EA039191B1 - Моноклональное анти-pcsk9 антитело - Google Patents
Моноклональное анти-pcsk9 антитело Download PDFInfo
- Publication number
- EA039191B1 EA039191B1 EA201990170A EA201990170A EA039191B1 EA 039191 B1 EA039191 B1 EA 039191B1 EA 201990170 A EA201990170 A EA 201990170A EA 201990170 A EA201990170 A EA 201990170A EA 039191 B1 EA039191 B1 EA 039191B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- dfsk9
- lcdr1
- lcdr2
- hcdr1
- Prior art date
Links
- 102100038955 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 101001098868 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Proteins 0.000 claims abstract 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 claims 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims 1
- 101710180553 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Proteins 0.000 abstract description 55
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 25
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 abstract description 4
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 abstract 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 abstract 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 38
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 23
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 14
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 14
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 12
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 9
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 9
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003211 Arteriosclerosis coronary artery Diseases 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 208000030831 Peripheral arterial occlusive disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 206010045261 Type IIa hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 2
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 229960002027 evolocumab Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100040199 Apolipoprotein B receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101100135844 Homo sapiens PCSK9 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000030673 Homozygous familial hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 208000000563 Hyperlipoproteinemia Type II Diseases 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010015340 Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein-1 Proteins 0.000 description 1
- 229940127355 PCSK9 Inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102100021923 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010022249 Proprotein Convertase 9 Proteins 0.000 description 1
- 108010044159 Proprotein Convertases Proteins 0.000 description 1
- 102000006437 Proprotein Convertases Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039066 Very low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710177612 Very low-density lipoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229960004539 alirocumab Drugs 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 108010091513 apolipoprotein B receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229950011350 bococizumab Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 108010018413 epidermal growth factor precursor Proteins 0.000 description 1
- 201000001386 familial hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229950006208 lodelcizumab Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000009521 phase II clinical trial Methods 0.000 description 1
- 238000009522 phase III clinical trial Methods 0.000 description 1
- -1 polybutylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 229920001707 polybutylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229940028952 praluent Drugs 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 229940017164 repatha Drugs 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 208000023516 stroke disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Предложены моноклональное анти-PCSK9 (пропротеиновая конвертаза субтилизин/кексинового типа 9) антитело, аминокислотная последовательность, содержащая вариабельные области и CDR области кодируемого антитела, способ получения этого моноклонального антитела и его применения. Моноклональные антитела к PCSK9 получают из фаговой библиотеки антител посредством скрининга; созревание аффинности достигается с использованием способа, в котором фаговую библиотеку антител конструируют посредством замещения цепей; библиотеку создают для скрининга мутаций в областях CDR1, 2, 3 легкой цепи моноклональных антител, полученных при первичном скрининге; выбирают моноклональные антитела, имеющие высокую аффинность, и затем библиотеку создают для скрининга мутаций в областях CDR1, 2, 3 тяжелой цепи моноклональных антител, имеющих высокую аффинность; и наконец посредством скрининга получают моноклональное анти-PCSK9 антитело, имеющее высокую аффинность. Это анти-PCSK9 антитело имеет хорошую аффинность к PCSK9, может ингибировать объединение PCSK9 с его лигандом и может быть использовано для лечения дислипидемии, сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваний и тромботических окклюзионных заболеваний.
Description
Область изобретения
Заявка относится к области инженерии антител и, в частности, к полностью человеческому моноклональному антителу против пропротеиновой конвертазы субтилизин/кексинового типа 9 (PCSK9), к способу его получения и его применению.
Предшествующий уровень техники
Пропротеиновая конвертаза субтилизин/кексинового типа 9 (PCSK9) принадлежит к подсемейству протеиназы K пропротеиновой конвертазы. Ген PCSK9 человека находится в хромосоме 1р32.3, имеет длину примерно 22 т.п.н., имеет 12 экзонов и способен кодировать белок, имеющий 692 аминокислотных остатка. Белок PCSK9 состоит из сигнального пептида, переднего структурного домена, каталитического домена и карбоксильного концевого структурного домена (V-структурного домена), синтезируется в виде растворимого предшественника массой 74 кДа и способен генерировать пропептид массой 14 кДа и зрелую протеазу массой 60 кДа посредством каталитического авторасщепления в эндоплазматическом ретикулуме. PCSK9 в основном экспрессируется в печени, кишечном тракте и почках, а также слабо экспрессируется в коже и нервной системе, но только PCSK9 в печени может секретироваться в систему кровообращения.
Исследование показывает, что PCSK9 способен опосредовать деградацию рецептора липопротеинов низкой плотности (LDLR) для регулирования уровня холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL-C) в плазме и процесс эндоцитоза LDL, опосредованный LDLR в печени, является основным путем удаления LDL из системы кровообращения. LDLR представляет собой белок, имеющий множество структурных доменов, и его внеклеточный домен тесно связан с гомологичными структурными доменами EGF-A, EGF-B и EGF-C предшественника эпидермального фактора роста. Когда деградация LDLR опосредуется PCSK9, PCSK9 прежде всего должен соединиться с LDLR, причем LDLR в основном имеет сайт связывания, который преимущественно представляет собой EGF-A, и образуется структура из PCSK9 и EGF-A. Исследование показывает, что PCSK9 также способен регулировать метаболизм холестерина с помощью рецептора липопротеинов очень низкой плотности, рецептора аполипопротеина В и рецептора аполипопротеина Е, но молекулярные механизмы этого не ясны.
Основное исследование и клинические испытания показывают, что, ингибируя активность PCSK9 посредством мер эктогенного вмешательства, выведение липопротеинов низкой плотности (LDL) из плазмы можно ускорить и таким образом может быть достигнута функция уменьшения жира крови. В настоящее время ингибиторы PCSK9 включают главным образом моноклональные антитела, антисмысловые нуклеотиды, малую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту (РНК), пептиды-имитаторы, низкомолекулярные ингибиторы и т.п.
Медицина на основе моноклональных антител представляет собой исследование и разработку в области биомедицины в этом году, обладающие хорошими характеристиками нацеливания, высокой специфичностью, низким токсическим и побочным эффектом и т.п. Это является новейшим направлением развития в области медицинского лечения. Моноклональное антитело, мишенью которого является PCSK9, может специфично объединяться с PCSK9 и способно препятствовать взаимодействию PCSK9 и LDLR и замедлять процесс деградации LDLR так, чтобы получить эффект снижения уровня LDL-C (холестерина липопротеидов низкой плотности). Клинические экспериментальные данные показали безопасность, эффективность и уникальное клиническое значение применения терапии на основе моноклональных анти-PCSK9 антител.
Полностью человеческое антитело является основным направлением разработки терапевтических антител. Благодаря методике библиотеки антител обеспечивается хорошая техническая платформа для получения и скрининга человеческих антител. Благодаря методике библиотеки антител исключается необходимость в ключевом гибридомном процессе в традиционном процессе исследования моноклональных антител и даже различные гены антител и молекулярные фрагменты антител могут быть получены без иммунологического процесса. Фаговая библиотека антител в настоящее время является самой ранней и наиболее широко используемой библиотекой антител. В соответствии с источником генов антител библиотека фаговых антител делится на иммунную библиотеку и неиммунную библиотеку, а неиммунная библиотека также включает природную библиотеку, полусинтетическую библиотеку и полностью синтетическую библиотеку. При скрининге фаговой библиотеки антител имитируют процесс созревания аффинности антител. Обычно антиген покрывают твердофазной средой, добавляют фаговую библиотеку антител, предназначенную для скрининга, и выполняют несколько циклов процессов адсорбция, промывка, элюирование и амплификация (т.е. элютрирование) вплоть до выявления антитела, обладающего высокой аффинностью.
В настоящее время несколько фармацевтических компаний активно разрабатывают лекарственные средства на основе моноклональных антител, нацеленные на PCSK9. Repatha (эволокумаб) от Amgen и Praluent (алирокумаб) от Sanofi/Regeneron оба являются полностью человеческими антителами, последовательно разрешены к продаже в 2015 г. и применяются для лечения первичной гиперхолестеринемии и семейной гиперхолестеринемии (гетерозиготной и гомозиготной). С помощью статина вместе с зволокумабом уровень холестерина LDL-C у пациента, страдающего первичной гиперхолестеринемией, может быть снижен на 77%, уровень холестерина LDL-C у пациента, страдающего гетерозиготной семейной
- 1 039191 гиперхолестеринемией, может быть снижен на 68%, и уровень холестерина LDL-C пациента, страдающего гомозиготной семейной гиперхолестеринемией, может быть снижен на 31%. Эволокумаб обладает хорошей переносимостью, и в настоящее время не имеется заметных проблем с его безопасностью. Человеческое моноклональное антитело бокоцизумаб от Pfizer проходит фазу III клинического испытания, а человеческое моноклональное антитело лоделцизумаб (lodelcizumab) от Novartis проходит фазу II клинического испытания. Roche и Merck также проходят клинические испытания.
В настоящее время в Китае по-прежнему отсутствуют самостоятельно разработанные полностью человеческие анти-PCSK9 антитела, обладающие высокой аффинностью.
