JP2016523257A - レクチン様酸化ldl受容体1抗体および使用法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒトレクチン様酸化LDL(低密度リポタンパク質)受容体1(以下、場合によって、「LOX−1」と称する)に結合するモノクローナル抗体、ならびにこれを含む医薬組成物および処置方法に関する。
Description
血管疾患は依然として、全世界において、有病率および死亡率の主要原因のうちの1つである。従来の危険因子を標的とする薬物は、血管危険性の一部を低下させる。しかし、実験データおよび臨床データは、他の新規の因子が、冠動脈疾患、大脳動脈疾患、および末梢動脈疾患、ならびにそれらの臨床症状の危険性のより大きな部分を説明しうることを示唆する。
スカベンジャー受容体に媒介された血管細胞による、酸化修飾された低密度リポタンパク質(LDL)粒子(oxLDL)の取込みの調節異常は、アテローム形成における極めて重要なステップであると考えられている。酸化脂質の取込みの媒介に加えて、スカベンジャー受容体は、内皮細胞およびマクロファージの活性化にも関与し、アテローム性動脈硬化の進行およびプラークのびらん/破裂のほか、組織潅流および酸素送達/酸素活用の機能障害を伴う、微小血管の機能不全をもたらす結果として、心筋虚血症または下肢虚血症ももたらす、酸化促進性シグナル伝達経路および炎症促進性シグナル伝達経路の活性化を媒介しうる。
レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体1(LOX−1)とは、血管内皮細胞上、単球上およびマクロファージ上、血管平滑筋細胞上、ならびに血小板上で発現する、多機能性スカベンジャー受容体である。LOX−1は、oxLDL、ならびにNADPHオキシダーゼの活性化およびスーパーオキシドアニオンを含む活性酸素種の発生を結果としてもたらす、他の酸化脂質に結合する。スーパーオキシドアニオンは、内皮一酸化窒素を不活化し、MAPキナーゼおよびNF−κBを活性化する。これにより、炎症性接着分子、サイトカインおよびケモカインのほか、マトリックスメタロプロテイナーゼ、ならびにアポトーシス促進性メディエーターの発現が誘導される。
内皮細胞内、平滑筋細胞内、およびマクロファージ内で、oxLDL−LOX−1により媒介されるシグナル伝達の、炎症促進性帰結、酸化促進性帰結、およびアポトーシス促進性帰結は、アテローム性動脈硬化の進行およびプラークの不安定性において鍵となる役割を果たし、また、虚血症を結果としてもたらす、組織潅流および酸素送達の機能障害においても役割を果たしうると考えられている。進行性アテローム性動脈硬化および臓器虚血症の臨床的帰結は、急性冠動脈症候群、心筋梗塞、不安定狭心症、脳卒中、狭心症、跛行、および重篤な下肢虚血症を含む。加えて、酸化ストレス、血管炎症、および結果として生じる微小血管の機能不全は、腎症および網膜症を含む、糖尿病性血管疾患に寄与すると考えられている。
基礎的なLOX−1の内皮発現レベルは、正常な生理学的状態下では比較的低いが、血管内のLOX−1の発現は、血管疾患と関連する状態では、上方調節される。内皮LOX−1レベルは、酸化ストレス、炎症促進性サイトカイン、C反応性タンパク質(CRP)、およびアンジオテンシンIIにより上昇することが示されている。LOX−1はまた、アテローム性動脈硬化性動物および糖尿病性動物の内皮中、ならびに血管疾患を伴う患者から単離された単球/マクロファージ中でも上方調節される。また、高血糖症、終末糖化産物、およびアテローム形成性リポタンパク質によっても、LOX−1の発現が上方調節されることから、糖尿病と、血管合併症との間の、特異的な分子機構的連関が提示される。
また、サイトカインおよびCRPによるLOX−1の上方調節からも、従来の血管危険因子と、危険性の高い患者および糖尿病患者における血管疾患の加速化との連関が示唆される。急性冠動脈症候群を伴う患者では、CRPおよび可溶性LOX−1のいずれもが増大する。in vitroデータにより、抗LOX−1抗体は、CRPに媒介される、単球の、ヒト大動脈内皮細胞への接着を防止することが示されたことから、血管炎症に関与性の接着分子としてのLOX−1の役割もさらに裏付けられている(Li et al., Circulation Research 2004, 95: 877-883)。
oxLDLおよび他の酸化リポタンパク質のレベルの上昇と連関するLOX−1の発現の増大は、部分的に、NADPHオキシダーゼの活性化および活性酸素種の発生により、内皮機能不全を誘導する。実験では、ApoEノックアウトマウスにおいて、酸化ストレスにより誘導される内皮機能不全を、抗LOX−1中和抗体で逆転することができる(Xu et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2007, 27:871-877)。この研究では、抗LOX−1抗体により、一酸化窒素のバイオアベイラビリティーおよびeNOSタンパク質の発現のいずれもが増大した。
in vivoにおける実験データにより、酸化脂質の存在下の、血管およびマクロファージにおける、LOX−1の過剰発現は、酸化促進性シグナル伝達経路および炎症促進性シグナル伝達経路を活性化させることにより、アテローム性動脈硬化および微小血管の機能不全に寄与することが指し示される。したがって、LOX−1の阻害は、アテローム性動脈硬化、ならびに急性冠動脈症候群、心筋梗塞、および不安定狭心症など、その急性合併症の発症および進行を防止することが期待される。加えて、LOX−1の阻害はまた、微小血管の機能不全を改善することから、慢性狭心症、不応性狭心症、跛行、および重篤な下肢虚血症など、組織虚血症の臨床症状を防止することも期待される。
LOX−1の阻害は、アテローム性動脈硬化性血管疾患の処置および防止において有用であるだけでなく、また、関節リウマチ、多様な形態の血管炎、ブドウ膜炎、加齢黄斑変性など、酸化ストレスおよび炎症を特徴とする他の病理学的状態の処置、ならびに自己免疫疾患(例えば、エリテマトーデス、乾癬)における心血管事象の防止においても有用である。
まとめると、実験データおよび臨床データは、LOX−1は、酸化ストレス、炎症、および血管疾患を連関させる、極めて重要な酸化脂質受容体でありうることを示唆する。本発明で記載される抗LOX−1抗体および抗原結合性断片は、oxLDLおよび他の酸化脂質/リポタンパク質の、LOX−1への結合を阻害することから、LOX−1の活性化を防止し、これにより、血管における酸化ストレスおよび炎症を軽減する。これらの抗体は、血管疾患の急性症状および慢性症状を防止および改善し、酸化ストレスおよび炎症を特徴とする他の疾患を防止および改善することが期待される。
本発明は、ヒトレクチン様酸化LDL(低密度リポタンパク質)受容体1(以下、場合によって、「LOX−1」と称する)に結合するモノクローナル抗体、ならびにこれを含む医薬組成物および処置方法に関する。
本明細書で記載される単離抗LOX−1抗体または抗原結合性断片は、LOX−1に、100pM以下の平衡解離定数(KD)で結合する。例えば、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片は、ヒトLOX−1に、100pM以下、50pM以下、45pM以下、40pM以下、35pM以下のKDで結合しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片はまた、ヒトLOX−1にも、Biacoreにより測定される34pM以下のKDで、または溶液平衡滴定アッセイ(SET)により測定される4pM以下のKDで結合することも可能であり、また、カニクイザルLOX−1に、Biacoreにより測定される53pM以下のKDで、またはSETにより測定される4pM以下のKDで結合することも可能である。
本発明は、ヒトLOX−1およびカニクイザルLOX−1に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片に関する。本発明はまた、LOX−1のC末端レクチン様ドメイン(oxLDL結合性ドメイン)に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
本発明はまた、LOX−1に結合し、表1に記載されている抗体との結合についてさらに競合する、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明はまた、表1に記載されている抗体と同じエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にもさらに関する。
本明細書で記載される単離抗体および抗原結合性断片の結合アフィニティーは、溶解平衡滴定(SET)により決定することができる。当技術分野では、SET法が知られており、以下でさらに詳細に記載される。代替的に、本明細書で記載される単離抗体または断片の結合アフィニティーは、Biacoreアッセイにより決定することもできる。当技術分野では、Biacore反応速度アッセイ法が知られており、以下でさらに詳細に記載される。
本明細書で記載される単離抗LOX−1抗体および抗原結合性断片を使用して、LOX−1の、oxLDL(修飾LDLとしてもまた公知の)への結合を阻害することができる。
本明細書で記載される単離抗LOX−1抗体および抗原結合性断片を使用して、LOX−1の、複数形態の修飾LDL(低密度リポタンパク質)への結合を、100nM以下、50nM以下、35nM以下、25nM以下、10nM以下、または5.2nM以下のIC50で阻害することができる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片は、LOX−1の、硫酸銅で酸化修飾されたLDL(ox−LDL)への結合を、100nM以下、50nM以下、35nM以下、25nM以下、10nM以下、または5.2nM以下のIC50で阻害しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片は、LOX−1の、マロンジアルデヒドで修飾されたLDLへの結合を、100nM以下、50nM以下、35nM以下、25nM以下、20nM以下、または18nM以下のIC50で阻害しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片は、LOX−1の、次亜塩素酸で修飾されたLDLへの結合を、100nM以下、50nM以下、35nM以下、25nM以下、10nM以下、または5nM以下のIC50で阻害しうる。
単離抗LOX−1抗体またはその抗原結合性断片を使用して、LOX−1および/またはNADPHオキシダーゼ(NADPHとは、NADPまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の還元形態である)の発現を低減することができる。
単離抗LOX−1抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、oxLDLの、LOX−1への結合を阻害することを介して、酸化ストレスを阻害する(例えば、その誘導を遮断する)のに使用することができる。単離抗LOX−1抗体またはその抗原結合性断片を使用して、oxLDLに刺激される活性酸素種(ROS)の産生を遮断することができる。単離抗体またはその抗原結合性断片を使用して、防止、処置、または改善しうる、血管の酸化ストレスは、血管収縮を誘導し、血管拡張の機能を障害し、酸素要求量を増大させることにより、心筋虚血症を引き起こす。
単離抗LOX−1抗体またはその抗原結合性断片を使用して、内皮一酸化窒素シンターゼ(eNOS)レベルを、健常なホメオスタシス状態へと回復させることができる。内皮NOSとは、血管内で一酸化窒素(NO)を発生させ、平滑筋の収縮および血小板の凝集を阻害することにより、血管の緊張を調節することに関与する、一酸化窒素シンターゼであり、その下方調節は、LOX−1に関連する内皮細胞機能不全と関連する。
本明細書で記載される単離抗LOX−1抗体またはそれらの抗原結合性断片は、モノクローナル抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、Fv断片、F(ab’)2断片、またはscFv断片、および/またはIgGアイソタイプでありうる。
本明細書で記載される単離抗LOX−1抗体またはそれらの抗原結合性断片はまた、アミノ酸が、ヒトVH生殖細胞系列配列またはヒトVL生殖細胞系列配列のそれぞれに由来する抗体フレームワークへと置換されたフレームワークも含みうる。
本発明の別の態様は、表1に記載されているFabの完全重鎖および軽鎖配列を有する単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。より具体的には、単離抗体またはその抗原結合性断片は、MOR21435、MOR20159、MOR22031、MOR22034、MOR21433、MOR21452、MOR21453、MOR21460、MOR21468、MOR20052、MOR20133、MOR20144、MOR20148、MOR20151、MOR20152、MOR022025、MOR22028、MOR22029、およびMOR22030の重鎖および軽鎖配列を有しうる。
本発明のさらなる態様は、表1に記載されているFabの重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有する単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。より具体的には、単離抗体またはその抗原結合性断片は、MOR21435、MOR20159、MOR22031、MOR22034、MOR21433、MOR21452、MOR21453、MOR21460、MOR21468、MOR20052、MOR20133、MOR20144、MOR20148、MOR20151、MOR20152、MOR022025、MOR22028、MOR22029、およびMOR22030の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有しうる。
本発明はまた、配列番号3、23、43、63、83、103、123、143、163、183、203、223、243、263、283、303、323、343、および363からなる群から選択される重鎖CDR1、配列番号4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264、284、304、324、344、および364からなる群から選択される重鎖CDR2、ならびに配列番号5、25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225、245、265、285、305、325、345、および365からなる群から選択される重鎖CDR3を含み、ヒトLOX−1に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。別の態様では、このような単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233、253、273、293、313、333、353、および373からなる群から選択される軽鎖CDR1、配列番号14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254、274、294、314、334、354、および374からなる群から選択される軽鎖CDR2、ならびに配列番号15、35、55、75、95、115、135、155、175、195、215、235、255、275、295、315、335、355、および375からなる群から選択される軽鎖CDR3をさらに含む。
本発明はまた、配列番号13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233、253、273、293、313、333、353、および373からなる群から選択される軽鎖CDR1、配列番号14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254、274、294、314、334、354、および374からなる群から選択される軽鎖CDR2、ならびに配列番号15、35、55、75、95、115、135、155、175、195、215、235、255、275、295、315、335、355、および375からなる群から選択される軽鎖CDR3を含み、ヒトLOX−1に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
本発明はまた、LOX−1に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびにLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を有し、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号3、4、および5を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号13、14、および15を含むか、またはHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号23、24、および25を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号33、34、および35を含むか、またはHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号43、44、および45を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号53、54、および55を含むか、またはHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号63、64、および65を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号73、74、および75を含むか、またはHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号83、84、および85を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号93、94、および95を含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
本発明はまた、LOX−1に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびにLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を有し、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号103、104、および105を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号113、114、および115を含むか;またはHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号123、124、および125を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号133、134、および135を含むか;またはHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号143、144、および145を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号153、154、および155を含むか;またはHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号163、164、および165を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号173、174、および175を含むか;またはHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号183、184、および185を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号193、194、および195を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
本発明はまた、LOX−1に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびにLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を有し、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号203、204、および205を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号213、214、および215を含むか;またはHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号223、224、および225を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号233、234、および235を含むか;またはHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号243、244、および245を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号253、254、および255を含むか;またはHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号263、264、および265を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号273、274、および275を含むか;またはHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号283、284、および285を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号293、294、および295を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
本発明はまた、LOX−1に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびにLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を有し、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号303、304、および305を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号313、314、および315を含むか;またはHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号323、324、および325を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号333、334、および335を含むか;またはHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号343、344、および345を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号353、354、および355を含むか;またはHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、配列番号363、364、および365を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号373、374、および375を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
本発明はまた、Chothiaにより規定される、配列番号9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、および369、の可変重鎖のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239、259、279、299、319、339、359、および379、の可変軽鎖のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を有する抗体または抗原結合性断片にも関する。本発明の別の態様では、抗体または抗原結合性断片は、Kabatにより規定される、配列番号9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、および369、の重鎖可変ドメイン配列のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239、259、279、299、319、339、359、および379、の軽鎖可変ドメイン配列のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を有しうる。
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、および369からなる群から選択される重鎖可変ドメイン配列を含む。単離抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変ドメイン配列をさらに含むことが可能であり、この場合、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとは、組み合わさって、LOX−1に対する抗原結合性部位を形成する。特に、軽鎖可変ドメイン配列は、配列番号24、44、64、84、および104から選択することができ、この場合、前記単離抗体またはその抗原結合性断片は、LOX−1に結合する。
本発明はまた、配列番号24、44、64、84、および104からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含み、ヒトLOX−1に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。単離抗体または抗原結合性断片は、重鎖可変ドメイン配列をさらに含むことが可能であり、この場合、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとは、組み合わさって、LOX−1に対する抗原結合性部位を形成する。
特に、LOX−1に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号14および24;34および44;54および64;74および84;または94および104、の配列をそれぞれ含む、重鎖および軽鎖可変ドメインを有しうる。
本発明はさらに、配列番号9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、および369からなる群から選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、LOX−1に結合する。一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片はまた、配列番号24、44、64、84、および104からなる群から選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインも含む。本発明のさらなる態様では、単離抗体または抗原結合性断片は、Kabatにより規定され、表1に記載されている、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を有する。
本発明はまた、配列番号24、44、64、84、および104からなる群から選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを有する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、LOX−1に結合する。
本発明の別の態様では、LOX−1に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号11、31、51、71、91、111、131、151、171、191、211、231、251、271、291、311、331、351、または371の配列を含む重鎖を有しうる。単離抗体はまた、重鎖と組み合わさって、ヒトLOX−1に対する抗原結合性部位を形成しうる軽鎖も含みうる。特に、軽鎖は、配列番号21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221、241、261、281、301、321、341、361、または381を含む配列を有しうる。特に、LOX−1に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号16および26;36および46;56および66;76および86;または96および106、のそれぞれの配列を含む重鎖および軽鎖を有しうる。
本発明はなおさらに、配列番号11、31、51、71、91、111、131、151、171、191、211、231、251、271、291、311、331、351、または371からなる群から選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖を含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、LOX−1に結合する。一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片はまた、配列番号21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221、241、261、281、301、321、341、361、または381からなる群から選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖も含む。
本発明はなおさらに、配列番号21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221、241、261、281、301、321、341、361、または381からなる群から選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖を含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、LOX−1に結合する。
本発明はまた、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。本発明は同様に、薬学的に許容される担体と組み合わせた抗体組成物にも関する。とりわけ、本発明は、例えば、抗体のMOR21435、MOR20159、MOR22031、MOR22034、MOR21433、MOR21452、MOR21453、MOR21460、MOR21468、MOR20052、MOR20133、MOR20144、MOR20148、MOR20151、MOR20152、MOR022025、MOR22028、MOR22029、およびMOR22030など、表1の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物をさらに含む。本発明はまた、表1の単離抗体またはそれらの抗原結合性断片のうちの2つ以上の組合せを含む医薬組成物にも関する。
本発明はまた、配列番号9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、および369から選択される配列を有する可変重鎖をコードする単離核酸配列にも関する。特に、核酸は、配列番号10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250、270、290、310、330、350、および370からなる群から選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有する。本発明のさらなる態様では、配列は、配列番号10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250、270、290、310、330、350、および370である。
本発明はまた、配列番号20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、および380から選択される配列を有する可変軽鎖をコードする単離核酸配列にも関する。特に、核酸は、配列番号20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、および380からなる群から選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有する。本発明のさらなる態様では、配列は、配列番号20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、および380である。
本発明はまた、配列番号20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、および380からなる群から選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸にも関する。
本発明はまた、本明細書で記載される核酸分子のうちの1つまたは複数を含むベクターにも関する。
本発明はまた、上記で記載した抗体の重鎖をコードする組換えDNA配列と、上記で記載した抗体の軽鎖をコードする第2の組換えDNA配列とを含む単離宿主細胞にも関し、この場合、前記DNA配列は、プロモーターに作動可能に連結され、宿主細胞内で発現することが可能である。抗体は、ヒトモノクローナル抗体でありうることが企図される。また、宿主細胞は、非ヒト哺乳動物細胞であることも企図される。
本発明はまた、LOX−1の発現および/またはNADPHオキシダーゼ発現を低減する方法であって、細胞を、有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む、方法にも関する。
本発明はまた、酸化LDL(oxLDL)の、ヒト酸化LDL受容体(LOX−1)への結合を阻害するか、またはヒト酸化LDL受容体に媒介される、酸化LDLの、細胞への組込みを阻害する方法であって、細胞を、有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む、方法にも関する。
細胞は、ヒト細胞であることが企図される。細胞は、対象中にあることがさらに企図される。一実施形態では、細胞は、内皮細胞であることが企図される。他の実施形態では、細胞は、マクロファージ、単球、樹状細胞、血管平滑筋細胞(SMC)、軟骨細胞、および心筋細胞のうちの1つまたは複数でありうる。対象は、ヒトであることがなおさらに企図される。
本発明はまた、対象におけるLOX−1関連障害を処置、改善、または防止する方法であって、対象へと、有効量の、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含む、方法にも関する。一態様では、LOX−1関連障害は、跛行(例えば、間欠性跛行、ラザフォード分類II/III跛行)と関連する。一態様では、LOX−1関連障害は、狭心症(例えば、不応性狭心症)と関連する。対象は、ヒトであることも企図される。
前出の単離抗体またはそれらの抗原結合性断片のうちのいずれも、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片でありうる。
定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
「LOX−1タンパク質」または「LOX−1抗原」または「LOX−1」または「Lox1」という用語は、互換的に使用され、異なる種におけるレクチン様酸化LDL受容体1(LOX−1)タンパク質を指す。例えば、ヒトLOX−1は、表1(配列番号1)に示される配列を有し、先行の報告および文献(Nature, Vol. 386, p. 73-77, 1997; Genomics, Vol. 54, No. 2, p. 191-199, 1998; Biochem. J., Vol. 339, Part 1, P. 177-184, 1999;Genbank受託番号:NP002534)において記載されている。ヒトLOX−1は、血管細胞によるoxLDLの取込み、および血管細胞内のoxLDLシグナル伝達を媒介する、クラスEのスカベンジャー受容体であり、それ自体、oxLDLの毒性効果のメディエーターでもある。LOX−1は、血管内皮細胞の表面上で発現し、血管内皮細胞での単球およびマクロファージの蓄積に関与している。
加えて、本発明の文脈では、「LOX−1」という用語は、天然のヒト酸化LDL受容体の突然変異体であって、上述の報告において記載されている、天然の一次構造(アミノ酸配列)のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する、突然変異体を含む。本明細書では、「実質的に同じアミノ酸配列を有する、天然のヒト酸化LDL受容体の突然変異体」という用語は、このような突然変異体のタンパク質を指す。
in vitroおよび/またはin vivoで形成された、複数形態の修飾LDLは、LOX−1に結合することが示されている。本明細書で使用される「修飾LDL」および「酸化LDL」(および「oxLDL」)という用語は、多様な化学的因子および物理的因子(例えば、熱)と組み合わされた、血管内皮細胞などの細胞により酸化される、低密度リポタンパク質について記載するのに互換的に使用される。LDLは、例えば、アテローム形成状態下の血管壁内で酸化して、oxLDLを形成する。「修飾LDL」という用語は、以下:酸化LDL、硫酸銅で酸化修飾されたLDL、アセチルLDL、塩素化LDL(例えば、化学的塩素化反応を介して修飾されたLDL)、ミエロペルオキシダーゼ修飾LDL、次亜塩素酸で修飾されたLDL、スクシニルLDL、およびマロンジアルデヒドで修飾されたLDL(すなわち、マロンジアルデヒドとの反応を介して修飾されたLDL;マロンジアルデヒドは、酸化ストレスの帰結として、in vivoにおいて産生される)を包含しうる。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、全抗体および任意の抗原結合性断片(すなわち、「抗原結合性部分」)またはそれらの単鎖体を意味する。全抗体は、ジスルフィド結合により相互接続される少なくとも2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書では、VHと略記する)および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、3つのドメインであるCH1、CH2、およびCH3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書では、VLと略記する)および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、1つのドメインであるCLを含む。VH領域およびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と称するより保存的な領域を散在させた、相補性決定領域(CDR)と称する超可変性の領域へとさらに細分することができる。各VHおよび各VLは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、以下の順序で配置される3つのCDRおよび4つのFR:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4からなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または免疫系の多様な細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第1の成分(Clq)を含む因子への結合を媒介しうる。
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合性部分」または「抗原結合性断片」という用語は、所与の抗原(例えば、ヒト酸化LDL受容体(LOX−1))に特異的に結合する能力を保持する、インタクトな抗体の1つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合性機能は、インタクトな抗体の断片により果たされうる。抗体の抗原結合性部分または抗原結合性断片という用語内に包含される結合性断片の例は、Fab断片、VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、およびCH1ドメインからなる一価断片;ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された2つのFab断片を含む二価断片であるF(ab)2断片;VHドメインおよびCH1ドメインからなるFd断片;抗体の単一のアームのVLドメインおよびVHドメインからなるFv断片;VHドメインまたはVLドメインからなる単一ドメイン抗体(dAb)断片(Wardら、1989 Nature 341:544〜546);ならびに単離相補性決定領域(CDR)を含む。
