CN107216390B

CN107216390B - 抗lox-1人源单链抗体及其制备方法和应用

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Publication number: CN107216390B
Application number: CN201710543628.XA
Authority: CN
Inventors: 相君妍; 谢秋宏; 相宏宇
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2017-07-05
Filing date: 2017-07-05
Publication date: 2020-08-21
Anticipated expiration: 2037-07-05
Also published as: CN107216390A

Abstract

本发明公开了一种抗LOX‑1人源单链抗体及其制备方法和应用，抗LOX‑1人源单链抗体，包括轻链和重链，包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；该组CDR与下述序列至少具有30％的同源性：HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1；HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2；HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3；LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4；LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5；LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6。本发明为动脉粥样硬化早期诊断试剂、靶向载药材料及治疗药物开发提供了理想材料。

Description

抗LOX-1人源单链抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种抗LOX-1人源单链抗体及其制备方法和应用。

背景技术

2016年10月8日的柳叶刀杂志公布的全球疾病负担最新数据显示，从1990年到2015年主要死因的排位发生了变化，2015年的主要死因，缺血性心脏病和脑血管疾病分别排在第一和第二位，也就是说，心脑血管疾病已经成为人类的第一杀手。

我国心血管病患病率及死亡率处于上升阶段，“中国心血管病报告2015”中指出，心血管病占居民疾病死亡构成的40％以上，为我国居民的首位死因。心血管病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生间题，防治心血管病刻不容缓。

心脑血管疾病的前身是动脉粥样硬化(Arteriosclerosis，As)。多项研究显示：As是经多年无症状发展而突然致残致死的疾病，70％-80％的冠状动脉血栓的形成是继发于As斑块的破裂。特别是最近的临床调查显示，30岁以下却已经出现动脉硬化的病例已有很多。对人类而言，随年龄的增长动脉硬化几乎是不可避免的，但是发病危险因素的有无是疾病进展的关键。As在形成脂纹这种初级阶段的时候是可逆的，经治疗，内腔狭窄和斑块可以回缩；但是随着病变的发展，将逐渐成为不可逆性改变。

As的发生始于血管内皮损伤，氧化型低密度脂蛋白(Oxidized Low DensityLipoprotein，ox-LDL)是导致血管内皮细胞激活、损伤和功能失调的主要危险因子，是As的主要致病因素。而ox-LDL必须通过其存在于血管内皮细胞的特异性受体，即植物凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low density lipoproteinreceptor-1，LOX-1)的介导才能发挥作用。近来研究发现：众多因素能调控LOX-1的病理表达，内皮细胞吞噬与LOX-1结合ox-LDL后触发一系列信息通路，调控转录因子的表达，使黏附分子、炎症因子等表达上调，活性氧表达降低，导致内皮损伤、As等疾病形成。LOX-1是As众多事件的初始阶段，已成为抗As药物研发的强有力新靶点。

目前，已经成功开发出鼠源和鸡源抗LOX-1单克隆抗体(Monoclonal antibody)，而且一系列的动物模型试验结果表明，抗LOX-1单克隆抗体不但能够抑制LOX-1介导的动脉粥样硬化类疾病的发生发展，还可以作为靶向载体用于动脉粥样硬化斑块的显像。虽然抗LOX-1单克隆抗体在动物模型的研究中显示了优越的诊疗效果，但是动物源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody，HAMA)，造成诸多毒副作用；三是在人体循环系统中被很快清除掉，难以达到理想的治疗效果。

