように、異種タンパク質または異種ポリペプチド
へと（またはその断片、好ましくは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０
、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０
、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチドへと）、組換えによ
り融合させるかまたは化学的にコンジュゲートさせた（共有結合的コンジュゲーションお
よび非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む）、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に特異
的に結合する抗体またはそれらの断片を提供する。特に、本発明は、本明細書で記載され
る抗体の抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片
、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬ ＣＤＲ）と、異種タンパク
質、異種ポリペプチド、または異種ペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。当技術
分野では、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを、抗体または抗体断片と融合ま
たはコンジュゲートさせる方法が知られている。例えば、米国特許第５，３３６，６０３
号明細書、同第５，６２２，９２９号明細書、同第５，３５９，０４６号明細書、同第５
，３４９，０５３号明細書、同第５，４４７，８５１号明細書、および同第５，１１２，
９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号明細書および同第３６７，１６６号明細書
；国際公開第９６／０４３８８号パンフレットおよび同第９１／０６５７０号パンフレッ
ト；Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539；Zheng et
al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600；およびVil et al., 1992, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89:11337-11341を参照されたい。
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシ
ャフリング、および／またはコドンシャフリング（まとめて、「ＤＮＡシャフリング」と
称する）の技法を介して作り出すことができる。ＤＮＡシャフリングを援用して、本発明
の抗体またはそれらの断片の活性を改変する（例えば、アフィニティーが大きく、解離速
度が小さい抗体またはそれらの断片）ことができる。一般に、米国特許第５，６０５，７
９３号明細書、同第５，８１１，２３８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書、同
第５，８３４，２５２号明細書、および同第５，８３７，４５８号明細書；Patten et al
., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol.
16（2）:76-82；Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76；ならびにLorenzo a
nd Blasco, 1998, Biotechniques 24（2）:308-313（これらの特許および刊行物の各々は
、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる）を参照されたい。抗体もし
くはそれらの断片、またはコードされる抗体もしくはそれらの断片は、組換えの前に、エ
ラープローンＰＣＲによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、または他
の方法にかけることにより改変することができる。ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に特異的に
結合する抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の異種分
子の１つまたは複数の成分、モチーフ、区間、一部、ドメイン、断片などで組み換えるこ
とができる。
さらに、抗体またはそれらの断片は、精製を容易とするペプチドなどのマーカー配列へ
と融合させることもできる。好ましい実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、それら
のうちの多くが市販されている中でとりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．
、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）にお
いて提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。Gentz et al., 1989,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824において記載されている通り、例えば、ヘキサ
ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグ
は、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープ（Wilson et al., 1
984, Cell 37:767）に対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ、および「フラッグ」タ
グを含むがこれらに限定されない。
他の実施形態では、本発明の抗体またはそれらの断片を、診断剤または検出可能薬剤へ
とコンジュゲートさせる。このような抗体は、疾患または障害の発生、発症、進行、およ
び／または重症度を、特定の治療の有効性を決定することなど、臨床検査手順の一部とし
てモニタリングまたは予後診断するのに有用でありうる。このような診断および検出は、
抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダ
ーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどであるがこれらに限定されない多様な酵素
；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどであるがこれらに限定さ
れない補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイ
ン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、また
はフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光材料；ルミノールなどである
がこれらに限定されない発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンな
どであるがこれらに限定されない生物発光材料；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ
、および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウ
ム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネシウム（９９Ｔ
ｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３
Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３
Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９
０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇ
ｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４
Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎなどであるがこれらに限定されない放
射性材料；ならびに多様なポジトロン断層法を使用するポジトロン放出金属および非放射
性の常磁性金属イオンを含むがこれらに限定されない検出可能な物質へとカップリングす
ることにより達成することができる。
本発明は、治療用部分へとコンジュゲートさせた抗体またはそれらの断片の使用もさら
に包含する。抗体またはその断片は、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤または殺細胞剤
、治療剤または放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体などの治療用部分へとコンジ
ュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞傷害剤は、細胞に有害な任意の薬剤を
含む。
さらに、抗体またはその断片は、所与の生物学的応答を修飾する治療用部分または薬物
部分へとコンジュゲートさせることもできる。治療用部分または薬物部分は、古典的化学
的治療剤に限定されるとは見なされないものとする。例えば、薬物部分は、所望の生物学
的活性を保有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドでありうる。このようなタ
ンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス属外毒素、コレラ毒素、また
はジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α－インターフェロン、β－インターフェ
ロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトー
シス剤、抗血管新生剤；または例えば、リンホカインなどの生体応答修飾剤などのタンパ
ク質を含みうる。
さらに、抗体は、２１３Ｂｉなどのアルファ放射体（alph-emiter）などの放射性金属
イオン、１３１Ｉｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含むがこれらに
限定されない放射性金属イオンを、ポリペプチドへとコンジュゲートするのに有用な大環
状キレート化剤などの治療用部分へとコンジュゲートさせることもできる。ある種の実施
形態では、大環状キレート化剤は、リンカー分子を介して抗体へと付着させうる、１，４
，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－テトラ酢酸（Ｄ
ＯＴＡ）である。当技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、各々が
参照によりそれらの全体において組み込まれる、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Re
s. 4（10）:2483-90；Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10（4）:553-7；およ
びZimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26（8）:943-50において記載されている
。
治療用部分を、抗体へとコンジュゲートさせるための技法は周知であり、例えば、Arno
n et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy"
, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al.（eds.）, pp.243-56（
Alan R. Liss, Inc. 1985）；Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", Con
trolled Drug Delivery（2nd Ed.）, Robinson et al.,（eds.）, pp.623-53（Marcel De
kker, Inc. 1987）；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Ther
apy: A Review", Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications,
Pinchera et al.（eds.）, pp.475-506（1985）；"Analysis, Results, And Future Pros
pective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Mono
clonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.（eds.）, pp.3
03-16（Academic Press 1985）；およびThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58
を参照されたい。
抗体はまた、特に、イムノアッセイまたは標的抗原の精製に有用な固体支持体へと付着
させることもできる。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミ
ド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンを含むがこれらに
限定されない。
本発明の抗体を作製する方法
抗体をコードする核酸
本発明は、上記で記載したＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体鎖のセグメントまたはドメインを
含むポリペプチドをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核酸
のいくつかは、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、または１３８に示され
る重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、および／または配列番号２３、４８、６
８、８８、１０８、１２８、または１４８に示される軽鎖可変領域をコードするヌクレオ
チド配列を含む。具体的な実施形態では、核酸分子は、表１において同定される核酸分子
である。本発明の他のいくつかの核酸分子は、表１において同定される核酸分子のヌクレ
オチド配列と実質的に（例えば、少なくとも６５、８０％、９５％、または９９％）同一
なヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターから発現させるとき、これらのポリヌク
レオチドによりコードされるポリペプチドは、ＡＮＧＰＴＬ４抗原結合能を呈示すること
が可能である。
本発明ではまた、上記で示したＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体の重鎖または軽鎖に由来する
少なくとも１つのＣＤＲ領域、および、通例３つ全てのＣＤＲ領域をコードするポリヌク
レオチドも提供される。他のいくつかのポリヌクレオチドは、上記で示したＡＮＧＰＴＬ
４結合性抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域配列の全てまたは実質的に全てをコー
ドする。コードの縮重性のために、様々な核酸配列は、免疫グロブリンアミノ酸配列の各
々をコードするであろう。
本発明の核酸分子は、抗体の可変領域および定常領域の両方をコードしうる。本発明の
核酸配列のうちのいくつかは、配列番号１５、２８、４０、６０、８０、１００、１２０
、および１４０に示される重鎖配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、ま
たは９９％）同一な重鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。他のいくつかの核酸配列
は、配列番号２５、５０、７０、９０、１１０、１３０、および１５０に示される軽鎖配
列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、または９９％）同一な軽鎖配列をコ
ードするヌクレオチドを含む。
ポリヌクレオチド配列は、デノボの固相ＤＮＡ合成、またはＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体
またはその結合性断片をコードする既存の配列（例えば、下記の実施例で記載される配列
）に対するＰＣＲによる突然変異誘発により作製することができる。核酸の直接的な化学
合成は、Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90によるホスホトリエステル法；Bro
wn et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979によるホスホジエステル法；Beaucage et al.,
Tetra. Lett., 22:1859, 1981によるジエチルホスホルアミダイト法；および米国特許第
４，４５８，０６６号明細書による固体支持体法など、当技術分野で公知の方法により達
成することができる。ＰＣＲによる、突然変異の、ポリヌクレオチド配列への導入は、例
えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Er
lich（Ed.）, Freeman Press, NY, NY, 1992；PCR Protocols: A Guide to Methods and
Applications, Innis et al.（Ed.）, Academic Press, San Diego, CA, 1990；Mattila
et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991；およびEckert et al., PCR Methods and Ap
plications 1:17, 1991において記載されている通りに実施することができる。
本発明ではまた、上記で記載したＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を作製するための発現ベク
ターおよび宿主細胞も提供される。多様な発現ベクターを、援用して、ＡＮＧＰＴＬ４結
合性抗体鎖または結合性断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。
ウイルスベースの発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターのいずれを使用しても、哺
乳動物宿主細胞内で抗体を作製することができる。非ウイルスベクターおよび非ウイルス
系は、プラスミド、典型的に、タンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセット
を伴うエピソームベクター、およびヒト人工染色体を含む（例えば、Harrington et al.,
Nat Genet 15:345, 1997を参照されたい）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞内
のＡＮＧＰＴＬ４結合性ポリヌクレオチドおよびＡＮＧＰＴＬ４結合性ポリペプチドの発
現に有用な非ウイルスベクターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ｂ、およ
びｐＴｈｉｏＨｉｓ Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、ｐＥＢＶＨ
ｉｓ Ｂ、およびｐＥＢＶＨｉｓ Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃ
Ａ）、ＭＰＳＶベクター、ならびに他のタンパク質を発現させるための、当技術分野で公
知の他の多数のベクターを含む。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウ
イルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベ
クター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベ
クター、およびセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）を含む。Brent et al.,前出；Smith,
Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995；およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1992を
参照されたい。
発現ベクターの選択は、その中でベクターを発現させる、意図される宿主細胞に依存す
る。発現ベクターは、ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体鎖または断片をコードするポリヌクレオ
チドに作動可能に連結されたプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー）
を含有することが典型的である。いくつかの実施形態では、誘導条件下を除き、挿入され
た配列の発現を防止するのに、誘導的プロモーターを援用する。誘導的プロモーターは、
例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプ
ロモーターを含む。形質転換された生物の培養物は、それらの発現産物が宿主細胞により
良好に許容されるコード配列の集団にバイアスをかけずに、非誘導条件下で増殖させるこ
とができる。プロモーターに加えて、他の調節的エレメントもまた、ＡＮＧＰＴＬ４結合
性抗体鎖または断片の効率的な発現に要求または所望される可能性がある。これらのエレ
メントは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接のリボソーム結合性部位または他の配列を典型的
に含む。加えて、発現の効率は、使用される細胞系に適するエンハンサーを組み入れるこ
とにより増強することもできる（例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ.
20:125, 1994；およびBittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照されたい
）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主
細胞内の発現を増大させることができる。
発現ベクターはまた、挿入されたＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体配列によりコードされるポ
リペプチドとの融合タンパク質を形成するように、分泌シグナル配列の位置ももたらしう
る。挿入されたＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体配列は、ベクター内に組み入れる前に、シグナ
ル配列へと連結することが多い。ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体の軽鎖可変ドメインおよび重
鎖可変ドメインをコードする配列を受容するのに使用されるベクターは、場合によってま
た、定常領域またはそれらの一部もコードする。このようなベクターは、定常領域との融
合タンパク質としての可変領域の発現を可能とし、これにより、インタクトな抗体または
それらの断片の作製をもたらす。このような定常領域は、ヒト定常領域であることが典型
的である。
ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体鎖を保有し、これを発現させるための宿主細胞は、原核細胞
の場合もあり、真核細胞の場合もある。大腸菌（E. coli）は、本発明のポリヌクレオチ
ドをクローニングし、発現させるのに有用な１つの原核生物宿主である。使用に適する他
の微生物宿主は、枯草菌（Bacillus subtilis）などの桿菌、およびサルモネラ（Salmone
lla）属種、セラチア（Serratia）属種、および多様なシュードモナス（Pseudomonas）属
種など、他の腸内細菌科を含む。これらの原核生物宿主内ではまた、典型的に、宿主細胞
と適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターも作製することが
できる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系
、ベータ－ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダに由来するプロモーター
系など、任意の数の、様々な周知のプロモーターも存在する。プロモーターは、任意選択
で、オペレーター配列により発現を制御することが典型的であるが、転写および翻訳を開
始して終結させるためのリボソーム結合性部位配列なども有する。本発明のＡＮＧＰＴＬ
４結合性ポリペプチドを発現させるのに、酵母など、他の微生物もまた援用することがで
きる。また、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用することができる
。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明のＡＮＧＰＴＬ４結合性ポリペプチドを発現
させ、作製するのに、哺乳動物宿主細胞を使用する。例えば、それらは、内因性免疫グロ
ブリン遺伝子を発現させるハイブリドーマ細胞系（例えば、実施例で記載される、１Ｄ６
．Ｃ９骨髄腫ハイブリドーマクローン）の場合もあり、外因性発現ベクターを保有する哺
乳動物細胞系（例えば、下記で例示されるＳＰ２／０骨髄腫細胞）の場合もある。それら
は、任意の正常非不死化動物細胞または正常不死化動物細胞もしくは非正常不死化動物細
胞またはヒト細胞を含む。例えば、ＣＨＯ細胞系、多様なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、
骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞、およびハイブリドーマを含む、インタクトな免疫グロブ
リンを分泌することが可能な多数の適切な宿主細胞系が開発されている。ポリペプチドを
発現させるための、哺乳動物組織細胞培養物の使用については、例えば、Winnacker, FRO
M GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987において一般に論じられている
。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハン
サーなどの発現制御配列（例えば、Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照
されたい）、ならびにリボソーム結合性部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部
位、および転写ターミネーター配列などの、必要なプロセシング情報部位を含みうる。こ
れらの発現ベクターは通例、哺乳動物遺伝子に由来するプロモーターまたは哺乳動物ウイ
ルスに由来するプロモーターを含有する。適切なプロモーターは、構成的プロモーター、
細胞型特異的プロモーター、段階特異的プロモーター、および／またはモジュレート可能
プロモーターもしくは調節可能プロモーターでありうる。有用なプロモーターは、メタロ
チオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン
誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモータ
ー、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト即
初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当技術分野で公知の
プロモーター－エンハンサーの組合せを含むがこれらに限定されない。
対象のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の種
類に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが一般に原核細胞に
活用されるのに対し、リン酸カルシウム処理または電気穿孔は、他の細胞宿主に使用する
ことができる（一般に、Sambrook et al.,前出を参照されたい）。他の方法は、例えば、
電気穿孔、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介型形質転換、注射およびマイクロイン
ジェクション、遺伝子銃法、ウィロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コン
ジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質である
ＶＰ２２との融合体（Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤増強型取
込み、およびｅｘ ｖｉｖｏにおける形質導入を含む。組換えタンパク質の長期にわたる
高収率作製のためには、安定的発現が所望されることが多い。例えば、ＡＮＧＰＴＬ４結
合性抗体鎖または結合性断片を安定的に発現させる細胞系は、ウイルス複製起点または内
因性発現エレメント、および選択マーカー遺伝子を含有する、本発明の発現ベクターを使
用して調製することができる。ベクターを導入した後、細胞は、強化培地中で１～２日間
にわたり成長させてから、選択培地へと切り替えることができる。選択マーカーの目的は
、選択に対する耐性を付与し、その存在により細胞の成長を可能とし、これにより、導入
された配列を選択培地中で発現させることに成功することである。耐性で安定的にトラン
スフェクトされた細胞は、細胞型に適する組織培養法を使用して増殖させることができる
。
本発明のモノクローナル抗体の作出
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Kohler and
Milstein, 1975 Nature 256: 495による標準的な体細胞ハイブリダイゼーションの技法
を含む、様々な技法により作製することができる。モノクローナル抗体を作製するための
多くの技法、例えば、Ｂリンパ球の、ウイルスによる形質転換または発がん性形質転換を
援用することができる。
ハイブリドーマを調製するための動物系は、マウス系、ラット系、およびウサギ系を含
む。マウスにおけるハイブリドーマの作製は、十分に確立された手順である。当技術分野
では、免疫化プロトコールと、融合のための、免疫化された脾臓細胞を単離するための技
法とが公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順もまた
公知である。
本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体は、上記で記載した通りに調製されたマウスモノ
クローナル抗体の配列に基づき、調製することができる。重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖
免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象のマウスハイブリドーマから得、標準的な分
子生物学の技法を使用して、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するよ
うに操作することができる。例えば、キメラ抗体を創出するには、当技術分野で公知の方
法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらによる米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照され
たい）を使用して、マウス可変領域を、ヒト定常領域へと連結することができる。ヒト化
抗体を創出するには、当技術分野で公知の方法を使用して、マウスＣＤＲ領域を、ヒトフ
レームワークへと挿入することができる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５２２
５５３９号明細書、ならびにＱｕｅｅｎらによる、米国特許第５５３０１０１号明細書；
同第５５８５０８９号明細書；同第５６９３７６２号明細書；および同第６１８０３７０
号明細書を参照されたい。
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ヒト化抗体である。ＡＮＧＰＴＬ４を指向す
る、このようなヒト化抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫系の部分を保有する、トラン
スジェニックマウスまたはトランスクロモソミックマウスを使用して作り出すことができ
る。これらのトランスジェニックマウスおよびトランスクロモソミックマウスは、本明細
書では、それぞれ、ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称するマウスを含み、本明細書
ではまとめて、「ヒトＩｇマウス」と称する。
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、ヒト免疫グロブリン
遺伝子のミニ遺伝子座であって、再配列されていないヒト重（μおよびγ）鎖免疫グロブ
リン配列およびヒトκ軽鎖免疫グロブリン配列を、内因性μ鎖遺伝子座および内因性κ鎖
遺伝子座を不活化させる標的突然変異と併せてコードする、ミニ遺伝子座（例えば、Lonb
erg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859を参照されたい）を含有する。したがっ
て、マウスは、マウスＩｇＭまたはマウスＩｇκの発現の低減を呈示し、免疫化に応答し
て、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチングおよび体細胞突然
変異を経て、高アフィニティーのヒトＩｇＧκモノクローナルを産出する（Lonberg, N.