さらに、Fv断片の2つのドメインであるVLドメインおよびVHドメインは、個別の遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用して、それらを単一のタンパク質鎖として作製することを可能とする人工のペプチドリンカーにより付着することができ、この場合、VL領域およびVH領域は、対合して一価分子(単鎖Fv(scFv)として公知であり、例えば、Birdら、1988 Science 242:423〜426;およびHustonら、1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879〜5883を参照されたい)を形成する。このような単鎖抗体は、抗体の1つまたは複数の抗原結合性部分または抗原結合性断片を含む。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、断片も、インタクトな抗体と同じ形で有用性についてスクリーニングされる。
抗原結合性断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、v−NAR、およびbis−scFv(例えば、HollingerおよびHudson、2005、Nature Biotechnology、23、9、1126〜1136を参照されたい)へと組み込むこともできる。抗体の抗原結合性部分は、III型フィブロネクチン(Fn3)などのポリペプチド(フィブロネクチンポリペプチドモノボディについて記載する米国特許第6,703,199号を参照されたい)に基づく足場へとグラフトすることができる。
抗原結合性断片は、相補的な軽鎖ポリペプチドと併せて抗原結合性領域の対を形成する、タンデムFvセグメント(VH−CH1−VH−CH1)の対を含む単鎖分子へと組み込むことができる(Zapataら、1995 Protein Eng. 8(10):1057〜1062;および米国特許第5,641,870号)。
本明細書で使用される「アフィニティー」という用語は、単一の抗原性部位における抗体と抗原との間の相互作用の強度を指す。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変領域は、多数の部位において、弱い非共有結合的力を介して抗原と相互作用し、相互作用が大きいほど、アフィニティーは強くなる。抗体またはその抗原結合性断片(例えば、Fab断片)について本明細書で使用される「高アフィニティー」という用語は一般に、KDが10−9M以下の抗体または抗原結合性断片を指す。
「アミノ酸」という用語は、自然発生のアミノ酸および合成アミノ酸のほか、自然発生のアミノ酸と同様の形で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体も指す。自然発生のアミノ酸とは、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸のほか、後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびO−ホスホセリンでもある。アミノ酸類似体とは、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合したアルファ炭素を有する化合物を指す。このような類似体は、修飾R基(例えば、ノルロイシン)または修飾ペプチド骨格を有するが、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、自然発生のアミノ酸と同様の形で機能する化学化合物を指す。
本明細書で使用される「結合特異性」という用語は、1つの抗原決定基だけと反応する個別の抗原結合部位の能力を指す。
抗体(例えば、LOX−1結合性抗体)に「特異的に(または選択的に)結合する」という語句は、タンパク質および他の生体物質の異質な集団内のコグネイト抗原(例えば、ヒトLOX−1またはカニクイザルLOX−1)の存在を決定する結合反応を指す。本明細書では、「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句が、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。
「LOX−1に媒介された」という用語は、LOX−1受容体が、LOX−1リガンド、例えば、oxLDLが、LOX−1に細胞表面上で結合したときの細胞応答を媒介し、次いで、これにより、細胞がある種の炎症促進性分子の産生を増大させることを誘発するという事実を指す。「炎症促進性遺伝子」という用語は、炎症過程において役割を果たすサイトカイン、ケモカイン、または細胞接着分子などであるがこれらに限定されない任意の分子をコードする遺伝子を指す。例示的な「炎症促進性」遺伝子は、インターロイキン8(IL−8)、細胞間接着分子1(ICAM−1)、血管細胞接着分子1(VCAM−1)、および単球走化性タンパク質1(MCP−1)を含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「LOX−1関連障害」、「LOX−1関連状態」、「LOX−1レベルの上昇と関連する疾患または状態」、または類似の用語は、LOX−1タンパク質レベルが異常に高く、かつ/またはLOX−1タンパク質レベルの低減が求められる、任意の数の状態または疾患を指す。これらの状態は、心血管障害、内皮細胞機能不全、内皮細胞障害、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、高血圧症、高脂血症、高コレステロール血症、糖尿病、一酸化窒素欠乏、心筋梗塞、血管の酸化ストレス、心筋虚血症、虚血症−再灌流、敗血症、糖尿病性腎症、腎疾患、心筋症、心不全、末梢動脈疾患、冠動脈性心疾患、跛行(例えば、間欠性跛行、ラザフォード分類II/III跛行)、末梢動脈疾患(PAD)、狭心症(例えば、不応性狭心症)、冠動脈疾患(CAD)(例えば、心臓に血液を供給する動脈のアテローム性動脈硬化に起因する)、脳卒中、および異常な内皮依存性血管拡張を含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「内皮細胞機能不全」とは、内皮細胞がその正常な機能を維持できないことを意味する。内皮は、血管平滑筋の緊張および増殖、血管の透過性、炎症性応答、凝固、および血小板の接着の調節において極めて重要な役割を果たす。内皮細胞機能の非限定的な例は、バランスの良い血管の緊張を維持すること、血栓を阻害すること、炎症促進性過程を阻害すること、血管の完全性(例えば、血管系が漏出しないこと)を維持すること、ならびに内皮細胞内および平滑筋細胞内のいずれにおいても抗増殖状態を維持することを含む。脂質異常症、高血圧症、糖尿病、および喫煙など、アテローム性動脈硬化の素因となる一般的状態および危険因子は全て、アテローム性動脈硬化の発症、進行、および合併症を促進する内皮機能不全と関連する。内皮機能不全は一般に、内皮依存性血管拡張の機能障害と評価されている。これは、内皮依存性血管拡張が、他の重要な内皮機能についてのサロゲートマーカーであることを仮定する。この仮定の基礎は、内皮NOシンターゼ(eNOS)により、L−アルギニンから合成される、内皮由来の一酸化窒素により、内皮依存性血管拡張および他の内皮血管保護機能が媒介されるという観察である。拡充されつつある臨床データベースは、内皮機能不全(内皮依存性血管拡張の機能障害)が、心筋虚血症および心筋梗塞、急性冠動脈症候群、跛行、および重篤な下肢虚血症、一過性虚血性発作、ならびに脳卒中を含む、主要な心血管有害事象と密接に関連することを示唆する。
実験データの蓄積はまた、内皮および心内における、eNOS由来のNOアベイラビリティーの機能障害は、異常な左室リモデリングをもたらしうるだけでなく、心不全の発症および進行に寄与する左室機能不全ももたらしうることも示唆する。
本明細書で使用される「内皮細胞障害」とは、内皮細胞機能不全を特徴とする任意の障害である。内皮細胞機能不全を特徴とする疾患または障害の非限定的な例は、腫瘍増殖を支援するのに血管新生を必要とするがんなどの血管新生性障害、感染性疾患、自己免疫障害、血管奇形、ディジョージ症候群、HHT、海綿状血管腫、移植性動脈症、血液透析と関連する血管アクセス狭窄、血管炎(vasculitis)、血管炎(vasculitidis)、血管炎症性障害、アテローム性動脈硬化、肥満、乾癬、疣、アレルギー性皮膚炎、瘢痕ケロイド、膿原性肉芽腫、水疱形成性疾患、カポジ肉腫、硝子体過形成遺残症候群、未熟児網膜症、脈絡膜血管新生、黄斑変性、糖尿病性網膜症、眼内血管新生、原発性肺高血圧症、喘息、鼻腔内ポリープ、炎症性腸疾患および歯周病、腹水、腹膜癒着、避妊、子宮内膜症、子宮内出血、卵巣嚢胞、卵巣過剰刺激、関節炎、関節リウマチ、慢性関節リウマチ、滑膜炎、骨関節炎、骨髄炎、骨棘形成、敗血症、および血管漏出を含む。内皮細胞機能不全は、内皮接着分子の発現の増大または一酸化窒素シンターゼ(eNOS)の発現もしくは生物学的活性の減少の検出を含む、当技術分野で公知のアッセイを使用して決定することができる。
本明細書で使用される「跛行」とは、重度の跛行および他の類似の用語を含み、運動機能障害および満たされていない大きな医療上の必要について記載する。跛行とは、下肢末端の虚血症、筋肉疲労を引き起こすこと、休息により緩和される、労作時における疼痛、運動の制限、および生活の質の低下を特徴とする状態であり、アテローム性動脈硬化および内皮依存性血管拡張の異常(例えば、内皮依存性血管拡張の機能障害)により引き起こされる。米国内のその有病数は、患者800〜1200万人である。間欠性跛行を伴う患者のうち、7%は、下肢末端のバイパス手術を受け、4%は、大規模な切断術を必要とし、16%は、跛行の悪化を発症する。5年間を超える重度の跛行罹患者のうちの20%では、心筋梗塞および脳卒中などの心血管事象が生じる。現行の治療は、手術による治療であり、本発明の抗LOX−1抗体の投与など、侵襲性の小さな手段を介する処置であれば、極めて大きな治療的飛躍を表すであろう。
本明細書で使用される「不応性狭心症」とは、冠動脈の閉塞または痙攣(例えば、冠動脈疾患に由来する)に一般に起因し、消耗性の症状、身体活動の大きな制限、および生活の質の低下を伴う、心筋の虚血に起因する胸痛を顕徴とする状態である。患者100〜180万人の、米国内の不応性狭心症罹患者は、心血管による死亡率の、毎年10%の増大率での増大を経ており、少なくとも100,000例の新たな不応性狭心症の症例が毎年生じている。
「キメラ抗体」という用語は、(a)抗原結合性部位(可変領域)を、クラス、エフェクター機能、および/もしくは種が異なるか、またはクラス、エフェクター機能、および/もしくは種を改変された定常領域、あるいはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などへと連結するように、定常領域またはその一部を、改変するか、置きかえるか、または交換した抗体分子;あるいは(b)可変領域またはその一部を、抗原特異性が異なるか、または抗原特異性を改変された可変領域により改変するか、置きかえるか、またはこれと交換した抗体分子を指す。例えば、マウス抗体は、その定常領域を、ヒト免疫グロブリンに由来する定常領域で置きかえることにより修飾することができる。ヒト定常領域による置きかえに起因して、キメラ抗体は、ヒトにおける抗原性を、元のマウス抗体と比較して低減しながら、抗原の認識におけるその特異性を保持しうる。
「保存的に修飾された変異体」という用語は、アミノ酸配列および核酸配列のいずれにも適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一なアミノ酸配列もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一な配列を指す。遺伝子コードの縮重性のために、多数の機能的に同一な核酸が、所与の任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンであるGCA、GCC、GCG、およびGCUのいずれも、アミノ酸であるアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを改変せずに、コドンを、記載された対応するコドンのうちのいずれかへと改変することができる。このような核酸変異は、保存的に修飾された変異のうちの1種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書のあらゆる核酸配列はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変異についても記載する。当業者は、核酸内の各コドン(通常メチオニンだけのコドンであるAUG、および通常トリプトファンだけのコドンであるTGGを除く)を修飾して、機能的に同一な分子をもたらしうることを認識するであろう。したがって、記載される各配列内では、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が含意されている。
ポリペプチド配列では、「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸の、化学的に類似するアミノ酸による置換を結果としてもたらす、ポリペプチド配列への個別の置換、欠失、または付加を含む。当技術分野では、機能的に類似するアミノ酸を提示する保存的置換表が周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に追加されるものであり、これらを除外するものではない。以下の8つの群:1)アラニン(A)、グリシン(G);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リシン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);7)セリン(S)、トレオニン(T);および8)システイン(C)、メチオニン(M)は、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含有する(例えば、Creighton、Proteins(1984)を参照されたい)。いくつかの実施形態では、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴にそれほど大きな影響を及ぼしたりこれを改変したりしないアミノ酸修飾を指すのに使用する。
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的な結合が可能なタンパク質決定基を意味する。エピトープは通例、アミノ酸または糖側鎖など、化学的に活性な表面分子群からなり、通例、特異的な三次元構造特徴のほか、特異的な電荷特徴も有する。コンフォメーショナルエピトープと非コンフォメーショナルエピトープとは、前者への結合は、変性溶媒の存在下で失われるが、後者への結合は失われないという点で区別される。
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域およびCDR領域のいずれもが、ヒト由来の配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまた、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系列配列またはヒト生殖細胞系列配列の突然変異させたバージョンに由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基(例えば、in vitroにおけるランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発により導入された突然変異、またはin vivoにおける体細胞突然変異により導入された突然変異)を含みうる。
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、単一の結合特異性を提示する抗体であって、フレームワーク領域およびCDR領域のいずれもが、ヒト配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製する。
「ヒト化」抗体とは、ヒトにおける免疫原性は小さいが、非ヒト抗体の反応性を保持する抗体である。これは、例えば、非ヒトCDR領域を保持し、抗体の残りの部分を、それらのヒト対応物(すなわち、可変領域の定常領域ならびにフレームワーク部分)で置きかえることにより達成することができる。例えば、Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81:6851〜6855、1984; MorrisonおよびOi、Adv. Immunol.、44:65〜92、1988; Verhoeyenら、Science、239:1534〜1536、1988; Padlan、Molec. Immun.、28:489〜498、1991;およびPadlan、Molec. Immun.、31:169〜217、1994を参照されたい。ヒト操作技術の他の例は、US5,766,886において開示されているXoma技術を含むがこれらに限定されない。
2つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「同一な」または「同一性」パーセントという用語は、2つ以上の配列または部分配列が同じであることを指す。以下の配列比較アルゴリズムのうちの1つを使用して、または手作業のアライメントおよび目視により測定される比較域または指定領域にわたり、最大の対応性について比較され、配列決定された場合の、2つの配列の、指定された百分率のアミノ酸残基またはヌクレオチドが同じであれば(すなわち、指定される領域にわたる、または、指定されない場合は、配列全体にわたる、60%の同一性、任意選択で、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%の同一性を有すれば)、2つの配列は「実質的に同一」である。任意選択で、同一性は、少なくとも約50ヌクレオチド(または10アミノ酸)の長さの領域にわたり、またはより好ましくは、100〜500、または1000ヌクレオチド以上(または20、50、または200アミノ酸以上)の長さの領域にわたり存在する。
配列比較では、1つの配列が、それに照らして被験配列を比較する基準配列として働くことが典型的である。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列および基準配列をコンピュータへと入力し、必要な場合は、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することもでき、代替的なパラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータに基づき、被験配列について、基準配列と比べた配列同一性パーセントを計算する。
本明細書で使用される「比較域」は、2つの配列を最適に配列決定した後で、配列を、同じ数の連続的な位置による基準配列と比較しうる、20〜600、通例約50〜約200、より通例では、約100〜約150からなる群から選択される連続的な位置の数のうちのいずれか1つによるセグメントに対する言及を含む。当技術分野では、比較のための配列アライメント法が周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、SmithおよびWaterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cによる局所相同性アルゴリズムにより行うこともでき、NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48:443、1970による相同性アライメントアルゴリズムにより行うこともでき、PearsonおよびLipman、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444、1988による類似性検索法により行うこともでき、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実装(Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)により行うこともでき、手作業のアライメントおよび目視(例えば、Brentら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.(Ringbou編、2003)を参照されたい)により行うこともできる。
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適するアルゴリズムの2つの例は、それぞれ、Altschulら、Nuc. Acids Res. 25:3389〜3402、1977;およびAltschulら、J. Mol. Biol. 215:403〜410、1990において記載されている、BLASTアルゴリズムおよびBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationにより公表されている。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードで配列決定したときに、ある正の値の閾値スコアTにマッチするかまたはこれを満たす、クエリー配列内の短いワード長Wを同定することにより、高スコア配列対(HSP)をまず同定することを伴う。Tを、隣接ワードスコア閾値(Altschulら、前出)と称する。これらの初期の隣接ワードヒットが、これらを含有するより長いHSPを見出す検索を開始するためのシードとして働く。累積アライメントスコアが増大しうる限りにおいて、ワードヒットを、各配列に沿っていずれの方向にも拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列では、パラメータM(マッチする残基の対についてのリウォードスコア;常に>0)およびN(ミスマッチ残基についてのペナルティースコア;常に<0)を使用して計算する。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。累積アライメントスコアが、達成されたその最大値から量Xだけ低下した場合;1つまたは複数の負スコア残基のアライメントの累積のために、累積スコアが、ゼロ以下に低下した場合;または配列のいずれかの末端に達した場合は、各方向へのワードヒットの拡張を停止させる。BLASTアルゴリズムパラメータであるW、T、およびXにより、アライメントの感度および速度が決定される。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列の場合)では、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=−4をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。アミノ酸配列のためのBLASTPプログラムでは、3のワード長、および10の期待値(E)、および50のBLOSUM62スコアリングマトリックス(HenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915、1989を参照されたい)アライメント(B)、10の期待値(E)、M=5、N=−4をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。
BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列の間の類似性についての統計学的解析(例えば、KarlinおよびAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873〜5787、1993を参照されたい)も実施する。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の1つの尺度は、2つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のマッチングが偶然に生じる確率の指標をもたらす最小合計確率(P(N))である。例えば、被験核酸を基準核酸に照らして比較したときの最小合計確率が約0.2未満であり、より好ましくは、約0.01未満であり、最も好ましくは、約0.001未満であれば、核酸は基準配列と類似すると考えられる。
2つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントはまた、PAM120重みづけ残基表、12のギャップ長ペナルティー、および4のギャップペナルティーを使用するALIGNプログラム(バージョン2.0)へと組み込まれた、E. MeyersおよびW. Miller(Comput. Appl. Biosci.、4:11〜17、1988)によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。加えて、2つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックス、および16、14、12、10、8、6、または4のギャップ重みづけ、および1、2、3、4、5、または6の長さ重みづけを使用する、GCGソフトウェアパッケージ(インターネット上のgcg.comで入手可能である)内のGAPプログラムへと組み込まれた、NeedlemanおよびWunsch(J. Mol, Biol. 48:444〜453、1970)によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。
上記で言及した配列同一性百分率以外の、2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、第1の核酸によりコードされるポリペプチドが、第2の核酸によりコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば、2つのペプチドが保存的置換だけによって異なる場合、ポリペプチドは、第2のポリペプチドと実質的に同一なことが典型的である。2つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、2つの分子またはそれらの相補体が、厳密な条件下で、互いとハイブリダイズすることである。2つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅しうることである。
「単離抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す(例えば、LOX−1に特異的に結合する単離抗体は、LOX−1以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかし、LOX−1に特異的に結合する単離抗体は、他の抗原に対する交差反応性を有しうる。さらに、単離抗体は、他の細胞内物質および/または化学物質を実質的に含まない場合もある。
「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によりもたらされる抗体クラス(例えば、IgM、IgE、IgG1またはIgG4などのIgG)を指す。アイソタイプはまた、これらのクラスのうちの1つの修飾バージョンも含み、その修飾は、Fc機能を改変する、例えば、エフェクター機能またはFc受容体への結合を増強または低減するように施されている。
本明細書で使用される「Kassoc」または「Ka」という用語が、特定の抗体−抗原間相互作用の会合速度を指すことを意図するのに対し、本明細書で使用される「Kdis」または「Kd」という用語は、特定の抗体−抗原間相互作用の解離速度を指すことを意図する。本明細書で使用される「KD」という用語は、KdのKaに対する比(すなわち、Kd/Ka)から得られる解離定数を指すことを意図し、モル濃度(M)として表す。抗体のKD値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のKDを決定するための方法は、Biacore(登録商標)システムなどのバイオセンサーシステムを使用して表面プラズモン共鳴を測定するか、または溶液平衡滴定(SET)により溶液中のアフィニティーを測定するステップを含む。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成による抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性およびアフィニティーを提示する。
本明細書では、「核酸」という用語が、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖形態または二本鎖形態におけるポリマーを指す。「核酸」という用語は、公知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは修飾連結を含有する核酸であって、合成の核酸、自然発生の核酸、および非自然発生の核酸であり、基準核酸と同様の結合特性を有し、基準ヌクレオチドと同様の形で代謝される核酸を包含する。このような類似体の例は、限定なしに述べると、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2−O−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)を含む。
別段に指し示されない限りにおいて、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその変異体(例えば、縮重コドン置換)および相補的配列も暗示的に包含するほか、明示的に指し示される配列も包含する。とりわけ、下記で詳述される通り、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された(または全ての)コドンの第3の位置が、混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作り出すことにより達成することができる(Batzerら、Nucleic Acid Res. 19:5081、1991; Ohtsukaら、J. Biol. Chem. 260:2605〜2608、1985;およびRossoliniら、Mol. Cell. Probes 8:91〜98、1994)。
「作動可能に連結された」という用語は、2つ以上のポリヌクレオチド(例えば、DNA)セグメントの間の機能的関係を指す。「作動可能に連結された」という用語は、転写調節配列の、転写される配列に対する機能的関係を指すことが典型的である。例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列は、それが、適切な宿主細胞内または他の発現系内のコード配列の転写を刺激またはモジュレートするとき、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写される配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写される配列と物理的に隣接する、すなわち、シス作用型である。しかし、エンハンサーなど、一部の転写調節配列は、その転写をそれらが増強するコード配列に物理的に隣接する必要も、近接して配置される必要もない。
本明細書で使用される「最適化された」という用語は、ヌクレオチド配列を、産生細胞または産生生物、一般に、真核細胞、例えば、ピキア(Pichia)属細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように改変していることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としてもまた公知の出発ヌクレオチド配列により本来コードされるアミノ酸配列を、完全に、または可能な限り多く保持するように操作する。本明細書の最適化された配列は、哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように操作されている。しかし、本明細書ではまた、他の真核細胞または原核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現も企図される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列もまた、最適化されていると称する。
本明細書では、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語が、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用される。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する自然発生のアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーのほか、自然発生のアミノ酸ポリマーおよび非自然発生のアミノ酸ポリマーにも適用される。別段に指し示されない限りにおいて、特定のポリペプチド配列はまた、保存的に修飾されたその変異体も暗示的に包含する。
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物(例えば、マウス)またはこれにより調製されるハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現させるように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部の、他のDNA配列へのスプライシングを伴う、他の任意の手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される抗体など、組換え手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される、全てのヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびCDR領域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、ある種の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、in vitroの突然変異誘発(または、ヒトIg配列についてトランスジェニックである動物を使用する場合は、in vivoの体細胞突然変異誘発)にかけることができ、したがって、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のVH配列およびVL配列に由来し、これらに関連するが、in vivoのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内で天然には存在しない可能性がある配列である。
「組換え宿主細胞」(または、簡単に、「宿主細胞」)という用語は、組換え発現ベクターを導入した細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞だけを指すことを意図するものではなく、このような細胞の子孫細胞も指すことを意図するものであることを理解されたい。後続する世代では、突然変異または環境的影響に起因して、ある種の修飾が生じうるため、このような子孫細胞は、実のところ、親細胞と同一ではない可能性もあるが、やはり本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、非ヒト霊長動物(例えば、カニクイザル)、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類など、全ての脊椎動物(例えば、哺乳動物および非哺乳動物)を含む。特記される場合を除き、本明細書では、「患者」または「対象」という用語が互換的に使用される。本明細書で使用される「カニクイザル(cyno)」または「カニクイザル(cynomolgus)」という用語は、カニクイザル(cynomolgus monkey)(カニクイザル(Macaca fascicularis))を指す。
一実施形態では、本明細書で使用される、任意の疾患または障害(例えば、LOX−1関連障害)「〜を処置すること」またはこれらの「処置」という用語は、疾患または障害を改善すること(すなわち、疾患またはその臨床症状のうちの少なくとも1つの発症を緩徐化するか、停止させるか、または軽減すること)を指す。別の実施形態では、「〜を処置すること」または「処置」とは、患者により識別可能でない可能性があるパラメータを含む少なくとも1つの物理的パラメータを緩和または改善することを指す。さらに別の実施形態では、「〜を処置すること」または「処置」とは、疾患または障害を、物理的にモジュレートする(例えば、識別可能な症状の安定化)か、生理学的にモジュレートする(例えば、物理的パラメータの安定化)か、または物理的かつ生理学的にモジュレートすることを指す。さらに別の実施形態では、「〜を処置すること」または「処置」とは、疾患または障害の発生または発症または進行を防止するかまたは遅延させることを指す。
例えばLOX−1関連障害を含む、本明細書で記載される適応に関する場合の「防止」とは、例えば、前記悪化の危険性がある患者における、下記で記載される、LOX−1関連疾患パラメータの悪化を防止または緩徐化する任意の作用を意味する。
「ベクター」という用語は、それが連結された別のポリヌクレオチドを輸送することが可能なポリヌクレオチド分子を指すことを意図する。ベクターのうちの1つの種類は、さらなるDNAセグメントをライゲーションしうる、環状の二本鎖DNAループを指す「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、さらなるDNAセグメントを、ウイルスゲノムへとライゲーションしうる、アデノ随伴ウイルスベクター(AAVまたはAAV2)などのウイルスベクターである。ある種のベクター(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよび哺乳動物のエピソームベクター)は、それらが導入された宿主細胞における自己複製が可能である。他のベクター(例えば、非哺乳動物のエピソームベクター)は、宿主細胞へと導入すると、宿主細胞のゲノムへと組み込むことができ、これにより、宿主ゲノムと共に複製する。さらに、ある種のベクターは、それらが作動的に連結された遺伝子の発現を方向付けることが可能である。本明細書では、このようなベクターを、「組換え発現ベクター」(または簡単に、「発現ベクター」)と称する。一般に、組換えDNA法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」とを互換的に使用することができる。しかし、本発明は、同等な機能をもたらすウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)など、発現ベクターの他の形態も含むことを意図する。
(詳細な説明)
本発明は部分的に、LOX−1に特異的に結合し、その生物学的活性を阻害する抗体分子の発見に基づく。本発明は、完全IgGフォーマットの抗体、ならびにFab断片(例えば、抗体のMOR21435、MOR20159、MOR22031、MOR22034、MOR21433、MOR21452、MOR21453、MOR21460、MOR21468、MOR20052、MOR20133、MOR20144、MOR20148、MOR20151、MOR20152、MOR022025、MOR22028、MOR22029、およびMOR22030)など、それらの抗原結合性断片の両方に関する。
本発明は部分的に、LOX−1に特異的に結合し、その生物学的活性を阻害する抗体分子の発見に基づく。本発明は、完全IgGフォーマットの抗体、ならびにFab断片(例えば、抗体のMOR21435、MOR20159、MOR22031、MOR22034、MOR21433、MOR21452、MOR21453、MOR21460、MOR21468、MOR20052、MOR20133、MOR20144、MOR20148、MOR20151、MOR20152、MOR022025、MOR22028、MOR22029、およびMOR22030)など、それらの抗原結合性断片の両方に関する。
したがって、本発明は、LOX−1(例えば、ヒトLOX−1、およびカニクイザルLOX−1)に特異的に結合する抗体、医薬組成物、このような抗体および組成物の作製法および使用法を提供する。
LOX−1タンパク質
本発明は、LOX−1に特異的に結合し、その酸化促進活性および炎症促進活性を含む、その生物学的活性を阻害する抗体を提供する。酸化修飾されたLDL(oxLDL)の受容体であるLOX−1は、血管細胞(内皮細胞および平滑筋細胞)、好中球、単球およびマクロファージ、および血小板の表面上で発現する。さらに、LOX−1は、ヒトおよび動物のアテローム性動脈硬化性病変を含む血管疾患において上方調節される(Kataoka H, et al., Circulation 99; 3110-3117)。LOX−1はまた、全身性炎症性疾患/全身性自己免疫疾患(例えば、関節リウマチ、ブドウ膜炎、加齢黄斑変性、および子癇前症)においても上方調節される。OxLDLは、血管疾患の発症機序に関与している。oxLDLに加えて、LOX−1は、アセチル化LDL、終末糖化産物(AGE)、熱ショックタンパク質70、(HSP70)、アポトーシス性細胞、老化赤血球、白血球、活性化血小板、細菌、ホスファチジルセリン、およびC反応性タンパク質(CRP)を含む他のリガンドにも結合する。
本発明は、LOX−1に特異的に結合し、その酸化促進活性および炎症促進活性を含む、その生物学的活性を阻害する抗体を提供する。酸化修飾されたLDL(oxLDL)の受容体であるLOX−1は、血管細胞(内皮細胞および平滑筋細胞)、好中球、単球およびマクロファージ、および血小板の表面上で発現する。さらに、LOX−1は、ヒトおよび動物のアテローム性動脈硬化性病変を含む血管疾患において上方調節される(Kataoka H, et al., Circulation 99; 3110-3117)。LOX−1はまた、全身性炎症性疾患/全身性自己免疫疾患(例えば、関節リウマチ、ブドウ膜炎、加齢黄斑変性、および子癇前症)においても上方調節される。OxLDLは、血管疾患の発症機序に関与している。oxLDLに加えて、LOX−1は、アセチル化LDL、終末糖化産物(AGE)、熱ショックタンパク質70、(HSP70)、アポトーシス性細胞、老化赤血球、白血球、活性化血小板、細菌、ホスファチジルセリン、およびC反応性タンパク質(CRP)を含む他のリガンドにも結合する。
