CN104684932B

CN104684932B - 能够结合凝血因子XI和/或其活化形式因子XIa的抗体及其用途

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Publication number: CN104684932B
Application number: CN201380037161.1A
Authority: CN
Inventors: A·威尔曼; J·斯特拉斯伯格; F·迪特默; M·施特雷拉特; A·布奇穆勒; J·格鲁德金斯卡-高宝; R·芬纳恩; M·沙弗尔; C·格德斯; H·乔里斯恩; 亜沙子·板倉; P·外梁; E·塔克
Original assignee: Bayer Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2012-05-10
Filing date: 2013-05-08
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2033-05-08
Also published as: HK1207091A1; IL235238A0; CA2872926C; CN104684932A; US10040866B2; US20190284300A1; TW201400504A; PL2847228T3; JP2015517305A; AU2018200850C1; HRP20181680T1; ES2698950T3; JP2018148920A; AU2018200850B2; TWI644925B; RS57889B1; TWI631140B; EP3404045A1; ZA201407784B; SG11201406719UA

Abstract

本发明涉及能够结合凝血因子XI和/或其活化形式因子XIa的抗体及其使用方法，特别是作为抑制血小板聚集并由此抑制血栓形成的试剂的使用方法。

Description

能够结合凝血因子XI和/或其活化形式因子XIa的抗体及其用途

技术领域

背景技术

1964年，Macfarlane和Davie&Ratnoff提出了他们关于血液凝血过程的级联假说[Macfarlane RG.An enzyme cascade in the blood clotting mechanism,and itsfunction as a biochemical amplifier.Nature1964；202:498–9.；Davie EW,RatnoffOD.Waterfall sequence for intrinsic blood clotting.Science 1964；145:1310–2.]。从那时起，我们对于体内凝血功能的知识已经增加了。在过去的几年内，起始凝血并会聚于一个共同途径，最终导致凝血酶产生和纤维蛋白沉积的两种不同路径——所谓的外源和内源途径——的理论已经得到修正。在目前的模型中，当血浆蛋白酶激活因子VII与组织因子(TF)接触并以此形成复合物时起始了凝血。这种组织因子-FVIIa复合物能够将酶原FX激活成其活化形式FXa，FXa能够将凝血酶原(凝血因子II)转化为凝血酶(IIa)。凝血酶——凝血过程中的关键因素——其进而能催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白。另外，凝血酶激活由血小板所表达的特定受体，这导致血小板的活化。活化的血小板和纤维蛋白对于凝血块形成是必需的，并因此是正常止血的基本因素。

第二条放大路径是通过凝血因子XI(FXI)形成的。已很好地证实，与凝血级联中的其他成员一样，FXI是在连接体内血液凝结的起始阶段与放大阶段中起关键作用的血浆丝氨酸蛋白酶酶原[Davie EW,Fujikawa K,Kisiel W.The coagulation cascade:initiation,maintenance,and regulation.Biochemistry 1991；30:10363–70；GailaniD,Broze Jr GJ.Factor XI activation in a revised model of bloodcoagulation.Science1991；253:909–12；Kravtsov DV,Matafonov A,Tucker EI,Sun MF,Walsh PN,Gruber A,et al.Factor XI contributes to thrombin generation in theabsence of factor XII.Blood 2009；114:452–8.3-5]。FXI缺乏通常不会导致自发性出血，但是其与止血困难的出血的风险增加相关，而出血的严重程度与FXI的血浆水平不太相关。在人类中，严重的FXI缺乏对血栓性疾病起到某些保护作用[Salomon O,Steinberg DM,Zucker M,Varon D,Zivelin A,Seligshon U.Patients with severe factor XIdeficiency have a reduced incidence of deep-vein thrombosis.ThrombHaemost2011；105:269–73；Salomon O,Steinberg DM,Koren-Morag N,Tanne D,SeligsohnU.Reduced incidence of ischemic stroke in patients with severe factor XIdeficiency.Blood2008；111:4113–7]。而高水平的FXI一直与血栓形成事件相关[MeijersJC,Tekelenburg WL,Bouma BN,Bertina RM,Rosendaal FR.High levels of coagulationfactor XI as a risk factor for venous thrombosis.N Engl J Med 2000；342:696–701]。因此，已经提议将抑制FXI作为开发新的抗血栓药以获得提高的效益-风险比的新方法。因此，仍然对有效阻断血管内血栓形成而又不损害止血的抗血栓形成、抗血小板药物具有很大的医疗需求。

发明内容

近年来，新抗血栓试剂的开发已取得了很大的进展。但是，这些试剂所造成的不希望的出血事件仍然是一个严重的问题。因此，仍然有待发现能够理想地抑制血栓形成而又不损害止血的最佳抗血栓化合物。

凝血因子XI(FXI/FXIa)与血小板受体apoER2相互作用。本发明首次证明了抑制FXI/FXIa活性干扰了在剪切流动条件下的病理性的血小板激活和血小板聚集的过程。在离体血栓形成模型中，抑制FXI/FXIa活性导致在经过胶原蛋白表面的生理流动条件下全血中血小板活化标记物如CD62P的显著减少以及导致下游微聚集体的减少。因此，在血小板依赖性的动脉血栓形成的灵长类模型中，抑制FXIa降低了血小板沉积而不会影响血小板依赖性的初期止血。虽然具有显著的抗血小板作用，但是令人惊讶地，血小板与组织因子依赖性的初期止血栓子形成所必需的血管外基质蛋白的初始相互作用却没有受到影响。因此，抑制FXI/FXIa活性代表一种理想的药理学原理，其表现出抗血栓形成活性而不会引起出血相关的副作用。为了清楚起见：不损害止血意指抑制凝血因子XI和/或XIa不导致不需要的且可测量的出血事件，即使在存在其他抗凝血化合物和/或抗血小板化合物的情况下。如在血友病C(Hemophilia C)患者中所显示的一样，只有在密集手术和/或严重受伤的情况下才会发生出血。

提供了组合物和方法用于显示针对以其酶原形式和/或其活化形式(凝血因子XIa)存在的凝血因子XI的抗体、抗原结合片段或其变体，通过抑制或减少血小板聚集并由此抑制或减少微聚集体和/或血栓凝血块的产生而表现出抗血小板活性。

使用本发明的这些抗凝血因子XI的抗体和/或抗凝血因子Xia的抗体，抗原结合抗体片段以及所述抗体和片段的变体抑制血小板聚集并由此抑制血栓形成而不会损害止血。

本文还描述了抗凝血因子XI的抗体和/或抗凝血因子Xia的抗体的给药是中和抗体，以及本发明的这些抗体、抗原结合抗体片段以及所述抗体和片段的变体(以用作抗凝血、抗血栓形成疗法)不会增加不需要的出血事件的风险。

本发明提供了能够选择性结合活化形式的血浆因子XI——FXIa，并因此抑制了血小板聚集及相关的血栓形成而不会损害止血的人单克隆抗体。组合物包括能够结合凝血因子XI的重链和/或凝血因子XIa的轻链的确定表位的抗凝血因子XI的抗体和/或抗凝血因子Xia的抗体。这些抗体通过或/和阻遏凝血因子XIa的蛋白水解活性和/或通过抑制凝血因子XI(经由凝血因子FXIIa和/或凝血酶)转化为其活化形式凝血因子XIa来表现中和活性。在一个优选的实施方案中，本发明还包含了所述抗体与来自非人的其他物种(主要来自于兔)的凝血因子XI和/或XIa的交叉反应性，使得能够进行深入的药理学和毒理学分析。

在另一个优选的实施方案中，使用方法来优化和降低本发明组合物的免疫原性以降低开发抗药物抗体的风险。

本发明还包含与本文所述的抗体中的一个相竞争的人类抗体。

另外，组合物包括本发明中的抗原结合抗体片段、抗体和片段的变体、产生这些抗体的细胞系和编码这些抗体的氨基酸的分离的核酸。本发明还包含药物组合物，所述药物组合物包含在可药用载体和/或溶液中的本发明的抗凝血因子XI的抗体和/或抗凝血因子Xia的抗体、或抗原结合抗体片段，以及所述抗体和片段的变体。

本发明的方法包括将上述组合物给予需要的受试者，目的是抑制血小板聚集并由此抑制血栓形成，降低了在血栓治疗中任何其他抗凝血试剂或抗血栓试剂的所需剂量，可治疗急性炎症反应，或治疗癌症，或治疗任何其他与所述凝血级联激活相关的疾病。还提供了用于产生本发明的抗凝血因子XI的抗体和/或抗FXIa的抗体、或抗原结合抗体片段，以及抗体和片段的变体的方法。

附图说明

图1：

包含可变轻链结构域的氨基酸序列SEQ ID NO:19和可变重链结构域的氨基酸序列SEQ ID NO:20的抗FXIa的抗体076D-M007-H04抑制人FXIa的剂量响应曲线(EC50等同于IC50)。此抗体包含CDRH1SEQ ID NO:21、CDRH2SEQ ID NO:22和CDRH3SEQ ID NO:23。此抗体还包含CDRL1SEQ ID NO:24、CDRL2SEQ ID NO:25和CDRL3SEQ ID NO:26。在所示浓度下测试了在淘选/筛选过程中鉴定的抗体抑制人FXIa的蛋白水解活性的能力。相关的DNA序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8所示。

图2：

抗FXIa的抗体076D-M007-H04抑制兔FXIa的剂量响应曲线。在所示浓度下测试了在淘选/筛选过程中鉴定的抗体抑制兔FXIa的蛋白水解活性的能力。

图3：

包含可变轻链结构域的氨基酸序列SEQ ID NO:27和可变重链结构域的氨基酸序列SEQ ID NO:20的抗FXIa的抗体076D-M007-H04-CDRL3-N110D抑制人FXIa的剂量响应曲线。在所示浓度下测试了在淘选/筛选过程中鉴定的抗体抑制人FXIa的蛋白水解活性的能力。

图4：

抗FXIa的抗体076D-M007-H04-CDRL3-N110D的剂量响应曲线。在所示浓度下测试了在淘选/筛选过程中鉴定的抗体抑制兔FXIa的蛋白水解活性的能力。

图5：

包含可变轻链结构域的氨基酸序列SEQ ID NO:29和可变重链结构域的氨基酸序列SEQ ID NO:30的抗FXI的抗体076D-M028-H17通过凝血因子XIIa抑制人FXI转化为FXIa的剂量响应曲线。此抗体包含CDRH1SEQ ID NO:31、CDRH2SEQ ID NO:32和CDRH3SEQ ID NO:33。此抗体还包含CDRL1SEQ ID NO:34、CDRL2SEQ ID NO:35和CDRL3SEQ ID NO:36。在所示浓度下测试了在淘选/筛选过程中鉴定的抗体抑制酶原FXI转化为其活化形式FXIa的能力。相关的DNA序列如SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:18所示。

图6：

抗FXI的抗体076D-M028-H17通过凝血因子IIa抑制人FXI转化为FXIa的剂量响应曲线。在所示浓度下测试了在淘选/筛选过程中鉴定的抗体抑制酶原FXI转化为其活化形式FXIa的能力。

图7：

抗FXI的抗体076D-M028-H17通过凝血因子XIIa抑制兔FXI转化为FXIa的剂量响应曲线。在所示浓度下测试了在淘选/筛选过程中鉴定的抗体抑制酶原FXI转化为其活化形式FXIa的能力。

图8：

抗FXI的抗体076D-M028-H17通过凝血因子IIa抑制兔FXI转化为FXIa的剂量响应曲线。在所示浓度下测试了在淘选/筛选过程中鉴定的抗体抑制酶原FXI转化为其活化形式FXIa的能力。

图9：

076D-M007-H04对人FXIa催化结构域的结合和阻断活性。尽管076D-M007-H04抑制了人FXIa的蛋白水解活性，而076D-M028-H17没有显示这种活性，表明了076D-M007-H04结合到FXIa的催化结构域上。

图10:

使用Lineweaver–Burk曲线图对076D-M007-H04的结合模式进行的表征显示该抗体表现出竞争性抑制活性。

图11：

CD62P表达和血小板微聚集体形成的流式细胞术分析。通过光散射和FITC-CD41/CD61(GPIIbIIIa)荧光的组合检测了单个血小板。(A)通过使用FITC-CD41和PE-CD62P荧光的点阵图确定CD62P表达。示出了灌注前(左侧)和灌注后(右侧)的圈选的血小板。(B)由增加的尺寸(正向散射)定义血小板微聚集体形成，示于圆圈中。示出了灌注前(左侧)和灌注后(右侧)收集的样品的点阵图。

图12：

通过FXI(a)抗体降低血小板CD62P表达。用(A)076D-M007-H04和(B)076D-M028-H17处理全血并在再钙化后立即灌注到胶原蛋白包被的表面上。作为平行实验，用载体或抑制剂处理后收集全血样品，并用TRAP6(10μg/ml)孵育5分钟或不进行孵育。如图11中所示，通过流式细胞术分析血小板CD62P表达。将数据表示为在至少5次实验的圈选群体中的CD62P-阳性血小板的平均值±SEM百分比。在每次处理的5分钟灌注过程中最高的CD62P表达水平示于图表中。

图13：

通过FXI(a)抗体抑制血小板微聚集体形成。用(A)076D-M007-H04和(B)076D-M028-H17处理全血并在再钙化后立即灌注到胶原蛋白包被的表面上。如图13中所示，通过流式细胞术分析血小板微聚集体并展示。将数据表示为相对于至少5次实验的10⁴个圈选的单个血小板的平均值±SEM聚集体计数。在每次处理的5分钟灌注过程中最大的聚集体计数示于图表中。

