JP2019531057A - 抗pcsk9モノクローナル抗体 - Google Patents
抗pcsk9モノクローナル抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019531057A JP2019531057A JP2019505510A JP2019505510A JP2019531057A JP 2019531057 A JP2019531057 A JP 2019531057A JP 2019505510 A JP2019505510 A JP 2019505510A JP 2019505510 A JP2019505510 A JP 2019505510A JP 2019531057 A JP2019531057 A JP 2019531057A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- dfsk9
- antibody
- light chain
- heavy chain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102100038955 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 101001098868 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Proteins 0.000 claims abstract 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 73
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 19
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 claims description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 2
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 2
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 21
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 10
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 abstract description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 3
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 abstract 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 abstract 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 23
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 23
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 12
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 12
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 10
- 238000008214 LDL Cholesterol Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 10
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 10
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000012917 library technology Methods 0.000 description 4
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 3
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 238000011960 computer-aided design Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 229960002027 evolocumab Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 3
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 206010014476 Elevated cholesterol Diseases 0.000 description 2
- 206010014486 Elevated triglycerides Diseases 0.000 description 2
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 208000030831 Peripheral arterial occlusive disease Diseases 0.000 description 2
- 108010044159 Proprotein Convertases Proteins 0.000 description 2
- 102000006437 Proprotein Convertases Human genes 0.000 description 2
- 206010045261 Type IIa hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 2
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 2
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 2
- 201000004050 brachyolmia-amelogenesis imperfecta syndrome Diseases 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013373 clone screening Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940125645 monoclonal antibody drug Drugs 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 208000023516 stroke disease Diseases 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100040199 Apolipoprotein B receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101100135844 Homo sapiens PCSK9 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000000563 Hyperlipoproteinemia Type II Diseases 0.000 description 1
- 102100040705 Low-density lipoprotein receptor-related protein 8 Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710180553 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 102100039066 Very low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710177612 Very low-density lipoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960004539 alirocumab Drugs 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 108010091513 apolipoprotein B receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 229950011350 bococizumab Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108010018413 epidermal growth factor precursor Proteins 0.000 description 1
- 201000001386 familial hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000000260 hypercholesteremic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229950006208 lodelcizumab Drugs 0.000 description 1
- 108010031117 low density lipoprotein receptor-related protein 8 Proteins 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 108091005763 multidomain proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000009521 phase II clinical trial Methods 0.000 description 1
- 238000009522 phase III clinical trial Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