Краткое изложение сущности изобретения
В данном изобретении предлагаются моноклональные антитела против пропротеиновой конвертазы субтилизин/кексинового типа 9 (PCSK9). Моноклональные анти-PCSK9 антитела подвергают скринингу из полностью синтетической библиотеки антител; создают синтетическую фаговую библиотеку легких цепей антител малой емкости с помощью компьютерного конструирования и анализа; посредством скрининга получают библиотеку мутаций в определяющих комплементарность областях CDR1, 2, 3 легкой цепи моноклональных анти-PCSK9 антител; после скрининга выбирают моноклональные антитела, имеющие высокую аффинность; создают библиотеку для скрининга мутаций в областях CDR1, 2, 3 тяжелой цепи моноклональных антител; и наконец с помощью скрининга получают моноклональное анти-PCSK9 антитело, обладающее высокой аффинностью. Моноклональное анти-PCSK9 антитело имеет совершенно новые последовательности, хорошие функции in vitro, особенно на клеточном уровне, и очень хорошие перспективы применения в медицине.
Для достижения вышеуказанных целей в изобретении предложено моноклональное анти-PCSK9 антитело, включающее легкие цепи и тяжелые цепи; определяющие комплементарность области CDR1, CDR2 и CDR3 легких цепей представлены LCDR1, LCDR2 и LCDR3 соответственно; кроме того, определяющие комплементарность области CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелых цепей представлены HCDR1, HCDR2 и HCDR3 соответственно; LCDR1 включает любую из RASQSIDNRLT (SEQ ID NO:22), RASQSVRNWLD (SEQ ID NO:23), RASQGINSWLN (SEQ ID NO:24), RASQNVNNWLN (SEQ ID NO:25), RASQNINSWLN (SEQ ID NO:26), RASQNINNWLN (SEQ ID NO:27), RASQGIHNWLN (SEQ ID NO:28), RASQDVDSWLT (SEQ ID NO:29), RASQSVRNWLN (SEQ ID NO:30), RASQDVRNWLT (SEQ ID NO:31) или RASQSIRSYLN (SEQ ID NO:32); LCDR2 включает любую из DASSRQS (SEQ ID NO:33), GASTLES (SEQ ID NO:34), AASTRET (SEQ ID NO:35), GASSRQS (SEQ ID NO:36), GASTRPT (SEQ ID NO:37), DASNRQS (SEQ ID NO:38), GASNLAS (SEQ ID NO:39), DASNLQS (SEQ ID NO:40) или DASSRPT (SEQ ID NO:41); LCDR3 включает любую из QQPENDPTT (SEQ ID NO:42), QQDNDIPLT (SEQ ID NO:43), QQWNNTPNT (SEQ ID NO:44), QQDNDMPLT (SEQ ID NO:45), QQWFDVPTT (SEQ ID NO:46), QQWDDTPNT (SEQ ID NO:47), QQNSNIPLT (SEQ ID NO:48), QQDSKIPLT (SEQ ID NO:49), QQWTDTPLT (SEQ ID NO:50), QQDDSTPPT (SEQ ID NO:51) или QQGDSMPMT (SEQ ID NO:52); HCDR1 включает любую из GGTFTNNA (SEQ ID NO:53), GYTVTSYG (SEQ ID NO:54) или GYSLTSYG (SEQ ID NO:55); HCDR2 включает любую из RIIPMFGMA (SEQ ID NO:56), WLSFYNGNT (SEQ ID NO:57), WVTFYNGNT (SEQ ID NO:58), WVSFYQGNT (SEQ ID NO:59), WVSFYNGQT (SEQ ID NO:60) или WVSFYNGNS (SEQ ID NO:61); HCDR3 включает AREGIPMI (SEQ ID NO:62), ARGYSLDV (SEQ ID NO:63), ARGYGMSI (SEQ ID NO:64), ARGFGMDR (SEQ ID NO:65), ARGYGMTV (SEQ ID NO:66) или ARGFGLSV (SEQ ID NO:67).
Здесь аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи предпочтительно выбрана из любой из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:21.
Здесь аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи предпочтительно выбрана из любой из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10.
Здесь последовательность HCDR1 вариабельной области тяжелой цепи выбрана из любой из GYTVTSYG (SEQ ID NO:54) или GYSLTSYG (SEQ ID NO:55); последовательность LCDR1 вариабельной области легкой цепи выбрана из любой аминокислотной последовательности RASQSVRNWLD (SEQ ID NO:23), RASQNVNNWLN (SEQ ID NO:25), RASQNINSWLN (SEQ ID NO:26), RASQNINNWLN (SEQ ID NO:27) или RASQDVDSWLT (SEQ ID NO:29); последовательность HCDR2 вариабельной области тяжелой цепи выбрана из любой аминокислотной последовательности WVSFYQGNT (SEQ ID NO:59), WVSFYNGQT (SEQ ID NO:60) или WVSFYNGNS (SEQ ID NO:61); последовательность LCDR2 вариабельной области легкой цепи выбрана из любой аминокислотной последовательности GASTLES (SEQ ID NO:34), AASTRET (SEQ ID NO:35), GASSRQS (SEQ ID NO:36), GASTRPT (SEQ ID NO:37) или GASNLAS (SEQ ID NO:39); последовательность HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи выбрана из любой аминокислотной последовательности ARGYSLDV (SEQ ID NO:63), ARGYGMSI (SEQ ID NO:64), ARGFGMDR (SEQ ID NO:65) или ARGYGMTV (SEQ ID NO:66); последовательность LCDR3 вариабельной области легкой цепи выбрана из любой аминокислотной последовательности QQDNDIPLT (SEQ ID NO:43), QQDNDMPLT (SEQ ID NO:45), QQWFDVPTT (SEQ ID NO:46), QQWDDTPNT (SEQ ID NO:47) или QQDSKIPLT (SEQ ID NO:49).
- 2 039191
Здесь в изобретении дополнительно предлагаются многочисленные антитела, полипептиды или белки, имеющие вышеуказанную легкую цепь или тяжелую цепь.
Здесь в изобретении дополнительно предлагаются многочисленные антитела, имеющие вышеуказанную легкую цепь или тяжелую цепь, антитела, способные специфично связываться с PCSK9, препятствуя связыванию PCSK9 с LDLD, увеличивая количество LDLR на поверхности клетки или уровень LDLR в системе кровообращения и снижая уровень LDL или LDL-C в системе кровообращения.
Здесь в изобретении дополнительно предлагается полинуклеотидная последовательность или полинуклеотидная комбинация, имеющая вышеуказанную легкую цепь или тяжелую цепь.
Здесь константная область тяжелой цепи моноклонального анти-PCSK9 антитела включает IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 и константная область легкой цепи включает Ск или Ολ.
Здесь константная область тяжелой цепи предпочтительно включает IgG4 или IgG2 и предпочтительно эукариотический экспрессионный вектор или прокариотический экспрессионный вектор тяжелой цепи.
Здесь константная область легкой цепи предпочтительно включает Ск и предпочтительно эукариотический экспрессионный вектор или прокариотический экспрессионный вектор легкой цепи.
Здесь в изобретении дополнительно предлагается экспрессионный рекомбинантный ДНК-вектор, имеющий полинуклеотидную последовательность или комбинацию; последовательность ДНК экспрессионного рекомбинантного ДНК-вектора включает ДНК-последовательность для кодирования антиPCSK9 антитела в вышеуказанной вариабельной области тяжелой цепи, константной области тяжелой цепи, вариабельной области легкой цепи и константной области легкой цепи.
Здесь в изобретении дополнительно предлагаются клетки-хозяева, трансфицированные экспрессионным рекомбинантным ДНК-вектором, и эти клетки-хозяева включают прокариотическую клетку, клетку дрожжей и клетку насекомых или млекопитающих.
Здесь прокариотическая клетка предпочтительно представляет собой Escherichia coli.
Здесь клетка млекопитающих предпочтительно представляет собой клетку эмбриональной почки человека 293 (HEK293), клетку яичника китайского хомячка (СНО) или клетку миеломы (NS0).
Здесь в изобретении дополнительно предлагаются многочисленные полноразмерные антитела, одноцепочечные антитела, однодоменные антитела, биспецифические антитела и конъюгаты антителолекарственное средство.
Здесь в изобретении дополнительно предлагаются многочисленные моноклональные антитела, искусственные векторы, лекарственные средства или лекарственные композиции, имеющие вышеуказанную легкую цепь или тяжелую цепь.
Здесь моноклональные антитела включают полноразмерные антитела и фрагменты моноклонального анти-PCSK9 антитела и фрагменты включают, без ограничения ими, Fab, Fab', F(ab')2, Fv или ScFv.
Здесь в изобретении дополнительно предложен реагент или набор для обнаружения, имеющий вышеуказанную легкую цепь или тяжелую цепь.
Антитело по изобретению может быть применено к заболеваниям, которые облегчают, ослабляют, ингибируют или предупреждают путем устранения, ингибирования или снижения активности PCSK9, и эти заболевания включают дислипидемию, сердечно-сосудистые и цереброваскулярные заболевания и тромботические окклюзионные заболевания.
Здесь дислипидемия включает повышение уровня холестерина, повышение уровня триглицеридов, повышение уровня липопротеинов низкой плотности и снижение уровня липопротеинов высокой плотности. Сердечно-сосудистые и цереброваскулярные заболевания включают коронарные артериосклеротические сердечные заболевания, острый инфаркт миокарда, атеросклероз, инсульт и окклюзионные заболевания периферических артерий.