图14：

076D-M007-H04对氯化铁诱导的血栓形成的体内作用(a)和对耳出血时间的体内作用(b)。可证明076D-M007-H04剂量依赖性地降低了血栓重量而没有增加耳出血时间。

图15：

076D-M007-H04-CDRL3-N110D对氯化铁诱导的血栓形成的体内作用(a)和对耳出血时间的体内作用(b)(记载于实施例XXX中)。可以证明076D-M007-H04-CDRL3-N110D剂量依赖性地降低了血栓重量而没有增加耳出血时间。

图16：

076D-M028-H17对氯化铁诱发的血栓形成的体内作用(a)和对耳部出血时间的体内作用(b)(记载于实施例XXX)。可以证明076D-M028-H17剂量依赖性的降低了血栓重量但没有增加耳出血时间。

图17：

该图显示了与FIXa(上部分)复合的Fab 076D-M007-H04(下部分)的卡通示意图。

图18a：

该图显示了Fab 076D-M007-H04(卡通图)对FIXa C500S的结合表位的详细视图。FIXa C500S以表面图(surface representation)显示。

图18b:

该图显示了具有以表面图显示的FIXa C500S的叠加肽X-射线结构的Fab 076D-M007-H04。活性中心裂缝用红色椭圆突出显示。

图19a:

该图显示了带有叠加的Fab 076D-M007-H04的酶原FXI的晶体结构(odb登录号2F83)。

图19b:

该图显示了同样的视角，但是酶原FXI的催化结构域被Fab076D-M007-H04：FXIaC500S复合结构中FXIa C500S的催化结构域替换。FXI和FXIa C500S的催化结构域都以表面图显示，所有其他结构域都以卡通显示。在与Fab 076D-M007-H04的交界面处未正确排序的环在图19中突出显示。

图20：

在收集自076D-M007-H04给药后的狒狒的血浆样品中确定了体外aPTT凝血时间的增加。

图21：

在给药2.5mg/kg 076D-M007-H04(静脉推注)后的ACT测量，从给药后5分钟到给药后504小时。

图22：

在给药2.5mg/kg 076D-M007-H04(静脉推注)后的ACT测量的头24小时。

图23：

在给药2.5mg/kg 076D-M007-H04(静脉推注)后的aPTT测量，从给药后5分钟到给药后504小时。

图24：

在给药2.5mg/kg 076D-M007-H04(静脉推注)后的aPTT测量的头24小时。

图25：

在2mm内径的胶原蛋白包被的ePTFE血管移植物上的血小板沉积。

图26：

如实施例12中所述的在胶原蛋白包被的ePTFE血管移植物上的血小板沉积。

图27：

如实施例12部分所述的在静脉扩张室(和在胶原蛋白包被的移植物和所述硅室之间的连接部分)上的血小板沉积。

图28：

在给药076D-M007-HO4后的狒狒血浆中测量的TAT水平。

图29：

在单独或在给予浓度为32mg/kg的可咀嚼阿司匹林(ASA，32mg/kg)后用0.5mg/kg076D-M007-H04和2mg/kg 076D-M007-H04(24小时后)处理的狒狒中的出血时间。

具体实施方式

定义

止血：术语止血是指分别将血流阻止(arrest)在损伤部位以及在伤口愈合过程中恢复血管通畅性(vascular patency)的主要机制。在正常止血和病理性血栓形成的过程中，三种机制同时激活：意指活化的血小板与血管壁相互作用的初期止血、纤维蛋白的形成和称为纤维蛋白溶解的过程[Arthur A.Sasahara,Joseph Loscalzo(2002)NewTherapeutic Agents for Thrombosis and Thrombolysis(2nd Edition)Marcel DekkerInc.New York,NY,ISBN 0-8247-0795-8]。

凝血和凝血级联：称为凝血级联的基于蛋白质的系统用于稳定已经形成的凝血块并进一步封闭伤口。所述凝血途径是蛋白水解级联。该途径的每一种酶都以酶原的形式(非活化形式)存在于血浆中，其在被激活时经历蛋白水解切割以从前体分子中释放出活性因子。凝血级联作为控制激活过程的一系列正向和负向反馈环路而发挥作用。所述途径的最终目的是产生凝血酶，凝血酶能够将可溶的纤维蛋白原转化为形成凝血块的纤维蛋白。可将产生凝血酶的过程分为三个阶段：提供用于产生活性凝血块因子FXa(激活的因子-X)的可选路径的内源和外源途径，和导致凝血酶形成的最终共同途径[Hoffman M.M.andMonroe D.M.(2005)Rethinking the coagulation cascade.CurrHematol Rep.4:391-396；Johne J,Blume C,Benz PM,Pozgajová M,Ullrich M,Schuh K,Nieswandt B,WalterU,Renné T.(2006)Platelets promote coagulation factor XII-mediated proteolyticcascade systems in plasma.Biol Chem.387:173-178]。

血小板聚集：当发生血管壁破裂时，暴露了一般不与血流直接接触的物质。这些物质(主要是胶原蛋白和冯维勒布兰德(von Willebrand)因子)使得血小板能够粘附在破裂的表面。一旦血小板粘附在所述表面，其便释放将其他血小板吸引到所述受损区域的化学物质，这称为血小板聚集。这两个过程是对止血的第一响应。

凝血因子XI和凝血因子XIa

所述凝血因子XI(FXI)在肝脏中合成并作为与高分子量激肽原复合的二硫键连接的二聚体而在血浆中循环。该二聚体的每条多肽链大约80KD。通过血液凝结的接触阶段或者通过血小板表面的凝血酶介导的激活将所述酶原因子XI转化为其活性形式——所述凝血因子XIa(FXIa)。在所述因子XI的激活过程中，两条链都有一个内部肽键被裂解，形成了活化因子FXIa——由二硫键连接在一起的两条重链和两条轻链组成的丝氨酸蛋白酶。所述丝氨酸蛋白酶FXIa将凝血因子IX转化为IXa，IXa随后激活凝血因子X(Xa)。然后Xa可介导凝血因子II/凝血酶的激活。该因子的缺陷导致罗森塔尔综合症(也被称为C型血友病)——一种具有以下特征凝血异常：由受损处长时间出血、经常或严重鼻出血、尿中微量的血和女性经期大量出血。本文使用的―凝血因子XI‖、―因子XI‖或―FXI‖是指来自任何表达该蛋白的哺乳动物物种的任何FXI。例如，FXI可是显示了参与调节血流、凝血和/或血栓形成的凝血因子XI的人类、非人灵长类动物(如狒狒)、鼠、狗、猫、奶牛、马、猪、兔或任何其他物种。

凝血因子XIIa激活凝血因子XI的切割位点是每条肽链中Arg-369和Ile-370之间的内部肽键[Fujikawa K,Chung DW,Hendrickson LE,Davie EW.(1986)Amino acidsequence of human factor XI,a blood coagulation factor with four tandemrepeats that are highly homologous with plasma prekallikrein.Biochemistry 25:2417-2424]。凝血因子XIa的每条重链(369个氨基酸)都含有称为苹果结构域(appledomain)的90-91个氨基酸的四个串联重复序列(命名为A1-A4)和一段短的连接肽[Fujikawa K,Chung DW,Hendrickson LE,Davie EW.(1986)Amino acid sequence ofhuman factor XI,a blood coagulation factor with four tandem repeats that arehighly homologous with plasma prekallikrein.Biochemistry 25:2417-2424；Sun MF,Zhao M,Gailani D.(1999)Identification of amino acids in the factor XI apple3domain required for activation of factor IX.J Biol Chem.274:36373-36378]。所述凝血因子XIa的轻链(每条238个氨基酸)含有具有丝氨酸蛋白酶的胰蛋白酶家族的典型序列的酶的催化部分[Fujikawa K,Chung DW,Hendrickson LE,Davie EW.(1986)Aminoacid sequence of human factor XI,a blood coagulation factor with four tandemrepeats that are highly homologous with plasma prekallikrein.Biochemistry25:2417-2424]。活化的因子XIa通过激活因子IX引发凝血内源途径的中间阶段。

保守性氨基酸变体

可制备保留了本文所述的抗体肽序列的整体分子结构的多肽变体。考虑到各氨基酸的性质，技术人员会认识到一些合理置换。例如，在所涉及的残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性的基础上，可进行氨基酸置换，即，“保守性置换”。

例如：(a)非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；(d)带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。一般在(a)-(d)组内进行置换。另外，基于甘氨酸和脯氨酸破坏α螺旋的能力可将它们相互置换。类似地，某些氨基酸，如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸在α螺旋中更常见，而缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和苏氨酸在β折叠层中更常见。甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和脯氨酸在转角中较为常见。可在以下组内进行一些优选的置换：(i)丝氨酸和苏氨酸；(ii)脯氨酸和甘氨酸；和(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。考虑到已知的遗传密码以及重组和合成DNA技术，熟练的科学家可很容易地构建编码保守性氨基酸变体的DNA。

本文使用的两条多肽序列之间的―序列同一性‖，表示所述序列之间相同的氨基酸的百分比。―序列同源性‖表示相同的或代表保守性氨基酸置换的氨基酸的百分比。本发明的优选多肽序列在CDR区域中具有至少60％的序列同一性，更优选地至少70％或80％，还更优选地至少90％，和最优选地至少95％。优选的抗体还在CDR区域中具有至少80％的序列同源性，更优选地90％和最优选地95％。

本发明的DNA分子

本发明还涉及编码本发明的抗体的DNA分子。这些序列包括，但不限于，SEQ IDNOs 1到18中所列出的那些DNA分子。

本发明中的DNA分子不限于本文所公开的序列，还包括其变体。可参照本发明中的DNA变体在杂交中的物理特性对它们进行描述。技术人员会认识到可通过核酸杂交技术使用DNA鉴定其互补序列和(因为DNA是双链的)其等价物或同系物。还会认识到，当互补性低于100％时依然能够发生杂交。但是，考虑到条件的适当选择，可基于DNA序列与特定探针的结构相关性使用杂交技术来区分DNA序列。关于此类条件的指导可参见Sambrook et al.,1989[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:Alaboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA)]和Ausubel et al.,1995[Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,&Struhl,K.eds.(1995).Current Protocols in MolecularBiology.New York:John Wiley and Sons]。

两条多核苷酸序列之间的结构相似性可表示为这两条序列会与彼此杂交的条件的―严格性‖的函数。本文使用的术语―严格性‖是指所述条件不利于杂交的程度。严格条件非常不利于杂交，并且在这样的条件下只有结构上最相关的分子会相互杂交。相反，非严格条件有利于表现出较低程度的结构相关性的分子的杂交。因此，杂交严格性与两条核苷酸序列的结构关系直接相关。下列关系可用于关联杂交和相关性(其中T_m是核酸双链体的熔解温度)。

a.T_m＝69.3+0.41(G+C)％

b.错配碱基对数目中每增加1％，双链DNA的T_m值降低1℃。

c.(T_m)_μ2-(T_m)_μ1＝18.5log₁₀μ2/μ1

其中μ1和μ2是两种溶液的离子强度。

杂交严格性是许多因素的函数，包括总DNA浓度、离子强度、温度、探针大小和破坏氢键的试剂的存在。促进杂交的因素包括高DNA浓度、高离子强度、低温、较长的探针大小和不存在破坏氢键的试剂。杂交一般分两个阶段进行：“结合”阶段和“洗涤”阶段。

首先，在所述结合阶段中，探针在有利于杂交的条件下结合到靶标上。通常通过改变温度在这一阶段控制严格性。对于高严格性，除非使用短的寡核苷酸探针(<20nt)，温度通常在65℃到70℃之间。代表性杂交溶液包含6x SSC、0.5％SDS、5x Denhardt溶液和100μg非特异性载体DNA[参见15]。当然，很多不同但功能等同的缓冲条件是已知的。当相关性程度较低时，可选择较低的温度。低严格性结合温度在约25℃到40℃之间。中等严格性在至少约40℃到小于约65℃之间。高严格性为至少约65℃。

第二，通过洗涤去除过量的探针。在该阶段通常采用更严格的条件。因此，所述“洗涤”阶段在通过杂交确定相关性中是最重要的。洗涤溶液一般包括较低的盐浓度。示例性的中等严格性溶液包含2×SSC和0.1％SDS。高严格性洗涤溶液包含小于约0.2X SSC的等同物(在离子强度上)，优选的严格性溶液包含约0.1×SSC。与各种严格性相关的温度与上述用于“结合”的温度相同。在洗涤的过程中，一般还多次更换所述洗涤溶液。例如，典型的高严格性洗涤条件包含在55℃下洗涤两次，每次持续30分钟；在60℃下洗涤三次，每次持续15分钟。

因此，本发明的主题是编码本发明的抗体和/或抗原结合片段的分离的核酸序列。本发明的另一个实施方案是前述的编码本发明的抗体的分离的核酸序列。因此，本发明包含在高严格性结合和洗涤条件下，与所提出的分子进行杂交的核酸分子，其中这类核酸分子编码具有如本文所述的性质的抗体或其功能片段。优选的分子(从mRNA角度)与本文所述的DNA分子中的一个具有至少75％或80％(优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％)的序列同一性。所述DNA编码这样的分子，其降低和/或抑制凝血因子XI转化为其活性形式XIa和/或直接阻断凝血因子XIa的催化活性。

重组DNA构建体和表达

本发明还提供了包含本发明的一个或多个核苷酸序列的重组DNA构建体。本发明的重组构建体可与其中插入有编码本发明的抗体的DNA分子的载体(如质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体)一起使用。