与单克隆抗体相比，单链抗体(Single-chain fragment variable，scFv)显示了其独特的优越性，它是在基因水平上将免疫球蛋白的重链可变区(the variable regionof heavy chain，VH)和轻链可变区(the variable region of light chain，VL)通过一段连接肽连接而成，它不仅具备单克隆抗体可与抗原特异结合的特征，更因其具有分子量小、组织穿透性好、免疫原性低、易于基因工程操作和构建抗体融合蛋白等诸多优点而凸显其在医学应用中的价值。目前，关于抗LOX-1单链抗体的研究报道很少，只有一株源于鼠源单克隆抗体(#10-1)的单链抗体。虽然动物源性单链抗体由于缺少了FC段，免疫原性显著降低，但仍存在很大的隐患。为了尽可能减少药用抗体的免疫原性，研究者尝试利各种抗体人源化技术对现有动物源抗体进行改造，但是人源化改造也面临很大的困境，一方面不可能完全去除抗体的免疫原性，另一方面在抗体改造过程中，抗体空间构型可能发生改变，亲和力往往会下降，很难达到预期的作用效果。因此，开发人源单链抗体，减少异源抗体的免疫原性，成为抗体研究的重点和难点。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种抗LOX-1人源单链抗体及其制备方法和应用。所述技术方案如下：

一方面，一种抗LOX-1人源单链抗体，包括轻链和重链，所述抗体包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；该组CDR与下述序列至少具有30％的同源性：

HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步的，所述抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

进一步的，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过柔性序列连接，所述柔性序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

进一步的，所述抗体C末端连接6个组氨酸序列，所述组氨酸序列如SEQ ID NO.10所示。

另一方面，一种多核苷酸，所述多核苷酸能够编码上述抗LOX-1人源单链抗体。

具体的，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

再一方面，一种载体，含有上述多核苷酸。

具体的，所述载体为pNY-scFv质粒。

再一方面，一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的载体。

具体的，所述宿主细胞为短小芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)SP3。

再一方面，上述抗LOX-1人源单链抗体在制备治疗心血管疾病药物中的应用。

再一方面，上述抗LOX-1人源单链抗体的制备方法，包括以下步骤：

以SEQ ID NO.11所示的序列为模板，通过PCR反应在所示序列的N端和C端分别接入末端酶切位点SalⅠ和HindⅡ；然后连接到载体的多克隆位点，构筑得到表达载体；将表达载体转化至宿主细胞中；挑选含有表达载体的宿主细胞阳性单菌落接种到MT液体培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按稀释度1:100接种到TM培养液中，30℃、150rpm振荡培养60小时；

取上清液通过镍柱亲和层析得到回收液，回收液经过分子筛过滤分离，得到纯化的抗LOX-1人源单链抗体。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：①提供了一种从人的外周血中获得抗LOX-1人源scFv的有效方法。②确定了在scFv的C末端加入组氨酸标签的可行性。加入的6个组氨酸标签不仅简化了表达后的scFv纯化方法，也确定了该标签不影响scFv的亲和力。这一成果为本发明的人源scFv在今后的融合载药开发方面提供了有力支持。③本发明提供的scFv表达体系与方法，为以后该人源scFv的量产提供有力保障，是今后以LOX-1为靶点的诊断试剂和基因工程抗体药物开发和推广的重要基础。④本发明可为动脉粥样硬化早期诊断试剂的开发，特别是靶向载药材料及其治疗药物的开发提供了可以消除外源蛋白对人体免疫系统影响的理想材料。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是从心血管病人外周血单核细胞提取的总RNA结果的电泳图；

图2是从cDNA文库中扩增出的VH-CH，Vκ-CL和Vλ-CL片段的电泳图；

图3是通过重叠延伸PCR方法获得的VH-Vκ和VH-Vλ片段的电泳图；

图4是构筑的含有人源单链抗体片段的噬菌体质粒示意图；

图5是多克隆噬菌体三轮淘筛的ELISA结果图；

图6是单克隆噬菌体筛选后10个阳性克隆的ELISA结果图；

图7是抗LOX-1人源单链抗体的氨基酸序列及CDR区域图；

图8是抗LOX-1人源单链抗体表达载体pNY-scFv的构建示意图；

图9是抗LOX-1人源单链抗体在短小芽孢杆菌中分泌表达的经时变化SDS-PAGE电泳图；

图10是分泌表达的抗LOX-1人源单链抗体纯化过程的SDS-PAGE电泳图；

图11是抗LOX-1人源单链抗体和人源LOX-1蛋白亲和力测定结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例1：人源单链抗体(single-chain antibody fragment/single-chainvariable fragment，scFv)噬菌体展示文库的构建

