JP6734467B2 - 抗pcsk9モノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
(1)抗PCSK9一本鎖抗体のバイオパニングを行って、3ラウンドの抗体ライブラリーの濃縮スクリーニング(Enriching Screening)によって、完全合成のScFvファージライブラリーから、親和性のより高い抗体配列DFSK9−1を取得する。その重鎖DFSK9−H1は、SEQ ID NO.1のアミノ酸配列を有し、その軽鎖DFSK9−L1は、SEQ ID NO.11のアミノ酸配列を有する。
(2)DFSK9−1に基づいて、コンピュータ三次構造シミュレーションにより、軽鎖相補性決定領域CDR1、CDR2、CDR3突然変異抗体ライブラリーを設計し構築し、さらにこの突然変異抗体ライブラリーに対してバイオパニング、陽性クローンのスクリーニング及び同定を行い、異なる軽鎖を含む10種類の一本鎖抗体配列を取得して、それぞれDFSK9−2、DFSK9−3、DFSK9−4、DFSK9−5、DFSK9−6、DFSK9−7、DFSK9−8、DFSK9−9、DFSK9−10、DFSK9−11と命名される。対応する軽鎖の可変領域は、それぞれDFSK9−L2、DFSK9−L3、DFSK9−L4、DFSK9−L5、DFSK9−L6、DFSK9−L7、DFSK9−L8、DFSK9−L9、DFSK9−L10、DFSK9−L11と命名される。それらに対応するアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21に示す。上記一本鎖抗体をファージレベルで親和性を比較する。
(3)5株の親和性のより高いクローンDFSK9−2、DFSK9−4、DFSK9−5、DFSK9−6およびDFSK9−8を選択し、重鎖相補性決定領域のCDR1、CDR2、CDR3突然変異体抗体ライブラリーを設計し構築し、そしてこの重鎖突然変異の抗体ライブラリーに対してバイオパニング、陽性クローンのスクリーニングおよび同定を行い、10種類の異なる一本鎖抗体配列が取得され、それぞれDFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20およびDFSK9−21と命名される。ここでは、DFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20およびDFSK9−21の軽鎖可変領域配列は、それぞれDFSK9−L2、DFSK9−L8、DFSK9−L5、DFSK9−L6、DFSK9−L5、DFSK9−L6、DFSK9−L5、DFSK9−L4、DFSK9−L6、DFSK9−L6である。それらに対応するアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO.12、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.16に示す。DFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20およびDFSK9−21の重鎖可変領域配列は、それぞれDFSK9−H2、DFSK9−H8、DFSK9−H7、DFSK9−H3、DFSK9−H6、DFSK9−H4、DFSK9−H4、DFSK9−H9、DFSK9−H5、DFSK9−H10である。それらに対応するアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO.2、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.10に示す。上記一本鎖抗体をファージレベルで親和性を比較する;
(4)、(3)に記載の前記モノクローナル重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変遺伝子を真核発現ベクターにクローニングし、宿主細胞にトランスフェクトして抗PCSK9モノクローナル抗体の完全抗体を得る。
ここでは、前記CDRは、相補性決定領域(complementarity−determining region)であり;前記ScFvは、一本鎖抗体(single−chain fragment variable)であり;前記ADCsは、抗体−薬物コンジュゲート(antibody−drug conjugates)であり;前記LDLRは、低密度リポタンパク質受容体(Low Density Lipoprotein Receptor)であり;前記LDL−Cは、低密度リポタンパク質コレステロール(Low Density Lipoprotein−Cholesterol)であり;前記HEK293E細胞は、ヒト胎児腎293E細胞(human embryonic kidney 293E cell)であり;前記CHO細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(chinese hamster ovary cell)であり;前記NS0細胞は、マウスNS0胸腺腫細胞である。
本開示には、多種の新規な抗PCSK9抗体が提供されており、基質と結合する親和性が高く、PCSK9とLDLRとの結合を十分にブロックし、且つ細胞表面上のLDLRの分布および発現に影響を与えることができ、これにより、細胞表面上のLDL−RとLDLとの結合能力を向上させ、細胞によるLDLの摂取および分解を増加させることによって、細胞外LDLおよびLDL−Cの含有量を低下させ、LDL、LDL−Cおよび総コレステロールを低下させる目的を達成する。
(1)抗PCSK9一本鎖抗体のバイオパニングを行って、3ラウンドの抗体ライブラリーの濃縮スクリーニングによって、親和性のより高い抗体配列DFSK9−1を取得する。
(2)DFSK9−1に基づいて、コンピュータ支援設計により、軽鎖CDR123突然変異抗体ライブラリーを設計し構築し、さらにこの抗体ライブラリーに対してバイオパニング、陽性クローンのスクリーニング及び同定を行い、10種類の異なる軽鎖の抗体配列のクローンDFSK9−2、DFSK9−3、DFSK9−4、DFSK9−5、DFSK9−6、DFSK9−7、DFSK9−8、DFSK9−9、DFSK9−10、DFSK9−11を取得する。上記10種類の一本鎖抗体をファージレベルで親和性を比較する;
(3)より高い親和性を有する5株のクローンを選択し、重鎖CDR123ライブラリーを構築し、さらにこのライブラリーに対してバイオパニングおよび陽性クローンのスクリーニングを行い、10種類の異なる配列の一本鎖抗体DFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20、DFSK9−21を取得する。上記一本鎖抗体をファージレベルで親和性を比較する;
(4)、(3)に記載の前記モノクローナル重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変遺伝子を真核発現ベクターにクローニングし、宿主細胞にトランスフェクトして抗PCSK9モノクローナル抗体の完全抗体を得る。
(実施例1)抗PCSK9一本鎖抗体のバイオパニング
pCom3ベクターを遺伝子クローニングの方法により組換え、組換えされたベクターをpScFvDisb−S1(図1)と命名された。このベクターに基づいて、完全合成ファージ抗体ライブラリーを構築する。
免疫チューブに抗原PCSK9−Hisを10μg/1ml/チューブでコーティングし、4℃で一晩コーティングする。PBST−4%milkを用いて免疫チューブおよびファージ抗体ライブラリー(ファージ投入量は約109〜1012である)をそれぞれ閉鎖して、37℃で1時間閉鎖する。閉鎖されたファージ抗体ライブラリーを免疫チューブに入れて抗原−抗体結合を行い、37℃で1時間反応させる。未結合ファージをPBST−PBSで洗い流し、0.1M pH2.2のGlycine−HClで溶出し、溶出液を1.5M pH8.8のTris−HClでpH7.0付近に中和する。OD値が約0.5〜0.8まで増殖させた10mlのXL1−Blue菌液を溶出液で感染させ、37℃で30分間静置した後、150rpmで1時間振とう培養する。1%菌液を提出して段階希釈を行い、ファージ収率を計算するために2YTATG小プレートにコーティングする。残りの菌液を遠心分離した後、2YTATGの大プレートにコーティングし、37℃で一晩培養する。一晩培養した菌を2YTATG液体培地に移し、対数期まで振盪した後、M13K07ヘルパーファージを入れて感染させ、ファージを28℃で一晩増殖させ、ファージを次のスクリーニングに用いるためにPEG6000−NaClで沈降して純化する。合計3ラウンドのファージライブラリーの濃縮スクリーニングを行う。
3ラウンドのスクリーニングを行った後、十分に分離したモノクローナルコロニーを拾い、2YTATG液体培地が添加された96ウェルのディープウェルプレートに接種し、37℃、220rpmで対数増殖期まで約5時間培養し、各ウェルに約1010のヘルパーファージM13KO7を添加し、37℃で30分間静置した後、150rpmで1時間振盪培養した。4000rpmで15分間の遠心分離した後、2YTATKA液体培地に沈殿を再懸濁し、28℃、220rpmで一晩培養する。4000rpm、4℃で15分間遠心分離した後、ファージを有する上清を、モノクローナルELISA同定のために吸引する。親和性のより高い一本鎖抗体DFSK9−1をスクリーニングして取得し、その重鎖可変領域をDFSK9−H1と命名され、そのアミノ酸配列をSEQ ID NO.1に示し、その軽鎖可変領域をDFSK9−L1と命名され、アミノ酸配列をSEQ ID NO.11に示す;
QVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGGTFTNNAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPMFGMANYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREGIPMIWGQGTTVTVSS
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDNRLTWYQQKPGKAPKLLIYDASSRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPENDPTTFGQGTKVEIK
3.1 DFSK9−1軽鎖CDR123突然変異ライブラリーの構築
pScFvDisb−DFSK9−1プラスミドをNheIおよびNotIでダブルダイジェストし、消化された産物をアガロースゲル電気泳動に供した後、5.5kbのバンドをゲルから切り出して回収し、NheIおよびNotIを用いて合成軽鎖突然変異ライブラリー遺伝子VLCDR123Mをダブルダイジェストして、産物を産物回収ユニバーサルキットで回収する。突然変異ライブラリー遺伝子とベクターとをモル比3:1の割合で、T4 DNAリガーゼを用いて16℃で4時間連結する。連結産物をXL1−Blueエレクトロポレーションコンピテント状態にエレクトロポレーションする。37℃、150rpmで振とう培養し、1時間蘇生する。1%菌液をとり、それを希釈して小プレートにコーティングし、ライブラリーの容量を計算する。残りの菌液を4000rpmで15分間遠心分離した後、2YTATGの大プレートに沈殿をコーティングし、37℃で一晩上下逆さまに培養する。構築された抗体ライブラリーは約108のライブラリー容量を有し、20個のクローンをランダムに選択して配列分析したところ、配列の正解率と多様性は、いずれも90%を超えている。
実施例1および実施例2の方法に従って、バイオパニングおよび陽性クローンのスクリーニングを行い、親和性のより高いクローンをシーケンシングして、10種類の異なる一本鎖抗体配列が得られ、それぞれ DFSK9−2、DFSK9−3、DFSK9−4、DFSK9−5、DFSK9−6、DFSK9−7、DFSK9−8、DFSK9−9、DFSK9−10、 DFSK9−11と命名される。対応する軽鎖可変領域は、DFSK9−L2、DFSK9−L3、DFSK9−L4、DFSK9−L5、DFSK9−L6、DFSK9−L7、DFSK9−L8、DFSK9−L9、DFSK9−L10、DFSK9−L11と命名される。それらに対応するアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20およびSEQ ID NO.21に示す。軽鎖可変領域配列SEQ ID NO.12-SEQ ID NO.21は、以下の通りである。
SEQ ID NO.12(DFSK9−L2軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRNWLDWYQQKPGKAPKLLIYGASTLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNDIPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.13(DFSK9−L3軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINSWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTRETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNNTPNTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.14(DFSK9−L4軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVNNWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTRETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNDMPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.15(DFSK9−L5軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINSWLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWFDVPTTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.16(DFSK9−L6軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINNWLNWYQQKPGKAPKLLIYGASTRPTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWDDTPNTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.17(DFSK9−L7軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIHNWLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNSNIPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.18(DFSK9−L8軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVDSWLTWYQQKPGKAPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDSKIPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.19(DFSK9−L9軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRNWLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWTDTPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.20(DFSK9−L10軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVRNWLTWYQQKPGKAPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDDSTPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.21(DFSK9−L11軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSRPTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDSMPMTFGQGTKVEIK
この実施例3.2で得られたクローンをモノクローナルファージのディスプレイおよび精製を行い、ファージレベルでの段階希釈ELISAによって一本鎖抗体の相対親和性を同定する。
PCSK9−His(300ng/ウェル/100μl)をpH7.2の0.01M PBS緩衝液でコーティングし、4℃で一晩コーティングする。PBSTで3回洗浄し、PBST−4%milkで37℃で1時間閉鎖する。PBST−4%milkの5倍段階希釈された精製ファージ試料(100μl/ウェル)を加え、37℃で1時間静置する。PBSTで5回洗浄し、PBST−4%milkで1:5000に希釈したanti−M13−HRPモノクローナル抗体(100μl/ウェル)を加え、37℃で1時間放置する。TMB発色キットで発色させ(100μl/ウェル)、室温で10分間発色させ、2M H2SO4(50μl/ウェル)を用いて発色を停止させる。マイクロプレートリーダーによって波長450nmおよび630nmで読み取る。ソフトウェアGraphPad Prism 5 Demoによってデータを分析し、且つプロットし、その結果は図3に示すようである:結果は、スクリーニングされたファージ一本鎖抗体はいずれもPCSK9に結合することができ、また、DFSK9−2、DFSK9−4、DFSK9−5、DFSK9−6およびDFSK9−8の親和性は、明らかに他のクローンより高いことを示しており、上記5つの一本鎖抗体を選択して次の試験を行う。
4.1鎖置換法による重鎖CDR123突然変異ライブラリーの構築
実施例3.3中のDFSK9−2、DFSK9−4、DFSK9−5、DFSK9−6およびDFSK9−8などの5種類の一本鎖抗体の混合プラスミドをNcoI−HFおよびKpnIでダブルダイジェストして、ゲルから切り出して大きさが5.5kbのバンドを回収する。合成された重鎖突然変異ライブラリー遺伝子VHCDR123MをNcoI−HFおよびKpnIでダブルダイジェストして、ダブルダイジェストされた産物をユニバーサル回収キットで回収する。突然変異ライブラリー遺伝子とベクターとをモル比3:1の割合で、T4 DNAリガーゼを用いて16℃で4時間連結する。連結産物をXL1エレクトロポレーションコンピテント状態にエレクトロポレーションする。37℃、150rpmで培養し、1時間蘇生する。1%菌液をとり、それを希釈して小プレートにコーティングし、ライブラリーの容量を計算する。残りの菌液を4000rpmで15分間遠心分離した後、2YTATGの大プレートに沈殿をコーティングし、37℃で一晩上下逆さまに培養する。構築された抗体ライブラリーは約5*108のライブラリー容量を有し、20個のクローンをランダムに選択して配列分析したところ、正解率と多様性は、いずれも90%を超えている。
実施例4.1中の抗体ライブラリーをファージディスプレイおよび精製回収を行う。このライブラリーから抗PCSK9の一本鎖抗体をパニングする。ファージ抗体ライブラリーのバイオパニング方法および陽性クローンのスクリーニングは、実施例1および実施例2の場合と同じである。シーケンシングされた後、10種類の異なる抗PCSK9抗体配列をスクリーニングした、それぞれDFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、 DFSK9−20、DFSK9−21と命名された。ここでは、DFSK9−12の軽鎖可変領域配列はDFSK9−L2であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.12に示される。DFSK9−13の軽鎖可変領域配列はDFSK9−L8であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.18に示される。DFSK9−14、DFSK9−16およびDFSK9−18の軽鎖可変領域配列はDFSK9−L5であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.15に示される。DFSK9−15、DFSK9−17、DFSK9−20およびDFSK9−21の軽鎖可変領域配列はDFSK9−L6であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.16に示される。DFSK9−19の軽鎖可変領域配列はDFSK9−L4であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.14に示される。DFSK9−12の重鎖可変領域配列はDFSK9−H2であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.2に示される。DFSK9−13の重鎖可変領域配列はDFSK9−H8であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.8に示される。DFSK9−14の重鎖可変領域配列はDFSK9−H7であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.7に示される。DFSK9−15の重鎖可変領域配列はDFSK9−H3であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.3に示される。DFSK9−16の重鎖可変領域配列はDFSK9−H6であり、対応するアミノ酸配列をSEQ ID NO.6に示される。DFSK9−17およびDFSK9−18の重鎖可変領域配列はDFSK9−H4であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.4に示される。DFSK9−19の重鎖可変領域はDFSK9−H9であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.9に示される。DFSK9−20の重鎖可変領域はDFSK9−H5であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.5に示される。DFSK9−21の重鎖可変領域配列はDFSK9−H10であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.10に示される。軽鎖可変領域配列は、実施例3.2中のアミノ酸SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16およびSEQ ID NO.18を参照し、重鎖可変領域アミノ酸配SEQ ID NO.2〜SEQ ID NO.10は以下の通りである:
SEQ ID NO.2(DFSK9−H2重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWLSFYNGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.3(DFSK9−H3重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.4(DFSK9−H4重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGNSNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.5(DFSK9−H5重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGNSNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGMDRWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.6(DFSK9−H6重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYQGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGMDRWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.7(DFSK9−H7重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYGMSIWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.8(DFSK9−H8重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYQGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYGMTVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.9(DFSK9−H9重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVTFYNGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGLSVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.10(DFSK9−H10重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGMDRWGQGTTVTVSS
この実施例4.2で得られたクローンをモノクローナルファージのディスプレイおよび精製を行い、ファージレベルでの段階希釈ELISA実験によって一本鎖抗体の親和性を同定し、その方法は実施例3の3.3と同じである。結果は図5に示すように、スクリーニングされた10種類の異なる一本鎖抗体は、いずれもPCSK9に良好に結合でき、また親和性がいずれも最初の一本鎖DFSK9−1より高い。
5.1抗PCSK9完全抗体の調製
実施例4にスクリーニングされた抗体の重鎖VHを、重鎖定常領域遺伝子(γ4)を含むベクターpTSEG4(図6)にクローニングし、軽鎖VK遺伝子を、軽鎖定常領域遺伝子(κ鎖)を含むベクターpTSEK(図7)にクローニングして、ベクターpTSEG4およびpTSEKは、いずれもPTTベクターに基づいて組換えによって得られるものである。PTTベクターの調製プロセスは、参考文献(Yves.Durocher,Sylvie.Perret and Amine.Kamen Nucleic Acids Research,2002Vol.30,No.2e9)に詳細に記載されている。HEK293E細胞を一過性トランスフェクトして、完全抗体の発現を行う。AKTA機器でprotein Aアフィニティーカラムを介して、完全抗体タンパク質を精製して取得する。
PCSK9−His(300ng/ウェル/100μl)をpH7.2の0.01M PBS緩衝液でコーティングし、4℃で一晩コーティングする。PBST(1‰Tween 20) 300μl/ウェルで3回洗浄し、PBST−4%milkを添加して37℃で1時間閉鎖する。異なる希釈度の完全抗体DFSK9−1,DFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20およびDFSK9−21を添加する。11種類の完全抗体の最高濃度は、50μg/mlであり、5倍段階希釈、各完全抗体に対して8つの階段を作り、37℃で1時間インキュベートする。PBST 300μl/ウェルで5回洗浄し、そしてPBST−4%milkで1:5000希釈されたヤギ抗ヒトIgG−HRP二次抗体を添加し、37℃で1時間インキュベートする。PBST 300μl/ウェルで5回洗浄し、TMB発色キット(100μl/ウェル)で発色し、室温で10分間発色させ、そして2M H2SO4(50μl/ウェル)で発色を停止させた。マイクロプレートリーダーによって波長450nmおよび630nmで読み取る。ソフトウェアGraphPad Prism 5Demoによってデータを分析し、且つプロットし、実験結果は図8及び表2に示すように、すべての抗体は、いずれもPCSK9に結合することができ、ここで、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−20およびDFSK9−21は、より高い親和性を有する。
LDLR−Fc(100ng/ウェル/100μl)をpH7.2の0.01M PBSでコーティングし、4℃で一晩コーティングする。PBSTで3回洗浄し、PBST−4%milkを添加して37℃で1時間閉鎖する。PBST−4%milkで希釈された濃度が2μg/mlであるPCSK9−His(100μl/ウェル)を添加し、37℃で1時間インキュベートする。PBST−4%milkを添加して希釈された異なる希釈度の完全抗体DFSK9−1,DFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20およびDFSK9−21を添加する。11種類の完全抗体の最高濃度は、100μg/mlであり、5倍段階希釈、各完全抗体に対して8つの階段を作り、37℃で2時間インキュベートする。PBSTで5回洗浄し、PBST−4%milkで希釈されたマウス抗His IgG−HRP二次抗体を添加し、37℃で1時間インキュベートする。TMB発色キットで発色させ(100μl/ウェル)、室温で10分間発色させ、2M H2SO4(50μl/ウェル)を用いて発色を停止させる。マイクロプレートリーダーによって波長450nmおよび630nmで読み取る。ソフトウェアGraphPad Prism 5 Demoによってプロットし、実験結果は図9及び表3に示すように、すべての抗体は、いずれもPCSK9とLDLRとの結合を阻害することができ、ここで、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−20およびDFSK9−21は、やや強い阻害能力を有する。
完全抗体の親和性は、捕獲法によって測定させる。ヤギ抗ヒトIgGをCM5チップの表面にカップリングさせ、DFSK9−1、DFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20およびDFSK9−21をそれぞれ希釈して、約200RUの抗体がヤギ抗ヒトIgGによって捕獲されることを確保する。PCSK9を、固定相の表面を流れる一連の濃度階段(200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM、0.78125nM)に設置し、抗体の親和性を測定する。その結果は、スクリーニングされた抗体がいずれもより高い親和性を有し(表4をご参照)、最も高い親和性を有する8種類の完全抗体が生物活性実験のために選択されたことを示した。
HepG2細胞を96ウェルに2.5×105cells/mlで播種した。翌日、10%FBSのEMEM増殖培地を、80μlの5%デリポタンパク質FBSを有する分析培地に変更し、37℃で24時間培養する。翌日、アッセイ培地に希釈された異なる希釈度の完全抗体(10μl/ウェル)を、HepG2細胞を接種した培養プレートに添加する。8種類の完全抗体試料の初期濃度は900nmol/Lであり、3倍の段階希釈で、各完全抗体を8つの階段を作る。そして、30nmol/LのPCSK9溶液(10μl/ウェル)を添加し、ミックスした後、37℃、5%CO2で4時間培養する。10μlの0.1mg/mLのBODIPY標識LDL溶液を各ウェルに加え、ミックスした後、37℃、5%CO2で15〜20時間培養する。PBS 200μl/ウェルを添加し、2回洗浄することによって各ウェルを洗浄する。ウェル毎に、100μlのPBSを添加し、マイクロプレートリーダーによって波長490nmおよび520nmで相対蛍光単位RFU値を読み取った。ソフトウェアGraphPad Prism 5 Demoによってデータを分析し、且つプロットし、結果は図10に示すように、アイソタイプIgGをネガティブコントロールとし、図によると、8個の抗体は、いずれも用量依存的にPCSK9と低密度リポタンパク質レセプターLDLRとの結合をブロックでき、HepG2細胞における低密度リポタンパク質LDLの取り込み率を増加させ、各抗体間の生物学的活性は類似している。
Claims (14)
- 軽鎖と重鎖とを備える、モノクローナル抗体であって、前記モノクローナル抗体の配列は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:1であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:11であるDFSK9−1、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:1であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:12であるDFSK9−2、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:1であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:13であるDFSK9−3、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:1であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:14であるDFSK9−4、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:1であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:15であるDFSK9−5、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:1であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:16であるDFSK9−6、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:1であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:17であるDFSK9−7、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:1であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:18であるDFSK9−8、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:1であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:19であるDFSK9−9、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:1であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:20であるDFSK9−10、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:1であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:21であるDFSK9−11、 前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:2であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:12であるDFSK9−12、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:8であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:18であるDFSK9−13、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:7であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:15であるDFSK9−14、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:3であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:16であるDFSK9−15、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:6であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:15であるDFSK9−16、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:4であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:16であるDFSK9−17、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:4であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:15であるDFSK9−18、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:9であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:14であるDFSK9−19、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:5であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:16であるDFSK9−20、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:10であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:16であるDFSK9−21から選択されたいずれか一つである、ことを特徴とする抗PCSK9のモノクローナル抗体。
- 請求項1に記載の軽鎖及び重鎖を含む抗体、ポリペプチドまたはタンパク質。
- 請求項1に記載の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列の、全長抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、または抗体薬物コンジュゲート。
- 請求項1に記載の軽鎖及び重鎖を含む抗体であって、前記抗体はPCSK9に特異的に結合することができる抗体。
- 請求項1に記載の軽鎖及び重鎖をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項5に記載のポリヌクレオチドを含む組換えDNA発現ベクター。
- 請求項6に記載の組換えDNA発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞であって、前記宿主細胞は原核細胞、酵母、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である宿主細胞。
- 前記原核細胞は大腸菌であり、前記哺乳動物細胞はHEK293E細胞、CHO細胞またはNS0細胞である、ことを特徴とする請求項7に記載の宿主細胞。
- 前記抗PCSK9モノクローナル抗体の重鎖の定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4を含み、前記軽鎖の定常領域はCκまたはCλを含む、請求項1に記載の抗PCSK9のモノクローナル抗体。
- 前記重鎖の定常領域は、IgG4またはIgG2であり、前記軽鎖の定常領域はCκ である、ことを特徴とする請求項9に記載の抗PCSK9のモノクローナル抗体。
- 請求項1に記載のモノクローナル抗体を含む、薬物。
- 前記モノクローナル抗体は、全長抗体または抗PCSK9モノクローナル抗体の断片を含み、前記断片はFab、Fab’、F(ab’)2、FvおよびScFv中の一つまたは複数の組合せである請求項11に記載の薬物。
- 請求項1に記載のモノクローナル抗体を含む検出試薬またはキット。
- 請求項1に記載のモノクローナル抗体であって、PCSK9活性を除去、阻害または低減することによって、疾患を改善、軽減、抑制または予防するように用い、前記疾患は、脂質異常血症と、心・脳血管疾患と、血栓閉塞性疾患とを含む抗体。
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