可通过记载于Sambrook et al.,1989和Ausubel et al.,1989[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:A laboratory manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA；Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,&Struhl,K.eds.(1995).CurrentProtocols in Molecular Biology.New York:John Wiley and Sons]中的技术产生所述编码基因。或者，可使用例如合成仪化学合成所述DNA序列。参见，例如，记载于其全文以引用的形式纳入本文的OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS[Gait,M.J.(1984)"An introductionto modern methods of DNA Synthesis"In Oligonucleotide Synthesis a PracticalApproach.Ed.M.J.Gait,IRL Press Oxford UK]中的技术。本领域中的专家能够将编码可变区的DNA与编码突变或未突变的各种人类IgG同种型及其衍生型的恒定区的基因片段融合。他能够利用重组DNA技术以使用如含有三重―甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸‖的15个氨基酸片段的接头将两个可变区融合为单链形式。本发明的重组构建体含有能够表达所述编码DNA的RNA和/或蛋白产物的表达载体。所述载体还可包含调节序列，包含与开放阅读框(ORF)可操作地连接的启动子。所述载体还可包含选择性标记序列。插入的靶基因编码序列的有效翻译还可能需要特定的起始和细菌分泌信号。

本发明还提供了含有至少一种本发明的DNA的宿主细胞。所述宿主细胞实际上可以是可利用表达载体的任何细胞。例如，其可以是高等真核宿主细胞如哺乳动物细胞、低等真核宿主细胞如酵母细胞，并且其可以是原核细胞如细菌细胞。可通过磷酸钙转染、DEAE、右旋糖酐介导的转染、电穿孔和噬菌体感染将所述重组构建体引入到所述宿主细胞中。

细菌表达

通过将编码所需蛋白质的结构DNA序列与适当的翻译起始和终止信号一起插入到带有功能性启动子的可操作阅读相中来构建用于细菌的可用表达载体。所述载体将包含一个或多个表型选择性标记和复制起点以确保维持所述载体，并且如果需要的话，以提供在宿主内的扩增。用于转化的适合的原核宿主包括大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)以及假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的多个种。

细菌载体可例如基于噬菌体、质粒或噬菌粒。这些载体可包含衍生自一般含有所公知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的元件的可商购质粒的选择性标记和细菌复制起点。在转化合适的宿主菌株并使宿主菌株生长至合适的细胞密度后，通过合适的方法(例如，温度变化或化学诱导)抑制/诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。一般通过离心收集细胞，通过物理或化学方法破碎，并保留所得粗提取物用于进一步纯化。

在细菌系统中，根据所表达的蛋白的目的用途，可有利地选择很多表达载体。例如，当用于产生抗体或为了筛选肽文库而需要生产大量的这类蛋白质时，可能需要指导容易纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体。

因此，本发明的目的是含有编码本发明的新抗体的核酸序列的表达载体。

哺乳动物表达和蛋白纯化

用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包含在哺乳动物细胞中指导高水平的蛋白表达的病毒元件，如衍生自巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(如SV 40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。对病毒调节元件及其序列的进一步描述[参见Stinski的U.S.5,168,062；Bell et al.的U.S.4,510,245；Schaffner et al.的U.S.4,968,615]。所述重组表达载体还可包含复制起点和选择性标记[参见Bell et al.的U.S.4,510,245；Schaffneret al.的U.S.4,968,615；Axel et al.的U.S.4,399,216]。合适的选择性标记包括赋予其中已引入所述载体的宿主细胞对药物(如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性的基因。例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因赋予了对氨甲蝶呤的抗性，并且neo基因赋予了对G418的抗性。

可使用标准技术如电穿孔、磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐转染将所述表达载体转染至宿主细胞中。

用于表达本文提供的抗体、抗原结合部分或其衍生物的适合的哺乳动物宿主细胞包括使用例如记载于[Axel et al.的U.S.5,179,017]中的DHFR选择性标记的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)[包括记载于[Axel et al.的U.S.4,634,665by]中的dhfr-CHO细胞]、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。在一些实施方案中，设计所述表达载体以使得所表达的蛋白分泌到其中生长宿主细胞的培养基中。可使用标准蛋白纯化方法从所述培养基中回收抗体、抗原结合部分或其衍生物。

可通过公知的方法从重组的细胞培养物中回收和纯化本发明的抗体及其抗原结合片段，所述方法包括，但不限于，硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、蛋白A色谱法、蛋白G色谱法、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法和凝集素色谱法。还可将高效液相色谱(“HPLC”)用于纯化[参见Urlaub G,Chasin LA.(1980)Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient indihydrofolate reductase activity.Proc Natl Acad Sci U S A.77:4216-4220；例如第1,4,6,8,9,10章,均通过引用的方式全文纳入本文]。本发明的抗体或其抗原结合片段包含天然纯化的产物、化学合成方法的产物和通过重组技术从真核宿主中产生的产物，所述真核宿主包括，例如，酵母细胞、高等植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。根据重组生产过程中使用的宿主，本发明的抗体可是糖基化的或可是非糖基化的。这些方法记载于很多标准实验手册中[参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)MolecularCloning:A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,USA)；Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,&Struhl,K.eds.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York:John Wiley and Sons,chapters 10,12,13,16,18and20]。因此，本发明的目的也是包含所述载体或包含核酸分子的宿主细胞，由此所述宿主细胞可以是高等真核宿主细胞如哺乳动物细胞、低等真核宿主细胞如酵母细胞，还可以是原核细胞如细菌细胞。

本发明的另一目的是使用所述宿主细胞产生抗体和抗原结合片段的方法，所述方法包括在合适条件下培养所述宿主细胞并回收所述抗体。

因此，本发明的另一目的是使用本发明的宿主细胞产生并纯化至至少95重量％均一性的抗体005-C04。

亲和力

通常通过测量平衡结合常数(ka)和平衡解离常数(kd)并计算kd除以ka的商(K_D＝kd/ka)来确定―亲和力‖或―结合亲和力‖K_D。术语―免疫特异性‖或―特异性结合‖意指抗体以小于或等于10^-6M(单价亲和力)的亲和力K_D结合到所述凝血因子XI和/或其活化形式——所述凝血因子XIa上。术语―高亲和力‖意指抗体以小于或等于10^-7M(单价亲和力)的亲和力K_D结合到所述凝血因子XI和/或其活化形式——所述凝血因子XIa上的K_D。所述抗体可对靶抗原比对其他无关分子具有实质上更大的亲和力。所述抗体也可对靶抗原比对同系物具有实质上更大的亲和力，例如，对所述靶抗原至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、10^-3倍、10^-4倍、10^-5倍、10^-6倍或更高的相对亲和力。可使用以下传统技术容易地确定这种亲和力：例如通过平衡透析；通过使用BIAcore2000仪器，使用生产商给出的常规步骤；通过使用放射性标记的靶抗原的放射免疫测定；或通过技术人员已知的其他方法。例如，可通过记载于[Kaufman RJ,Sharp PA.(1982)Amplification and expression of sequencescotransfected with a modular dihydrofolate reductase complementary dna gene.JMol Biol.159:601-621]中的方法分析亲和力数据。

抗体

本文使用的短语―阻断所述凝血因子XI和/或其活化形式——所述凝血因子XIa的抗体‖意指通过本发明的抗体阻断FXI和/或FXIa，这导致所述凝血因子FXI和/或FXIa活性的完全或部分抑制。所述氨基酸序列包括，但不限于，SEQ ID NOs 19到36中所列出的那些DNA分子。

术语―抗体‖以其最广泛的意义使用并包括完全组装的抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、能结合抗原的抗体片段(例如Fab'、F'(ab)2、Fv、单链抗体，双链抗体(diabody))、骆驼本体(camel body)以及包含前述的重组肽，只要它们表现出所需的生物活性。抗体可在其优选地衍生自IgG1、IgG2或IgG4同种型的重链上携带不同的恒定区(Fc结构域)(参见下文)。可引入修饰效应子功能的突变。已鉴定出在与补体蛋白C1q和Fc受体相互作用中起主要作用的Fc结构域上的氨基酸残基，并描述了影响效应子功能的突变[综述参见Colligan,Current Protocols in Immunology,or CurrentProtocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)]。特别是，可通过将氨基酸第297位的天冬酰胺突变为丙氨酸或将天冬酰胺突变为谷氨酰胺来实现IgG1的去糖基化，已报道这消除了抗体衍生的细胞介导的细胞毒性(ADCC)[Labrijn AF,AalberseRC,Schuurman J.(2008)When binding is enough:nonactivating antibodyformats.Curr Opin Immunol.20:479-485]。第322位的赖氨酸被丙氨酸置换导致降低了ADCC并去除了补体衍生的细胞毒性(CDC)，而第234和235位的两个亮氨酸同时被丙氨酸置换则避免了ADCC和CDC[Sazinsky SL,Ott RG,Silver NW,Tidor B,Ravetch JV,WittrupKD.(2008)Aglycosylated immunoglobulin G1variants productively engageactivating Fc receptors.Proc Natl Acad Sci U S A.105:20167-20172]。为了将IgG4同种型在体内作为保留了亲合力的二价治疗剂使用，可引入修饰如在“核心铰链区”中的丝氨酸到脯氨酸的置换[Schuurman J,Van Ree R,Perdok GJ,Van Doorn HR,Tan KY,Aalberse RC.(1999)Normal human immunoglobulin G4is bispecific:it has twodifferent antigen-combining sites.Immunology.97:693-698]。可通过将第127、232和233位的半胱氨酸中的一个置换为丝氨酸避免(circumvent)人IgG2分子形成异质共价二聚体的趋势[Simmons LC,Reilly D,Klimowski L,Raju TS,Meng G,Sims P,Hong K,ShieldsRL,Damico LA,Rancatore P,Yansura DG.(2002)Expression of full-lengthimmunoglobulins in Escherichia coli:rapid and efficient production ofaglycosylated antibodies.J Immunol Methods.263:133-147]。可选的具有降低的效应子功能的形式可以是衍生自携带4个IgG4-特异性的氨基酸残基改变的IgG2的IgG2m4形式[Hezareh M,Hessell AJ,Jensen RC,van de Winkel JG,Parren PW.(2001)Effectorfunction activities of a panel of mutants of a broadly neutralizing antibodyagainst human immunodeficiency virus type 1.J Virol.75:12161-1218]。抗体片段可通过重组DNA技术或通过对完整抗体的酶促或化学切割来生产，并在下文进一步描述。单克隆抗体的非限制性实施例包括鼠类的、嵌合的、人源化的、人的、和HumanEngineered^TM的免疫球蛋白、抗体、具有衍生自免疫球蛋白的序列的嵌合融合蛋白、或其突变蛋白质或衍生物，各自在下文进一步描述。可考虑完整分子和/或片段的多聚体或聚集体(包括化学衍生化的抗体)。

本文使用的术语“单克隆抗体”是指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即，除了可以极小量存在的可能的天然存在的突变外，组成该群的单个抗体都是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单个抗原位点。另外，与一般包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性，单克隆抗体的有利之处还在于它们由同质培养物合成，不被具有不同特异性和特征的其他免疫球蛋白污染。

修饰词“单克隆”是指从基本上同质的一群抗体中获得的抗体的特征，并且不应被解释为需要通过任何特定的方法生产该抗体。例如，待使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler et al.[Allen MJ,Guo A,Martinez T,Han M,Flynn GC,Wypych J,Liu YD,ShenWD,Dillon TM,Vezina C,Balland A.(2009)Interchain disulfide bonding in humanIgG2antibodies probed by site-directed mutagenesis.Biochemistry.48:3755-3766]描述的杂交瘤方法进行制备，或可通过重组DNA方法进行制备[参见An Z,Forrest G,MooreR,Cukan M,Haytko P,Huang L,Vitelli S,Zhao JZ,Lu P,Hua J,Gibson CR,Harvey BR,Montgomery D,Zaller D,Wang F,Strohl W.(2009)IgG2m4,an engineered antibodyisotype with reduced Fc function.MAbs.1:572-579]。所述“单克隆抗体”还可以例如是重组的、嵌合的、人源化的、人的、HumanEngineered^TM的、或抗体片段。

“免疫球蛋白”或“天然抗体”是四聚体糖蛋白。在天然存在的免疫球蛋白中，每个四聚体由2个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100到110个或更多个氨基酸的“可变”区。每条链的羧基末端部分定义主要负责效应子功能的恒定区。根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归于不同类。重链被分类为mu(μ)、delta(Δ)、gamma(γ)、alpha(α)和epsilon(ε)，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。这些中的几种可进一步被分成亚类或同种型，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。不同的同种型具有不同的效应子功能；例如，IgGl和IgG3同种型通常具有ADCC活性。人轻链被分类为kappa(K)和lambda(λ)轻链。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，所述重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区[通常参见，G,Milstein C.(1975)Continuous cultures of fused cells secreting antibody ofpredefined specificity.Nature.256:495-497]。

在此将抗体/免疫球蛋白的“功能性片段”或“抗原结合抗体片段”定义为保留了抗原结合区的抗体/免疫球蛋白的片段(例如，IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”一般存在于抗体的一个或多个超变区，即CDR-1区、CDR-2区和/或CDR-3区；但是，可变“框架”区也可例如通过为CDR提供支架而在抗原结合中起重要作用。优选地，“抗原结合区”至少包含可变轻(VL)链的第4到103位的氨基酸残基和可变重(VH)链的第5到109位的氨基酸残基，更优选VL的第3到107位氨基酸残基和VH的第4到111位氨基酸残基，特别优选的是完整的VL和VH链[当根据Kabat数据库进行氨基酸位置编号时[美国专利NO：4,816,567]，VL的第1到109位的氨基酸和VH的第1到113位的氨基酸]。用于本发明的一类优选的免疫球蛋白是IgG。