軽鎖と重鎖とを備え、前記軽鎖の相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれLCDR1、LCDR2およびLCDR3で表示され、また前記重鎖の相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれHCDR1、HCDR2およびHCDR3で表示され、LCDR1は、RASQSIDNRLT(SEQ NO.22)、RASQSVRNWLD(SEQ NO.23)、RASQGINSWLN(SEQ NO.24)、RASQNVNNWLN(SEQ NO.25)、RASQNINSWLN(SEQ NO.26)、RASQNINNWLN(SEQ NO.27)、RASQGIHNWLN(SEQ NO.28)、RASQDVDSWLT(SEQ NO.29)、RASQSVRNWLN(SEQ NO.30)、RASQDVRNWLT(SEQ NO.31)またはRASQSIRSYLN(SEQ NO.32)中のいずれか1つを含み、LCDR2は、DASSRQS(SEQ NO.33)、GASTLES(SEQ NO.34)、AASTRET(SEQ NO.35)、GASSRQS(SEQ NO.36)、GASTRPT(SEQ NO.37)、DASNRQS(SEQ NO.38)、GASNLAS(SEQ NO.39)、DASNLQS(SEQ NO.40)またはDASSRPT(SEQ NO.41)中のいずれか1つを含み、LCDR3は、QQPENDPTT(SEQ NO.42)、QQDNDIPLT(SEQ NO.43)、QQWNNTPNT(SEQ NO.44)、QQDNDMPLT(SEQ NO.45)、QQWFDVPTT(SEQ NO.46)、QQWDDTPNT(SEQ NO.47)、QQNSNIPLT(SEQ NO.48)、QQDSKIPLT(SEQ NO.49)、QQWTDTPLT(SEQ NO.50)、QQDDSTPPT(SEQ NO.51)またはQQGDSMPMT(SEQ NO.52)中のいずれか1つを含み、HCDR1は、GGTFTNNA(SEQ NO.53)、GYTVTSYG(SEQ NO.54)またはGYSLTSYG(SEQ NO.55)中のいずれか1つを含み、HCDR2は、RIIPMFGMA(SEQ NO.56)、WLSFYNGNT(SEQ NO.57)、WVTFYNGNT(SEQ NO.58)、WVSFYQGNT(SEQ NO.59)、WVSFYNGQT(SEQ NO.60)またはWVSFYNGNS(SEQ NO.61)中のいずれか1つを含み、HCDR3は、AREGIPMI(SEQ NO.62)、ARGYSLDV(SEQ NO.63)、ARGYGMSI(SEQ NO.64)、ARGFGMDR(SEQ NO.65)、ARGYGMTV(SEQ NO.66)またはARGFGLSV(SEQ NO.67)中のいずれか1つを含む。
(1)抗PCSK9一本鎖抗体のバイオパニングを行って、3ラウンドの抗体ライブラリーの濃縮スクリーニング(Enriching Screening)によって、完全合成のScFvファージライブラリーから、親和性のより高い抗体配列DFSK9−1を取得する。その重鎖DFSK9−H1は、SEQ NO.1のアミノ酸配列を有し、その軽鎖DFSK9−L1は、SEQ NO.11のアミノ酸配列を有する。
(2)DFSK9−1に基づいて、コンピュータ三次構造シミュレーションにより、軽鎖相補性決定領域CDR1、CDR2、CDR3突然変異抗体ライブラリーを設計し構築し、さらにこの突然変異抗体ライブラリーに対してバイオパニング、陽性クローンのスクリーニング及び同定を行い、異なる軽鎖を含む10種類の一本鎖抗体配列を取得して、それぞれDFSK9−2、DFSK9−3、DFSK9−4、DFSK9−5、DFSK9−6、DFSK9−7、DFSK9−8、DFSK9−9、DFSK9−10、DFSK9−11と命名される。対応する軽鎖の可変領域は、それぞれDFSK9−L2、DFSK9−L3、DFSK9−L4、DFSK9−L5、DFSK9−L6、DFSK9−L7、DFSK9−L8、DFSK9−L9、DFSK9−L10、DFSK9−L11と命名される。それらに対応するアミノ酸配列は、それぞれSEQ NO.12、SEQ NO.13、SEQ NO.14、SEQ NO.15、SEQ NO.16、SEQ NO.17、SEQ NO.18、SEQ NO.19、SEQ NO.20、SEQ NO.21に示す。上記一本鎖抗体をファージレベルで親和性を比較する。
(3)5株の親和性のより高いクローンDFSK9−2、DFSK9−4、DFSK9−5、DFSK9−6およびDFSK9−8を選択し、重鎖相補性決定領域のCDR1、CDR2、CDR3突然変異体抗体ライブラリーを設計し構築し、そしてこの重鎖突然変異の抗体ライブラリーに対してバイオパニング、陽性クローンのスクリーニングおよび同定を行い、10種類の異なる一本鎖抗体配列が取得され、それぞれDFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20およびDFSK9−21と命名される。ここでは、DFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20およびDFSK9−21の軽鎖可変領域配列は、それぞれDFSK9−L2、DFSK9−L8、DFSK9−L5、DFSK9−L6、DFSK9−L5、DFSK9−L6、DFSK9−L5、DFSK9−L4、DFSK9−L6、DFSK9−L6である。それらに対応するアミノ酸配列は、それぞれSEQ NO.12、SEQ NO.18、SEQ NO.15、SEQ NO.16、SEQ NO.15、SEQ NO.16、SEQ NO.15、SEQ NO.14、SEQ NO.16、SEQ NO.16に示す。DFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20およびDFSK9−21の重鎖可変領域配列は、それぞれDFSK9−H2、DFSK9−H8、DFSK9−H7、DFSK9−H3、DFSK9−H6、DFSK9−H4、DFSK9−H4、DFSK9−H9、DFSK9−H5、DFSK9−H10である。それらに対応するアミノ酸配列は、それぞれSEQ NO.2、SEQ NO.8、SEQ NO.7、SEQ NO.3、SEQ NO.6、SEQ NO.4、SEQ NO.4、SEQ NO.9、SEQ NO.5、SEQ NO.10に示す。上記一本鎖抗体をファージレベルで親和性を比較する;
(4)、(3)に記載の前記モノクローナル重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変遺伝子を真核発現ベクターにクローニングし、宿主細胞にトランスフェクトして抗PCSK9モノクローナル抗体の完全抗体を得る。
ここでは、前記CDRは、相補性決定領域(complementarity−determining region)であり;前記ScFvは、一本鎖抗体(single−chain fragment variable)であり;前記ADCsは、抗体−薬物コンジュゲート(antibody−drug conjugates)であり;前記LDLRは、低密度リポタンパク質受容体(Low Density Lipoprotein Receptor)であり;前記LDL−Cは、低密度リポタンパク質コレステロール(Low Density Lipoprotein−Cholesterol)であり;前記HEK293E細胞は、ヒト胎児腎293E細胞(human embryonic kidney 293E cell)であり;前記CHO細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(chinese hamster ovary cell)であり;前記NS0細胞は、マウスNS0胸腺腫細胞である。
本開示には、多種の新規な抗PCSK9抗体が提供されており、基質と結合する親和性が高く、PCSK9とLDLRとの結合を十分にブロックし、且つ細胞表面上のLDLRの分布および発現に影響を与えることができ、これにより、細胞表面上のLDL−RとLDLとの結合能力を向上させ、細胞によるLDLの摂取および分解を増加させることによって、細胞外LDLおよびLDL−Cの含有量を低下させ、LDL、LDL−Cおよび総コレステロールを低下させる目的を達成する。
(1)抗PCSK9一本鎖抗体のバイオパニングを行って、3ラウンドの抗体ライブラリーの濃縮スクリーニングによって、親和性のより高い抗体配列DFSK9−1を取得する。
(2)DFSK9−1に基づいて、コンピュータ支援設計により、軽鎖CDR123突然変異抗体ライブラリーを設計し構築し、さらにこの抗体ライブラリーに対してバイオパニング、陽性クローンのスクリーニング及び同定を行い、10種類の異なる軽鎖の抗体配列のクローンDFSK9−2、DFSK9−3、DFSK9−4、DFSK9−5、DFSK9−6、DFSK9−7、DFSK9−8、DFSK9−9、DFSK9−10、DFSK9−11を取得する。上記10種類の一本鎖抗体をファージレベルで親和性を比較する;
(3)より高い親和性を有する2株のクローンを選択し、重鎖CDR123ライブラリーを構築し、さらにこのライブラリーに対してバイオパニングおよび陽性クローンのスクリーニングを行い、10種類の異なる配列の一本鎖抗体DFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20、DFSK9−21を取得する。上記一本鎖抗体をファージレベルで親和性を比較する;
(4)、(3)に記載の前記モノクローナル重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変遺伝子を真核発現ベクターにクローニングし、宿主細胞にトランスフェクトして抗PCSK9モノクローナル抗体の完全抗体を得る。
(実施例1)抗PCSK9一本鎖抗体のバイオパニング
pCom3ベクターを遺伝子クローニングの方法により組換え、組換えされたベクターをpScFvDisb−S1(図1)と命名された。このベクターに基づいて、完全合成ファージ抗体ライブラリーを構築する。