LOX−1は、C型レクチンファミリーに属するII型膜タンパク質である。LOX−1はまた、クラスEのスカベンジャー受容体としても分類される。LOX−1は、4つのドメイン:短いN末端細胞質ドメイン、膜貫通領域、コネクティングネック、およびC末端におけるレクチン様ドメインからなる。C末端レクチン様ドメイン(CTLD;また、oxLDL結合性ドメインとも称する)は、リガンド結合性ドメイン(Sawamura T, et al., Nature 386; 73-77; Shi X, et al., J Cell Sci. 114; 1273-1282)である。ヒトLOX−1は、表1(配列番号1)に示される配列を有し、先行の報告および文献(Nature, Vol. 386, p. 73-77, 1997; Genomics, Vol. 54, No. 2, p. 191-199, 1998; Biochem. J., Vol. 339, Part 1, P. 177-184, 1999;Genbank受託番号:NP002534)において記載されている。
oxLDL/LOX−1経路は、酸化ストレス、血管炎症、アテローム性動脈硬化、ならびに組織血流および酸素送達の機能障害に寄与する。LOX−1リガンド(例えば、oxLDL)の結合による、LOX−1の活性化は、NADPHオキシダーゼの活性化に起因する、活性酸素種の発生、ならびに炎症を結果としてもたらす、後続のNFkB経路およびMAPキナーゼ経路の活性化を結果としてもたらす。LOX−1により誘導される活性酸素種により、さらなるoxLDLの形成が結果としてもたらされ、LOX−1の発現が上方調節されるという点で、oxLDL/LOX−1シグナル伝達経路は、ポジティブフィードバックループとして作用する。また、oxLDLの、マクロファージの表面上で発現するLOX−1への結合も、泡沫細胞の形成およびアテローム性動脈硬化に寄与する、oxLDLの取込みを結果としてもたらす。重要なことは、血管炎症が、心筋梗塞および虚血性脳卒中を含む、アテローム性動脈硬化の急性血栓性合併症の病理生物学にとって極めて重要であると考えられることである。LOX−1の活性化はまた、NADPHオキシダーゼを伴う機構により血管拡張の機能を障害することにより、血管運動機能を変化させることも示されている。血管拡張の機能障害は、慢性冠動脈疾患および狭心症を伴う患者、ならびに末梢動脈疾患および跛行を伴う患者において生じることが示されている。
LOX−1ノックアウトマウスおよびLOX−1アンタゴニスト抗体を用いた研究により、LOX−1の阻害は、有益な心血管効果を及ぼしうることが示されている。例えば、LOX−1をノックアウトすることにより、oxLDLに媒介される、血管弛緩の機能障害が防止され、アテローム性動脈硬化が低減される(Mehta et al, Circulation Research 2007, 100: 16344)。加えて、抗LOX−1抗体は、(i)ヒト内皮細胞内の、oxLDLにより誘導される酸化ストレスを遮断し(Ou et al., J Appl Phys 2010, 108: 1745)、(ii)スーパーオキシドの産生を阻害し、eNOSの発現を回復させる結果として、NOのバイオアベイラビリティーの改善および血管拡張をもたらすことが示されている(Xu et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2007, 27: 871-877)。
本発明者らは、例えば、本発明の抗LOX−1抗体の投与を介して、LOX−1を阻害することにより、虚血性組織への血流および酸素送達を改善する結果として、治療的利益を、狭心症、跛行、および重篤な下肢虚血症を含む慢性血管疾患を伴う患者へともたらすことを提起する。また、例えば、本発明の抗LOX−1抗体の投与を介して、LOX−1を阻害することにより、アテローム性動脈硬化の進行を緩徐化または逆転し、その急性血栓性合併症(例えば、急性冠動脈症候群、不安定狭心症、心筋梗塞、および虚血性脳卒中)の発症率を低減することもできる。
LOX−1抗体および抗原結合性断片
本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ヒト、およびカニクイザルLOX−1にも特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、実施例で記載される通りに単離されたヒトモノクローナル抗体およびFabを含むがこれらに限定されない。
本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ヒト、およびカニクイザルLOX−1にも特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、実施例で記載される通りに単離されたヒトモノクローナル抗体およびFabを含むがこれらに限定されない。
本発明は、LOX−1タンパク質(例えば、ヒト、およびカニクイザルLOX−1)に特異的に結合する抗体であって、配列番号9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、および369のアミノ酸配列を有するVHドメインを含む抗体を提供する。本発明はまた、LOX−1タンパク質に特異的に結合する抗体であって、以下の表1に列挙されるVH CDRのうちのいずれか1つのアミノ酸配列を有するVH CDRを含む抗体も提供する。特に、本発明は、LOX−1タンパク質(例えば、ヒト、およびカニクイザルLOX−1)に特異的に結合する抗体であって、以下の表1に列挙されるVH CDRのうちのいずれかのアミノ酸配列を有する、1つ、2つ、3つ以上のVH CDRを含む(または、代替的に、これらからなる)抗体を提供する。
本発明は、LOX−1タンパク質に特異的に結合する抗体であって、配列番号19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239、259、279、299、319、339、359、および379のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体を提供する。本発明はまた、LOX−1タンパク質(例えば、ヒト、およびカニクイザルLOX−1)に特異的に結合する抗体であって、以下の表1に列挙されるVL CDRのうちのいずれか1つのアミノ酸配列を有するVL CDRを含む抗体も提供する。特に、本発明は、LOX−1タンパク質(例えば、ヒト、およびカニクイザルLOX−1)に特異的に結合する抗体であって、以下の表1に列挙されるVL CDRのうちのいずれかのアミノ酸配列を有する、1つ、2つ、3つ以上のVL CDRを含む(または、代替的に、これらからなる)抗体を提供する。
本発明の他の抗体は、突然変異させているが、なお、CDR領域内で、表1に記載されている配列内で描示されるCDR領域と、少なくとも60、70、80、85、90、または95パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明の他の抗体は、CDR領域内で、表1に記載されている配列内で描示されるCDR領域と比較して、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ以下のアミノ酸を突然変異させた、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、LOX−1タンパク質(例えば、ヒト、およびカニクイザルLOX−1)に特異的に結合する抗体のVH、VL、全長重鎖、および全長軽鎖をコードする核酸配列も提供する。このような核酸配列は、哺乳動物細胞における発現について最適化することができる(例えば、表1は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖に最適化された核酸配列を示す)。
本発明の他の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸を突然変異させているが、表1に記載されている配列となお少なくとも60、65、70、75、80、85、90、または95パーセントの同一性を有する抗体を含む。いくつかの実施形態は、可変領域内で、実質的に同じ抗原結合活性を保持しながら、表1に記載されている配列内で描示された可変領域と比較した場合に、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ以下のアミノ酸を突然変異させている、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
これらの抗体の各々は、LOX−1に結合しうるので、VH配列、VL配列、全長軽鎖配列、および全長重鎖配列(アミノ酸配列と、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と)を「混合し、マッチさせて」、本発明の他のLOX−1結合性抗体を創出することができる。このような「混合し、マッチさせた」LOX−1結合性抗体は、当技術分野で公知の結合アッセイ(例えば、ELISAおよび実施例節で記載される他のアッセイ)を使用して調べることができる。これらの鎖を混合し、マッチさせる場合、特定のVH/VL対合に由来するVH配列を、構造的に類似するVH配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全長重鎖/全長軽鎖対合に由来する全長重鎖配列を、構造的に類似する全長重鎖配列で置きかえるものとする。同様に、特定のVH/VL対合に由来するVL配列を、構造的に類似するVL配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全長重鎖/全長軽鎖対合に由来する全長軽鎖配列を、構造的に類似する全長軽鎖配列で置きかえるものとする。
したがって、一態様では、本発明は、配列番号9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、および369からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号24、44、64、84、および104からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する単離抗体またはその抗原結合性領域を提供し、この場合、抗体は、LOX−1(例えば、ヒト、およびカニクイザルLOX−1)に特異的に結合する。
より具体的に、ある種の態様では、本発明は、配列番号14および24;34および44;54および64;74および84;または94および104、のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを有する、単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。
別の態様では、本発明は、(i)哺乳動物細胞における発現について最適化されたアミノ酸配列であって、配列番号11、31、51、71、91、111、131、151、171、191、211、231、251、271、291、311、331、351、または371からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長重鎖、ならびに哺乳動物細胞における発現について最適化されたアミノ酸配列であって、配列番号21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221、241、261、281、301、321、341、361、または381からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長軽鎖を有する単離抗体、または(ii)その抗原結合性部分を含む機能的タンパク質を提供する。より具体的に、ある種の態様では、本発明は、配列番号14および24;34および44;54および64;74および84;または94および104、のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。
本明細書で使用される「相補性決定領域」および「CDR」という用語は、抗原特異性および抗原結合アフィニティーを付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一般に、各重鎖可変領域(HCDR1、HCDR2、HCDR3)内には、3つのCDRがあり、各軽鎖可変領域(LCDR1、LCDR2、LCDR3)内には、3つのCDRがある。
所与のCDRの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabatら(1991)、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD(「Kabat」番号付けスキーム)、Al-Lazikaniら、(1997)JMB 273、927〜948(「Chothia」番号付けスキーム)により記載されているスキームを含む、周知の多数のスキームのうちのいずれかを使用して、たやすく決定することができる。
例えば、Kabatによれば、重鎖可変ドメイン(VH)内の抗体であるMOR21435のCDRアミノ酸残基は、31〜35(HCDR1)、50〜66(HCDR2)、および99〜110(HCDR3)と番号付けされており、軽鎖可変ドメイン(VL)内のCDRアミノ酸残基は、24〜34(LCDR1)、50〜56(LCDR2)、および89〜97(LCDR3)と番号付けされている。Chothiaによれば、VH内のCDRアミノ酸は、26〜30(HCDR1)、52〜57(HCDR2)、および99〜110(HCDR3)と番号付けされており、VL内のアミノ酸残基は、26〜32(LCDR1)、50〜52(LCDR2)、および91〜96(LCDR3)と番号付けされている。KabatおよびChothia両方のCDR定義を組み合わせることにより、CDRは、ヒトVH内のアミノ酸残基26〜35(HCDR1)、50〜66(HCDR2)、および99〜110(HCDR3)、ならびにヒトVL内のアミノ酸残基24〜34(LCDR1)、50〜56(LCDR2)、および89〜97(LCDR3)からなる。
別の態様では、本発明は、表1に記載されている重鎖および軽鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3、またはこれらの組合せを含むLOX−1結合性抗体を提供する。抗体のVH CDR1のアミノ酸配列は、配列番号3、23、43、63、83、103、123、143、163、183、203、223、243、263、283、303、323、343、および363に示されている。抗体のVH CDR2のアミノ酸配列は、配列番号4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264、284、304、324、344、および364に示されている。抗体のVH CDR3のアミノ酸配列は、配列番号5、25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225、245、265、285、305、325、345、および365に示されている。抗体のVL CDR1のアミノ酸配列は、配列番号13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233、253、273、293、313、333、353、および373に示されている。抗体のVL CDR2のアミノ酸配列は、配列番号14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254、274、294、314、334、354、および374に示されている。抗体のVL CDR3のアミノ酸配列は、配列番号15、35、55、75、95、115、135、155、175、195、215、235、255、275、295、315、335、355、および375に示されている。これらのCDR領域は、Kabatシステムを使用して表される。
代替的に、Chothiaシステム(Al-Lazikaniら、(1997)、JMB 273 927〜948)を使用して規定される通り、抗体のVH CDR1のアミノ酸配列は、配列番号6、26、46、66、86、106、126、146、166、186、206、226、246、266、286、306、326、346、および366に示されている。抗体のVH CDR2のアミノ酸配列は、配列番号7、27、47、67、87、107、127、147、167、187、207、227、247、267、287、307、327、347、および367に示されている。抗体のVH CDR3のアミノ酸配列は、配列番号8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268、288、308、328、348、および368に示されている。抗体のVL CDR1のアミノ酸配列は、配列番号16、36、56、76、96、116、136、156、176、196、216、236、256、276、296、316、336、356、および376に示されている。抗体のVL CDR2のアミノ酸配列は、配列番号17、37、57、77、97、117、137、157、177、197、217、237、257、277、297、317、337、357、および377に示されている。抗体のVL CDR3のアミノ酸配列は、配列番号18、38、58、78、98、118、138、158、178、198、218、238、258、278、298、318、338、358、および378に示されている。
これらの抗体の各々は、LOX−1に結合することが可能であり、抗原結合特異性は主に、CDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域によりもたらされることを踏まえれば、各抗体は、本発明の他のLOX−1結合性分子を創出するのに、VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3、ならびにVL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含有することが好ましいが、VH CDR1配列、VH CDR2配列、およびVH CDR3配列、ならびにVL CDR1配列、VL CDR2配列、およびVL CDR3配列を、「混合し、マッチさせる」ことができる(すなわち、異なる抗体に由来するCDRを、混合し、マッチさせることができる)。このような「混合し、マッチさせた」LOX−1結合性抗体は、当技術分野で公知の結合アッセイおよび実施例で記載される結合アッセイ(例えば、ELISA、SET、Biacore)を使用して調べることができる。VH CDR配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のVH配列に由来するCDR1配列、CDR2配列、および/またはCDR3配列を、構造的に類似するCDR配列で置きかえるものとする。同様に、VL CDR配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のVL配列に由来するCDR1配列、CDR2配列、および/またはCDR3配列を、構造的に類似するCDR配列で置きかえるものとする。当業者には、新規のVH配列およびVL配列を、1つまたは複数のVH CDR領域配列および/またはVL CDR領域配列を、本発明のモノクローナル抗体のための、本明細書で示されるCDR配列に由来する、構造的に類似する配列で置換することにより創出しうることがたやすく明らかであろう。前出に加えて、一実施形態では、本明細書で記載される抗体の抗原結合性断片は、VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3、またはVL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含むことが可能であり、この場合、断片は、LOX−1に、単一の可変ドメインとして結合する。
本発明のある種の実施形態では、抗体またはそれらの抗原結合性断片は、表1に記載されているFabの重鎖および軽鎖配列を有しうる。より具体的には、抗体またはその抗原結合性断片は、MOR21435、MOR20159、MOR22031、MOR22034、MOR21433、MOR21452、MOR21453、MOR21460、MOR21468、MOR20052、MOR20133、MOR20144、MOR20148、MOR20151、MOR20152、MOR022025、MOR22028、MOR22029、およびMOR22030の重鎖および軽鎖配列を有しうる。
本発明の他の実施形態では、LOX−1に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、Kabatにより規定され、表1に記載されている、重鎖可変領域のCDR1、重鎖可変領域のCDR2、重鎖可変領域のCDR3、軽鎖可変領域のCDR1、軽鎖可変領域のCDR2、および軽鎖可変領域のCDR3を含む。本発明のさらに他の実施形態では、LOX−1に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、Chothiaにより規定され、表1に記載されている、重鎖可変領域のCDR1、重鎖可変領域のCDR2、重鎖可変領域のCDR3、軽鎖可変領域のCDR1、軽鎖可変領域のCDR2、および軽鎖可変領域のCDR3を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号3の重鎖可変領域のCDR1、配列番号4の重鎖可変領域のCDR2、配列番号5の重鎖可変領域のCDR3、配列番号13の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号14の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号15の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号23の重鎖可変領域のCDR1、配列番号24の重鎖可変領域のCDR2、配列番号25の重鎖可変領域のCDR3、配列番号33の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号34の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号35の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号43の重鎖可変領域のCDR1、配列番号44の重鎖可変領域のCDR2、配列番号45の重鎖可変領域のCDR3、配列番号53の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号54の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号55の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号63の重鎖可変領域のCDR1、配列番号64の重鎖可変領域のCDR2、配列番号65の重鎖可変領域のCDR3、配列番号73の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号74の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号75の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号83の重鎖可変領域のCDR1、配列番号84の重鎖可変領域のCDR2、配列番号85の重鎖可変領域のCDR3、配列番号93の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号94の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号95の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号103の重鎖可変領域のCDR1、配列番号104の重鎖可変領域のCDR2、配列番号105の重鎖可変領域のCDR3、配列番号113の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号114の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号115の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号123の重鎖可変領域のCDR1、配列番号124の重鎖可変領域のCDR2、配列番号125の重鎖可変領域のCDR3、配列番号133の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号134の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号135の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号143の重鎖可変領域のCDR1、配列番号144の重鎖可変領域のCDR2、配列番号145の重鎖可変領域のCDR3、配列番号153の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号154の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号155の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号163の重鎖可変領域のCDR1、配列番号164の重鎖可変領域のCDR2、配列番号165の重鎖可変領域のCDR3、配列番号173の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号174の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号175の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号183の重鎖可変領域のCDR1、配列番号184の重鎖可変領域のCDR2、配列番号185の重鎖可変領域のCDR3、配列番号193の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号194の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号195の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号203の重鎖可変領域のCDR1、配列番号204の重鎖可変領域のCDR2、配列番号205の重鎖可変領域のCDR3、配列番号213の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号214の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号215の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号223の重鎖可変領域のCDR1、配列番号224の重鎖可変領域のCDR2、配列番号225の重鎖可変領域のCDR3、配列番号233の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号234の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号235の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号243の重鎖可変領域のCDR1、配列番号244の重鎖可変領域のCDR2、配列番号245の重鎖可変領域のCDR3、配列番号253の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号254の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号255の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号263の重鎖可変領域のCDR1、配列番号264の重鎖可変領域のCDR2、配列番号265の重鎖可変領域のCDR3、配列番号273の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号274の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号275の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号283の重鎖可変領域のCDR1、配列番号284の重鎖可変領域のCDR2、配列番号285の重鎖可変領域のCDR3、配列番号293の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号294の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号295の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号303の重鎖可変領域のCDR1、配列番号304の重鎖可変領域のCDR2、配列番号305の重鎖可変領域のCDR3、配列番号313の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号314の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号315の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号323の重鎖可変領域のCDR1、配列番号324の重鎖可変領域のCDR2、配列番号325の重鎖可変領域のCDR3、配列番号333の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号334の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号335の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号343の重鎖可変領域のCDR1、配列番号344の重鎖可変領域のCDR2、配列番号345の重鎖可変領域のCDR3、配列番号353の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号354の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号355の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号363の重鎖可変領域のCDR1、配列番号364の重鎖可変領域のCDR2、配列番号365の重鎖可変領域のCDR3、配列番号373の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号374の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号375の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号6の重鎖可変領域のCDR1、配列番号7の重鎖可変領域のCDR2、配列番号8の重鎖可変領域のCDR3、配列番号16の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号17の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号18の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号26の重鎖可変領域のCDR1、配列番号27の重鎖可変領域のCDR2、配列番号28の重鎖可変領域のCDR3、配列番号36の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号37の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号38の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号46の重鎖可変領域のCDR1、配列番号47の重鎖可変領域のCDR2、配列番号48の重鎖可変領域のCDR3、配列番号56の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号57の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号58の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号66の重鎖可変領域のCDR1、配列番号67の重鎖可変領域のCDR2、配列番号68の重鎖可変領域のCDR3、配列番号76の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号77の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号78の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号86の重鎖可変領域のCDR1、配列番号87の重鎖可変領域のCDR2、配列番号88の重鎖可変領域のCDR3、配列番号96の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号97の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号98の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号106の重鎖可変領域のCDR1、配列番号107の重鎖可変領域のCDR2、配列番号108の重鎖可変領域のCDR3、配列番号116の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号117の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号118の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号126の重鎖可変領域のCDR1、配列番号127の重鎖可変領域のCDR2、配列番号128の重鎖可変領域のCDR3、配列番号136の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号137の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号138の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号146の重鎖可変領域のCDR1、配列番号147の重鎖可変領域のCDR2、配列番号148の重鎖可変領域のCDR3、配列番号156の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号157の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号158の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号166の重鎖可変領域のCDR1、配列番号167の重鎖可変領域のCDR2、配列番号168の重鎖可変領域のCDR3、配列番号176の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号177の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号178の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号186の重鎖可変領域のCDR1、配列番号187の重鎖可変領域のCDR2、配列番号188の重鎖可変領域のCDR3、配列番号196の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号197の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号198の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号206の重鎖可変領域のCDR1、配列番号207の重鎖可変領域のCDR2、配列番号208の重鎖可変領域のCDR3、配列番号216の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号217の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号218の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号226の重鎖可変領域のCDR1、配列番号227の重鎖可変領域のCDR2、配列番号228の重鎖可変領域のCDR3、配列番号236の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号237の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号238の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号246の重鎖可変領域のCDR1、配列番号247の重鎖可変領域のCDR2、配列番号248の重鎖可変領域のCDR3、配列番号256の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号257の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号258の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号266の重鎖可変領域のCDR1、配列番号267の重鎖可変領域のCDR2、配列番号268の重鎖可変領域のCDR3、配列番号276の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号277の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号278の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号286の重鎖可変領域のCDR1、配列番号287の重鎖可変領域のCDR2、配列番号288の重鎖可変領域のCDR3、配列番号296の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号297の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号298の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号306の重鎖可変領域のCDR1、配列番号307の重鎖可変領域のCDR2、配列番号308の重鎖可変領域のCDR3、配列番号316の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号317の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号318の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号326の重鎖可変領域のCDR1、配列番号327の重鎖可変領域のCDR2、配列番号328の重鎖可変領域のCDR3、配列番号336の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号337の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号338の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号346の重鎖可変領域のCDR1、配列番号347の重鎖可変領域のCDR2、配列番号348の重鎖可変領域のCDR3、配列番号356の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号357の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号358の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、LOX−1に特異的に結合する抗体であって、配列番号366の重鎖可変領域のCDR1、配列番号367の重鎖可変領域のCDR2、配列番号368の重鎖可変領域のCDR3、配列番号376の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号377の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号378の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
ある種の実施形態では、本発明は、表1に記載されている、LOX−1に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片を含む。好ましい実施形態では、LOX−1に結合する抗体または抗原結合性断片は、MOR21435、MOR20159、MOR22031、MOR22034、MOR21433、MOR21452、MOR21453、MOR21460、MOR21468、MOR20052、MOR20133、MOR20144、MOR20148、MOR20151、MOR20152、MOR022025、MOR22028、MOR22029、およびMOR22030である。