术语“高变”区是指负责抗原结合的抗体或功能性片段的可变结构域VH和VL的氨基酸残基。如[Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989)]中所述的，高变区包含来自“互补决定区”或CDR的氨基酸残基[即，轻链可变结构域中的残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和88-97(LCDR3)以及重链可变结构域中的29-36(HCDR1)、48-66(HCDR2)和93-102(HCDR3)]和/或来自高变环的那些氨基酸残基[即，轻链可变结构域中的残基26-32(在LCDR1内)、50-52(在LCDR2内)和91-96(在LCDR3内)以及重链可变结构域中的26-32(在HCDR1内)、53-55(在HCDR2内)和96-101(在HCDR3内)]。

抗体片段的非限制性实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、结构域抗体(dAb)、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体(minibody)、直链抗体[Johnson G,Wu TT.(2000)Kabat database and itsapplications:30years after the first variability plot.Nucleic Acids Res.28:214-218]；螯合重组抗体、三体(tribody)或双体(bibody)、胞内抗体(intrabody)、纳米抗体、小分子免疫药物(small modular immimopharmaceutical)(SMIP)、抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、驼源化(camelized)抗体、含VHH的抗体、或其突变蛋白质或衍生物、和包含至少一部分免疫球蛋白的多肽(所述部分足以赋予多肽特异性的抗原结合，例如CDR序列)，只要所述抗体保留所需的生物活性；和由抗体片段形成的多特异性抗体[Chothia C,Lesk AM.(1987)Canonical structures for the hypervariable regions ofimmunoglobulins.J Mol Biol.196:901-917；Zapata G,Ridgway JB,Mordenti J,OsakaG,Wong WL,Bennett GL,Carter P.(1995)Engineering linear F(ab')2fragments forefficient production in Escherichia coli and enhanced antiproliferativeactivity.Protein Eng.8:1057-1062]。应理解非“双特异性”或“双功能性”抗体的抗体的每个结合位点都是相同的。可将所述F(ab')₂或Fab进行改造以最小化或完全除去发生在C_H1和C_L结构域之间的分子间二硫化物相互作用。抗体的木瓜蛋白酶消化产生2个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，各自具有单个抗原结合位点)，和剩余的“Fc”片段(其名称反映了其容易结晶的能力)。胃蛋白酶处理得到具有2个“Fv”片段的F(ab')²片段。“Fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这个区域由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在构型中每个可变结构域的3个CDR相互作用，以在VH-VL二聚体的表面上确定抗原结合位点。共同地，6个CDR赋予抗体抗原结合特异性。但是，甚至单个可变结构域(或仅包含对抗原特异的3个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力。

“单链F_V”或“sFv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。

优选地，Fv多肽还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得Fv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于sFv的综述，参见[C.A.K Borrebaeck,editor(1995)AntibodyEngineering(Breakthroughs in Molecular Biology),Oxford University Press]。

所述Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一个恒定结构域(CH1)。Fab片段不同于Fab'片段之处在于所述重链CH1结构域的羧基末端处几个残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基具有游离巯基的Fab'的命名。F(ab')²抗体片段最初作为Fab'片段对的形式产生，该Fab'片段对在其间具有铰链半胱氨酸。

“框架”或FR残基是除了高变区残基外的那些可变结构域残基。

短语“恒定区”是指赋予效应子功能的抗体分子的部分。

术语“突变蛋白质”或“变体”可互换使用，并且是指如下的抗体的多肽序列，其在可变区或等价于可变区的部分中包含至少一个氨基酸置换、缺失或插入，只要所述突变蛋白质或变体保留所需的结合亲和力或生物活性。

突变蛋白质可与亲本抗体基本同源或基本相同。

术语“衍生物”是指通过如下技术进行共价修饰的抗体，所述技术如泛素化、与治疗剂或诊断剂缀合、标记(例如用放射性核素或各种酶)、共价聚合物连接如聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)和通过非天然氨基酸的化学合成进行的插入或置换。

“人”抗体或功能性人抗体片段在此被定义为是非嵌合的或“人源化的”，并且不来自(无论是整体还是部分)非人物种的抗体或功能性抗体片段。人抗体或功能性抗体片段可来源于人类或可是合成的人抗体。“合成的人抗体”在此定义为具有(全部或部分地)以计算机方法衍生自合成序列的序列的抗体，所述合成序列是基于已知的人抗体序列的分析。例如，可通过分析人抗体或抗体片段序列的数据库和使用由此获得的数据设计多肽序列来实现人抗体序列或其片段的计算机设计。人抗体或功能性抗体片段的另一实例是由分离自人源抗体序列的文库(即，这种文库基于取自人天然来源的抗体)的核酸所编码的抗体或功能性抗体片段。人抗体的实例包括记载于[Kontermann R.and&Duebel S.,editors(2001)Antibody Engineering(Springer Laboratory Manual),Springer Verlag；Pluckthun inThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；Carlsson R,E.(2001)n-CoDeR concept:unique types of antibodies for diagnostic use andtherapy.Expert Rev Mol Diagn.1:102-108]中的基于n-CoDeR的抗体。

“人源化抗体”或功能性人源化抗体片段在本文被定义为：其是(I)衍生自非人来源(例如，带有异源免疫系统的转基因小鼠)，该抗体基于人种系序列；或(II)CDR-移植的，其中所述可变区的CDR来自非人来源，而所述可变区的一个或多个框架是人来源的，并且恒定区(如果有的话)是人来源的。

本文使用的短语“嵌合抗体”是指含有衍生自一般源自不同物种的两个不同抗体的序列的抗体。最典型地，嵌合抗体包含人和鼠类抗体片段，通常为人恒定区和小鼠可变区。

本发明的抗体可衍生自重组抗体基因文库。用于制备重组人抗体基因库(repertoire)和用于在丝状噬菌体表面显示所编码抗体片段的技术的开发提供了用于直接制备和选择人抗体的重组方法，还可将该方法应用于人源化的、嵌合的、鼠类的或突变蛋白质抗体。通过噬菌体技术产生的抗体在细菌中作为抗原结合片段(通常是Fv或Fab片段)产生，并因此缺乏效应子功能。可通过如下两种策略中的一种引入效应子功能：可将所述片段改造为用于在哺乳动物细胞中表达的完整抗体，或将其改造为带有能够引发效应子功能的第二结合位点的双特异性抗体片段。通常，通过PCR分别克隆抗体的Fd片段(VH-CH1)和轻链(VL-CL)，并在组合噬菌体展示文库中随机重组，然后可针对与特定抗原的结合对其进行选择。所述Fab片段在噬菌体表面上表达，即，与编码它们的基因物理连接。因此，通过抗原结合来选择Fab，同时也共选择了随后可被扩增的Fab编码序列。通过若干轮的抗原结合和再扩增——称为淘选(panning)的过程，特异性针对所述抗原的Fab被富集并最终被分离。

已经描述了多种方法用于从噬菌体展示文库中获得人抗体。这种文库可建立在单个主框架上，使得各种体内形成的(即衍生自人的)CDR能够如[美国专利NO:6,989,250；美国专利NO:4,816,567]所描述的重新组合到该单个主框架中。或者，这类文库可基于已经以计算机方法设计并已由合成产生的核酸编码的氨基酸序列。例如，通过分析人序列的数据库并使用从那里获得的数据设计多肽来实现抗体序列的计算机设计。记载了用于设计和获得计算机创建的序列的方法；例如，参见[Carlsson R,E.(2001)n-CoDeRconcept:unique types of antibodies for diagnostic use and therapy.Expert RevMol Diagn.1:102-108；美国专利NO:6,989,250；Knappik A,Ge L,Honegger A,Pack P,Fischer M,Wellnhofer G,Hoess A,J,Plückthun A,B.(2000)Fullysynthetic human combinatorial antibody libraries(HuCAL)based on modularconsensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides.J Mol Biol.296:57-86]。关于噬菌体展示技术的综述，参见[Krebs B,Rauchenberger R,Reiffert S,RotheC,Tesar M,Thomassen E,Cao M,Dreier T,Fischer D,A,Inge L,Knappik A,Marget M,Pack P,Meng XQ,Schier R,P,Winter J,J,KretzschmarT.(2001)High-throughput generation and engineering of recombinant humanantibodies.J Immunol Methods.254:67-84]。

或者，本发明的抗体可来自于动物。这类抗体可以是在[Krebs B,RauchenbergerR,Reiffert S,Rothe C,Tesar M,Thomassen E,Cao M,Dreier T,Fischer D,A,Inge L,Knappik A,Marget M,Pack P,Meng XQ,Schier R,P,Winter J,J,Kretzschmar T.(2001)High-throughput generation and engineering ofrecombinant human antibodies.J Immunol Methods.254:67-84]中所总结的人源化的或人改造的。这类抗体可以来自转基因动物[参见Krebs B,Rauchenberger R,Reiffert S,Rothe C,Tesar M,Thomassen E,Cao M,Dreier T,Fischer D,A,Inge L,KnappikA,Marget M,Pack P,Meng XQ,Schier R,P,Winter J,J,Kretzschmar T.(2001)High-throughput generation and engineering of recombinanthuman antibodies.J Immunol Methods.254:67-84]。

本文使用的不同“形式”的抗原(例如，凝血因子XI和/或凝血因子XIa)在此被定义为不同的蛋白质分子，其产生自不同的翻译修饰和翻译后修饰——例如，但不限于，初级FXI转录物的剪接的差异，糖基化的差异，和翻译后蛋白水解切割的差异。

本文使用的术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸侧链或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。如果在竞争性结合测定中通过本领域技术人员公知的任意方法显示了一个抗体与另一抗体竞争，并且如果优选地，所述表位的所有氨基酸都被这两个抗体结合，则认为这两个抗体“结合相同表位”。

术语“成熟抗体”或“成熟抗原结合片段”(如成熟的Fab变体)包括抗体或抗体片段的衍生物，其表现出对给定的抗原如FXI具有更强的和/或增高的结合——即，具有增强的亲和力的结合。成熟是在抗体或抗体片段的6个CDR内鉴定少量突变的过程，导致增强了所述亲和力。所述成熟过程是用于将突变引入到所述抗体中并筛选以鉴定改进的结合物(binder)的分子生物学方法的组合。

药物组合物和给药

本发明还涉及可包含单独的或与至少一种其他试剂(如稳定化合物)组合的FXI/FXIa抗体的药物组合物，其可以在任何无菌的、生物相容性药物载体(包括，但不限于，盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水)中给药。可将任何这些分子单独给药患者，或与其他试剂、药物或激素组合给药患者，在其中所述分子与赋形剂或可药用载体混合的药物组合物中。在本发明的一个实施方案中，所述可药用载体在药学上是惰性的。

本发明还涉及药物组合物的给药。这种给药可经肠胃外完成。肠胃外递送的方法包括局部、动脉内(直接到肿瘤)、肌肉内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内或鼻内给药。除了活性成分之外，这些药物组合物还可含有合适的可药用载体，所述可药用载体包含促进将所述活性化合物加工成可在药学上使用的制剂的赋形剂和助剂。用于配制和给药的技术的其他细节可见于最新版本的Remington's Pharmaceutical Sciences(Ed.Maack出版公司，Easton,Pa.)。

用于肠胃外给药的药物制剂包括活性化合物的水溶液。对于注射，本发明的药物组合物可在水溶液中配制，优选在生理上相容的缓冲液如Hank's溶液、Ringer's溶液或生理缓冲盐水中。水性注射悬液可包含提高所述悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。另外，可将所述活性化合物的悬液制备成适合的油性注射悬液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油、或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯、或脂质体。任选地，所述悬液还可包含增加了化合物溶解度以使得能够制备高度浓缩溶液的合适稳定剂或试剂。

对于局部或经鼻给药，在所述制剂中使用了适合于待渗透的特定屏障的渗透剂。这种渗透剂通常是本领域已知的。

所述肠胃外给药还包含肠胃外递送的方法，所述肠胃外递送还包括动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、以及心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道或鼻内给药。

试剂盒

本发明还涉及药物包装和含一个或多个容器的试剂盒，所述容器装有上文提到的本发明组合物的一种或多种成分。与这些容器相关的可能是以管理药品或生物产品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的通告，反映了该机构批准生产、使用或销售用于人类给药的所述产品。

在另一个实施方案中，所述试剂盒可包含编码本发明抗体的DNA序列。优选地，在适合用于转染到宿主细胞中并通过其表达的质粒中提供了编码这些抗体的DNA序列。所述质粒可包含启动子(通常是诱导型启动子)以调节该DNA在宿主细胞中的表达。所述质粒还可包含适当的限制性位点以便于将其他DNA序列插入到所述质粒中以产生各种抗体。所述质粒还可包含许多其他元件以便于克隆和表达所编码的蛋白。这类元件是本领域技术人员所公知的，并包括例如选择性标记、起始密码子、终止密码子等。

生产和储藏

可以本领域已知的方式生产本发明的药物组合物，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制锭、研磨、乳化、包封、包埋或冻干方法。

所述药物组合物可在pH4.5至5.5下的1mM-50mM组氨酸、0.1％-2％蔗糖、2％-7％甘露醇中的冻干的粉末的形式提供，该粉末在使用前与缓冲液混合。

在制备了包含配制于可接受的载体中的本发明化合物的药物组合物后，可将它们置于合适的容器中并贴上用于治疗指定疾病的标签。对于抗凝血因子XI和/或抗凝血因子XIa抗体的给药，这种标签将包括给药的量、频率和方法。

IC50/EC50

根据FDA，IC50代表用于50％抑制给定的生物过程所需的化合物的浓度。本发明的抗体显示出IC50值为100μM、优选1μM、更优选0.1μM、更优选0.01μM、更优选0.001μM、更优选0.0001μM。

治疗有效剂量

适合用于本发明的药物组合物包括其中包含有效量的活性成分以达到预期的目的的组合物，即，治疗由凝血因子XI和/或凝血因子XIa所表征的特定的疾病状态。有效剂量的确定在本领域技术人员的能力范围内。

治疗有效剂量是指缓解症状或病症的蛋白质或其抗体、拮抗剂或抑制剂的量。可通过标准药学方法在细胞培养物或实验动物中确定这类化合物的治疗效果和毒性，例如，ED₅₀(在群体的50％中治疗有效的剂量)和LD₅₀(使群体的50％致死的剂量)。治疗作用和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，其可表示为比值ED₅₀/LD₅₀。优选表现出较大治疗指数的药物组合物。在配制一系列用于人使用的剂量时使用了从细胞培养物测定和动物研究中获得的数据。这类化合物的剂量优选处于循环浓度的范围内，该循环浓度包含具有很少或无毒性的ED50。所述剂量可在该范围内变化，这取决于所使用的剂型、患者的敏感性和给药途径。

由个体医师根据待治疗的患者选择确切剂量。调整剂量和给药以提供足够水平的活性部分或维持所需效果。可考虑的其他因素包括疾病状态的严重性、患者的年龄、体重和性别；饮食、给药的时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受/反应。根据具体制剂的半衰期和清除速率，可每3到4天、每周、或每两周一次或一个月内一次给药长效药物组合物。

根据给药途径，正常剂量可以在0.1到100,000微克、最高达约2g的总剂量内变化。在文献中提供了关于具体递送剂量和方法的指导[参见美国专利NO：6,300,064]。本领域技术人员会使用用于多核苷酸的而不是用于蛋白质或其抑制剂的不同的制剂。类似地，多核苷酸或多肽的递送将是特定细胞、病症、位置等特异性的。优选的放射性标记抗体的比活力可以是0.1到10mCi/mg的蛋白质[WO08/022295，US 4,657,760；US 5,206,344；US 5,225,212；Riva P,Franceschi G,Frattarelli M,Lazzari S,Riva N,Giuliani G,Casi M,Sarti G,Guiducci G,Giorgetti G,Gentile R,Santimaria M,Jermann E,Maeke HR.(1999)Loco-regional radioimmunotherapy of high-grade malignant gliomas usingspecific monoclonal antibodies labeled with 90Y:a phase I study.Clin CancerRes.5(10Suppl):3275s-3280s]。

通过以下实施例对本发明进行了进一步描述。提供了所述实施例仅为了参照具体的实施方案说明本发明。这些例证，虽然说明了本发明的某些特定方面，但没有进行限制或没有限制所公开的发明的范围。

使用常规技术进行所有的实施例，这些技术对本领域技术人员来说是公知的且是常规的，除非另有详细说明。以下实施例的常规分子生物学技术可以如标准实验手册如[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:A laboratorymanual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA]所述进行。

在缓冲液中测量凝血因子XI和/或凝血因子XIa抑制作用。

为了测定以上所列出的物质的因子Xa抑制作用，构建了生物测试系统，其中将因子XIa底物的转化用于测定人凝血因子XIa的酶活性。在微量滴定板中进行所述测定。

测定抗凝血活性

在人血浆和/或兔血浆和/或大鼠血浆中体外测定了所述测试物质的抗凝血活性。为此，使用0.11摩尔的柠檬酸钠溶液作为接收器以1/9的柠檬酸钠/血液的混合比例将血液抽出。血液抽出后立即将其充分混合并以约4000g离心15分钟。将上清液吸出。

使用商业测试试剂盒(购自Roche(之前的BoehringerMannheim)的或购自InstrumentationLaboratory的RecombiPlastin)在不同浓度的测试物质或相应溶剂的存在下测定了凝血酶原时间(PT，同义词：凝血活酶时间，快速测试)。将所述测试化合物用血浆在37℃下孵育3分钟。然后通过加入促凝血酶原激酶启动凝血，并且测定发生凝血时的时间。测定了使得所述凝血酶原时间加倍的测试物质的浓度。

使用商业测试试剂盒(购自Roche的凝血酶试剂)在不同浓度的测试物质或相应溶剂的存在下测定了凝血酶时间(TT)。将所述测试化合物用血浆在37℃下孵育3分钟。然后通过加入凝血酶试剂启动凝血，并且测定发生凝血时的时间。测定了使得所述凝血酶时间加倍的测试物质的浓度。

使用商业测试试剂盒(购自Roche的PTT试剂)在不同浓度的测试物质或相应溶剂的存在下测定了活化部分凝血活酶时间(aPTT)。将所述测试化合物用血浆和所述PTT试剂在37℃下孵育3分钟。然后通过加入25mM氯化钙启动凝血，并且测定发生凝血时的时间。测定了使得所述aPTT加倍的测试物质的浓度。

本发明的抗体的浓度为如下时导致所述aPTT加倍：在浓度为100μM时，优选在浓度为1μM时，更优选在浓度为0.1μM时、更优选在浓度为0.01μM时、更优选在浓度为0.001μM时、更优选在浓度为0.0001μM时、更优选在浓度为0.00001μM时。

治疗用途

可将本发明的抗凝血因子XI的抗体和/或抗凝血因子XIa的抗体给予任何受试者，在所述受试者中对所述凝血级联的抑制和对血小板聚集的抑制和对血栓形成的抑制将是有益的。

因此，本发明的抗凝血因子XI的抗体和/或抗凝血因子XIa的抗体适合用于在在人类以及动物中治疗和/或预防凝血相关的疾病。

术语“血栓栓塞性疾病”包括疾病如在ECG上有或没有ST升高(STEMI和非STEMI)的心肌梗死(MI)或急性心肌梗死(AMI)、稳定型心绞痛以及不稳定型心绞痛、冠状动脉介入(如血管成形术或冠状动脉旁路移植术(CABG))后的再闭塞和再狭窄、外周动脉闭塞性疾病(PAOD)、肺栓塞(PE)、深静脉血栓形成(DVT)以及肾静脉血栓形成、短暂性脑缺血发作(TIA)、血栓形成性中风和血栓栓塞性中风。

这些抗体还适合用于治疗和预防心源性血栓栓塞如脑缺血、卒中发作以及全身性血栓栓塞，用于治疗具有不规则心跳或心脏节律异常的患者，例如用于具有心房纤颤的患者，用于具有瓣膜性心脏病或人造心脏瓣膜的患者。另外，这些抗体可有助于治疗患有弥散性血管内凝血(DIC)的患者。

可能由血管壁的动脉粥样硬化病变(特别是内皮功能障碍)引起血栓栓塞并发症，这可能导致急性血栓形成性阻塞。动脉粥样硬化是依赖于大量的心血管危险因素的多因素病。临床研究已经显示，使用抗凝血剂进行预防明确不影响动脉血管疾病的进程。因此，结合抗血栓形成治疗的对所述危险因素的靶向治疗是有利的。冠心病、外周和脑血管疾病的危险因素是，例如：血清胆固醇水平升高、动脉高血压、吸烟和糖尿病。预防性药物的原理是基于消除这些危险因素。除了生活方式的改变，还包括药理学措施，例如，抗高血压治疗、降脂药物或预防血栓形成。另外，与冠状动脉治疗剂的组合适合用于治疗先前存在的冠心病。

血栓栓塞并发症涉及微血管病性溶血性贫血(MAHA)、体外血循环如血液透析和主动脉瓣膜置换。

另外，本发明的抗体可用于治疗或预防炎症性疾病如类风湿性关节炎(RA)，或如神经疾病如阿尔茨海默氏疾病(AD)。另外，这些抗体可以用于治疗癌症和转移、血栓性微血管病(TMA)、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性肾病以及其它微血管疾病。

本发明的抗体还可用于治疗肿瘤患者手术后或肿瘤患者进行化疗和/或放疗后的血栓栓塞并发症。

本发明的抗体还可用于治疗和/或预防透析患者，特别是在血液透析中分流血栓形成的Cimino-瘘管预防。可使用由人造表面组成的天然动静脉瘘、合成回路移植物、大口径中心静脉导管或其他设备进行血液透析。在透析过程中和之后不久，给予本发明的抗体将防止在瘘管中形成凝血块(以及防止在肺动脉中增加(propagate)栓塞性凝血块)。

本发明的抗体还可用于治疗和/或预防在心肺旁路手术(例如，ECMO：体外膜式人工氧合)后发生心脏内和肺内血栓形成的患者。

在全身性抗凝作用、装置的机械稳定性和持续时间的需求之外，心室辅助装置的主要限制是高发生率的血栓栓塞事件。因此，本发明的抗体还可用于治疗和/或预防具有左心室辅助装置的患者。

在透析患者中高度需要抗凝作用，而不会增加不需要的出血事件的风险，并且在该群体中静脉血栓栓塞(VTE)和心房纤维性颤动(例如，在血液透析患者中的晚期肾病)的发生率较高。本发明的抗体也可用于治疗和/或预防这些类型的患者。

本发明的抗体还可用于治疗和/或预防患有特发性血小板减少性紫癜(IPT)的患者。和普通人群相比，这些患者的血栓形成的风险增加。凝血因子FXI的浓度在ITP患者组中比在对照组中显著升高，并且aPTT在ITP患者中显著更长。

本发明的抗体也可用于治疗和/或预防肺高压(pulmonary hypertension)。

术语“肺高压”遵循由世界卫生组织WHO所确定的方针(肺高压的临床分类，威尼斯2003)，例如，肺动脉高压，由左心室疾病引起的肺高压，由肺疾病和/或低氧引起的肺高压，由血块、动脉收缩和其他疾病如慢性血栓栓塞性肺高压(CTEPH)引起的肺高压。

术语“肺高压”还包括疾病如特发性肺动脉高压IPAH、家族性肺动脉高压(FPAH)、相关性肺动脉高压(APAH)，其可能与胶原性疾病、先天性全身肺分流缺陷、HIV感染、或与疾病(如甲状腺疾病、糖原贮积症(GSD)、Morbus戈谢病、遗传性出血性毛细血管扩张症、血红蛋白病和/或骨髓增生性疾病)相关联的某些药物的给药相关。

本发明的抗体可用于治疗和/或预防疾病如肺静脉闭塞性疾病、肺毛细血管多发性血管瘤(PCH)以及新生儿持续性肺动脉高压。

术语“肺高压”还包括疾病如慢性阻塞性肺病(COPD)、间质性肺病(ILD)、睡眠呼吸暂停、肺泡通气过度、高空病、以及体质发育异常。

由慢性血栓栓塞性肺动脉高压(CTEPH)引起的疾病可与近端和/或远端肺动脉阻塞相关、或与非血栓形成性肺栓塞如癌症、寄生虫或污染物相关。

另外，本发明的抗体可用于治疗和/或预防由结节病、组织细胞增多病X和淋巴管瘤病引起的肺高压。

另外，本发明的抗体可用于治疗和/或预防肺纤维化和/或肝纤维化。

本发明的抗体还可用于治疗和/或预防脓毒症、全身性炎症反应综合症(SIRS)、器官功能障碍、多器官功能障碍综合症(MODS)、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤(ALI)、弥散性血管内凝血(DIC)。

术语“脓毒症”定义为存在感染或全身性炎症反应综合症(SIRS)。SIRS主要由感染诱导，但是其也可在损伤、烧伤、休克、手术、局部缺血、胰腺炎、复苏(reanimation)或肿瘤侵袭(tumor affection)之后发生。在脓毒症期间，可以激活所述凝血级联，此过程被称为弥散性血管内凝血或简称为DIC。这可导致形成微血栓并导致继发性并发症。

另外，脓毒症或SIRS可导致内皮功能障碍，导致增加了血管渗透性。在脓毒症或SIRS的过程中，可发生几种器官的组合衰竭，例如肾衰竭、肝衰竭、肺衰竭、心血管系统的衰竭。

诱导脓毒症或SIRS的致病性生物体是革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌、病毒、和/或真核病原体。

DIC和/或SIRS可能与脓毒症一起发生，但是也可能由于手术、肿瘤疾病、烧伤、或其它类型的损伤而发生。

在DIC的过程中，所述凝血级联的激活发生在损伤血管或其他类型组织的表面。这会导致形成微血栓，微血栓本身导致小血管阻塞。

在一个实施方案中，将抗凝结因子XI的抗体和/或抗凝血因子Xia的抗体与用于治疗和/或预防已述疾病的其他药物联合使用。

在下文中，合适的组合的实例被列出并因此被优选提到：

-与降脂化合物的组合，特别是3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶的抑制剂，如洛伐他汀(Mevacor；US 4,231,938)、辛伐他汀(Zocor；US 4,444,784)、普伐他汀(Pravachol；US 4,346,227)、氟伐他汀(Lescol；US 5,354,772)和阿托伐他汀(Lipitor；US5,273,995)。

-与适合用于治疗冠状动脉疾病的化合物和/或表现出血管舒张活性的化合物的组合，特别是血管紧张素转换酶抑制剂如卡托普利、赖诺普利、依那普利、雷米普利、西拉普利、贝那普利、福辛普利、喹那普利和培哚普利，或血管紧张素II受体拮抗剂如恩布沙坦(US5,863,930)、氯沙坦、缬沙坦、伊贝沙坦、坎地沙坦、依普沙坦和替米沙坦，或β-肾上腺素受体拮抗剂如卡维地洛、阿普洛尔、比索洛尔、醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、卡提罗尔、美托洛尔、纳多洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔和噻吗洛尔；或与α1肾上腺素受体拮抗剂如哌唑嗪、布那唑嗪，多沙唑嗪和特拉唑嗪的组合。

-与利尿剂氢氯噻嗪、呋塞米、布美他尼、吡咯他尼、托拉塞米、阿米洛利和双肼酞嗪的组合。

-与钙通道的抑制剂如维拉帕米和地尔硫、二氢吡啶衍生物如硝苯地平(Adalat)、尼群地平(Bayotensin)，5-单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯和硝酸甘油的组合。

-与导致环鸟苷酸(cGMP)浓度增加的化合物如可溶性鸟苷酸环化酶的刺激剂(WO98/16223,WO 98/16507,WO 98/23619,WO 00/06567,WO 00/06568,WO 00/06569,WO 00/21954,WO 00/66582,WO 01/17998,WO 01/19776,WO 01/19355,WO 01/19780,WO 01/19778,WO 07/045366,WO 07/045367,WO 07/045369,WO 07/045370,WO 07/045433)的组合。

-与所述凝血级联的其他抑制剂如纤溶酶原激活剂(溶栓剂/纤溶剂)以及增加血栓形成和/或纤维蛋白溶解的化合物、或纤溶酶原激活剂的抑制剂或凝血酶激活的纤溶酶抑制剂(TAFI-抑制剂)如组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、链激酶、瑞替普酶和尿激酶的组合。

-与抗凝血剂如未分级肝素、低分子量肝素、类肝素、水蛭素、比伐卢定和/或阿加曲班的组合。

其他联合治疗是将抗凝血因子XI的抗体和/或抗凝血因子XIa的抗体与抗生素治疗剂、抗真菌治疗剂和抗病毒治疗剂共给药。

另外，将抗凝血因子XI的抗体和/或抗凝血因子XIa的抗体与如下进行组合：

-血管加压剂如去甲肾上腺素、多巴胺、和加压素

-肌收缩治疗剂，如多巴酚丁胺

-皮质类固醇，如氢化可的松或氟氢可的松

-重组表达的活化蛋白C

-血液产品，如新鲜冰冻血浆、红血球浓缩物和/或血小板浓缩物。

本发明的另一个实施方案是将抗凝血因子XI的抗体和/或抗凝血因子XIa的抗体作为包含凝血因子XI和/或凝血因子XIa的血液探针、血液防腐剂、其他血浆产品或生物样品的抗凝血剂使用。以这样的一种方式表征这些样品：加入有效浓度的抗体以避免体外凝血。

还可将本发明的抗凝因子XI的抗体和/或抗凝血因子XIa的抗体用于抑制离体凝血，如制备血液导管或其他药用添加剂或装置，用于包被体内以及离体使用的包含凝血因子XI和/或凝血因子XIa的药用添加剂、装置或其他生物样品。

实施例1：鉴定抗体

用于噬菌体选择的工具：

从表1所列出的不同来源中获得了用于分离本发明的人抗体的蛋白质。根据制造商的说明，使用约2倍摩尔过量的生物素-LC-NHS(Pierce；目录号：21347)将蛋白质生物素化并使用Zeba脱盐柱(Pierce；目录号：89889)进行脱盐。

表1：用于噬菌体选择和筛选的蛋白质的列表：

噬菌体选择：

使用DYAX人Fab抗体文库FAB-310(其是结合了天然和合成多样性的Fab文库)通过噬菌体展示技术(DYAX Corp.，Cambridge，MA；记载于Hoet et al.,Nat.Biotech.2005,23:344-8)进行本发明的人抗体或其抗原结合片段的分离。表2至6总结了用于选择覆盖多个表位的抗体的不同策略。

表2：选择策略I：在每轮选择前，包括耗尽(depletion)生物素化的激肽释放酶/前激肽释放酶(500nM)的步骤。

表3:选择策略II：如策略I所述，在每轮选择前，包括耗尽生物素化的激肽释放酶/前激肽释放酶(500nM)的步骤。另外，在存在复合物hFXIa(500nM)/抑肽酶(25μM)的情况下进行了选择。

表4：选择策略III：在每轮选择前，包括耗尽生物素化的激肽释放酶/前激肽释放酶(500nM)的步骤。

表5：选择策略IV：如策略III所述，在每轮选择前，包括耗尽生物素化的激肽释放酶/前激肽释放酶(500nM)的步骤。另外，在存在复合物hFXIa(500nM)/抑肽酶(25μM)的情况下进行了选择。

表6：选择策略V：在每轮选择前，包括耗尽生物素化的激肽释放酶/前激肽释放酶(500nM)和生物素化的hFXI(500nM)的步骤。

筛选的轮数：	策略V
		1	500nM生物素化的hFXIa
2	200nM生物素化的rbFXIa
		3	200nM生物素化的hFXIa
4	100nM生物素化的rbFXIa

在该实施例中使用的标准缓冲液是：

1x PBS：来自Sigma(D5652-50l)

PBST：补充有0.05％吐温20的1x PBS(Sigma，P7949)

封闭缓冲液：补充有3％BSA的PBST(Sigma A4503)

沉淀缓冲液：溶于2.5M NaCl中的20％PEG6000(Calbiochem,528877)

细胞淘选-缓冲液：补充有3％FBS(GIBCO，10082)和0.01％NaN₃(Sigma，71289)的PBS

用于文库选择的一般方法已经记载于Hoet et.al.(Hoet RM,Cohen EH,Kent RB,Rookey K,Schoonbroodt S,Hogan S,Rem L,Frans N,Daukandt M,Pieters H,vanHegelsom R,Neer NC,Nastri HG,Rondon IJ,Leeds JA,Hufton SE,Huang L,Kashin I,Devlin M,Kuang G,Steukers M,Viswanathan M,Nixon AE,Sexton DJ,Hoogenboom HR,Ladner RC.(2005)Generation of high-affinity human antibodies by combiningdonor-derived and synthetic complementarity-determining-region diversity.NatBiotechnol.23:344-348)。简言之，通过以下方式沉淀所述Fab抗体文库：通过加入1/5体积的沉淀缓冲液，随后于冰上孵育1小时和离心步骤(以5500rpm，1小时)。随后将所得沉淀文库重悬于1ml封闭缓冲液中并在室温下孵育30分钟。

同时，通过用PBST洗涤3次制备了链霉亲和素包被的Dynabeads M280(Invitrogen，11206D)的等份试样。然后将一些等份试样与生物素化的激肽释放酶/前激肽释放酶(500nM)或生物素化的hFXI(500nM)混合，同时将剩余的与生物素化的靶蛋白混合(如表2至6所示)。将所得混合物在4℃下在端到端旋转器上孵育ON，随和在1ml PBST中洗涤5次。最后通过重悬于1ml封闭缓冲液中封闭包被的小珠，等份分装在5个试管中，然后收集小珠并除去上清液。

按照所指示的通过以下方式进行了5个连续的耗尽步骤：将封闭的文库(如上所述)加入到以生物素化的激肽释放酶/前激肽释放酶(500nM)或生物素化的hFXI(500nM)包被的经封闭Dynabeads中，并在室温下旋转孵育10分钟。在磁架上收集小珠后，通过离心澄清上清液并与以靶蛋白包被的经封闭Dynabeads混合。在端到端旋转器上孵育30分钟后，将所得样品用封闭缓冲液洗涤3次，然后用PBST洗涤9次。根据表2至6所述的策略，然后使用一半含富集噬菌体的重悬小珠感染以指数生长的大肠杆菌TG1(来自Stratagene)用于制备在下一轮选择中使用的新的噬菌体储液。更详细地说，用500μl的dynabeads/噬菌体悬液在37℃下感染6ml的TG1培养物30分钟，并且没有振荡。然后，取出等份试样用于输出滴定(output tirtration)。将剩余培养物以5000rpm离心15分钟，将所得沉淀重悬浮于2ml 2×YT中，并将其铺板到琼脂平板(2×YT、100μg/ml氨苄青霉素、2％葡萄糖)上。在37℃下过夜孵育后，将细胞刮下到5ml 2×YT中并用于接种OD600为0.05的20ml 2×YT的新鲜培养物(100μg/ml Amp)并用于制备甘油储液。将所得新鲜液体培养物在37℃下振荡约2小时直到OD600达到0.5-0.8，然后将5ml培养物与感染复数(MOI)为约20的M13辅助噬菌体M123K075(Invitogen 420311)混合。在37℃下缓慢振荡30分钟后，加入预热的2×YT(100μg/ml氨苄青霉素、20μg/ml卡那霉素、见原稿(f.c.))，并将所述培养物在30℃振荡ON。第二天早上，通过以6000rpm离心收集上清液并通过以Steriflip(0.22μm；Milipore SCGP00525)过滤使其澄清。随后，如上所述沉淀噬菌体，并悬浮于1ml封闭缓冲液(或细胞淘洗缓冲液)中用于下一轮选择。使用等份试样用于测定输入滴度。

酶联免疫吸附测定(ELISA)：

噬菌体ELISA：

通过在生物素化的靶蛋白上进行的ELISA分析不同轮选选后的噬菌体混合物的特定结合物(binder)的富集。简言之，将来自甘油储液的等份试样在37℃下铺板到2×YT(100mg/ml氨苄青霉素、1％葡萄糖)上ON。挑选单个克隆到含100μl培养基(2×YT、100μg/ml氨苄青霉素、1％葡萄糖)的MTP孔中，并在37℃下振荡过夜。通过以下方式进行噬菌体表达：通过将10μl过夜培养物加入到含辅助噬菌体M123K07(Invitogen 420311)的190μl新鲜培养基(补充有100μg/ml氨苄青霉素的2×YT)中，并在96孔MTP中在37℃下以200rpm孵育直至OD600达到约0.5。

将用链霉亲和素(Pierce，15500)预包被的96-孔ELISA-板在4℃下用1μg/ml生物素化的靶蛋白过夜包被。第二天，将平板用PBST洗涤7次、用封闭试剂处理、并用PBST再洗涤三次。同时，将ON噬菌体培养物用100μl封闭缓冲液混合。然后每孔转入100μl封闭的噬菌体并在室温下孵育1小时。用PBST洗涤7次后，加入偶联至HRP的抗M13的抗体(GE Healthcare，27-9421-01；以1:2500的稀释度溶于PBST中)，在室温下孵育1小时并将孔再洗涤7次。通过加入100μl TMB(Invitrogen，2023)显影(develop)显色反应并于5-15分钟后通过加入100μl H₂SO₄(Merck，1120801000)中止。在板读数仪(plate reader，Tecan)中在450nM下记录比色反应。

表7：来自Fab/噬菌体ELISA中不同策略的混合物的活性化合物(hit)比例：数目分别是指人/兔/两个靶标(交叉反应性)上的％活性化合物比例。

IA

IB

IIA

IIB

IIIA

IIIB

IVA

IVB

V

第二轮

3/1/0

1/0/0

6/5/4

0/1/0

1/1/0

1/0/0

0/0/0

第三轮

77/20/18

22/18/16

80/30/31

41/28/32

35/8/3

11/18/9

35/3/0

10/13/10

13/23/9

第四轮

n.a.

74/72/63

n.a.

80/84/67

n.a.

42/72/34

n.a.

86/90/73

65/70/53

通过GenIII-去除再克隆sFab以用于sFab筛选

为了生成可溶性Fab片断(sFab)，从第2、3和4轮选择中分离噬茵粒DNA，并依照供应商说明书用限制性内切酶MluI(New England Biloabs，R0198L)进行消化。为了除去含基因III的片段，从凝胶提取出所述载体，并使用NdeI(New England Biloabs，R0111S)进行切割(kill-cut)。EtOH-沉淀后，将所得的片段重新连接，并使用标准方法将构建体转化至化学感受态大肠杆茵Top10中。

实施例2：抗凝血因子XI的抗体和/或抗凝血因子XIa的抗体

本发明的抗体、抗原结合抗体片段以及所述抗体和片段的变体包含轻链可变区和重链可变区。本发明中考虑到的抗体或抗原结合抗体片段的变体为这样的分子：即其中保留了所述抗体或抗原结合抗体片段对所述凝血因子XI和/或凝血因子XIa的结合活性的分子。

本发明提供了抗体或抗原结合片段

-由此，所述可变重链区和轻链区的氨基酸序列与可变轻链结构域的DNA序列SEQID NO：1和氨基酸序列SEQ ID NO：19，以及与可变重链结构域的DNA序列SEQ ID NO：2和氨基酸序列SEQ ID NO：20有至少60％、更优选70％、更优选80％、或90％、或甚至更优选95％相同，或

-由此，对于这些抗体的成熟形式，所述可变重链结构域和轻链结构域的氨基酸序列与其有至少60％、更优选70％、更优选80％、或90％、或甚至更优选95％相同。

-由此，所述CDR的氨基酸序列与重链结构域的DNA序列SEQ ID NO：3、4和5和氨基酸序列SEQ ID NO：21、22、23，以及与可变轻链结构域的DNA序列SEQ ID NO：6、7、和8和氨基酸序列SEQ ID NO：24、25、和26有至少60％、更优选70％、更优选80％、更优选90％，或甚至更优选95％相同。

本发明还提供了抗体或抗原结合片段

-由此，所述可变重链区和轻链区的氨基酸序列与可变轻链的DNA序列SEQ ID NO：9和氨基酸序列SEQ ID NO：27，以及与可变重链结构域的DNA序列SEQ ID NO：2和氨基酸序列SEQ ID NO：20有至少60％、更优选70％、更优选80％、或90％、或甚至更优选95％相同，或

-由此，所述CDR的氨基酸序列与可变轻链结构域的DNA序列SEQ ID NO：10和氨基酸序列SEQ ID NO：28有至少60％、更优选70％、更优选80％、更优选90％，或甚至更优选95％相同。

本发明还提供了抗体或抗原结合片段

-由此，所述可变重链区和轻链区的氨基酸序列与可变轻链结构域的DNA序列SEQID NO：11和氨基酸序列SEQ ID NO：29，以及与可变重链结构域的DNA序列SEQ ID NO：12和氨基酸序列SEQ ID NO：30有至少60％、更优选70％、更优选80％、或90％、或甚至更优选95％相同，或

-由此，所述CDR的氨基酸序列与重链结构域的DNA序列SEQ ID NO：13、14和15和氨基酸序列SEQ ID NO：31、32和33，以及与可变轻链结构域的DNA序列SEQ ID NO：16、17、和18和氨基酸序列SEQ ID NO：34、35、和36有至少60％、更优选70％、更优选80％、更优选90％，或甚至更优选95％相同。

实施例3：使用活化部分促凝血活原激酶时间(aPTT)测定来确定所述抗凝血活性

通过使用活化部分促凝血活原激酶时间(aPTT)测定测试了抗体076D-M007-H04、076D-M007-H04-CDRL3-N110D和076D-M028-H17的抗凝血活性。

用于在人和兔血浆中加倍aPTT所需的浓度值列于表8中：

表8：用于加倍人和兔血浆的aPTT所需的抗体浓度。

	2xaPTT人[μM]	2xaPTT兔[μM]
			076D-M028-H17	0,3	0,003
M076D-M007-H04	0,9	0,178
			076D-M007-H04-CDRL3-N110D	0,3	0,063

表9：示出了本发明的抗体的实例和序列。

实施例4：FXIa抗体的抗聚集(anti-aggregatory)活性的测定

为了在流动条件下测量血小板激活，将载玻片(SUPERFROST76x26mm；Gerhard Menzel GmbH，布伦瑞克，德国)用胶原蛋白(150μg/ml)在4℃下包被过夜，随后用BSA(5mg/ml)封闭，然后组装到Zeiss Axiovert 135显微镜(Carl Zeiss，哥廷根，德国)的平台上的流动系统中。将柠檬酸盐化的全血用GPRP(终浓度为3mM)和载体或FXI抗体在37℃下孵育10分钟。加入CaCl₂(5mM)后，立即将血液以1000s^-1的初始剪切速率灌注(perfuse)在胶原蛋白包被的载玻片上，持续5分钟。如上所述全血灌注后，每隔1分钟将后室(post-chamber)全血收集到柠檬酸钠(1：10体积/体积)中。也对前室(pre-chamber)血液进行取样，并用TRAP6(10μg/ml)处理5分钟或不进行处理作为阳性对照。

将前室和后室血液样品稀释在Cell Wash(BD Biosciences，海德堡，德国)中并用抗体在4℃下孵育20分钟。通过加入冰冷的Cell Wash终止抗体反应并将所有样品静置在冰上直至进行测量。利用FITC缀合的血小板标记物(CD41a或CD61a)的阳性结果(positivity)和通过流式细胞术(FACSCalibur；BD Biosciences，海德堡，德国)得到的特征性光散射模式对10000个单个血小板进行测定。对于CD62P表达，使用以未标记的对照样品确认的PE-CD62P荧光阈值将单个血小板圈选到(gate)单独的散点图中。认为阈值以上的血小板群体是激活的并对其进行了定量。用正向散射(Forward Scatter，FSC)和FITC-荧光的任意(arbitrary)阈值定义了血小板微聚集体。

实施例5：FeCl₂在兔中诱导的血栓形成和耳出血时间

在动脉血栓形成模型中测定了076D-M007-H04、076D-M007-H04-CDRL3-N110D和076D-M028-H17的抗血栓形成活性。在静脉推注给药076D-M007-H04(0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg)、076D-M007-H04-CDRL3-N110D(0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg)或076D-M028-H17(0.075mg/kg、0.15mg/kg、0.3mg/kg)15分钟后，在兔中通过氯化铁造成颈动脉的化学损伤来诱导血栓形成。使用通过肌肉注射(i.m.injection)给予的甲苯噻嗪和氯胺酮的混合物(Rompun，Bayer 5mg/kg和Ketavet Pharmacia&Upjohn GmbH，40mg/kg体重)麻醉雄性兔(Crl：KBL(NZW)BR，Charles River)。通过在右耳的缘静脉输注所述麻醉剂混合物给予辅助麻醉剂。在暴露右侧颈总动脉后，通过以不影响血流的方式在右侧颈总动脉下将一张吸墨纸(blotting paper，10mm x 10mm)放置在(25mm x 12mm)条上来产生血管损伤。用100μl FeCl₂(氯化铁(II)四水合物，13％，溶于A.dest，Sigma)饱和所述吸墨纸。5分钟后，移去滤纸，并将血管用0.9％NaCl漂洗两次。在损伤30分钟后，除去颈动脉，将血栓取出并立即称重。每组使用5-7只动物。在FeCl₂-损伤2分钟后测定耳出血时间。将左耳去毛，用手术刀(编号10-150-10，Martin，Tuttlingen，德国)平行于耳长轴做出标准切口(3mm长)。小心避免损伤可见的血管。使用滤纸以30秒间隔将切口部位吸干(blot)，小心避免与创伤接触。通过测量从切开切口到血液不再染色滤纸的时间来测定出血时间。

实施例6：测定在兔中FeCl₂诱导的血栓形成和耳出血时间

如图14所示，076D-M007-H04剂量依赖性地降低血栓重量，并不会延长耳出血时间。图15证明了076D-M007-H04-CDRL3-N110D具有抗血栓形成作用，而不会增加耳出血时间。在图16中示出了076D-M028-H17具有抗血栓形成作用并且不延长出血时间。

实施例7：Fab 076D-M007-H04：FXIa复合物的复合物形成、结晶和X-射线结构测定。

复合物形成和结晶。

FXIa C500S(氨基酸388-625)购自Proteros Biostructures。使用FXIa C500S以1：1的比例混合所纯化的Fab 076D-M007-H04。为了使得能够进行复合物形成，将溶液在冰上放置18小时。将所得复合物溶液上样到Superdex 200HR 16/60柱上，并进一步浓缩至在pH7.5的20mM Tris/HCl和75mM NaCl中的终浓度20mg/ml。使用沉滴法(sitting-dropmethod)使包含Fab 076D-M007-H04和FXIa C500S的蛋白质复合物的晶体在20℃下生长，并通过混合等体积的蛋白质复合物溶液和作为沉淀剂的池液(well soluton)(100mM TRISpH 8.25、0.05％PEG20000和2.4M NH₄SO₄)来进行结晶。约5天后出现簇状晶体(rosettelike crystal)。

数据收集和处理

将晶体在液氮中速冻，而不使用冷冻缓冲液。在MAR CCD检测器上在光束线BL14.1、BESSY同步加速器(Berlin)上收集晶体数据。使用XDS(Kabsch,W.(2010)ActaCryst.D66,125-132)将数据进行索引和整合，准备用于使用POINTLESS进行统一(scale)，并用SCALA进行统一(P.R.Evans,(2005)Acta Cryst.D62,72-82)。晶体衍射至最高达并且在不对称单元中具有晶胞常数为a＝61.9、b＝70.7、c＝185.9的正交空间群P2(1)22(1)以及一个Fab 076D-M007-H04：FXIa C500S复合物。

结构测定和精修

在不同的步骤中通过分子置换解析FXIa和单克隆抗体Fab076D-M007-H04的复合物结构。首先以pdb编号3GJE作为搜索模型，使用BALBES(F.Long,A.Vagin,P.Young和G.N.Murshudov(2008)Acta Cryst.D64,125-132)定位H-链。然后以内部的FXIa晶体结构作为搜索模型，使用程序MolRep加入FXIa C500S。使用REFMAC5.5(G.N.Murshudov et al.(1997)Acta Cryst.D53,240-255)进行初始精修，得到R1＝39.4％和Rfree＝44.1％。最后使用pdb登录号3IDX的L-链作为搜索模型以及初始精修的H-链和FXIa C500S溶液(solution)的固定坐标来定位H-链。使用COOT(P.Emsley et al.(2010)Acta Cryst.D66:486-501)进行迭代循环建模并使用REFMAC5.5进行最大似然精修，完成所述模型。数据集和精修统计总结在表10中。

表10：Fab 076D-M007-H04：FXIa复合物的数据集和精修统计。

实施例8：基于X-射线结构的表位定位

Fab 076D-M007-H04和FXIa C500S的复合物(图17)以每个不对称单元中一个复合物拷贝的形式结晶。测定了与FXIa C500S接触(表位)的Fab 076D-M007-H04(互补位)的残基并列于表Xa和Xb中。使用CCP4程序AREAIMOL(P.J.Briggs(2000)CCP4Newsletter No.38)以及分别用结合和未结合Fab 076D-M007-H04(表11a)和FXIa C500S(表11b)计算时显示出总面积差异的残基来分析包埋的表面。

表11a：与Fab 076D-M007-H04接触的FXIa的残基

表位：

残基Nr	面积差异
		HIS A 406	-8.30
PRO A 410	-55.30
		THR A 411	-60.10
GLN A 412	-2.10
		ARG A 413	-35.60
HIS A 414	-4.00
		ASN A 450	-12.40
GLN A 451	-26.90
		SER A 452	-48.20
ILE A 454	-1.50
		LYS A 455	-32.40
ARG A 522	-29.90
		LYS A 523	-53.00
LEU A 524	-105.20
		ARG A 525	-171.10
ASP A 526	-6.20
		LYS A 527	-120.10
ILE A 528	-28.60
		GLN A 529	-41.30
ASN A 530	-58.50
		THR A 531	-6.30

表11b：与FXIa接触的Fab 076D-M007-H04的残基

互补位：

残基Nr	面积差异
		SER L 32	-4.50
ASN L 33	-15.90
		TYR L 34	-87.20
TYR L 51	-21.80
		ASP L 52	-18.30
ASN L 55	-38.10
		THR L 58	-33.50
ALA L 93	-12.50
		ASN L 94	-36.80
SER L 95	-11.80
		PHE L 96	-41.30
VAL L 98	-0.30

THR H 28	-27.80
		GLN H 31	-60.20
TYR H 32	-19.00
		GLY H 33	-15.00
ASP H 35	-3.90
		GLY H 50	-5.60
ILE H 51	-7.20
		GLY H 52	-10.20
PRO H 53	-13.30
		SER H 57	-3.00
VAL H 59	-0.70
		GLY H 99	-8.80
GLY H 100	-5.50
		PRO H 101	-3.10
TYR H 102	-149.50
		TYR H 103	-103.50
TYR H 104	-10.20
		TYR H 105	-52.10

总之，FXIa C500S表位是由以下残基形成：

HIS A 406、PRO A 410、THR A 411、GLN A 412、ARG A 413、HIS A 414、ASN A450、GLN A 451、SER A 452、ILE A 454、LYS A 455、ARG A 522、LYS A 523、LEU A 524、ARGA 525、ASP A 526、LYS A 527、ILE A 528、GLN A 529、ASN A 530、THR A 531。

Fab 076D-M007-H04用作变构竞争性抑制剂。其不直接阻断FXIa的活性位点，但结合到其邻近区域。这种邻近结合引起FXIa的部分活性位点的重新排列，阻碍了天然底物结合到活化的FXIa上(图18)。

相比之下，Fab 076D-M007-H04不结合酶原FXI。在报道的酶原FXI的X-射线结构(pdb登录号2F83)中，构成Fab 076D-M007-H04的活性位点和表位的多个环未被正确排序。尤其是表位区域在Fab076D-M007-HO4：FXIa C500S复合物中是结构良好的(wellstructured)。

实施例9：基于氢/氘交换质谱法的表位定位。

已通过合同研究组织ExSAR[ExSAR Corporation；11Deer Park Drive,Suite103；Monmouth Junction,NJ 08852；USA]对表位定位进行了不同的分析。在该情况下，已经通过差异氢/氘交换质谱法[综述参见Percy AJ,Rey M,Burns KM,Schriemer DC.(2012)Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and massspectrometry-a review.Anal Chim Acta.721:7-21]对FXIa C500S(氨基酸388–625；购自Proteros Biostructures)分别与所纯化的076D-M007-H04的Fab和076D-M049-O15的Fab的相互作用进行了分析。因此，10％以上的氘化水平的差异指示由相应抗原的Fab进行的很强的保护。5％和10％之间的数值指示很弱的结合，低于5％的氘化水平的差异指示根本没有保护。

表12a和表12b分别总结了与FIXa接触的Fab 076D-M007-H04和Fab 076D-M049-O15的残基。

表12a：与FIXa接触的Fab 076D-M007-H04的残基

残基Nr	平均氘化水平差异(％)
		THR 408	5-10
SER 409	5-10
		PRO 410	5-10
THR 411	5-10
		GLN 412	5-10
ARG 413	5-10
		HIS 414	5-10
LEU 415	5-10
		CYS 416	5-10
GLY 417	5-10
		GLY 418	5-10
SER 419	5-10
		ILE 420	5-10
ILE 421	5-10
		GLY 422	5-10
ASN 423	5-10
		GLN 424	5-10
VAL 444	＞10
		TYR 445	＞10
SER 446	＞10
		GLY 447	＞10
ILE 448	＞10
		LEU 449	＞10
ASN 450	＞10
		GLN 451	＞10
SER 452	＞10
		ILE 454	＞10
LYS 455	＞10
		THR 517	＞10
GLY 518	＞10
		TRP 519	＞10
LYS 523	34
		LEU 524	34
ARG 525	34
		ASP 526	34
LYS 527	34
		ILE 528	34
GLN 529	34
		ASN 530	34
THR 531	34
		LEU 532	34
GLN 533	34

表12b：与FIXa接触的Fab 076D-M049-O15的残基

这些数据清楚地表明，覆盖FXIa内的200个氨基酸的表位(FXIa C500S的氨基酸408～609)导致抑制了FXIa蛋白水解活性。

实施例10：通过本发明抗体对FXIa的功能性中和

通过测量对特异性的、荧光标记的底物(I-1575，Bachem，最终浓度为25μM)的裂解来测定人FXIa(Haematologic Technologies，Inc.，目录号为HCXIA-160)活性，并使用SpectraFluorplus读数仪(Tecan)在360/465nm下连续监测荧光。为了测试抑制活性，使用溶于含有50mM Tris/HCl、100mM NaCl、5mM CaCl₂和0.1％BSA的缓冲液中的终浓度为10nM的FXIa在37℃下预孵育所述抗体60分钟。该孵育步骤之后，加入底物I-1575，并测量来自该反应的信号。如图1、图2、图3和图4所示使用GraphPadPrism软件分析数据。数据被表示为平均值±SEM，n＝4。对于一些实验，使用了所分离的FXIa C500S的催化结构域(氨基酸388～625；购自Proteros Biostructures)替代全长的人FXIa(Haematologic Technologies，Inc.，目录号为HCXIA-160)。所有其他条件如上所述。

实施例11：通过本发明的抗体对FXI至其活化形式FXIa的转化的功能性中和

为测试通过FXIIa或凝血酶(凝血酶是IIa)抑制FXI(HaematologicTechnologies，Inc.，目录号为HCXIA-0150)至其活性形式FXIa的转化，将10nM人FXI在50mMTris/HCl、100mM NaCl、5mM CaCl₂和0.1％BSA的缓冲液中与不同浓度的所述抗体在37℃下孵育1小时。在下一步骤中，加入10nM终浓度的人FXIIa(Enzyme Research，目录号HFXIIa1212a)或终浓度为1单位/mg的凝血酶(Enzyme Research，目录号HT1002a)并在37℃下孵育24小时。接着，加入终浓度为200nM的玉米胰蛋白酶抑制剂(Enzyme Research，CTI)和荧光标记的底物(I-1575，Bachem，终浓度为25μM)。使用SpectraFluorplus读数仪(Tecan)在360/465nm下连续监测荧光。如图5和图7(FXIIa介导的FXI转化)以及图6和图8(凝血酶诱导的FXI至其活化形式FXIa的转化)所示，使用GraphPadPrism软件分析数据。数据被表示为平均值±SEM，n＝4。

实施例12：在灵长类动物中的实验性血栓形成体内模型中评估抗-FXIa的抗体076D-M007-H04的抗血栓形成活性。

实验步骤

在重量为9～11kg的不含抗凝血剂的醒着的幼年狒狒上进行实验。如在别处所述(Hanson et al.(1993)Journal of Clinical Investigation92:2003-2012)，这些动物的慢性外置动静脉(AV)分流处(shunt)位于股动脉和静脉之间。在所有的研究动物中，基线分流处血液流速超过250ml/min。用低剂量的氯胺酮(<2mg/kg/hr)控制焦虑。在实验之前和之后，每天测量全血细胞计数。在任何的实验日，计算的血液损失不超过总血液体积的4％。

如之前所述(Hanson et al.[1993]J.Clin.Invest.92:2003-2012)，通过插入人工血管移植物的血栓形成段(ePTFE,WL Gore&Co.,Flagstaff,Ariz.)在狒狒AV分流处内启动血栓形成。为了一致地引发血小板依赖性血栓形成，将临床移植段用固定化的胶原蛋白包被。将内径(i.d.)为2或4mm的20mm长的移植物用马I型胶原蛋白(1mg/ml；NycomedArzenmittel，慕尼黑，德国)填充15分钟，然后在无菌气流下干燥过夜。

如通过扫描电子显微镜所测定的，此方法在移植物内腔内产生了均匀的胶原蛋白包被层。另外，在一些实验中，20mm长的9mm内径的室紧随着4mm内径的20mm长的移植物以分别模拟平均静脉和动脉剪切速率。然后将血栓形成胶原蛋白包被的移植物整合到硅橡胶管的部分之间，并部署在AV分流处。将移植物暴露于血液中最长达60分钟。在每个实验的过程中，通过夹紧近端硅橡胶分流段将通过移植物的血流速度限制在100ml/min，从而在4mm的移植物中产生了265/s的平均壁剪切速率(MWSR)，而在2mm的移植物中的初始MWSR是2120/s。使用超声波流量计(Transonics Systems，Ithaca，N.Y.)连续监测流速。所述4mm的移植物不会阻塞并且脉动流动速率保持在100ml/min直到在60分钟时移去该血栓形成移植物段。在每次实验后通过永久分流恢复基线血流。在所述2mm直径的移植物中，由于血栓形成，血流速率逐渐下降。当流速从100ml/min下降到低于20ml/min时(这预示着将发生阻塞)从AV分流处移去移植物。将从血流起始到移植物移除(血流<20ml/min)的时间视为阻塞时间。

对于血小板沉积的成像，如之前所述(Hanson et al.[1993]J.Clin.Invest.92:2003-2012)，将自体狒狒血小板用1mCi的111In-喹啉(oxine)标记。输注所标记的血小板并使得能够循环至少1小时，然后进行研究。使用γ闪烁相机以5分钟的间隔测量所标记的血小板在血栓形成移植物和硅室上的沉积。在每次研究的前10分钟，输注同源的125I-标记的狒狒血纤蛋白原(4μCi，>90％是可凝固的)，并在>30天后使用γ计数器评估所标记的纤维蛋白在血栓内的整合以使111In衰变。用所沉积的放射性(cpm)除以原始研究时候采集的样品的可凝固纤维蛋白(原)放射性(cpm/mg)。

使用产生高初始壁剪切速率(在100ml/min的夹紧血流下的2120/s)的20mm长、内径为2mm的胶原蛋白包被的装置进行阻塞研究。使用γ闪烁相机以3分钟的间隔测量所标记的血小板在所述2mm血栓形成移植物上的沉积。通过近端夹紧将流动尽可能长时间的控制在100ml/min，然后当增加的血栓开始阻塞装置时降低流速。将20ml/min的最终血流速度用作阻塞的临界值，因为完全闭塞性血栓和该装置的缺乏血流会导致分流处的阻塞和动物的严重血损失。

血样分析。使用微-60自动细胞计数器(Horiba-ABX Diagnostics)测定血细胞计数。将血液样品收集到终浓度为0.32％的柠檬酸钠中。将所有样品以12,900g离心5分钟，收集血浆并储存在-80℃。使用交叉反应性ELISA测定确定了凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT，Enzygnost-TAT，Dade-Behring；LOD：2ng/mL)。这些研究使用的所有ELISA测试试剂盒之前已经显示了对狒狒标志物的敏感性。

在中断研究中(仅4mm内径的胶原蛋白包被的移植物)，将076D-M007-H04以推注形式给予该研究(0.5mg/kg，静脉推注10秒)30分钟，以确定该抗体是否能够中断急性血栓增加。在阻塞研究中(仅2mm内径的胶原蛋白包被的移植物)，在实验前3小时以推注形式给予076D-M007-H04(在0.5mg/kg剂量24小时后0.5mg/kg或2mg/kg，静脉)。在预防研究中(4mm内径的胶原蛋白包被的移植物，接着是9mm内径的硅室)，在实验前1小时以推注形式给予076D-M007-H04(在0.5mg/kg剂量24小时后0.5mg/kg或2mg/kg，静脉)。

止血评估。使用标准模板皮肤出血时间测试评估在狒狒中FXIa抑制对初期止血的效果(International Technidyne Corp)。在实验上，这种测试以及类似的测试(例如，Simplate出血时间)已经在人和非人灵长类动物中显示出对治疗性抗凝血剂、抗血小板试剂和凝血异常的敏感性(Gruber et al.[2007]Blood 109:3733-3740；Smithet al.[1985]Am.J.Clin.Pathol.83:211-215；Payne et al.[2002]J.Vasc.Surg.35:1204-1209)。由相同的专业技术人员进行所有的出血时间测量。为了间接评估止血，还在实验之前、期间和之后的不同时间点进行了aPTT(活化部分促凝血活原激酶时间；SynthASil,HemosIL；Instrumentation Laboratory Company,Bedford,MA)和ACT(活化凝血时间，LupoTek KCT；r2Diagnostics,South Bend,IN)的测量。

体外aPTT。在启动所述aPTT测定之前，将不同浓度的076D-M007-H04在血浆中孵育10分钟。如图20中所示，在“前”时间点(pre time point)(即，给予任何处理之前)，在收集自狒狒的血浆样品中测定了aPTT凝血时间。结果表明，076D-M007-H04在来自血栓形成研究中所使用的所有6个实验狒狒的血浆中是抗凝血剂。

体内凝血研究。在这些研究中使用了三只狒狒：两只狒狒在被给予32m/kg的可咀嚼阿司匹林后被给予076D-M007-H04(2.5mg/kg H04，静脉推注)，一只狒狒在被给予0.5mg/kg 076D-M007-H04(静脉推注)24小时后被给予2mg/kg剂量。在给药后的不同时间点测量了ACT(图21和图22)和aPTT(图23和图24)。

在分流实验过程中的血小板沉积

血栓形成阻塞实验。用于评估076D-M007-H04治疗是否可以防止小血管的阻塞或延长阻塞时间的血栓形成装置由2mm内径的20mm长的胶原蛋白包被的移植物组成。如图25中所示，血小板沉积显示了60分钟或(适用时)直到移植物阻塞时。12/14的对照装置在60分钟内发生了堵塞，2/5的076D-M007-H04(0.5mg/kg)和2/5的076D-M007-H04(0.5mg/kg+2mg/kg)装置发生了堵塞。数据为平均值±SEM。

血栓形成预防实验。用于评估076D-M007-H04对血栓起始和增加的作用的血栓形成装置由4mm内径的20mm长的胶原蛋白包被的ePTFE移植物组成，该移植物之后是9mm内径的20mm长的硅橡胶室。如图26所示的血小板沉积的斜率指示了抗血小板活性。两种剂量的076D-M007-H04(0.5mg/kg以及0.5mg/kg 24小时后2mg/kg)显示出了效力，这可通过如从血栓形成起始后的不同时间点上的血小板沉积速率的降低来证明。已经将所得数据进行归一化以解释实验之间的血小板数目变化。数据为平均值±SEM。

如图27中所示，两种剂量的076D-M007-H04(0.5mg/kg以及0.5mg/kg 24小时后2mg/kg)显示出了效力，这可通过从血栓形成起始后的不同时间点上的硅室中血小板沉积速率的显著降低来证明。数据为平均值±SEM。

凝血酶-抗凝血酶复合物。由于FXI的抑制可通过限制凝血酶介导的血小板活化和纤维蛋白形成和/或通过增加溶栓来降低体内血栓形成，因此使用可商购的ELISA试剂盒测定了凝血酶-抗凝血酶(TAT)的水平。如图28中所示，使用076D-M007-H04(0.5mg/kg以及0.5mg/kg 24小时后2mg/kg)对狒狒进行的预处理防止了TAT水平的增加，意味着在缺失FXIa活性的情况下凝血酶生成显著降低。

出血时间。使用已被FDA批准的用于儿童和成人的成人Surgicutt装置(http://www.itcmed/com/products/surgicutt-bleeding-time-device)对初期止血进行了评估。手动记录出血时间(BT)。观察到伤口的再出血情况30分钟，第二天评估了皮肤的擦伤、瘀斑、血肿和溢血。这些止血评估中的一个或多个已被证明是灵敏的并且能预测几乎所有市售抗血栓形成试剂(抗血小板药物、抗凝血剂、溶栓剂)的抗止血作用。

可单独或在给予可咀嚼的阿司匹林(ASA，32mg/kg)后将076D-M007-H04(0.5mg/kg和24小时后2mg/kg)给予狒狒。如图29中所示，使用任何076D-M007-H04治疗时的出血时间和基线相比都没有增加。和单独的阿司匹林治疗相比，将076D-M007-H04给予经阿司匹林治疗的动物似乎没有进一步增加出血时间。

Claims

1.能够结合凝血因子XIa(FXIa)的人单克隆抗体及其抗原结合片段，其包含可变轻链结构域和可变重链结构域，其中所述可变轻链结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:19组成，且所述可变重链结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:20组成。

2.能够结合FXIa的人单克隆抗体及其抗原结合片段，其包含CDRH1SEQ ID NO:21、CDRH2SEQ ID NO:22和CDRH3SEQID NO:23以及CDRH1SEQ ID NO:24、CDRH2SEQ ID NO:25和CDRH3SEQ ID NO:26。

3.能够结合FXIa的人单克隆抗体及其抗原结合片段，其包含可变轻链结构域和可变重链结构域，其中所述可变轻链结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成，且所述可变重链结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:20组成。

4.能够结合FXIa的人单克隆抗体及其抗原结合片段，其包含CDRH1SEQ ID NO:21、CDRH2SEQ ID NO:22和CDRH3SEQID NO:23以及CDRH1SEQ ID NO:24、CDRH2SEQ ID NO:25和CDRH3SEQ ID NO:28。

5.包含权利要求1至4中任一项的抗体的药物组合物。

6.包含权利要求1至4中任一项的抗体的药物。

7.编码权利要求1至4中的抗体中的一种或多种的核酸。

8.包含权利要求7的核酸的载体。

9.包含权利要求8的载体的宿主细胞。