免疫チューブに抗原PCSK9−Hisを10μg/1ml/チューブでコーティングし、4℃で一晩コーティングする。PBST−4%milkを用いて免疫チューブおよびファージ抗体ライブラリー(ファージ投入量は約109〜1012である)をそれぞれ閉鎖して、37℃で1時間閉鎖する。閉鎖されたファージ抗体ライブラリーを免疫チューブに入れて抗原−抗体結合を行い、37℃で1時間反応させる。未結合ファージをPBST−PBSで洗い流し、0.1M pH2.2のGlycine−HClで溶出し、溶出液を1.5M pH8.8のTris−HClでpH7.0付近に中和する。OD値が約0.5〜0.8まで増殖させた10mlのXL1−Blue菌液を溶出液で感染させ、37℃で30分間静置した後、150rpmで1時間振とう培養する。1%菌液を提出して段階希釈を行い、ファージ収率を計算するために2YTATG小プレートにコーティングする。残りの菌液を遠心分離した後、2YTATGの大プレートにコーティングし、37℃で一晩培養する。一晩培養した菌を2YTATG液体培地に移し、対数期まで振盪した後、M13K07ヘルパーファージを入れて感染させ、ファージを28℃で一晩増殖させ、ファージを次のスクリーニングに用いるためにPEG6000−NaClで沈降して純化する。合計3ラウンドのファージライブラリーの濃縮スクリーニングを行う。
3ラウンドのスクリーニングを行った後、十分に分離したモノクローナルコロニーを拾い、2YTATG液体培地が添加された96ウェルのディープウェルプレートに接種し、37℃、220rpmで対数増殖期まで約5時間培養し、各ウェルに約1010のヘルパーファージM13KO7を添加し、37℃で30分間静置した後、150rpmで1時間振盪培養した。4000rpmで15分間の遠心分離した後、2YTATKA液体培地に沈殿を再懸濁し、28℃、220rpmで一晩培養する。4000rpm、4℃で15分間遠心分離した後、ファージを有する上清を、モノクローナルELISA同定のために吸引する。親和性のより高い一本鎖抗体DFSK9−1をスクリーニングして取得し、その重鎖可変領域をDFSK9−H1と命名され、そのアミノ酸配列をSEQ NO.1に示し、その軽鎖可変領域をDFSK9−L1と命名され、アミノ酸配列をSEQ NO.11に示す;
QVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGGTFTNNAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPMFGMANYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREGIPMIWGQGTTVTVSS
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDNRLTWYQQKPGKAPKLLIYDASSRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPENDPTTFGQGTKVEIK
3.1 DFSK9−1軽鎖CDR123突然変異ライブラリーの構築
pScFvDisb−DFSK9−1プラスミドをNheIおよびNotIでダブルダイジェストし、消化された産物をアガロースゲル電気泳動に供した後、5.5kbのバンドをゲルから切り出して回収し、NheIおよびNotIを用いて合成軽鎖突然変異ライブラリー遺伝子VLCDR123Mをダブルダイジェストして、産物を産物回収ユニバーサルキットで回収する。突然変異ライブラリー遺伝子とベクターとをモル比3:1の割合で、T4 DNAリガーゼを用いて16℃で4時間連結する。連結産物をXL1−Blueエレクトロポレーションコンピテント状態にエレクトロポレーションする。37℃、150rpmで振とう培養し、1時間蘇生する。1%菌液をとり、それを希釈して小プレートにコーティングし、ライブラリーの容量を計算する。残りの菌液を4000rpmで15分間遠心分離した後、2YTATGの大プレートに沈殿をコーティングし、37℃で一晩上下逆さまに培養する。構築された抗体ライブラリーは約108のライブラリー容量を有し、20個のクローンをランダムに選択して配列分析したところ、配列の正解率と多様性は、いずれも90%を超えている。
実施例1および実施例2の方法に従って、バイオパニングおよび陽性クローンのスクリーニングを行い、親和性のより高いクローンをシーケンシングして、10種類の異なる一本鎖抗体配列が得られ、それぞれ DFSK9−2、DFSK9−3、DFSK9−4、DFSK9−5、DFSK9−6、DFSK9−7、DFSK9−8、DFSK9−9、DFSK9−10、 DFSK9−11と命名される。対応する軽鎖可変領域は、DFSK9−L2、DFSK9−L3、DFSK9−L4、DFSK9−L5、DFSK9−L6、DFSK9−L7、DFSK9−L8、DFSK9−L9、DFSK9−L10、DFSK9−L11と命名される。それらに対応するアミノ酸配列は、それぞれSEQ NO.12、SEQ NO.13、SEQ NO.14、SEQ NO.15、SEQ NO.16、SEQ NO.17、SEQ NO.18、SEQ NO.19、SEQ NO.20およびSEQ NO.21に示す。軽鎖可変領域配列SEQ NO.12-SEQ NO.21は、以下の通りである。
SEQ NO.12(DFSK9−L2軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRNWLDWYQQKPGKAPKLLIYGASTLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNDIPLTFGQGTKVEIK
SEQ NO.13(DFSK9−L3軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINSWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTRETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNNTPNTFGQGTKVEIK
SEQ NO.14(DFSK9−L4軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVNNWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTRETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNDMPLTFGQGTKVEIK
SEQ NO.15(DFSK9−L5軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINSWLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWFDVPTTFGQGTKVEIK
SEQ NO.16(DFSK9−L6軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINNWLNWYQQKPGKAPKLLIYGASTRPTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWDDTPNTFGQGTKVEIK
SEQ NO.17(DFSK9−L7軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIHNWLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNSNIPLTFGQGTKVEIK
SEQ NO.18(DFSK9−L8軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVDSWLTWYQQKPGKAPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDSKIPLTFGQGTKVEIK
SEQ NO.19(DFSK9−L9軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRNWLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWTDTPLTFGQGTKVEIK
SEQ NO.20(DFSK9−L10軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVRNWLTWYQQKPGKAPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDDSTPPTFGQGTKVEIK
SEQ NO.21(DFSK9−L11軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSRPTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDSMPMTFGQGTKVEIK
この実施例3.2で得られたクローンをモノクローナルファージのディスプレイおよび精製を行い、ファージレベルでの段階希釈ELISAによって一本鎖抗体の相対親和性を同定する。
PCSK9−His(300ng/ウェル/100μl)をpH7.2の0.01M PBS緩衝液でコーティングし、4℃で一晩コーティングする。PBSTで3回洗浄し、PBST−4%milkで37℃で1時間閉鎖する。PBST−4%milkの5倍段階希釈された精製ファージ試料(100μl/ウェル)を加え、37℃で1時間静置する。PBSTで5回洗浄し、PBST−4%milkで1:5000に希釈したanti−M13−HRPモノクローナル抗体(100μl/ウェル)を加え、37℃で1時間放置する。TMB発色キットで発色させ(100μl/ウェル)、室温で10分間発色させ、2M H2SO4(50μl/ウェル)を用いて発色を停止させる。マイクロプレートリーダーによって波長450nmおよび630nmで読み取る。ソフトウェアGraphPad Prism 5 Demoによってデータを分析し、且つプロットし、その結果は図3に示すようである:結果は、スクリーニングされたファージ一本鎖抗体はいずれもPCSK9に結合することができ、また、DFSK9−2、DFSK9−4、DFSK9−5、DFSK9−6およびDFSK9−8の親和性は、明らかに他のクローンより高いことを示しており、上記5つの一本鎖抗体を選択して次の試験を行う。
4.1鎖置換法による重鎖CDR123突然変異ライブラリーの構築
実施例3.3中のDFSK9−2、DFSK9−4、DFSK9−5、DFSK9−6およびDFSK9−8などの5種類の一本鎖抗体の混合プラスミドをNcoI−HFおよびKpnIでダブルダイジェストして、ゲルから切り出して大きさが5.5kbのバンドを回収する。合成された重鎖突然変異ライブラリー遺伝子VHCDR123MをNcoI−HFおよびKpnIでダブルダイジェストして、ダブルダイジェストされた産物をユニバーサル回収キットで回収する。突然変異ライブラリー遺伝子とベクターとをモル比3:1の割合で、T4 DNAリガーゼを用いて16℃で4時間連結する。連結産物をXL1エレクトロポレーションコンピテント状態にエレクトロポレーションする。37℃、150rpmで培養し、1時間蘇生する。1%菌液をとり、それを希釈して小プレートにコーティングし、ライブラリーの容量を計算する。残りの菌液を4000rpmで15分間遠心分離した後、2YTATGの大プレートに沈殿をコーティングし、37℃で一晩上下逆さまに培養する。構築された抗体ライブラリーは約5*108のライブラリー容量を有し、20個のクローンをランダムに選択して配列分析したところ、正解率と多様性は、いずれも90%を超えている。