et al., 1994 supra；Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:
49-101；Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, and Har
ding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546において総説され
ている）。ＨｕＭＡｂマウスの調製および使用、ならびにこのようなマウスにより保有さ
れるゲノム修飾については、それらの全ての内容が、参照によりそれらの全体において本
明細書に具体的に組み込まれる、Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:
6287-6295；Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656；Tuaillon e
t al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724；Choi et al., 1993 Nature Ge
netics 4:117-123；Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830；Tuaillon et al., 19
94 J. Immunol. 152:2912-2920；Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 5
79-591；およびFishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851において
さらに記載されている。さらに、全てＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙによる、米国特許第５
，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６
号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，７８９，６５０号明細書；同第５
，８７７，３９７号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；同第５，８１４，３１８
号明細書；同第５，８７４，２９９号明細書；および同第５，７７０，４２９号明細書；
Ｓｕｒａｎｉらによる米国特許第５，５４５，８０７号明細書；全てＬｏｎｂｅｒｇおよ
びＫａｙによる、ＰＣＴ国際公開第９２１０３９１８号パンフレット、国際公開第９３／
１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９
７１１３８５２号パンフレット、国際公開第９８／２４８８４号パンフレット、および国
際公開第９９／４５９６２号パンフレット；ならびにＫｏｒｍａｎらによるＰＣＴ国際公
開第０１／１４４２４号パンフレットも参照されたい。
別の実施形態では、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保有するマウスな
ど、導入遺伝子上および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウスを使用
して、本発明のヒト抗体をもたらすことができる。本明細書では、このようなマウスを、
「ＫＭマウス」と称するが、これについては、Ｉｓｈｉｄａらによる、ＰＣＴ国際公開第
０２／４３４７８号パンフレットにおいて詳細に記載されている。
ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる、当技術分野では、なおさらに代替的なトラン
スジェニック動物系が利用可能であり、本発明のＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体をもたらすの
に使用することができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と
称する、代替的なトランスジェニック系も使用することができる。このようなマウスにつ
いては、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる、米国特許第５，９３９，５９８号
明細書；同第６，０７５，１８１号明細書；同第６，１１４，５９８号明細書；同第６，
１５０，５８４号明細書；および同第６，１６２，９６３号明細書において記載されてい
る。
さらに、当技術分野では、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる、代替的なトランス
クロモソミック動物系が利用可能であり、本発明のＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体をもたらす
のに使用することができる。例えば、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両
方を保有するマウスであって、「ＴＣマウス」と称するマウスを使用しうるが、このよう
なマウスについては、Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727
において記載されている。当技術分野ではさらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を保有
するウシについても記載されており（Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:8
89-894）、本発明のＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体をもたらすのに使用することができる。
本発明のヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニン
グするためのファージディスプレイ法を使用して調製することもできる。当技術分野では
、ヒト抗体を単離するための、このようなファージディスプレイ法が確立されているか、
または下記の実施例において記載される。例えば、Ｌａｄｎｅｒらによる、米国特許第５
，２２３，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；および同第５，５７１，
６９８号明細書；Ｄｏｗｅｒらによる、米国特許第５，４２７，９０８号明細書；および
同第５，５８０，７１７号明細書；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらによる、米国特許第５，９６
９，１０８号明細書；および同第６，１７２，１９７号明細書；ならびにＧｒｉｆｆｉｔ
ｈｓらによる、米国特許第５，８８５，７９３号明細書；同第６，５２１，４０４号明細
書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８
２，９１５号明細書；および同第６，５９３，０８１号明細書を参照されたい。
本発明のヒト化抗体はまた、免疫化したら、ヒト抗体応答を発生させうるように、ヒト
免疫細胞を再構築した、ＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。このようなマ
ウスについては、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらによる、米国特許第５，４７６，９９６号明細
書；および同第５，６９８，７６７号明細書において記載されている。
フレームワークまたはＦｃの操作
本発明の操作抗体は、例えば、抗体の特性を改善するように、ＶＨおよび／またはＶＬ
内のフレームワーク残基へと修飾を施した操作抗体を含む。このようなフレームワーク修
飾は、抗体の免疫原性を低下させるように施すことが典型的である。例えば、１つの手法
は、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列配列へと「復帰突然
変異させる」ことである。より具体的には、体細胞突然変異を経た抗体は、抗体が由来す
る生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含有しうる。このような残基は、抗体
フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定する
ことができる。フレームワーク領域配列を、それらの生殖細胞系列の立体配置へと戻すに
は、例えば、部位特異的突然変異誘発により、体細胞突然変異を、生殖細胞系列配列へと
「復帰突然変異させる」ことができる。このような「復帰突然変異させた」抗体もまた、
本発明により包含されることを意図する。
フレームワーク修飾の別の種類は、１つもしくは複数のフレームワーク領域内の残基、
なおまたは、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトー
プを除去して、これにより、抗体の潜在的な免疫原性を低減することを伴う。この手法は
また、「脱免疫化」とも称し、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０
４３号明細書においてさらに詳細に記載されている。
フレームワーク内またはＣＤＲ領域内に施された修飾に加えて、またはこれと代替的に
、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内の修飾を含んで、典型的に、血清半減期、補体の結合、Ｆ
ｃ受容体の結合、および／または抗原依存性細胞性細胞傷害など、抗体の１つまたは複数
の機能的特性を改変するように操作することもできる。さらに、本発明の抗体は、化学的
に修飾することもでき（例えば、１つまたは複数の化学的部分を抗体に付着することがで
きる）、そのグリコシル化を改変して、ここでもまた、抗体の１つまたは複数の機能的特
性を改変するように修飾することもできる。これらの実施形態の各々については、下記で
さらに詳細に記載する。Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔによるＥＵインデッ
クスである。
一実施形態では、ヒンジ領域内のシステイン残基の数を改変する、例えば、増大または
減少させるように、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾する。この手法は、Ｂｏｄｍｅｒらによる
米国特許第５，６７７，４２５号明細書においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ
領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易とするか
、または抗体の安定性を増大もしくは低下させるように改変する。
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させて、抗体の生物学的半減期を
短縮する。より具体的には、抗体のブドウ球菌属プロテインＡ（Staphylococcyl protein
A）（ＳｐＡ）への結合が、天然Ｆｃ－ヒンジドメインのＳｐＡへの結合と比べて損なわ
れるように、１つまたは複数のアミノ酸突然変異を、Ｆｃ－ヒンジ断片のＣＨ２ドメイン
－ＣＨ３ドメイン間界面領域へと導入する。この手法は、Ｗａｒｄらによる米国特許第６
，１６５，７４５号明細書においてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を延長するように修飾する。多様な手
法が可能である。例えば、以下の突然変異：Ｗａｒｄによる米国特許第６，２７７，３７
５号明細書において記載されている、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆのうちの１つ
または複数を導入することができる。代替的に、生物学的半減期を延長するために、抗体
を、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書；および同第６，１２
１，０２２号明細書において記載されている、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つ
のループから採取されたサルベージ受容体結合性エピトープを含有するように、ＣＨ１領
域内またはＣＬ領域内で改変することもできる。
さらに他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を、抗体のエフェクター機能
を改変する異なるアミノ酸残基で置きかえることにより、Ｆｃ領域を改変する。例えば、
抗体が、エフェクターリガンドに対するアフィニティーを改変しているが、親抗体の抗原
結合能は保持するように、１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえ
ることができる。それに対するアフィニティーを改変するエフェクターリガンドは、例え
ば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。この手法は、両方ともＷｉｎｔｅｒら
による米国特許第５，６２４，８２１号明細書；および同第５，６４８，２６０号明細書
においてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、抗体が、Ｃ１ｑへの結合を改変し、かつ／または補体依存性細胞傷
害作用（ＣＤＣ）を低減もしくは消失させるように、アミノ酸残基から選択される１つま
たは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。この手法は、Ｉ
ｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号明細書においてさらに詳細に記
載されている。
別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基を改変して、これにより、補体に結
合する抗体の能力を改変する。この手法は、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ国際公開第９４
／２９３５１号パンフレットにおいてさらに記載されている。
さらに別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸を修飾することにより、抗体依存
性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増大させ、かつ／またはＦｃγ受
容体に対する抗体のアフィニティーを増大させるように、Ｆｃ領域を修飾する。この手法
は、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ国際公開第００／４２０７２号パンフレットにおいてさら
に記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上の、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩ
ＩＩ、およびＦｃＲｎに対する結合性部位もマップされており、結合を改善させた変異体
も記載されている（Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604を参照
されたい）。
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、脱グリコシル化抗
体（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠く）を作製することができる。グリコシル化は
、例えば、「抗原」に対する抗体のアフィニティーを増大させるように改変することがで
きる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化
部位を改変することにより達成することができる。例えば、１つまたは複数の可変領域フ
レームワークグリコシル化部位の消失を結果としてもたらす、１つまたは複数のアミノ酸
置換を作製して、これにより、その部位におけるグリコシル化を消失させることができる
。このような脱グリコシル化により、抗原に対する抗体のアフィニティーを増大させるこ
とができる。このような手法は、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号明細書；
および同第６，３５０，８６１号明細書においてさらに詳細に記載されている。
加えて、または代替的に、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体または二分枝
型ＧｌｃＮａｃ構造を増大させた抗体など、グリコシル化の種類を改変した抗体を作製す
ることもできる。このようなグリコシル化パターンの改変は、抗体のＡＤＣＣ能を増大さ
せることが裏付けられている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構を
改変した宿主細胞内で抗体を発現させることにより達成することができる。当技術分野で
は、グリコシル化機構を改変した細胞が記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ
、これにより、グリコシル化を改変した抗体を産生するための宿主細胞として使用するこ
とができる。例えば、Ｈａｎｇらによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、この
ような細胞系内で発現させた抗体が、低フコシル化を呈示するように、フコシルトランス
フェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を機能的に破壊した細胞系について記載している
。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットは、フコース
をＡｓｎ（２９７）連結された炭水化物へと付着する能力を低減し、また、その宿主細胞
内で発現させた抗体の低フコシル化も結果としてもたらす、変異体のＣＨＯ細胞系である
、Ｌｅｃｌ３細胞について記載している（また、Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol.
Chem. 277:26733-26740も参照されたい）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ国際公開第９９／
５４３４２号パンフレットは、操作細胞系内で発現させた抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の
増大を結果としてもたらす二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造の増大を呈示するように、糖タンパ
ク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）－Ｎアセチル
グルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現させるように操作さ
れた細胞系について記載している（また、Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-18
0も参照されたい）。
改変抗体を操作する方法
上記で論じた通り、本明細書で示されるＶＨ配列およびＶＬ配列または全長重鎖および
全長軽鎖配列を有するＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体は、全長重鎖配列および／もしくは全長
軽鎖配列、ＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列、またはこれらへと付着された定常領域を
修飾することにより、新たなＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を創出するのに使用することがで
きる。したがって、本発明の別の態様では、本発明のＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体の構造特
色を使用して、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合し、また、ＡＮＧＰＴＬ４の１つまたは複数の
機能的特性も阻害すること（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４とＡＮＧＰＴＬ４受容体の結合を阻
害する、ＡＮＧＰＴＬ４依存性の細胞増殖を阻害する）など、本発明の抗体の少なくとも
１つの機能的特性を保持する、構造的に関連するＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を創出する。
例えば、本発明の抗体の１つまたは複数のＣＤＲ領域またはそれらの突然変異は、組換
えにより、公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組み合わせて、組換え
により操作された、上記で論じた、本発明の、さらなるＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を創出
することができる。他の種類の修飾は、前出の節で記載した修飾を含む。操作法のための
出発材料は、本明細書で提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つもし
くは複数、またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域である。操作抗体を創出するの
に、本明細書で提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数
、またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわ
ち、タンパク質として発現させる）ことは必要ではない。そうではなくて、配列内に含有
される情報を、元の配列に由来する「第２世代の」配列を創出するための出発材料として
使用し、次いで、「第２世代の」配列を、タンパク質として調製し、発現させる。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号７、３２、５２、７２、９２、１
１２、および１３２からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号８、３３、５３、
７３、９３、１１３、および１３３からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／
または配列番号９、３４、５４、７４、９４、１１４、および１３４からなる群から選択
されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域の抗体配列と、配列番号１７、４２、６２、８
２、１０２、１２２、および１４２からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１
８、４３、６３、８３、１０３、１２３、および１４３からなる群から選択されるＣＤＲ
２配列、ならびに／または配列番号１９、４４、６４、８４、１０４、１２４、および１
４４からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域の抗体配列とからなる
ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を作製するステップと、重鎖可変領域の抗体配列および／また
は軽鎖可変領域の抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも１
つの改変抗体配列を創出するステップと、改変抗体配列を、タンパク質として発現させる
ステップとを含む方法を提供する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号１０、３５、５５、７５、９５、
１１５、および１３５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１１、３６、５
６、７６、９６、１１６、および１３６からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならび
に／または配列番号１２、３７、５７、７７、９７、１１７、および１３７からなる群か
ら選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域の抗体配列と、配列番号２０、４５、６
５、８５、１０５、１２５、および１４５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列
番号２１、４６、６６、８６、１０６、１２６、および１４６からなる群から選択される
ＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号２２、４７、６７、８７、１０７、１２７、お
よび１４７からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域の抗体配列とか
らなるＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を調製し、重鎖可変領域の抗体配列および／または軽鎖
可変領域の抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも１つの改
変抗体配列を創出し、改変抗体配列を、タンパク質として発現させるための方法を提供す
る。
したがって、別の実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞における発現について最適化
されたＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体であって、配列番号１５、２８、４０、６０、８０、１
００、１２０、および１４０の群から選択される配列を有する全長重鎖抗体配列と、配列
番号２５、５０、７０、９０、１１０、１３０、および１５０の群から選択される配列を
有する全長軽鎖抗体配列とからなるＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を調製し、全長重鎖抗体配
列および／または全長軽鎖抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少な
くとも１つの改変抗体配列を創出し、改変抗体配列を、タンパク質として発現させるため
の方法を提供する。一実施形態では、重鎖または軽鎖の改変は、重鎖または軽鎖のフレー
ムワーク領域内である。
改変抗体配列はまた、ＣＤＲ３配列、または米国特許出願公開第２００５／０２５５５
５２号明細書において記載されている、最小限の不可欠な結合決定基を固定し、ＣＤＲ１
配列およびＣＤＲ２配列には多様性を持たせた抗体ライブラリーをスクリーニングするこ
とによっても調製することができる。スクリーニングは、ファージディスプレイ技術など
、抗体を、抗体ライブラリーからスクリーニングするのに適切な任意のスクリーニング技
術に従い実施することができる。
標準的な分子生物学の技法を使用して、改変抗体配列を調製し、発現させることができ
る。改変抗体配列によりコードされる抗体は、ヒト、カニクイザル、ラットおよび／また
はマウスＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合すること；ならびに抗体が、Ｆ３６Ｅ細胞増殖ア
ッセイおよび／またはＢａ／Ｆ３－ＡＮＧＰＴＬ４Ｒ細胞増殖アッセイにおいて、ＡＮＧ
ＰＴＬ４依存性の細胞増殖を阻害することを含むがこれらに限定されない、本明細書で記
載されるＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体の機能的特性のうちの１つ、一部、または全部を保持
する抗体である。
本発明の抗体を操作する方法のある種の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体コー
ド配列の全部または一部に沿って、ランダムに、または選択的に、突然変異を導入するこ
とができ、結果として得られる修飾ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を、本明細書で記載される
結合活性および／または他の機能的特性についてスクリーニングすることができる。当技
術分野では、突然変異法が記載されている。例えば、ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ国際公開第
０２／０９２７８０号パンフレットは、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブ
リー、またはこれらの組合せを使用して、抗体の突然変異を創出し、スクリーニングする
ための方法について記載している。代替的に、ＬａｚａｒらによるＰＣＴ国際公開第０３
／０７４６７９号パンフレットは、コンピュータによるスクリーニング法を使用して、抗
体の生理化学的特性を最適化する方法について記載している。
本発明のある種の実施形態では、抗体は、脱アミド化部位を除去するように操作されて
いる。脱アミド化は、ペプチド内またはタンパク質内の構造的変化および機能的変化を引
き起こすことが公知である。脱アミドは、生物学的活性の低下のほか、タンパク質医薬品
の薬物動態および抗原性の改変も結果としてもたらしうる（Anal Chem. 2005 March 1,;7
7（5）:1432-9）。
本発明のある種の実施形態では、抗体は、ｐＩを増大させ、それらの薬物様特性を改善
するように操作されている。タンパク質のｐＩは、分子の全体的な生物物理的特性の鍵と
なる決定因子である。ｐＩが小さな抗体は、可溶性が小さく、安定性が小さく、凝集しや
すいことが公知である。さらに、ｐＩが小さな抗体の精製は、とりわけ、臨床における使
用のためのスケールアップにおいて、困難であり、問題を生じる可能性がある。本発明の
抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはＦａｂのｐＩを増大させることにより、それらの可溶性が改
善され、抗体を高濃度（＞１００ｍｇ／ｍｌ）で製剤化することが可能となった。抗体を
高濃度（例えば、＞１００ｍｇ／ｍｌ）で製剤化することにより、高用量の抗体を、患者
の眼へと、硝子体内注射を介して投与することが可能な利点がもたらされ、これにより、
心血管障害を含む慢性疾患を処置するための著明な利点である、投与頻度の低減を可能と
することができる。ｐＩの増大はまた、抗体のＩｇＧバージョンのＦｃＲｎを媒介するリ
サイクリングも増大させ、これにより、薬物が長時間にわたり体内にとどまり、要求され
る注射の回数を少なくすることも可能としうる。最後に、ｐＩの増大に起因して、抗体の
全体的な安定性が著明に改善され、その結果として、保管寿命およびｉｎ ｖｉｖｏにお
ける生物学的活性の延長がもたらされる。ｐＩは、８．２以上であることが好ましい。
改変抗体の機能的特性は、実施例において示されるアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）な
ど、当技術分野において利用可能であり、かつ／または本明細書で記載される標準的なア
ッセイを使用して評価することができる。
予防的使用および治療的使用
本明細書で記載されるＡＮＧＰＴＬ４に結合する抗体は、それを必要とする対象へと、
有効量の、本発明の抗体または抗原結合性断片を投与することにより、ＡＮＧＰＴＬ４レ
ベルの上昇および／またはＡＮＧＰＴＬ４活性の増大と関連する疾患または障害を処置す
るのに治療的に有用な濃度で使用することができる。本発明は、それを必要とする対象へ
と、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、ＡＮＧＰＴＬ４関連心血管障害を処
置する方法を提供する。本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体
を投与することにより、ＡＮＧＰＴＬ４関連心血管障害を処置する方法を提供する。
本発明の抗体を使用して、とりわけ、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質レベルが異常に高く、
かつ／またはＡＮＧＰＴＬ４タンパク質レベルの低減が求められる、任意の数の状態また
は疾患を含むがこれらに限定されない、ＡＮＧＰＴＬ４に関連する状態または障害を防止
処置、防止、および改善することができる。これらの状態は、高脂血症、高リポタンパ
ク血症、および脂質異常症など、脂質代謝に関与する状態であって、アテローム性脂質異
常症、糖尿病性脂質異常症、高トリグリセリド血症（例えば、重度の高トリグリセリド血
症（例えば、ＴＧ＞１０００ｍｇ／ｄＬとする）、肥満と関連する高トリグリセリド血症
、およびＶ型高トリグリセリド血症）、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、混
合型脂質異常症（肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病など）、リポジストロフィー
、脂肪萎縮症、ならびに、例えば、ＬＰＬ活性の低下および／またはＬＰＬの欠損、ＬＤ
Ｌ受容体の活性の低下および／またはＬＤＬ受容体の欠損、ＡｐｏＣ２の改変、ＡｐｏＥ
の欠損、ＡｐｏＢの増大、極低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の産生の増大および／ま
たはＶＬＤＬの消失の減少、ある種の薬物処置（例えば、グルココルチコイド処置に誘導
される脂質異常症）、任意の遺伝的素因、食餌、生活様式などにより引き起こされる他の
状態を含む、状態を含むがこれらに限定されない。
高脂血症、高リポタンパク血症、および／または脂質異常症と関連するか、またはこれ
らから生じる、他のＡＮＧＰＴＬ４関連疾患または障害は、アテローム性動脈硬化、動脈
瘤、高血圧症、狭心症、脳卒中、脳血管疾患、うっ血性心不全、冠動脈疾患、心筋梗塞、
末梢血管疾患などの心血管疾患または障害；急性膵炎；非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡ
ＳＨ）；糖尿病などの血糖障害；肥満などを含むがこれらに限定されない。
本発明の抗体はまた、ＡＮＧＰＴＬ４関連障害を防止、処置、または改善するための他
の薬剤と組み合わせても使用することができる。例えば、スタチン療法を、トリグリセリ
ドに関連する障害を伴う患者を処置するために、本発明のＡＮＧＰＴＬ４抗体および抗原
結合性断片と組み合わせて使用することができる。
医薬組成物
本発明は、医薬的に許容される担体と併せて製剤化されたＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体（
インタクトなまたは結合性断片）を含む医薬組成物を提供する。組成物は加えて、例えば
、心血管障害の処置または防止に適する１つまたは複数の他の治療剤も含有しうる。医薬
的に許容される担体は、組成物を増強するかもしくは安定化させるか、または、組成物の
調製を容易とするのに使用することもできる。医薬的に許容される担体は、生理学的に適
合性の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤な
どを含む。
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することができる。
投与経路および／または投与方式は、所望される結果に応じて変化する。投与は、硝子体
内投与、静脈内投与、筋内投与、腹腔内投与、もしくは皮下投与であるか、または標的部
位に近接して投与することが好ましい。医薬的に許容される担体は、硝子体内投与、静脈
内投与、筋内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与（例えば、注射ま
たは注入による）に適するものとする。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、二特
異性分子および多特異性分子である抗体は、化合物を、化合物を不活化しうる酸および他
の天然の状態の作用から保護する材料でコーティングすることができる。
組成物は、滅菌であり、かつ、流体であるものとする。適正な流体性は、例えば、レシ
チンなどのコーティングを使用することにより維持することができ、分散液の場合には、
要求される粒子サイズを維持し、界面活性剤を使用することにより維持することができる
。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどの
多価アルコール、および塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長時間吸
収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまた
はゼラチンを組み入れることによりもたらすことができる。
本発明の医薬組成物は、当技術分野において周知であり、日常的に実施されている方法
に従い調製することができる。例えば、Remington：The Science and Practice of Pharm
acy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000；およびSustained and Controlled Release
Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978
を参照されたい。医薬組成物は、ＧＭＰ条件下で製造することが好ましい。本発明の医薬
組成物中では、ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体の治療的に有効な用量（dose）または治療的に
効果的な用量を援用することが典型的である。ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体は、当業者に公
知の従来の方法により、医薬的に許容される剤形（dosage form）へと製剤化する。投与
レジメン（dosage regimen）は、所望される最適応答（例えば、治療的応答）をもたらす
ように調整する。例えば、単一のボーラスを投与することもでき、複数に分割された用量
をある期間にわたり投与することもでき、治療状況の要件により指し示されるのに応じて
、用量を比例的に低減するかまたは増大させることもできる。投与の容易さおよび投与量
（dosage）の均一性のために、非経口組成物を、投与量単位形態（dosage unit form）で
製剤化することがとりわけ有利である。本明細書で使用される投与量単位形態とは、処置
される対象のための単位投与量として適する、物理的に個別の単位を指す。各単位は、要
求される医薬担体との関連で、所望の治療効果をもたらすように計算された、所定量の活
性化合物を含有する。
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性とならずに、特
定の患者、組成物、および投与方式に所望される治療的応答を達成するのに有効な量の有
効成分を得るように変化させることができる。選択される投与量レベルは、援用される本
発明の特定の組成物、またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、
投与時期、援用される特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、援用される特定の組成
物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、処置される患者の
年齢、性別、体重、状態、全般的健康、および医療既往歴などの因子を含む様々な薬物動
態因子に依存する。
医師または獣医師は、医薬組成物中で援用される本発明の抗体の投与を、所望の治療効
果を達成するのに要求されるレベル未満のレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで
、投与量を漸増させることができる。一般に、本明細書で記載される心血管障害を処置す
るのに有効な、本発明の組成物の用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患
者がヒトであるのか動物であるのか、投与される他の薬物、および処置が予防的であるの
か治療的であるのかを含む、多くの異なる因子に応じて変化する。処置投与量は、安全性
および有効性を最適化するように滴定することが必要である。抗体の全身投与では、投与
量は、宿主の体重１ｋｇ当たり約０．０００１～１００ｍｇの範囲であり、より通例では
、宿主の体重１ｋｇ当たり０．０１～１５ｍｇの範囲である。抗体の硝子体内投与では、
投与量は、眼１つ当たり０．１ｍｇ～眼１つ当たり５ｍｇの範囲でありうる。例えば０．
１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／
ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１
．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ
／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、
１．９ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、２．１ｍｇ／ｍｌ、２．２ｍｇ／ｍｌ、２．３ｍ
ｇ／ｍｌ、２．４ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、２．６ｍｇ／ｍｌ、２．７ｍｇ／ｍｌ
、２．８ｍｇ／ｍｌ、２．９ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、３．１ｍｇ／ｍｌ、３．２
ｍｇ／ｍｌ、３．３ｍｇ／ｍｌ、３．４ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、３．６ｍｇ／ｍ
ｌ、３．７ｍｇ／ｍｌ、３．８ｍｇ／ｍｌ、３．９ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、４．
１ｍｇ／ｍｌ、４．２ｍｇ／ｍｌ、４．３ｍｇ／ｍｌ、４．４ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／
ｍｌ、４．６ｍｇ／ｍｌ、４．７ｍｇ／ｍｌ、４．８ｍｇ／ｍｌ、４．９ｍｇ／ｍｌ、ま
たは５．０ｍｇ／ｍｌ。例示的な処置レジメは、２週間ごとに１回、または毎月１回、ま
たは３～６カ月ごとに１回の全身投与を伴う。例示的な処置レジメは、２週間ごとに１回
、または毎月１回、または３～６カ月ごとに１回の全身投与、または必要に応じた（ＰＲ
Ｎ）全身投与を伴う。
抗体は通例、複数回投与する。単回の投与の間の間隔は、毎週、毎月、または毎年であ
りうる。間隔はまた、患者におけるＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体の血中レベルを測定するこ
とにより指し示される通り、不規則でもありうる。加えて、医師が代替的な投与間隔を決
定する場合もあり、毎月または効果的であるのに必要な間隔で投与する。全身投与のいく
つかの方法では、投与量は、抗体の血漿中濃度１～１０００μｇ／ｍｌを達成するように
調整し、いくつかの方法では、２５～５００μｇ／ｍｌを達成するように調整する。代替
的に、抗体は、持続放出製剤として投与することもでき、この場合は、低頻度の投与が要
求される。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般に、
ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体の半減期より長い半減期を示す。投与量およ
び投与頻度は、処置が予防的であるのか治療的であるのかに応じて変化しうる。予防的適
用では、比較的低投与量を、比較的低頻度の間隔で、長期にわたり投与する。一部の患者
には、彼らの余生にわたり処置を施し続ける。治療的適用では場合によって、比較的高投
与量が、疾患の進行が軽減されるか終結するまで、比較的短い間隔で要求され、好ましく
は、患者が、疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで要求される。その後、患者
には、予防的レジメを投与することができる。
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために提示されるものであり、その範囲を限
定するために提示されるものではない。当業者には、本発明の他の変形がたやすく明らか
であろうし、添付の特許請求の範囲によっても包含される。
実施例１：抗原としての、抗体特徴付け実験における使用のための、精製組換えヒトＡＮ
ＧＰＴＬ４の調製
全長ヒトＡＮＧＰＴＬ４ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列であるＮＭ＿１３９３１４．２に
マッチする、アミノ酸２６～４０６）を、ヒトＩｇＧ－カッパに由来するＮ末端シグナル
ペプチド（ＭＫＴＦＩＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＩＦＬＬＰＧＡＴＡ）（配列番号１５２）、
ならびにＣ末端ＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫＨ）（配列番号１５３）、ヘキサ
ヒスチジン精製タグ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１５４）、およびＡｖｉタグ（すなわち
、ＢｉｒＡビオチニル化配列であるＧＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）（配列番号１
５５）と共にコードする核酸配列を、哺乳動物細胞発現ベクターであるｐＲＳ５ａへとサ
ブクローニングして、プラスミドであるｐＲＳ－Ｉｋｋ－ｈＡＮＧＰＴＬ４（２６～４０
６）－ＦＬＡＧ－６ＨＩＳ－Ａｖｉであって、２０アミノ酸のＩＫＫシグナル配列に続い
て、ヒトＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸２６～４０６を、カルボキシル末端のＦｌａｇタグ、
６ＨＩＳタグ、およびＡｖｉタグと共に含有する、プラスミドを作り出した（表２、配列
番号１５６）。
一部の調製物には、以下の手順を使用して、ヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を発現させ
、精製し、ビオチニル化した（方法１）：懸濁液に適合させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、無
血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番１
２３３８－０１８）中で培養し、ポリエチレンイミントランスフェクション試薬（Ｐｏｌ
ｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番２３９６６）を使用して、プラスミドであるｐＲＳ－Ｉｋｋ－
ｈＡＮＧＰＴＬ４（２６～４０６）－ＦＬＡＧ－Ｈｉｓ６－Ａｖｉをトランスフェクトし
た。トランスフェクションの５時間後において、ヘパリン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、型番
Ａ１６１９８）を、培養培地へと、０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。次いで、
細胞を、７２～９６時間にわたり培養し、次いで、細胞培養物上清を、４℃の遠心分離に
より採取し、０．２２μｍのフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ、型番５６７－００１０）を使用
して、滅菌濾過した。次いで、濾過された細胞培養物上清を、接線流濾過により、約１０
０ｍｌまで濃縮した。濃縮された上清を、ＴＢＳ－グリセロール緩衝液（５０ｍＭのトリ
ス－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１５％のグリセロール、ｐＨ７．４）により
、１リットルの容量まで希釈し、試料を、接線流濾過により、約２００ｍｌまで濃縮した
。次いで、ＴＢＳ－グリセロール緩衝液であらかじめ平衡化させた抗Ｆｌａｇ Ｍ２アガ
ロース樹脂（Ｓｉｇｍａ、型番２２０１０２－１７７）を、試料へと添加し、結果として
得られる溶液を、４℃で１時間にわたり、静かに混合した。次いで、アガロース樹脂を、
２５ｍｌのＴＢＳ－グリセロールで５回にわたり洗浄し、結合したＡＮＧＰＴＬ４タンパ
ク質を、０．２ｍｇ／ｍｌのＦｌａｇペプチド（Ｓｉｇｍａ、型番２２０１７６－３１７
）を含有する、２０ｍｌのＴＢＳ－グリセロールで溶出させた。ペルオキシド非含有Ｔｗ
ｅｅｎ－２０（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、型番Ａ１２８４，００２５）を、溶出させたタンパ
ク質溶液へと、０．１％の最終濃度まで添加し、結果として得られる溶液を、０．１％の
Ｔｗｅｅｎ－２０（緩衝液Ａ）を含有するＴＢＳ－グリセロール中であらかじめ平衡化さ
せた、５ｍｌのＨｉＴｒａｐヘパリンカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番１
７－０４０７－０１）へとロードした。カラムを、５０ｍｌの緩衝液Ａに続き、３００ｍ
ＭのＮａＣｌを含有する、５０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。次いで、ＡＮＧＰＴＬ４タン
パク質を、６００ｍＭのＮａＣｌを含有する、２０ｍｌの緩衝液Ａで溶出させた。分子量
カットオフを３０ｋＤとする遠心分離型濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ、型番ＵＦＣ
９０３０２４）を使用して、溶出させたタンパク質を濃縮した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより
評価される、精製ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質の純度は、＞９０％であった。
一部の適用には、ＡＮＧＰＴＬ４ １ｍｇ当たり１０μｇの精製ビオチン－タンパク質
リガーゼ（ＢｉｒＡ）（Ａｖｉｄｉｔｙ）を使用して、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を、Ｃ
末端のＡｖｉタグ上で、部位特異的にビオチニル化した。緩衝液に、最終濃度が１０ｍＭ
のＡＴＰ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、および０．５Ｍのｄ－ビオチンを補充した。反
応混合物を、３０℃で２時間にわたり、次いで、４℃で一晩にわたりインキュベートし、
次いで、緩衝液Ａ中で平衡化させた、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（
２６ｍｍ×６００ｍｍ）（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番２８－９８９３－３６
）へとロードした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムから
の画分を解析し、ＡＮＧＰＴＬ４を含有する画分をプールし、遠心分離型濃縮器を使用し
て、濃縮した。
他の調製物には、以下の手順を使用して、ヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を発現させ、
精製し、ビオチニル化した（方法２）。標準的なポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランス
フェクション法を使用して、プラスミドであるｐＲＳ－Ｉｋｋ－ｈＡＮＧＰＴＬ４（２６
～４０６）Ｃ－Ｆｌａｇ６ＨｉｓＡｖｉを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと、一過性にトランス
フェクトした。細胞を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地中の懸濁培養により増殖さ
せ、トランスフェクションは、１リットルのフラスコを使用して、培地４リットル中に、
１ｍｌ当たり１×１０６個の細胞の最終細胞濃度で、実行した。トランスフェクションの
５時間後において、５００μｇ／ｍｌの最終濃度のヘパリンを添加した。細胞を、３７℃
および５％のＣＯ２で７２時間にわたり増殖させた。次いで、細胞を、遠心分離によりペ
レット化させ、上清を、０．２２μｍの滅菌フィルターに通した。清明化させた上清を、
濃縮し、接線流濾過（ＴＦＦ）を使用して、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１５
０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）へと
、緩衝液を交換した。次いで、濃縮された試料を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、
１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１０ｍＭのイミダゾール、０．１％のｎ
－オクチル－β－マルトシド、ｐＨ７．４）で平衡化させた、５ｍｌのＮｉ－ＮＴＡアフ
ィニティーカラムに通した。試料をロードした後で、２８０ｎｍにおけるベースラインの
吸光度に達するまで、カラムを、同じ緩衝液で洗浄した。次いで、イミダゾール勾配（１
０ｍＭ～５００ｍＭ）を使用することにより、結合したＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を溶出
させた。ヒトＡＮＧＰＴＬ４を含有する溶出画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ濃縮器（分子
量カットオフを１０ｋＤとする）を使用して、濃縮し、ＰＤ－１０カラムを使用して、保
存緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５％のグリセロール、
ｐＨ７．４）へと緩衝液を交換し、アリコート分割し、液体窒素中で瞬時凍結させ、－８
０℃で保存した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより評価される、精製ヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク
質の純度は、＞９０％であった。
一部の適用には、上記で記載した通りに調製された、精製ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を
、以下の通りに部位特異的にビオチニル化した。５０ｍＭのビシン（ｐＨ８．３）緩衝液
中、約１ｍｇ／ｍＬの最終濃度の精製タンパク質を、１０ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭの酢酸
マグネシウム、０．１ｍＭのビオチン、およびＢｉｒＡビオチンリガーゼ（Ａｖｉｄｉｔ
ｙ）の存在下において、３０℃で１時間にわたり、次いで、４℃で一晩にわたりインキュ
ベートした。次いで、Ａｍｉｃｏｎ濃縮器（分子量カットオフを１０ｋＤとする）を使用
して、タンパク質を濃縮し、ＰＤ－１０カラムを使用して、保存緩衝液（５０ｍＭのトリ
ス－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５％のグリセロール、ｐＨ７．４）へと緩衝液を
交換し、アリコート分割し、液体窒素中で瞬時凍結させ、－８０℃で保存した。
実施例２：抗体特徴付け実験における使用のための、精製組換えヒトＡＮＧＰＴＬ４のＮ
末端コイルドコイルドメインタンパク質の調製
ヒトＡＮＧＰＴＬ４（アミノ酸２６～１６１）のＮ末端コイルドコイルドメインの発現
、精製、およびビオチニル化は、実施例１の方法２で、ヒト全長ヒトＡＮＧＰＴＬ４につ
いて記載された、本質的に同じ方法を使用して実行した。精製ヒトＡＮＧＰＴＬ４のＮ末
端ドメインタンパク質の配列を、表２（配列番号１５７）に示す。
Figure 2024026226000025
実施例３：モノクローナル抗体の調製およびスクリーニング
組換えヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質は、実施例１に記載した通りに自家調製し、抗Ａ
ＮＧＰＴＬ４ハイブリドーマクローンを作り出すための免疫原として使用した。標準的な
急速免疫化プロトコールに従い、Ｂｃｌ－２トランスジェニックマウスを、組換えヒトＡ
ＮＧＰＴＬ４で免疫化した。ハイブリドーマは、標準的なエレクトロフュージョンベース
の方法を使用することにより作り出した。
標準的な方法を使用して、膜貫通ドメインへと融合させたヒトＡＮＧＰＴＬ４を安定的
に発現させるＣＨＯ－Ｋ１ＰＤ細胞を作り出した。膜貫通ドメインの存在のために、これ
らの細胞は、ＡＮＧＰＴＬ４を、細胞表面上に提示する。したがって、これらの細胞の表
面上の、抗体の、ＡＮＧＰＴＬ４への結合は、フローサイトメトリーを使用して検出する
ことができる。
ハイブリドーマ上清は、上清中に存在する抗体の、ＣＨＯ－Ｋ１ＰＤ細胞の表面上に発
現させたヒトＡＮＧＰＴＬ４への結合を検出することによりスクリーニングした。抗体の
、細胞への結合は、蛍光標識した抗マウス二次抗体およびフローサイトメトリーを使用し
て検出した。ＡＮＧＰＴＬ４を発現させない親ＣＨＯ－Ｋ１ＰＤ細胞は、陰性対照として
使用した。ＡＮＧＰＴＬ４に結合したハイブリドーマについて、標準的な方法を使用して
、抗体を、細胞上清から精製し、結果として得られる富化上清を、フローサイトメトリー
アッセイにおいて、ＣＨＯ－Ｋ１ＰＤ／ＡＮＧＰＴＬ４細胞およびＣＨＯ－Ｋ１ＰＤ親細
胞を用いて調べた。
ハイブリドーマ上清中のＡＮＧＰＴＬ４抗体力価は、組換えヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパ
ク質を、ＥＬＩＳＡプレートの表面上に固定化した、標準的な直接的ＥＬＩＳＡアッセイ
を使用することにより決定した。確認された陽性ハイブリドーマをサブクローニングし、
標準的な方法を使用して、これらのハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体
の配列を決定した。
その後、下記の実施例７で記載される方法を使用して、モノクローナル抗体である、１
４Ｐ１８、１７Ｂ１、１９Ｃ１６、および３７Ｐ１は、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に媒介される
、ヒトリポタンパク質リパーゼの阻害を阻害することを示した。１４Ｐ１８、１７Ｂ１、
１９Ｃ１６、および３７Ｐ１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およ
びアミノ酸配列は、標準的な方法を使用して決定した。
実施例４：モノクローナル抗体のヒト化
当技術分野では、ヒト化の工程について十分に記載されている（Jones, et al 1986, Q
ueen, et al 1989, Riechmann, et al 1988, Verhoeyen, Milstein and Winter 1988）。
ヒト化という用語は、非ヒト抗体、例えば、マウス由来抗体の抗原結合性部位の、ヒトア
クセプターフレームワーク、例えば、ヒト生殖細胞系列配列への導入として説明される（
Retter, et al 2005）。抗体をヒト化する主要な根拠は、抗体を、ヒトにおける治療剤と
して投与する場合に、抗体に対する免疫原性応答を発生させる危険性を最小化することで
ある（Rebello, et al 1999）。
抗原結合性部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）（Chothia and Lesk 1987, Kabat, et a
l 1991）と、可変ドメイン（ＶＬおよびＶＨ）のフレームワーク領域内の位置であって、
結合に直接的または間接的に影響を及ぼす位置とを含む。結合に直接的に影響を及ぼしう
るフレームワーク残基は、例えば、ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置する、いわゆる「ア
ウター」ループ領域内に見出すことができる。結合に間接的に影響を及ぼす残基は、例え
ば、いわゆるバーニヤ帯域において見出される（Foote and Winter 1992）。これらは、
ＣＤＲのコンフォメーションを支持すると考えられる。ＣＤＲの外側のこれらの位置は、
フレームワーク領域内のヒト生殖細胞系列アクセプター配列に照らした、最終的なヒト化
抗体の逸脱の数を最小化するのに適する、アクセプターフレームワークを選び出す場合に
考慮される。
実施例５：抗体配列の最適化およびアフィニティー成熟
ある種のアミノ酸配列モチーフは、グリコシル化（例えば、ＮｘＳ／Ｔ［配列中、ｘは
、Ｐ以外の任意のアミノ酸である］）、遊離システインの酸化、脱アミノ化（例えば、Ｎ
Ｇ配列中の、Ｎの脱アミノ化）または異性体化（例えば、ＤＧ配列における）などの翻訳
後修飾（ＰＴＭ）を経ることが公知である。ＣＤＲ領域内に存在する場合、これらのモチ
ーフは、産物の均質性を増大させるために、部位特異的突然変異誘発により除去すること
が理想的である。
当技術分野では、アフィニティー成熟の工程について十分に記載されている。多くのデ
ィスプレイ系の中で、ファージディスプレイ（Smith 1985）および酵母など、真核細胞上
のディスプレイ（Boder and Wittrup 1997）は、抗体－抗原間相互作用について選択する
のに、最も一般的に適用される系である。これらのディスプレイ系の利点は、広範にわた
る抗原に適し、選択厳密性を容易に調整しうることである。ファージディスプレイでは、
ｓｃＦｖ断片またはＦａｂ断片を提示することができ、酵母ディスプレイでは、ｓｃＦｖ
、Ｆａｂ、または全長ＩｇＧを提示することができる。これらの一般的に適用される方法
は、多様性が１×１０７を超える、大規模なライブラリーからの、所望の抗体変異体の選
択を可能とする。多様性が小規模（例えば、１，０００）のライブラリーは、マイクロ発
現およびＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることができる。
非標的化抗体変異体ライブラリーまたはランダム抗体変異体ライブラリーは、例えば、
エラープローンＰＣＲ（Cadwell and Joyce 1994）により作り出すことができ、非常に簡
便であるが、場合によって限定的な手法をもたらす。別の戦略は、抗体候補物質のＣＤＲ
指向性多様化である。１つまたは複数のＣＤＲ内の１つまたは複数の位置は、例えば、縮
重オリゴヌクレオチド（Thompson, et al 1996）、トリヌクレオチド突然変異誘発（ＴＲ
ＩＭ）（Kayushin, et al 1996）、または当技術分野で公知の、他の任意の手法を使用し
て、特異的に標的とすることができる。
実施例６：ヒト化抗体の発現および精製
ヒト（Homo Sapiens）へのコドン最適化を含む、ヒト化ＶＬドメインおよびヒト化ＶＨ
ドメインをコードするＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に依頼した。ＶＬドメインお
よびＶＨドメインをコードする配列は、ＧｅｎｅＡｒｔによるベクターからのカットアン
ドペーストにより、哺乳動物細胞による発現および分離に適する発現ベクターへとサブク
ローニングした。重鎖および軽鎖は、共トランスフェクションを可能とするように、個別
の発現ベクターへとクローニングした。発現ベクターのエレメントは、プロモーター（サ
イトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー－プロモーター）、分泌を容易とするシグナ
ル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ
）遺伝子に由来する）、エピソームにおける複製および原核生物内の複製を可能とするエ
レメント（例えば、ＳＶ４０起点およびＣｏｌＥ１エレメントまたは当技術分野で公知の
他のエレメント）、ならびに選択を可能とするエレメント（アンピシリン耐性遺伝子およ
びゼオシンマーカー）を含む。
ＳＶ４０ラージＴ抗原を構成的に発現させるヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３－Ｔ
ＡＴＣＣ１１２６８）は、ヒト化ＩｇＧタンパク質および／または最適化されたＩｇＧ
タンパク質の一過性発現に好ましい宿主細胞系のうちの１つである。トランスフェクショ
ンは、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、ＭＷ：２５，０００、直鎖状；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ、ＵＳＡ、型番２３９６６）を、トランスフェクション試薬として使用して実施す
る。ＰＥＩ原液は、９００ｍｌの細胞培養グレード水中に、１ｇのＰＥＩを、室温（ＲＴ
）で、注意深く溶解することにより調製する。ＰＥＩの溶解を容易とするために、溶液を
、ＨＣｌを添加することにより、ｐＨ３～５まで酸性化させるのに続いて、ＮａＯＨによ
り、７．０５の最終ｐＨまで中和する。最後に、容量を、１Ｌへと調整し、溶液を、０．
２２μｍのフィルターに通して濾過し、アリコート分割し、さらなる使用まで、－８０℃
で凍結させた。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞は、細胞のトランスフェクションおよび増殖のため
のＮｏｖａｒｔｉｓの特許品である無血清培養培地、ならびに産生／フィード培地として
のＥｘＣｅｌｌ ＶＰＲＯ無血清培養培地（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ
、型番２４５６１Ｃ）を使用して培養する。一過性トランスフェクションのために調製し
た細胞は、懸濁培養により培養する。小スケール（＜５Ｌ）のトランスフェクションには
、細胞を、５％のＣＯ２（播種用フラスコ）で加湿されたインキュベーター内のオービタ
ルシェーカー（１００～１２０ｒｐｍ）上のＣｏｒｎｉｎｇ振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉ
ｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）内で増殖させる。種培養物中の細胞は、指数増殖期（
１ｍｌ当たりの細胞５×１０５個～１ｍｌ当たりの細胞３×１０６個の間の細胞密度）に
維持され、トランスフェクションのために、＞９０％の生存率を提示するものとする。小
スケール（＜５Ｌ）のトランスフェクションには、細胞のアリコートを、種培養物から採
取し、Ｎｏｖａｒｔｉｓ無血清培養培地により、最終容量の３６％中に１ｍｌ当たりの細
胞１．４×１０６個へと調整する。ＤＮＡ溶液（溶液１：１Ｌのトランスフェクションの
ための、０．５ｍｇの重鎖発現プラスミドおよび０．５ｍｇの軽鎖発現プラスミド）は、
ＤＮＡを、最終培養物容量の７％中に１ｍｇ／ｌ（最終容量）まで希釈することに続く、
静かな混合により調製する。細菌の混入を防止するには、０．２２μｍのフィルター（例
えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｔｅｒｉｃｕｐ）を使用して、この溶液を濾過する。次い
で、３ｍｇ／Ｌ（最終容量）のＰＥＩ溶液もまた、最終培養物容量の７％中に希釈し、静
かに混合する（溶液２）。いずれの溶液も、室温（ＲＴ）で５～１０分間にわたりインキ
ュベートする。その後、静かに混合しながら、溶液２を、溶液１へと添加し、室温でさら
に５～１５分間にわたりインキュベートする。次いで、トランスフェクションミックスを
、細胞へと添加し、細胞の培養を、４～６時間にわたり継続する。最後に、総生成容量の
残りの５０％は、ＥｘＣｅｌｌ（登録商標）ＶＰＲＯ無血清培養培地の添加により達成す
る。細胞の培養は、トランスフェクション後１１日間にわたり継続する。
培養物は、４℃、４５００ｒｐｍで２０分間にわたる遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ（登録
商標）、Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３ Ｓ－Ｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏ
ｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）により採取する。回収された細胞上清は、ステリカップフィルター
（０．２２μｍ）に通して滅菌濾過し、さらなる処理まで、４℃で保存する。精製は、消
毒（０．２５ＭのＮａＯＨ）したばかりのＨｉＴｒａｐ ５ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＳｕＲｅカラムを使用して、冷却キャビネット内４℃の
「ＡＫＴＡ １００ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ａｉｒ」クロマトグラフィーシステム上で実施
した。カラムは、５カラム容量のリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で平衡化させ、次いで、滅菌濾
過された上清を、４．０ｍｌ／分でロードした。カラムを、１３カラム容量のＰＢＳで洗
浄した。次いで、抗体を、５０ｍＭのクエン酸塩、７０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．２ ５
カラム容量で溶出させた。溶出物を、３ｍｌの画分に回収し、１Ｍのトリス－ＨＣｌ、ｐ
Ｈ１０で、ｐＨ７へと調整した。抗体を含有する画分をプールし、滅菌濾過（Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ、０．２２ｕｍ）し、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｎ
Ｄ－１０００）を使用して、ＯＤ ２８０ｎｍを測定し、ＯＤ ２８０と、タンパク質配
列に基づき計算されるモル吸光係数とに基づき、タンパク質濃度を計算した。溶出物を、
多角度光散乱検出器（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）を伴うサイズ除外クロマトグラフィーにより、
凝集について調べ、純度を、ゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、内毒素アッセイ（ＬＡ
Ｌ）、および質量分析（ＭＳ）により評価した。必要な場合、第２の精製ステップのため
に、第１の精製からの抗体を、消毒（０．５ＭのＮａＯＨ）したばかりのゲル濾過カラム
（gel viltration column）（Ｈｉ Ｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００
、１２０ｍＬ、ＧＥ－Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ）へとロードした。カラムを、ＰＢＳで平衡化
させ、流量を１ｍｌ／分とするＰＢＳ緩衝液で試行した。溶出物は、１．２ｍｌの画分に
回収した。抗体を含有するタンパク質をプールし、結果として得られる精製抗体を、第１
の精製ステップについて記載された通りに解析した。
上記で記載した方法を使用して、以下のヒト化抗体：ＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６－Ｌ
ＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１８、ＮＥＧ３１８－ＬＡＬＡ、ＮＥＧ
３１９、ＮＥＧ３１３、およびＮＥＧ３１５を、調製し、発現させ、精製した。これらの
ヒト化抗体のフレームワークおよび親抗体を、表３に示し、ヌクレオチド配列およびアミ
ノ酸配列を、表１に示す。全てのヒト化抗体は、重鎖内のＬｅｕ２３４－Ｌｅｕ２３５配
列を、Ａｌａ２３４－Ａｌａ２３５で置きかえた、修飾Ｆｃ領域（ヒトＩｇＧ１－ＬＡＬ
Ａ）を使用して調製した、ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡおよびＮＥＧ３１８－ＬＡＬＡを除き
、ヒトＩｇＧ１抗体として調製した。ヒトＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体は、野生型ヒトＩｇＧ
１抗体と比較して、抗体のエフェクター機能が低減されていることが公知である。
Figure 2024026226000026
実施例７：ヒトリポタンパク質リパーゼアッセイ
標準的なポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション法を使用して、Ｆｒｅｅ
Ｓｔｙｌｅ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養されたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に、
全長ヒトリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列であるＮＭ＿０
００２３７．２にマッチする）をコードする、哺乳動物発現プラスミドをトランスフェク
トした。トランスフェクションの２４時間後において、ヘパリンを、培養培地へと、３Ｕ
／ｍｌの最終濃度まで添加して、細胞表面から分泌されるｈＬＰＬの放出を増強した。ト
ランスフェクションの６０時間後において、培養培地を回収し、０．２μｍのフィルター
を使用して濾過し、グリセロールを、１０％ｖ／ｖの最終濃度まで添加した。結果として
得られる溶液を、緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０％
ｖ／ｖのグリセロール、ｐＨ７．２）であらかじめ平衡化させた、５ｍｌのＨｅｐａｒｉ
ｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ）へとロードした。カラムを、緩衝
液Ａで洗浄し、次いで、ヒトＬＰＬタンパク質を、緩衝液Ａ中に５００ｍＭのＮａＣｌ、
１ＭのＮａＣｌ、および２ＭのＮａＣｌの段階的勾配により溶出させた。最も純度が高く
、最も触媒活性が大きなヒトＬＰＬは、２ＭのＮａＣｌで溶出した。精製ヒトＬＰＬのア
リコートは、瞬時凍結させ、使用まで－８０℃で保存した。
以下のプロトコールを使用して、ＡＮＧＰＴＬ４による、ヒトリポタンパク質リパーゼ
の阻害を遮断する、本発明の抗体の能力を評価した。３８４ウェルアッセイプレート（Ｃ
ｏｒｎｉｎｇ、型番３５７３）および試料プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ、
型番７８１２０１）を、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ウェル１つ当たり０．１
ｍｌ）により、室温で３０分間にわたり洗浄した。次いで、プレートを、０．０５％のＴ
ｗｅｅｎ－２０溶液で、２回にわたり洗浄した。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中のＡＮＧＰＴＬ４抗体（最終アッセイ濃度を０
．０２ｎＭ～５００ｎＭの範囲とする、ウェル１つ当たり２０μｌの系列希釈液）を、試
料プレートへと添加するのに続いて、アッセイ緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭ
のＭｇＣｌ２、ｐＨ７．０）中に２０μｌのヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質（１０ｎＭの
最終アッセイ濃度）を添加し、プレートを、静かに振とうしながら、室温で２０分間にわ
たりインキュベートした。次いで、アッセイ緩衝液（２０μｌ）中で希釈されたリポタン
パク質リパーゼを添加しプレートを、静かに振とうしながら、室温で１０分間にわたりイ
ンキュベートした。
アッセイ緩衝液中にアシル－補酵素Ａオキシダーゼ（Ｓｅｋｉｓｕｉ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃｓ、型番Ｔ－１７）、アシル－補酵素Ａシンテターゼ（Ｓｅｋｉｓｕｉ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ、型番Ｔ－１６）、および西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｅｋｉｓｕｉ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ、型番Ａ７６９９）および補酵素Ａ（
ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、型番１００４９３）を含有する、カップリング酵素ミッ
クスを調製した。カタラーゼアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ、型番Ｃ９２８４）を、カッ
プリング酵素ミックスへと添加し、混合物を、振とうしながら、４℃で３０分間にわたり
インキュベートし、次いで、カタラーゼアガロースビーズを、遠心分離により除去した。
ヒトＶＬＤＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、型番ＬＰ１）を、アッセイ緩衝液中で希釈し、カ
タラーゼアガロースビーズで３０分間にわたり処理し、遠心分離により、ビーズを、溶液
から除去した。アッセイ緩衝液中のＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、型番
Ａ１２２２２）を、３３μＭの濃度まで添加した。
ＬＰＬ、ＡＮＧＰＴＬ４、およびＡＮＧＰＴＬ４抗体を含有する試料プレート内の溶液
へと、カップリング酵素ミックス（２０μｌ）を添加し、結果として得られる溶液５４μ
ｌを、アッセイプレートへと移した。リポタンパク質リパーゼ反応を開始するために、Ｖ
ＬＤＬ／Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ溶液（１８μｌ）を添加し、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチウェ
ルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、レゾルフィン蛍光を、３
０分間にわたり、持続的にモニタリングした。最終アッセイ濃度は、９．４ｎＭのＡＮＧ
ＰＴＬ４、約４ｎＭのヒトリポタンパク質リパーゼ、２．３μｇ／ｍｌのヒトＶＬＤＬ、
０．７５ｍＭのＡＴＰ、９０μＭの補酵素Ａ、０．５Ｕ／ｍｌのＡＣＯ、１．２５Ｕ／ｍ
ｌのＡＣＳ、１．２Ｕ／ｍｌのＨＲＰ、および１０μＭのＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄであった
。
結果として得られるレゾルフィン蛍光対時間データを使用して、各試料について、リポ
タンパク質リパーゼ酵素活性（初期速度）を決定した。ＬＰＬを伴わない対照試料（バッ
クグラウンド対照）、またはＡＮＧＰＴＬ４もしくはＡＮＧＰＴＬ４抗体を伴わない対照
試料（ＬＰＬ活性対照）を使用して、酵素活性を標準化し、これを、ＬＰＬ対照活性に対
する百分率として表した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、異な
るＡＮＧＰＴＬ４抗体濃度についての酵素活性データをプロットし、データを当てはめて
、ＡＮＧＰＴＬ４抗体に媒介される、リポタンパク質リパーゼ酵素活性の増大についての
ＥＣ５０値を生成した。このアッセイでは、１０ｎＭの濃度におけるヒトＡＮＧＰＴＬ４
は、ＬＰＬ活性を、７０～９５％阻害することが典型的であった。本発明のＡＮＧＰＴＬ
４抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４によるＬＰＬの阻害を、用量依存的に逆転した。このアッセイ
からのＥＣ５０結果を、表４に示す。本発明の、選択された抗体についての代表的なデー
タを、図１に示す。
Figure 2024026226000027
実施例８：抗体の特徴付けにおける使用のための、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４タンパク
質、マウスＡＮＧＰＴＬ４タンパク質、およびラットＡＮＧＰＴＬ４タンパク質、ならび
にヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の調製
カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４の配列は、カニクイザル肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｂｉ
ｏｃｈａｉｎ、型番Ｃ１５３４１４９－Ｃｙ、ロット番号Ｂ４０９０５１）に由来する遺
伝子配列を増幅することにより決定した。プライマーである、５－ＵＴ－Ｃｙｎｏ５’－
ＡＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＡＣ－３’（配列番号１５８）および３－ＵＴ－ｃ
ｙｎｏ５’－ＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＴＧＡＡＧ－ＣＴＣＣＡＴＧＣＣ－３’（配列番号１
５９）は、ヒトＡＮＧＰＴＬ４ ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ配列であるＮＭ＿１３９３１４．２
）の５’側非翻訳領域および３’側非翻訳領域に基づきデザインした。ゲル精製されたＰ
ＣＲ産物を、ｐＣＲ４－Ｂｌｕｎｔ－ＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、
型番Ｋ２８７５－４０）へとライゲーションし、配列決定した。クローニングされたカニ
クイザルＡＮＧＰＴＬ４ ｃＤＮＡは、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に対する９５％の相同性を伴
う、４０６アミノ酸のタンパク質をコードした。カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸
２６～４０６をコードする核酸配列を、哺乳動物発現ベクターであるｐＲＳ５へとサブク
ローニングして、２０アミノ酸のＩｋｋシグナル配列、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４のア
ミノ酸２６～４０６、ならびにカルボキシル末端のＦＬＡＧタグ、６ＨＩＳタグ、および
Ａｖｉタグ（表５における配列番号１６０）を有するプラスミドである、ｐＲＳ－Ｉｋｋ
－ｃｙｎｏＡＮＧＰＴＬ４（２６～４０６）－ＦＬＡＧ－６ＨＩＳ－Ａｖｉを作製した。
実施例１において、ヒトＡＮＧＰＴＬ４（２６～４０６）－ＦＬＡＧ－６ＨＩＳ－Ａｖ
ｉタンパク質について記載したのと同様の方法を使用して、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４
（２６～４０６）－ＦＬＡＧ－６ＨＩＳ－Ａｖｉタンパク質を発現させ、精製した。一部
の適用には、実施例１において、ヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質について記載したのと同
様のものを使用して、精製カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を、部位特異的にビオ
チニル化した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより評価される、精製カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４タ
ンパク質の純度は、＞９０％であった。
同様の方法を使用して、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４（２６～１６１）－ＦＬＡＧ－６
ＨＩＳ－Ａｖｉタンパク質を調製した。その対応する発現構築物によりコードされる、カ
ニクイザルＡＮＧＰＴＬ４（２６～１６１）タンパク質の配列を、表５に示す（配列番号
１６１）。
マウスＡＮＧＰＴＬ４（アミノ酸２６～４１０）およびラットＡＮＧＰＴＬ４（アミノ
酸２４～４０５）の発現、精製、およびビオチニル化を、実施例１の方法２において、ヒ
トＡＮＧＰＴＬ４について記載した方法と本質的に同じ方法を使用して実行した。対応す
る発現構築物によりコードされる、マウスＡＮＧＰＴＬ４タンパク質およびラットＡＮＧ
ＰＴＬ４タンパク質の配列を、表５に示す（それぞれ、配列番号１６２および１６３）。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより評価される、精製マウスＡＮＧＰＴＬ４タンパク質および精製ラ
ットＡＮＧＰＴＬ４タンパク質の純度は、＞９０％であった。
ＡＮＧＰＴＬ３（配列番号５、表１）とは、ＡＮＧＰＴＬ４と近縁のヒトタンパク質で
ある。本発明の抗体の、ＡＮＧＰＴＬ３への可能な結合についての査定を可能とするため
に、実施例１の方法２において、ヒトＡＮＧＰＴＬ４について記載した方法と同様の方法
を使用して、ヒトＡＮＧＰＴＬ３（１４～４６０）－ＦＬＡＧ－Ｈｉｓ－Ａｖｉタンパク
質（配列番号１６４、表５）を、発現させ、精製し、ビオチニル化した。
Figure 2024026226000028
Figure 2024026226000029
実施例９：直接的ＥＬＩＳＡアッセイによる抗体結合特異性の特徴付け
直接的ＥＬＩＳＡアッセイを行って、本発明の選択された抗体の抗体結合特異性を特徴
付けた。アッセイは、以下の通りに実施した。プレートを、ウェル１つ当たり５０μＬの
ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、５％ｗ／ｖのウシ血清アルブミン）と共に、
一定の振とう（６００ｒｐｍ）を伴って、２２℃で１時間にわたりインキュベートするこ
とにより、３８４ウェルの、ストレプトアビジンでコーティングしたＭｅｓｏ Ｓｃａｌ
ｅ Ｄｉｓｃｏｅｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プレートをブロッキングした。次いで、プレート洗
浄器（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して、ブロッキングされたＭＳＤプレートを、洗浄緩衝液（
ＰＢＳ、ｐＨ７．４および０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０）で、３回にわたり洗浄
した。洗浄に続き、アッセイ緩衝液（ＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２を伴わないＰＢＳ、ｐ
Ｈ７．４、０．５％ｗ／ｖの脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン、および０．０２％ｖ／ｖ
のＴｗｅｅｎ－２０）中で希釈された、ビオチニル化ヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質：全
長ヒトＡＮＧＰＴＬ４（ｈＡＮＧＰＴＬ４）、ヒトＡＮＧＰＴＬ４コイルドコイルドメイ
ン（ｈＡＮＧＰＴＬ４－ＣＣＤ）、および全長ヒトＡＮＧＰＴＬ３（ｈＡＮＧＰＴＬ３）
を、１ｎＭの濃度（ウェル１つ当たり１５μＬ）、２２℃で１時間にわたるインキュベー
ションにより、表面上に固定化した。次いで、プレートを、前出で記載した通りに、３回
にわたり洗浄した。次いで、アッセイ緩衝液中１ｎＭの濃度まで希釈された抗体を、ＭＳ
Ｄプレートへと適用し（ウェル１つ当たり１５μＬ）、プレートを、一定の振とう（６０
０ｒｐｍ）を伴って、２２℃で１時間にわたりインキュベートした。結合した抗体は、Ｓ
ｕｌｆｏタグ付けされたヤギ抗ヒトＩｇＧの１：５００希釈液、ウェル１つ当たり１５μ
Ｌを添加することにより検出した。次いで、プレートを、一定の振とう（６００ｒｐｍ）
を伴って、１時間にわたりインキュベートした。プレートを３回にわたり洗浄し、次いで
、１倍濃度のＭＳＤ ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ、ウェル１つ当たり１５μＬを添加し
、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｅｖｅｒ
ｙ）を使用して、プレートを現像した。解析のために、データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ
Ｅｘｃｅｌへと移し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ６を使用してプロットした。こ
れらの実験により、このアッセイにおける本発明の被験抗体の全ては、全長ヒトＡＮＧＰ
ＴＬ４およびヒトＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端ドメインに結合するが、全長ヒトＡＮＧＰＴＬ
３には結合しないことが示された。ＡＮＧＰＴＬ３特異的基準抗体は、ＡＮＧＰＴＬ３結
合アッセイ（図２）のための陽性対照として使用した。
実施例１０：溶液平衡滴定（ＳＥＴ）アッセイによる抗体の解離定数の決定
ＳＥＴアッセイは、以下の通りに実施した。９６ウェルポリプロピレンプレート内で、
一定濃度のＡＮＧＰＴＬ４抗体（１０ｐＭ）を、ＳＥＴ緩衝液（ＣａＣｌ２またはＭｇＣ
ｌ２を伴わないＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５％ｗ／ｖのウシ血清アルブミン（脂肪酸非含
有）、および０．０２％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０）中、異なる濃度の、非ビオチニル化
のヒト、カニクイザル、マウスもしくはラットの全長ＡＮＰＧＬＴ４タンパク質、または
ヒトＡＮＧＰＴＬ４ Ｎ末端ドメインタンパク質（０．０１ｐＭ～１００ｎＭの範囲にわ
たる、５倍の系列希釈液）と共に混合した。最終反応容量は、８０μＬであった。接着性
フィルムを使用して、プレートをシーリングし、一定の振とう（３００ｒｐｍ）を伴って
、２２℃で１４時間にわたりインキュベートした。同じ時間において、プレートを、ウェ
ル１つ当たり５０μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、５％ｗ／ｖのウシ血
清アルブミン）と共に、４℃でインキュベートすることにより、３８４ウェルの、ストレ
プトアビジンでコーティングしたＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｅｖｅｒｙ（ＭＳＤ
）プレートをブロッキングした。プレート洗浄器（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して、ブロッキ
ングされたＭＳＤプレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４および０．０５％ｖ／ｖ
のＴｗｅｅｎ－２０）で、３回にわたり洗浄した。ビオチニル化ＡＮＧＰＴＬ４（全長ヒ
トＡＮＧＰＴＬ４、全長カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４、全長マウスＡＮＧＰＴＬ４、また
は全長ラットＡＮＧＰＴＬ４、またはヒトＡＮＧＰＴＬ４ Ｎ末端ドメイン）タンパク質
（１ｎＭ、ウェル１つ当たり１５μＬ）を、一定の振とう（６００ｒｐｍ）を伴う、２２
℃で１時間にわたるインキュベーションにより、ストレプトアビジンでコーティングした
ＭＳＤプレートの表面上に固定化した。次いで、プレートを、前出で記載した通りに、３
回にわたり洗浄した。
平衡結合反応物（ウェル１つ当たり１５μＬ）を、ＡＮＧＰＴＬ４を固定化したＭＳＤ
プレートへと適用し、２２℃で２０分間にわたりインキュベートした。結合しなかった材
料は、プレートを、洗浄緩衝液で、３回にわたり洗浄することにより除去し、捕捉された
抗体は、Ｓｕｌｆｏタグ付けされたヤギ抗ヒトＩｇＧの１：５００希釈液、ウェル１つ当
たり１５μＬ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｅｖｅｒｙ）を添加することにより検
出した。次いで、プレートを、一定の振とう（６００ｒｐｍ）を伴って、１時間にわたり
インキュベートした。プレートを３回にわたり洗浄し、次いで、１倍濃度のＭＳＤ ｒｅ
ａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ、ウェル１つ当たり１５μＬを添加し、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇ
ｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｅｖｅｒｙ）を使用して、プレート
を現像した。解析のために、データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌへと移し、Ｇｒ
ａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ６を使用してプロットした。ＫＤ値は、データを、以下の
式：
ｙ＝（Ｂｍａｘ／（ＣＡｂ／２））×（（ＣＡｂ／２）－（（（（（（ＣＡｇ＋ＣＡｂ）
＋ＫＤ）／２）－（（（（（（ＣＡｇ＋ＣＡｂ）＋ＫＤ）２）／４）－（ＣＡｇ×ＣＡｂ
））０．５））２）／（２×ＣＡｂ）））
［式中、Ｂｍａｘは、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質が溶液中に存在しない場合のシグナルで
あり、ＣＡｂは、溶液中のＡＮＧＰＴＬ４抗体の一定の濃度であり、ＣＡｇは、溶液中の
ＡＮＧＰＴＬ４の濃度であり、ＫＤは、平衡解離定数である］へと当てはめることにより
決定した。この方法を使用して決定された平衡解離定数を、表６に示す。
Figure 2024026226000030
実施例１１：Ｏｃｔｅｔ動態結合アッセイにより決定される抗体の結合動態および解離定
数
本発明の、選択された抗体について解離定数（ＫＤ）を、Ｏｃｔｅｔ（ＦｏｒｔｅＢｉ
ｏ）動態結合アッセイを使用することにより決定した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ １０× Ｋｉ
ｎｅｔｉｃｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、型番１８－５０３２）を、ＤＰＢＳ（
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番１４１９０－１３６）で１０倍に希釈し、結
果として得られる溶液を、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、型番６５５２０）へと
添加した（ウェル１つ当たり０．２ｍｌ）。ストレプトアビジンセンサー（ＦｏｒｔｅＢ
ｉｏ、型番１８－５０２０）を、溶液中に浸漬し、室温で少なくとも１０分間にわたり平
衡化させた。第２の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、型番６５５２０）内では、セ
ンサーを、１× Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｕｆｆｅｒ中で洗浄し、次いで、２５ｎＭのビオ
チニル化ヒトＡＮＧＰＴＬ４またはビオチニル化基準タンパク質（バックグラウンドを差
し引くための）２００ｕｌ中に、室温で１０００秒間にわたり（for 1000 sec at second
s）浸漬した。次いで、センサーを、１× Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｕｆｆｅｒ中で１２０
秒間にわたり洗浄し、１× Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｕｆｆｅｒ中、多様な濃度（２倍の系
列希釈液；最高濃度は、１２．５ｎＭまたは２５ｎＭであり；最低濃度は、０．８～３．
１ｎＭの範囲であり；各ＫＤの決定のために、４つ～６つの異なる抗体濃度を使用した）
で希釈されたＡＮＧＰＴＬ４抗体２００ｕｌ中に浸漬し、抗体の会合は、４８０秒間にわ
たりモニタリングした。次いで、センサーを、１× Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｕｆｆｅｒ
２００ｕｌを含有するウェルへと移し、抗体の解離を、１２００秒間にわたりモニタリン
グした。バックグラウンド補正した会合曲線および解離曲線を、Ｏｃｔｅｔ Ｓｏｆｔｗ
ａｒｅ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）により、大域的に当てはめて、会合速度定数（ｋａ）および
解離速度定数（ｋｄ）を生成し、これを使用して、平衡解離定数（ＫＤ）を計算した。結
果として得られる、本発明の、選択された抗体についてのデータを、表７および表８に示
す。
Figure 2024026226000031
Figure 2024026226000032
実施例１２：水素－重水素交換／質量分析によるエピトープマッピング
質量分析（ＭＳ）と組み合わせた水素－重水素交換（ＨＤｘ）（Woods, 2001）を使用
して、ＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端ドメイン上の、抗体であるＮＥＧ２７６およびＮＥＧ３１
８の結合部位をマッピングした。ＨＤｘでは、タンパク質の、交換可能なアミド水素を、
重水素で置きかえる。この工程は、タンパク質の構造／動態および溶媒接触性に対して高
感度であり、したがって、リガンドの結合について報告することが可能である。これらの
実験の目標は、ＡＮＧＰＴＬ４上の、ＮＥＧ２７６およびＮＥＧ３１８のエピトープの同
定であった。
自動式ＨＤｘ／ＭＳ実験は、文献（Chalmers, 2006）に記載されている方法と同様の方
法を使用して実施した。実験は、ＬＥＡＰ ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ、ｎａｎｏＡＣＱＵ
ＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ、およびＳｙｎａｐｔ Ｇ２質量分析計を含む、Ｗａｔ
ｅｒｓ ＨＤｘ－ＭＳプラットフォーム上で実施した。タンパク質骨格を重水素で標識付
けするのに使用される重水素緩衝液は、５０ｍＭのＤ－トリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、
５００ｍＭのＮａＣｌ、１５％のグリセロール、および０．１％のｎ－オクチルβ－Ｄ－
マルトシドであり、溶液中の重水素の全百分率は、８２．５％であった。ＡＮＧＰＴＬ４
抗体の非存在下における、ヒトＡＮＧＰＴＬ４（２６～１６１）の重水素による標識付け
実験のために、冷却された試験管内で、１００μｌの重水素緩衝液を使用して、３００ピ
コモルのヒトＡＮＧＰＬＴ４（２６～１６１）（１．３μｌ）を希釈し、４℃のローテー
ター上で、２５分間にわたりインキュベートした。次いで、標識付け反応を、１００μｌ
の冷却クエンチ緩衝液により、氷上で３分間にわたりクエンチした。３分後、クエンチさ
れた溶液を、自動式ペプシン消化およびペプチド解析のための、ＬＣ－ＭＳシステムへと
注入した。結合したＡＮＧＰＴＬ４抗体の存在下における、ヒトＡＮＧＰＴＬ４（２６～
１６１）重水素による標識付け実験のために、３００ピコモルのＡＮＧＰＴＬ４抗体を、
まず、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｐｌｕｓビーズ上に固定化し、スベリン酸ジ
スクシンイミジル（ＤＳＳ）を使用して架橋した。標識付け実験を実施するために、抗体
ビーズ（３００ピコモルの抗体を含有する）を、３００ピコモルのヒトＡＮＧＰＴＬ４（
２６～１６１）と共に、４℃で３０分間にわたりインキュベートした。３０分後、ビーズ
を、２００μｌのトリス緩衝液で洗浄した。次いで、２００μｌの冷却された重水素緩衝
液を添加し、複合体を、４℃で２５分間にわたりインキュベートした。２５分後、標識付
け反応を、１２５μｌの冷却されたクエンチ緩衝液により、氷上で２．５分間にわたりク
エンチした。試料を、遠心分離機内で、３０秒間にわたりスピンした後、クエンチされた
溶液を、自動式ペプシン消化およびペプチド解析のための、ＬＣ－ＭＳシステムへと注入
した。
全ての測定は、最低３回にわたる三連解析試行を使用して実行した。全ての重水素交換
実験は、０．５ＭのＴＣＥＰおよび３Ｍの尿素（ｐＨ＝２．５）を使用してクエンチした
。クエンチの後、交換された抗原を、１２℃でＰｏｒｏｓｚｙｍｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚ
ｅｄ Ｐｅｐｓｉｎカラム（２．１×３０ｍｍ）を使用するオンラインペプシン消化に続
く、Ｗａｔｅｒｓ Ｖａｎｇｕａｒｄ ＨＳＳ Ｔ３トラッピングカラム上のトラッピン
グにかけた。ペプチドを、トラッピングカラムから溶出させ、Ｗａｔｅｒｓ ＣＳＨ Ｃ
１８ １×１００ｍｍカラム（１℃で維持される）上、４０μｌ／分の流量で、２～３５
％Ｂの二成分の８分の勾配（移動相Ａは、９９．９％の水および０．１％のギ酸であり；
移動相Ｂは、９９．９％のアセトニトリルおよび０．１％のギ酸である）を使用して分離
した。
これらの重水素交換実験では、ＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端ドメイン配列のうちの、８７％
をカバリングするペプチドを検出した。検出されたペプチド、および各ペプチドについて
の重水素の取込みの低減を、表９に指し示す。ＨＤｘＭＳマッピング実験により、ＡＮＧ
ＰＴＬ４のＮ末端ドメインの３つの領域であって、ＮＥＧ２７６およびＮＥＧ３１８の両
方により著明に保護される３つの領域：アミノ酸２６～３５（Ｇ２６ＰＶＱＳＫＳＰＲＦ
３５）（配列番号１６５）、アミノ酸４２～６８（Ｎ４２ＶＬＡＨＧＬＬＱＬＧＱＧＬＲ
ＥＨＡＥＲＴＲＳＱＬＳＡ６８）（配列番号１７４）、およびアミノ酸６９～９５（Ｌ６
９ＥＲＲＬＳＡＣＧＳＡＣＱＴＥＧＳＴＤＬＰＬＡＰＥＳ９５）（配列番号１９０）が同
定された。ＮＥＧ２７６およびＮＥＧ３１８が、ＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端ドメインの複数
の領域を、重水素の取込みから保護するという観察は、直鎖状ペプチドエピトープマッピ
ングからの結果であって、ＮＥＧ２７６およびＮＥＧ３１８が、直鎖状エピトープではな
く、コンフォメーショナルエピトープを有することを示唆する結果と符合する（実施例１
３を参照されたい）。
Figure 2024026226000033
Figure 2024026226000034
実施例１３：直鎖状ペプチドの結合によるエピトープマッピング
本発明の、選択された抗体、すなわち、ＮＥＧ２７６およびＮＥＧ３１８が、ヒトＡＮ
ＧＰＴＬ４のＮ末端コイルドコイルドメインに由来する、１５アミノ酸の直鎖状ペプチド
に結合する能力について調べた。標準的な方法を使用して、合計４３のペプチドを合成お
よび精製した（ペプチドの配列を、表１０に示す）。ペプチドを、ガラス表面上に固定化
し、ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）において、直鎖状ペプチドエピトープマッピングのために最適化された実験法を使用
して、ＮＥＧ２７６およびＮＥＧ３１８が、固定化されたペプチドに結合する能力を査定
した。ＡＮＧＰＴＬ４に結合しない抗体は、非特異的結合についての対照として使用した
。これらの実験では、ＮＥＧ２７６またはＮＥＧ３１８の、１５マーのペプチド４３のう
ちのいずれに対する特異的結合も観察されなかった。これらの結果は、ＮＥＧ２７６およ
びＮＥＧ３１８のエピトープが、直鎖状ＡＮＧＰＴＬ４ペプチドではなく、コンフォメー
ショナルエピトープであることを強く示唆する。
Figure 2024026226000035
Figure 2024026226000036
実施例１４：本発明のＡＮＧＰＴＬ４抗体の、ヒトＡＮＧＰＴＬ４トランスジェニックマ
ウスにおける血漿トリグリセリド濃度に対する効果
マウスにおいてトランスジェニックヒトＡＮＧＰＴＬ４を発現させる構築物は、全長ヒ
トＡＮＧＰＴＬ４ ｃＤＮＡ配列を、ヒトアポリポタンパク質Ｅ遺伝子プロモーターと、
その肝臓における制御領域とを含有する、ｐＬＩＶＬＥ６ベクターのポリリンカー領域へ
と挿入することにより制作した。ＡＮＧＰＴＬ４トランスジェニックマウスは、Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６Ｊバックグラウンド上で作り出し、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ
、ＮＪ）において繁殖させた。７日齢のトランスジェニックマウスの尾を切除し、ＲＥＤ
Ｅｘｔｒａｃｔ－Ｎ－Ａｍｐ Ｔｉｓｓｕｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉ
ｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；型番ＸＮＡＴＲ）を使用して、ＤＮＡを、尾から抽出し
た。ヒトＡＮＧＰＴＬ４導入遺伝子は、ｐＬＩＶＬＥ６ベクターを標的とするプライマー
対と、ＡＮＧＰＴＬ４ ｃＤＮＡを標的とするプライマー対とを使用することにより検出
した。マウスは、底部の堅固なケージ内の、不断に自動給水するように装備されたラック
上で飼育し、１２時間の明暗周期（午前６時～午後６時）で維持し、標準的な齧歯動物用
食餌（Ｈａｒｌａｎ－Ｔｅｋｌａｄ；Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ；型番８６０４）を施し
た。動物施設は、３０～７０％の湿度を伴う、６８～７６°Ｆの間で維持した。マウスは
、同腹仔と共に飼育され、研究期間中、試料回収の前の４時間にわたる空腹時間を除き、
食料および水を不断に施された。
ベースラインの血漿トリグリセリド濃度を測定する、顎下腺からの血液回収のために、
動物を、４時間にわたり空腹にさせ、短時間にわたり麻酔をかけた。次いで、マウスに、
ＰＢＳ（１ｋｇ当たり１０ｍＬの注射容量）中で希釈された、１ｋｇ当たり３０ｍｇの抗
体を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。血液は、投与後１、２、および５日目における、４時
間にわたる空腹時間の後で回収して、血漿トリグリセリドおよび総ヒトＩｇＧ濃度を測定
した。血液は、ＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ／ｓｅｐａｒａｔ
ｏｒ ｔｕｂｅｓ ｗｉｔｈ ＥＤＴＡ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ａｎｄ
Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、型番３６５９７３）内に回収し
た。試料を、２０，８１７×ｇで１０分間にわたり遠心分離し、血漿を、０．２ｍＬのＴ
ｈｅｒｍｏ－ｓｔｒｉｐ ｔｕｂｅ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｐｉｔｔｓ
ｂｕｒｇ、ＰＡ；型番ＡＢ ０４５１）へと移し、－８０℃で凍結させ、保存した。
血漿トリグリセリド濃度は、Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＧＰＯ）Ｌｉｑｕｉｄ Ｒｅ
ａｇｅｎｔ ｓｅｔ（Ｐｏｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｎｔｏｎ、ＭＩ、型番
Ｔ７５３２－５００）を使用して測定した。略述すると、３７℃まであらかじめ加熱され
た、３００μＬのアッセイ試薬を、透明平底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ、型番２６９６２０）内の５μＬの血漿へと添加した。プレートを、プレ
ートシェーカー上で３０秒間にわたり混合し、次いで、３７℃のインキュベーター内に、
５分間にわたり静置した。２０秒間にわたる混合に続き、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉ
ｃｅｓ ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＰＬＵＳプレートリーダーを使用して、５００ｎｍにお
ける吸光度を測定した。トリグリセリド濃度は、既知量のトリグリセリド基準物質（Ｐｏ
ｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、型番Ｔ７５３１－ＳＴＤ）を使用して作成した、検量
線を使用することにより計算した。
抗体ＮＥＧ２７６およびＮＥＧ３１８はいずれも、ヒトＡＮＧＰＴＬ４トランスジェニ
ックマウスへと投与されると、血漿トリグリセリドレベルを低減した（図３）。
実施例１５：本発明のＡＮＧＰＴＬ４抗体のうちの１つを、肥満した糖尿病で高トリグリ
セリド血症のカニクイザルへと投与することの効果
ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡの薬物動態プロファイルおよび薬理学的効果を査定するために
、本発明者らは、単回、１ｋｇ当たり３ｍｇの皮下投与を、４匹の高トリグリセリド血症
のカニクイザルに施した。この研究で使用されるサルの、ベースラインの血漿トリグリセ
リドレベルは、２０７ｍｇ／ｄＬ～２４３８ｍｇ／ｄＬであった。ＮＥＧ２７６－ＬＡＬ
Ａの投与後５週間にわたる多様な時点において、血漿試料を回収した（血液試料は、動物
から、午前中の給餌の前に取り出し、動物を一晩にわたり空腹させることはしなかった）
。
総ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ血漿濃度は、標準的な方法により決定した。ＮＥＧ２７６－
ＬＡＬＡは、投与の３日後において、１５，５３６±２２８１ｎｇ／ｍＬの平均最大血漿
濃度（Ｃｍａｘ）に達した。投与後２１日目に、平均ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡ血漿濃度は
、２６６３ｎｇ／ｍＬであった（図４）。
血漿ＴＧ、総コレステロール、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール、総ア
ポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）、およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ａｐｏＣＩＩＩ
）濃度は、市販のアッセイキット（ＴＧ：Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＧＰＯ）Ｌｉｑｕ
ｉｄ Ｒｅａｇｅｎｔ ｓｅｔ、Ｐｏｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、型番Ｔ７５３２
－５００；総コレステロール：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔ、Ｐｏ
ｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、型番Ｃ７５１０－５００；ＨＤＬ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅ
ｒｏｌ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｒｏｍ ｍａｎｕａｌ ＨＤ
Ｌ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ、和光純薬工業株式会社、型番４３１－５２５０１；総Ａｐ
ｏＢ：Ｋ－Ａｓｓａｙ Ａｐｏ Ｂ、Ｋａｍｉｙａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ、型番ＫＡＩ－００４；ＡｐｏＣ－ＩＩＩ：ＡｐｏＣ－ＩＩＩ Ａｓｓａｙ Ｒｅａ
ｇｅｎｔ、Ｒａｎｄｏｘ、型番ＬＰ－３８６５）を使用して決定した。
ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡの投与は、血漿トリグリセリド（ＴＧ）レベルの顕著な低下を
結果としてもたらした。ピーク血漿ＴＧの低下は、投与後７日目に観察され、この時点に
おいて、血漿ＴＧ濃度は、ベースラインの血漿ＴＧレベルより５８％低かった。投与後７
日目にピークＴＧの低下が生じた後で、血漿ＴＧ濃度は、投与後２１日目まで、ベースラ
インの濃度と比べた、４０％を超える抑制を保ち、次いで、ベースラインへと戻った（図
５）。血漿ＴＧに対するその効果に加えて、ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡの投与は、血漿総コ
レステロール濃度を、ベースラインと比べて約３０％低減し（図６）、投与後７～２１日
目において、ＨＤＬコレステロール濃度を、ベースラインから２０％を超えて増大させた
（図７）。加えて、投与後７～２１日目において、血漿総ａｐｏＢ濃度の、約３０％の減
少も観察され（図８）、７～２１日目において、血漿ａｐｏＣ－ＩＩＩ濃度の、ベースラ
インと比べた約２５％の減少も観察された（図９）。本発明者らはまた、標準的なサイズ
除外クロマトグラフィー法を使用してリポタンパク質成分を分離することにより、ＮＥＧ
２７６－ＬＡＬＡの投与の、リポタンパク質関連トリグリセリドレベルおよびコレステロ
ールレベルに対する効果も査定した。投与前（０日目）の試料と投与後７日目の試料とに
ついての、リポタンパク質プロファイリングデータの比較は、ＮＥＧ２７６－ＬＡＬＡの
投与が、トリグリセリドに富むリポタンパク質（ＴＲＬ）と関連するコレステロール濃度
、およびトリグリセリド濃度の顕著な減少（１匹のサルからの結果を、図１０および図１
１に示す）を結果としてもたらすことを示した。
参照による組込み
本明細書で引用される全ての参考文献であって、特許、特許出願、論文、教科書などを
含む参考文献、およびそれらにおいて引用された参考文献は、それらについて既に言及し
た程度において（to the extent that they are not already）、参照によりそれらの全
体において本明細書に組み込まれる。
同等物
前出の明細書は、当業者が、本発明を実施することを可能とするのに十分であると考え
られる。前出の記載および実施例は、本発明のある種の好ましい実施形態について詳述し
、本発明者らにより企図される最良の方式について記載する。しかし、前出の記載および
実施例が、本文中でいかに詳述されているように見えるとしても、本発明は、多くの様式
で実施することができ、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらの任意の同等物に
従うとみなされるべきであることが察知されるであろう。

本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
単離抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその断片。
［２］
前記抗体または断片が、ＬＰＬの、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質への結合を遮断する、上
記項目のいずれかに記載の単離抗体または断片。
［３］
ＦｏｒｔｅＢｉｏ動態結合アッセイにより測定される４５ｐＭ以下のＫＤ、または溶液
平衡滴定アッセイ（ＳＥＴ）により測定される２４ｐＭ以下のＫＤで、ヒトＡＮＧＰＴＬ
４タンパク質に結合する、単離抗体またはその断片。
［４］
前記抗体または断片が、表１に列挙されたＣＤＲのうちの少なくとも１つに対して少な
くとも９５％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、上記項目のいず
れかに記載の単離抗体または断片。
［５］
前記抗体または断片が、表１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、上記項目
のいずれかに記載の単離抗体または断片。
［６］
前記抗体または断片が、表１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、変異体が
、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちの１つにおいて、少なくとも１～４カ所の
アミノ酸変化を有する、上記項目のいずれかに記載の単離抗体または断片。
［７］
ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその断片であって、配列番号９、３４、
５４、７４、９４、１１４、および１３４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む
、単離抗体またはその断片。
［８］
ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその断片であって、配列番号１３、３８
、５８、７８、９８、１１８、および１３８からなる群から選択されるＶＨ；ならびに配
列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８からなる群から選択され
るＶＬまたはその９７～９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離抗体またはそ
の断片。
［９］
配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８からなる群から選択さ
れる重鎖可変ドメイン配列を含む、単離抗体またはその断片。
［１０］
配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８からなる群から選択
される軽鎖可変ドメイン配列を含む、単離抗体またはその断片。
［１１］
配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８からなる群から選択さ
れる重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、お
よび１４８からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含む、単離抗体またはその
断片。
［１２］
配列番号７、３２、５２、７２、９２、１１２、および１３２からなる群から選択され
る重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号８、３３、５３、７３、９３、１１３、および１３
３からなる群から選択されるＣＤＲ２；９、３４、５４、７４、９４、１１４、および１
３４からなる群から選択されるＣＤＲ３；配列番号１７、４２、６２、８２、１０２、１
２２、および１４２からなる群から選択される軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１８、
４３、６３、８３、１０３、１２３、および１４３からなる群から選択されるＣＤＲ２；
ならびに配列番号１９、４４、６４、８４、１０４、１２４、および１４４からなる群か
ら選択されるＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１３］
配列番号１０、３５、５５、７５、９５、１１５、および１３５からなる群から選択さ
れる重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１１、３６、５６、７６、９６、１１６、および
１３６からなる群から選択されるＣＤＲ２；１２、３７、５７、７７、９７、１１７、お
よび１３７からなる群から選択されるＣＤＲ３；配列番号２０、４５、６５、８５、１０
５、１２５、および１４５からなる群から選択される軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号
２１、４６、６６、８６、１０６、１２６、および１４６からなる群から選択されるＣＤ
Ｒ２；ならびに配列番号２２、４７、６７、８７、１０７、１２７、および１４７からな
る群から選択されるＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１４］
配列番号７の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号８のＣＤＲ２；配列番号９のＣＤＲ３
；配列番号１７の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１８のＣＤＲ２；および配列番号１
９のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１５］
配列番号３２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号３３のＣＤＲ２；配列番号３４のＣ
ＤＲ３；配列番号４２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号４３のＣＤＲ２；および配列
番号４４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１６］
配列番号５２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号５３のＣＤＲ２；配列番号５４のＣ
ＤＲ３；配列番号６２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号６３のＣＤＲ２；および配列
番号６４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１７］
配列番号７２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号７３のＣＤＲ２；配列番号７４のＣ
ＤＲ３；配列番号８２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号８３のＣＤＲ２；および配列
番号８４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１８］
配列番号９２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号９３のＣＤＲ２；配列番号９４のＣ
ＤＲ３；配列番号１０２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１０３のＣＤＲ２；および
配列番号１０４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１９］
配列番号１１２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１１３のＣＤＲ２；配列番号１１
４のＣＤＲ３；配列番号１２２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１２３のＣＤＲ２；
および配列番号１２４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２０］
配列番号１３２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１３３のＣＤＲ２；配列番号１３
４のＣＤＲ３；配列番号１４２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１４３のＣＤＲ２；
および配列番号１４４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２１］
配列番号１０の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１１のＣＤＲ２；配列番号１２のＣ
ＤＲ３；配列番号２０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号２１のＣＤＲ２；および配列
番号２２のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２２］
配列番号３５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号３６のＣＤＲ２；配列番号３７のＣ
ＤＲ３；配列番号４５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号４６のＣＤＲ２；および配列
番号４７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２３］
配列番号５５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号５６のＣＤＲ２；配列番号５７のＣ
ＤＲ３；配列番号６５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号６６のＣＤＲ２；および配列
番号６７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２４］
配列番号７５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号７６のＣＤＲ２；配列番号７７のＣ
ＤＲ３；配列番号８５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号８６のＣＤＲ２；および配列
番号８７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２５］
配列番号９５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号９６のＣＤＲ２；配列番号９７のＣ
ＤＲ３；配列番号１０５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１０６のＣＤＲ２；および
配列番号１０７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２６］
配列番号１１５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１１６のＣＤＲ２；配列番号１１
７のＣＤＲ３；配列番号１２５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１２６のＣＤＲ２；
および配列番号１２７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２７］
配列番号１３５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１３６のＣＤＲ２；配列番号１３
７のＣＤＲ３；配列番号１４５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１４６のＣＤＲ２；
および配列番号１４７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２８］
上記項目の一項に記載の抗体またはその断片と、医薬的に許容される担体とを含む、医
薬組成物。
［２９］
ＡＮＧＰＴＬ４障害を処置する方法であって、有効量の、上記項目のいずれかに記載の
抗体または断片を含む医薬組成物を、ＡＮＧＰＴＬ４障害に罹患している患者へ投与する
ステップを含む、方法。
［３０］
前記患者が、重度の高トリグリセリド血症（例えば、血漿トリグリセリド濃度が＞５０
０ｍｇ／ｄＬである）、肥満と関連する高トリグリセリド血症、Ｖ型高トリグリセリド血
症、およびカイロミクロン血症のうちの１つまたは複数に罹患している、上記［２９］に
記載の方法。
［３１］
前記患者が、原発性脂質異常症、メタボリックシンドローム、および２型糖尿病のうち
の１つまたは複数に罹患している、上記［２９］に記載の方法。
［３２］
上記項目のいずれかに記載の単離抗体または断片と同じエピトープに結合する、単離抗
体またはその断片。
［３３］
ヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に結合し、上記項目のいずれかに記載の単離抗体または
断片と交差競合する、単離抗体またはその断片。

Claims (33)

  1. 単離抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその断片。
  2. 前記抗体または断片が、ＬＰＬの、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質への結合を遮断する、前
    記請求項のいずれかに記載の単離抗体または断片。
  3. ＦｏｒｔｅＢｉｏ動態結合アッセイにより測定される４５ｐＭ以下のＫＤ、または溶液
    平衡滴定アッセイ（ＳＥＴ）により測定される２４ｐＭ以下のＫＤで、ヒトＡＮＧＰＴＬ
    ４タンパク質に結合する、単離抗体またはその断片。
  4. 前記抗体または断片が、表１に列挙されたＣＤＲのうちの少なくとも１つに対して少な
    くとも９５％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、前記請求項のい
    ずれかに記載の単離抗体または断片。
  5. 前記抗体または断片が、表１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、前記請求
    項のいずれかに記載の単離抗体または断片。
  6. 前記抗体または断片が、表１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、変異体が
    、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちの１つにおいて、少なくとも１～４カ所の
    アミノ酸変化を有する、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または断片。
  7. ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその断片であって、配列番号９、３４、
    ５４、７４、９４、１１４、および１３４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む
    、単離抗体またはその断片。
  8. ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその断片であって、配列番号１３、３８
    、５８、７８、９８、１１８、および１３８からなる群から選択されるＶＨ；ならびに配
    列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８からなる群から選択され
    るＶＬまたはその９７～９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離抗体またはそ
    の断片。
  9. 配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８からなる群から選択さ
    れる重鎖可変ドメイン配列を含む、単離抗体またはその断片。
  10. 配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８からなる群から選択
    される軽鎖可変ドメイン配列を含む、単離抗体またはその断片。
  11. 配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８からなる群から選択さ
    れる重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、お
    よび１４８からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含む、単離抗体またはその
    断片。
  12. 配列番号７、３２、５２、７２、９２、１１２、および１３２からなる群から選択され
    る重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号８、３３、５３、７３、９３、１１３、および１３
    ３からなる群から選択されるＣＤＲ２；９、３４、５４、７４、９４、１１４、および１
    ３４からなる群から選択されるＣＤＲ３；配列番号１７、４２、６２、８２、１０２、１
    ２２、および１４２からなる群から選択される軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１８、
    ４３、６３、８３、１０３、１２３、および１４３からなる群から選択されるＣＤＲ２；
    ならびに配列番号１９、４４、６４、８４、１０４、１２４、および１４４からなる群か
    ら選択されるＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  13. 配列番号１０、３５、５５、７５、９５、１１５、および１３５からなる群から選択さ
    れる重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１１、３６、５６、７６、９６、１１６、および
    １３６からなる群から選択されるＣＤＲ２；１２、３７、５７、７７、９７、１１７、お
    よび１３７からなる群から選択されるＣＤＲ３；配列番号２０、４５、６５、８５、１０
    ５、１２５、および１４５からなる群から選択される軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号
    ２１、４６、６６、８６、１０６、１２６、および１４６からなる群から選択されるＣＤ
    Ｒ２；ならびに配列番号２２、４７、６７、８７、１０７、１２７、および１４７からな
    る群から選択されるＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  14. 配列番号７の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号８のＣＤＲ２；配列番号９のＣＤＲ３
    ；配列番号１７の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１８のＣＤＲ２；および配列番号１
    ９のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  15. 配列番号３２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号３３のＣＤＲ２；配列番号３４のＣ
    ＤＲ３；配列番号４２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号４３のＣＤＲ２；および配列
    番号４４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  16. 配列番号５２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号５３のＣＤＲ２；配列番号５４のＣ
    ＤＲ３；配列番号６２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号６３のＣＤＲ２；および配列
    番号６４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  17. 配列番号７２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号７３のＣＤＲ２；配列番号７４のＣ
    ＤＲ３；配列番号８２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号８３のＣＤＲ２；および配列
    番号８４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  18. 配列番号９２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号９３のＣＤＲ２；配列番号９４のＣ
    ＤＲ３；配列番号１０２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１０３のＣＤＲ２；および
    配列番号１０４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  19. 配列番号１１２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１１３のＣＤＲ２；配列番号１１
    ４のＣＤＲ３；配列番号１２２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１２３のＣＤＲ２；
    および配列番号１２４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  20. 配列番号１３２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１３３のＣＤＲ２；配列番号１３
    ４のＣＤＲ３；配列番号１４２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１４３のＣＤＲ２；
    および配列番号１４４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  21. 配列番号１０の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１１のＣＤＲ２；配列番号１２のＣ
    ＤＲ３；配列番号２０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号２１のＣＤＲ２；および配列
    番号２２のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  22. 配列番号３５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号３６のＣＤＲ２；配列番号３７のＣ
    ＤＲ３；配列番号４５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号４６のＣＤＲ２；および配列
    番号４７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  23. 配列番号５５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号５６のＣＤＲ２；配列番号５７のＣ
    ＤＲ３；配列番号６５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号６６のＣＤＲ２；および配列
    番号６７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  24. 配列番号７５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号７６のＣＤＲ２；配列番号７７のＣ
    ＤＲ３；配列番号８５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号８６のＣＤＲ２；および配列
    番号８７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  25. 配列番号９５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号９６のＣＤＲ２；配列番号９７のＣ
    ＤＲ３；配列番号１０５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１０６のＣＤＲ２；および
    配列番号１０７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  26. 配列番号１１５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１１６のＣＤＲ２；配列番号１１
    ７のＣＤＲ３；配列番号１２５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１２６のＣＤＲ２；
    および配列番号１２７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  27. 配列番号１３５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１３６のＣＤＲ２；配列番号１３
    ７のＣＤＲ３；配列番号１４５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１４６のＣＤＲ２；
    および配列番号１４７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
  28. 上記請求項の一項に記載の抗体またはその断片と、医薬的に許容される担体とを含む、
    医薬組成物。
  29. ＡＮＧＰＴＬ４障害を処置する方法であって、有効量の、前記請求項のいずれかに記載
    の抗体または断片を含む医薬組成物を、ＡＮＧＰＴＬ４障害に罹患している患者へ投与す
    るステップを含む、方法。
  30. 前記患者が、重度の高トリグリセリド血症（例えば、血漿トリグリセリド濃度が＞５０
    ０ｍｇ／ｄＬである）、肥満と関連する高トリグリセリド血症、Ｖ型高トリグリセリド血
    症、およびカイロミクロン血症のうちの１つまたは複数に罹患している、請求項２９に記
    載の方法。
  31. 前記患者が、原発性脂質異常症、メタボリックシンドローム、および２型糖尿病のうち
    の１つまたは複数に罹患している、請求項２９に記載の方法。
  32. 前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または断片と同じエピトープに結合する、単離
    抗体またはその断片。
  33. ヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に結合し、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体また
    は断片と交差競合する、単離抗体またはその断片。
JP2023202489A 2014-08-07 2023-11-30 アンジオポエチン様４抗体および使用法 Pending JP2024026226A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462034409P 2014-08-07 2014-08-07
US62/034,409 2014-08-07
JP2020004261A JP2020075929A (ja) 2014-08-07 2020-01-15 アンジオポエチン様４抗体および使用法
JP2022007104A JP7397104B2 (ja) 2014-08-07 2022-01-20 アンジオポエチン様４抗体および使用法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022007104A Division JP7397104B2 (ja) 2014-08-07 2022-01-20 アンジオポエチン様４抗体および使用法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024026226A true JP2024026226A (ja) 2024-02-28

Family

ID=53836146

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017506693A Active JP6649358B2 (ja) 2014-08-07 2015-08-06 アンジオポエチン様４抗体および使用法
JP2020004261A Pending JP2020075929A (ja) 2014-08-07 2020-01-15 アンジオポエチン様４抗体および使用法
JP2022007104A Active JP7397104B2 (ja) 2014-08-07 2022-01-20 アンジオポエチン様４抗体および使用法
JP2023202489A Pending JP2024026226A (ja) 2014-08-07 2023-11-30 アンジオポエチン様４抗体および使用法

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017506693A Active JP6649358B2 (ja) 2014-08-07 2015-08-06 アンジオポエチン様４抗体および使用法
JP2020004261A Pending JP2020075929A (ja) 2014-08-07 2020-01-15 アンジオポエチン様４抗体および使用法
JP2022007104A Active JP7397104B2 (ja) 2014-08-07 2022-01-20 アンジオポエチン様４抗体および使用法

Country Status (32)

Country Link
US (4) US9771417B2 (ja)
EP (2) EP4122957A1 (ja)
JP (4) JP6649358B2 (ja)
KR (2) KR20240056627A (ja)
CN (1) CN107148428B (ja)
AP (1) AP2017009721A0 (ja)
AR (1) AR101486A1 (ja)
AU (1) AU2015300685B2 (ja)
BR (1) BR112017002173B1 (ja)
CA (1) CA2957219A1 (ja)
CL (1) CL2017000212A1 (ja)
CO (1) CO2017001087A2 (ja)
CR (1) CR20170040A (ja)
CU (1) CU24453B1 (ja)
DK (1) DK3177642T3 (ja)
EA (1) EA201790336A1 (ja)
EC (1) ECSP17013904A (ja)
ES (1) ES2906216T3 (ja)
IL (1) IL250289B2 (ja)
JO (1) JO3565B1 (ja)
MA (1) MA40512A (ja)
MX (2) MX2017001746A (ja)
NZ (1) NZ728425A (ja)
PE (1) PE20170287A1 (ja)
PH (1) PH12017500156A1 (ja)
PL (1) PL3177642T3 (ja)
PT (1) PT3177642T (ja)
SG (2) SG10201805646WA (ja)
TN (1) TN2017000019A1 (ja)
TW (1) TWI675043B (ja)
UY (1) UY36262A (ja)
WO (1) WO2016020880A2 (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3194437B1 (en) 2014-08-07 2021-01-20 Novartis AG Angiopoietin-like 4 (angptl4) antibodies and methods of use
KR20240056627A (ko) 2014-08-07 2024-04-30 노파르티스 아게 안지오포이에틴-유사 4 항체 및 사용 방법
GB2569144B (en) * 2017-12-06 2021-06-16 Proimmune Ltd Method for screening the activity of mutated expressed polypeptides
CN111868082A (zh) * 2018-02-02 2020-10-30 博奥泰克尼公司 调节vista和vsig3的相互作用的化合物及其制备和使用方法
CR20210492A (es) * 2019-03-26 2021-11-19 Janssen Pharmaceutica Nv ANTICUERPOS CONTRA AMILOIDES-ß CON PIROGLUTAMATO Y USOS DE ESTOS
WO2023175022A1 (en) * 2022-03-16 2023-09-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New method to treat infectious diseases

Family Cites Families (129)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
JPH02500329A (ja) 1987-05-21 1990-02-08 クリエイテイブ・バイオマリキユールズ・インコーポレーテツド ターゲット化多機能蛋白質
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
EP0401384B1 (en) 1988-12-22 1996-03-13 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69123241T2 (de) 1990-12-14 1997-04-17 Cell Genesys Inc Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
ES2202310T3 (es) 1991-12-13 2004-04-01 Xoma Corporation Metodos y materiales para la preparacion de dominios variables de anticuerpos modificados y sus usos terapeuticos.
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
DK1087013T3 (da) 1992-08-21 2009-05-11 Univ Bruxelles Immunoglobuliner uden lette kæder
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
AU1397895A (en) 1993-12-22 1995-07-10 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Peptide analogs of the activated platelet binding site on factor xi
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
CA2196200A1 (en) 1994-07-29 1996-02-15 Michael Joseph Browne Novel compounds
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
MA24512A1 (fr) 1996-01-17 1998-12-31 Univ Vermont And State Agrienl Procede pour la preparation d'agents anticoagulants utiles dans le traitement de la thrombose
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US7368531B2 (en) 1997-03-07 2008-05-06 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
EP1724282B1 (en) 1997-05-21 2013-05-15 Merck Patent GmbH Method for the production of non-immunogenic proteins
CA2304254C (en) 1997-06-11 2012-05-22 Hans Christian Thogersen Trimerising module
EP0985039B1 (en) 1997-06-12 2008-02-20 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Artificial antibody polypeptides
US6030831A (en) 1997-09-19 2000-02-29 Genetech, Inc. Tie ligand homologues
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
PT1914244E (pt) 1999-04-09 2013-07-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para regular a actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
US7001766B2 (en) 1999-07-20 2006-02-21 Curagen Corporation Nucleic acid sequences encoding human angiopoietin-like polypeptides
EP1212422B1 (en) 1999-08-24 2007-02-21 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
NZ521540A (en) 2000-04-11 2004-09-24 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
CA2405709A1 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CA2441903C (en) 2000-05-26 2012-07-31 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
ATE378403T1 (de) 2000-11-30 2007-11-15 Medarex Inc Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humänen antikörpern
AU2002245978A1 (en) 2001-04-04 2002-10-21 Jane E. Aubin Estrogen receptor-related receptor alpha (err) agonist for inducing cartilage formation
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
WO2002092780A2 (en) 2001-05-17 2002-11-21 Diversa Corporation Novel antigen binding molecules for therapeutic, diagnostic, prophylactic, enzymatic, industrial, and agricultural applications, and methods for generating and screening thereof
EP1443961B1 (en) 2001-10-25 2009-05-06 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
WO2003074679A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
US20040180855A1 (en) 2003-02-19 2004-09-16 Schumacher William A. Methods of treating thrombosis with reduced risk of increased bleeding times
WO2004089297A2 (en) 2003-04-02 2004-10-21 Suntory Pharmaceutical Research Laboratories, Llc Compounds and methods for treatment of thrombosis
DE10324447A1 (de) 2003-05-28 2004-12-30 Scil Proteins Gmbh Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin
CA2531796A1 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Transtech Pharma, Inc. Aryl and heteroaryl compounds, compositions, and methods of use
CA2553692C (en) 2004-01-20 2014-10-07 Kalobios, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
US8604185B2 (en) 2004-07-20 2013-12-10 Genentech, Inc. Inhibitors of angiopoietin-like 4 protein, combinations, and their use
BRPI0513534A (pt) 2004-07-20 2008-05-06 Genentech Inc inibidores de proteìna 4 semelhante à angiopoietina, combinações, e seu uso
DK1781698T3 (en) 2004-07-20 2016-10-03 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE USE OF Angiopoietin-like-4-PROTEIN
EP1773771A2 (en) 2004-07-23 2007-04-18 Daiamed, Inc. Compounds and methods for treatment of thrombosis
KR101387781B1 (ko) 2005-01-07 2014-04-21 렉시컨 파마슈티컬스 인코퍼레이티드 앤지오포이에틴-유사 단백질 4 (ａｎｇｐｔｌ４) 에 대한단일클론 항체
US7459564B2 (en) 2005-01-13 2008-12-02 Bristol-Myers Squibb Company Substituted biaryl compounds as factor XIa inhibitors
CA2648522A1 (en) 2005-04-04 2006-10-12 Daiamed, Inc. Substituted azetidinones
US20070041905A1 (en) 2005-08-19 2007-02-22 Hoffman Rebecca S Method of treating depression using a TNF-alpha antibody
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
AU2006283532B2 (en) 2005-08-19 2012-04-26 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
JP5225098B2 (ja) 2005-12-14 2013-07-03 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー 第ＸＩａ因子インヒビターとしてのアリールプロピオンアミド、アリールアクリルアミド、アリールプロピンアミド、またはアリールメチルウレアアナログ
WO2007109307A2 (en) * 2006-03-20 2007-09-27 Curagen Corporation Antibodies directed to angiopoietin-like protein 4 and uses thereof
EP2222707B1 (en) 2007-11-21 2016-01-06 Oregon Health & Science University Anti-factor xi monoclonal antibodies and methods of use thereof
US8168586B1 (en) 2007-11-21 2012-05-01 Celera Corporation Cancer targets and uses thereof
ES2380648T3 (es) 2008-03-13 2012-05-17 Bristol-Myers Squibb Company Derivados de piridazina como inhibidores del factor XIA
TR201820051T4 (tr) 2008-06-19 2019-01-21 Prothix Bv Anti-faktör XI Antikorlarının Trombüs Oluşumunun Engellenmesi Veya Tedavisi İçin Kullanılması
NZ592203A (en) 2008-10-15 2013-01-25 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation of factor 11 expression
JP5823871B2 (ja) 2008-12-10 2015-11-25 アブリンクス エン．ヴェー． 血管新生に関連した疾患及び障害の治療のための、アンジオポイエチン／Ｔｉｅシステムに指向性を有するアミノ酸配列及びこれを含むポリペプチド
US20120207770A1 (en) 2009-10-14 2012-08-16 Nanyang Technological University Antiproliferative agent
JO3274B1 (ar) * 2009-12-24 2018-09-16 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية للبروتين 4 المشابه لأجيوبيوتين البشري
WO2012088302A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Abbott Laboratories Half immunoglobulin binding proteins and uses thereof
CN102692500B (zh) * 2011-03-21 2015-06-10 上海市肿瘤研究所 Angptl4作为血清学检测肝癌转移的标志物及其应用
US20140242084A1 (en) * 2011-08-08 2014-08-28 Nanyang Technological University Angiopoietin-Like 4 and Its Use in Modulating Cell Leakiness
AU2013245630A1 (en) 2012-04-13 2014-10-30 The Johns Hopkins University Treatment of ischemic retinopathies
PL2847228T3 (pl) 2012-05-10 2019-03-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Przeciwciała zdolne do wiązania się z czynnikiem krzepnięcia XI i/lub jego aktywowaną postacią, czynnikiem Xla oraz ich zastosowanie
CN104768972B (zh) 2012-08-14 2019-12-06 南洋理工大学 血管生成素样4抗体及其用在癌症治疗中的方法
KR20240056627A (ko) 2014-08-07 2024-04-30 노파르티스 아게 안지오포이에틴-유사 4 항체 및 사용 방법
EP3194437B1 (en) 2014-08-07 2021-01-20 Novartis AG Angiopoietin-like 4 (angptl4) antibodies and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
PH12017500156A1 (en) 2017-05-29
JP2017529324A (ja) 2017-10-05
WO2016020880A2 (en) 2016-02-11
ECSP17013904A (es) 2019-02-28
AU2015300685B2 (en) 2018-07-19
US20160145326A1 (en) 2016-05-26
SG10201805646WA (en) 2018-08-30
CN107148428A (zh) 2017-09-08
IL250289A0 (en) 2017-03-30
CU20170012A7 (es) 2017-04-05
KR102659872B1 (ko) 2024-04-24
US20220213181A1 (en) 2022-07-07
EP4122957A1 (en) 2023-01-25
CU24453B1 (es) 2019-11-04
CA2957219A1 (en) 2016-02-11
PL3177642T3 (pl) 2022-03-07
TWI675043B (zh) 2019-10-21
TW201613978A (en) 2016-04-16
US20180044410A1 (en) 2018-02-15
MX2017001746A (es) 2017-04-27
PE20170287A1 (es) 2017-04-05
EA201790336A1 (ru) 2017-06-30
US10577411B2 (en) 2020-03-03
NZ728425A (en) 2022-05-27
BR112017002173B1 (pt) 2023-11-21
UY36262A (es) 2016-04-01
TN2017000019A1 (en) 2018-07-04
IL250289B2 (en) 2023-02-01
DK3177642T3 (da) 2022-02-21
WO2016020880A3 (en) 2016-05-19
JP6649358B2 (ja) 2020-02-19
KR20240056627A (ko) 2024-04-30
CR20170040A (es) 2017-04-28
PT3177642T (pt) 2022-02-14
MA40512A (fr) 2021-03-24
EP3177642A2 (en) 2017-06-14
KR20170039711A (ko) 2017-04-11
US9771417B2 (en) 2017-09-26
EP3177642B1 (en) 2021-11-24
AR101486A1 (es) 2016-12-21
JO3565B1 (ar) 2020-07-05
ES2906216T3 (es) 2022-04-13
US20200392215A1 (en) 2020-12-17
IL250289B (en) 2022-10-01
AU2015300685A1 (en) 2017-02-23
CO2017001087A2 (es) 2017-05-10
MX2022002635A (es) 2022-03-25
CN107148428B (zh) 2021-03-09
BR112017002173A2 (pt) 2017-11-21
AP2017009721A0 (en) 2017-01-31
JP2020075929A (ja) 2020-05-21
CL2017000212A1 (es) 2017-07-14
JP2022058685A (ja) 2022-04-12
SG11201700473QA (en) 2017-02-27
JP7397104B2 (ja) 2023-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7397104B2 (ja) アンジオポエチン様４抗体および使用法
JP7100745B2 (ja) Ｆｇｆ２１関連障害を処置する方法
AU2017245335B2 (en) Lectin-like oxidized LDL receptor 1 antibodies and methods of use
US9988443B2 (en) Angiopoetin-like 4 (ANGPTL4) antibodies and methods of use
JP6991246B2 (ja) Ｆｇｆ２１模倣抗体及びその使用
JP2016523257A (ja) レクチン様酸化ｌｄｌ受容体１抗体および使用法
EA041397B1 (ru) Антитела к ангиопоэтинподобному белку 4 и способы применения

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231225

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20231225