实验材料：

载体pCANTAB5E，菌株TG1均购自Pharmacia公司。淋巴细胞分离液，Hank’s液购自Amresco公司。Anti-M13antibody(HRP)购自abcam公司。高纯质粒小量制备试剂盒，BSA和多功能DNA纯化回收试剂盒均购自BioTeke。限制性内切酶SfiⅠ和NotⅠ，T4DNA连接酶，rTaq和LA Taq购自Takara。qRT-PCR的M-MLV第一链合成系统试剂盒购自invitrogen，Bst NⅠ购自NEB公司。

蛋白胨，酵母浸粉，琼脂粉和蛋白胨购自安琪公司。氨苄青霉素，盐酸硫胺素，IPTG和卡那霉素购自北京鼎国昌生物技术有限责任公司。NaCO₃，NaHCO₃，KCl，Na₂HPO₄，KH₂PO₄，NH₄Cl，NaOH，NaCl和葡萄糖购自北京化工厂。HEPES，TMB购自solarbio公司。

血样来自20名心脑血管疾病患者志愿者，由吉林大学中日联谊医院提供。

建库用引物见表1。

表1 建库用引物序列

表1中斜体碱基为SfiⅠ和NotⅠ的酶切位点；带有下划线标注的碱基为Linker(G₄S)₃的碱基序列。

基本的分子生物学操作和使用的培养基及试剂等的配制，依据《分子生物学实验技术手册》执行。使用试剂盒的操作，按试剂盒使用说明执行。

人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的分离按下述步骤实施：

(1)将新鲜的抗凝血与等体积Hank’s液均匀混合，再小心地加入已装有淋巴细胞分离液的离心管中。

(2)1500rpm离心15-20min。

(3)用移液枪移取离心管中第二层的环状乳白色单核细胞层。

(4)采用血球计数板对单核细胞进行计数。

(5)将单核细胞分装后于-80℃冷冻保存。

总RNA从人外周血PMBC提取获得，电泳检查结果见图1；电泳结果表明总RNA提取质量良好，可以用于反转录合成cDNA文库。我们以oligo(dT)₂₀为引物，利用RT-PCR试剂盒，以上述提取的总RNA为模板，反转录为cDNA，从而获得cDNA文库。

以合成的cDNA文库为模板，用表1中的引物，采用半巢式PCR方法扩增VH和Vλ/Vκ片段，结果见图2，图中M为DNA Maker，1为VH-CH，2为Vκ-CL，3为Vλ-CL，结果显示在大约700bp附近获得了目的片段。随后通过overlapping PCR，将VH和Vλ/Vκ片段分别组装成scFv(VH-Vλ/Vκ)，结果见图3，图中M为DNA Maker，4为VH-Vλ，5为VH-Vκ，组装后的scFv大小在750bp附近，且特性很好；至此，人源scFv文库构建成功，为下一步利用噬菌体展示系统筛选特异性亲和LOX-1的scFv奠定了材料基础。

取噬菌体质粒pCANTAB5E，利用限制性内切酶位点将scFv片段连接到质粒中(如图4所示)，并通过电转化方法将质粒pCANTAB5E-scFv导入TG1细胞中，从而建立人源scFv噬菌体展示文库。进而对文库的阳性率、多样性和库容量进行鉴定。

构建的人源scFv噬菌体展示文库的阳性率大于98％，多样性为90％。采用梯度稀释涂板计数文库菌落，并结合文库阳性率和多样性结果计算得出单链抗体scFv(VH-Vλ)和scFv(VH-Vκ)噬菌体展示文库的库容量分别为2.7×10¹¹和3.5×10¹¹，噬菌体展示文库的总容量为6.2×10¹¹。