実施例4.1中の抗体ライブラリーをファージディスプレイおよび精製回収を行う。このライブラリーから抗PCSK9の一本鎖抗体をパニングする。ファージ抗体ライブラリーのバイオパニング方法および陽性クローンのスクリーニングは、実施例1および実施例2の場合と同じである。シーケンシングされた後、10種類の異なる抗PCSK9抗体配列をスクリーニングした、それぞれDFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、 DFSK9−20、DFSK9−21と命名された。ここでは、DFSK9−12の軽鎖可変領域配列はDFSK9−L2であり、対応するアミノ酸配列はSEQ NO.12に示される。DFSK9−13の軽鎖可変領域配列はDFSK9−L8であり、対応するアミノ酸配列はSEQ NO.18に示される。DFSK9−14、DFSK9−16およびDFSK9−18の軽鎖可変領域配列はDFSK9−L5であり、対応するアミノ酸配列はSEQ NO.15に示される。DFSK9−15、DFSK9−17、DFSK9−20およびDFSK9−21の軽鎖可変領域配列はDFSK9−L6であり、対応するアミノ酸配列はSEQ NO.16に示される。DFSK9−19の軽鎖可変領域配列はDFSK9−L4であり、対応するアミノ酸配列はSEQ NO.14に示される。DFSK9−12の重鎖可変領域配列はDFSK9−H2であり、対応するアミノ酸配列はSEQ NO.2に示される。DFSK9−13の重鎖可変領域配列はDFSK9−H8であり、対応するアミノ酸配列はSEQ NO.8に示される。DFSK9−14の重鎖可変領域配列はDFSK9−H7であり、対応するアミノ酸配列はSEQ NO.7に示される。DFSK9−15の重鎖可変領域配列はDFSK9−H3であり、対応するアミノ酸配列はSEQ NO.3に示される。DFSK9−16の重鎖可変領域配列はDFSK9−H6であり、対応するアミノ酸配列をSEQ NO.6に示される。DFSK9−17およびDFSK9−18の重鎖可変領域配列はDFSK9−H4であり、対応するアミノ酸配列はSEQ NO.4に示される。DFSK9−19の重鎖可変領域はDFSK9−H9であり、対応するアミノ酸配列はSEQ NO.9に示される。DFSK9−20の重鎖可変領域はDFSK9−H5であり、対応するアミノ酸配列はSEQ NO.5に示される。DFSK9−21の重鎖可変領域配列はDFSK9−H10であり、対応するアミノ酸配列はSEQ NO.10に示される。軽鎖可変領域配列は、実施例3.2中のアミノ酸SEQ NO.12、SEQ NO.14、SEQ NO.15、SEQ NO.16およびSEQ NO.18を参照し、重鎖可変領域アミノ酸配SEQ NO.2〜SEQ NO.10は以下の通りである:
SEQ NO.2(DFSK9−H2重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWLSFYNGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSS
SEQ NO.3(DFSK9−H3重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSS
SEQ NO.4(DFSK9−H4重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGNSNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSS
SEQ NO.5(DFSK9−H5重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGNSNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGMDRWGQGTTVTVSS
SEQ NO.6(DFSK9−H6重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYQGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGMDRWGQGTTVTVSS
SEQ NO.7(DFSK9−H7重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYGMSIWGQGTTVTVSS
SEQ NO.8(DFSK9−H8重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYQGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYGMTVWGQGTTVTVSS
SEQ NO.9(DFSK9−H9重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVTFYNGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGLSVWGQGTTVTVSS
SEQ NO.10(DFSK9−H10重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYGMDRWGQGTTVTVSS
この実施例4.2で得られたクローンをモノクローナルファージのディスプレイおよび精製を行い、ファージレベルでの段階希釈ELISA実験によって一本鎖抗体の親和性を同定し、その方法は実施例3の3.3と同じである。結果は図5に示すように、スクリーニングされた10種類の異なる一本鎖抗体は、いずれもPCSK9に良好に結合でき、また親和性がいずれも最初の一本鎖DFSK9−1より高い。
5.1抗PCSK9完全抗体の調製
実施例4にスクリーニングされた抗体の重鎖VHを、重鎖定常領域遺伝子(γ4)を含むベクターpTSEG4(図6)にクローニングし、軽鎖VK遺伝子を、軽鎖定常領域遺伝子(κ鎖)を含むベクターpTSEK(図7)にクローニングして、ベクターpTSEG4およびpTSEKは、いずれもPTTベクターに基づいて組換えによって得られるものである。PTTベクターの調製プロセスは、参考文献(Yves.Durocher,Sylvie.Perret and Amine.Kamen Nucleic Acids Research,2002Vol.30,No.2e9)に詳細に記載されている。HEK293E細胞を一過性トランスフェクトして、完全抗体の発現を行う。AKTA機器でprotein Aアフィニティーカラムを介して、完全抗体タンパク質を精製して取得する。
PCSK9−His(300ng/ウェル/100μl)をpH7.2の0.01M PBS緩衝液でコーティングし、4℃で一晩コーティングする。PBST(1‰Tween 20) 300μl/ウェルで3回洗浄し、PBST−4%milkを添加して37℃で1時間閉鎖する。異なる希釈度の完全抗体DFSK9−1,DFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20およびDFSK9−21を添加する。11種類の完全抗体の最高濃度は、50μg/mlであり、5倍段階希釈、各完全抗体に対して8つの階段を作り、37℃で1時間インキュベートする。PBST 300μl/ウェルで5回洗浄し、そしてPBST−4%milkで1:5000希釈されたヤギ抗ヒトIgG−HRP二次抗体を添加し、37℃で1時間インキュベートする。PBST 300μl/ウェルで5回洗浄し、TMB発色キット(100μl/ウェル)で発色し、室温で10分間発色させ、そして2M H2SO4(50μl/ウェル)で発色を停止させた。マイクロプレートリーダーによって波長450nmおよび630nmで読み取る。ソフトウェアGraphPad Prism 5Demoによってデータを分析し、且つプロットし、実験結果は図8及び表2に示すように、すべての抗体は、いずれもPCSK9に結合することができ、ここで、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−20およびDFSK9−21は、より高い親和性を有する。
LDLR−Fc(100ng/ウェル/100μl)をpH7.2の0.01M PBSでコーティングし、4℃で一晩コーティングする。PBSTで3回洗浄し、PBST−4%milkを添加して37℃で1時間閉鎖する。PBST−4%milkで希釈された濃度が2μg/mlであるPCSK9−His(100μl/ウェル)を添加し、37℃で1時間インキュベートする。PBST−4%milkを添加して希釈された異なる希釈度の完全抗体DFSK9−1,DFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20およびDFSK9−21を添加する。11種類の完全抗体の最高濃度は、100μg/mlであり、5倍段階希釈、各完全抗体に対して8つの階段を作り、37℃で2時間インキュベートする。PBSTで5回洗浄し、PBST−4%milkで希釈されたマウス抗His IgG−HRP二次抗体を添加し、37℃で1時間インキュベートする。TMB発色キットで発色させ(100μl/ウェル)、室温で10分間発色させ、2M H2SO4(50μl/ウェル)を用いて発色を停止させる。マイクロプレートリーダーによって波長450nmおよび630nmで読み取る。ソフトウェアGraphPad Prism 5 Demoによってプロットし、実験結果は図9及び表3に示すように、すべての抗体は、いずれもPCSK9とLDLRとの結合を阻害することができ、ここで、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−20およびDFSK9−21は、やや強い阻害能力を有する。
完全抗体の親和性は、捕獲法によって測定させる。ヤギ抗ヒトIgGをCM5チップの表面にカップリングさせ、DFSK9−1、DFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20およびDFSK9−21をそれぞれ希釈して、約200RUの抗体がヤギ抗ヒトIgGによって捕獲されることを確保する。PCSK9を、固定相の表面を流れる一連の濃度階段(200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM、0.78125nM)に設置し、抗体の親和性を測定する。その結果は、スクリーニングされた抗体がいずれもより高い親和性を有し(表4をご参照)、最も高い親和性を有する8種類の完全抗体が生物活性実験のために選択されたことを示した。