抗体の可変領域または全長鎖が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合、本明細書で使用されるヒト抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産物」であるかまたはこれ「に由来する」、重鎖もしくは軽鎖可変領域または全長重鎖もしくは軽鎖を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを、対象の抗原で免疫化するか、または対象の抗原を伴うファージ上で提示されるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはこれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列がヒト抗体の配列と最も近似する(すなわち、同一性%が最大である)ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列を選択することにより、それ自体として同定することができる。
特定のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはこれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、自然発生の体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的な導入に起因して、生殖細胞系列配列と比較したアミノ酸の差異を含有しうる。しかし、VHフレームワーク領域またはVLフレームワーク領域では、選択されたヒト抗体は、アミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一であり、ヒト抗体を、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖細胞系列配列)と比較した場合に、ヒトとして同定するアミノ酸残基を含有することが典型的である。ある種の場合には、ヒト抗体は、アミノ酸配列が、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、少なくとも60%、70%、80%、90%、または少なくとも95%、なおまたは、少なくとも96%、97%、98%、または99%同一でありうる。
組換えヒト抗体は、VHフレームワーク領域内またはVLフレームワーク領域内のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、10アミノ酸以下の差異を提示することが典型的である。ある種の場合には、ヒト抗体は、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、5アミノ酸以下、なおまたは、4、3、2、または1アミノ酸以下の差異を提示しうる。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子の例は、下記で記載される生殖細胞系列の可変ドメイン断片のほか、DP47およびDPK9も含むがこれらに限定されない。
相同抗体
さらに別の実施形態では、本発明は、表1に記載されている配列と相同なアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供するが、抗体は、LOX−1タンパク質(例えば、ヒト、およびカニクイザルLOX−1)に結合し、表1に記載されている抗体の所望の機能的特性を保持する。
さらに別の実施形態では、本発明は、表1に記載されている配列と相同なアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供するが、抗体は、LOX−1タンパク質(例えば、ヒト、およびカニクイザルLOX−1)に結合し、表1に記載されている抗体の所望の機能的特性を保持する。
例えば、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、単離抗体またはその機能的抗原結合性断片を提供し、この場合、重鎖可変ドメインは、配列番号9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、および369からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含み;軽鎖可変ドメインは、配列番号19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239、259、279、299、319、339、359、および379からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含み;抗体は、LOX−1(例えば、ヒト、およびカニクイザルLOX−1)に特異的に結合する。本発明のある種の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Kabatにより規定される、HCDR1配列、HCDR2配列、HCDR3配列、LCDR1配列、LCDR2配列、およびLCDR3配列、例えば、それぞれ、配列番号8、9、10、18、19、および20をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Chothiaにより規定される、HCDR1配列、HCDR2配列、HCDR3配列、LCDR1配列、LCDR2配列、およびLCDR3配列、例えば、それぞれ、配列番号11、12、13、21、22、および23をさらに含む。
他の実施形態では、VHアミノ酸配列および/またはVLアミノ酸配列は、表1に示される配列と、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一でありうる。他の実施形態では、VHアミノ酸配列および/またはVLアミノ酸配列は、1、2、3、4、または5カ所以下のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を除き同一でありうる。表1に記載されている抗体のVH領域およびVL領域と大きな(すなわち、80%以上の)同一性を有するVH領域およびVL領域を有する抗体は、配列番号10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250、270、290、310、330、350、または370、および配列番号20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、または380、のそれぞれをコードする核酸分子の突然変異誘発(例えば、部位特異的突然変異誘発またはPCR媒介突然変異誘発)の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができる。
他の実施形態では、全長重鎖アミノ酸配列および/または全長軽鎖アミノ酸配列は、表1に示される配列と、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一でありうる。配列番号11、31、51、71、91、111、131、151、171、191、211、231、251、271、291、311、331、351、または371、のうちのいずれかの全長重鎖、および配列番号21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221、241、261、281、301、321、341、361、または381、のうちのいずれかの全長軽鎖と大きな(すなわち、80%以上の)同一性を有する全長重鎖および全長軽鎖を有する抗体は、このようなポリペプチドをコードする核酸分子の突然変異誘発(例えば、部位特異的突然変異誘発またはPCR媒介突然変異誘発)の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができる。
他の実施形態では、全長重鎖ヌクレオチド配列および/または全長軽鎖ヌクレオチド配列は、表1に示される配列と、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一でありうる。
他の実施形態では、重鎖可変領域のヌクレオチド配列および/または軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、表1に示される配列と、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一でありうる。
本明細書で使用される、2つの配列の間の同一性パーセントとは、2つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する配列により共有される、同一な位置の数の関数(すなわち、同一性%=同一な位置の数/位置の総数×100)である。2つの配列の間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、下記の非限定的な例で記載されている、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
加えて、または代替的に、本発明のタンパク質配列は、公表されたデータベースに照らして検索を実施する、例えば、関連の配列を同定するための「クエリー配列」としてさらに使用することもできる。例えば、このような検索は、Altschulら、1990 J. Mol. Biol. 215:403〜10によるBLASTプログラム(バージョン2.0)を使用して実施することができる。
保存的修飾を伴う抗体
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、CDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびにCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を有し、この場合、これらのCDR配列のうちの1つまたは複数は、本明細書で記載される抗体またはそれらの保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は、本発明のLOX−1結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、CDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびにCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を有し、この場合、これらのCDR配列のうちの1つまたは複数は、本明細書で記載される抗体またはそれらの保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は、本発明のLOX−1結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。
したがって、本発明は、CDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびにCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域からなる単離抗体またはその抗原結合性断片であって、重鎖可変領域のCDR1アミノ酸配列が、配列番号3、23、43、63、83、103、123、143、163、183、203、223、243、263、283、303、323、343、および363、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域のCDR2アミノ酸配列が、配列番号4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264、284、304、324、344、および364、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域のCDR3アミノ酸配列が、配列番号5、25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225、245、265、285、305、325、345、および365、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のCDR1アミノ酸配列が、配列番号13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233、253、273、293、313、333、353、および373、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のCDR2アミノ酸配列が、配列番号14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254、274、294、314、334、354、および374、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のCDR3アミノ酸配列が、配列番号15、35、55、75、95、115、135、155、175、195、215、235、255、275、295、315、335、355、および375、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、LOX−1に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
他の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物細胞における発現について最適化されており、全長重鎖配列および全長軽鎖配列を有し、これらの配列のうちの1つまたは複数は、本明細書で記載される抗体またはそれらの保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は、本発明のLOX−1結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。したがって、本発明は、全長重鎖および全長軽鎖からなる、哺乳動物細胞における発現について最適化された単離抗体であって、全長重鎖が、配列番号11、31、51、71、91、111、131、151、171、191、211、231、251、271、291、311、331、351、または371、ならびにそれらの保存的修飾の群から選択されるアミノ酸配列を有し、全長軽鎖が、配列番号21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221、241、261、281、301、321、341、361、または381、ならびにそれらの保存的修飾の群から選択されるアミノ酸配列を有し、LOX−1(例えば、ヒト、およびカニクイザルLOX−1)に特異的に結合する抗体を提供する。
同じエピトープに結合する抗体
本発明は、表1に記載されているLOX−1結合性抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。したがって、LOX−1結合アッセイ(実施例で記載されるLOX−1結合アッセイなど)において、本発明の他の抗体と競合する(例えば、本発明の他の抗体の結合を、統計学的に有意な形で競合的に阻害する)それらの能力に基づき、さらなる抗体を同定することができる。本発明の抗体の、LOX−1タンパク質への結合を阻害する被験抗体の能力により、被験抗体が、その抗体と、LOX−1への結合について競合することが可能であり、このような抗体は、非限定的な理論によれば、LOX−1タンパク質上の、それが競合する抗体と同じであるかまたは関連の(例えば、構造的に類似するか、または空間的に近接した)エピトープに結合しうることが裏付けられる。ある種の実施形態では、本発明の抗体と同じLOX−1上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、本明細書で記載される通りに、調製および単離することができる。本明細書で使用される通り、等モル濃度の競合抗体の存在下で、競合抗体が、本発明の抗体または抗原結合性断片のLOX−1との結合を、50%を超えて(例えば、80%、85%、90%、95%、98%、または99%)阻害するとき、抗体は、結合について「競合する」。
本発明は、表1に記載されているLOX−1結合性抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。したがって、LOX−1結合アッセイ(実施例で記載されるLOX−1結合アッセイなど)において、本発明の他の抗体と競合する(例えば、本発明の他の抗体の結合を、統計学的に有意な形で競合的に阻害する)それらの能力に基づき、さらなる抗体を同定することができる。本発明の抗体の、LOX−1タンパク質への結合を阻害する被験抗体の能力により、被験抗体が、その抗体と、LOX−1への結合について競合することが可能であり、このような抗体は、非限定的な理論によれば、LOX−1タンパク質上の、それが競合する抗体と同じであるかまたは関連の(例えば、構造的に類似するか、または空間的に近接した)エピトープに結合しうることが裏付けられる。ある種の実施形態では、本発明の抗体と同じLOX−1上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、本明細書で記載される通りに、調製および単離することができる。本明細書で使用される通り、等モル濃度の競合抗体の存在下で、競合抗体が、本発明の抗体または抗原結合性断片のLOX−1との結合を、50%を超えて(例えば、80%、85%、90%、95%、98%、または99%)阻害するとき、抗体は、結合について「競合する」。
操作抗体および修飾抗体
出発抗体から特性を改変した修飾抗体を操作する出発材料として、本明細書で示されるVH配列および/またはVL配列のうちの1つまたは複数を有する抗体を使用して、本発明の抗体をさらに調製することができる。抗体は、一方または両方の可変領域(すなわち、VHおよび/またはVL)内、例えば、1つもしくは複数のCDR領域内、および/または1つもしくは複数のフレームワーク領域内の1つまたは複数の残基を修飾することにより操作することができる。加えて、または代替的に、抗体は、定常領域内の残基を修飾して、例えば、抗体のエフェクター機能を改変することによっても操作することができる。
出発抗体から特性を改変した修飾抗体を操作する出発材料として、本明細書で示されるVH配列および/またはVL配列のうちの1つまたは複数を有する抗体を使用して、本発明の抗体をさらに調製することができる。抗体は、一方または両方の可変領域(すなわち、VHおよび/またはVL)内、例えば、1つもしくは複数のCDR領域内、および/または1つもしくは複数のフレームワーク領域内の1つまたは複数の残基を修飾することにより操作することができる。加えて、または代替的に、抗体は、定常領域内の残基を修飾して、例えば、抗体のエフェクター機能を改変することによっても操作することができる。
実施しうる可変領域操作のうちの1つの種類は、CDRグラフティングである。抗体は、主に6つの重鎖および軽鎖相補性決定領域(CDR)内に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。この理由で、CDR内のアミノ酸配列は、個別の抗体の間の多様性が、CDRの外部の配列より大きい。CDR配列は、大半の抗体−抗原間相互作用の一因となるため、異なる特性を伴う異なる抗体に由来するフレームワーク配列へとグラフトされた特異的自然発生抗体に由来するCDR配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的自然発生抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である(例えば、Riechmann, L.ら、1998 Nature 332:323〜327; Jones, P.ら、1986 Nature 321:522〜525; Queen, C.ら、1989 Proc. Natl. Acad. U.S.A. 86:10029〜10033;Winterによる米国特許第5,225,539号、ならびにQueenらによる米国特許第5,530,101号;同第5,585,089号;同第5,693,762号;および同第6,180,370号を参照されたい)。
したがって、本発明の別の実施形態は、配列番号3、23、43、63、83、103、123、143、163、183、203、223、243、263、283、303、323、343、および363からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するCDR1配列、配列番号4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264、284、304、324、344、および364からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するCDR2配列、配列番号5、25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225、245、265、285、305、325、345、および365からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するCDR3配列のそれぞれを含む重鎖可変領域と、配列番号13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233、253、273、293、313、333、353、および373からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するCDR1配列、配列番号14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254、274、294、314、334、354、および374からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するCDR2配列、ならびに配列番号15、35、55、75、95、115、135、155、175、195、215、235、255、275、295、315、335、355、および375からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR3配列のそれぞれを有する軽鎖可変領域とを含む単離抗体またはその抗原結合性断片に関する。したがって、このような抗体は、モノクローナル抗体のVH CDR配列およびVL CDR配列を含有するが、これらの抗体に由来する異なるフレームワーク配列を含有しうる。
このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む公表されたDNAデータベースまたは公表された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列DNA配列は、ヒト生殖細胞系列の配列データベースである「VBase」(インターネットのmrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能である)のほか、それらの各々の内容が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Kabat, E. A.ら、1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、U.S. Department of Health and Human Services、NIH Publication第91-3242号; Tomlinson, I. M.ら、1992 J. Mol. Biol. 227:776〜798;およびCox, J. P. L.ら、1994 Eur. J Immunol. 24:827〜836においても見出すことができる。
本発明の抗体における使用のためのフレームワーク配列の例は、本発明の選択された抗体により使用されるフレームワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体により使用されるコンセンサス配列および/またはフレームワーク配列と構造的に類似するフレームワーク配列である。VH CDR1配列、VH CDR2配列、およびVH CDR3配列、ならびにVL CDR1配列、VL CDR2配列、およびVL CDR3配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子内で見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域へとグラフトすることもでき、CDR配列は、生殖細胞系列配列と比較して、1つまたは複数の突然変異を含有するフレームワーク領域へとグラフトすることもできる。例えば、ある種の場合には、フレームワーク領域内の残基を突然変異させて、抗体の抗原結合能力を維持または増強することが有益であると見出されている(例えば、Queenらによる米国特許第5,530,101号;同第5,585,089号;同第5,693,762号;および同第6,180,370号を参照されたい)。本明細書で記載される抗体および抗原結合性断片をその上に構築する足場として活用されうるフレームワークは、VH1A、VH1B、VH3、Vk1、Vl2、およびVk2を含むがこれらに限定されない。当技術分野では、さらなるフレームワークが知られており、例えば、インターネットのvbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1上のvBaseデータベースにおいて見出すことができる。
したがって、本発明の実施形態は、配列番号9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、および369からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239、259、279、299、319、339、359、および379からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をさらに含む、単離LOX−1結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片に関する。
可変領域修飾の別の種類は、「アフィニティー成熟」として公知の、VH CDR1領域内、VH CDR2領域内、および/もしくはVH CDR3領域内、ならびに/またはVL CDR1領域内、VL CDR2領域内、および/もしくはVL CDR3領域内のアミノ酸残基を突然変異させて、これにより、対象の抗体の1つまたは複数の結合特性(例えば、アフィニティー)を改善することである。部位特異的突然変異誘発またはPCR媒介突然変異誘発を実施して、突然変異を導入することができ、本明細書で記載され、実施例でも提示される、in vitroアッセイまたはin vivoアッセイにおいて、抗体結合性または他の対象の機能的特性に対する効果を査定することができる。保存的修飾(上記で論じた)を導入することができる。突然変異は、アミノ酸の置換の場合もあり、付加の場合もあり、欠失の場合もある。さらに、CDR領域内の、典型的には1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ以下の残基も改変する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号3、23、43、63、83、103、123、143、163、183、203、223、243、263、283、303、323、343、および363からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号3、23、43、63、83、103、123、143、163、183、203、223、243、263、283、303、323、343、および363と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVH CDR1領域、配列番号4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264、284、304、324、344、および364からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264、284、304、324、344、および364と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVH CDR2領域、配列番号5、25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225、245、265、285、305、325、345、および365からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号5、25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225、245、265、285、305、325、345、および365と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVH CDR3領域、配列番号13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233、253、273、293、313、333、353、および373からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233、253、273、293、313、333、353、および373と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVL CDR1領域、配列番号14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254、274、294、314、334、354、および374からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254、274、294、314、334、354、および374と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVL CDR2領域、ならびに配列番号15、35、55、75、95、115、135、155、175、195、215、235、255、275、295、315、335、355、および375からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号15、35、55、75、95、115、135、155、175、195、215、235、255、275、295、315、335、355、および375と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVL CDR3領域を有する重鎖可変領域からなる単離LOX−1結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片を提供する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号6、26、46、66、86、106、126、146、166、186、206、226、246、266、286、306、326、346、および366からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号6、26、46、66、86、106、126、146、166、186、206、226、246、266、286、306、326、346、および366と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVH CDR1領域、配列番号7、27、47、67、87、107、127、147、167、187、207、227、247、267、287、307、327、347、および367からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号7、27、47、67、87、107、127、147、167、187、207、227、247、267、287、307、327、347、および367と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVH CDR2領域、ならびに配列番号8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268、288、308、328、348、および368からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268、288、308、328、348、および368と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVH CDR3領域を有する重鎖可変領域と、配列番号16、36、56、76、96、116、136、156、176、196、216、236、256、276、296、316、336、356、および376からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号16、36、56、76、96、116、136、156、176、196、216、236、256、276、296、316、336、356、および376と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVL CDR1領域、配列番号17、37、57、77、97、117、137、157、177、197、217、237、257、277、297、317、337、357、および377からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号17、37、57、77、97、117、137、157、177、197、217、237、257、277、297、317、337、357、および377と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVL CDR2領域、ならびに配列番号18、38、58、78、98、118、138、158、178、198、218、238、258、278、298、318、338、358、および378からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号18、38、58、78、98、118、138、158、178、198、218、238、258、278、298、318、338、358、および378と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVL CDR3領域を有する軽鎖可変領域とからなる単離LOX−1結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片を提供する。
抗原結合性ドメインの、代替的なフレームワークまたは足場へのグラフティング
結果として得られるポリペプチドが、LOX−1に特異的に結合する少なくとも1つの結合性領域を含む限りにおいて、多種多様な抗体/免疫グロブリンのフレームワークまたは足場を援用することができる。このようなフレームワークまたは足場は、ヒト免疫グロブリンまたはそれらの断片の5つの主要なイディオタイプを含み、好ましくはヒト化側面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。この点で、ラクダ科動物において同定される単一重鎖抗体などの単一重鎖抗体は、特に対象である。当業者により、新規のフレームワーク、足場、および断片が、発見および開発され続けている。
結果として得られるポリペプチドが、LOX−1に特異的に結合する少なくとも1つの結合性領域を含む限りにおいて、多種多様な抗体/免疫グロブリンのフレームワークまたは足場を援用することができる。このようなフレームワークまたは足場は、ヒト免疫グロブリンまたはそれらの断片の5つの主要なイディオタイプを含み、好ましくはヒト化側面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。この点で、ラクダ科動物において同定される単一重鎖抗体などの単一重鎖抗体は、特に対象である。当業者により、新規のフレームワーク、足場、および断片が、発見および開発され続けている。
一態様では、本発明は、本発明のCDRをグラフトしうる非免疫グロブリン足場を使用して、非免疫グロブリンベースの抗体を作り出すことに関する。それらが、標的のLOX−1タンパク質に特異的な結合性領域を含む限りにおいて、公知または将来の非免疫グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場を援用することができる。公知の非免疫グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場は、フィブロネクチン(Compound Therapeutics,Inc.、Waltham、MA)、アンキリン(Molecular Partners AG、Zurich、Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis,Ltd.、Cambridge、MA;およびAblynx nv、Zwijnaarde、Belgium)、リポカリン(Pieris Proteolab AG、Freising、Germany)、低分子モジュラー免疫医薬(Trubion Pharmaceuticals Inc.、Seattle、WA)、マキシボディ(Avidia,Inc.、Mountain View、CA)、プロテインA(Affibody AG、Sweden)、およびアフィリン(ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン)(Scil Proteins GmbH、Halle、Germany)を含むがこれらに限定されない。
フィブロネクチン足場は、III型フィブロネクチンドメイン(例えば、III型フィブロネクチンの第10モジュール(10 Fn3ドメイン))に基づく。III型フィブロネクチンドメインは、それら自体が互いに対してパックされてタンパク質のコアを形成し、ベータ鎖を互いへと接続し、溶媒へと露出されるループもさらに含有する(CDRと類似する)、2つのベータシートの間に分配された、7つまたは8つのベータ鎖を有する。ベータシートサンドイッチの各エッジには、少なくとも3つのこのようなループがあり、エッジは、ベータ鎖の方向に対して垂直なタンパク質の境界である(US6,818,418を参照されたい)。全体的なフォールドは、ラクダおよびラマIgG内の抗原認識単位全体を含む最小の機能的抗体断片である重鎖可変領域のフォールドと密接に関連するが、これらのフィブロネクチンベースの足場は、免疫グロブリンではない。この構造のために、非免疫グロブリン抗体は、性質およびアフィニティーが抗体の性質およびアフィニティーと類似する抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、in vivoにおける抗体のアフィニティー成熟の工程と類似する、in vitroにおけるループのランダム化戦略およびシャフリング戦略において使用することができる。これらのフィブロネクチンベースの分子は、標準的なクローニング法を使用して、分子のループ領域を本発明のCDRで置きかえうる、足場として使用することができる。
アンキリン技術は、アンキリンに由来するリピートモジュールを伴うタンパク質を、異なる標的への結合に使用しうる可変領域を保有する足場として使用することに基づく。アンキリンリピートモジュールとは、2つのアンチパラレルのα−ヘリックスおよびβ−ターンからなる、33アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソームディスプレイを使用することにより大部分が最適化される。
アビマーは、LRP−1など、天然のAドメイン含有タンパク質に由来する。これらのドメインは、本来、タンパク質間相互作用に使用され、ヒトでは、250を超えるタンパク質が、構造的にAドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して連結された多数の(2つ〜10の)異なる「Aドメイン」単量体からなる。標的抗原に結合しうるアビマーは、例えば、米国特許出願公開第20040175756号;同第20050053973号;同第20050048512号;および同第20060008844号において記載されている方法を使用して創出することができる。
アフィニティーリガンドであるアフィボディとは、プロテインAのIgG結合性ドメインのうちの1つの足場に基づく3ヘリックスバンドルからなる、低分子の単純なタンパク質である。プロテインAとは、細菌である黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)に由来する表面タンパク質である。この足場ドメインは、それらのうちの13が、多数のリガンド変異体を伴うアフィボディライブラリーを作り出す、ランダム化されている58アミノ酸からなる(例えば、US5,831,012を参照されたい)。アフィボディ分子は、抗体を模倣し、150kDaである抗体の分子量と比較して、分子量が6kDaである。その小サイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は、抗体の結合部位と同様である。
アンチカリンとは、Pieris ProteoLab AG社により開発された生成物である。アンチカリンは、通例、化学的に感受性の化合物または不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵に関与する、広範にわたる低分子の頑健なタンパク質群であるリポカリンに由来する。いくつかの天然リポカリンは、ヒト組織内またはヒト体液中で生じる。タンパク質のアーキテクチャーは、リジッドフレームワークの上部の超可変ループを伴う免疫グロブリンを連想させる。しかし、抗体またはそれらの組換え断片とは対照的に、リポカリンは、単一の免疫グロブリンドメインよりかろうじて大きい、160〜180アミノ酸残基を伴う単一のポリペプチド鎖からなる。結合性ポケットを構成する4つのループのセットは、顕著な構造可塑性を示し、様々な側鎖を許容する。したがって、異なる形状の規定の標的分子を、高度なアフィニティーおよび特異性で認識するために、結合性部位を独自の工程で再形成することができる。4つのループのセットを突然変異誘発することによりアンチカリンを開発するのには、リポカリンファミリーの1つのタンパク質である、オオモンシロチョウ(Pieris Brassicae)のビリン結合性タンパク質(BBP)が使用されている。アンチカリンについて記載する特許出願の1つの例は、PCT公開第WO199916873号にある。
アフィリン分子とは、タンパク質および低分子に対する特異的なアフィニティーのためにデザインされた低分子非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン分子は、それらの各々が、異なるヒト由来の足場タンパク質に基づく2つのライブラリーから非常に迅速に選択することができる。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質に対するいかなる構造相同性も示さない。現在、2つのアフィリン足場が援用されており、それらのうちの一方は、ヒト水晶体の構造タンパク質であるガンマクリスタリンであり、他方は、「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。いずれのヒト足場も非常に小型で、高度な熱安定性を示し、pH変化および変性剤に対してほぼ耐性である。この高度な安定性は主に、タンパク質のベータシート構造の展開に起因する。ガンマクリスタリンに由来するタンパク質の例は、WO200104144において記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例は、WO2004106368において記載されている。
タンパク質エピトープ模倣体(PEM)とは、タンパク質間相互作用に関与する主要な二次構造である、タンパク質のベータ−ヘアピン二次構造を模倣する、中程度のサイズの環状ペプチド様分子(分子量:1〜2kDa)である。
本発明は、LOX−1タンパク質に特異的に結合する完全ヒト抗体を提供する。キメラ抗体またはヒト化抗体と比較して、本発明のヒトLOX−1結合性抗体は、ヒト対象へと投与された場合の抗原性がさらに低減されている。
ラクダ科動物抗体
ラマ種(アルパカ(Lama paccos)、ラマ(Lama glama)、およびビクーニャ(Lama vicugna))などの新世界メンバー含む、ラクダおよびヒトコブラクダ(dromedary)(フタコブラクダ(Camelus bactrianus)およびヒトコブラクダ(Calelus dromaderius))ファミリーのメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性、およびヒト対象に対する抗原性に関して特徴付けられている。天然で見出されるこのファミリーの哺乳動物に由来するある種のIgG抗体は、軽鎖を欠き、したがって、他の動物に由来する抗体の場合の、2つの重鎖および2つの軽鎖を有する、典型的な4つの鎖の四次構造とは構造的に異なっている。PCT/EP93/02214(1994年3月3日に公表されたWO94/04678)を参照されたい。
ラマ種(アルパカ(Lama paccos)、ラマ(Lama glama)、およびビクーニャ(Lama vicugna))などの新世界メンバー含む、ラクダおよびヒトコブラクダ(dromedary)(フタコブラクダ(Camelus bactrianus)およびヒトコブラクダ(Calelus dromaderius))ファミリーのメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性、およびヒト対象に対する抗原性に関して特徴付けられている。天然で見出されるこのファミリーの哺乳動物に由来するある種のIgG抗体は、軽鎖を欠き、したがって、他の動物に由来する抗体の場合の、2つの重鎖および2つの軽鎖を有する、典型的な4つの鎖の四次構造とは構造的に異なっている。PCT/EP93/02214(1994年3月3日に公表されたWO94/04678)を参照されたい。
VHHとして同定される小型の単一の可変ドメインである、ラクダ科動物抗体の領域は、標的に対して高いアフィニティーを有する低分子タンパク質をもたらすことから、「ラクダ科動物ナノボディ」として公知の低分子量抗体由来タンパク質を結果としてもたらす遺伝子操作により得ることができる。1998年6月2日に取得された米国特許第5,759,808号を参照されたい。また、Stijlemans, B.ら、2004 J Biol Chem 279:1256〜1261; Dumoulin, M.ら、2003 Nature 424:783〜788; Pleschberger, M.ら、2003 Bioconjugate Chem 14:440〜448; Cortez-Retamozo, V.ら、2002 Int J Cancer 89:456〜62;およびLauwereys, M.ら、1998 EMBO J 17:3512〜3520も参照されたい。ラクダ科動物抗体および抗体断片の操作ライブラリーは、例えば、Ablynx、Ghent、Belgiumから市販されている。非ヒト由来の他の抗体と同様に、ラクダ科動物抗体のアミノ酸配列は、ヒト配列により酷似する配列を得るように、組換えにより改変することができる、すなわち、ナノボディは、「ヒト化」することができる。したがって、ヒトに対するラクダ科動物抗体の天然の小さな抗原性を、さらに低減することができる。
ラクダ科動物ナノボディの分子量は、ヒトIgG分子の分子量の約10分の1で、タンパク質の物理的直径は、数ナノメートルに過ぎない。サイズが小さいことの1つの帰結は、大型の抗体タンパク質には機能的に不可視である抗原性部位に結合するラクダ科動物ナノボディの能力である、すなわち、ラクダ科動物ナノボディは、古典的な免疫学的技法を使用するこれ以外の形では隠蔽されたままの抗原を検出する試薬として有用であり、可能な治療剤として有用である。したがって、サイズが小さいことのさらに別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、標的タンパク質のグルーブ内または狭小なクレフト内の特異的部位に結合することの結果として、標的タンパク質を阻害することが可能であり、よって、古典的な抗体の機能よりも、古典的な低分子量の薬物の機能により酷似する能力において用いられうることである。
低分子量およびコンパクトなサイズはさらに、熱安定性が極めて大きく、極端なpHおよびタンパク質分解性消化に対して安定的であり、抗原性が小さいラクダ科動物ナノボディを結果としてもたらす。別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、循環系から組織へとたやすく移動し、血液脳関門もなお越え、神経組織に影響を及ぼす障害も処置しうることである。ナノボディはさらに、血液脳関門を越える薬物輸送も容易としうる。2004年8月19日に公表された米国特許出願第20040161738号を参照されたい。これらの特色を、ヒトに対する抗原性が小さいことと組み合わせることにより、大きな治療的可能性が指し示される。さらに、これらの分子は、大腸菌(E. coli)などの原核細胞内で完全に発現させることができ、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現させ、機能的である。
したがって、本発明の特色は、LOX−1に対して高いアフィニティーを有するラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディである。本明細書のある種の実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディは、天然ではラクダ科動物において産生される、すなわち、他の抗体について本明細書で記載される技法を使用する、LOX−1またはそのペプチド断片による免疫化の後で、ラクダ科動物により産生される。代替的に、LOX−1結合性ラクダ科動物ナノボディは、操作もされる、すなわち、例えば、本明細書の実施例において記載されている、標的としてのLOX−1を伴うパニング手順を使用する、適切に突然変異誘発されたラクダ科動物ナノボディタンパク質を提示するファージライブラリーからの選択によっても作製される。操作されたナノボディはさらに、遺伝子操作により、レシピエント対象における半減期が、45分間〜2週間となるようにカスタマイズすることもできる。具体的な実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディを、例えば、PCT/EP93/02214において記載されている通り、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のCDR配列を、ナノボディまたは単一ドメイン抗体フレームワーク配列へとグラフトすることにより得る。
二特異性分子および多価抗体
別の態様では、本発明は、本発明のLOX−1結合性抗体またはその断片を含む二特異性分子または多特異性分子を特色とする。本発明の抗体またはその抗原結合性領域は、少なくとも2つの異なる結合性部位または標的分子に結合する二特異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質(例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド)へと連結することもできる。本発明の抗体は実際、3つ以上の異なる結合性部位および/または標的分子に結合する多特異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、他の2つ以上の機能的分子へと連結することもでき、このような多特異性分子はまた、本明細書で使用される「二特異性分子」という用語により包含されることも意図される。本発明の二特異性分子を創出するには、本発明の抗体を、二特異性分子が結果として得られるように、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合性模倣体など、1つまたは複数の他の結合性分子へと機能的に連結する(例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合により、またはこれら以外の形で)ことができる。
別の態様では、本発明は、本発明のLOX−1結合性抗体またはその断片を含む二特異性分子または多特異性分子を特色とする。本発明の抗体またはその抗原結合性領域は、少なくとも2つの異なる結合性部位または標的分子に結合する二特異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質(例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド)へと連結することもできる。本発明の抗体は実際、3つ以上の異なる結合性部位および/または標的分子に結合する多特異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、他の2つ以上の機能的分子へと連結することもでき、このような多特異性分子はまた、本明細書で使用される「二特異性分子」という用語により包含されることも意図される。本発明の二特異性分子を創出するには、本発明の抗体を、二特異性分子が結果として得られるように、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合性模倣体など、1つまたは複数の他の結合性分子へと機能的に連結する(例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合により、またはこれら以外の形で)ことができる。
したがって、本発明は、LOX−1に対する少なくとも1つの第1の結合特異性および第2の標的エピトープに対する第2の結合特異性を含む二特異性分子を含む。例えば、第2の標的エピトープは、第1の標的エピトープと異なる、LOX−1の別のエピトープである。
加えて、二特異性分子が多特異性である本発明では、分子は、第1の標的エピトープおよび第2の標的エピトープに加えて、第3の結合特異性もさらに含みうる。
一実施形態では、本発明の二特異性分子は、結合特異性として、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、または単鎖Fvを含む、少なくとも1つの抗体またはその抗体断片を含む。抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖の二量体、またはLadnerら、米国特許第4,946,778号において記載されている、Fvもしくは単鎖構築物など、その任意の最小断片でありうる。
ダイアボディとは、同じ鎖上の2つのドメインの間の対合を可能とするには短すぎるリンカーにより接続されたVHドメインおよびVLドメインを単一のポリペプチド鎖上で発現させた、二価の二特異性分子である。VHドメインおよびVLドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対合し、これにより、2つの抗原結合性部位を創出する(例えば、Holligerら、1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444〜6448; Poljakら、1994 Structure 2:1121〜1123を参照されたい)。ダイアボディは、VHA−VLBおよびVHB−VLA構造(VH−VL立体配置)、またはVLA−VHBおよびVLB−VHA構造(VL−VH立体配置)を伴う2つのポリペプチド鎖を、同じ細胞内で発現させることにより作製することができる。ダイアボディの大半は、細菌内の可溶性形態で発現させることができる。単鎖ダイアボディ(scDb)は、2つのダイアボディ形成ポリペプチド鎖を、約15アミノ酸残基のリンカーで接続することにより作製する(HolligerおよびWinter、1997 Cancer Immunol. Immunother.、45(3〜4):128〜30; Wuら、1996 Immunotechnology、2(1):21〜36を参照されたい)。scDbは、細菌内の可溶性で活性の単量体形態で発現させることができる(HolligerおよびWinter、1997 Cancer Immunol. Immunother.、45(34):128〜30; Wuら、1996 Immunotechnology、2(1):21〜36; PluckthunおよびPack、1997 Immunotechnology、3(2):83〜105; Ridgwayら、1996 Protein Eng.、9(7):617〜21を参照されたい)。ダイアボディをFcへと融合させて、「ジダイアボディ」を作り出すことができる(Luら、2004 J. Biol. Chem.、279(4):2856〜65を参照されたい)。
本発明の二特異性分子内で援用しうる他の抗体は、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、およびヒト化モノクローナル抗体である。
二特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、構成要素である結合特異性をコンジュゲートさせることにより調製することができる。例えば、二特異性分子の各結合特異性は、個別に作り出し、次いで、互いとコンジュゲートさせることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合は、様々なカップリング剤または架橋剤を、共有結合的コンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例は、プロテインA、カルボジイミド、N−スクシンイミジル−S−アセチル−チオアセテート(SATA)、5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)、o−フェニレンジマレイミド(oPDM)、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、およびスルホスクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(スルホ−SMCC)を含む(例えば、Karpovskyら、1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MAら、1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい)。他の方法は、Paulus、1985 Behring Ins. Mitt. 78号、118〜132; Brennanら、1985 Science 229:81〜83;およびGlennieら、1987 J. Immunol. 139:2367〜2375において記載されている方法を含む。コンジュゲート剤は、SATAおよびスルホ−SMCCであり、いずれも、Pierce Chemical Co.(Rockford、IL)から入手可能である。
結合特異性が、抗体である場合、それらは、2つの重鎖のC末端ヒンジ領域をスルフヒドリル結合させることによりコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態では、コンジュゲーションの前に、奇数のスルフヒドリル残基、例えば、1つのスルフヒドリル残基を含有するように、ヒンジ領域を修飾する。
代替的に、いずれの結合特異性も、同じベクター内でコードさせ、同じ宿主細胞内で発現およびアセンブルさせることができる。この方法は、二特異性分子が、mAb×mAb融合タンパク質、mAb×Fab融合タンパク質、Fab×F(ab’)2融合タンパク質、またはリガンド×Fab融合タンパク質である場合に、特に有用である。本発明の二特異性分子は、1つの単鎖抗体および結合決定基を含む単鎖分子の場合もあり、2つの結合決定基を含む単鎖二特異性分子の場合もある。二特異性分子は、少なくとも2つの単鎖分子を含みうる。二特異性分子を調製する方法については、例えば、米国特許第5,260,203号;米国特許第5,455,030号;米国特許第4,881,175号;米国特許第5,132,405号;米国特許第5,091,513号;米国特許第5,476,786号;米国特許第5,013,653号;米国特許第5,258,498号;および米国特許第5,482,858号において記載されている。
それらの特異的な標的に対する二特異性分子の結合は、例えば、酵素免疫測定アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(REA)、FACS解析、バイオアッセイ(例えば、成長阻害アッセイ)、またはウェスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらのアッセイの各々では一般に、対象の複合体に特異的な、標識された試薬(例えば、抗体)を援用することにより、特に対象となるタンパク質−抗体間複合体の存在が検出される。
別の態様では、本発明は、LOX−1に結合する、本発明の抗体の少なくとも2つの同一であるかまたは異なる抗原結合性部分を含む、多価化合物を提供する。抗原結合性部分は、タンパク質の融合または共有結合的連結もしくは非共有結合的連結を介して、併せて連結することができる。代替的に、二特異性分子のための連結法も記載されている。四価化合物は、例えば、本発明の抗体を、本発明の抗体の定常領域に結合する抗体、例えば、Fc領域またはヒンジ領域と架橋することにより得ることができる。
三量体化ドメインについては、例えば、Boreanによる特許であるEP1012280B1において記載されている。五量体化モジュールについては、例えば、PCT/EP97/05897において記載されている。
半減期を延長した抗体
本発明は、in vivoにおける半減期を延長した、LOX−1タンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。
本発明は、in vivoにおける半減期を延長した、LOX−1タンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。
多くの因子が、in vivoにおけるタンパク質の半減期に影響を及ぼしうる。例えば、腎臓における濾過、肝臓における代謝、タンパク質分解性酵素(プロテアーゼ)による分解、および免疫原性応答(例えば、抗体によるタンパク質の中和およびマクロファージおよび樹状細胞による取込み)。様々な戦略を使用して、本発明の抗体の半減期を延長することができる。例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、reCODE PEG、抗体足場、ポリシアル酸(PSA)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、アルブミン結合性リガンド、および炭水化物シールドとの化学的連結により、アルブミン、IgG、FcRn、およびトランスフェリンなどの血清タンパク質に結合するタンパク質との遺伝子融合により、ナノボディ、Fab、DARPin、アビマー、アフィボディ、およびアンチカリンなど、血清タンパク質に結合する他の結合部分とカップリングする(遺伝子的または化学的に)ことにより、rPEG、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合性タンパク質、およびFcとの遺伝子融合により、またはナノ担体、徐放製剤、もしくは医療デバイスへの組込みにより、本発明の抗体の半減期を延長することができる。
in vivoにおける抗体の血清中循環を延長するため、高分子量のPEGなど、不活性のポリマー分子を、PEGの、抗体のN末端もしくはC末端への部位特異的コンジュゲーションを介して、またはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多官能性リンカーを伴うかまたは多官能性リンカーを伴わない、抗体またはそれらの断片へと付着することができる。抗体をPEG化するには、抗体またはその断片を、ポリエチレングリコール(PEG)の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのPEGと、1つまたは複数のPEG基が抗体または抗体断片に付着する条件下で反応させることが典型的である。PEG化は、反応性PEG分子(または類似する反応性の水溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応により実行することができる。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ(C1〜C10)アルコキシ−ポリエチレングリコールもしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するのに使用されているPEGの形態のうちのいずれかを包含することを意図するものである。ある種の実施形態では、PEG化される抗体は、脱グリコシル化抗体である。直鎖状ポリマーまたは分枝状ポリマーの誘導体化であって、生物学的活性の喪失を結果として最小とする誘導体化が、使用されるであろう。コンジュゲーションの程度を、SDS−PAGEおよび質量分析により緊密にモニタリングして、PEG分子の抗体への適正なコンジュゲーションを確認することができる。反応しなかったPEGは、サイズ除外クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体−PEGコンジュゲートから分離することができる。PEG誘導体化抗体は、当業者に周知の方法を使用して、例えば、本明細書で記載されるイムノアッセイにより、結合活性ならびにin vivoにおける有効性について調べることができる。当技術分野では、タンパク質をPEG化する方法が知られており、本発明の抗体に適用することができる。例えば、NishimuraらによるEP0154316およびIshikawaらによるEP0401384を参照されたい。
他の改変されたPEG化技術は、tRNAシンセターゼおよびtRNAを含む再構成系を介して、化学的に特定された側鎖を、生合成タンパク質へと組み込む、再構成化学的直交性直接操作技術(reconstituting chemically orthogonal directed engineering)(ReCODE PEG)を含む。この技術は、30を超える新たなアミノ酸の、大腸菌(E. coli)細胞内、酵母細胞内、および哺乳動物細胞内の生合成タンパク質への組込みを可能とする。tRNAは、非天然アミノ酸を、アンバーコドンが配置される任意の位置へと組み込み、終止アンバーコドンから、化学的に特定されたアミノ酸の組込みシグナルを伝達するコドンへと転換する。
組換えPEG化技術(rPEG)はまた、血清半減期の延長にも使用することができる。この技術は、300〜600アミノ酸の非構造化タンパク質テールを、既存の医薬用タンパク質へと遺伝子融合させることを伴う。このような非構造化タンパク質鎖の見かけの分子量は、その実際の分子量の約15倍であるため、タンパク質の血清半減期は、大きく増大する。化学的コンジュゲーションおよび再精製を要求する従来のPEG化とは対照的に、製造工程は大きく簡略化され、生成物は、均質である。
ポリシアリル化は、天然のポリマーであるポリシアル酸(PSA)を使用して、活性寿命を延長し、治療用ペプチドおよび治療用タンパク質の安定性を改善する、別の技術である。PSAとは、シアル酸(糖)のポリマーである。タンパク質および治療用ペプチドの薬物送達に使用される場合、コンジュゲーション時に、ポリシアル酸は、保護的微小環境をもたらす。これは、循環内の治療用タンパク質の活性寿命を延長し、それが免疫系により認識されることを防止する。PSAポリマーは、天然では、ヒト体内で見出される。PSAは、数百万年にわたり、それらの壁をPSAでコーティングするように進化したある種の細菌により採用された。次いで、これらの天然でポリシアリル化した細菌は、分子的模倣により、体内の防御系を失効化することが可能となった。自然の究極のステルス技術であるPSAは、このような細菌から、大量に、かつ、所定の物理的特徴を伴って、容易に作製することができる。細菌PSAは、ヒト体内ではPSAと化学的に同一であるので、タンパク質へとカップリングさせた場合でもなお、完全に非免疫原性である。
別の技術は、抗体に連結されたヒドロキシエチルデンプン(「HES」)誘導体の使用を含む。HESとは、蝋状トウモロコシデンプンに由来する、修飾された天然ポリマーであり、体内の酵素により代謝されうる。HES溶液は通例、血液量不足を補い、血液のレオロジー特性を改善するために投与される。抗体のHES化は、分子の安定性を増大させることのほか、腎クリアランスを低減することによっても、循環半減期の延長を可能とし、生物学的活性の増大を結果としてもたらす。HESの分子量など、異なるパラメータを改変することにより、広範にわたるHES抗体コンジュゲートをカスタマイズすることができる。
in vivoにおける半減期を延長した抗体はまた、1つまたは複数のアミノ酸修飾(すなわち、置換、挿入、または欠失)を、IgG定常ドメインまたはそのFcRn結合性断片(好ましくはFcドメイン断片またはヒンジFcドメイン断片)へと導入しても作り出すことができる。例えば、国際特許公開第WO98/23289号、国際特許公開第WO97/34631号;および米国特許第6,277,375号を参照されたい。
さらに、抗体または抗体断片を、in vivoにおいてより安定的とするか、またはin vivoにおける半減期を延長するために、抗体を、アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン;HSA)へとコンジュゲートさせることもできる。当技術分野では、技法が周知であり、例えば、国際特許公開第WO93/15199号、同第WO93/15200号、および同WO01/77137号;ならびに欧州特許第EP413,622号を参照されたい。加えて、上記で記載した二特異性抗体の文脈では、抗体の特異性は、抗体の1つの結合性ドメインが、LOX−1に結合するのに対し、抗体の第2の結合性ドメインは、血清アルブミン、好ましくは、HSAに結合するようにデザインすることもできる。
半減期を延長するための戦略は、in vivoにおける半減期の延長が所望される、ナノボディ、フィブロネクチンベースの結合剤、および他の抗体またはタンパク質においてとりわけ有用である。
抗体コンジュゲート
本発明は、融合タンパク質を作り出すように、異種タンパク質または異種ポリペプチドへと(またはその断片、好ましくは、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、または少なくとも100アミノ酸のポリペプチドへと)、組換えにより融合させるかまたは化学的にコンジュゲートさせた(共有結合的コンジュゲーションおよび非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む)、LOX−1タンパク質に特異的に結合する抗体またはそれらの断片を提供する。特に、本発明は、本明細書で記載される抗体の抗原結合性断片(例えば、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F(ab)2断片、VHドメイン、VH CDR、VLドメイン、またはVL CDR)と、異種タンパク質、異種ポリペプチド、または異種ペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。当技術分野では、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを、抗体または抗体断片と融合またはコンジュゲートさせる方法が知られている。例えば、米国特許第5,336,603号、同第5,622,929号、同第5,359,046号、同第5,349,053号、同第5,447,851号、および同第5,112,946号;欧州特許第EP307,434および同第EP367,166号;国際特許公開第WO96/04388号および同第WO91/06570号;Ashkenaziら、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535〜10539; Zhengら、1995、J. Immunol. 154:5590〜5600;およびVilら、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337〜11341を参照されたい。
本発明は、融合タンパク質を作り出すように、異種タンパク質または異種ポリペプチドへと(またはその断片、好ましくは、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、または少なくとも100アミノ酸のポリペプチドへと)、組換えにより融合させるかまたは化学的にコンジュゲートさせた(共有結合的コンジュゲーションおよび非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む)、LOX−1タンパク質に特異的に結合する抗体またはそれらの断片を提供する。特に、本発明は、本明細書で記載される抗体の抗原結合性断片(例えば、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F(ab)2断片、VHドメイン、VH CDR、VLドメイン、またはVL CDR)と、異種タンパク質、異種ポリペプチド、または異種ペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。当技術分野では、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを、抗体または抗体断片と融合またはコンジュゲートさせる方法が知られている。例えば、米国特許第5,336,603号、同第5,622,929号、同第5,359,046号、同第5,349,053号、同第5,447,851号、および同第5,112,946号;欧州特許第EP307,434および同第EP367,166号;国際特許公開第WO96/04388号および同第WO91/06570号;Ashkenaziら、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535〜10539; Zhengら、1995、J. Immunol. 154:5590〜5600;およびVilら、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337〜11341を参照されたい。
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、および/またはコドンシャフリング(まとめて、「DNAシャフリング」と称する)の技法を介して作り出すことができる。DNAシャフリングを援用して、本発明の抗体またはそれらの断片の活性を改変する(例えば、アフィニティーが大きく、解離速度が小さい抗体またはそれらの断片)ことができる。一般に、米国特許第5,605,793号、同第5,811,238号、同第5,830,721号、同第5,834,252号、および同第5,837,458号;Pattenら、1997、Curr. Opinion Biotechnol. 8:724〜33; Harayama、1998、Trends Biotechnol. 16(2):76〜82; Hanssonら、1999、J. Mol. Biol. 287:265〜76;ならびにLorenzoおよびBlasco、1998、Biotechniques 24(2):308〜313(これらの特許および刊行物の各々は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる)を参照されたい。抗体もしくはそれらの断片、またはコードされる抗体もしくはそれらの断片は、組換えの前に、エラープローンPCRによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法にかけることにより改変することができる。LOX−1タンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、1つまたは複数の異種分子の1つまたは複数の成分、モチーフ、区間、一部、ドメイン、断片などで組み換えることができる。
さらに、抗体またはそれらの断片は、精製を容易とするペプチドなどのマーカー配列へと融合させることもできる。好ましい実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、それらのうちの多くが市販されている中でとりわけ、pQEベクター(QIAGEN,Inc.、9259 Eton Avenue、Chatsworth、CA、91311)において提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。Gentzら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821〜824において記載されている通り、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープ(Wilsonら、1984、Cell 37:767)に対応するヘマグルチニン(「HA」)タグ、および「フラッグ」タグを含むがこれらに限定されない。
他の実施形態では、本発明の抗体またはそれらの断片を、診断剤または検出可能薬剤へとコンジュゲートさせる。このような抗体は、疾患または障害の発生、発症、進行、および/または重症度を、特定の治療の有効性を決定することなど、臨床検査手順の一部としてモニタリングまたは予後診断するのに有用でありうる。このような診断および検出は、抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどであるがこれらに限定されない多様な酵素;ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンなどであるがこれらに限定されない補欠分子族;ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光材料;ルミノールなどであるがこれらに限定されない発光材料;ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどであるがこれらに限定されない生物発光材料;ヨウ素(131I、125I、123I、および121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(115In、113In、112In、および111In)、テクネシウム(99Tc)、タリウム(201Tl)、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、および117Tinなどであるがこれらに限定されない放射性材料;ならびに多様なポジトロン断層法を使用するポジトロン放出金属および非放射性の常磁性金属イオンを含むがこれらに限定されない検出可能な物質へとカップリングすることにより達成することができる。
本発明は、治療用部分へとコンジュゲートさせた抗体またはそれらの断片の使用もさらに包含する。抗体またはその断片は、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤または殺細胞剤、治療剤または放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体などの治療用部分へとコンジュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞傷害剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。
さらに、抗体またはその断片は、所与の生物学的応答を修飾する治療用部分または薬物部分へとコンジュゲートさせることもできる。治療用部分または薬物部分は、古典的化学的治療剤に限定されるとは見なされないものとする。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドでありうる。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス属外毒素、コレラ毒素、またはジフテリア毒素などの毒素;腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、抗血管新生剤;または例えば、リンホカインなどの生体応答修飾剤などのタンパク質を含みうる。
さらに、抗体は、213Biなどのアルファ放射体などの放射性金属イオン、131In、131LU、131Y、131Ho、131Smを含むがこれらに限定されない放射性金属イオンを、ポリペプチドへとコンジュゲートするのに有用な大環状キレート化剤などの治療用部分へとコンジュゲートさせることもできる。ある種の実施形態では、大環状キレート化剤は、リンカー分子を介して抗体へと付着させうる、1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−N,N’,N’’,N’’’−テトラ酢酸(DOTA)である。当技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、各々が参照によりそれらの全体において組み込まれる、Denardoら、1998、Clin Cancer Res. 4(10):2483〜90; Petersonら、1999、Bioconjug. Chem. 10(4):553〜7;およびZimmermanら、1999、Nucl. Med. Biol. 26(8):943〜50において記載されている。
治療用部分を、抗体へとコンジュゲートさせるための技法は周知であり、例えば、Arnonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeldら(編)、243〜56頁(Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、Controlled Drug Delivery(2版)、Robinsonら(編)、623〜53頁(Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」、Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications、Pincheraら(編)、475〜506頁(1985); 「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwinら(編)、303〜16頁(Academic Press 1985);およびThorpeら、1982、Immunol. Rev. 62:119〜58を参照されたい。
抗体はまた、特に、イムノアッセイまたは標的抗原の精製に有用な固体支持体へと付着させることもできる。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンを含むがこれらに限定されない。
本発明の抗体を作製する方法
抗体をコードする核酸
本発明は、上記で記載したLOX−1結合性抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核酸のいくつかは、配列番号10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250、270、290、310、330、350、または370、に示される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、および/または配列番号20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、または380に示される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態では、核酸分子は、表1において同定される核酸分子である。本発明の他のいくつかの核酸分子は、表1において同定される核酸分子のヌクレオチド配列と実質的に(例えば、少なくとも65、80%、95%、または99%)同一なヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターから発現させるとき、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、LOX−1抗原結合能を呈示することが可能である。
抗体をコードする核酸
本発明は、上記で記載したLOX−1結合性抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核酸のいくつかは、配列番号10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250、270、290、310、330、350、または370、に示される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、および/または配列番号20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、または380に示される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態では、核酸分子は、表1において同定される核酸分子である。本発明の他のいくつかの核酸分子は、表1において同定される核酸分子のヌクレオチド配列と実質的に(例えば、少なくとも65、80%、95%、または99%)同一なヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターから発現させるとき、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、LOX−1抗原結合能を呈示することが可能である。
本発明ではまた、上記で示したLOX−1結合性抗体の重鎖または軽鎖に由来する少なくとも1つのCDR領域、および、通例3つ全てのCDR領域をコードするポリヌクレオチドも提供される。他のいくつかのポリヌクレオチドは、上記で示したLOX−1結合性抗体の重鎖および/または軽鎖の可変領域配列の全てまたは実質的に全てをコードする。コードの縮重性のために、様々な核酸配列は、免疫グロブリンアミノ酸配列の各々をコードするであろう。
本発明の核酸分子は、抗体の可変領域および定常領域の両方をコードしうる。本発明の核酸配列のうちのいくつかは、配列番号11、31、51、71、91、111、131、151、171、191、211、231、251、271、291、311、331、351、または371に示される重鎖配列と実質的に(例えば、少なくとも80%、90%、または99%)同一な重鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。他のいくつかの核酸配列は、配列番号21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221、241、261、281、301、321、341、361、または381に示される軽鎖配列と実質的に(例えば、少なくとも80%、90%、または99%)同一な軽鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。
ポリヌクレオチド配列は、デノボの固相DNA合成、またはLOX−1結合性抗体またはその結合性断片をコードする既存の配列(例えば、下記の実施例で記載される配列)に対するPCRによる突然変異誘発により作製することができる。核酸の直接的な化学合成は、Narangら、1979、Meth. Enzymol. 68:90によるホスホトリエステル法;Brownら、Meth. Enzymol. 68:109、1979によるホスホジエステル法;Beaucageら、Tetra. Lett., 22:1859、1981によるジエチルホスホルアミダイト法;および米国特許第4,458,066号による固体支持体法など、当技術分野で公知の方法により達成することができる。PCRによる、突然変異の、ポリヌクレオチド配列への導入は、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification、H.A. Erlich(編)、Freeman Press、NY、NY、1992;PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、Innisら(編)、Academic Press、San Diego、CA、1990; Mattilaら、Nucleic Acids Res. 19:967、1991;およびEckertら、PCR Methods and Applications 1:17、1991において記載されている通りに実施することができる。
本発明ではまた、上記で記載したLOX−1結合性抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞も提供される。多様な発現ベクターを、援用して、LOX−1結合性抗体鎖または結合性断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスベースの発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターのいずれを使用しても、哺乳動物宿主細胞内で抗体を作製することができる。非ウイルスベクターおよび非ウイルス系は、プラスミド、典型的に、タンパク質またはRNAを発現させるための発現カセットを伴うエピソームベクター、およびヒト人工染色体を含む(例えば、Harringtonら、Nat Genet 15:345、1997を参照されたい)。例えば、哺乳動物(例えば、ヒト)細胞内のLOX−1結合性ポリヌクレオチドおよびLOX−1結合性ポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターは、pThioHis A、pThioHis B、およびpThioHis C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、pEBVHis B、およびpEBVHis C(Invitrogen、San Diego、CA)、MPSVベクター、ならびに他のタンパク質を発現させるための、当技術分野で公知の他の多数のベクターを含む。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、SV40に基づくベクター、パピローマウイルス、HBPエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター、およびセムリキ森林熱ウイルス(SFV)を含む。Brentら、前出; Smith、Annu. Rev. Microbiol. 49:807、1995;およびRosenfeldら、Cell 68:143、1992を参照されたい。
発現ベクターの選択は、その中でベクターを発現させる、意図される宿主細胞に依存する。発現ベクターは、LOX−1結合性抗体鎖または断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターおよび他の調節配列(例えば、エンハンサー)を含有することが典型的である。いくつかの実施形態では、誘導条件下を除き、挿入された配列の発現を防止するのに、誘導的プロモーターを援用する。誘導的プロモーターは、例えば、アラビノース、lacZ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプロモーターを含む。形質転換された生物の培養物は、それらの発現産物が宿主細胞により良好に許容されるコード配列の集団にバイアスをかけずに、非誘導条件下で増殖させることができる。プロモーターに加えて、他の調節的エレメントもまた、LOX−1結合性抗体鎖または断片の効率的な発現に要求または所望される可能性がある。これらのエレメントは、ATG開始コドンおよび隣接のリボソーム結合性部位または他の配列を典型的に含む。加えて、発現の効率は、使用される細胞系に適するエンハンサーを組み入れることにより増強することもできる(例えば、Scharfら、Results Probl. Cell Differ. 20:125、1994;およびBittnerら、Meth. Enzymol., 153:516、1987を参照されたい)。例えば、SV40エンハンサーまたはCMVエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞内の発現を増大させることができる。
発現ベクターはまた、挿入されたLOX−1結合性抗体配列によりコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するように、分泌シグナル配列の位置ももたらしうる。挿入されたLOX−1結合性抗体配列は、ベクター内に組み入れる前に、シグナル配列へと連結することが多い。LOX−1結合性抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする配列を受容するのに使用されるベクターは、場合によってまた、定常領域またはそれらの一部もコードする。このようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現を可能とし、これにより、インタクトな抗体またはそれらの断片の作製をもたらす。このような定常領域は、ヒト定常領域であることが典型的である。
LOX−1結合性抗体鎖を保有し、これを発現させるための宿主細胞は、原核細胞の場合もあり、真核細胞の場合もある。大腸菌(E. coli)は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングし、発現させるのに有用な1つの原核生物宿主である。使用に適する他の微生物宿主は、枯草菌(Bacillus subtilis)などの桿菌、およびサルモネラ(Salmonella)属種、セラチア(Serratia)属種、および多様なシュードモナス(Pseudomonas)属種など、他の腸内細菌科を含む。これらの原核生物宿主内ではまた、典型的に、宿主細胞と適合性の発現制御配列(例えば、複製起点)を含有する発現ベクターも作製することができる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン(trp)プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダに由来するプロモーター系など、任意の数の、様々な周知のプロモーターも存在する。プロモーターは、任意選択で、オペレーター配列により発現を制御することが典型的であるが、転写および翻訳を開始して終結させるためのリボソーム結合性部位配列なども有する。本発明のLOX−1結合性ポリペプチドを発現させるのに、酵母など、他の微生物もまた援用することができる。また、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用することができる。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明のLOX−1結合性ポリペプチドを発現させ、作製するのに、哺乳動物宿主細胞を使用する。哺乳動物宿主細胞は、任意の正常非不死化動物細胞または正常不死化動物細胞もしくは非正常不死化動物細胞またはヒト細胞を含む。例えば、CHO細胞系、多様なCos細胞系、HeLa細胞、骨髄腫細胞系、および形質転換B細胞を含む、インタクトな免疫グロブリンを分泌することが可能な多数の適切な宿主細胞系が開発されている。ポリペプチドを発現させるための、哺乳動物組織細胞培養物の使用については、例えば、Winnacker、FROM GENES TO CLONES、VCH Publishers、N.Y.、N.Y.、1987において一般に論じられている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列(例えば、Queenら、Immunol. Rev. 89:49〜68、1986を参照されたい)、ならびにリボソーム結合性部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの、必要なプロセシング情報部位を含みうる。
これらの発現ベクターは通例、哺乳動物遺伝子に由来するプロモーターまたは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含有する。適切なプロモーターは、構成的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、段階特異的プロモーター、および/またはモジュレート可能プロモーターもしくは調節可能プロモーターでありうる。有用なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性MMTVプロモーター、SV40プロモーター、MRP polIIIプロモーター、構成的MPSVプロモーター、テトラサイクリン誘導性CMVプロモーター(ヒト即初期CMVプロモーターなど)、構成的CMVプロモーター、および当技術分野で公知のプロモーター−エンハンサーの組合せを含むがこれらに限定されない。
対象のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の種類に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが一般に原核細胞に活用されるのに対し、リン酸カルシウム処理または電気穿孔は、他の細胞宿主に使用することができる(一般に、Sambrookら、前出を参照されたい)。他の方法は、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介型形質転換、注射およびマイクロインジェクション、遺伝子銃法、ウィロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン:核酸コンジュゲート、ネイキッドDNA、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質であるVP22との融合体(ElliotおよびO'Hare、Cell 88:223、1997)、DNAの薬剤増強型取込み、およびex vivoにおける形質導入を含む。組換えタンパク質の長期にわたる高収率作製のためには、安定的発現が所望されることが多い。例えば、LOX−1結合性抗体鎖または結合性断片を安定的に発現させる細胞系は、ウイルス複製起点または内因性発現エレメント、および選択マーカー遺伝子を含有する、本発明の発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターを導入した後、細胞は、強化培地中で1〜2日間にわたり成長させてから、選択培地へと切り替えることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与し、その存在により細胞の成長を可能とし、これにより、導入された配列を選択培地中で発現させることに成功することである。耐性で安定的にトランスフェクトされた細胞は、細胞型に適する組織培養法を使用して増殖させることができる。
フレームワークまたはFcの操作
本発明の操作抗体は、例えば、抗体の特性を改善するように、VHおよび/またはVL内のフレームワーク残基へと修飾を施した操作抗体を含む。このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるように施すことが典型的である。例えば、1つの手法は、1つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」ことである。より具体的には、体細胞突然変異を経た抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含有しうる。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定することができる。フレームワーク領域配列を、それらの生殖細胞系列の立体配置へと戻すには、例えば、部位特異的突然変異誘発により、体細胞突然変異を、生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」ことができる。このような「復帰突然変異させた」抗体もまた、本発明により包含されることを意図する。
本発明の操作抗体は、例えば、抗体の特性を改善するように、VHおよび/またはVL内のフレームワーク残基へと修飾を施した操作抗体を含む。このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるように施すことが典型的である。例えば、1つの手法は、1つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」ことである。より具体的には、体細胞突然変異を経た抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含有しうる。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定することができる。フレームワーク領域配列を、それらの生殖細胞系列の立体配置へと戻すには、例えば、部位特異的突然変異誘発により、体細胞突然変異を、生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」ことができる。このような「復帰突然変異させた」抗体もまた、本発明により包含されることを意図する。
フレームワーク修飾の別の種類は、1つもしくは複数のフレームワーク領域内の残基、なおまたは、1つもしくは複数のCDR領域内の残基を突然変異させて、T細胞エピトープを除去して、これにより、抗体の潜在的な免疫原性を低減することを伴う。この手法はまた、「脱免疫化」とも称し、Carrらによる米国特許公開第20030153043号においてさらに詳細に記載されている。
フレームワーク内またはCDR領域内に施された修飾に加えて、またはこれと代替的に、本発明の抗体は、Fc領域内の修飾を含んで、典型的に、血清半減期、補体の結合、Fc受容体の結合、および/または抗原依存性細胞性細胞傷害など、抗体の1つまたは複数の機能的特性を改変するように操作することもできる。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾することもでき(例えば、1つまたは複数の化学的部分を抗体に付着することができる)、そのグリコシル化を改変して、ここでもまた、抗体の1つまたは複数の機能的特性を改変するように修飾することもできる。これらの実施形態の各々については、下記でさらに詳細に記載する。Fc領域内の残基の番号付けは、KabatによるEUインデックスである。
一実施形態では、ヒンジ領域内のシステイン残基の数を改変する、例えば、増大または減少させるように、CH1のヒンジ領域を修飾する。この手法は、Bodmerらによる米国特許第5,677,425号においてさらに記載されている。CH1のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易とするか、または抗体の安定性を増大もしくは低下させるように改変する。
別の実施形態では、抗体のFcヒンジ領域を突然変異させて、抗体の生物学的半減期を短縮する。より具体的には、抗体のブドウ球菌属プロテインA(SpA)への結合が、天然Fc−ヒンジドメインのSpAへの結合と比べて損なわれるように、1つまたは複数のアミノ酸突然変異を、Fc−ヒンジ断片のCH2ドメイン−CH3ドメイン間界面領域へと導入する。この手法は、Wardらによる米国特許第6,165,745号においてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を延長するように修飾する。多様な手法が可能である。例えば、以下の突然変異:Wardによる米国特許第6,277,375号において記載されている、T252L、T254S、T256Fのうちの1つまたは複数を導入することができる。代替的に、生物学的半減期を延長するために、抗体を、Prestaらによる米国特許第5,869,046号;および同第6,121,022号において記載されている、IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから採取されたサルベージ受容体結合性エピトープを含有するように、CH1領域内またはCL領域内で改変することもできる。
さらに他の実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸残基を、抗体のエフェクター機能を改変する異なるアミノ酸残基で置きかえることにより、Fc領域を改変する。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対するアフィニティーを改変しているが、親抗体の抗原結合能は保持するように、1つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。それに対するアフィニティーを改変するエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1成分でありうる。この手法は、両方ともWinterらによる米国特許第5,624,821号;および同第5,648,260号においてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、抗体が、C1qへの結合を改変し、かつ/または補体依存性細胞傷害作用(CDC)を低減もしくは消失させるように、アミノ酸残基から選択される1つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。この手法は、Idusogieらによる米国特許第6,194,551号においてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸残基を改変して、これにより、補体に結合する抗体の能力を改変する。この手法は、BodmerらによるPCT公開第WO94/29351号においてさらに記載されている。
さらに別の実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸を修飾することにより、抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)を媒介する抗体の能力を増大させ、かつ/またはFcγ受容体に対する抗体のアフィニティーを増大させるように、Fc領域を修飾する。この手法は、PrestaによるPCT公開第WO00/42072号においてさらに記載されている。さらに、ヒトIgG1上の、FcγRI、FcγRII、FcγRIII、およびFcRnに対する結合性部位もマップされており、結合を改善させた変異体も記載されている(Shields, R.L.ら、2001 J. Biol. Chen. 276:6591〜6604を参照されたい)。
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、脱グリコシル化抗体(すなわち、抗体は、グリコシル化を欠く)を作製することができる。グリコシル化は、例えば、「抗原」に対する抗体のアフィニティーを増大させるように改変することができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の1つまたは複数のグリコシル化部位を改変することにより達成することができる。例えば、1つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の消失を結果としてもたらす、1つまたは複数のアミノ酸置換を作製して、これにより、その部位におけるグリコシル化を消失させることができる。このような脱グリコシル化により、抗原に対する抗体のアフィニティーを増大させることができる。このような手法は、Coらによる米国特許第5,714,350号;および同第6,350,861号においてさらに詳細に記載されている。
加えて、または代替的に、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体または二分枝型GlcNac構造を増大させた抗体など、グリコシル化の種類を改変した抗体を作製することもできる。このようなグリコシル化パターンの改変は、抗体のADCC能を増大させることが裏付けられている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構を改変した宿主細胞内で抗体を発現させることにより達成することができる。当技術分野では、グリコシル化機構を改変した細胞が記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、これにより、グリコシル化を改変した抗体を産生するための宿主細胞として使用することができる。例えば、HangらによるEP1,176,195は、このような細胞系内で発現させた抗体が、低フコシル化を呈示するように、フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子を機能的に破壊した細胞系について記載している。PrestaによるPCT公開第WO03/035835号は、フコースをAsn(297)連結された炭水化物へと付着する能力を低減し、また、その宿主細胞内で発現させた抗体の低フコシル化も結果としてもたらす、変異体のCHO細胞系である、Lecl3細胞について記載している(また、Shields, R.L.ら、2002 J. Biol. Chem. 277:26733〜26740も参照されたい)。UmanaらによるPCT公開第WO99/54342号は、操作細胞系内で発現させた抗体が、抗体のADCC活性の増大を結果としてもたらす二分枝型GlcNac構造の増大を呈示するように、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ(例えば、ベータ(1,4)−NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII))を発現させるように操作された細胞系について記載している(また、Umanaら、1999 Nat. Biotech. 17:176〜180も参照されたい)。
改変抗体を操作する方法
上記で論じた通り、本明細書で示されるVH配列およびVL配列または全長重鎖および全長軽鎖配列を有するLOX−1結合性抗体は、全長重鎖配列および/もしくは全長軽鎖配列、VH配列および/もしくはVL配列、またはこれらへと付着された定常領域を修飾することにより、新たなLOX−1結合性抗体を創出するのに使用することができる。したがって、本発明の別の態様では、本発明のLOX−1結合性抗体の構造特色を使用して、ヒトLOX−1に結合し、また、LOX−1の1つまたは複数の機能的特性も阻害すること(例えば、LOX−1とLOX−1受容体の結合を阻害する、LOX−1依存性の細胞増殖を阻害する)など、本発明の抗体の少なくとも1つの機能的特性を保持する、構造的に関連するLOX−1結合性抗体を創出する。
上記で論じた通り、本明細書で示されるVH配列およびVL配列または全長重鎖および全長軽鎖配列を有するLOX−1結合性抗体は、全長重鎖配列および/もしくは全長軽鎖配列、VH配列および/もしくはVL配列、またはこれらへと付着された定常領域を修飾することにより、新たなLOX−1結合性抗体を創出するのに使用することができる。したがって、本発明の別の態様では、本発明のLOX−1結合性抗体の構造特色を使用して、ヒトLOX−1に結合し、また、LOX−1の1つまたは複数の機能的特性も阻害すること(例えば、LOX−1とLOX−1受容体の結合を阻害する、LOX−1依存性の細胞増殖を阻害する)など、本発明の抗体の少なくとも1つの機能的特性を保持する、構造的に関連するLOX−1結合性抗体を創出する。
例えば、本発明の抗体の1つまたは複数のCDR領域またはそれらの突然変異は、組換えにより、公知のフレームワーク領域および/または他のCDRと組み合わせて、組換えにより操作された、上記で論じた、本発明の、さらなるLOX−1結合性抗体を創出することができる。他の種類の修飾は、前出の節で記載した修飾を含む。操作法のための出発材料は、本明細書で提示されるVH配列および/もしくはVL配列のうちの1つもしくは複数、またはそれらの1つもしくは複数のCDR領域である。操作抗体を創出するのに、本明細書で提示されるVH配列および/もしくはVL配列のうちの1つもしくは複数、またはそれらの1つもしくは複数のCDR領域を有する抗体を実際に調製する(すなわち、タンパク質として発現させる)ことは必要ではない。そうではなくて、配列内に含有される情報を、元の配列に由来する「第2世代の」配列を創出するための出発材料として使用し、次いで、「第2世代の」配列を、タンパク質として調製し、発現させる。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号3、23、43、63、83、103、123、143、163、183、203、223、243、263、283、303、323、343、および363からなる群から選択されるCDR1配列、配列番号4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264、284、304、324、344、および364からなる群から選択されるCDR2配列、ならびに/または配列番号5、25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225、245、265、285、305、325、345、および365からなる群から選択されるCDR3配列を有する重鎖可変領域の抗体配列と、配列番号13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233、253、273、293、313、333、353、および373からなる群から選択されるCDR1配列、配列番号14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254、274、294、314、334、354、および374からなる群から選択されるCDR2配列、ならびに/または配列番号15、35、55、75、95、115、135、155、175、195、215、235、255、275、295、315、335、355、および375からなる群から選択されるCDR3配列を有する軽鎖可変領域の抗体配列とからなるLOX−1結合性抗体を作製するステップと、重鎖可変領域の抗体配列および/または軽鎖可変領域の抗体配列内の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも1つの改変抗体配列を創出するステップと、改変抗体配列を、タンパク質として発現させるステップとを含む方法を提供する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号6、26、46、66、86、106、126、146、166、186、206、226、246、266、286、306、326、346、および366からなる群から選択されるCDR1配列、配列番号7、27、47、67、87、107、127、147、167、187、207、227、247、267、287、307、327、347、および367からなる群から選択されるCDR2配列、ならびに/または配列番号8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268、288、308、328、348、および368からなる群から選択されるCDR3配列を有する重鎖可変領域の抗体配列と、配列番号16、36、56、76、96、116、136、156、176、196、216、236、256、276、296、316、336、356、および376からなる群から選択されるCDR1配列、配列番号17、37、57、77、97、117、137、157、177、197、217、237、257、277、297、317、337、357、および377からなる群から選択されるCDR2配列、ならびに/または配列番号18、38、58、78、98、118、138、158、178、198、218、238、258、278、298、318、338、358、および378からなる群から選択されるCDR3配列を有する軽鎖可変領域の抗体配列とからなるLOX−1結合性抗体を調製し、重鎖可変領域の抗体配列および/または軽鎖可変領域の抗体配列内の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも1つの改変抗体配列を創出し、改変抗体配列を、タンパク質として発現させるための方法を提供する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞における発現について最適化されたLOX−1結合性抗体であって、配列番号11、31、51、71、91、111、131、151、171、191、211、231、251、271、291、311、331、351、または371の群から選択される配列を有する全長重鎖抗体配列と、配列番号21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221、241、261、281、301、321、341、361、または381の群から選択される配列を有する全長軽鎖抗体配列とからなるLOX−1結合性抗体を調製し、全長重鎖抗体配列および/または全長軽鎖抗体配列内の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも1つの改変抗体配列を創出し、改変抗体配列を、タンパク質として発現させるための方法を提供する。一実施形態では、重鎖または軽鎖の改変は、重鎖または軽鎖のフレームワーク領域内である。
改変抗体配列はまた、CDR3配列、またはUS2005/0255552において記載されている、最小限の不可欠な結合決定基を固定し、CDR1配列およびCDR2配列には多様性を持たせた抗体ライブラリーをスクリーニングすることによっても調製することができる。スクリーニングは、ファージディスプレイ技術など、抗体を、抗体ライブラリーからスクリーニングするのに適切な任意のスクリーニング技術に従い実施することができる。
標準的な分子生物学の技法を使用して、改変抗体配列を調製し、発現させることができる。改変抗体配列によりコードされる抗体は、ヒト、カニクイザル、ラットおよび/またはマウスLOX−1に特異的に結合すること;ならびに抗体が、F36E細胞増殖アッセイおよび/またはBa/F3−LOX−1R細胞増殖アッセイにおいて、LOX−1依存性の細胞増殖を阻害することを含むがこれらに限定されない、本明細書で記載されるLOX−1結合性抗体の機能的特性のうちの1つ、一部、または全部を保持する抗体である。
本発明の抗体を操作する方法のある種の実施形態では、LOX−1結合性抗体コード配列の全部または一部に沿って、ランダムに、または選択的に、突然変異を導入することができ、結果として得られる修飾LOX−1結合性抗体を、本明細書で記載される結合活性および/または他の機能的特性についてスクリーニングすることができる。当技術分野では、突然変異法が記載されている。例えば、ShortによるPCT公開第WO02/092780号は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー、またはこれらの組合せを使用して、抗体の突然変異を創出し、スクリーニングするための方法について記載している。代替的に、LazarらによるPCT公開第WO03/074679号は、コンピュータによるスクリーニング法を使用して、抗体の生理化学的特性を最適化する方法について記載している。
本発明のある種の実施形態では、抗体は、脱アミド化部位を除去するように操作されている。脱アミド化は、ペプチド内またはタンパク質内の構造的変化および機能的変化を引き起こすことが公知である。脱アミドは、生物学的活性の低下のほか、タンパク質医薬品の薬物動態および抗原性の改変も結果としてもたらしうる(Anal Chem. 2005年3月1日;77(5):1432〜9)。
本発明のある種の実施形態では、抗体は、pIを増大させ、それらの薬物様特性を改善するように操作されている。タンパク質のpIは、分子の全体的な生物物理的特性の鍵となる決定因子である。pIが小さな抗体は、可溶性が小さく、安定性が小さく、凝集しやすいことが公知である。さらに、pIが小さな抗体の精製は、とりわけ、臨床における使用のためのスケールアップにおいて、困難であり、問題を生じる可能性がある。本発明の抗LOX−1抗体またはFabのpIを増大させることにより、それらの可溶性が改善され、抗体を高濃度(>100mg/ml)で製剤化することが可能となった。抗体を高濃度(例えば、>100mg/ml)で製剤化することにより、高用量の抗体を、患者の眼へと、硝子体内注射を介して投与することが可能な利点がもたらされ、これにより、心血管障害を含む慢性疾患を処置するための著明な利点である、投与頻度の低減を可能とすることができる。pIの増大はまた、抗体のIgGバージョンのFcRnを媒介するリサイクリングも増大させ、これにより、薬物が長時間にわたり体内にとどまり、要求される注射の回数を少なくすることも可能としうる。最後に、pIの増大に起因して、抗体の全体的な安定性が著明に改善され、その結果として、保管寿命およびin vivoにおける生物学的活性の延長がもたらされる。pIは、8.2以上であることが好ましい。
改変抗体の機能的特性は、実施例において示されるアッセイ(例えば、ELISA)など、当技術分野において利用可能であり、かつ/または本明細書で記載される標準的なアッセイを使用して評価することができる。
予防的使用および治療的使用
本明細書で記載されるLOX−1に結合する抗体は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体または抗原結合性断片を投与することにより、LOX−1レベルの上昇および/またはLOX−1活性の増大と関連する疾患または障害を処置するのに治療的に有用な濃度で使用することができる。本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、LOX−1関連心血管障害を処置する方法を提供する。本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、LOX−1関連心血管障害を処置する方法を提供する。
本明細書で記載されるLOX−1に結合する抗体は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体または抗原結合性断片を投与することにより、LOX−1レベルの上昇および/またはLOX−1活性の増大と関連する疾患または障害を処置するのに治療的に有用な濃度で使用することができる。本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、LOX−1関連心血管障害を処置する方法を提供する。本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、LOX−1関連心血管障害を処置する方法を提供する。
本発明の抗体を使用して、とりわけ、心血管障害、内皮細胞機能不全、内皮細胞障害、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、高血圧症、高脂血症、高コレステロール血症、糖尿病、一酸化窒素欠乏、心筋梗塞、血管の酸化ストレス、心筋虚血症、虚血症−再灌流、敗血症、糖尿病性腎症、腎疾患、心筋症、心不全、末梢動脈疾患、冠動脈性心疾患、跛行(例えば、間欠性跛行、ラザフォード分類II/III跛行)、末梢動脈疾患(PAD)、狭心症(例えば、不応性狭心症)、冠動脈疾患(CAD)(例えば、心臓に血液を供給する動脈のアテローム性動脈硬化に起因する)、脳卒中、および異常な内皮依存性血管拡張を含むがこれらに限定されない、LOX−1に関連する状態または障害を処置、防止、および改善することができる。
心血管障害、例えば、LOX−1関連心血管障害の処置および/または防止は、血管機能の臨床的に関与性の測定値を使用する医療ケア従事者により決定されうる。LOX−1関連心血管障害の処置とは、血管機能、血管解剖学的特徴、および/もしくは血液動態パラメータの改善もしくは保存を結果としてもたらすか、またはこれらを結果としてもたらすことが企図される任意の作用(例えば、本明細書で記載される抗LOX−1抗体の投与)を意味する。加えて、心血管障害と関連する状態または障害に関する場合の防止とは、本明細書で規定される、血管機能および/または心血管障害パラメータの悪化を、前記悪化の危険性がある患者において防止または緩徐化する、任意の作用(例えば、本明細書で記載される抗LOX−1抗体の投与)を意味する。
安定狭心症および急性虚血性症候群では、oxLDLおよび可溶性LOX−1レベルのいずれも増大するので、本発明の抗LOX−1抗体は、血管の酸化ストレスを阻害し、心筋虚血症を低減し、狭心症および運動耐容能を改善することが期待され、前記抗体は、利用可能な最初の疾患修飾抗狭心症処置となる潜在性を有する。
前記治療的投与の有効性は、一過性虚血性事象(ホルターECGモニタリング)および狭心症(Seattle angina questionnaire)の頻度および持続時間の逐次的評価、ならびに潅流イメージングの選択肢を伴う逐次的運動負荷試験により測定することができる。有効性はまた、血漿oxLDL、可溶性LOX−1、および酸化ストレスバイオマーカー(F2−イソプロスタン、マロンジアルデヒド、ミエロペルオキシダーゼ)など、バイオマーカーの使用によって測定することもできる。
本明細書で使用される「跛行」とは、重度の跛行および他の類似の用語を含み、運動機能障害および満たされていない大きな医療上の必要について記載する。跛行とは、下肢末端の虚血症、筋肉疲労を引き起こすこと、休息により緩和される、労作時における疼痛、運動の制限、および生活の質の低下を特徴とする状態であり、アテローム性動脈硬化および内皮依存性血管拡張の異常(例えば、内皮依存性血管拡張の機能障害)により引き起こされる。米国内のその有病数は、患者800〜1200万人である。間欠性跛行を伴う患者のうち、7%は、下肢末端のバイパス手術を受け、4%は、大規模な切断術を必要とし、16%は、跛行の悪化を発症する。5年間を超える重度の跛行罹患者のうちの20%では、心筋梗塞および脳卒中などの心血管事象が生じる。現行の治療は、手術による治療であり、本発明の抗LOX−1抗体の投与など、侵襲性の小さな手段を介する処置であれば、極めて大きな治療的飛躍を表すであろう。
前記治療的投与の有効性は、疼痛の発症までの時間、運動持続時間、および歩行距離を含む評価項目を伴う、運動により誘導される跛行の逐次的評価(足底屈およびトレッドミル)により測定することができる。有効性はまた、血漿oxLDLおよび可溶性LOX−1;酸化ストレスバイオマーカー(F2−イソプロスタン、マロンジアルデヒド、ミエロペルオキシダーゼ)など、機構的バイオマーカーの使用;運動により誘導される、下肢末端の血流および筋内O2飽和度の変化によっても測定することができる。
別の満たされていない大きな医療上の必要であって、本発明の抗LOX−1抗体が治療的に有用な医療上の必要は、不応性狭心症である。狭心症は、最適の医学的治療(例えば、長時間作用型ベータ遮断剤、硝酸薬、およびカルシウムチャネル遮断剤の投与)にもかかわらず、罹患した対象において再発し、血管再建のための選択肢が存在しない。不応性狭心症とは、心筋の虚血に起因する胸痛を顕徴とする状態であり、冠動脈の閉塞または痙攣(例えば、冠動脈疾患に由来する)に一般に起因し、消耗性の症状、身体活動の大きな制限、および生活の質の低下を伴う。患者100〜180万人の、米国内の不応性狭心症罹患者は、心血管による死亡率の、毎年10%の増大率での増大を経ており、少なくとも100,000例の新たな不応性狭心症の症例が毎年生じている。
本発明の抗体はまた、LOX−1関連障害を防止、処置、または改善するための他の薬剤と組み合わせても使用することができる。例えば、スタチン療法を、心血管障害を伴う患者を処置するために、本発明のLOX−1抗体および抗原結合性断片と組み合わせて使用することができる。
医薬組成物
本発明は、薬学的に許容される担体と併せて製剤化されたLOX−1結合性抗体(インタクトなまたは結合性断片)を含む医薬組成物を提供する。組成物は加えて、例えば、心血管障害の処置または防止に適する1つまたは複数の他の治療剤も含有しうる。薬学的に許容される担体は、組成物を増強するかもしくは安定化させるか、または、組成物の調製を容易とするのに使用することもできる。薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。
本発明は、薬学的に許容される担体と併せて製剤化されたLOX−1結合性抗体(インタクトなまたは結合性断片)を含む医薬組成物を提供する。組成物は加えて、例えば、心血管障害の処置または防止に適する1つまたは複数の他の治療剤も含有しうる。薬学的に許容される担体は、組成物を増強するかもしくは安定化させるか、または、組成物の調製を容易とするのに使用することもできる。薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することができる。投与経路および/または投与方式は、所望される結果に応じて変化する。投与は、硝子体内投与、静脈内投与、筋内投与、腹腔内投与、もしくは皮下投与であるか、または標的部位に近接して投与することが好ましい。薬学的に許容される担体は、硝子体内投与、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与(例えば、注射または注入による)に適するものとする。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、二特異性分子および多特異性分子である抗体は、化合物を、化合物を不活化しうる酸および他の天然の状態の作用から保護する材料でコーティングすることができる。
組成物は、滅菌であり、かつ、流体であるものとする。適正な流体性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより維持することができ、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持し、界面活性剤を使用することにより維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどの多価アルコール、および塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長時間吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組み入れることによりもたらすことができる。
本発明の医薬組成物は、当技術分野において周知であり、日常的に実施されている方法に従い調製することができる。例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、Mack Publishing Co.、20版、2000;およびSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems、J.R. Robinson編、Marcel Dekker, Inc.、New York、1978を参照されたい。医薬組成物は、GMP条件下で製造することが好ましい。本発明の医薬組成物中では、LOX−1結合性抗体の治療的に有効な用量または治療的に効果的な用量を援用することが典型的である。LOX−1結合性抗体は、当業者に公知の従来の方法により、薬学的に許容される剤形へと製剤化する。投与レジメンは、所望される最適応答(例えば、治療的応答)をもたらすように調整する。例えば、単一のボーラスを投与することもでき、複数に分割された用量をある期間にわたり投与することもでき、治療状況の要件により指し示されるのに応じて、用量を比例的に低減するかまたは増大させることもできる。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を、投与量単位形態で製剤化することがとりわけ有利である。本明細書で使用される投与量単位形態とは、処置される対象のための単位投与量として適する、物理的に個別の単位を指す。各単位は、要求される医薬担体との関連で、所望の治療効果をもたらすように計算された、所定量の活性化合物を含有する。
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性とならずに、特定の患者、組成物、および投与方式に所望される治療的応答を達成するのに有効な量の有効成分を得るように変化させることができる。選択される投与量レベルは、援用される本発明の特定の組成物、またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時期、援用される特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、援用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および/または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康、および医療既往歴などの因子を含む様々な薬物動態因子に依存する。
医師または獣医師は、医薬組成物中で援用される本発明の抗体の投与を、所望の治療効果を達成するのに要求されるレベル未満のレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで、投与量を漸増させることができる。一般に、本明細書で記載される心血管障害を処置するのに有効な、本発明の組成物の用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるのか動物であるのか、投与される他の薬物、および処置が予防的であるのか治療的であるのかを含む、多くの異なる因子に応じて変化する。処置投与量は、安全性および有効性を最適化するように滴定することが必要である。抗体の全身投与では、投与量は、宿主の体重1kg当たり約0.0001〜100mgの範囲であり、より通例では、宿主の体重1kg当たり0.01〜15mgの範囲である。抗体の硝子体内投与では、投与量は、眼1つ当たり0.1mg〜眼1つ当たり5mgの範囲でありうる。例えば0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2.0mg/ml、2.1mg/ml、2.2mg/ml、2.3mg/ml、2.4mg/ml、2.5mg/ml、2.6mg/ml、2.7mg/ml、2.8mg/ml、2.9mg/ml、3.0mg/ml、3.1mg/ml、3.2mg/ml、3.3mg/ml、3.4mg/ml、3.5mg/ml、3.6mg/ml、3.7mg/ml、3.8mg/ml、3.9mg/ml、4.0mg/ml、4.1mg/ml、4.2mg/ml、4.3mg/ml、4.4mg/ml、4.5mg/ml、4.6mg/ml、4.7mg/ml、4.8mg/ml、4.9mg/ml、または5.0mg/ml。例示的な処置レジメは、2週間ごとに1回、または毎月1回、または3〜6カ月ごとに1回の全身投与を伴う。例示的な処置レジメは、2週間ごとに1回、または毎月1回、または3〜6カ月ごとに1回の全身投与、または必要に応じた(PRN)全身投与を伴う。
抗体は通例、複数回投与する。単回の投与の間の間隔は、毎週、毎月、または毎年でありうる。間隔はまた、患者におけるLOX−1結合性抗体の血中レベルを測定することにより指し示される通り、不規則でもありうる。加えて、医師が代替的な投与間隔を決定する場合もあり、毎月または効果的であるのに必要な間隔で投与する。全身投与のいくつかの方法では、投与量は、抗体の血漿中濃度1〜1000μg/mlを達成するように調整し、いくつかの方法では、25〜500μg/mlを達成するように調整する。代替的に、抗体は、持続放出製剤として投与することもでき、この場合は、低頻度の投与が要求される。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体の半減期より長い半減期を示す。投与量および投与頻度は、処置が予防的であるのか治療的であるのかに応じて変化しうる。予防的適用では、比較的低投与量を、比較的低頻度の間隔で、長期にわたり投与する。一部の患者には、彼らの余生にわたり処置を施し続ける。治療的適用では場合によって、比較的高投与量が、疾患の進行が軽減されるか終結するまで、比較的短い間隔で要求され、好ましくは、患者が、疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで要求される。その後、患者には、予防的レジメを投与することができる。
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために提示されるものであり、その範囲を限定するために提示されるものではない。当業者には、本発明の他の変形がたやすく明らかであろうし、添付の特許請求の範囲によっても包含される。
抗原としての使用のための、精製組換えヒト可溶性LOX−1の調製
ヒトCD33、精製タグ(EFHR)、およびBirAビオチニル化配列(GLNDIFEAQKIEWHE)に由来するN末端シグナルペプチド(配列番号384)を伴う、ヒトLOX−1ポリペプチドの細胞外ドメイン(アミノ酸残基61〜273)をコードする核酸配列を、哺乳動物細胞用発現ベクターである、pRS5aへとサブクローニングした。結果として得られるプラスミドである、pRS5a_APP−Avi−ヒト−sLOX−1(61〜273)を、HEK293T細胞へと、標準的なポリエチレンイミン(PEI)トランスフェクション法を使用して、一過性にトランスフェクトした。細胞は、Novartis培地M11V3(Bioconcept)中の懸濁培養液中で増殖させ、トランスフェクションは、Wave Bioreactorを使用して、培地5リットル中に、1ml当たり1.4×106個の細胞の最終細胞濃度で実行した。
ヒトCD33、精製タグ(EFHR)、およびBirAビオチニル化配列(GLNDIFEAQKIEWHE)に由来するN末端シグナルペプチド(配列番号384)を伴う、ヒトLOX−1ポリペプチドの細胞外ドメイン(アミノ酸残基61〜273)をコードする核酸配列を、哺乳動物細胞用発現ベクターである、pRS5aへとサブクローニングした。結果として得られるプラスミドである、pRS5a_APP−Avi−ヒト−sLOX−1(61〜273)を、HEK293T細胞へと、標準的なポリエチレンイミン(PEI)トランスフェクション法を使用して、一過性にトランスフェクトした。細胞は、Novartis培地M11V3(Bioconcept)中の懸濁培養液中で増殖させ、トランスフェクションは、Wave Bioreactorを使用して、培地5リットル中に、1ml当たり1.4×106個の細胞の最終細胞濃度で実行した。
トランスフェクションの5時間後、5リットルのExCell VPRO無血清培地(Sigma)を添加した。細胞は、37℃および5%のCO2で10日間にわたり増殖させた。次いで、細胞を、遠心分離により採取した後で、0.22ミクロンの滅菌フィルターで濾過した。清明化させた上清に、PBSで平衡化させた20mLの抗APPアフィニティー樹脂(Novartisの特許品)上を通過させた。カラムは、280nmにおけるベースラインの吸光度に達するまで、PBSで洗浄した。次いで、カラムを、1%のTriton X−100および0.3%のトリ−n−ブチルリン酸を含有する10カラム容量のPBSに続き、25カラム容量のPBSで洗浄した。次いで、sLOX−1タンパク質を、50mMのクエン酸ナトリウム、pH3.0で溶出させ、画分を、1Mのトリス、pH9.0 1/10容量で中和した。関与性の画分をプールし、PBSに対して十分に透析し、次いで、アリコート分割し、液体窒素中で瞬時凍結させた。解析的サイズ決定解析により、精製された可溶性LOX−1タンパク質材料が、このタンパク質の期待された形態である、>95%の二量体形態であることが示された。
ヒトLOX−1をトランスフェクトされたHEK293細胞の調製
抗LOX1特異的抗体の結合特異性および機能的活性について調べるために、ヒトLOX−1を安定的に過剰発現させるHEK293細胞を発生させた。標準的なLipofectamine 2000トランスフェクション法を使用して、HEK293−6E細胞に、全長ヒトLOX−1 cDNAおよびハイグロマイシン耐性をコードする哺乳動物用発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた培養物を、トランスフェクション後3日目に、LOX−1の表面における発現について、フローサイトメトリーにより査定し、次いで、ハイグロマイシン選択(200μg/ml)にかけて、安定的発現細胞について濃縮した。クローン集団は、2ラウンドにわたる逐次的な限界希釈により得、発現は、フローサイトメトリーにより確認した。培養物中で、4週間を超えて安定的なLOX−1の発現を維持するクローンだけを選択し、後続の抗体特徴付けアッセイにおいて使用した。
抗LOX1特異的抗体の結合特異性および機能的活性について調べるために、ヒトLOX−1を安定的に過剰発現させるHEK293細胞を発生させた。標準的なLipofectamine 2000トランスフェクション法を使用して、HEK293−6E細胞に、全長ヒトLOX−1 cDNAおよびハイグロマイシン耐性をコードする哺乳動物用発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた培養物を、トランスフェクション後3日目に、LOX−1の表面における発現について、フローサイトメトリーにより査定し、次いで、ハイグロマイシン選択(200μg/ml)にかけて、安定的発現細胞について濃縮した。クローン集団は、2ラウンドにわたる逐次的な限界希釈により得、発現は、フローサイトメトリーにより確認した。培養物中で、4週間を超えて安定的なLOX−1の発現を維持するクローンだけを選択し、後続の抗体特徴付けアッセイにおいて使用した。
ヒトFabファージライブラリーによるパニング
ファージミドライブラリーは、ファージ表面上にFabを提示するために、HuCAL(登録商標)概念(Knappik et al., 2000)に基づき、CysDisplay(登録商標)技術(Lohning, 2001)を援用する。
ファージミドライブラリーは、ファージ表面上にFabを提示するために、HuCAL(登録商標)概念(Knappik et al., 2000)に基づき、CysDisplay(登録商標)技術(Lohning, 2001)を援用する。
LOX−1に対する捕捉パニング:捕捉パニングのために、抗原であるLOX−1を、抗原へと融合させたAPP−Aviタグを指向する捕捉抗体(Novartisで調製されたマウス抗APPタグ捕捉抗体;バッチコード:ACE21514)を介して、96ウェルMaxisorp(商標)プレート上に固定化した。ファージによる選択のために、96ウェルMaxisorp(商標)プレートの適切な数(サブライブラリープールの数に応じた数)のウェルを、4℃で一晩にわたり、捕捉抗体でコーティングし、その後、抗原溶液を添加し、室温で少なくとも1時間にわたりインキュベートした。各パニングのために、約4×1013個のHuCAL PLATINUM(登録商標)ファージ−抗体を、粉乳およびBSAでブロッキングした。さらなるブロッキング試薬を、ブロッキング緩衝液へと添加して、タグまたは捕捉抗体(非類縁タンパク質His−APP−Aviおよびマウスガンマ−グロブリン)に対する抗体の選択を回避した。ブロッキング手順の後で、あらかじめブロッキングされたファージミックスを、十分にコーティングおよびブロッキングされた各抗原へと添加し、インキュベートした。その後、非特異的に結合したファージを、複数回にわたる洗浄ステップにより洗い落とした。特異的に結合したファージを溶出させるために、DTTを、ウェルへと、室温で10分間にわたり添加した。DTTによる溶出物を、大腸菌(E. coli)TG1へと導入した。ファージを感染させるために、大腸菌(E. coli)TG1と、DTTによる溶出物とのミックスを、水浴中37℃で45分間にわたりインキュベートした。細菌ペレットを、増殖培地中に再懸濁させ、LB/Cam寒天プレート上に播種し、一晩にわたりインキュベートした。コロニーを、プレートからこすり落とし、ファージのレスキュー、選択されたクローンのポリクローナル増幅、およびファージの産生のために使用した。精製されたファージにより、次のパニングラウンドを開始した。第2のラウンドおよび第3のラウンドの捕捉パニングを、より厳密な洗浄条件を除き、第1のラウンドのプロトコールに従い実施した。
LOX−1に対する、カルボキシビーズによるパニング:ビーズベースのパニングの前に、製造元のプロトコールに従い、抗原を、カルボキシビーズ(Dynabeads(登録商標)M−270 Carboxylic Acid、Invitrogen)上に固定化した。略述すると、カルボキシビーズの活性化を、NHSの存在下で、カルボジイミドにより実施した後で、抗原であるLOX−1(アミンを含有する)をカップリングさせる結果として、ビーズと抗原との間の安定的なアミド結合をもたらした。ファージプール1つ当たり、1×107個の抗原でコーティングしたビーズを、PBS、Tween20、および粉乳を使用してブロッキングした。並行して、各パニングのために、HuCAL PLATINUM(登録商標)ファージ−抗体を、等容量のPBS、Tween20、および粉乳でブロッキングした。次いで、1×107個の、ブロッキングされた抗原コーティングビーズを、あらかじめ吸着させ、ブロッキングしたファージ粒子へと添加し、室温でインキュベートした。抗原でコーティングしたビーズに結合したファージ粒子を、磁気分離器で回収した。非特異的に結合したファージを、複数回にわたる洗浄ステップにより洗い落とし、DTTを使用して、特異的に結合したファージを、抗原でコーティングしたビーズから溶出させた。次いで、DTTによる溶出物を、大腸菌(E. coli)TG1へと導入し、ファージを感染させるために、TG1とDTTによる溶出物とのミックスを、37℃でインキュベートした。細菌ペレットを、増殖培地中に再懸濁させ、LB/Cam寒天プレート上に播種し、インキュベートした。コロニーを、プレートからこすり落とし、ファージのレスキュー、選択されたクローンのポリクローナル増幅、およびファージの産生のために使用した。精製されたファージにより、次のパニングラウンドを開始した。第2のラウンドおよび第3のラウンドのビーズベースのパニングを、より厳密な洗浄条件を除き、第1のラウンドのプロトコールに従い実施した。
LOX−1に対する、ストレプトアビジンとカップリングさせた磁気ビーズによる溶液パニング:溶液パニングの前に、抗原をビオチニル化させ、ビオチニル化させたLOX−1抗原の活性の保持を確認した。溶液パニングでは、Fabを提示するファージと、ビオチニル化させた抗原とを、抗原の、ファージへの接近可能性を促進する溶液中でインキュベートした。各ファージプール、ストレプトアビジンビーズ(Dynabeads(登録商標)M−280 Streptavidin;Invitrogen)を、1倍濃度のChemiblocker中でブロッキングした。並行して、各パニングのために、約4×1013個のHuCAL PLATINUM(登録商標)ファージ−抗体を、等容量の2倍濃度Chemiblocker/Tween20でブロッキングした。次いで、100nMのビオチニル化抗原であるLOX−1を、あらかじめ吸着させ、ブロッキングしたファージ粒子へと添加し、ローテーター上、室温でインキュベートした。ファージ−抗原複合体を、2mgの、ブロッキングされたストレプトアビジンビーズを使用して捕捉し、ストレプトアビジンビーズに結合したファージ粒子を、磁気分離器で回収した。Tween20およびPBSを使用して、非特異的に結合したファージを、複数回にわたる洗浄ステップにより洗い落とし、DTTを使用して、特異的に結合したファージを、ストレプトアビジンビーズから溶出させた。次いで、DTTによる溶出物を、大腸菌(E. coli)TG1へと導入し、ファージを感染させるために、TG1とDTTによる溶出物とのミックスを、37℃でインキュベートした。細菌ペレットを、増殖培地中に再懸濁させ、LB/Cam寒天プレート上に播種し、一晩にわたりインキュベートした。コロニーを、プレートからこすり落とし、ファージのレスキュー、選択されたクローンのポリクローナル増幅、およびファージの産生のために使用した。精製されたファージにより、次のパニングラウンドを開始した。第2のラウンドおよび第3のラウンドの溶液パニングを、より厳密な洗浄条件を除き、第1のラウンドのプロトコールに従い実施した。
LOX−1に対する全細胞パニング:各パニングのために、約4×1013個のHuCAL PLATINUM(登録商標)ファージ−抗体を、FCS中でブロッキングした。並行して、ファージプールごとに、抗原であるLOX−1を発現させる標的細胞と、抗原であるLOX−1の発現を伴わない吸着細胞とを再懸濁させ、FCSを使用してブロッキングした。ブロッキングされた標的細胞をスピンダウンし、あらかじめブロッキングされたファージ粒子中に再懸濁させ、インキュベートした。ファージ−細胞複合体を、3回にわたり洗浄した。特異的に結合したファージの、標的細胞からの溶出は、酸性溶出により実施した。遠心分離の後、上清(溶出物)を、非緩衝トリスを添加することにより中和した。吸着ステップの後、上清を、大腸菌(E. coli)TG1培養物への感染のために使用し、ファージを感染させるために、37℃でインキュベートした。細菌ペレットを、増殖培地中に再懸濁させ、LB/Cam寒天プレート上に播種し、一晩にわたりインキュベートした。コロニーを、プレートからこすり落とし、ファージのレスキューおよびファージの増幅のために使用した。増幅されたファージを、次のパニングラウンドのために使用した。第2のラウンドおよび第3のラウンドの全細胞パニングを、より厳密な洗浄条件を除き、第1のラウンドのプロトコールに従い実施した。
LOX−1に対する、示差的全細胞パニング:示差的全細胞パニングでは、上記で記載した手順に従い、LOX−1発現細胞および精製LOX−1タンパク質に対する交代式選択を実施した。2つの異なる戦略:細胞に対する2ラウンド(第1のラウンドおよび第3のラウンド;細胞−タンパク質−細胞)の選択、または1ラウンド(第2のラウンド;タンパク質−細胞−タンパク質)の選択を適用した。
アフィニティー成熟によるパニング:選択された抗体断片のアフィニティーおよび生物学的活性を増大させるために、トリヌクレオチドにより方向づけられた突然変異誘発(Virnekas et al., 1994)を使用するカセット突然変異誘発により、軽鎖CDR3(L−CDR3)領域と重鎖CDR2(H−CDR2)領域とを並行して最適化する一方で、フレームワーク領域は一定に保った。アフィニティー成熟についてクローニングする前に、親Fab断片を、対応する発現ベクターであるpM(登録商標)x11から、CysDisplay(登録商標)ベクターであるpMORPH(登録商標)30へと導入した。
親Fab断片のL−CDR3を最適化するために、軽鎖のL−CDR3、フレームワーク、および定常領域を、サブクローニングにより、フレームワーク4および定常ドメインと併せて、多様化させたL−CDR3のレパートリーで置きかえた。第2のライブラリーセット内では、H−CDR2を多様化させる一方で、接続するフレームワーク領域は一定に保った。このライブラリーサイズにより、理論上の多様性のカバレッジが確保された。ライブラリーの増幅は、他の場所(Rauchenberger et al., 2003)で記載される通りに実施した。品質管理のために、単一のクローンをランダムに採取し、配列決定した。
アフィニティーが改善された結合剤を選択するために、成熟ライブラリーから導出されたファージを、LOX−1を使用する、3ラウンドの溶液パニングにかけた。厳密性は、より厳密な洗浄ステップと組み合わせて、各パニングラウンドにおける抗原濃度を低下させること(Low et al., 1996)により増大させた。
IgGの発現および精製
全長IgGを発現させるために、重鎖(VH)および軽鎖(VL)の可変ドメイン断片を、Fab発現ベクターから、ヒトIgG1f_LALAに適するpMorph(登録商標)_hIgベクターへとサブクローニングした。制限酵素であるMfeI、BlpIは、VHドメイン断片を、pMorph(登録商標)4ベクターへとサブクローニングするために使用し、EcoRV、BsiWI、HpaIは、VLドメイン断片を、pMorph(登録商標)4ベクターへとサブクローニングするために使用した。RapCLONE(登録商標)を実施して、Fabクローンを、IgGフォーマットへと転換した。
全長IgGを発現させるために、重鎖(VH)および軽鎖(VL)の可変ドメイン断片を、Fab発現ベクターから、ヒトIgG1f_LALAに適するpMorph(登録商標)_hIgベクターへとサブクローニングした。制限酵素であるMfeI、BlpIは、VHドメイン断片を、pMorph(登録商標)4ベクターへとサブクローニングするために使用し、EcoRV、BsiWI、HpaIは、VLドメイン断片を、pMorph(登録商標)4ベクターへとサブクローニングするために使用した。RapCLONE(登録商標)を実施して、Fabクローンを、IgGフォーマットへと転換した。
HKB11真核細胞に、IgGの重鎖および軽鎖の両方をコードする、pMORPH(登録商標)4真核生物用発現ベクターDNAをトランスフェクトした。トランスフェクション後3または7日目に細胞培養物上清を採取し、標準的なプロテインAアフィニティークロマトグラフィー(MabSelect SURE、GE Healthcare)にかけた。全ての試料を滅菌濾過した(0.2μmの小孔サイズ)。IgGの純度は、Labchip System(Caliper GXII、Perkin Elmer)を使用して、またはSDS−PAGE上で、変性条件下、還元条件下、および非還元条件下において解析した。タンパク質濃度は、UV分光光度法により決定し、HP−SECを実施して、天然状態のIgG調製物を解析した。
FabおよびIgGによる、OxLDLまたはMDA−LDLの、LOX−1への結合の阻害
実施例1で記載した通りに調製される、精製APP−Avi−可溶性ヒト可溶性LOX−1(61〜273)タンパク質を、以下の通りにビオチニル化させた:50mMのビシン(pH8.3)緩衝液中に、約1mg/mLの最終濃度の精製可溶性LOX−1タンパク質(8〜10mg)を、10mMのATP、10mMの酢酸マグネシウム、0.1mMのビオチン、およびBirAビオチンリガーゼ(Avidity)の存在下において、30℃で1時間にわたりインキュベートし、次いで、4℃で一晩にわたり静置した。次いで、タンパク質を、PBSで平衡化させた、S200 Superdex 16/60カラムを使用して精製した。関与性の画分をプールし、タンパク質を、約1mg/mLの濃度まで濃縮し、アリコート分割し、液体窒素中で瞬時凍結させた。ビオチニル化パーセントは、非ビオチニル化試料およびビオチニル化試料の、質量分析によるペプチドマッピングにより評価した。ビオチニル化収率は>95%であり、非ビオチニル化材料は検出されないことが典型的であった。解析的サイズ決定解析により、ビオチニル化させた材料が、このタンパク質の期待された形態である、100%の二量体形態であることが示された。
実施例1で記載した通りに調製される、精製APP−Avi−可溶性ヒト可溶性LOX−1(61〜273)タンパク質を、以下の通りにビオチニル化させた:50mMのビシン(pH8.3)緩衝液中に、約1mg/mLの最終濃度の精製可溶性LOX−1タンパク質(8〜10mg)を、10mMのATP、10mMの酢酸マグネシウム、0.1mMのビオチン、およびBirAビオチンリガーゼ(Avidity)の存在下において、30℃で1時間にわたりインキュベートし、次いで、4℃で一晩にわたり静置した。次いで、タンパク質を、PBSで平衡化させた、S200 Superdex 16/60カラムを使用して精製した。関与性の画分をプールし、タンパク質を、約1mg/mLの濃度まで濃縮し、アリコート分割し、液体窒素中で瞬時凍結させた。ビオチニル化パーセントは、非ビオチニル化試料およびビオチニル化試料の、質量分析によるペプチドマッピングにより評価した。ビオチニル化収率は>95%であり、非ビオチニル化材料は検出されないことが典型的であった。解析的サイズ決定解析により、ビオチニル化させた材料が、このタンパク質の期待された形態である、100%の二量体形態であることが示された。
NeutrAvidin 384ウェルプレートを、PBS中で希釈された2.5μg/mlのビオチニル化LOX−1でコーティングした。PBS中に25%のBlock Ace(AbD Serotec;型番BUF029)でブロッキングした後で、PBS/1%のBSA中で希釈された精製Fabまたは精製IgGを添加した。その後、PBS/1%のBSA中で希釈された、OxLDL(硫酸銅により酸化されたLDL;Kalen Biomedical;型番770202)リガンド、またはMDA−LDL(Academy Biomedical;型番20P−MD−L102)リガンドを、コーティングされたLOX−1に結合させた。PBS/1%のBSA中で1:1,000に希釈された二次抗体(HRPコンジュゲートヒツジ抗ApoB IgG;結合部位)を添加した後で、TMB基質(Thermo Scientific)を添加した。10分間後、1MのH2SO4を添加し、吸光度を、450nmで決定した。初期スクリーニング時のこのoxLDL結合アッセイはまた、Fabを含有する粗大腸菌(E. coli)溶解物を使用して、Fab断片についても調べた。
FabおよびIgGによる、AGE−BSAの、LOX−1への結合の阻害
実施例1で記載した通りに調製される、精製APP−Avi−可溶性ヒト可溶性LOX−1(61〜273)タンパク質を、実施例5で記載した通りにビオチニル化させた。NeutrAvidin 384ウェルプレートを、重炭酸緩衝液(Thermo Scientific)中で希釈された5μg/mlのビオチニル化LOX−1でコーティングした。PBS/2%のBSA/0.1%のTween20/0.1%のTritonX−100でブロッキングした後で、PBS/2%のBSA/0.1%のTween20/0.1%のTritonX−100中で希釈された精製Fabまたは精製IgGを添加した。その後、PBS/2%のBSA/0.1%のTween20/0.1%のTritonX−100中で希釈されたAGE−BSAリガンド(R&D Systems;型番BT4127)を、コーティングされたLOX−1に結合させた。PBS/2%のBSA/0.1%のTween20/0.1%のTritonX−100中で1:200に希釈された、ストレプトアビジン−HRP(R&D Systems)を添加した後で、TMB基質(Thermo Scientific)を添加した。10分間後、1MのH2SO4を添加し、吸光度を、450nmで決定した。アッセイの成績は、ブロッキング溶液および希釈溶液のために使用されるBSAの種類の影響を受けた。アッセイの成績を最適化するために、Sigma製のBSA(型番A4503)を使用した。
実施例1で記載した通りに調製される、精製APP−Avi−可溶性ヒト可溶性LOX−1(61〜273)タンパク質を、実施例5で記載した通りにビオチニル化させた。NeutrAvidin 384ウェルプレートを、重炭酸緩衝液(Thermo Scientific)中で希釈された5μg/mlのビオチニル化LOX−1でコーティングした。PBS/2%のBSA/0.1%のTween20/0.1%のTritonX−100でブロッキングした後で、PBS/2%のBSA/0.1%のTween20/0.1%のTritonX−100中で希釈された精製Fabまたは精製IgGを添加した。その後、PBS/2%のBSA/0.1%のTween20/0.1%のTritonX−100中で希釈されたAGE−BSAリガンド(R&D Systems;型番BT4127)を、コーティングされたLOX−1に結合させた。PBS/2%のBSA/0.1%のTween20/0.1%のTritonX−100中で1:200に希釈された、ストレプトアビジン−HRP(R&D Systems)を添加した後で、TMB基質(Thermo Scientific)を添加した。10分間後、1MのH2SO4を添加し、吸光度を、450nmで決定した。アッセイの成績は、ブロッキング溶液および希釈溶液のために使用されるBSAの種類の影響を受けた。アッセイの成績を最適化するために、Sigma製のBSA(型番A4503)を使用した。
LOX−1抗体による、OxLDLの、LOX−1タンパク質への結合の阻害
oxLDLの、LOX−1タンパク質への結合を阻害するLOX−1抗体の能力は、実施例4で記載した方法を使用して決定した。このアッセイでは、硫酸銅に媒介されたLDLの酸化により発生させた、Kalen Biomedical製の「high binding OxLDL」(型番770212−7)に加えて、他の2つの形態の修飾LDL:マロンジアルデヒドで修飾されたLDL(Academy Bio−Medical Co.;型番20P−MD−L105)、および次亜塩素酸で修飾されたLDLについても調べた。次亜塩素酸で修飾されたLDLは、以下の手順に従い調製した。ヒトLDL(Kalen Biomedical;型番770200−4)は、PBSで、0.25mg/mLの最終濃度まで希釈した。次いで、次亜塩素酸ナトリウム(NaOCl;JT Baker;型番9416−01)を、0.1mMの最終濃度まで添加した。溶液を、室温で4時間にわたりインキュベートし、次いで、200μlの総容量当たり100mMのメチオニン5μlを添加して、L−メチオニンを反応の最終濃度まで添加することにより、反応を停止させた。硫酸銅により酸化されたLDL(oxLDL)の、LOX−1への結合の、LOX−1抗体による阻害を示す代表的なデータを、図1A〜1Bに示し、表3、5、および7に記載する。
oxLDLの、LOX−1タンパク質への結合を阻害するLOX−1抗体の能力は、実施例4で記載した方法を使用して決定した。このアッセイでは、硫酸銅に媒介されたLDLの酸化により発生させた、Kalen Biomedical製の「high binding OxLDL」(型番770212−7)に加えて、他の2つの形態の修飾LDL:マロンジアルデヒドで修飾されたLDL(Academy Bio−Medical Co.;型番20P−MD−L105)、および次亜塩素酸で修飾されたLDLについても調べた。次亜塩素酸で修飾されたLDLは、以下の手順に従い調製した。ヒトLDL(Kalen Biomedical;型番770200−4)は、PBSで、0.25mg/mLの最終濃度まで希釈した。次いで、次亜塩素酸ナトリウム(NaOCl;JT Baker;型番9416−01)を、0.1mMの最終濃度まで添加した。溶液を、室温で4時間にわたりインキュベートし、次いで、200μlの総容量当たり100mMのメチオニン5μlを添加して、L−メチオニンを反応の最終濃度まで添加することにより、反応を停止させた。硫酸銅により酸化されたLDL(oxLDL)の、LOX−1への結合の、LOX−1抗体による阻害を示す代表的なデータを、図1A〜1Bに示し、表3、5、および7に記載する。
LOX−1抗体による、OxLDLの、LOX−1/HEK293細胞への結合の阻害
huLOX−1/HEK293細胞は、10%のFBSおよび1%のペニシリン−ストレプトマイシンを、含有するDMEM中で、75cm2の表面積当たり20mlの培養培地を含有するT型フラスコ内の接着性単層として維持した。細胞は、加湿されたインキュベーター内に、5%のCO2および37℃でインキュベートし、2〜3日ごとに継代培養した。細胞を継代培養するために、培養培地を除去し、単層を、10〜20mlのあらかじめ加熱されたPBSで1回洗浄する。洗浄した後で、1mlのあらかじめ加熱されたTrypLE Expressを添加し、細胞を、37℃で5分間にわたりインキュベートした。次いで、あらかじめ加熱された新鮮な培養培地を添加した。
huLOX−1/HEK293細胞は、10%のFBSおよび1%のペニシリン−ストレプトマイシンを、含有するDMEM中で、75cm2の表面積当たり20mlの培養培地を含有するT型フラスコ内の接着性単層として維持した。細胞は、加湿されたインキュベーター内に、5%のCO2および37℃でインキュベートし、2〜3日ごとに継代培養した。細胞を継代培養するために、培養培地を除去し、単層を、10〜20mlのあらかじめ加熱されたPBSで1回洗浄する。洗浄した後で、1mlのあらかじめ加熱されたTrypLE Expressを添加し、細胞を、37℃で5分間にわたりインキュベートした。次いで、あらかじめ加熱された新鮮な培養培地を添加した。
huLOX−1/HEK293細胞を、1mL当たり1×106個の細胞で再懸濁させ、ウェル1つ当たり50μLを、96ウェルV型底プレートへと播種した(ウェル1つ当たり5×104個の細胞)。次いで、アッセイ培地(DMEM+10%のFBS)中のLOX−1抗体または非関与性の対照抗体を、細胞へと添加した。典型的な最終抗体濃度は、0.006μg/mL〜20μg/mLの範囲とした。細胞を、37℃で1時間にわたりインキュベートし、次いで、加熱されたHBSSで2回にわたり洗浄した。次いで、50ulのアッセイ培地中のDil−oxLDL(ヒトdiI標識「High Oxidized」LDL;Kalen Biomedical;型番770262−9;DiIとは、1,1’−ジオクタデシル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロレートである)を、30〜100μg/mLの最終濃度まで添加した。次いで、細胞を、37℃で2時間にわたりインキュベートし、次いで、FACS緩衝液(PBS中に2%のFBS)で2回にわたり洗浄した。次いで、図2A〜2Bおよび表3に描示する通り、細胞を、フローサイトメトリーにより、Di−I蛍光の強度について解析した。
OxLDL誘導活性酸素種(ROS)産生アッセイ
LOX−1抗体または非関与性の対照抗体を、単独または(Fab)2架橋剤(ポリクローナルヤギ抗ヒトIgG Fc(Fab)2;Abcam;型番ab98526))の存在下、0.05mLのアッセイ培地(DMEM+10%のFBS)中に2倍の最終濃度で、室温で15分間にわたりインキュベートした。(Fab)2架橋剤の、LOX−1抗体に対する比を変化させ、1:1および1:2の比を組み入れた。LOX−1抗体または対照抗体単独(架橋剤を伴わない)による用量応答実験では、0.005μg/mL〜20μg/mLの範囲の抗体濃度を使用した。抗体単独を、架橋剤を伴う抗体と比較する実験では、0.03μg/mL〜20μg/mLの範囲の抗体濃度を使用した。
LOX−1抗体または非関与性の対照抗体を、単独または(Fab)2架橋剤(ポリクローナルヤギ抗ヒトIgG Fc(Fab)2;Abcam;型番ab98526))の存在下、0.05mLのアッセイ培地(DMEM+10%のFBS)中に2倍の最終濃度で、室温で15分間にわたりインキュベートした。(Fab)2架橋剤の、LOX−1抗体に対する比を変化させ、1:1および1:2の比を組み入れた。LOX−1抗体または対照抗体単独(架橋剤を伴わない)による用量応答実験では、0.005μg/mL〜20μg/mLの範囲の抗体濃度を使用した。抗体単独を、架橋剤を伴う抗体と比較する実験では、0.03μg/mL〜20μg/mLの範囲の抗体濃度を使用した。
ヒトLOX−1を発現させる細胞(huLOX1/HEK293)を、TrypLE Express(Invitrogen;型番12605−010)を使用して解離させ、PBSで1回洗浄した。次いで、細胞を、アッセイ培地(DMEM+10%のFBS)中1mL当たり2×106個の細胞で再懸濁させ、ウェル1つ当たり50μlで(ウェル1つ当たり1×105個の細胞で)、96ウェルV型底プレート(Costar;型番3894)へと播種した。架橋Fab(上記で記載した通りに調製した)を伴うかまたは伴わない、ウェル1つ当たり50μlのLOX−1(または対照)抗体溶液を添加し、混合物を、37℃で15分間にわたりインキュベートした。OxLDL(アッセイ緩衝液中、ウェル1つ当たり0.1mL;Kalen製の「High oxLDL」;型番770252−7)を、25μg/mLの最終濃度まで添加し、結果として生じる混合物を、37℃で100分間にわたりインキュベートした。H2DCFDAは、アッセイ培地中、ウェル1つ当たり0.1mLで希釈し、5〜10μMの最終濃度まで添加し、混合物を、37℃で15分間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、カルシウムおよびマグネシウムを含有する、ウェル1つ当たり200μlのHBSSで1回洗浄し、ウェル1つ当たり200μlの冷却したFACS緩衝液(PBS中2%のFBS)で1回洗浄し、ウェル1つ当たり50〜100μLの、冷却したFACS緩衝液中に再懸濁させた。H2DCFDAの酸化の結果として発生した蛍光は、フローサイトメーター(励起:488nm;発光:500/530nm)を使用して測定した。例示的な結果を、図3および4A〜4G、ならびに表4、5、および6に示す。
LOX−1抗体は、ヒト好中球上の内因性LOX−1に結合する
Thermo Scientific製のキット(EZ−Link Micro NHS−PEO4−Biotinylation Kit;Thermo Scientific;型番21955)を使用して、LOX−1抗体であるMOR20225、MOR20228、MOR20229、MOR20230、MOR20231、MOR20234、およびアイソタイプをマッチさせた対照抗体を、ビオチニル化させた。略述すると、PBS緩衝液中の抗体を、50倍モル過剰量のNHS−ビオチン試薬と共に、室温で60分間にわたりインキュベートした。次いで、PBS中で平衡化させ、製造元の指示書に従い使用される、脱塩スピンカラム(Zeba Desalt Spin Column 7K MWCO、Thermo Scientific;型番89882)を使用して、ビオチニル化させた抗体を、過剰量のビオチニル化試薬から分離した。ビオチニル化させた抗体の濃度は、280nmにおけるその吸光度の測定に基づき決定した。
Thermo Scientific製のキット(EZ−Link Micro NHS−PEO4−Biotinylation Kit;Thermo Scientific;型番21955)を使用して、LOX−1抗体であるMOR20225、MOR20228、MOR20229、MOR20230、MOR20231、MOR20234、およびアイソタイプをマッチさせた対照抗体を、ビオチニル化させた。略述すると、PBS緩衝液中の抗体を、50倍モル過剰量のNHS−ビオチン試薬と共に、室温で60分間にわたりインキュベートした。次いで、PBS中で平衡化させ、製造元の指示書に従い使用される、脱塩スピンカラム(Zeba Desalt Spin Column 7K MWCO、Thermo Scientific;型番89882)を使用して、ビオチニル化させた抗体を、過剰量のビオチニル化試薬から分離した。ビオチニル化させた抗体の濃度は、280nmにおけるその吸光度の測定に基づき決定した。
好中球を、健常ドナーから得られたヒト血液試料から単離した。略述すると、ヒト全血液を、EDTAを含有するバイアル内に回収した。10mLの血液試料へと、10mLの沈降緩衝液(3%のデキストラン、0.9%の塩化ナトリウム)を添加し、結果として得られる溶液を静かに混合し、室温で20分間にわたり静置した。白血球に富む血漿を含む上層を、4℃、1200rpm(250×g)で10分間にわたり遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、室温、10mLの0.9%の塩化ナトリウム中に速やかに再懸濁させた。結果として得られる細胞懸濁液を、10mLのFicoll−Paqueを含有する50mLの円錐型試験管へと注意深く移し、Ficoll−Paqueの上に細胞懸濁液を成層させ、次いで、試験管を、室温、1400rpm(400×g)で、ブレーキをかけずに、30分間にわたり遠心分離した。次いで、上層を廃棄した。結果として得られる細胞ペレットへと、10mLの0.2%の氷冷塩化ナトリウムを添加し、混合物を、正確に30秒間にわたりインキュベートして、赤血球を溶解させ、次いで、1.6%の氷冷塩化ナトリウム10mLを添加して、等張性を回復させた。次いで、細胞懸濁液を、1200rpm(250×g)で5分間にわたり遠心分離した。上清を廃棄し、赤血球溶解手順を今一度繰り返した。結果として得られる細胞ペレットを、FACS緩衝液(PBS中に2mMのEDTA、1%のBSA、および0.2%のアジ化ナトリウム)中に、1mL当たり2×106個の細胞の細胞密度で再懸濁させた。
単離したばかりのヒト好中球を含有する細胞懸濁液を、96ウェルV型底プレートのウェル(ウェル1つ当たり1×105個の細胞で)(Costar;型番3894)へと移した(ウェル1つ当たり50μl)。ブロッキング緩衝液(FACS緩衝液(PBS中に2mMのEDTA、1%のBSA、および0.2%のアジ化ナトリウム)中で希釈された、4%の正常ウサギ血清)(ウェル1つ当たり50μl)を添加し、プレートを、氷上で30分間にわたりインキュベートした。FACS緩衝液中のビオチニル化LOX−1抗体またはビオチニル化アイソタイプ対照抗体を、ウェルへと、2、5、および20μg/mlの最終濃度まで添加し、プレートを、氷上で30分間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、1200rpm(250〜300×g)で3分間にわたり遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、0.2mLのFACS緩衝液で2回にわたり洗浄し、次いで、FACS緩衝液中で1:250に希釈された、0.1mLのPE−ストレプトアビジン(BD Pharmingen;型番554061)を添加し、プレートを、氷上で30分間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを再度遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を、0.2mLのFACS緩衝液で2回にわたり洗浄した。次いで、細胞を、0.05mLの固定緩衝液(2%のパラホルムアルデヒドを伴うFACS緩衝液)中に再懸濁させ、FACS測定器を使用して解析した。LOX−1抗体は、ヒト好中球に結合することが見出されたのに対し、アイソタイプ対照抗体の、ヒト好中球への結合は、検出されなかった(図5)。
LOX−1抗体結合アッセイにおける使用のための、精製組換えカニクイザル可溶性LOX−1の調製
カニクイザルLOX−1のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を決定するために、全RNAを、3匹の個別のサルから得られた臓器:Zyagen/GW製の1匹の個体に由来する3つの臓器、およびCovance,Inc製の2匹の個体に由来する12の臓器から抽出した。次いで、全RNAを、公開データベース(Uniprot;NCBI)に従いデザインされた、非翻訳領域に由来するプライマーを使用するPCR増幅のために使用した。標準的な配列決定法を使用して、増幅されたLOX−1 mRNAの核酸配列を決定した。カニクイザルLOX−1(アミノ酸61〜273に対応する)の細胞外ドメイン内で、3匹の個別のサルに由来するカニクイザルLOX−1のアミノ酸配列は同一であった。
カニクイザルLOX−1のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を決定するために、全RNAを、3匹の個別のサルから得られた臓器:Zyagen/GW製の1匹の個体に由来する3つの臓器、およびCovance,Inc製の2匹の個体に由来する12の臓器から抽出した。次いで、全RNAを、公開データベース(Uniprot;NCBI)に従いデザインされた、非翻訳領域に由来するプライマーを使用するPCR増幅のために使用した。標準的な配列決定法を使用して、増幅されたLOX−1 mRNAの核酸配列を決定した。カニクイザルLOX−1(アミノ酸61〜273に対応する)の細胞外ドメイン内で、3匹の個別のサルに由来するカニクイザルLOX−1のアミノ酸配列は同一であった。
ヒトCD33、精製タグ(EFHR)、およびBirAビオチニル化配列(GLNDIFEAQKIEWHE)に由来するN末端シグナルペプチド(配列番号385;表2)を伴う、カニクイザルLOX−1ポリペプチドの細胞外ドメイン(アミノ酸残基61〜273)をコードする核酸配列を、哺乳動物細胞用発現ベクターであるpRS5aへとサブクローニングした。カニクイザル可溶性LOX−1の発現および精製は、実施例1でヒト可溶性LOX−1について記載した方法と同じ方法を使用して実行した。成熟APP−Avi−可溶性カニクイザルLOX−1(61〜273)のアミノ酸配列を、表2に示す。いくつかの実験では、実施例5でヒト可溶性LOX−1について記載した方法と同じ方法を使用して、カニクイザル可溶性LOX−1タンパク質をビオチニル化させた。
溶液平衡滴定(SET)アッセイによる抗体の解離定数の決定
溶液平衡滴定(SET)を使用する、抗LOX−1 IgGのアフィニティーの決定は基本的に、文献(Friguet et al., 1985 J Immunol Methods 77: 305-319)において記載されている通りに実施した。アッセイは、96ウェルポリプロピレンプレート(Thermo Scientific;型番AB−1127)内で、異なる濃度の非ビオチニル化ヒトLOX−1タンパク質または非ビオチニル化カニクイザルLOX−1タンパク質と混合された一定濃度のLOX−1抗体を使用して実施し、一定の振とう(300rpm)を伴って、22℃で14時間にわたりインキュベートした。
溶液平衡滴定(SET)を使用する、抗LOX−1 IgGのアフィニティーの決定は基本的に、文献(Friguet et al., 1985 J Immunol Methods 77: 305-319)において記載されている通りに実施した。アッセイは、96ウェルポリプロピレンプレート(Thermo Scientific;型番AB−1127)内で、異なる濃度の非ビオチニル化ヒトLOX−1タンパク質または非ビオチニル化カニクイザルLOX−1タンパク質と混合された一定濃度のLOX−1抗体を使用して実施し、一定の振とう(300rpm)を伴って、22℃で14時間にわたりインキュベートした。
あらかじめブロッキングされたMSDプレート(Meso Scale Discovery;型番L21SA)上で、ビオチニル化ヒト可溶性LOX−1タンパク質またはビオチニル化カニクイザル可溶性LOX−1タンパク質を固定化し、その後、洗浄した。次いで、平衡結合反応を、LOX−1を固定化したMSDプレートへと適用し、30分間にわたりインキュベートした。結合しなかった材料は、プレートを洗浄することにより除去し、捕捉された抗体は、Sulfoタグ付けされたヤギ抗ヒトIgG(Meso Scale Discovery;型番R3AJ−1)を添加することにより検出した。インキュベーションおよび1回の洗浄後、MSD read buffer T(Meso Scale Discovery;型番R92TC−2)を添加し、Sector Imager 6000(Meso Scale Discovery)を使用して、プレートを現像した。解析のためにデータを、Excelへと移し、GraphPad Prism v5を使用してプロットした。KD値は、データを、以下の式:
[式中、Bmaxは、LOX−1タンパク質が溶液中に存在しない場合のシグナルであり、CAbは、溶液中のLOX−1抗体の一定の濃度であり、CAgは、溶液中の可溶性LOX−1の濃度であり、KDは、平衡結合定数である]へと当てはめることにより決定した。
[式中、Bmaxは、LOX−1タンパク質が溶液中に存在しない場合のシグナルであり、CAbは、溶液中のLOX−1抗体の一定の濃度であり、CAgは、溶液中の可溶性LOX−1の濃度であり、KDは、平衡結合定数である]へと当てはめることにより決定した。
参照による組込み
本明細書で引用される全ての参考文献であって、特許、特許出願、論文、教科書などを含む参考文献、およびそれらにおいて引用された参考文献は、それらについて既に言及した程度において、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
本明細書で引用される全ての参考文献であって、特許、特許出願、論文、教科書などを含む参考文献、およびそれらにおいて引用された参考文献は、それらについて既に言及した程度において、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
同等物
前出の明細書は、当業者が、本発明を実施することを可能とするのに十分であると考えられる。前出の記載および実施例は、本発明のある種の好ましい実施形態について詳述し、本発明者らにより企図される最良の方式について記載する。しかし、前出の記載および実施例が、本文中でいかに詳述されているように見えるとしても、本発明は、多くの様式で実施することができ、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらの任意の同等物に従うとみなされるべきであることが察知されるであろう。
前出の明細書は、当業者が、本発明を実施することを可能とするのに十分であると考えられる。前出の記載および実施例は、本発明のある種の好ましい実施形態について詳述し、本発明者らにより企図される最良の方式について記載する。しかし、前出の記載および実施例が、本文中でいかに詳述されているように見えるとしても、本発明は、多くの様式で実施することができ、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらの任意の同等物に従うとみなされるべきであることが察知されるであろう。
Claims (65)
- 単離抗LOX−1抗体またはその断片。
- LOX−1のリガンド結合性ドメインに結合する、単離抗LOX−1抗体またはその断片。
- LOX−1のエピトープに結合する単離抗体またはその断片であって、前記エピトープが、LOX−1のアミノ酸残基100〜109、207〜218、または228〜246を含む、単離抗体またはその断片。
- OxLDLの、LOX−1タンパク質への結合を遮断する、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または断片。
- oxLDL誘導活性酸素種(ROS)産生を阻害する、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または断片。
- Biacoreにより測定される34pM以下のKD、または溶液平衡滴定アッセイ(SET)により測定される4pM以下のKDで、ヒトLOX−1タンパク質に結合する、単離抗体またはその断片。
- 表1に列挙されたCDRのうちの少なくとも1つに対して少なくとも95%の同一性を有する少なくとも1つの相補性決定領域を含む、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または断片。
- 表1のCDR1、CDR2、およびCDR3を含む、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または断片。
- 表1のCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、変異体が、CDR1、CDR2、またはCDR3のうちの1つにおいて、少なくとも1〜4カ所のアミノ酸変化を有する、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または断片。
- ヒトLOX−1に結合する単離抗体またはその断片であって、配列番号5、25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225、245、265、285、305、325、345、および365からなる群から選択される重鎖CDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- ヒトLOX−1に結合する単離抗体またはその断片であって、配列番号9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、および369からなる群から選択されるVH;ならびに配列番号19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239、259、279、299、319、339、359、および379からなる群から選択されるVLまたは97〜99%の同一性を有するそのアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、および369からなる群から選択される可変重鎖配列を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239、259、279、299、319、339、359、および379からなる群から選択される可変軽鎖配列を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、および369からなる群から選択される可変重鎖、ならびに配列番号19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239、259、279、299、319、339、359、および379からなる群から選択される可変軽鎖配列を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号3、23、43、63、83、103、123、143、163、183、203、223、243、263、283、303、323、343、および363からなる群から選択される重鎖可変領域のCDR1、配列番号4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264、284、304、324、344、および364からなる群から選択される重鎖可変領域のCDR2、5、25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225、245、265、285、305、325、345、および365からなる群から選択される重鎖可変領域のCDR3、配列番号13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233、253、273、293、313、333、353、および373からなる群から選択される軽鎖可変領域のCDR1、配列番号14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254、274、294、314、334、354、および374からなる群から選択される軽鎖可変領域のCDR2、ならびに配列番号15、35、55、75、95、115、135、155、175、195、215、235、255、275、295、315、335、355、および375からなる群から選択される軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号6、26、46、66、86、106、126、146、166、186、206、226、246、266、286、306、326、346、および366からなる群から選択される重鎖可変領域のCDR1、配列番号7、27、47、67、87、107、127、147、167、187、207、227、247、267、287、307、327、347、および367からなる群から選択される重鎖可変領域のCDR2、8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268、288、308、328、348、および368からなる群から選択される重鎖可変領域のCDR3、配列番号16、36、56、76、96、116、136、156、176、196、216、236、256、276、296、316、336、356、および376からなる群から選択される軽鎖可変領域のCDR1、配列番号17、37、57、77、97、117、137、157、177、197、217、237、257、277、297、317、337、357、および377からなる群から選択される軽鎖可変領域のCDR2、ならびに配列番号18、38、58、78、98、118、138、158、178、198、218、238、258、278、298、318、338、358、および378からなる群から選択される軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号3の重鎖可変領域のCDR1、配列番号4の重鎖可変領域のCDR2、配列番号5の重鎖可変領域のCDR3、配列番号13の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号14の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号15の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号23の重鎖可変領域のCDR1、配列番号24の重鎖可変領域のCDR2、配列番号25の重鎖可変領域のCDR3、配列番号33の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号34の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号35の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号43の重鎖可変領域のCDR1、配列番号44の重鎖可変領域のCDR2、配列番号45の重鎖可変領域のCDR3、配列番号53の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号54の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号55の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号63の重鎖可変領域のCDR1、配列番号64の重鎖可変領域のCDR2、配列番号65の重鎖可変領域のCDR3、配列番号73の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号74の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号75の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号83の重鎖可変領域のCDR1、配列番号84の重鎖可変領域のCDR2、配列番号85の重鎖可変領域のCDR3、配列番号93の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号94の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号95の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号103の重鎖可変領域のCDR1、配列番号104の重鎖可変領域のCDR2、配列番号105の重鎖可変領域のCDR3、配列番号113の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号114の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号115の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号123の重鎖可変領域のCDR1、配列番号124の重鎖可変領域のCDR2、配列番号125の重鎖可変領域のCDR3、配列番号133の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号134の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号135の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号143の重鎖可変領域のCDR1、配列番号144の重鎖可変領域のCDR2、配列番号145の重鎖可変領域のCDR3、配列番号153の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号154の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号155の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号163の重鎖可変領域のCDR1、配列番号164の重鎖可変領域のCDR2、配列番号165の重鎖可変領域のCDR3、配列番号173の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号174の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号175の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号183の重鎖可変領域のCDR1、配列番号184の重鎖可変領域のCDR2、配列番号185の重鎖可変領域のCDR3、配列番号193の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号194の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号195の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号203の重鎖可変領域のCDR1、配列番号204の重鎖可変領域のCDR2、配列番号205の重鎖可変領域のCDR3、配列番号213の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号214の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号215の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号223の重鎖可変領域のCDR1、配列番号224の重鎖可変領域のCDR2、配列番号225の重鎖可変領域のCDR3、配列番号233の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号234の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号235の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号243の重鎖可変領域のCDR1、配列番号244の重鎖可変領域のCDR2、配列番号245の重鎖可変領域のCDR3、配列番号253の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号254の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号255の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号263の重鎖可変領域のCDR1、配列番号264の重鎖可変領域のCDR2、配列番号265の重鎖可変領域のCDR3、配列番号273の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号274の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号275の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号283の重鎖可変領域のCDR1、配列番号284の重鎖可変領域のCDR2、配列番号285の重鎖可変領域のCDR3、配列番号293の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号294の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号295の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号303の重鎖可変領域のCDR1、配列番号304の重鎖可変領域のCDR2、配列番号305の重鎖可変領域のCDR3、配列番号313の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号314の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号315の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号323の重鎖可変領域のCDR1、配列番号324の重鎖可変領域のCDR2、配列番号325の重鎖可変領域のCDR3、配列番号333の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号334の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号335の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号343の重鎖可変領域のCDR1、配列番号344の重鎖可変領域のCDR2、配列番号345の重鎖可変領域のCDR3、配列番号353の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号354の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号355の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号363の重鎖可変領域のCDR1、配列番号364の重鎖可変領域のCDR2、配列番号365の重鎖可変領域のCDR3、配列番号373の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号374の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号375の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号6の重鎖可変領域のCDR1、配列番号7の重鎖可変領域のCDR2、配列番号8の重鎖可変領域のCDR3、配列番号16の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号17の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号18の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号26の重鎖可変領域のCDR1、配列番号27の重鎖可変領域のCDR2、配列番号28の重鎖可変領域のCDR3、配列番号36の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号37の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号38の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号46の重鎖可変領域のCDR1、配列番号47の重鎖可変領域のCDR2、配列番号48の重鎖可変領域のCDR3、配列番号56の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号57の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号58の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号66の重鎖可変領域のCDR1、配列番号67の重鎖可変領域のCDR2、配列番号68の重鎖可変領域のCDR3、配列番号76の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号77の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号78の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号86の重鎖可変領域のCDR1、配列番号87の重鎖可変領域のCDR2、配列番号88の重鎖可変領域のCDR3、配列番号96の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号97の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号98の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号106の重鎖可変領域のCDR1、配列番号107の重鎖可変領域のCDR2、配列番号108の重鎖可変領域のCDR3、配列番号116の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号117の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号118の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号126の重鎖可変領域のCDR1、配列番号127の重鎖可変領域のCDR2、配列番号128の重鎖可変領域のCDR3、配列番号136の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号137の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号138の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号146の重鎖可変領域のCDR1、配列番号147の重鎖可変領域のCDR2、配列番号148の重鎖可変領域のCDR3、配列番号156の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号157の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号158の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号166の重鎖可変領域のCDR1、配列番号167の重鎖可変領域のCDR2、配列番号168の重鎖可変領域のCDR3、配列番号176の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号177の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号178の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号186の重鎖可変領域のCDR1、配列番号187の重鎖可変領域のCDR2、配列番号188の重鎖可変領域のCDR3、配列番号196の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号197の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号198の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号206の重鎖可変領域のCDR1、配列番号207の重鎖可変領域のCDR2、配列番号208の重鎖可変領域のCDR3、配列番号216の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号217の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号218の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号226の重鎖可変領域のCDR1、配列番号227の重鎖可変領域のCDR2、配列番号228の重鎖可変領域のCDR3、配列番号236の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号237の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号238の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号246の重鎖可変領域のCDR1、配列番号247の重鎖可変領域のCDR2、配列番号248の重鎖可変領域のCDR3、配列番号256の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号257の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号258の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号266の重鎖可変領域のCDR1、配列番号267の重鎖可変領域のCDR2、配列番号268の重鎖可変領域のCDR3、配列番号276の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号277の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号278の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号286の重鎖可変領域のCDR1、配列番号287の重鎖可変領域のCDR2、配列番号288の重鎖可変領域のCDR3、配列番号296の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号297の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号298の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号306の重鎖可変領域のCDR1、配列番号307の重鎖可変領域のCDR2、配列番号308の重鎖可変領域のCDR3、配列番号316の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号317の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号318の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号326の重鎖可変領域のCDR1、配列番号327の重鎖可変領域のCDR2、配列番号328の重鎖可変領域のCDR3、配列番号336の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号337の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号338の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号346の重鎖可変領域のCDR1、配列番号347の重鎖可変領域のCDR2、配列番号348の重鎖可変領域のCDR3、配列番号356の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号357の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号358の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 配列番号366の重鎖可変領域のCDR1、配列番号367の重鎖可変領域のCDR2、配列番号368の重鎖可変領域のCDR3、配列番号376の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号377の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号378の軽鎖可変領域のCDR3を含む、単離抗体またはその断片。
- 上記請求項の一項に記載の抗体またはその断片と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- 前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または断片と同じエピトープに結合する、単離抗体またはその断片。
- ヒトLOX−1タンパク質に結合し、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または断片と交差競合する、単離抗体またはその断片。
- MOR021448、MOR021449、MOR021450、MOR021443、MOR021444、MOR021445、MOR021458、MOR021459、MOR021460、MOR021461、MOR021462、MOR021463、MOR021464、MOR021465、MOR021466、MOR021467、MOR021468、MOR021469、MOR021470、MOR021553、MOR021452、MOR021453、MOR021454、MOR021456、MOR021457、MOR021451、MOR021455、MOR021433、MOR021434、MOR021435、MOR021436、MOR021437、MOR021438、MOR021439、MOR021440、MOR021441、およびMOR021442からなる群から選択される、単離抗LOX−1抗体またはその断片。
- LOX−1のリガンド結合性ドメインに結合する、請求項58に記載の単離抗LOX−1抗体またはその断片。
- LOX−1のエピトープに結合し、前記エピトープが、LOX−1のアミノ酸残基100〜109、207〜218、または228〜246を含む、請求項58に記載の単離抗体またはその断片。
- OxLDLの、LOX−1タンパク質への結合を遮断する、請求項58に記載の単離抗体またはその断片。
- oxLDL誘導活性酸素種(ROS)産生を阻害する、請求項58に記載の単離抗体またはその断片。
- LOX−1障害を処置する方法であって、有効量の、前記請求項のいずれかに記載の抗体または断片を含む医薬組成物を、LOX−1障害に罹患している対象へと投与するステップを含む、方法。
- 前記対象が、間欠性跛行およびラザフォード分類II/III跛行のうちの1つまたは複数に罹患している、請求項63に記載の方法。
- 前記対象が、狭心症に罹患している、請求項63に記載の方法。
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