实施例2：抗LOX-1人源scFv淘筛

抗LOX-1人源scFv的淘筛采用免疫管淘筛法。淘筛操作按下述程序执行：

一、辅助噬菌体M13KO₇的制备

(1)采用2×TY培养基在37℃，200rpm条件下培养TG1培养液至OD₆₀₀为0.4，分装至1.5mL无菌离心管内，200μL/管。

(2)将M13KO₇逐级梯度稀释至10^-4、10^-6、10^-8、10^-10和10^-12倍。分别取10μL不同数量级的M13KO₇侵染该200μL TG1，37℃水浴静止放置30min。将侵染完毕的200μL TG1全部加入3mL溶解状态的约42℃的琼脂中，平铺在预先温浴好的2×TY平板上(不含抗生素)，37℃培养过夜。

(3)挑取一个小的噬菌斑于5mL处于对数中期的TG1菌液中，于37℃，200rpm条件下培养2h。

(4)将培养好的TG1全部加入含有500mL 2×YT的3L摇瓶中，37℃震荡培养1h，然后加入卡那霉素使终浓度为50μg/mL，30℃震荡过夜培养。

(5)将过夜培养物10800g离心15min。将100mL含有2.5M NaCl的10％PEG加入400mL上清中，冰浴1h。

(6)10800g离心30min，弃上清。

(7)采用8mL PBS缓冲液重悬沉淀，并加入2mL NaCl/PEG混匀，冰浴20min。

(8)10800g离心30min，弃上清。

(9)5mL PBS缓冲液重悬沉淀，11600g离心10min彻底除去细菌残片。

(10)分装M13KO₇，200μL/管，并保存于4℃冰箱备用。长期保存的M13KO₇加入10％甘油于-80℃保存。

(11)辅助噬菌体滴度测定。将M13KO₇逐级梯度稀释至10^-18、10^-20、10^-20、10^-22倍。取梯度稀释的噬菌体50μL加入1mL TG1(OD₆₀₀为0.4)菌液，混匀后加入3mL融化的琼脂(42℃)中，均匀平铺于2×YT平板。

(12)根据平板上的噬菌体斑数计算噬菌体滴度(cfu/mL)。

二、重组噬菌粒的制备

(1)向装有20mL 2×YT-AG培养基中加入scFv(VH-Vλ/κ)噬菌体展示文库甘油保存液，在37℃，250rpm条件下培养1h。

(2)向文库培养液中加入4×10¹⁰pfu M13KO₇，37℃水浴30min，分别取出10μL于90μL的2×YT-G培养基，混匀后涂布于2×YT-AG和2×YT-KG平板，用于鉴定感染效率。

(3)37℃，250rpm培养30min。

(4)1000g离心10min，小心去除上清。

(5)将沉淀细胞用20mL 2×YT-AK培养基(不含葡萄糖)重悬，于100mL摇瓶中，37℃、250rpm，过夜培养。

(6)1000g离心20min。

(7)转移上清(含有重组噬菌粒)至50mL无菌离心管中。

三、浓缩重组噬菌粒

(1)向20mL重组噬菌粒中加入4mL NaCl/PEG，混匀冰浴放置1h。

(2)10800g，4℃离心30min，彻底去除上清。

(3)用4mL的PBS缓冲液重悬沉淀，并用0.45μm滤膜去除菌体以用于淘筛。

四、免疫管淘筛法

(1)取3.5mL缓冲液稀释的50μg LOX-1ECD于免疫管，4℃过夜包被。

(2)采用3.5mL的PBST震荡洗涤免疫管3次，每次5min。

(3)采用含有2％BSA的PBS溶液封闭免疫管，37℃放置2h。PBST震荡洗涤免疫管3次，每次5min。

(4)将重组噬菌粒与含有2％BSA的PBS溶液按体积比3:2进行混合，于室温放置20min。

(5)向封闭好的免疫管中加入混合重组噬菌粒3.5mL，37℃缓和震荡孵育2h。

(6)去除免疫管中的重组噬菌粒，并采用3.5mL的PBST震荡洗涤免疫管3次，每次5min。

(7)向免疫管中加入4mL新鲜宿主菌TG1(OD₆₀₀为0.5)。37℃、150rpm震荡培养1h。

(8)取震荡培养的菌液10μL按照“一、辅助噬菌体M13KO₇的制备”的方法确定淘筛输出的噬菌体量。

(9)将剩余的菌液全部转移至50mL离心管中，加入终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素和4×10¹⁰pfu的M13KO₇。

(10)37℃水浴静置30min后，于37℃、250rpm震荡培养30min。

(11)1000g离心10min，小心去除上清。

(12)将沉淀细胞用20mL 2×YT-AK培养基(不含葡萄糖)重悬于50mL摇瓶中，于37℃、250rpm条件下过夜培养。

(13)1000g离心20min。

(14)转移上清约20mL(含有重组噬菌体)至50mL无菌离心管中。

(15)按“三、浓缩重组噬菌粒”的方法浓缩噬菌体，用于下一轮陶筛。

五、多克隆Phage ELISA

(1)包被，每孔包被2μg LOX-1ECD蛋白，100μL/孔，包被条件为4℃过夜。采用BSA作为阴性对照孔。

(2)洗涤，PBST震荡洗涤3次，每次5min。

(3)封闭，每孔加入100μL含有2％BSA的PBS溶液，37℃封闭2h。

(4)洗涤，PBST震荡洗涤3次，每次5min。

(5)加样，取100μL重组噬菌体加入抗原包被孔，37℃反应2h。

(6)洗涤，PBST震荡洗涤3次，每次5min。

(7)采用2％BSA的PBS缓冲液以1:5000稀释Anti-M13antibody(HRP)，每孔加入100μL，37℃孵育1h。

(8)洗涤，PBST震荡洗涤3次，每次5min。

(9)显色，每孔加入100μL TMB显色液，37℃反应30min。

(10)终止反应，采用2M H₂SO₄终止反应5min。

(11)采用酶标仪测定A450吸光度值。每个样品作两2个平行，取平均值。

六、单克隆Phage ELISA

(2)洗涤，PBST震荡洗涤3次，每次5min。

(3)封闭，每孔加入100μL含有2％BSA的PBS溶液，37℃封闭2h。

(4)洗涤，PBST震荡洗涤3次，每次5min。

(5)加样，取100μL单克隆浓缩重组噬菌体加入抗原包被孔，37℃反应2h。

(6)洗涤，PBST震荡洗涤3次，每次5min。

(8)洗涤，PBST震荡洗涤3次，每次5min。

(9)显色，每孔加入100μL TMB显色液，37℃反应30min。

(10)终止反应，采用2M H₂SO₄终止反应5min。

(11)酶标仪测定A450吸光度值。A450值与阴性对照孔比值大于2.0的为阳性样品，每个样品作两2个平行，取平均值。

通过三轮淘筛后，特异性噬菌体一共被成功富集142.5倍。多克隆phage ELISA结果(图5)表明，在第二轮陶筛中，已经有了大幅度的提高，在第三轮淘筛后，信号值提高幅度较小。经过三轮淘筛后使LOX-1特异性结合的scFv得到充分富集。

从淘筛富集后的文库中挑取1000个单克隆，并分别制备每个单克隆的重组噬菌体，再进行单克隆phage ELISA鉴定。S/N值大于2的阳性克隆共200个，典型的10个阳性克隆结果见图6，10个阳性克隆中有7个与LOX-1蛋白亲和力较强，其中以39号亲和力最高。

实施例3：抗LOX-1人源scFv分子鉴定及功能区分析

从200个阳性克隆中选取与LOX-1亲和活性显著高的7株单克隆，提取制粒，将质粒委托华大基因公司测序，测序后的结果，利用(http://www.IMGT.org)的IMGT软件对scFv序列进行分析，确定scFv序列是否具有人源VH和VL区序列的基因特征。并确定scFv的CDR和FR序列区域。此外，分别采用ExPAsy网站的SOPMA工具、GENETYX软件对scFv的结构特征、物理性质进行预测。

图7是本发明的抗LOX-1人源scFv氨基酸序列及相关功能图。抗LOX-1人源scFv含有的如下的结合片段，包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，氨基酸序列如下：

HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1；

HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2；

HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3；

LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4；

LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5；

LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6。

图7中抗LOX-1人源scFv由768个核苷酸编码而成，如SEQ ID NO.11所示。

实施例4：抗LOX-1人源scFv的原核表达及纯化

本发明的抗LOX-1人源scFv的编码核苷酸序列(见序列表中的SEQ ID NO.11所示)，以该序列为模板，通过PCR反应在N端和C端分别接入末端酶切位点SalⅠ和HindⅡ；之后连接到表达载体pNY326的多克隆位点中，见附图8，构筑好的质粒被命名为pNY-scFv；接下来将pNY-scFv电转化至宿主短小芽孢杆菌SP3(Brevibacillus choshinensis SP3)中。挑选含有pNY-scFv重组质粒的Brevibacillus choshinensis SP3阳性单菌落接种到MT液体培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按稀释度1:100接种到TM培养液中，30℃、150rpm振荡培养96小时。每隔12小时取培养液，进行SDS-PAGE电泳，经过染色、脱色，发现Brevibacilluschoshinensis SP3的表达产物在约30kDa处有明显的条带，与预期的目的蛋白带大小一致，表明抗LOX-1人源scFv基因获得了表达，见图9。在TM培养基中，30℃振荡培养60小时，目的蛋白达到较大表达量。

抗LOX-1人源scFv基因在Brevibacillus choshinensis SP3宿主菌中表达主要以可溶的形式存在上清液中。为方便表达，在抗LOX-1人源scFv的C末端加上了6个组氨酸标签，表达后的蛋白可以通过镍柱亲和层析得到回收，在经过分子筛过滤分离，可以得到纯化的抗LOX-1人源scFv蛋白。图10是重组的抗LOX-1人源scFv经两步法纯化的结果。SDS-PAGE可以看到经分子筛纯化后的蛋白为单一条带，说明经亲和层析和分子筛层析纯化后，能够得到较高纯度的目的抗LOX-1人源scFv蛋白。

实施例5：抗LOX-1人源scFv的鉴定

采用生物分子相互作用系统(Bio-Layer Interferometry，BLI)测定抗LOX-1人源scFv片段与抗原LOX-1的亲和活性。整个实验在Octet RED96(ForteBio)操作系统下进行，温度设定在30℃。将人源LOX-1蛋白(Sino Biological Inc.)溶于PBS缓冲液中，用生物素化试剂盒EZLink Sulfo-NHS-Biotin(Pierce)进行生物塑化；生物塑化的LOX-1蛋白与链霉亲和素传感器(SA sensor)于PBS缓冲液中进行孵育600秒；结合有LOX-1的SA sensor移至PBS缓冲液中平衡60秒；然后移至含有不同浓度抗体(分别为400，200，100，50，25nmol/L)的PBS溶液中，使SA sensor上的抗原LOX-1与抗体孵育结合600秒；将上述反应后的SA sensor移至PBS溶液中，进行解离600秒；结果使用软件Data Analysis7.0进行数据分析。

BLI测定图谱见图11，随着scFv浓度的增加，纳米位移深度增加；在解离过程中，scFv浓度大于200nmol/L时，解离度有所增强。通过该图谱利用软件Data Analysis 7.0分析得表2的动力学参数，其中K_no为结合动力学常数；K_dis为解离动力学常数，K_D为解离平衡常数(K_D＝K_dis/K_no)。K_D是scFv同LOX-1亲和力的表征参数，其数值越小，说明scFv与LOX-1的亲和力越强。表2中的结果表明，本发明的人源抗LOX-1scFv的K_D为6.69×10^-9，是一个特异性较强的抗LOX-1人源scFv。

表2 基于BLI的抗LOX-1人源scFv动力学参数

K<sub>D</sub>(M)	K<sub>no</sub>(1/Ms)	K<sub>dis</sub>(1/s)
			6.69E-09	6.98E+03	4.67E-05

本发明提供了一种从人的外周血中获得抗LOX-1人源scFv的有效方法。确定了在scFv的C末端加入组氨酸标签的可行性。加入的6个组氨酸标签不仅简化了表达后的scFv纯化方法，也确定了该标签不影响scFv的亲和力。这一成果为本发明的人源scFv在今后的融合载药开发方面提供了有力支持。本发明提供的scFv表达体系与方法，为以后该人源scFv的量产提供有力保障，是今后以LOX-1为靶点的诊断试剂和基因工程抗体药物开发和推广的重要基础。本发明可为动脉粥样硬化早期诊断试剂的开发，特别是靶向载药材料及其治疗药物的开发提供了可以消除外源蛋白对人体免疫系统影响的理想材料。

上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。

以上所描述的系统实施例仅仅是示意性的，其中所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性的劳动的情况下，即可以理解并实施。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林大学

<120> 抗LOX-1人源单链抗体及其制备方法和应用

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人外周血单核细胞

<400> 1

Gly Asn Ser Ile Ser Arg Gly Ser Tyr Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人外周血单核细胞

<400> 2

Val Ser His Ser Gly Ser Thr Tyr

1 5

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人外周血单核细胞

<400> 3

Arg His Gly Leu Gly Ser Arg Ser Gly Tyr Asn Asp Ala Phe

1 5 10

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人外周血单核细胞

<400> 4

Gln Gly Val Gly Thr Ala

1 5

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人外周血单核细胞

<400> 5

Ala Ala Ser Thr Leu

1 5

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人外周血单核细胞

<400> 6

Gln Gln Tyr Gln Ser Tyr Pro

1 5

<210> 7

<211> 125

<212> PRT

<213> 人外周血单核细胞

<400> 7

Arg Cys Ser Cys Cys Ser Leu Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asn Ser Ile Ser Arg Gly

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Val Ser His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Ile Ile Ser Val Asp Thr Cys Lys Asn Gln Leu

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Ser

85 90 95

Cys Ala Arg His Gly Leu Gly Ser Arg Ser Gly Tyr Asn Asp Ala Phe

100 105 110

Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 8

<211> 110

<212> PRT

<213> 人外周血单核细胞

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Gly Val Gly Thr Ala

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Thr Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala

100 105 110

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

His His His His His His

1 5

Claims

1.抗LOX-1人源单链抗体，包括轻链和重链，其特征在于，所述抗体包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；

HCDR1的氨基酸序列为Gly Asn Ser Ile Ser Arg Gly Ser Tyr Tyr；

HCDR2的氨基酸序列为Val Ser His Ser Gly Ser Thr Tyr；

HCDR3的氨基酸序列为Arg His Gly Leu Gly Ser Arg Ser Gly Tyr Asn Asp AlaPhe；

LCDR1的氨基酸序列为Gln Gly Val Gly Thr Ala；

LCDR2的氨基酸序列为Ala Ala Ser Thr Leu；

LCDR3的氨基酸序列为Gln Gln Tyr Gln Ser Tyr Pro。

2.如权利要求1所述的抗LOX-1人源单链抗体，其特征在于，所述抗体的重链氨基酸序列为Arg Cys Ser Cys Cys Ser Leu Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr LeuSer Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asn Ser Ile Ser Arg Gly Ser Tyr Tyr Trp GlyTrp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Val Ser His SerGly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Ile Ile Ser Val Asp ThrCys Lys Asn Gln Leu Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala ValTyr Ser Cys Ala Arg His Gly Leu Gly Ser Arg Ser Gly Tyr Asn Asp Ala Phe AspIle Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser，所述抗体的轻链氨基酸序列为AspIle Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val IleIle Thr Cys Arg Ala Thr Gln Gly Val Gly Thr Ala Leu Ala Trp Phe Gln Gln LysSer Gly Gln Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly ValPro Ser Thr Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn SerLeu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Tyr Pro ProThr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala。

3.如权利要求2所述的抗LOX-1人源单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过柔性序列连接，所述柔性序列的氨基酸序列为Gly Gly Gly Gly Ser GlyGly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。

4.如权利要求3所述的抗LOX-1人源单链抗体，其特征在于，所述抗体C末端连接6个组氨酸序列，所述组氨酸序列为His His His His His His。

5.如权利要求1-4任一项所述的抗LOX-1人源单链抗体在制备治疗心血管疾病药物中的应用。