HepG2細胞を96ウェルに2.5×105cells/mlで播種した。翌日、10%FBSのEMEM増殖培地を、80μlの5%デリポタンパク質FBSを有する分析培地に変更し、37℃で24時間培養する。翌日、アッセイ培地に希釈された異なる希釈度の完全抗体(10μl/ウェル)を、HepG2細胞を接種した培養プレートに添加する。8種類の完全抗体試料の初期濃度は900nmol/Lであり、3倍の段階希釈で、各完全抗体を8つの階段を作る。そして、30nmol/LのPCSK9溶液(10μl/ウェル)を添加し、ミックスした後、37℃、5%CO2で4時間培養する。10μlの0.1mg/mLのBODIPY標識LDL溶液を各ウェルに加え、ミックスした後、37℃、5%CO2で15〜20時間培養する。PBS 200μl/ウェルを添加し、2回洗浄することによって各ウェルを洗浄する。ウェル毎に、100μlのPBSを添加し、マイクロプレートリーダーによって波長490nmおよび520nmで相対蛍光単位RFU値を読み取った。ソフトウェアGraphPad Prism 5 Demoによってデータを分析し、且つプロットし、結果は図10に示すように、アイソタイプIgGをネガティブコントロールとし、図によると、8個の抗体は、いずれも用量依存的にPCSK9と低密度リポタンパク質レセプターLDLRとの結合をブロックでき、HepG2細胞における低密度リポタンパク質LDLの取り込み率を増加させ、各抗体間の生物学的活性は類似している。
(1)抗PCSK9一本鎖抗体のバイオパニングを行って、3ラウンドの抗体ライブラリーの濃縮スクリーニング(Enriching Screening)によって、完全合成のScFvファージライブラリーから、親和性のより高い抗体配列DFSK9−1を取得する。その重鎖DFSK9−H1は、SEQ ID NO.1のアミノ酸配列を有し、その軽鎖DFSK9−L1は、SEQ ID NO.11のアミノ酸配列を有する。
(2)DFSK9−1に基づいて、コンピュータ三次構造シミュレーションにより、軽鎖相補性決定領域CDR1、CDR2、CDR3突然変異抗体ライブラリーを設計し構築し、さらにこの突然変異抗体ライブラリーに対してバイオパニング、陽性クローンのスクリーニング及び同定を行い、異なる軽鎖を含む10種類の一本鎖抗体配列を取得して、それぞれDFSK9−2、DFSK9−3、DFSK9−4、DFSK9−5、DFSK9−6、DFSK9−7、DFSK9−8、DFSK9−9、DFSK9−10、DFSK9−11と命名される。対応する軽鎖の可変領域は、それぞれDFSK9−L2、DFSK9−L3、DFSK9−L4、DFSK9−L5、DFSK9−L6、DFSK9−L7、DFSK9−L8、DFSK9−L9、DFSK9−L10、DFSK9−L11と命名される。それらに対応するアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21に示す。上記一本鎖抗体をファージレベルで親和性を比較する。
(3)5株の親和性のより高いクローンDFSK9−2、DFSK9−4、DFSK9−5、DFSK9−6およびDFSK9−8を選択し、重鎖相補性決定領域のCDR1、CDR2、CDR3突然変異体抗体ライブラリーを設計し構築し、そしてこの重鎖突然変異の抗体ライブラリーに対してバイオパニング、陽性クローンのスクリーニングおよび同定を行い、10種類の異なる一本鎖抗体配列が取得され、それぞれDFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20およびDFSK9−21と命名される。ここでは、DFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20およびDFSK9−21の軽鎖可変領域配列は、それぞれDFSK9−L2、DFSK9−L8、DFSK9−L5、DFSK9−L6、DFSK9−L5、DFSK9−L6、DFSK9−L5、DFSK9−L4、DFSK9−L6、DFSK9−L6である。それらに対応するアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO.12、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.16に示す。DFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20およびDFSK9−21の重鎖可変領域配列は、それぞれDFSK9−H2、DFSK9−H8、DFSK9−H7、DFSK9−H3、DFSK9−H6、DFSK9−H4、DFSK9−H4、DFSK9−H9、DFSK9−H5、DFSK9−H10である。それらに対応するアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO.2、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.10に示す。上記一本鎖抗体をファージレベルで親和性を比較する;
(4)、(3)に記載の前記モノクローナル重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変遺伝子を真核発現ベクターにクローニングし、宿主細胞にトランスフェクトして抗PCSK9モノクローナル抗体の完全抗体を得る。
ここでは、前記CDRは、相補性決定領域(complementarity−determining region)であり;前記ScFvは、一本鎖抗体(single−chain fragment variable)であり;前記ADCsは、抗体−薬物コンジュゲート(antibody−drug conjugates)であり;前記LDLRは、低密度リポタンパク質受容体(Low Density Lipoprotein Receptor)であり;前記LDL−Cは、低密度リポタンパク質コレステロール(Low Density Lipoprotein−Cholesterol)であり;前記HEK293E細胞は、ヒト胎児腎293E細胞(human embryonic kidney 293E cell)であり;前記CHO細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(chinese hamster ovary cell)であり;前記NS0細胞は、マウスNS0胸腺腫細胞である。
(1)抗PCSK9一本鎖抗体のバイオパニングを行って、3ラウンドの抗体ライブラリーの濃縮スクリーニングによって、親和性のより高い抗体配列DFSK9−1を取得する。
(2)DFSK9−1に基づいて、コンピュータ支援設計により、軽鎖CDR123突然変異抗体ライブラリーを設計し構築し、さらにこの抗体ライブラリーに対してバイオパニング、陽性クローンのスクリーニング及び同定を行い、10種類の異なる軽鎖の抗体配列のクローンDFSK9−2、DFSK9−3、DFSK9−4、DFSK9−5、DFSK9−6、DFSK9−7、DFSK9−8、DFSK9−9、DFSK9−10、DFSK9−11を取得する。上記10種類の一本鎖抗体をファージレベルで親和性を比較する;
(3)より高い親和性を有する5株のクローンを選択し、重鎖CDR123ライブラリーを構築し、さらにこのライブラリーに対してバイオパニングおよび陽性クローンのスクリーニングを行い、10種類の異なる配列の一本鎖抗体DFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、DFSK9−20、DFSK9−21を取得する。上記一本鎖抗体をファージレベルで親和性を比較する;
(4)、(3)に記載の前記モノクローナル重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変遺伝子を真核発現ベクターにクローニングし、宿主細胞にトランスフェクトして抗PCSK9モノクローナル抗体の完全抗体を得る。
3ラウンドのスクリーニングを行った後、十分に分離したモノクローナルコロニーを拾い、2YTATG液体培地が添加された96ウェルのディープウェルプレートに接種し、37℃、220rpmで対数増殖期まで約5時間培養し、各ウェルに約1010のヘルパーファージM13KO7を添加し、37℃で30分間静置した後、150rpmで1時間振盪培養した。4000rpmで15分間の遠心分離した後、2YTATKA液体培地に沈殿を再懸濁し、28℃、220rpmで一晩培養する。4000rpm、4℃で15分間遠心分離した後、ファージを有する上清を、モノクローナルELISA同定のために吸引する。親和性のより高い一本鎖抗体DFSK9−1をスクリーニングして取得し、その重鎖可変領域をDFSK9−H1と命名され、そのアミノ酸配列をSEQ ID NO.1に示し、その軽鎖可変領域をDFSK9−L1と命名され、アミノ酸配列をSEQ ID NO.11に示す;
QVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGGTFTNNAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPMFGMANYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREGIPMIWGQGTTVTVSS
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDNRLTWYQQKPGKAPKLLIYDASSRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPENDPTTFGQGTKVEIK
実施例1および実施例2の方法に従って、バイオパニングおよび陽性クローンのスクリーニングを行い、親和性のより高いクローンをシーケンシングして、10種類の異なる一本鎖抗体配列が得られ、それぞれ DFSK9−2、DFSK9−3、DFSK9−4、DFSK9−5、DFSK9−6、DFSK9−7、DFSK9−8、DFSK9−9、DFSK9−10、 DFSK9−11と命名される。対応する軽鎖可変領域は、DFSK9−L2、DFSK9−L3、DFSK9−L4、DFSK9−L5、DFSK9−L6、DFSK9−L7、DFSK9−L8、DFSK9−L9、DFSK9−L10、DFSK9−L11と命名される。それらに対応するアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20およびSEQ ID NO.21に示す。軽鎖可変領域配列SEQ ID NO.12-SEQ ID NO.21は、以下の通りである。