Способ получения анти-PCSK9 моноклонального антитела включает (1 ) проведение биопэннинга в отношении одноцепочечного анти-PCSK9 антитела и проведение трех циклов обогащающего скрининга библиотеки антител с получением последовательности антитела DFSK9-1, имеющей высокую аффинность, из полностью синтетической ScFv-фаговой библиотеки; тяжелая цепь DFSKSK9-H1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 и легкая цепь DF9-L1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11;
(2 ) на основе DFSK9-1, посредством компьютерного моделирования третичной структуры, разработку и создание библиотеки антител с мутациями определяющих комплементарность областей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, проведение биопэннинга и скрининга положительного клонирования и идентификация в библиотеке антител мутаций с получением 10 одноцепочечных последовательностей антител, имеющих разные легкие цепи, которые соответственно названы как DFSK9-2, DFSK9-3, DFSK9-4, DFSK9-5, DFSK9-6, DFSK9-7, DFSK9-8, DFSK9-9, DFSK9-10 и DFSK9-11, соответствующие вариабельные области легкой цепи соответственно названы как DFSK9-L2, DFSK9-L3, DFSK9-L4, DFSK9-L5, DFSK9-L6, DFSK9-L7, DFSK9-L8, DFSK9-L9, DFSK9-L10 и DFSK9-L11, и соответствующие аминокислотные последовательности областей соответственно показаны в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и
- 3 039191
SEQ ID NO:21; сравнение аффинности одноцепочечных антител на уровне фага;
(3 ) выбор пяти клонов DFSK9-2, DFSK9-4, DFSK9-5, DFSK9-6 и DFSK9-8, моделирование и создание библиотеки мутаций антител в определяющих комплементарность областях CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, проведение биопэннинга и скрининг положительного клонирования, а также идентификация в тяжелой цепи мутаций тяжелой цепи с получением 10 разных последовательностей одноцепочечных антител, которые соответственно названы как DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20 и DFSK9-21; здесь DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20 и DFSK9-21 соответственно имеют последовательности вариабельной области легкой цепи DFSK9-L2, DFSK9-L8, DFSK9-L5, DFSK9-L6, DFSK9-L5, DFSK9-L6, DFSK9-L5, DFSK9-L4, DFSK9-L6 и DFSK9-L6; соответствующие аминокислотные последовательности этих последовательностей соответственно показаны в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16 и SEQ ID NO:16; DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20 и DFSK9-21 соответственно имеют последовательности вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H2, DFSK9-H8, DFSK9-H7, DFSK9-H3, DFSK9-H6, DFSK9-H4, DFSK9-H4, DFSK9-H9, DFSK9-H5 и DFSK9-H10; соответствующие аминокислотные последовательности этих последовательностей соответственно показаны в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:10; сравнение аффинности одноцепочечных антител на уровне фага;
(4 ) клонирование гена вариабельной области тяжелой цепи и гена вариабельной области легкой цепи этих клонов в (3) эукариотический экспрессионный вектор, трансфицирование в клетку-хозяина и получение полного моноклонального анти-PCSK9 антитела.
Здесь CDR представляет собой область, определяющую комплементарность; ScFv представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент; ADC представляют собой конъюгаты антителолекарственное средство; LDLR представляет собой рецептор липопротеинов низкой плотности; LDL-C представляет собой холестерин липопротеинов низкой плотности; клетки HEK293E представляют собой клетки эмбриональной почки человека 293Е; клетки СНО представляют собой клетки яичника китайского хомячка; клетки NSO представляют собой клетки NSO тимомы мыши.
По сравнению с известным уровнем техники изобретение обеспечивает следующие полезные эффекты.
В изобретении предложено несколько совершенно новых анти-PCSK9 антител, которые имеют высокую аффинность связывания с субстратами, способны хорошо препятствовать связыванию PCSK9 с LDLR и, кроме того, влияют на распределение и экспрессию LDLR на поверхности клеток. Следовательно, улучшаются характеристики связывания LDLR с LDL на клеточной поверхности, улучшаются захват и деградация LDL клеткой и достигается цель сокращения внеклеточного содержания LDL и LDL-C и снижения общего холестерина LDL и LDL-C.
Моноклональное антитело, предложенное в изобретении, можно использовать для устранения, ингибирования или снижения активности PCSK9 для облегчения, снижения, ингибирования или предупреждения заболеваний; эти заболевания включают дислипидемию, сердечно-сосудистые и цереброваскулярные заболевания и тромботические окклюзионные заболевания; дислипидемия включает повышение холестерина и триглицеридов, увеличение липопротеинов низкой плотности, снижение липопротеинов высокой плотности и т.п.; сердечно-сосудистые и цереброваскулярные заболевания включают коронарные артериосклеротические сердечные заболевания, острый инфаркт миокарда, атеросклероз, инсульт, окклюзионные заболевания периферических артерий и т.п.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показано изображение плазмиды pScFvDisb-S1;
на фиг. 2 показана относительная аффинность одноцепочечных антител от положительно клонированного фага и библиотеки мутантных легких цепей антител, определенная с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA);
на фиг. 3 показано сравнение относительной аффинности одноцепочечного антитела библиотеки мутантных легких цепей антител с помощью ELISA с градиентным разбавлением на основе моноклонального положительно клонированного фага;
на фиг. 4 показано определение относительной аффинности одноцепочечного антитела библиотеки мутантных тяжелых цепей антител с помощью моноклонального положительно клонированного фага (ELISA);
на фиг. 5 показано сравнение относительной аффинности одноцепочечного антитела библиотеки мутантных тяжелых цепей антител с помощью ELISA с градиентным разбавлением на основе моноклонального положительно клонированного фага;
на фиг. 6 показано изображение плазмиды pTSEG4;
на фиг. 7 показано изображение плазмиды pTSEK;
на фиг. 8 показан тест связывания полного антитела против пропротеиновой конвертазы субтилизин/кексинового типа 9 (PCSK9) с PCSK9 на молекулярном уровне;
- 4 039191 на фиг. 9 показано, что aHTU-PCSK9 антитело конкурентно ингибирует связывание рецептора липопротеина низкой плотности (LDLR) и PCSK9;
на фиг. 10 показано тестирование биологической активности полного анти-PCSK9 антитела.
Подробное описание воплощений
Подробные способы реализации изобретения показаны в воплощениях. Экспериментальные методы и реагенты, описанные в воплощениях, представляют собой обычные экспериментальные методы и реагенты без специального описания. Нижеследующее описание используется только для иллюстрации и интерпретации настоящего описания изобретения, но не для какого-либо его ограничения.
В описании изобретения предложен один тип моноклонального антитела, которое специфично связывается с пропротеиновой конвертазой субтилизин/кексинового типа 9 (PCSK9), последовательность вариабельной области тяжелой цепи включает любую из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и последовательность вариабельной области легкой цепи включает любую из SEQ ID NO:11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 21.
Предпочтительно последовательность вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела, которое специфично связывается с PCSK9, выбирают из любой из SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 и последовательность вариабельной области легкой цепи выбирают из любой из SEQ ID NO:12, 14, 15, 16 и 18.
Посредством скрининга фаговой библиотеки легкой цепи аминокислотная последовательность областей, определяющих комплементарность, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 легкой цепи или функциональные фрагменты легкой цепи антитела выбирают из любой комбинации следующим образом (как показано в табл. 1).
Таблица 1
Аминокислотные последовательности разных CDR легкой цепи
| Номер | LCDR1 | LCDR2 | LCDR3 |
| А | RASQSIDNRLT (SEQ ID NO:22) | DASSRQS (SEQ ID NO:33) | QQPENDPTT (SEQ ID NO:42) |
| В | RASQSVRNWLD (SEQ ID NO:23) | GASTLES (SEQ ID NO:34) | QQDNDIPLT (SEQ ID NO:43) |
| С | RASQGINSWLN (SEQ ID NO:24) | AASTRET (SEQ ID NO:35) | QQWNNTPNT (SEQ ID NO:44) |
| D | RASQNVNNWLN (SEQ ID NO:25) | AASTRET (SEQ ID NO:35) | QQDNDMPLT (SEQ ID NO:45) |
| Е | RASQNINSWLN (SEQ ID NO:26) | GASSRQS (SEQ ID NO:36) | QQWFDVPTT (SEQ ID NO:46) |
| F | RASQNINNWLN (SEQ ID NO:27) | GASTRPT (SEQ ID NO:37) | QQWDDTPNT (SEQ ID NO:47) |
| G | RASQGIHNWLN (SEQ ID NO:28) | DASNRQS (SEQ ID NO:38) | QQNSNIPLT (SEQ ID NO:48) |
| Н | RASQDVDSWLT (SEQ ID NO:29) | GASNLAS (SEQ ID NO:39) | QQDSKIPLT (SEQ ID NO:49) |
| I | RASQSVRNWLN (SEQ ID NO:30) | DASNLQS (SEQ ID NO:40) | QQWTDTPLT (SEQ ID NO:50) |
| J | RASQDVRNWLT (SEQ ID NO:31) | GASNLAS (SEQ ID NO:39) | QQDDSTPPT (SEQ ID NO:51) |
| К | RASQSIRSYLN (SEQ ID NO:32) | DASSRPT (SEQ ID NO:41) | QQGDSMPMT (SEQ ID NO:52) |
Посредством скрининга фаговой библиотеки тяжелой цепи, CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи антитела или функционального фрагмента соответственно представлены HCDR1, HCDR2 и HCDR3: HCDR1 представляет собой одну из GGTFTNNA (SEQ ID NO:53), GYTVTSYG (SEQ ID NO:54) или GYSLTSYG (SEQ ID NO:55); HCDR2 представляет собой одну из RIIPMFGMA (SEQ ID NO:56), WLSFYNGNT (SEQ ID NO:57), WVTFYNGNT (SEQ ID NO:58), WVSFYQGNT (SEQ ID NO:59), WVSFYNGQT (SEQ ID NO:60) или WVSFYNGNS (SEQ ID NO:61); HCDR3 представляет собой одну из AREGIPMI (SEQ ID NO:62), ARGYSLDV (SEQ ID NO:63), ARGYGMSI (SEQ ID NO:64), ARGFGMDR (SEQ ID NO:65), ARGYGMTV (SEQ ID NO:66) или ARGFGLSV (SEQ ID NO:67).
Предпочтительно, посредством скрининга фаговой библиотеки тяжелой цепи, моноклональное антитело, которое специфично связывается с PCSK9, включает вариабельные области тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3 и вариабельные области легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи HCDR1 представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из GYTVTSYG (SEQ ID NO:54) или GYSLTSYG (SEQ ID NO:55); последова- 5 039191 тельность вариабельной области легкой цепи LCDR1 представляет собой любую аминокислотную последовательность, выбранную из RASQSVRNWLD (SEQ ID NO:23), RASQNVNNWLN (SEQ ID NO:25), RASQNINSWLN (SEQ ID NO:26), RASQNINNWLN (SEQ ID NO:27) или RASQDVDSWLT (SEQ ID NO:29); последовательность вариабельной области тяжелой цепи HCDR2 представляет собой любую аминокислотную последовательность, выбранную из WVSFYQGNT (SEQ ID NO:59), WVSFYNGQT (SEQ ID NO:60) или WVSFYNGNS (SEQ ID NO:61); последовательность вариабельной области легкой цепи LCDR2 представляет собой любую аминокислотную последовательность, выбранную из GASTLES (SEQ ID NO:34), AASTRET (SEQ ID NO:35), GASSRQS (SEQ ID NO:36), GASTRPT (SEQ ID NO:37) или GASNLAS (SEQ ID NO:39); последовательность вариабельной области тяжелой цепи HCDR3 представляет собой любую аминокислотную последовательность, выбранную из ARGYSLDV (SEQ ID NO:63), ARGYGMSI (SEQ ID NO:64), ARGFGMDR (SEQ ID NO:65) или ARGYGMTV (SEQ ID NO:66); последовательность вариабельной области легкой цепи LCDR3 представляет собой любую аминокислотную последовательность, выбранную из QQDNDIPLT (SEQ ID NO:43), QQDNDMPLT (SEQ ID NO:45), QQWFDVPTT (SEQ ID NO:46), QQWDDTPNT (SEQ ID NO:47) или QQDSKIPLT (SEQ ID NO:49).
Способ получения специфического антитела посредством полного синтеза одноцепочечной фаговой библиотеки ScFv-фрагментов антител, полностью человеческое моноклональное антитело, которое специфично связывается с PCSK9, получают посредством скрининга с использованием способа фаговой библиотеки антител, включающего (1) проведение биопэннинга в отношении одноцепочечного анти-PCSK9 антитела и проведение трех циклов обогащающего скрининга библиотеки антител с получением последовательности антитела DFSK9-1, имеющего высокую аффинность;
(2) на основании DFSK9-1, с помощью компьютерного моделирования, создание библиотеки мутаций легкой цепи CDR123 и проведение биопэннинга, скрининга и идентификации положительного клона в библиотеке антител с получением 10 разных последовательностей легкой цепи антител, включающих клоны DFSK9-2, DFSK9-3, DFSK9-4, DFSK9-5, DFSK9-6, DFSK9-7, DFSK9-8, DFSK9-9, DFSK9-10 и DFSK9-11; сравнение аффинности вышеуказанных 10 одноцепочечных антител на уровне фага;
(3) выбор пяти клонов, имеющих высокую аффинность, и создание библиотеки тяжелой цепи CDR123, проведение биопэннинга, скрининга и идентификации положительного клона в библиотеке антител с получением одноцепочечных антител с разными последовательностями, включающими DFSK912, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20 и DFSK921; сравнение аффинности одноцепочечных антител на уровне фага;
(4) клонирование гена вариабельной области тяжелой цепи и гена вариабельной области легкой цепи клонов со стадии (3) в эукариотическом экспрессирующем векторе, трансфицированном в клеткухозяина, с получением полного моноклонального анти-PCSK9 антитела.
Предпочтительно дополнительно проводят тест на аффинность и биологическую активность полного моноклонального анти-PCSK9 антитела со стадии (4).
Конкретные воплощения
Настоящая заявка подробно описана ниже вместе с графическими материалами и воплощениями.
Воплощение 1. Биопэннинг моноклонального антитела против пропротеиновой конвертазы субтилизин/кексинового типа 9 (PCSK9).
Модифицируют вектор pCom3 посредством клонирования генов, присваивают модифицированному вектору название pScFvDisb-S1 (как показано на фиг. 1) и создают на основе этого вектора полностью синтетическую фаговую библиотеку антител.
Покрывают антигеном PCSK9-His 10 мкг/1 мл/пробирка иммунную пробирку в течение ночи при 4°С. Блокируют иммунную пробирку и фаговую библиотеку антител (количество фага составляет примерно 109-1012), соответственно, с использованием PBST-4% молока в течение 1 ч при 37°С, помещают блокированную фаговую библиотеку антител в иммунную пробирку для связывания антигена с антителом и осуществляют взаимодействие в течение 1 ч при 37°С; промывают несвязанный фаг с использованием фосфатно-буферного раствора - фосфатно-солевого буфера (PBST-PBS), элюируют с использованием 0,1М глицина-HCl с рН 2,2 и нейтрализуют нейтральный элюент с использованием 1,5M Tris-HCl c рН 8,8 вплоть до примерно рН 7,0; инфицируют 10 мл элюента для роста в бактериальную жидкость XL1-Blue со значением OD (оптическая плотность) примерно 0,5-0,8, сначала оставляют стоять в течение 30 мин при 37°С и осуществляют встряхивание вибрационного стола с культурой в течение 1 ч при 150 об/мин; осуществляют градиентное разбавление 1% бактериальной жидкости, наносят на маленький планшет 2YTATG и подсчитывают выход фага; центрифугируют оставшуюся бактериальную жидкость, наносят на большой планшет 2YTATG и культивируют в течение ночи при 37°С; переносят бактерию, культивированную в течение ночи, в 2YTATG жидкую культуральную среду, встряхивают до логарифмической фазы, добавляют M13K07 для содействия фаговой инфекции, культивируют при 28°С в течение ночи для амплификации фага, выполняют очистку фага посредством осаждения с использованием PEG6000-NaCl для следующего цикла скрининга и проводят три цикла обогащения фаговой библиотеки и скрининг в полном масштабе.
- 6 039191
Воплощение 2. Скрининг положительных клонов одноцепочечного антитела против пропротеиновой конвертазы субтилизин/кексинового типа 9 (PCSK9).
После трех циклов скрининга отбирают хорошо разделенные моноклональные бактериальные колонии, инокулируют в 96-луночный планшет с глубокими лунками с жидкой культуральной средой 2YTATG, культивируют в течение 5 ч при 220 об/мин и 37°С вплоть до достижения логарифмической фазы, помещают примерно 1010хелперного фага M13K07 в каждую лунку, оставляют стоять в течение 30 мин при 37°С и выполняют встряхивание культуры в течение 1 ч при 150 об/мин; центрифугируют в течение 15 мин при 4000 об/мин, ресуспендируют осадок в жидкой культуральной среде 2YTATKA и культивируют в течение ночи при 220 об/мин и 28°С; центрифугируют в течение 15 мин при 4000 об/мин при 4°С и выполняют идентификацию посредством моноклонального твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) фаг-содержащего супернатанта; проводят скрининг одноцепочечного антитела DFSK9-1, обладающего высокой аффинностью, вариабельную область тяжелой цепи антитела называют DFSK9-H1, аминокислотная последовательность антитела показана в SEQ ID NO:1; вариабельную область легкой цепи антитела называют DFSK9-L1, аминокислотная последовательность антитела показана в
SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:1 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H1): QVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGGTFTNNAISWVRQAPGQGLEWMGRIIP
MFGMANYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREGIPMIWGQGTT VTVSS
SEQ ID NO:11 (последовательность вариабельной области легкой цепи DFSK9-L1):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDNRLTWYQQKPGKAPKLLIYDASSRQS
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPENDPTTFGQGTKVEIK
Воплощение 3. In vitro созревание аффинности одноцепочечного антитела DFSK9-1 против пропротеиновой конвертазы субтилизин/кексинового типа 9 (PCSK9).
3.1. Создание библиотеки мутаций CDR123 легкой цепи антитела DFSK9-1.
Проводят двойное расщепление pScFvDisb-DFSK9-1 плазмиды с использованием NheI и NotI, проводят электрофорез продукта расщепления на агарозном геле, разрезают гель и повторяют цикл с полосками 5,5 т.о.; проводят двойное расщепление гена VLCDR123M синтетической библиотеки мутаций легкой цепи с использованием NheI и NotI, повторяют цикл с продуктом, используя универсальный набор для рециклинга продукта; присоединяют ген библиотеки мутаций к вектору в течение 4 ч с использованием Т4 ДНК лигазы при 16°С с мольным соотношением 3:1; трансформируют продукт указанного присоединения в электрокомпетентные клетки XL1-Blue с использованием метода электропорации; при 37°С производят встряхивание культуры в течение 1 ч при 150 об/мин с достижением анабиоза; разбавляют 1% бактериальной жидкости, наносят на небольшой планшет и рассчитывают емкость библиотеки; центрифугируют остальную бактериальную жидкость в течение 15 мин при 4000 об/мин, наносят осадок на большой планшет 2YTATG, переворачивают и культивируют при 37°С в течение ночи; емкость созданной библиотеки антител составляет примерно 108, случайным образом отбирают 20 клонов для проведения анализа последовательности, причем как показатель точности последовательности, так и разнообразие составляют более 90%.
3.2. Биопэннинг фаговых библиотек антител и скрининг положительных клонов.
Биопэннинг и скрининг положительных клонов выполняют с использованием способов из воплощения 1 и воплощения 2, секвенируют клоны, имеющие высокую аффинность, с получением 10 разных последовательностей одноцепочечных антител, которые соответственно называют DFSK9-2, DFSK9-3, DFSK9-4, DFSK9-5, DFSK9-6, DFSK9-7, DFSK9-8, DFSK9-9, DFSK9-10 и DFSK9-11, соответствующую вариабельную область легкой цепи называют DFSK9-L2, DFSK9-L3, DFSK9-L4, DFSK9-L5, DFSK9-L6, DFSK9-L7, DFSK9-L8, DFSK9-L9, DFSK9-L10 и DFSK9-L11, и соответствующие аминокислотные последовательности соответственно показаны в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21; последовательности вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:21 показаны ниже.
SEQ ID NO:12 (последовательность вариабельной области легкой цепи DFSK9-L2):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRNWLDWYQQKPGKAPKLLIYGASTLE
SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNDIPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:13 (последовательность вариабельной области легкой цепи DFSK9-L3):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINSWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTRE
TGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNNTPNTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:14 (последовательность вариабельной области легкой цепи DFSK9-L4):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVNNWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTR
ETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNDMPLTFGQGTKVEIK
- 7 039191
SEQ ID NO:15 (последовательность вариабельной области легкой цепи DFSK9-L5):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINSWLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSRQ
SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWFDVPTTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:16 (последовательность вариабельной области легкой цепи DFSK9-L6):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINNWLNWYQQKPGKAPKLLIYGASTRP
TGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWDDTPNTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:17 (последовательность вариабельной области легкой цепи DFSK9-L7):
DIQMTQSP S SLS AS VGDRVTITCRASQGIHNWLNW YQQKPGKAPKLLIYD ASNR
QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNSNIPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:18 (последовательность вариабельной области легкой цепи DFSK9-L8):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVDSWLTWYQQKPGKAPKLLIYGASNL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDSKIPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:19 (последовательность вариабельной области легкой цепи DFSK9-L9):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRNWLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNL
QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWTDTPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:20 (последовательность вариабельной области легкой цепи DFSK9-L10):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVRNWLTWYQQKPGKAPKLLIYGASNL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDDSTPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:21 (последовательность вариабельной области легкой цепи DFSK9-L11):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSRPT
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDSMPMTFGQGTKVEIK
Результаты определения посредством моноклонального фагового ELISA показаны на фиг. 2.
3.3. Определение относительной аффинности одноцепочечного анти-PCSK9 антитела при помощи фагового твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с горизонтальным градиентным разбавлением.
Осуществляют метод моноклонального фагового дисплея и очистку клонов, полученных в воплощении 3.2, и проводят определение относительной аффинности моноклонального антитела посредством фагового ELISA с горизонтальным градиентным разбавлением.
Покрывают PCSK9-His (300 нг/лунка/100 мкл) при помощи 0,01M фосфатно-солевого буфера (PBS) с рН 7,2 и проводят покрытие в течение ночи при 4°С; промывают три раза полибутилентерефталатом (PBST) и блокируют с помощью PBST-4% молока при 37°С в течение 1 ч; добавляют очищенный образец фага (100 мкл/лунка), который разбавляют PBST-4% молока для получения пятикратного градиента и оставляют стоять в течение 1 ч при 37°С; промывают PBST пять раз, добавляют моноклональное антиM13-HRP антитело (100 мкл/лунка), которое разбавляют PBST-4% молоком в соотношении 1:5000, и оставляют стоять в течение 1 ч при 37°С; проявляют с помощью набора для проявления с тетраметилбензидином (ТМВ) (100 мкл/лунка) в течение 10 мин при комнатной температуре и заканчивают проявку с помощью 2M H2SO4 (50 мкл/лунка); считывают показатели с помощью микропланшетного ридера при длинах волн 450 и 630 нм; анализируют данные и графически изображают, используя программу GraphPad Prism 5 Demo (результаты показаны на фиг. 3). Результаты показывают, что все отобранные в результате скрининга фаговые одноцепочечные антитела способны связываться с PCSK9. Аффинности DFSK9-2, DFSK9-4, DFSK9-5, DFSK9-6 и DFSK9-8 к PCSK9 значительно выше, чем у других клонов, и пять одноцепочечных антител отбирают для следующего теста.
Воплощение 4. In vitro созревание аффинности отобранных в результате скрининга одноцепочечных антител против пропротеиновой конвертазы субтилизин/кексинового типа 9 (PCSK9) в течение другого периода.
4.1. Создание библиотеки мутаций CDR123 тяжелой цепи с использованием метода замены цепей.
Проводят двойное расщепление смешанной плазмиды пяти одноцепочечных антител, включающих DFSK9-2, DFSK9-4, DFSK9-5, DFSK9-6 и DFSK9-8 в воплощении 3.3, с использованием NcoI-HF и KpnI, разрезают гель и повторяют цикл с полоской 5,5 т.о.; проводят двойное расщепление гена VLCDR123M синтетической библиотеки мутаций тяжелой цепи с использованием NheI и NotI и повторяют цикл с продуктом расщепления, используя универсальный набор для рециклинга; присоединяют ген библиотеки мутаций к вектору в течение 4 ч с использованием Т4 ДНК лигазы при 16°С с мольным соотношением 3:1; трансформируют продукт присоединения в электрокомпетентные клетки XL1-Blue с использованием метода электропорации; при 37°С производят встряхивание культуры в течение 1 ч при 150 об/мин с достижением анабиоза; разбавляют 1% бактериальной жидкости, наносят на небольшой планшет и рассчитывают емкость библиотеки; центрифугируют остальную бактериальную жидкость в течение 15 мин при 4000 об/мин, наносят осадок на большой планшет 2YTATG, переворачивают и культивируют при 37°С в течение ночи; емкость созданной библиотеки антител составляет примерно 5*108, случайным образом
- 8 039191 выбирают 20 клонов для проведения анализа последовательности, причем как показатель точности последовательности, так и разнообразие составляют более 90%.
4.2. Биопэннинг фаговых библиотек антител и скрининг положительных клонов.
Осуществляют метод фагового дисплея и очистку библиотеки антител в воплощении 4.1; проводят пэннинг анти-PCSK9 одноцепочечных антител; метод биопэннинга фаговой библиотеки антител и скрининг положительных клонов были такими же, как в воплощении 1 и воплощении 2; секвенируют для скрининга 10 разных последовательностей анти-PCSK9 антител, которые соответственно называют DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20 и DFSK9-21; здесь DFSK9-12 имеет последовательность вариабельной области легкой цепи DFSK9-L2, и соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:12; DFSK9-13 имеет последовательность вариабельной области легкой цепи DFSK9-L8, и соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:18; DFSK9-14, DFSK9-16 и DFSK9-18 имеют последовательность вариабельной области легкой цепи DFSK9-L5, и соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:15; DFSK9-15, DFSK9-17, DFSK9-20 и DFSK9-21 имеют последовательность вариабельной области легкой цепи DFSK9-L6, и соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:16; DFSK9-19 имеет последовательность вариабельной области легкой цепи DFSK9-L4, и соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:14; DFSK912 имеет последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H2, и соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:2; DFSK9-13 имеет последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H8, и соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:8; DFSK9-14 имеет последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9H7, и соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:7; DFSK9-15 имеет последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H3, и соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:3; DFSK9-16 имеет последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H6, и соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:6; DFSK9-17 и DFSK9-18 имеют последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9H4, и соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:4; DFSK9-19 имеет последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H9, и соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:9; DFSK9-20 имеет последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H5, и соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:5; DFSK9-21 имеет последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H10, и соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:10. Последовательности вариабельной области легкой цепи показаны в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 и SEQ ID NO:18 в воплощении 3.2, и аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:10 являются следующими:
SEQ ID NO:2 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H2):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWLSFY
NGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTV
TVSS
SEQ ID NO:3 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H3): QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQ
GLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARG
YSLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:4 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H4): QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQ
GLEWMGWVSFYNGNSNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARG
YSLD VWGQGTT VT VS S
SEQ ID NO:5 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H5): QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQ
GLEWMGWVSFYNGNSNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARG FGMDRWGQGTT VT VS S
SEQ ID NO:6 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H6):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVS
FYQGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGMDRWGQG
TTVTVSS
SEQ ID NO:7 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H7):
- 9 039191
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVS
FYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYGMSIWGQGT
TVTVSS
SEQ ID NO:8 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H8):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVS
FYQGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYGMTVWGQG
TTVTVSS
SEQ ID NO:9 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H9):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVT
FYNGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGLSVWGQGT
TVTVSS
SEQ ID NO:10 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи DFSK9-H10):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVS
FYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGMDRWGQG
TTVTVSS
Определение с помощью моноклональной фаговой ELISA относительной аффинности фаговых Ab показано на фиг. 4.
4.3. Определение аффинности одноцепочечных анти-PCSK9 антител с помощью фаговой ELISA с градиентным разбавлением.
Осуществляют метод моноклонального фагового дисплея и очистку клонов, полученных в воплощении 4.2, и проводят определение аффинности одноцепочечного антитела с помощью фаговой ELISA с горизонтальным градиентным разбавлением, с использованием тех же методов, что и в воплощении 3.3 воплощения 3. Результаты представлены на фиг. 5. Все десять разных отобранных в результате скрининга одноцепочечных антител способны хорошо связываться с PCSK9 и имеют более высокую аффинность, чем первичный одноцепочечный DFSK9-1.
Воплощение 5. Определение аффинности полных антител против пропротеиновой конвертазы субтилизин/кексинового типа 9 (PCSK9).
5.1. Получение полных анти-PCSK9 антител.
Клонируют ген тяжелой цепи VH антитела, отобранного в результате скрининга в воплощении 4, в вектор pTSEG4 (фиг. 6), который имеет ген константной области тяжелой цепи (γ4), клонируют ген легкой цепи VK в вектор pTSEK (фиг. 7), который имеет ген константной области легкой цепи (к цепь), а оба вектора pTSEG4 и pTSEK получают посредством трансформации на основе вектора РТТ. Способ получения вектора РТТ конкретно описан в ссылке (Yves.Durocher, Sylvie.Perret and Amine.Kamen Nucleic Acids Research, 2002, vol.30, No.2e9). Проводят временную трансфекцию клеток HEK293E, осуществляют экспрессию полного антитела и очистку с использованием аффинной колонки АКТА на основе белка А с получением полных антительных белков.
5.2. Тестирование связывания полных антител с PCSK9.
Покрывают PCSK9-His (300 нг/лунка/100 мкл) с помощью 0,01М PBS-буфера при рН 7,2 в течение ночи при 4°С, промывают три раза с помощью PBST (1% Tween 20) по 300 мкл/лунка, затем добавляют PBST-4% молока и блокируют в течение 1 ч при 37°С; добавляют полные антитела DFSK9-1, DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20 и DFSK9-21 с разными степенями разбавления; самая высокая концентрация 11-ти полных антител составляет 50 мкг/мл, разбавляют в виде пятикратного градиента, разбавляют с получением восьми градиентов для каждого полного антитела и инкубируют в течение 1 ч при 37°С; промывают 5 раз PBST по 300 мкл/лунка, затем добавляют козье античеловеческое IgG-HRP вторичное антитело, разведенное PBST-4% молоком в соотношении 1:5000, и инкубируют в течение 1 ч при 37°С; промывают 5 раз с помощью PBST по 300 мкл/лунка, проявляют с использованием набора для проявки с тетраметилбензидином (ТМВ) (100 мкл/лунка), проявку осуществляют в течение 10 мин при комнатной температуре и заканчивают с помощью 2M H2SO4 (50 мкл/лунка); считывают показатели с помощью микропланшетного ридера при длинах волн 450 и 630 нм; анализируют данные и графически изображают, используя программу GraphPad Prism 5 Demo (результаты показаны на фиг. 8 и в табл. 2). Результаты показывают, что все антитела способны хорошо связываться с PCSK9, a DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK918, DFSK9-20 и DFSK9-21 имеют высокую аффинность.
- 10 039191
Таблица 2
Значение аффинности EC50 полных антител
| Номер | Образец | ECso (нг/мл) | Номер | Образец | ЕС so (нг/мл) |
| 1 | DFSK9-1 | 170,8 | 7 | DFSK9-17 | 31,41 |
| 2 | DFSK9-12 | 64,65 | 8 | DFSK9-18 | 33,9 |
| 3 | DFSK9-13 | 83,51 | 9 | DFSK9-19 | 83,16 |
| 4 | DFSK9-14 | 42,22 | 10 | DFSK9-20 | 33,73 |
| 5 | DFSK9-15 | 39,74 | И | DFSK9-21 | 28,2 |
| 6 | DFSK9-16 | 56,21 |
5.3. Тестирование полных антител, ингибирующих связывание рецептора липопротеинов низкой плотности (LDLR) с PCSK9.
Покрывают LDLR-Fc (100 нг/лунка/100 мкл) при помощи 0,01 М буфера PBS при рН 7,2 в течение ночи при 4°С, промывают три раза с помощью PBST, затем добавляют PBST-4% молоко и блокируют в течение 1 ч при 37°С; затем добавляют 2 мкг/мл PCSK9-His (100 мкл/лунка), разведенного PBST-4% молоком, и инкубируют до 1 ч при 37°С; добавляют полные антитела DFSK9-1, DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20 и DFSK9-21 в разной степени разбавления; самая высокая концентрация 11-ти полных антител составляет 100 мкг/мл, разбавляют с пятикратным градиентом, разбавляют для восьми градиентов для каждого полного антитела, и инкубируют в течение 2 ч при 37°С; промывают 5 раз раствором PBST с последующим добавлением мышиного анти-His IgG-HRP вторичного антитела, разбавленного PBST-4% молоком и инкубируют в течение 1 ч при 37°С; проявляют, используя ТМВ набор для проявки (100 мкл/лунка), проявляя в течение 10 мин при комнатной температуре и останавливая проявку с помощью 2M H2SO4 (50 мкл/лунка); считывают показатели с помощью микропланшетного ридера при 450 и 630 нм; анализируют данные и графически изображают, используя программу GraphPad Prism 5 Demo (результаты показаны на фиг. 9 и в табл. 3). Результаты показывают, что все антитела могут эффективно ингибировать связывание PCSK9 с LDLR, и DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-20 и DFSK9-21 обладают более высокой ингибирующей способностью.
Таблица 3
Значение IC50 в конкурентном тестировании полных антител
| Номер | Образец | IC50 (нг/мл) | Номер | Образец | IC50 (нг/мл) |
| 1 | DFSK9-1 | 847,4 | 7 | DFSK9-17 | 88,98 |
| 2 | DFSK9-12 | 266,2 | 8 | DFSK9-18 | 107,5 |
| 3 | DFSK9-13 | 382,8 | 9 | DFSK9-19 | 533,5 |
| 4 | DFSK9-14 | 145,9 | 10 | DFSK9-20 | 216,3 |
| 5 | DFSK9-15 | 113,9 | 11 | DFSK9-21 | 161,3 |
| 6 | DFSK9-16 | 281,7 |
5.4. Определение аффинности полных антител с помощью BIAcore X100.
Определение аффинности полных антител выполняют с использованием метода захвата; связывают козьи античеловеческие IgG с поверхностью чипа СМ5, соответственно разбавляя DFSK9-1, DFSK9-12, DFSK9-13, DFSK9-14, DFSK9-15, DFSK9-16, DFSK9-17, DFSK9-18, DFSK9-19, DFSK9-20 и DFSK9-21 и обеспечивая захват примерно 200 RU (относительных единиц) антител козьими анти-человеческими IgG; устанавливают серию градиентов концентрации (200 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 12.5 нМ, 6.25 нМ, 3.125 нМ, 1.5625 нМ, 0.78125 нМ) для PCSK9, пропускают через поверхность неподвижной фазы и определяют аффинность антител. Результаты показывают, что все выбранные в результате скрининга антитела имеют высокую аффинность (см. табл. 4), и восемь полных антител, имеющих наибольшую аффинность, отбирают для теста на биологическую активность.
- 11 039191
Таблица 4
Экспериментальные значения констант аффинности полных aHTu-PCSK9 антител
| Номер | Образец | ka (1/Mc) | kd (1/c) | KD(M) |
| 1 | DFSK9-1 | 5Д78Е+5 | 9Д91Е-5 | l,755E-10 |
| 2 | DFSK9-12 | 4Д80Е+5 | 4,975E-5 | 1Д90Е-10 |
| 3 | DFSK9-13 | 5,747E+5 | 2,990E-5 | 5,202E-ll |
| 4 | DFSK9-14 | 2,700E+6 | 7,901E-5 | 2,926E-11 |
| 5 | DFSK9-15 | 5,425E+5 | 4,746E-6 | 8,749E-12 |
| 6 | DFSK9-16 | l,217E+6 | 5,613E-5 | 4,613E-11 |
| 7 | DFSK9-17 | 1Д84Е+6 | l,844E-6 | 1,557E-12 |
| 8 | DFSK9-18 | 5Д17Е+5 | l,992E-6 | 3,893E-12 |
| 9 | DFSK9-19 | 3,952E+5 | 7,339E-5 | l,857E-10 |
| 10 | DFSK9-20 | 9,252E+5 | l,451E-5 | 1,568E-11 |
| 11 | DFSK9-21 | 5,918E+5 | 4,23 9E-6 | 7Д62Е-12 |
Воплощение 6. Определение биологической активности полных антител против пропротеиновой конвертазы субтилизин/кексинового типа 9 (PCSK9).
Клетки HepG2 инокулируют в 96 лунок в количестве 2,5x10 клеток/мл; на следующий день заменяют культуральную среду 10% FBS Mem Ebss Minimum Essential Medium (EMEM) на 80 мкл культуральной среды для анализа с 5% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и культивируют в течение 24 ч при 37°С; на следующий день добавляют полные антитела (10 мкл/лунка), разведенные культуральной средой для анализа с разными степенями разведения, в планшет с инокулированными клетками HepG2. Восемь образцов полных антител, имеющих начальную концентрацию 900 нмоль/л, разбавляют с получением трехкратного градиента и разбавляют каждое полное антитело с получением восьми градиентов; затем добавляют раствор PCSK9, 30 нмоль/л (10 мкл/лунка), равномерно перемешивают и культивируют в течение 4 ч при 37°С в присутствии 5% СО2; добавляют 10 мкл раствора липопротеинов низкой плотности (LDL), маркированного 0,1 мг/мл бордипиррометеном (BODIPY), равномерно перемешивают и непрерывно культивируют в течение 15-20 ч в присутствии 5% СО2 при 37°С; добавляют 200 мкл PBS в каждую лунку, дважды промывают, добавляют 100 мкл PBS в каждую лунку, считывают значения относительных единиц флуоресценции (RFU) с использованием считывающего устройства для микропланшетов при длинах волн 490 и 520 нм; анализируют данные и графически изображают, используя программу GraphPad Prism 5 Demo (результаты показаны на фиг. 10). В качестве отрицательного контроля с гомологичными IgG диаграммы показывают, что все эти восемь антител могут блокировать связывание PCSK9 с LDLR дозозависимым образом и увеличивают скорость поглощения LDL в клетках HepG2 и эти антитела обладают примерно одинаковой биологической активностью.
Таблица 5
Значение EC50 в тестировании биологической активности
| Номер | Образец | ECso (нмоль/л) | Номер | Образец | ECso (нмоль/л) |
| 1 | DFSK9-13 | 29,61 | 7 | DFSK9-17 | 18,51 |
| 2 | DFSK9-14 | 16,59 | 8 | DFSK9-18 | 23,91 |
| 3 | DFSK9 | 15,31 | 9 | DFSK9-20 | 17,95 |
| 4 | DFSK9-16 | 23,80 | 10 | DFSK9-21 | 20,33 |
Для специалистов в данной области техники воплощения описывают раскрытие изобретения только в качестве примеров, и очевидно, что конкретная реализация настоящей заявки не ограничена вышеупомянутыми способами. Любое несущественное улучшение на основе концепции способа и технических схем, раскрытых в описании изобретения, или раскрытия в описании изобретения концепции способа и технических схем без улучшения в других ситуациях входит в объем защиты данной заявки.
Claims (9)
1. Моноклональное анти-PCSK9 антитело, содержащее легкую цепь и тяжелую цепь, где легкая цепь имеет области, определяющие комплементарность, CDR1, CDR2 и CDR3, представленные LCDR1, LCDR2 и LCDR3 соответственно; и тяжелая цепь имеет области CDR1, CDR2 и CDR3, представленные HCDR1, HCDR2 и HCDR3 соответственно; где LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 и HCDR3 указанного моноклонального анти-PCSK9 антитела выбраны из следующей группы:
первая группа: HCDR1: SEQ ID NO:53; HCDR2: SEQ ID NO:56; HCDR3: SEQ ID NO:62; LCDR1:
- 12 039191
SEQ ID NO:22; LCDR2: SEQ ID NO:33; LCDR3: SEQ ID NO:42;
вторая группа: HCDR1: SEQ ID NO:53; HCDR2: SEQ ID NO:56; HCDR3: SEQ ID NO:62; LCDR1:
SEQ ID NO:23; LCDR2: SEQ ID NO:34; LCDR3: SEQ ID NO:43;
третья группа: HCDR1: SEQ ID NO:53; HCDR2: SEQ ID NO:56; HCDR3: SEQ ID NO:62; LCDR1:
SEQ ID NO:24; LCDR2: SEQ ID NO:35; LCDR3: SEQ ID NO:44;
четвертая группа: HCDR1: SEQ ID NO:53; HCDR2: SEQ ID NO:56; HCDR3: SEQ ID NO:62; LCDR1: SEQ ID NO:25; LCDR2: SEQ ID NO:35; LCDR3: SEQ ID NO:45;
пятая группа: HCDR1: SEQ ID NO:53; HCDR2: SEQ ID NO:56; HCDR3: SEQ ID NO:62; LCDR1: SEQ ID NO:26; LCDR2: SEQ ID NO:36; LCDR3: SEQ ID NO:46;
шестая группа: HCDR1: SEQ ID NO:53; HCDR2: SEQ ID NO:56; HCDR3: SEQ ID NO:62; LCDR1: SEQ ID NO:27; LCDR2: SEQ ID NO:37; LCDR3: SEQ ID NO:47;
седьмая группа: HCDR1: SEQ ID NO:53; HCDR2: SEQ ID NO:56; HCDR3: SEQ ID NO:62; LCDR1: SEQ ID NO:28; LCDR2: SEQ ID NO:38; LCDR3: SEQ ID NO:48;
восьмая группа: HCDR1: SEQ ID NO:53; HCDR2: SEQ ID NO:56; HCDR3: SEQ ID NO:62; LCDR1: SEQ ID NO:29; LCDR2: SEQ ID NO:39; LCDR3: SEQ ID NO:49;
девятая группа: HCDR1: SEQ ID NO:53; HCDR2: SEQ ID NO:56; HCDR3: SEQ ID NO:62; LCDR1: SEQ ID NO:30; LCDR2: SEQ ID NO:40; LCDR3: SEQ ID NO:50;
десятая группа: HCDR1: SEQ ID NO:53; HCDR2: SEQ ID NO:56; HCDR3: SEQ ID NO:62; LCDR1: SEQ ID NO:31; LCDR2: SEQ ID NO:39; LCDR3: SEQ ID NO:51;
одиннадцатая группа: HCDR1: SEQ ID NO:53; HCDR2: SEQ ID NO:56; HCDR3: SEQ ID NO:62; LCDR1: SEQ ID NO:32; LCDR2: SEQ ID NO:41; LCDR3: SEQ ID NO:52;
двенадцатая группа: HCDR1: SEQ ID NO:54; HCDR2: SEQ ID NO:57; HCDR3: SEQ ID NO:63; LCDR1: SEQ ID NO:23; LCDR2: SEQ ID NO:34; LCDR3: SEQ ID NO:43;
тринадцатая группа: HCDR1: SEQ ID NO:55; HCDR2: SEQ ID NO:59; HCDR3: SEQ ID NO:66; LCDR1: SEQ ID NO:29; LCDR2: SEQ ID NO:39; LCDR3: SEQ ID NO:49;
четырнадцатая группа: HCDR1: SEQ ID NO:55; HCDR2: SEQ ID NO:60; HCDR3: SEQ ID NO:64; LCDR1: SEQ ID NO:26; LCDR2: SEQ ID NO:36; LCDR3: SEQ ID NO:46;
пятнадцатая группа: HCDR1: SEQ ID NO:54; HCDR2: SEQ ID NO:60; HCDR3: SEQ ID NO:63; LCDR1: SEQ ID NO:27; LCDR2: SEQ ID NO:37; LCDR3: SEQ ID NO:47;
шестнадцатая группа: HCDR1: SEQ ID NO:54; HCDR2: SEQ ID NO:59; HCDR3: SEQ ID NO:65; LCDR1: SEQ ID NO:26; LCDR2: SEQ ID NO:36; LCDR3: SEQ ID NO:46;
семнадцатая группа: HCDR1: SEQ ID NO:54; HCDR2: SEQ ID NO:61; HCDR3: SEQ ID NO:63; LCDR1: SEQ ID NO:27; LCDR2: SEQ ID NO:37; LCDR3: SEQ ID NO:47;
восемнадцатая группа: HCDR1: SEQ ID NO:54; HCDR2: SEQ ID NO:61; HCDR3: SEQ ID NO:63; LCDR1: SEQ ID NO:26; LCDR2: SEQ ID NO:36; LCDR3: SEQ ID NO:46;
девятнадцатая группа: HCDR1: SEQ ID NO:55; HCDR2: SEQ ID NO:58; HCDR3: SEQ ID NO:67; LCDR1: SEQ ID NO:25; LCDR2: SEQ ID NO:35; LCDR3: SEQ ID NO:45;
двадцатая группа: HCDR1: SEQ ID NO:55; HCDR2: SEQ ID NO:61; HCDR3: SEQ ID NO:65; LCDR1: SEQ ID NO:27; LCDR2: SEQ ID NO:37; LCDR3: SEQ ID NO:47;
двадцать первая группа: HCDR1: SEQ ID NO:55; HCDR2: SEQ ID NO:60; HCDR3: SEQ ID NO:65; LCDR1: SEQ ID NO:27; LCDR2: SEQ ID NO:37; LCDR3: SEQ ID NO:47.
2. Моноклональное анти-PCSK9 антитело по п.1, где аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи предпочтительно выбрана из любой из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:21, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи предпочтительно выбрана из любой из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10.
3. Моноклональное анти-PCSK9 антитело по любому из пп.1, 2, где константная область тяжелой цепи моноклонального анти-PCSK9 антитела содержит IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 и константная область легкой цепи содержит Ск или Сλ.
4. Моноклональное анти-PCSK9 антитело по п.3, где константная область тяжелой цепи содержит IgG4 или IgG2 и константная область легкой цепи содержит Ск.
5. Рекомбинантный экспрессионный ДНК-вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность для кодирования тяжелой цепи и легкой цепи моноклонального анти-PCSK9 антитела по п.1 или 2.
6. Клетка-хозяин, трансфицированная вектором по п.5.
7. Клетка-хозяин по п.6, где клетка-хозяин включает прокариотическую клетку, клетку дрожжей, клетку насекомого или клетку млекопитающего.
8. Клетка-хозяин по п.7, где прокариотическая клетка представляет собой клетку Escherichia coli; клетка млекопитающего представляет собой клетку HEK293 (клетку эмбриональной почки человека 293), клетку СНО (клетку яичника китайского хомячка) или клетку NS0.
9. Применение анти-PCSK9 антитела по любому из пп.1, 2 для удаления, ингибирования или
- 13 039191 уменьшения активности PCSK9 и ослабления, облегчения, ингибирования или предупреждения заболеваний, где заболевания включают дислипидемию, сердечно-сосудистые и цереброваскулярные заболевания и тромботические окклюзионные заболевания.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710052879.8A CN106749670B (zh) | 2017-01-22 | 2017-01-22 | 抗pcsk9单克隆抗体 |
| PCT/CN2017/119822 WO2018133649A1 (zh) | 2017-01-22 | 2017-12-29 | 抗pcsk9单克隆抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201990170A1 EA201990170A1 (ru) | 2019-07-31 |
| EA039191B1 true EA039191B1 (ru) | 2021-12-15 |
Family
ID=58942477
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201990170A EA039191B1 (ru) | 2017-01-22 | 2017-12-29 | Моноклональное анти-pcsk9 антитело |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11390688B2 (ru) |
| EP (1) | EP3480216A4 (ru) |
| JP (1) | JP6734467B2 (ru) |
| KR (1) | KR102257462B1 (ru) |
| CN (3) | CN106749670B (ru) |
| AU (1) | AU2017394444B2 (ru) |
| CA (1) | CA3032506C (ru) |
| EA (1) | EA039191B1 (ru) |
| WO (1) | WO2018133649A1 (ru) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106749670B (zh) * | 2017-01-22 | 2018-06-12 | 北京东方百泰生物科技有限公司 | 抗pcsk9单克隆抗体 |
| WO2018228406A1 (zh) * | 2017-06-14 | 2018-12-20 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途 |
| CN109897110B (zh) * | 2017-12-08 | 2022-05-17 | 深圳华大生命科学研究院 | 纳米抗体及其制备方法 |
| CN110872353B (zh) * | 2018-09-03 | 2021-05-04 | 深圳华大基因科技有限公司 | 特异性结合pcsk9抗原的纳米抗体及其制备方法和应用 |
| CN110981962B (zh) * | 2019-12-19 | 2022-07-12 | 中国药科大学 | Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其应用 |
| CN111171152B (zh) * | 2020-01-15 | 2023-04-18 | 吉林医药学院 | Pcsk9抗体及其制备方法和应用 |
| CN111620950B (zh) * | 2020-06-16 | 2023-01-31 | 中国药科大学 | 全人源抗pcsk9抗体、其抗原结合片段及其应用 |
| CN113150149B (zh) * | 2020-06-19 | 2021-10-08 | 北京东方百泰生物科技股份有限公司 | 一种抗il-17ra单克隆抗体的纯化方法 |
| CN114525258A (zh) * | 2020-10-30 | 2022-05-24 | 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 | 一种表达pcsk9阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用 |
| CN117343171B (zh) * | 2022-11-01 | 2024-03-19 | 上海百英生物科技股份有限公司 | 一种抗bsa的兔单克隆抗体及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102245641A (zh) * | 2008-12-15 | 2011-11-16 | 瑞泽恩制药公司 | 抗pcsk9的高亲和力人抗体 |
| CN103261230A (zh) * | 2010-12-22 | 2013-08-21 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 抗pcsk9抗体及使用方法 |
| WO2014150983A2 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Amgen Inc. | Human antigen binding proteins that bind to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 |
| CN105315371A (zh) * | 2015-03-05 | 2016-02-10 | 北京百特美博生物科技有限公司 | 抗人il-17单克隆抗体 |
| CN105348390A (zh) * | 2015-10-26 | 2016-02-24 | 北京智仁美博生物科技有限公司 | 抗人pcsk9单克隆抗体 |
| CN106749670A (zh) * | 2017-01-22 | 2017-05-31 | 北京东方百泰生物科技有限公司 | 抗pcsk9单克隆抗体 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MX2014014830A (es) * | 2012-06-15 | 2015-05-11 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-pcsk9, formulaciones, dosificacion y metodos de uso. |
-
2017
- 2017-01-22 CN CN201710052879.8A patent/CN106749670B/zh active Active
- 2017-01-22 CN CN201711161968.2A patent/CN107698680B/zh active Active
- 2017-01-22 CN CN201711161960.6A patent/CN107698679B/zh active Active
- 2017-12-29 EP EP17893120.0A patent/EP3480216A4/en active Pending
- 2017-12-29 CA CA3032506A patent/CA3032506C/en active Active
- 2017-12-29 WO PCT/CN2017/119822 patent/WO2018133649A1/zh unknown
- 2017-12-29 AU AU2017394444A patent/AU2017394444B2/en active Active
- 2017-12-29 JP JP2019505510A patent/JP6734467B2/ja active Active
- 2017-12-29 KR KR1020197003329A patent/KR102257462B1/ko active IP Right Grant
- 2017-12-29 EA EA201990170A patent/EA039191B1/ru unknown
- 2017-12-29 US US16/321,472 patent/US11390688B2/en active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102245641A (zh) * | 2008-12-15 | 2011-11-16 | 瑞泽恩制药公司 | 抗pcsk9的高亲和力人抗体 |
| CN103261230A (zh) * | 2010-12-22 | 2013-08-21 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 抗pcsk9抗体及使用方法 |
| WO2014150983A2 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Amgen Inc. | Human antigen binding proteins that bind to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 |
| CN105315371A (zh) * | 2015-03-05 | 2016-02-10 | 北京百特美博生物科技有限公司 | 抗人il-17单克隆抗体 |
| CN105348390A (zh) * | 2015-10-26 | 2016-02-24 | 北京智仁美博生物科技有限公司 | 抗人pcsk9单克隆抗体 |
| CN106749670A (zh) * | 2017-01-22 | 2017-05-31 | 北京东方百泰生物科技有限公司 | 抗pcsk9单克隆抗体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107698680B (zh) | 2019-03-01 |
| CN106749670A (zh) | 2017-05-31 |
| AU2017394444A1 (en) | 2019-02-21 |
| EP3480216A1 (en) | 2019-05-08 |
| CN107698679B (zh) | 2019-03-01 |
| KR20190025980A (ko) | 2019-03-12 |
| CA3032506C (en) | 2023-08-22 |
| CN107698679A (zh) | 2018-02-16 |
| CN106749670B (zh) | 2018-06-12 |
| AU2017394444B2 (en) | 2020-04-09 |
| US11390688B2 (en) | 2022-07-19 |
| EA201990170A1 (ru) | 2019-07-31 |
| JP6734467B2 (ja) | 2020-08-05 |
| CA3032506A1 (en) | 2018-07-26 |
| JP2019531057A (ja) | 2019-10-31 |
| CN107698680A (zh) | 2018-02-16 |
| US20210277146A1 (en) | 2021-09-09 |
| EP3480216A4 (en) | 2020-07-01 |
| WO2018133649A1 (zh) | 2018-07-26 |
| KR102257462B1 (ko) | 2021-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA039191B1 (ru) | Моноклональное анти-pcsk9 антитело | |
| KR102662387B1 (ko) | B7-h3 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도 | |
| JP7112659B2 (ja) | 抗ｐｃｓｋ９抗体およびその使用 | |
| CN107428838B (zh) | 结合tfpi的新型抗体以及包含所述抗体的组合物 | |
| US9908944B2 (en) | Antibodies that bind urokinase plasminogen activator | |
| CN111378037B (zh) | 一种抗hIL-33人源化单抗及其应用 | |
| KR20230118922A (ko) | 항lag-3의 단일 클론 항체, 이의 항원 결합 단편 및이의 응용 | |
| Xian et al. | Blocking the PD-1-PD-L1 axis by a novel PD-1 specific nanobody expressed in yeast as a potential therapeutic for immunotherapy | |
| CN114096275A (zh) | 新型bssl抗体 | |
| Fan et al. | De novo protein sequencing, humanization and in vitro effects of an antihuman CD34 mouse monoclonal antibody | |
| CN116023495B (zh) | 一种抗cd40纳米抗体及其制备方法与应用 | |
| RU2826992C2 (ru) | Новые антитела к bssl | |
| TWI773264B (zh) | 結合人ngf的抗體、其製備方法和用途 | |
| US10981993B2 (en) | Anti-PD-1 monoclonal antibody and obtaining method therefor | |
| TWI615408B (zh) | 人源化之單株抗體及其用途 | |
| CN111620950A (zh) | 全人源抗pcsk9抗体、其抗原结合片段及其应用 | |
| WO2024193989A1 (en) | Combotope antibody libraries | |
| CN107177003A (zh) | 一种特异性抗人pcsk9的抗体及其应用 |