SEQ ID NO.12(DFSK9−L2軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRNWLDWYQQKPGKAPKLLIYGASTLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNDIPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.13(DFSK9−L3軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINSWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTRETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNNTPNTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.14(DFSK9−L4軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVNNWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTRETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNDMPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.15(DFSK9−L5軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINSWLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWFDVPTTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.16(DFSK9−L6軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINNWLNWYQQKPGKAPKLLIYGASTRPTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWDDTPNTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.17(DFSK9−L7軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIHNWLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNSNIPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.18(DFSK9−L8軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVDSWLTWYQQKPGKAPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDSKIPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.19(DFSK9−L9軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRNWLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWTDTPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.20(DFSK9−L10軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVRNWLTWYQQKPGKAPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDDSTPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.21(DFSK9−L11軽鎖可変領域配列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSRPTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDSMPMTFGQGTKVEIK
実施例4.1中の抗体ライブラリーをファージディスプレイおよび精製回収を行う。このライブラリーから抗PCSK9の一本鎖抗体をパニングする。ファージ抗体ライブラリーのバイオパニング方法および陽性クローンのスクリーニングは、実施例1および実施例2の場合と同じである。シーケンシングされた後、10種類の異なる抗PCSK9抗体配列をスクリーニングした、それぞれDFSK9−12、DFSK9−13、DFSK9−14、DFSK9−15、DFSK9−16、DFSK9−17、DFSK9−18、DFSK9−19、 DFSK9−20、DFSK9−21と命名された。ここでは、DFSK9−12の軽鎖可変領域配列はDFSK9−L2であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.12に示される。DFSK9−13の軽鎖可変領域配列はDFSK9−L8であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.18に示される。DFSK9−14、DFSK9−16およびDFSK9−18の軽鎖可変領域配列はDFSK9−L5であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.15に示される。DFSK9−15、DFSK9−17、DFSK9−20およびDFSK9−21の軽鎖可変領域配列はDFSK9−L6であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.16に示される。DFSK9−19の軽鎖可変領域配列はDFSK9−L4であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.14に示される。DFSK9−12の重鎖可変領域配列はDFSK9−H2であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.2に示される。DFSK9−13の重鎖可変領域配列はDFSK9−H8であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.8に示される。DFSK9−14の重鎖可変領域配列はDFSK9−H7であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.7に示される。DFSK9−15の重鎖可変領域配列はDFSK9−H3であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.3に示される。DFSK9−16の重鎖可変領域配列はDFSK9−H6であり、対応するアミノ酸配列をSEQ ID NO.6に示される。DFSK9−17およびDFSK9−18の重鎖可変領域配列はDFSK9−H4であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.4に示される。DFSK9−19の重鎖可変領域はDFSK9−H9であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.9に示される。DFSK9−20の重鎖可変領域はDFSK9−H5であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.5に示される。DFSK9−21の重鎖可変領域配列はDFSK9−H10であり、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO.10に示される。軽鎖可変領域配列は、実施例3.2中のアミノ酸SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16およびSEQ ID NO.18を参照し、重鎖可変領域アミノ酸配SEQ ID NO.2〜SEQ ID NO.10は以下の通りである:
SEQ ID NO.2(DFSK9−H2重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWLSFYNGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.3(DFSK9−H3重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.4(DFSK9−H4重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGNSNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.5(DFSK9−H5重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGNSNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGMDRWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.6(DFSK9−H6重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYQGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGMDRWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.7(DFSK9−H7重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYGMSIWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.8(DFSK9−H8重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYQGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYGMTVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.9(DFSK9−H9重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVTFYNGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGLSVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.10(DFSK9−H10重鎖可変領域配列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGMDRWGQGTTVTVSS
Claims (17)
- 軽鎖と重鎖とを備え;前記軽鎖の相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれLCDR1、LCDR2およびLCDR3で表示され;また前記重鎖の相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれHCDR1、HCDR2およびHCDR3で表示され;LCDR1は、RASQSIDNRLT、RASQSVRNWLD、RASQGINSWLN、RASQNVNNWLN、RASQNINSWLN、RASQNINNWLN、RASQGIHNWLN、RASQDVDSWLT、RASQSVRNWLN、RASQDVRNWLTまたはRASQSIRSYLN中のいずれか1つを含み;LCDR2は、DASSRQS、GASTLES、AASTRET、GASSRQS、GASTRPT、DASNRQS、GASNLAS、DASNLQSまたはDASSRPT中のいずれか一つを含み;LCDR3は、QQPENDPTT、QQDNDIPLT、QQWNNTPNT、QQDNDMPLT、QQWFDVPTT、QQWDDTPNT、QQNSNIPLT、QQDSKIPLT、QQWTDTPLT、QQDDSTPPTまたはQQGDSMPMT中のいずれか1つを含み;HCDR1は、GGTFTNNA、GYTVTSYGまたはGYSLTSYG中のいずれか1つを含み;HCDR2は、RIIPMFGMA、LSFYNGNT、VTFYNGNT、VSFYQGNT、VSFYNGQTまたはVSFYNGNS中のいずれか1つを含み;HCDR3は、AREGIPMI、ARGYSLDV、ARGYGMSI、ARGFGMDR、ARGYGMTVまたはARGFGLSV中のいずれか1つを含む、ことを特徴とする抗PCSK9のモノクローナル抗体。
- 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ NO.11、SEQ NO.12、SEQ NO.13、SEQ NO.14、SEQ NO.15、SEQ NO.16、SEQ NO.17、SEQ NO.18、SEQ NO.19、SEQ NO.20またはSEQ NO.21中のいずれか1つが好ましい、ことを特徴とする請求項1に記載の抗PCSK9のモノクローナル抗体。
- 前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4、SEQ NO.5、SEQ NO.6、SEQ NO.7、SEQ NO.8、SEQ NO.9またはSEQ NO.10中のいずれか1つが好ましい、ことを特徴とする請求項1に記載の抗PCSK9のモノクローナル抗体。
- 前記重鎖可変領域HCDR1配列は、GYTVTSYGまたはGYSLTSYGから選択されたアミノ酸配列であり;前記軽鎖可変領域LCDR1配列は、RASQSVRNWLD、RASQNVNNWLN、RASQNINSWLN、RASQNINNWLNまたはRASQDVDSWLT中から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列であり、前記重鎖可変領域HCDR2配列は、VSFYQGNT、VSFYNGQTまたはVSFYNGNS中から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域LCDR2配列は、GASTLES、AASTRET、GASSRQS、GASTRPTまたはGASNLAS中から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列であり、前記重鎖可変領域HCDR3配列は、ARGYSLDV、ARGYGMSI、ARGFGMDRまたはARGYGMTV中から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域LCDR3配列は、QQDNDIPLT、QQDNDMPLT、QQWFDVPTT、QQWDDTPNTまたはQQDSKIPLT中から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列である、ことを特徴とする請求項1に記載の抗PCSK9のモノクローナル抗体。
- 請求項1乃至4のいずれか一項に記載の軽鎖または重鎖を含む抗体、ポリペプチドまたはタンパク質。
- 請求項1乃至4のいずれか一項に記載の軽鎖または重鎖のアミノ酸配列の、全長抗体と、一本鎖抗体と、単一ドメイン抗体と、二重特異性抗体と、抗体薬物コンジュゲートと、キメラ抗原受容体T細胞免疫療法とへの使用。
- 請求項1乃至4のいずれか一項に記載の軽鎖または重鎖を含む抗体であって、前記抗体はPCSK9に特異的に結合することができる抗体。
- 請求項1乃至4のいずれか一項に記載の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列または組合せ。
- 請求項8に記載のポリヌクレオチド配列または組合せを含む組換えDNA発現ベクター。
- 請求項9に記載の組換えDNA発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞であって、前記宿主細胞は原核細胞と、酵母と、昆虫細胞と、哺乳動物細胞とを含む宿主細胞。
- 前記原核細胞は大腸菌が好ましく、前記哺乳動物細胞はHEK293E細胞、CHO細胞またはNS0細胞が好ましい、ことを特徴とする請求項10に記載の宿主細胞。
- 前記抗PCSK9モノクローナル抗体の重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4を含み、前記軽鎖定常領域はCκまたはCλを含む、請求項1乃至4のいずれか一項に記載の抗PCSK9のモノクローナル抗体。
- 前記重鎖定常領域は、IgG4またはIgG2が好ましく、前記軽鎖定常領域はCκが好ましい、ことを特徴とする請求項12に記載の抗PCSK9のモノクローナル抗体。
- 請求項1乃至4のいずれか一項に記載の軽鎖または重鎖を含む、モノクローナル抗体、人工ベクター、薬物または医薬組成物。
- 前記モノクローナル抗体は、全長抗体または抗PCSK9モノクローナル抗体の断片を含み、
前記断片はFab、Fab’、F(ab’)2、FvおよびScFv中の一つまたは複数の組合せを含むが、これらに限定されない、
請求項14に記載のモノクローナル抗体。 - 請求項1乃至4のいずれか一項に記載の軽鎖または重鎖を含む検出試薬またはキット。
- 請求項1乃至4のいずれか一項に記載の軽鎖または重鎖の抗体であって、PCSK9活性を除去、阻害または低減することによって、疾患を改善、軽減、抑制または予防するように用い、前記疾患は、脂質異常血症と、心・脳血管疾患と、血栓閉塞性疾患とを含む抗体。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710052879.8A CN106749670B (zh) | 2017-01-22 | 2017-01-22 | 抗pcsk9单克隆抗体 |
CN201710052879.8 | 2017-01-22 | ||
PCT/CN2017/119822 WO2018133649A1 (zh) | 2017-01-22 | 2017-12-29 | 抗pcsk9单克隆抗体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019531057A true JP2019531057A (ja) | 2019-10-31 |
JP6734467B2 JP6734467B2 (ja) | 2020-08-05 |
Family
ID=58942477
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019505510A Active JP6734467B2 (ja) | 2017-01-22 | 2017-12-29 | 抗pcsk9モノクローナル抗体 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11390688B2 (ja) |
EP (1) | EP3480216A4 (ja) |
JP (1) | JP6734467B2 (ja) |
KR (1) | KR102257462B1 (ja) |
CN (3) | CN107698680B (ja) |
AU (1) | AU2017394444B2 (ja) |
CA (1) | CA3032506C (ja) |
EA (1) | EA039191B1 (ja) |
WO (1) | WO2018133649A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107698680B (zh) | 2017-01-22 | 2019-03-01 | 北京东方百泰生物科技有限公司 | 抗pcsk9单克隆抗体 |
WO2018228406A1 (zh) * | 2017-06-14 | 2018-12-20 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途 |
CN109897110B (zh) * | 2017-12-08 | 2022-05-17 | 深圳华大生命科学研究院 | 纳米抗体及其制备方法 |
CN110872353B (zh) * | 2018-09-03 | 2021-05-04 | 深圳华大基因科技有限公司 | 特异性结合pcsk9抗原的纳米抗体及其制备方法和应用 |
CN110981962B (zh) * | 2019-12-19 | 2022-07-12 | 中国药科大学 | Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其应用 |
CN111171152B (zh) * | 2020-01-15 | 2023-04-18 | 吉林医药学院 | Pcsk9抗体及其制备方法和应用 |
CN111620950B (zh) * | 2020-06-16 | 2023-01-31 | 中国药科大学 | 全人源抗pcsk9抗体、其抗原结合片段及其应用 |
CN113150148B (zh) * | 2020-06-19 | 2021-10-08 | 北京东方百泰生物科技股份有限公司 | 一种抗il-17ra单克隆抗体的纯化方法 |
CN114525258A (zh) * | 2020-10-30 | 2022-05-24 | 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 | 一种表达pcsk9阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用 |
CN117343171B (zh) * | 2022-11-01 | 2024-03-19 | 上海百英生物科技股份有限公司 | 一种抗bsa的兔单克隆抗体及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014511106A (ja) * | 2010-12-22 | 2014-05-08 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 抗pcsk9抗体及び使用方法 |
CN105348390A (zh) * | 2015-10-26 | 2016-02-24 | 北京智仁美博生物科技有限公司 | 抗人pcsk9单克隆抗体 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JO3672B1 (ar) * | 2008-12-15 | 2020-08-27 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9). |
WO2013188855A1 (en) * | 2012-06-15 | 2013-12-19 | Genentech, Inc. | Anti-pcsk9 antibodies, formulations, dosing, and methods of use |
JP2016514668A (ja) * | 2013-03-15 | 2016-05-23 | アムジエン・インコーポレーテツド | プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン9型に結合するヒト抗原結合タンパク質 |
CN105315371B (zh) * | 2015-03-05 | 2018-05-29 | 北京百特美博生物科技有限公司 | 抗人il-17单克隆抗体 |
CN107698680B (zh) * | 2017-01-22 | 2019-03-01 | 北京东方百泰生物科技有限公司 | 抗pcsk9单克隆抗体 |
-
2017
- 2017-01-22 CN CN201711161968.2A patent/CN107698680B/zh active Active
- 2017-01-22 CN CN201710052879.8A patent/CN106749670B/zh active Active
- 2017-01-22 CN CN201711161960.6A patent/CN107698679B/zh active Active
- 2017-12-29 AU AU2017394444A patent/AU2017394444B2/en active Active
- 2017-12-29 KR KR1020197003329A patent/KR102257462B1/ko active IP Right Grant
- 2017-12-29 US US16/321,472 patent/US11390688B2/en active Active
- 2017-12-29 EP EP17893120.0A patent/EP3480216A4/en active Pending
- 2017-12-29 CA CA3032506A patent/CA3032506C/en active Active
- 2017-12-29 JP JP2019505510A patent/JP6734467B2/ja active Active
- 2017-12-29 EA EA201990170A patent/EA039191B1/ru unknown
- 2017-12-29 WO PCT/CN2017/119822 patent/WO2018133649A1/zh unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014511106A (ja) * | 2010-12-22 | 2014-05-08 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 抗pcsk9抗体及び使用方法 |
CN105348390A (zh) * | 2015-10-26 | 2016-02-24 | 北京智仁美博生物科技有限公司 | 抗人pcsk9单克隆抗体 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EA039191B1 (ru) | 2021-12-15 |
US11390688B2 (en) | 2022-07-19 |
CN107698679B (zh) | 2019-03-01 |
AU2017394444A1 (en) | 2019-02-21 |
CA3032506A1 (en) | 2018-07-26 |
CN107698679A (zh) | 2018-02-16 |
JP6734467B2 (ja) | 2020-08-05 |
EP3480216A1 (en) | 2019-05-08 |
AU2017394444B2 (en) | 2020-04-09 |
KR102257462B1 (ko) | 2021-05-31 |
EA201990170A1 (ru) | 2019-07-31 |
CN107698680A (zh) | 2018-02-16 |
EP3480216A4 (en) | 2020-07-01 |
CA3032506C (en) | 2023-08-22 |
WO2018133649A1 (zh) | 2018-07-26 |
KR20190025980A (ko) | 2019-03-12 |
US20210277146A1 (en) | 2021-09-09 |
CN106749670B (zh) | 2018-06-12 |
CN107698680B (zh) | 2019-03-01 |
CN106749670A (zh) | 2017-05-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6734467B2 (ja) | 抗pcsk9モノクローナル抗体 | |
KR102662387B1 (ko) | B7-h3 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도 | |
CN109310756B (zh) | 新型血管生成素2,vegf双特异性拮抗剂 | |
JP2021535743A (ja) | 抗cd47抗体及びその応用 | |
RU2663721C1 (ru) | Моноклональные антитела к человеческому il-17 и их применение | |
CN110590952B (zh) | 一种抗ca125糖类抗原的高亲和力纳米抗体及其应用 | |
US10858447B2 (en) | Anti-PCSK9 antibody and use thereof | |
KR20230118922A (ko) | 항lag-3의 단일 클론 항체, 이의 항원 결합 단편 및이의 응용 | |
Kuai et al. | Characterization of binding mode of action of a blocking anti-platelet-derived growth factor (PDGF)-B monoclonal antibody, MOR8457, reveals conformational flexibility and avidity needed for PDGF-BB to bind PDGF receptor-β | |
CN114096275A (zh) | 新型bssl抗体 | |
Krinner et al. | A highly stable polyethylene glycol-conjugated human single-chain antibody neutralizing granulocyte-macrophage colony stimulating factor at low nanomolar concentration | |
KR20220007120A (ko) | 항-cd25 항체 및 이의 적용 | |
CN111620950B (zh) | 全人源抗pcsk9抗体、其抗原结合片段及其应用 | |
WO2023051656A1 (zh) | 双特异性抗体及其应用 | |
US10981993B2 (en) | Anti-PD-1 monoclonal antibody and obtaining method therefor | |
TWI615408B (zh) | 人源化之單株抗體及其用途 | |
CN115043940A (zh) | 抗人血清白蛋白抗体及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190131 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190131 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200106 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200326 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200622 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200709 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6734467 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |