BR112014027952B1 - Anticorpos monoclonais humanos capazes de se ligarem ao fator de coagulação xi, seu uso, composição farmacêutica e medicamento os compreendendo, ácido nucleico que o codifica, bem como vetor - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANOS CAPAZES DE SE LIGAREM AO FATOR DE COAGULAÇÃO XI E/OU À SUA FORMA ATIVADA FATOR XIA, SEUS USOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MEDICAMENTO OS COMPREENDENDO, ÁCIDO NUCLEICO QUE O CODIFICA, BEM COMO VETOR E HOSPEDEIRO A presente invenção diz respeito a anticorpos capazes de se ligar ao fator XI de coagulação e/ou à sua forma ativada fator XIa e a métodos para a sua utilização, em particular, métodos para a sua utilização como agentes para inibir a agregação de plaquetas e, devido a tal, inibir a formação de trombos.

Description

Campo da invenção

[001] A presente invenção diz respeito a anticorpos capazes de se ligar ao fator XI de coagulação e/ou à sua forma ativada, fator XIa, e a métodos para a sua utilização, em particular, métodos para a sua utilização como agentes para inibir a agregação de plaquetas e, devido a tal, inibir a formação de trombos.

Antecedentes da invenção

[002] Em 1964, Macfarlane e Davie & Ratnoff [Macfarlane RG. An enzyme cascade in the blood clotting mechanism, and its function as a biochemical amplifier. Nature 1964; 202: 498-9; Davie EW, Ratnoff OD. Waterfall sequence for intrinsic blood clotting. Science 1964; 145: 1310-2] introduziram a sua hipótese de cascata para o processo de coagulação do sangue. Desde essa altura, o conhecimento da função da coagulação in vivo aumentou. Nos últimos anos, tem vindo a ser revista a teoria de duas vias distintas, a designada via extrínseca e intrínseca, a qual inicia a coagulação e converge numa via comum, dando origem, em último lugar, à geração de trombina e ao depósito de fibrina. No modelo corrente, a iniciação de coagulação ocorre quando o fator VII activado por protease no plasma contacta com o fator de tecido (TF), formando assim um complexo. Este complexo fator de tecido-FVIIa pode activar o zimogénio FX na sua forma activa FXa, o qual, por sua vez, pode converter protrombina (fator de coagulação II) em trombina (IIa). A trombina, que é um fator chave na coagulação, pode, por sua vez, catalisar a conversão de fibrinogénio em fibrina. Além disso, a trombina activa receptores específicos expressos pelas plaquetas, o que dá origem à activação destas últimas. As plaquetas activas em combinação com fibrina são essenciais para a formação de coágulos e, por tal motivo, são fatores fundamentais de uma hemostase normal.

[003] A segunda via de ampliação é formada pelo fator de coagulação XI (FXI). Está bem confirmado que o FXI é, tal como os outros membros da cascata de coagulação, um zimogénio de serina protease no plasma com um papel chave na ligação em ponte da fase inicial e da fase de ampliação da coagulação do sangue in vivo [Davie EW, Fujikawa K, Kisiel W. The coagulation cascade: initiation, maintenance, and regulation. Biochemistry 1991; 30: 10363-70; Gailani D, Broze Jr GJ. Fator XI activation in a revised model of blood coagulation. Science 1991; 253: 909-12; Kravtsov DV, Matafonov A, Tucker EI, Sun MF, Walsh PN, Gruber A, et al. Fator XI contributes to thrombin generation in the absence of fator XII. Blood 2009; 114: 4528.3-5]. A deficiência em FXI não provoca normalmente hemorragia espontânea, embora esteja associada ao risco elevado de desafios hemostáticos, ao passo que a gravidade de hemorragia está pouco correlacionada com o nível de FXI no plasma. Uma grave deficiência de FXI nos seres humanos possui determinados efeitos protectores contra doenças trombóticas [Salomon O, Steinberg DM, Zucker M, Varon D, Zivelin A, Seligshon U. Patients with severe fator XI deficiency have a reduced incidence of deep-vein thrombosis. Thromb Haemost 2011; 105: 269-73; Salomon O, Steinberg DM, Koren-Morag N, Tanne D, Seligsohn U. Reduced incidence of ischemic stroke in patients with severe fator XI deficiency. Blood 2008; 111: 4113-7]. No entanto, um nível elevado de FXI foi associado a eventos trombóticos [Meijers JC, Tekelenburg WL, Bouma BN, Bertina RM, Rosendaal FR. High levels of coagulation fator XI as a risk fator for venous thrombosis. N Engl J Med 2000; 342: 696-701]. Assim sendo, foi proposto a inibição de FXI como uma nova abordagem para o desenvolvimento de novos antitrombóticos para se alcançar uma taxa melhorada de benefício-risco. Assim, existe ainda uma elevada necessidade médica para fármacos anti-plaquetas, anti-trombóticos que bloqueiem eficazmente a trombose intravascular sem debilitar a hemostase.

Descrição abreviada da invenção

[004] Nos anos recentes, o desenvolvimento de novos agentes antitrombóticos tem feito grandes progressos; no entanto, eventos indesejados de hemorragia provocados por estes agentes constituem ainda um problema grave. Assim sendo, o composto antitrombótico óptimo que, idealmente, iniba a trombose mas que poupe a hemostase ainda está por descobrir.

[005] O fator de coagulação XI (FXI/FXIa) interage com o receptor de plaquetas apoER2. A presente invenção demonstra, pela primeira vez, que a inibição da actividade de FXI/FXIa interfere com o processo de activação de plaquetas e de agregação de plaquetas patológicos sob condições de fluxo de cisalhamento. Num modelo de trombose ex vivo, a inibição de FXI/FXIa dá origem a uma redução significativa de marcadores da activação de plaquetas, tais como CD62P, bem como uma redução de microagregados a jusante em sangue total sob condições de fluxo fisiológico sobre uma superfície de colagénio. Assim sendo, a inibição de FXIa reduz a deposição de plaquetas sem comprometer a hemostase primária dependente de plaquetas num modelo de primata de formação de tombos do tipo artéria dependente de plaquetas. Apesar do efeito antiplaquetas pronunciado, a interacção inicial das plaquetas com as proteínas da matriz extravasculares que é necessária para a formação de um tampão hemostático primário dependente do fator de tecido não é, surpreendentemente, afectada. Assim sendo, a inibição da actividade de FXI/FXIa representa um princípio farmacológico ideal que exibe uma actividade antitrombótica sem causar efeitos secundários associados a hemorragia. Para clarificar: sem comprometer a hemostase significa que a inibição do fator de coagulação XI e/ou XIa não provoca eventos de hemorragia indesejados e mensuráveis na presença de outos compostos anti- coagulantes e/ou compostos anti-plaquetas. Tal como mostrado para pacientes de hemofília C, a hemorragia ocorre apenas no contexto de cirurgias intensivas e/ou de lesões graves.

[006] São proporcionados composições e métodos para mostrar que os anticorpos ou fragmentos de ligação a antigénio, ou suas variantes, dirigidas contra o fator de coagulação XI sob a forma do seu zimogénio e/ou a sua forma ativada, o fator de coagulação XIa, exibem uma actividade anti-plaquetas por meio da inibição ou redução da agregação de plaquetas e, por meio de tal inibição ou redução, a geração de microagregados e/ou coágulos trombóticos.

[007] Utilizando estes anticorpos anti-fator de coagulação XI e/ou anticorpos anti-fator de coagulação XIa, fragmentos de anticorpos de ligação a antigénio e variantes dos anticorpos e fragmentos da invenção, inibe-se a agregação de plaquetas e, através desta, inibe-se a trombose sem comprometer a hemostase.

[008] Também é aqui descrito que a administração dos anticorpos anti-fator de coagulação XI e/ou anticorpos anti-fator de coagulação XIa, os quais são anticorpos neutralizantes, e que estes anticorpos, fragmentos de anticorpo de ligação a antigénio e variantes dos anticorpos e fragmentos da invenção, enquanto anti-coagulantes, a terapia anti-trombótica não causa um risco aumentado de eventos de hemorragia indesejados.

[009] A presente invenção proporciona anticorpos monoclonais humanos capazes de se ligarem selectivamente à forma ativada de fator XI no plasma, FXIa, e, assim, inibir a agregação de plaquetas e a trombose associada sem comprometer a hemostase. As composições compreendem anticorpos anti-fator de coagulação XI e/ou anticorpos anti-fator de coagulação XIa que são capazes de se ligar a epítopos definidos da cadeia pesada do fator de coagulação XI e/ou da cadeia leve do fator de coagulação XIa. Estes anticorpos exibem uma actividade neutralizadora por meio do bloqueio da actividade proteolítica do fator de coagulação XIa e/ou por meio da inibição da conversão do fator de coagulação XI na sua forma ativada, o fator de coagulação XIa, através dos fatores de coagulação FXIIa e/ou trombina. De acordo com uma variante preferida, a invenção compreende ainda a inter-reactividade dos anticorpos com o fator de coagulação XI e/ou XIa provenientes de outras espécies diferentes da humana, nomeadamente de coelho, permitindo uma análise farmacológica e toxicológica mais profundas.

[010] De acordo com outra variante preferida, são utilizados métodos para optimizar e reduzir a imunogenicidade das composições da presente invenção de modo a reduzir o risco de desenvolvimento de anticorpos anti-fármaco.

[011] A presente invenção compreende ainda anticorpos humanos que competem com um dos anticorpos aqui descritos.

[012] Além do mais, as composições compreendem fragmentos de anticorpo de ligação a antigénio, e variantes dos anticorpos e fragmentos da invenção, linhagens celulares que produzem estes anticorpos, e ácidos nucleicos isolados que codificam os aminoácidos destes anticorpos. A invenção também inclui composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos, ou fragmentos de anticorpo de ligação a antigénio, anti-fator de coagulação XI e/ou anti- fator de coagulação XIa, e variantes dos anticorpos e fragmentos da invenção, num veículo e/ou solução farmaceuticamente aceitável.

[013] Os métodos da presente invenção compreendem a administração das composições descritas antes a um sujeito que de tal necessite com o propósito de inibir a agregação de plaquetas e, por meio desta, inibir trombose, reduzindo a dose necessária de qualquer outro agente anti-coagulante ou agente anti-trombótico no tratamento de trombose, no tratamento de uma reacção inflamatória aguda, ou no tratamento de cancro, ou no tratamento de qualquer outra doença associada à activação da cascata de coagulação.

[014] Também são proporcionados métodos para gerar anticorpos, ou fragmentos de anticorpos de ligação a antigénio, anti-fator de coagulação XI e/ou anti-FXIa, e variantes dos anticorpos e fragmentos da invenção.

Descrição abreviada das figuras Figura 1:

[015] Curvas de dose-resposta (CE50 é idêntico a CI50) do anticorpo anti-FXIa 076D-M007-H04, que compreende a SEQ ID NO: 19 para a sequência de aminoácidos para o domínio de cadeia leve variável e a SEQ ID NO: 20 para a sequência de aminoácidos para o domínio de cadeia pesada variável, que inibe FXIa humano. Este anticorpo compreende enquanto CDRH1 a SEQ ID NO: 21, enquanto CDRH2 a SEQ ID NO: 22 e enquanto CDRH3 a SEQ ID NO: 23. Este anticorpo compreende ainda enquanto CDRL1 a SEQ ID NO: 24, enquanto CDRL2 a SEQ ID NO: 25 e enquanto CDRL3 a SEQ ID NO: 26. O anticorpo identificado na campanha de panorâmica/pesquisa foi testado nas concentrações indicadas quando à sua aptidão para inibir a actividade proteolítica de FXIa humano. As sequências de ADN associadas são apresentadas como SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 8.

Figura 2:

[016] Curvas de dose-resposta do anticorpo anti-FXIa 076D-M007- H04 que inibe FXIa de coelho. O anticorpo identificado na campanha de panorâmica/pesquisa foi testado nas concentrações indicadas quando à sua aptidão para inibir a actividade proteolítica de FXIa de coelho.

Figura 3:

[017] Curvas de dose-resposta do anticorpo anti-FXIa 076D-M007- H04-CDRL3-N110D, que compreende a SEQ ID NO: 27 para a sequência de aminoácidos para o domínio de cadeia leve variável e a SEQ ID NO: 20 para a sequência de aminoácidos para o domínio de cadeia pesada variável, que inibe FXIa humano. O anticorpo identificado na campanha de panorâmica/pesquisa foi testado nas concentrações indicadas quanto à sua aptidão para inibir a actividade proteolítica de FXIa humano.

Figura 4:

[018] Curvas de dose-resposta do anticorpo anti-FXIa 076D-M007- H04-CDRL3-N110D. O anticorpo identificado na campanha de panorâmica/pesquisa foi testado nas concentrações indicadas quanto à sua aptidão para inibir a actividade proteolítica de FXIa de coelho.

Figura 5:

[019] Curvas de dose-resposta do anticorpo anti-FXI 076D-M028- H17, que compreende a SEQ ID NO: 29 para a sequência de aminoácidos para o domínio de cadeia leve variável e a SEQ ID NO: 30 para a sequência de aminoácidos para o domínio de cadeia pesada variável, que inibe a conversão de FXI humano em FXIa pelo fator de coagulação XIIa. Este anticorpo compreende enquanto CDRH1 a SEQ ID NO: 31, enquanto CDRH2 a SEQ ID NO: 32 e enquanto CDRH3 a SEQ ID NO: 33. Este anticorpo compreende ainda enquanto CDRL1 a SEQ ID NO: 34, enquanto CDRL2 a SEQ ID NO: 35 e enquanto CDRL3 a SEQ ID NO: 36. O anticorpo identificado na campanha de panorâmica/pesquisa foi testado nas concentrações indicadas quanto à sua aptidão para inibir a conversão do zimogénio FXI na sua forma ativada FXIa. As sequências de ADN associadas são apresentadas como SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 18.

Figura 6:

[020] Curvas de dose-resposta do anticorpo anti-FXI 076D-M028- H17 que inibe a conversão de FXI humano em FXIa pelo fator de coagulação IIa. O anticorpo identificado na campanha de panorâmica/pesquisa foi testado nas concentrações indicadas quanto à sua aptidão para inibir a conversão do zimogénio FXI na sua forma ativada FXIa.

Figura 7:

[021] Curvas de dose-resposta do anticorpo anti-FXI 076D-M028- H17 que inibe a conversão de FXI de coelho em FXIa pelo fator de coagulação XIIa. O anticorpo identificado na campanha de panorâmica/pesquisa foi testado nas concentrações indicadas quanto à sua aptidão para inibir a conversão do zimogénio FXI na sua forma ativada FXIa.

Figura 8:

[022] Curvas de dose-resposta do anticorpo anti-FXI 076D-M028- H17 que inibe a conversão de FXI de coelho em FXIa pelo fator de coagulação IIa. O anticorpo identificado na campanha de panorâmica/pesquisa foi testado nas concentrações indicadas quanto à sua aptidão para inibir a conversão do zimogénio FXI na sua forma ativada FXIa.

Figura 9:

[023] Actividade de ligação e bloqueio de 076D-M007-H04 para o domínio catalítico de FXIa humano. Ao passo que o 076D-M007-H04 inibe a actividade proteolítica de FXIa humano, o 076D-M028-H17 não exibe uma tal actividade, o que indica que o 076D-M007-H04 se liga ao domínio catalítico de FXIa.

Figura 10:

[024] A caracterização do modo de ligação de 076D-M007-H04, utilizando a representação Lineweaver-Burk, mostra que este anticorpo exibe uma actividade de inibição de tipo competitivo.

Figura 11:

[025] Análise citométrica de fluxo para a expressão de CD62P e formação de microagregados de plaquetas. As plaquetas individuais foram detectadas por meio da combinação de difusão de luz e fluorescência de FITC-CD41/CD61 (GPIIbIIIa). (A) Determinação da expressão de CD62P através de uma representação de pontos com fluorescência de FITC-CD41 e PE-CD62P. São apresentadas as plaquetas controladas antes (esquerdas) e após (direita) perfusão. (B) A formação de microagregados de plaquetas foi definida com o tamanho aumentado (difusão para a frente), indicada no círculo. São apresentadas as representações de pontos de amostras colhidas antes (esquerda) e após (direita) perfusão.

Figura 12:

[026] A expressão de CD62P em plaquetas foi reduzida pelos anticorpos para FXI(a).

[027] Sangue total foi tratado com (A) 076D-M007-H04 e (B) 076D- M028-H17 e perfundido sobre uma superfície revestida com colagénio imediatamente após recalcificação. Em paralelo, as amostras de sangue total foram colhidas após tratamento com veículo ou com inibidor, e foram mantidas a incubar na presença ou ausência de TRAP6 (10 μg/mL) durante 5 minutos. A expressão de CD62P em plaquetas foi analisada por citometria de fluxo conforme apresentado na figura 11. Os dados são registados como percentagem de média ± EPM de plaquetas positivas para CD62P numa população controlada, de pelo menos 5 experiências. Os níveis máximos de expressão de CD62P durante 5 minutos de perfusão em cada tratamento são apresentados nos gráficos.

Figura 13:

[028] A formação de microagregados de plaquetas foi inibida pelos anticorpos para FXI(a).

[029] Sangue total foi tratado com (A) 076D-M007-H04 e (B) 076D- M028-H17 e perfundido sobre uma superfície revestida com colagénio imediatamente após recalcificação. Os microagregados de plaquetas foram analisados por citometria de fluxo conforme apresentado na figura 13 e representados como tal. Os dados são registados como média ± EPM da contagem de agregados versus 104 plaquetas individuais controladas, de pelo menos 5 experiências. As contagens máximas de agregados durante 5 minutos de perfusão em cada tratamento são apresentadas nos gráficos.

Figura 14:

[030] Efeito in vivo de 076D-M007-H04 sobre trombose induzida por cloreto férrico (a) e sobre o tempo de hemorragia do ouvido (b). Foi possível demonstrar que o 076D-M007-H04 reduz, de um modo dependente da dose, o peso do trombo seu aumentar o tempo de hemorragia do ouvido.

Figura 15:

[031] Efeito in vivo de 076D-M007-H04-CDRL3-N110D sobre trombose induzida por cloreto férrico (a) e sobre o tempo de hemorragia do ouvido (b) (descritos no exemplo xxx). Foi possível demonstrar que o 076D-M007-H04-CDRL3-N110D reduz, de um modo dependente da dose, o peso do trombo seu aumentar o tempo de hemorragia do ouvido.

Figura 16:

[032] Efeito in vivo mostra o efeito de 076D-M028-H17 sobre trombose induzida por cloreto férrico (a) e sobre o tempo de hemorragia do ouvido (b) (descritos no exemplo xxx). Foi possível demonstrar que o 076D-M028-H17 reduz, de um modo dependente da dose, o peso do trombo seu aumentar o tempo de hemorragia do ouvido.

Figura 17:

[033] Esta figura ilustra uma representação animada do Fab 076D- M007-H04 (parte inferior) no complexo com FXIa (parte superior).

Figure. 18a:

[034] Esta figura ilustra - uma vista detalhada no epítopo de ligação de Fab 076D-M007-H04 (animação) para FXIa C500S. O FXIa C500S é apresentado sob a forma de uma representação de superfície.

Figura 18b:

[035] Esta figura mostra o Fab 076D-M007-H04 com uma estrutura de raio-x peptídica sobreposta de FXIa C500S, apresentado como uma representação de superfície. A fenda do local activo é salientada com um elipsoide a vermelho.

Figure 19a:

[036] Esta figura ilustra a estrutura de cristal do zimogénio FXI (entrada odb 2F83) com sobreposição de Fab 076D-M007-H04.

Figure 19b:

[037] Esta figura ilustra a mesma vista, mas o domínio catalítico de FXI do zimogénio é substituído pelo domínio catalítico de FXIa C500S da estrutura do complexo de Fab 076D-M007-H04:FXIa C500S. Os domínios catalíticos de FXI e de FXIa C500S são apresentados como representações de superfície, todos os outros domínios são apresentados como animações. Os arcos não adequadamente ordenados na interface do Fab 076D-M007-H04 são salientados na figura 19.

Figura 20:

[038] Aumento no tempo de coagulação de aPTT in vitro determinado em amostras de plasma colhidas a partir de babuínos após administração de 076D-M007-H04.

Figura 21:

[039] Medições de ACT após administração de 2,5 mg/kg de 076D-M007-H04 (ampola i.v.) desde 5 minutos pós-dose até 504 horas pós-dose.

Figura 22:

[040] As primeiras 24 horas de medições de ACT após administração de 2,5 mg/kg de 076D-M007-H04 (ampola i.v.).

Figura 23:

[041] Medições de aPTT após administração de 2,5 mg/kg de 076D-M007-H04 (ampola i.v.) desde 5 minutos pós-dose até 504 horas pós-dose.

Figura 24:

[042] As primeiras 24 horas de medições de aPTT após administração de 2,5 mg/kg de 076D-M007-H04 (ampola i.v.).

Figura 25:

[043] Deposição de plaquetas em enxertos vasculares de ePTFE revestidos com colagénio com 2 mm de d.i..

Figura 26:

[044] Deposição de plaquetas em enxertos vasculares de ePTFE revestidos com colagénio conforme descrito no exemplo 12.

Figura 27:

[045] Deposição de plaquetas na câmara de expansão venosa (e na secção ligadora entre o enxerto revestido com colagénio e a câmara de silicone), conforme descrito na secção do exemplo 12.

Figura 28:

[046] Níveis de TAT medidos em plasma de babuíno após administração de 076D-M007-HO4.

Figura 29:

[047] Tempo de hemorragia em babuínos tratados com 0,5 mg/kg de 076D-M007-H04 e 2 mg/kg de 076D-M007-H04 (decorridas 24 horas later), por si sós ou após terem recebido uma aspirina mastigável com uma concentração de 32 mg/kg.

Descrição minuciosa da invenção Definições

[048] Hemostase: o termo hemostase representa os mecanismos principais para interromper o fluxo de sangue em locais de lesão e restaurar a desobstrução vascular durante a cicatrização de feridas, respectivamente. Durante a hemostase normal e trombose patológica, são activados três mecanismos em simultâneo: hemostase primária, que designa as interacções das plaquetas ativadas com a parede do vaso, a formação de fibrina e um processo designado como fibrinólise [Arthur A. Sasahara, Joseph Loscalzo (2002) New Therapeutic Agents for Thrombosis and Thrombolysis (2a Edition) Marcel Dekker Inc. New York, NY, ISBN 0-8247-0795-8].

[049] Coagulação e cascata de coagulação: o sistema baseado em proteínas designado por cascata de coagulação serve para estabilizar o coágulo formado e ainda para selar a ferida. A via de coagulação é uma cascata proteolítica. Cada enzima da via está presente no plasma como um zimogénio (numa forma inactiva), que, após activação, sofre uma clivagem proteolítica para libertar o fator activo a partir da molécula precursora. A cascata de coagulação actua como um conjunto de arcos de resposta positivas e negativas que controlam o processo de activação. O objectivo final da via é a produção de trombina, que pode então converter o fibrinogénio solúvel em fibrina que forma um coágulo. O processo de geração de trombina pode ser dividido em três fases: as vias intrínseca e extrínseca que proporcionam vias alternativas para a geração de um fator de coagulação activo: FXa (fator activado X) e via comum final que resulta na formação de trombina [Hoffman M.M. e Monroe D.M. (2005) Rethinking the coagulation cascade. Curr Hematol Rep. 4: 391-396; Johne J, Blume C, Benz PM, Pozgajová M, Ullrich M, Schuh K, Nieswandt B, Walter U, Renné T. (2006) Platelets promote coagulation fator XII-mediated proteolytic cascade systems in plasma. Biol Chem. 387: 173-178].

[050] Agregação de plaquetas: quando ocorre uma quebra num vaso sanguíneo, são expostas substâncias que não estão normalmente em contacto directo com o fluxo sanguíneo. Estas substâncias (em particular, colagénio e fator de von Willebrand) permitem que as plaquetas adiram à superfície quebrada. Depois de uma plaqueta aderir à superfície, esta liberta químicos que atraem plaquetas adicionais à área lesionada, sendo tal designado como agregação de plaquetas. Estes dois processos constituem as primeiras respostas para parar a hemorragia.

Fator de coagulação XI e fator de coagulação XIa

[051] O fator de coagulação XI (FXI) é sintetizado no fígado e circula no plasma como um dímero ligado por meio de uma ligação dissulfureto complexado com quininogénio de elevado peso molecular. Cada cadeia polipeptídica deste dímero possui aproximadamente 80 kD. O zimogénio fator XI é convertido na sua forma activa, o fator de coagulação (FXIa), quer por meio da fase de contacto da coagulação de sangue quer através de activação mediada com trombina na superfície de plaquetas. Durante esta activação do fator XI, uma ligação peptídica interna é clivada em cada uma das duas cadeias, obtendo-se o fator XIa activado, uma serina protease constituída por duas cadeias pesadas e dias cadeias leves mantidas em conjunto por meio de ligações dissulfureto. Esta serina protease de FXIa converte o fator de coagulação IX em IXa, que subsequentemente activa o fator de coagulação X (Xa). O Xa pode então mediar a activação de fator de coagulação II/trombina. Os defeitos neste fator dão origem à síndrome de Rosenthal (também conhecida como hemofília C), que é uma anomalia na coagulação do sangue caracterizada por hemorragia prolongadas a partir de lesões, hemorragias nasais frequentes ou carregadas, vestígios de sangue na urina e hemorragias menstruais carregadas em fêmeas. Tal como aqui utilizada, a expressão “fator de coagulação X”, “fator XI” ou “FXI” designa qualquer FXI proveniente de quaisquer espécies mamíferas que expresse a proteína. Por exemplo, o FXI pode ser humano, primata não humano (tal como babuíno), murganho, cão, gato, vaca, cavalo, porco, coelho e qualquer outra espécie que exiba o fator de coagulação XI implicado na regulação do fluxo sanguíneo, coagulação e/ou trombose.

[052] O local de clivagem para a activação do fator de coagulação XI pelo fator de coagulação XIIa é uma ligação peptídica interna entre Arg-369 e Ile-370 em cada cadeia polipeptídica [Fujikawa K, Chung DW, Hendrickson LE, Davie EW. (1986) Amino acid sequence of human fator XI, a blood coagulation fator with four tandem repeats that are highly homologous with plasma prekallikrein. Biochemistry 25: 2417-2424]. Cada cadeia pesada do fator de coagulação XIa (369 aminoácidos) contém quatro repetições enfileiradas de 90-91 aminoácidos designadas como domínios maçã (designadas A1-A4) mais um péptido curto de ligação [Fujikawa K, Chung DW, Hendrickson LE, Davie EW. (1986) Amino acid sequence of human fator XI, a blood coagulation fator with four tandem repeats that are highly homologous with plasma prekallikrein. Biochemistry 25: 2417-2424; Sun MF, Zhao M, Gailani D. (1999) Identification of amino acids in the fator XI apple 3 domain required for activation of fator IX. J Biol Chem. 274: 36373-36378]. As cadeias leves do fator de coagulação XIa (cada uma com 238 aminoácidos) contêm a porção catalítica da enzima com sequências que são típicas da família tripsina de serina proteases [Fujikawa K, Chung DW, Hendrickson LE, Davie EW. (1986) Amino acid sequence of human fator XI, a blood coagulation fator with four tandem repeats that are highly homologous with plasma prekallikrein. Biochemistry 25: 2417-2424]. O fator XIa activado desencadeia a fase do meio da via intrínseca da coagulação de sangue, por meio da activação do fator IX.

Variantes conservativas de aminoácidos

[053] Podem ser feitas variantes polipeptídicas que conservam a estrutura molecular global de uma sequência peptídica de anticorpo aqui descrita. De acordo com as propriedades dos aminoácidos individuais, algumas substituições racionais serão reconhecidas por um especialista na matéria. As substituições de aminoácidos, isto é, “substituições conservativas”, podem ser efectuadas, por exemplo, com base na semelhança em termos de polaridade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfipática dos resíduos implicados.

[054] Por exemplo, (a) os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; (b) os aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; (c) os aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e (d) os aminoácidos carregados negativamente (acídicos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Tipicamente, podem ser efectuadas substituições dentro dos grupos (a) a (d). Além disso, a glicina e a prolina podem ser substituídas entre si com base na sua aptidão para perturbas as hélices α. De igual modo, determinados aminoácidos, tais como alanina, cisteína, leucina, metionina, ácido glutâmico, glutamina, histidina e lisina, são mais comummente encontrados em hélices α, ao passo que os aminoácidos valina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano e treonina são mais comummente encontrados em folhas pregueadas β. Os aminoácidos glicina, serina, ácido aspártico, asparagina e prolina são mais comummente encontrados em dobras. Algumas substituições preferidas podem ser efectuadas entre os seguintes grupos: (i) S e T; (ii) P e G e (iii) A, V, L e I. Com base no código genético conhecido e as técnicas de ADN recombinantes e sintéticas, um especialista na matéria poderá facilmente construir ADN que codifiquem as variantes conservativas de aminoácidos.

[055] Tal como aqui utilizada, a expressão “identidade de sequência” entre duas sequências polipeptídicas, indica a percentagem de aminoácidos que são idênticos entre as sequências. A expressão “homologia de sequência” indica a percentagem de aminoácidos que é idêntica ou que representa substituições conservativas de aminoácidos. As sequências polipeptídicas preferidas da invenção possuem uma identidade de sequência nas regiões de CDR pelo menos de 60%, mais preferencialmente, pelo menos de 70% ou 80%, ainda mais preferencialmente, pelo menos de 90% e, muito mais preferencialmente, pelo menos de 95%. Os anticorpos preferidos também possuem uma homologia de sequência nas regiões de CDR pelo menos de 80%, mais preferencialmente, de 90% e, ainda mais preferencialmente, de 95%.

Moléculas de ADN da invenção

[056] A presente invenção também diz respeito a moléculas de ADN que codificam um anticorpo da invenção. Estas sequências incluem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as moléculas de ADN apresentadas nas sequências SEQ ID NOs: 1 a 18.

[057] As moléculas de ADN da invenção não estão limitadas às sequências aqui descritas, mas incluem também as suas variantes. As variantes de ADN na invenção podem ser descritas por referência às suas propriedades físicas na hibridação. Um especialista na matéria será capaz de reconhecer que o ADN pode ser utilizado para identificar o seu complemento e, visto que o ADN possui uma cadeia dupla, o seu equivalente ou homólogo, utilizando técnicas de hibridação de ácido nucleico. Também será capaz de reconhecer que a hibridação pode ocorrer com um valor inferior a 100% de complementaridade. No entanto, com uma selecção adequada de condições, as técnicas de hibridação podem ser utilizadas para a diferenciação entre as sequências de ADN com base na sua relação estrutural com uma sonda particular.

[058] Para orientação no que diz respeito a tais condições ver Sambrook et al., 1989 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA)] e Ausubel et al., 1995 [Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons].

[059] A semelhança estrutural entre duas sequências polipeptídicas pode ser expressa como função da “estringência” das condições sob as quais as duas sequências irão hibridar entre si. Tal como aqui utilizado, o termo “estringência” designa o grau que as condições desfavorecem a hibridação. As condições estringentes desfavorecem fortemente a hibridação e apenas as moléculas mais estruturalmente relacionadas irão hibridar entre si sob tais condições. Pelo contrário, condições não estringentes favorecem a hibridação de moléculas que apresentem um grau inferior de relação estrutural. Assim sendo, a estringência de hibridação está directamente correlacionada com as relações estruturais entre duas sequências de ácidos nucleicos. As seguintes relações são úteis na correlação entre hibridação e relação (em que Tm representa a temperatura de fusão de uma estrutura dúplice de ácido nucleico): a. Tm = 69,3 + 0,41(G+C)% b. A Tm de uma estrutura dúplice de ADN diminui em 1 °C com cada aumento de 1% no número de pares de bases incompatibilizados. c. (Tm)μ2 - (Tm) μ1 = 18,5 log10μ2/μ1 em que μ1 e μ2 são as forças iónicas das duas soluções.

[060] A estringência de hibridação é uma função de muitos fatores, incluindo a concentração global em ADN, a força iónica, a temperatura, o tamanho da sonda e a presença de agentes que perturbem a ligação a hidrogénio. Como fatores que promovem a hibridação refere-se concentrações elevadas em ADN, forças iónicas elevadas, temperaturas baixas, tamanhos de sonda mais longos e a ausência de agentes que perturbem a ligação a hidrogénio. Tipicamente, a hibridação é efectuada em duas fases: a fase de “ligação” e a fase de “lavagem”.

[061] Em primeiro lugar, na fase de ligação, a sonda é ligada ao alvo sob condições que favorecem a hibridação. A estringência é normalmente controlada nesta fase por meio da alteração da temperatura. Para estringência elevada, a temperatura está normalmente compreendida entre 65 °C e 70 °C, salvo quando são utilizadas sondas de oligonucleótidos curtas (< 20 nt). Uma solução de hibridação representativa compreende 6x SSC, 0,5% de SDS, 5x solução de Denhardt e 100 μg de ADN veículo não específico [ver 15]. Como é evidente, são conhecidos condições de tamponamento muito diferentes e, no entanto, funcionalmente equivalentes. Quando o grau de relação é inferior, poderá ser escolhida uma temperatura mais baixa. As temperaturas de ligação de estringência reduzida estão compreendidas entre cerca de 25 °C e 40 °C. Uma estringência média está compreendida entre pelo menos cerca de 40 °C e um valor inferior a cerca de 65 °C. Uma estringência elevada é pelo menos de cerca de 65 °C.

[062] Em segundo lugar, o excesso de sonda é removido por lavagem. É nesta fase que são normalmente aplicadas as condições de maior estringência. Assim, é esta fase de “lavagem” que é a mais importante para se determinar a relação por meio de hibridação. Tipicamente, as soluções de lavagem contêm concentrações reduzidas em sal. Uma solução exemplificativa de estringência média contém 2X SSC e 0,1% de SDS. Uma solução de lavagem de estringência elevada contém o equivalente (em força iónica) de menos do que cerca de 0,2X SSC, com uma solução de estringência preferida contendo cerca de 0,1X SSC. As temperaturas associadas às diversas estringências são as mesmas que as descritas antes a propósito da “ligação”. Também tipicamente, a solução de lavagem é substituída diversas vezes durante a lavagem. Por exemplo, as condições de estringência elevada típicas compreendem a lavagem duas vezes durante 30 minutos a 55 °C e três vezes durante 15 minutos a 60 °C.

[063] Assim sendo, o assunto da presente invenção diz respeito a uma sequência de ácidos nucleicos isolada que codifica o anticorpo e/ou os fragmentos de ligação a antigénio da presente invenção. Uma outra variante da presente invenção diz respeito à sequência de ácidos nucleicos isolada supramencionada, a qual codifica os anticorpos da presente invenção. Assim sendo, a presente invenção inclui moléculas de ácido nucleico que hibridam para as moléculas referidas antes, sob condições de ligação e lavagem de elevada estringência, em que tais moléculas de ácido nucleico codificam um anticorpo ou um seu fragmento funcional que possua propriedades, tal como aqui descritas. As moléculas preferidas (a partir de uma perspectiva de mARN) são aquelas que possuem pelo menos 75% ou 80% (de preferência, pelo menos 85%, mais preferencialmente, pelo menos 90% e, ainda mais preferencialmente, pelo menos 95%) de identidade de sequência com uma das moléculas de ADN aqui descritas. O ADN codifica moléculas que reduzem e/ou inibem a conversão do fator de coagulação XI na sua forma activa fator XIa e/ou bloqueiam directamente a actividade catalítica do fator de coagulação XIa.

Construções de ADN recombinantes e expressão

[064] A presente invenção proporciona ainda construções de ADN recombinantes que compreendem uma ou mais das sequências de nucleótidos da presente invenção. As construções recombinantes da presente invenção são utilizadas em conjunto com um vector, tal como um plasmídeo, fagomídeo, vector de fagos ou viral, no qual é inserida a molécula de ADN que codifica um anticorpo da presente invenção.

[065] O gene codificado pode ser produzido por meio de técnicas descritas por Sambrook et al., 1989, e por Ausubel et al., 1989. [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA; Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons]. Em alternativa, as sequências de ADN podem ser quimicamente sintetizadas utilizando, por exemplo, sintetizadores. Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Oligonucleotide Synthesis [Gait, M.J. (1984) “An introduction to modern methods of DNA Synthesis” em Oligonucleotide Synthesis a Practical Approach. Ed. M.J. Gait, IRL Press Oxford UK], a qual se considera aqui incorporada na sua totalidade por referência. Um especialista na matéria é capaz de fundir ADN que codifica os domínios variáveis com fragmentos de gene que codificam as regiões constantes de vários isótipos de IgG humana ou seus derivados, quer mutados quer não mutados. Ele é capaz de aplicar tecnologia de ADN recombinante para fundir ambos os domínios variáveis num formato de cadeia individual utilizando ligadores, tais como extensores com quinze aminoácidos que contêm três vezes glicina-glicina-glicina-glicina-serina. As construções recombinantes da invenção estão compreendidas em vectores de expressão que são capazes de expressar ARN e/ou produtos proteicos do(s) ADN codificado(s). o vector pode ainda compreender sequências regulatórias, incluindo um promotor ligado funcionalmente ao quadro de leitura aberta (ORF). O vector pode ainda compreender uma sequência de um marcador selecionável. Também podem ser necessários uma iniciação e sinais excretórios bacterianos específicos para uma tradução eficaz das sequências que codificam o gene alvo inserido.

[066] A presente invenção proporciona ainda células hospedeiras que contêm pelo menos um dos ADN da presente invenção. A célula hospedeira pode ser virtualmente qualquer célula para a qual se encontrem disponíveis vectores de expressão. Por exemplo, pode ser uma célula hospedeira eucariótica superior, tal como uma célula de mamífero, uma célula hospedeira eucariótica inferior, tal como uma célula de levedura, e pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana. A introdução da construção bacteriana na célula hospedeira pode ser efectuada por transfecção com fosfato de cálcio, DEAE, transfecção mediada por dextrano, electroporação ou infecção com fagos.

Expressão bacteriana

[067] Os vectores de expressão úteis para utilização bacteriana são construídos por inserção de uma sequência de ADN estrutural que codifica a proteína desejada em conjunto com sinais de iniciação e de terminação de tradução adequados numa fase de leitura funcional com um promotor funcional. O vector irá compreender um ou mais marcadores seleccionáveis fenotípicos e uma origem de replicação para garantir a manutenção do vector e, se desejável, para proporcionar amplificação dentro do hospedeiro. Como hospedeiros procarióticos adequados para transformação refere-se E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e várias espécies dentro do género Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus.

[068] Por exemplo, os vectores bacterianos podem ser com base em bacteriófagos, plasmídeos ou fagomídeos. Tais vectores podem conter um marcador seleccionável e origem de replicação bacteriana proveniente de plasmídeos comercialmente disponíveis que contêm tipicamente elementos do bem conhecido vector de clonagem pBR322 (ATCC 37017). Após transformação de uma estirpe de hospedeiro adequada e desenvolvimento da estirpe hospedeira até uma densidade celular adequada, o promotor seleccionado é de- reprimido/induzido pelos meios adequados (v.g., desvio na temperatura ou indução química) e as células são desenvolvidas em cultura durante um período suplementar. Tipicamente, as células são colhidas por centrifugação, são perturbadas por meios físicos ou químicos e o extracto impuro resultante é retido para nova purificação.

[069] Nos sistemas bacterianos, há diversos vectores de expressão que podem ser vantajosamente seleccionados em função da utilização pretendida para a proteína que se pretende expressar. Por exemplo, quando se pretende produzir uma quantidade elevada de uma tal proteína, para a geração de anticorpos ou para pesquisar bancos de dados de péptidos, por exemplo, poderão ser desejáveis vectores que dirijam a expressão de níveis elevados de produtos de proteína de fusão que sejam facilmente purificados.

[070] Assim sendo, constitui um objecto da presente invenção um vector de expressão que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica os novos anticorpos da presente invenção.

Expressão em mamíferos e purificação de proteínas

[071] As sequências regulatórias preferidas para a expressão em células hospedeiras de mamíferos incluem elementos virais que dirigem para níveis elevados de expressão de proteínas em células de mamíferos, tais como promotores e/ou potenciadores provenientes de citomegalovírus (CMV) (tal como o promotor/potenciador SV40), adenovírus (v.g., o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)) e poliomas. Para uma outra descrição de elementos regulatórios virais e suas sequências [ver os documentos U.S. 5 168 062 por Stinski; U.S. 4 510 245 por Bell et al.; U.S. 4 968 615 por Schaffner et al.]. Os vectores de expressão recombinantes também podem incluir origens de replicação e marcadores seleccionáveis [ver os documentos U.S. 4 510 245 por Bell et al.; U.S. 4 968 615 por Schaffner et al.; U.S. 4 399 216 por Axel et al.]. como marcadores seleccionáveis adequados refere-se genes que conferem resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, numa célula hospedeira na qual o vector foi introduzido. Por exemplo, o gene di-hidrofolato reductase (DHFR) confere resistência contra metotrexato e o gene neo confere resistência contra G418.

[072] A transfecção do vector de expressão numa célula hospedeira pode ser efectuada utilizando técnicas convencionais, tais como electroporação, precipitação com fosfato de cálcio e transfecção mediada por DEAE-dextrano.

[073] Como células hospedeiras de mamífero adequadas para a expressão dos anticorpos, porções de ligação a antigénio e seus derivados aqui proporcionados refere-se células de ovário de hamster chinês (células CHO) [incluindo as células dhfr-CHO, descritas no documento U.S. 4 634 665 por Axel et al.] utilizadas com um marcador seleccionável DHFR, v.g., conforme descrito no documento [U.S. 5 179 017 por Axel et al.], células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Em algumas variantes, o vector de expressão é concebido de um modo tal que a proteína expressa é segregada no meio de cultura, no qual as células hospedeiras são desenvolvidas. Os anticorpos, porções de ligação a antigénio e seus derivados podem ser recuperados a partir do meio de cultura utilizando métodos de purificação de proteínas convencionais.

[074] Os anticorpos da invenção ou um seu fragmento de ligação a antigénio podem ser recuperados e purificados a partir de culturas de células recombinantes por meio de métodos bem conhecidos, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, precipitação com sulfato de amónio ou etanol, extracção com ácido, cromatografia com proteína A, cromatografia com proteína G, cromatografia de permuta aniónica ou catiónica, cromatografia de fosfo-celulose, cromatografia de interacção hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilo-apatite e cromatografia de lectina. Também é possível utilizar a cromatografia líquida de elevado rendimento (“HPLC”) para a purificação [ver Urlaub G, Chasin LA. (1980) Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 77: 4216-4220; v.g., capítulos 1, 4, 6, 8, 9, 10, cada um deles aqui incorporado na sua totalidade por referência]. Os anticorpos da presente invenção ou os seus fragmentos de ligação a antigénio incluem produtos purificados naturalmente, produtos de procedimentos sintéticos químicos e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro eucariótico, incluindo, por exemplo, células de leveduras, de plantas superiores, de insectos e de mamíferos. Dependendo do hospedeiro utilizado no procedimento de produção recombinante, o anticorpo da presente invenção pode ser glicosilado ou pode ser não glicosilado. Tais métodos encontram-se descritos em muitos manuais de laboratório convencionais [ver Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA); Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons, capítulos 10, 12, 13, 16, 18 e 20]. Assim sendo, também constitui um objecto da presente invenção células hospedeiras que compreendem o vector ou uma molécula de ácido nucleico, em que a célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira eucariótica superior, tal com uma célula de mamífero, uma célula eucariótica inferior, tal com uma célula de levedura, e pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana.

[075] Um outro objecto da presente invenção consiste num método de utilização da célula hospedeira para produzir um anticorpos e fragmentos de ligação a antigénio, o qual compreende o desenvolvimento em cultura da célula hospedeira sob condições adequadas e a recuperação do referido anticorpo.

[076] Assim sendo, constitui um outro objecto da presente invenção o anticorpo 005-C04 produzido com as células hospedeiras da presente invenção e purificado até pelo menos 95% de homogeneidade em peso.

Afinidade

[077] Os termos “afinidade” ou “afinidade de ligação” KD são frequentemente determinados por medição da constante de associação em equilíbrio (ka) e a constante de dissociação em equilíbrio (kd), calculando o quociente entre kd e ka (KD = kd/ka). O termo “imunoespecífico” ou “especificamente ligado” designa que o anticorpo se liga ao fator de coagulação XI e/ou à sua forma ativada, o fator de coagulação XIa, com uma afinidade KD inferior ou igual a 106M (afinidade monovalente). O termo “afinidade elevada” designa que o anticorpo se liga ao fator de coagulação XI e/ou à sua forma ativada, o fator de coagulação XIa, com uma afinidade KD inferior ou igual a 107M (afinidade monovalente). O anticorpo pode apresentar uma afinidade substancialmente superior para o antigénio alvo em comparação com outras moléculas não relacionadas. O anticorpo também pode apresentar uma afinidade substancialmente superior para o antigénio alvo em comparação com homólogos, v.g., de pelo menos 1,5 vezes, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 100 vezes, 10-3 vezes, 10-4 vezes, 10-5 vezes, 10-6 vezes ou afinidade relativa superior para o antigénio alvo. Tais afinidades podem ser facilmente determinadas utilizando técnicas convencionais, tais com diálise em equilíbrio; utilizando o instrumento BIAcore 2000, utilizando os procedimentos gerais indicados pelo fabricante; por radioimunoensaio utilizando antigénio alvo radiomarcado; ou por meio de outro método conhecido por um especialista na matéria. Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, pelo método descrito em [Kaufman RJ, Sharp PA. (1982) Amplification and expression of sequences cotransfected with a modular dihydrofolate reductase complementary dna gene. J Mol Biol. 159: 601-621].

Anticorpos

[078] Tal como aqui utilizada, a expressão “anticorpos que bloqueiam o fator de coagulação FXI e/ou a sua forma ativada, o fator de coagulação XIa” pretende designar um bloqueio de FXI e/ou FXIa pelos anticorpos da presente invenção que dá origem a uma inibição completa ou parcial da actividade do fator de coagulação FXI e/ou do FXIa. As sequências de aminoácidos incluem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, aquelas sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 19 a 36.

[079] O termo “anticorpo” é utilizado no sentido mais amplo e inclui anticorpos totalmente montados, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (v.g., anticorpos bi- específicos), fragmentos de anticorpo que se ligam ao antigénio (v.g., Fab', F'(ab)2, Fv, anticorpos de cadeia única, diacorpos), camelocorpos e péptidos recombinantes que compreendem os resíduos desde que estes exibam a actividade biológica desejada. Os anticorpos podem suportar diferentes domínios constantes (domínios Fc) na sua cadeia pesada, de preferência, provenientes de isotipos de IgG1, IgG2 ou IgG4 (ver infra). É possível introduzir mutações para a modificação das funções efectoras. Os resíduos aminoácido no domínio Fc que desempenham um papel dominante nas interacções com a proteína complementar C1q e com os receptores Fc foram identificados e as mutações que influenciam as funções efectoras foram descritas [para uma revisão ver Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)]. Em particular, a aglicosilação de IgG1 pode ser alcançada por mutação de asparagina em alanina ou asparagina em glutamina na posição de aminoácido 297, a qual foi descrita como sendo capaz de abolir a citotoxidade mediada por células provenientes de anticorpo (ADCC) [Labrijn AF, Aalberse RC, Schuurman J. (2008) When binding is enough: nonactivating antibody formats. Curr Opin Immunol. 20: 479-485]. A substituição de lisina por alanina na posição 322 dá origem à redução de ADCC e à remoção de citotoxicidade proveniente do complemento (CDC), ao passo que a substituição simultânea de duas leucinas nas posições 234 e 235 por alaninas proporciona o impedimento de ADCC e CDC [Sazinsky SL, Ott RG, Silver NW, Tidor B, Ravetch JV, Wittrup KD. (2008) Aglycosylated immunoglobulin G1 variants productively engage activating Fc receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 105: 20167-20172]. Para se aplicar os isotipos de IgG4 como terapêuticos bivalentes in vivo que mantenham a avidez, é possível introduzir uma modificação, tal como uma alteração de serina para prolina na ‘região da charneira do núcleo’ [Schuurman J, Van Ree R, Perdok GJ, Van Doorn HR, Tan KY, Aalberse RC. (1999) Normal human immunoglobulin G4 is bispecific: it has two different antigen- combining sites. Immunology. 97: 693-698]. A tendência das moléculas de IgG2 humanas para formarem dímeros covalentes heterogéneos pode ser ultrapassada por meio da alteração de uma das cisteínas nas posições 127, 232 e 233 para serina [Simmons LC, Reilly D, Klimowski L, Raju TS, Meng G, Sims P, Hong K, Shields RL, Damico LA, Rancatore P, Yansura DG. (2002) Expression of full-length immunoglobulins in Escherichia coli: rapid and efficient production of aglycosylated antibodies. J Immunol Methods. 263: 133-147]. Um formato alternativo com uma função efectora reduzida pode ser o formato IgG2m4, obtido a partir de IgG2 que suporta quatro alterações de resíduos aminoácido específicas para IgG4 [Hezareh M, Hessell AJ, Jensen RC, van de Winkel JG, Parren PW. (2001) Effector function activities of a panel of mutants of a broadly neutralizing antibody against human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 75: 12161-1218]. Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por técnicas de ADN recombinantes ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos e encontra-se descrita infra. Como exemplos não limitativos de anticorpos monoclonais refere-se anticorpos de murino, quiméricos, humanizados, humanos e imunoglobulinas Engineered™ humanas, proteínas de fusão quiméricas que possuem sequências obtidas a partir de imunoglobulinas, ou suas muteínas ou derivados, cada um deles descritos infra. São contemplados os multímeros ou agregados de moléculas intactas e/ou de fragmentos, incluindo anticorpos quimicamente transformados.

[080] O termo “anticorpo monoclonal”, tal como aqui utilizado, designa um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos excepto para mutações que ocorrem naturalmente que possam estar presentas em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são extremamente específicos, sendo dirigidos contra um local antigénico individual. Além do mais, ao contrário das preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que incluem, tipicamente, diferentes anticorpos dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um determinante individual no antigénio. Para além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos na medida que são sintetizados em culturas homogéneas, não contaminadas com outras imunoglobulinas com diferentes especificidades e características.

[081] O modificador “monoclonal” indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos e não deverá ser entendido como requerendo uma produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais que se pretende utilizar podem ser preparados pelo método de hibridoma, descrito em primeiro lugar por Kohler et al. [Allen MJ, Guo A, Martinez T, Han M, Flynn GC, Wypych J, Liu YD, Shen WD, Dillon TM, Vezina C, Balland A. (2009) Interchain disulfide bonding in human IgG2 antibodies probed by site-directed mutagenesis. Biochemistry. 48: 3755-3766] ou podem ser preparados por métodos de ADN recombinantes [ver, An Z, Forrest G, Moore R, Cukan M, Haytko P, Huang L, Vitelli S, Zhao JZ, Lu P, Hua J, Gibson CR, Harvey BR, Montgomery D, Zaller D, Wang F, Strohl W. (2009) IgG2m4, an engineered antibody isotype with reduced Fc function. MAbs. 1: 572-579]. Os “anticorpos monoclonais” também podem ser. Por exemplo, recombinantes, quiméricos, humanizados, humanos, Engineered™ humanos ou fragmentos de anticorpos.

[082] Uma “imunoglobulina” ou “anticorpo nativo” é uma glicoproteína tetramérica. Numa imunoglobulina que ocorre naturalmente, cada tetrâmero é constituído por dois pares idênticos de cadeias de polipéptidos, cada par tendo uma cadeia 2leve” (cerca de 25 kDa) e uma cadeia “pesada” (cerca de 50 a 70 kDa). A porção do terminal amino de cada cadeia inclui uma região “variável” de cerca de 110 a 110 ou mais aminoácidos que são os responsáveis principais pelo reconhecimento do antigénio. A porção do terminal carboxilo de cada cadeia define uma região constante, que é a responsável principal para a função efectora. As imunoglobulinas podem ser atribuídas a classes diferentes dependendo da sequência de aminoácidos do domínio contante das suas cadeias pesadas. As cadeias pesadas são classificadas como mu (μ), delta (Δ), gama (Y), alfa (α) e épsilon (ε), e definem o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Muitos destes podem ainda ser divididos em subclasses ou isotipos, v.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Os isotipos diferentes possuem funções efectoras diferentes; por exemplo, os isotipos IgG1 e IgG3 possuem frequentemente actividade de ADCC. As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves kapa (K) e lambda (À). Nas cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região “J” com cerca de 12 ou mais aminoácidos, em que a cadeia pesada também inclui uma região “D” com cerca de mais 10 aminoácidos [ver, de um modo geral, Kohler G, Milstein C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256: 495-497].

[083] Um “fragmento funcional” ou “fragmento de anticorpo de ligação a antigénio” de um anticorpo/imunoglobulina é aqui definido como um fragmento de um anticorpo/imunoglobulina (v.g., uma região variável de uma IgG) que mantém a região de ligação ao antigénio. Uma “região de ligação ao antigénio” de um anticorpo é tipicamente encontrada em uma ou mais regiões hipervariáveis de um anticorpo, isto é, as regiões CDR-1, -2 e/ou -3; no entanto, as regiões de “estrutura” variáveis também podem desempenhar um papel importante na ligação ao antigénio, tal como, proporcionando um complemento para as CDR. De preferência, a “região de ligação ao antigénio” compreende pelo menos os resíduos aminoácidos 4 a 103 da cadeia leve variável (VL) e 5 a 109 da cadeia pesada variável (VH), mais preferencialmente, os resíduos aminoácidos 3 a 107 da VL e 4 a 111 da VH e, ainda mais preferencialmente, compreendem as cadeias VL e VH completas [posições de aminoácidos 1 a 109 da VL e 1 a 113 da VH, em que a numeração das posições dos aminoácidos é efectuada de acordo com a base de dados Kabat [patente de invenção norte-americana n° 4 816 567]. Uma classe preferida de imunoglobulinas utilizável na presente invenção é a IgG.

[084] O termo região “hipervariável” refere-se aos resíduos aminoácidos dos domínios variáveis de VH e VL de um anticorpo ou fragmento funcional que são responsáveis pela ligação ao antigénio. A região hipervariável compreende os resíduos aminoácidos de uma “região determinante da complementaridade” ou CDR [isto é, os resíduos 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) e 88-97 (LCDR3) no domínio variável da cadeia leve e 29-36 (HCDR1), 48-66 (HCDR2) e 93-102 (HCDR3) no domínio variável da cadeia pesada e/ou aqueles resíduos de um arco hipervariável [isto é, os resíduos 26-32 (na LCDR1), 50-52 (na LCDR2) e 91-96 (na LCDR3) no domínio variável da cadeia leve e 26-32 (na HCDR1), 53-55 (na HCDR2) e 96-101 (na HCDR3) no domínio variável da cadeia pesada, conforme descrito em [Fundamental Immunology, Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)].

[085] Como exemplos não limitativos de fragmentos de anticorpo refere-se Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticorpo de domínio (dAb), fragmentos da região determinante da complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia individual (scFv), fragmentos de anticorpo de cadeia individual, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, anticorpos lineares [Johnson G, Wu TT. (2000) Kabat database and its applications: 30 years after the first variability plot. Nucleic Acids Res. 28: 214-218]; anticorpos recombinantes quelantes, tricorpos ou bicorpos, intracorpos, nanocorpos, imunofarmacêuticos modulares pequenos (SMIP), uma proteína de fusão de imunoglobulina do domínio de ligação a antigénio, uma anticorpo camelizado, um VHH que contém anticorpo, ou muteínas ou seus derivados, e polipéptidos que contenham pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que seja suficiente para conferir ligação específica ao antigénio aos polipéptidos, tal como uma sequência da CDR, desde que o anticorpo mantenha a actividade biológica desejada; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo [Chothia C, Lesk AM. (1987) Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J Mol Biol. 196: 901-917; Zapata G, Ridgway JB, Mordenti J, Osaka G, Wong WL, Bennett GL, Carter P. (1995) Engineering linear F(ab')2 fragments for efficient production in Escherichia coli and enhanced antiproliferative activity. Protein Eng. 8: 1057-1062]. Um anticorpo diferente de um anticorpo “biespecífico” ou “bifuncional” é entendido como tendo cada um dos seus locais de ligação idênticos. O F(ab’)2 ou o Fab podem ser manipulados por forma a minimizar ou remover completamente as interacções dissulfureto intermoleculares que ocorrem entre os domínios CH1 e CL. A digestão com papaína dos anticorpos produz dois fragmentos de ligação a antigénio idênticos, designados fragmentos “Fab”, cada um deles com um local de ligação a antigénio individual e um fragmento “Fc” residual, cujo nome reflecte a sua aptidão para cristalizar rapidamente. O tratamento com pepsina proporciona um fragmento F(ab')2, que possui dois fragmentos “Fv”. Um fragmento “Fv” é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de reconhecimento e de ligação do antigénio completo. Esta região é constituída por um dímero de um domínio variável de uma cadeia pesada e de uma cadeia leve numa associação não covalente compacta. É nesta configuração que as três CDR de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação ao antigénio na superfície do dímero VH-VL. Colectivamente, as seis CDR conferem, a especificidade de ligação a antigénio ao anticorpo. No entanto, mesmo um domínio variável individual (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDR específicas para um antigénio) possui a aptidão para reconhecer e ligar o antigénio.

[086] Os fragmentos de anticorpo “Fv de cadeia individual” ou “sFv” ou “scFv” compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que tais domínios estão presentes numa cadeia de polipéptido individual.

[087] De preferência, o polipéptido Fv compreende ainda um ligador polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que o Fv forme a estrutura desejada para a ligação a antigénio. Para uma descrição sobre sFv, ver [C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press].

[088] O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab são diferentes dos fragmentos Fab' pela adição de alguns resíduos no terminal carboxilo do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas a partir da região da charneira do anticorpo. O Fab'-SH é a designação aqui utilizada para Fab' em que o(s) resíduo(s) cisteína dos domínios constantes suportam um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram produzidos originalmente como pares de fragmentos Fab' que possuem cisteínas de charneira entre eles.

[089] Os resíduos da “estrutura” ou resíduos FR são aqueles resíduos do domínio variável diferentes dos resíduos da região hipervariável.

[090] A expressão “região constante” designa a porção molécula de anticorpo que confere as funções efectoras.

[091] O termo “muteína” ou “variante” pode ser utilizado de um modo interpermutável e designa a sequência de polipéptidos de um anticorpo que contém pelo menos uma substituição, supressão ou inserção de aminoácidos na região variável ou na porção equivalente à região variável, desde que a muteína ou variante mantenha a afinidade de ligação ou actividade biológica desejada.

[092] As muteínas podem ser substancialmente homólogas ou substancialmente idênticas ao anticorpo original.

[093] O termo “derivado” designa anticorpos covalentemente modificados por meio de técnicas tais como ubiquinação, conjugação com agentes terapêuticos ou de diagnóstico, marcação (v.g., com radionuclídeos ou várias enzimas), ligação covalente de polímero, tal como pegilação (transformação com polietileno-glicol) e inserção ou substituição por síntese química de aminoácidos não naturais.

[094] Um anticorpo “humano” ou fragmento de anticorpo humano funcional é aqui definido como um que não é quimérico ou “humanizado” e que não é proveniente (quer na totalidade quer em parte) de uma espécie não humana. Um anticorpo humano ou um fragmento de anticorpo funcional pode ser obtido a partir de um ser humano ou pode ser um anticorpo humano sintético. Um “anticorpo humano sintético” é aqui definido como um anticorpo que possui uma sequência obtida, na totalidade ou em parte, in silico a partir de sequências sintéticas que são baseadas na análise de sequências de anticorpos humanos conhecidos. A concepção in silico de uma sequência de anticorpo humano ou de um seu fragmento pode ser alcançado, por exemplo, por meio da análise de uma base de dados de sequências de anticorpos humanos ou de fragmentos de anticorpos e construção de uma sequência de polipéptidos utilizando os dados obtidos a partir desta. Um outro exemplo de um anticorpo humano ou fragmento de anticorpo funcional é um que seja codificado por um ácido nucleico isolado a partir de um banco de dados de sequências de anticorpos de origem humana (isto é, sendo tal banco de dados baseado em anticorpos recolhidos a partir de uma fonte natural humana). Como exemplos de anticorpos humanos refere-se anticorpos com base em n-CoDeR, tal como descrito por [Kontermann R. e & Duebel S., editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag; Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., SpringerVerlag, New York, págs. 269-315 (1994); Carlsson R, Soderlind E. (2001) n-CoDeR concept: unique types of antibodies for diagnostic use and therapy. Expert Rev Mol Diagn. 1: 102-108].

[095] Um “anticorpo humanizado” ou fragmento de anticorpo humanizado funcional é aqui definido como um que é (I) obtido a partir de uma fonte não humana (v.g., um murganho transgénico que suporta um sistema imune heterólogo), anticorpo esse que é baseado numa sequência de linha germinal humana ou (II) enxertado com CDR, em que as CDR do domínio variável são provenientes de uma origem não humana, ao passo que uma ou mais estruturas do domínio variável são de origem humana e o domínio constante (caso exista) é de origem humana.

[096] A expressão “anticorpo quimérico”, tal como aqui utilizada, designa um anticorpo que contém uma sequência obtida a partir de dois anticorpos diferentes que têm origem, tipicamente, em espécies diferentes. Mais tipicamente, os anticorpos quiméricos compreendem fragmentos de anticorpo de humanos e de murinos e, geralmente, regiões constantes humanas e regiões variáveis de murganho.

[097] Um anticorpo da invenção pode ser obtido a partir de um banco de dados de gene de anticorpos recombinantes. O desenvolvimento de tecnologias para fazer reportórios de genes de anticorpos humanos recombinantes e a apresentação dos fragmentos de anticorpo codificados na superfície de bacteriófagos filamentosos, proporcionou um meio recombinante para preparar e selecionar directamente anticorpos humanos, o que também pode ser aplicado a anticorpos humanizados, quiméricos, de murino ou muteína. Os anticorpos produzidos por tecnologia de fagos são produzidos como fragmentos de ligação a antigénio - normalmente, fragmentos Fv ou Fab - em bactérias e, assim, falta-lhes das funções efectoras. As funções efectoras podem ser introduzidas por meio de uma de duas estratégias: os fragmentos podem ser manipulados em anticorpos completos para expressão em células de mamíferos ou em fragmentos de anticorpo bi-específicos com um segundo local de ligação capaz de desencadear uma função efectora. Tipicamente, o fragmento Fd (VH- CH1) e a cadeia leve (VL-CL) dos anticorpos são clonados em separado por PCR e recombinados aleatoriamente em bancos de dados de apresentação de fagos combinatórios, podendo então ser seleccionados para ligação a um antigénio particular. Os fragmentos Fab são expressos na superfície do fago, isto é, fisicamente ligados aos genes que os codificam. Assim, a selecção de Fab por ligação a antigénio co-selecciona as sequências que codificam Fab, as quais podem ser amplificadas subsequentemente. Por meio de diversos ciclos de ligação a antigénio e re-amplificação, um procedimento designado por panorâmica, os Fab específicos para o antigénio são enriquecidos e, por último, isolados.

[098] Foram já descritos diversos procedimentos para a obtenção de anticorpos humanos a partir de bancos de dados de apresentação de fagos. Tais bancos de dados podem ser construídos numa estrutura principal individual, na qual é permitido que diversas CDR formadas in vivo (isto é, provenientes de humanos) se recombinem, tal como descrito em [patente de invenção norte-americana n° 6 989 250; patente de invenção norte-americana n° 4 816 567]. Em alternativa, um tal banco de dados de anticorpos pode ser baseado em sequências de aminoácidos que foram concebidas in silico e codificadas por ácidos nucleicos que são criados sinteticamente. A concepção in silico de uma sequência de anticorpos é alcançada, por exemplo, por meio da análise de uma base de dados de sequências humanas e construção de uma sequência de polipéptidos utilizando os dados obtidos a partir desta. Os métodos para a concepção e obtenção de sequências criadas in silico encontram-se descritos; por exemplo, ver [Carlsson R, Soderlind E. (2001) n-CoDeR concept: unique types of antibodies for diagnostic use and therapy. Expert Rev Mol Diagn. 1: 102-108; patente de invenção norte-americana n° 6 989 250; Knappik A, Ge L, Honegger A, Pack P, Fischer M, Wellnhofer G, Hoess A, Wolle J, Plückthun A, Virnekas B. (2000) Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides. J Mol Biol. 296: 57-86]. Para uma revisão sobre técnicas de apresentação de fagos, ver [Krebs B, Rauchenberger R, Reiffert S, Rothe C, Tesar M, Thomassen E, Cao M, Dreier T, Fischer D, Hoss A, Inge L, Knappik A, Marget M, Pack P, Meng XQ, Schier R, Sohlemann P, Winter J, Wolle J, Kretzschmar T. (2001) High-throughput generation and engineering of recombinant human antibodies. J Immunol Methods. 254: 67-84].

[099] Em alternativa, um anticorpo da presente invenção pode ser proveniente de animais. Um tal anticorpo pode ser humanizado ou manipulado para uma forma humana, tal como resumido por [Krebs B, Rauchenberger R, Reiffert S, Rothe C, Tesar M, Thomassen E, Cao M, Dreier T, Fischer D, Hoss A, Inge L, Knappik A, Marget M, Pack P, Meng XQ, Schier R, Sohlemann P, Winter J, Wolle J, Kretzschmar T. (2001) High-throughput generation and engineering of recombinant human antibodies. J Immunol Methods. 254: 67-84]; um tal anticorpo pode ser proveniente de animais transgénicos [ver, Krebs B, Rauchenberger R, Reiffert S, Rothe C, Tesar M, Thomassen E, Cao M, Dreier T, Fischer D, Hoss A, Inge L, Knappik A, Marget M, Pack P, Meng XQ, Schier R, Sohlemann P, Winter J, Wolle J, Kretzschmar T. (2001) High-throughput generation and engineering of recombinant human antibodies. J Immunol Methods. 254: 67-84].

[100] Tal como aqui utilizadas, as diferentes ‘formas’ de antigénio, v.g., fator de coagulação XI e/ou do fator de coagulação XIa, são aqui definidas como diferentes moléculas de proteínas resultantes de diferentes modificações por tradução e pós-tradução, tais como, mas sem que isso constitua qualquer limitação, diferenças em splicing do transcrito de FXI primário, diferenças na glicosilação e diferenças na clivagem proteolítica pós-tradução.

[101] Tal como aqui utilizado, o termo “epítopo” inclui qualquer determinante de proteína capaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina ou receptor de células T. os determinantes epitópicos são normalmente constituídos por agrupados de moléculas activos quimicamente na superfície, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar, e possuem normalmente características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Diz-se que dois anticorpos ‘se ligam ao mesmo epítopo’ caso um anticorpo mostre competir com o segundo anticorpo num ensaio de ligação competitivo, por qualquer um dos métodos bem conhecidos pelos especialistas na matéria, e caso, de preferência, todos os aminoácidos do epítopo sejam ligados pelos dois anticorpos.

[102] A expressão ‘anticorpos maduros’ ou ‘fragmentos de ligação a antigénio maduros’, tais como variantes Fab maduras, inclui derivados de um anticorpo ou fragmento de anticorpo que exibem uma ligação mais forte e/ou melhorada - isto é, ligação com afinidade aumentada - a um determinado antigénio, tal como FXI. A maturação é um processo de identificação de um número reduzido de mutações dentro das seis CDR de um anticorpo ou de um fragmento de anticorpo que proporcionam este aumento em afinidade. O processo de maturação consiste na combinação de métodos de biologia molecular para a introdução de mutações no anticorpo e pesquisa para identificar os ligadores melhorados.

Composição farmacêutica e administração

[103] A presente invenção também diz respeito a composições farmacêuticas que podem compreender anticorpos de FXI/FXIa, por si sós ou em combinação com pelo menos um outro agente, tal como um composto de estabilização, as quais podem ser administradas em qualquer veículos farmacêutico estéril e biocompatível, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, soluto salino, soluto salino tamponado, dextrose e água. Qualquer uma destas moléculas pode ser administrada ao paciente por si só ou em combinação com outros agentes, fármacos ou hormonas, em composições farmacêuticas nas quais é misturada com excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. De acordo com uma variante da presente invenção, o veículo farmaceuticamente aceitável é farmaceuticamente inerte.

[104] A presente invenção também diz respeito à administração das composições farmacêuticas. Tal administração é efectuada por via parentérica. Como métodos de administração por via parentérica refere-se a administração por vias tópica, intra-arterial (directamente ao tumor), intramuscular, subcutânea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intra-uterina ou intranasal. Para além dos ingredientes activos, estas composições farmacêuticas podem conter veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados, os quais compreendem excipientes e auxiliares que facilitam o processamento dos compostos activos nas preparações que podem ser utilizadas sob o ponto de vista farmacêutico. Outros pormenores sobre técnicas para formulação e administração encontram-se descritos na última edição da obra Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.).

[105] As formulações farmacêuticas para administração por via parentérica incluem soluções aquosas de compostos activos. Para injecção, as composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas em soluções aquosas, de preferência, em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hank, solução de Ringer ou soluto salino fisiologicamente tamponado. As suspensões aquosas para injecção podem conter substâncias que aumentem a viscosidade da suspensão, tal como carboximetil-celulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Além disso, as suspensões dos compostos activos podem ser preparados como suspensões oleosas adequadas para injecção. Como solventes ou veículos lipofílicos adequados refere-se óleos gordos, tais como óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos gordos sintéticos, tais como oleato de etilo ou triglicéridos, ou lipossomas. Facultativamente, a suspensão também pode conter estabilizadores ou agentes adequados que aumentem a solubilidade dos compostos de modo a permitir a preparação de soluções bastante concentradas.

[106] Para a administração por via tópica ou nasal, são utilizados na formulação penetrantes adequados para a barreira particular que se pretende permear. De um modo geral, tais penetrantes são conhecidos na especialidade.

[107] A administração por via parentérica também compreende métodos de administração por via parentérica que incluam também a administração por vias intra-arterial, intramuscular, subcutânea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intra-uterina, vaginal ou intranasal.

Estojos

[108] A presente invenção diz ainda respeito a embalagens ou estojos farmacêuticos que compreendem um ou mais recipientes carregados com um ou mais ingredientes das composições supramencionadas da invenção. Associado a tais recipientes pode existir uma informação sob uma forma prescrita por uma agência governamental que regule a produção, utilização ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, a qual reflecte a aprovação pela agência da produção, utilização ou venda do produto para administração a seres humanos.

[109] De acordo com uma outra variante, os estojos podem conter sequências de ADN que codificam os anticorpos da invenção. De preferência, as sequências de ADN que codificam estes anticorpos são fornecidas num plasmídeo adequado para transfecção e expressão por meio de uma célula hospedeira. O plasmídeo pode conter um promotor (frequentemente um promotor indutível) para regular a expressão de ADN na célula hospedeira. O plasmídeo também pode conter locais de restrição adequados para facilitar a inserção de outras sequências de ADN no plasmídeo para produzir vários anticorpos. Os plasmídeos também podem conter diversos outros elementos para facilitar a clonagem e a expressão das proteínas codificadas. Tais elementos são bem conhecidos pelos especialistas na matéria e compreendem, por exemplo, marcadores selecionáveis, codões de iniciação, codões de terminação e semelhantes.

Produção e armazenamento

[110] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser produzidas de um modo conhecido na especialidade, v.g., por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, preparação de drageias, levigação, emulsionamento, encapsulação, aprisionamento ou liofilização.

[111] A composição farmacêutica pode ser fornecida como um pó liofilizado em histidina 1 mM-50 mM, sacarose a 0,1%-2%, manitol a 2%-7%, num intervalo de pH de 4,5 a 5,5, que é combinado com tampão antes da utilização.

[112] Depois de terem sido preparadas as composições farmacêuticas que compreende um composto da invenção formulado num veículo aceitável, estas podem ser colocadas num recipiente adequado e marcadas para o tratamento de uma patologia indicada. Para a administração de anticorpos anti-fator de coagulação XI e/ou anti-fator de coagulação XIa, tal informação deverá incluir a quantidade, a frequência e o método de administração.

CI50/CE50

[113] De acordo com a FDA, a CI50 representa a concentração de um composto que é necessária para 50% de inibição de um determinado processo biológico. Os anticorpos da presente invenção exibem valores de CI50 de 100 μM, de preferência, de 1 μM, mais preferencialmente, de 0,1 μM, ainda mais preferencialmente, de 0,01 μM, muito mais preferencialmente, de 0,001 μM e, ainda muito mais preferencialmente, de 0,0001 μM.

Dose terapeuticamente eficaz

[114] As composições farmacêuticas adequadas para utilização na presente invenção incluem composições em que os ingredientes activos estão presentes numa quantidade eficaz para se alcançar o propósito pretendido, isto é, tratamento de um estado de doença particular caracterizado pelo fator de coagulação XI e/ou o fator de coagulação XIa. A determinação de uma dose eficaz está ao alcance das capacidades dos especialistas na matéria.

[115] Uma dose terapeuticamente eficaz diz respeito à quantidade de proteína ou dos seus anticorpos, antagonistas ou inibidores que melhoram os sintomas ou a patologia. A eficácia terapêutica e toxicidade de tais compostos podem ser determinadas por meio de procedimentos farmacêuticos convencionais em culturas de células ou em experiências com animais, v.g., DE50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) e DL50 (a dose letal para 50% da população). A proporção de dose entre os efeitos terapêuticos e tóxicos constitui o índice terapêutico e pode ser expressa como proporção DE50/DL50. As composições farmacêuticas que exibem índices farmacêuticos elevados são preferidas. Os dados obtidos a partir de ensaios de culturas de células e de estudos com animais são utilizados para a formulação de um intervalo de dosagem para utilização em humanos. A dosagem de tais compostos está preferencialmente compreendida num intervalo de concentrações em círculo que inclua o valor de DE50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem varia neste intervalo em função da forma de dosagem empregue, da sensibilidade do paciente e da via de administração.

[116] A dosagem exacta é seleccionada pelo médico assistente individual tendo em consideração o paciente que se pretende tratar. A dosagem e a administração são ajustadas de modo a proporcionarem níveis suficientes de resíduos activo ou manterem o efeito desejado. Como fatores adicionais que é possível tomar em consideração refere- se a gravidade do estado de doença, a idade, o peso e o género do paciente; a dieta, o tempo e a frequência de administração, as combinações de fármaco, as sensibilidades à reacção e a tolerância/resposta à terapia. As composições farmacêuticas de actuação longa podem ser administradas a cada 3 ou 4 dias, a cada semana, uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês, dependendo do período de semi-vida e da taxa de eliminação da formulação particular.

[117] As quantidades normais de dosagem podem variar entre 0,1 e 100000 microgramas, até uma dose total de cerca de 2 g, dependendo da via de administração. Na literatura são proporcionadas linhas gerais de orientação sobre dosagens e métodos de administração particulares [ver, patente de invenção norte-americana n° 6 300 064]. Os especialistas na matéria irão utilizar formulações diferentes para polinucleótidos das utilizadas para proteínas ou para os seus inibidores. De igual modo, a administração de polinucleótidos ou polipéptidos será específica para as células, patologias, locais, etc., particulares. As actividades específicas preferidas para um anticorpo radiomarcado podem estar compreendidas entre 0,1 e 10 mCi/mg de proteína [documentos WO 08/022295, US. 4 657 760; US 5 206 344; US 5 225 212; Riva P, Franceschi G, Frattarelli M, Lazzari S, Riva N, Giuliani G, Casi M, Sarti G, Guiducci G, Giorgetti G, Gentile R, Santimaria M, Jermann E, Maeke HR. (1999) Loco-regional radioimmunotherapy of high-grade malignant gliomas using specific monoclonal antibodies labeled with 90Y: a phase I study. Clin Cancer Res. 5 (10 Supl.): 3275s-3280s].

[118] A presente invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplos. Os exemplos são apresentados apenas para ilustrar a invenção por referência a variantes específicas. Estes exemplos, embora ilustrem determinados aspectos específicos da invenção, não deverão constituir uma limitação ou circunscrever o âmbito da invenção descrita.

[119] Todos os exemplos foram efectuados utilizando técnicas convencionais, as quais são bem conhecidas e de rotina para os especialistas na matéria, excepto quando descrito minuciosamente de outro modo. As técnicas de biologia molecular de rotina dos exemplos seguintes podem ser efectuadas conforme descrito nos manuais de laboratório convencionais, tais como [Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA].

Medição da inibição do fator de coagulação XI e/ou do fator de coagulação XIa em tampão.

[120] Para se determinar a inibição do fator Xa da substância listada antes, é construído um sistema de teste biológico no qual é utilizada a conversão de um substrato de fator XIa para a determinação da actividade enzimática de fator XIa humano. As determinações foram efectuadas em placas de microtitulação.

Determinação da actividade anticoagulante

[121] A actividade anticoagulante das substâncias de teste é determinada in vitro em plasma humano e/ou plasma de coelho e/ou plasma de rato. Para este propósito, o sangue é recolhido numa proporção de mistura de citrato de sódio/sangue de 1/9, utilizando uma solução de citrato de sódio 0,11 molar como receptor. Imediatamente após a colheita do sangue, este é misturado minuciosamente e centrifugado a cerca de 4000 g durante 15 minutos. O sobrenadante é removido com uma pipeta.

[122] O tempo de protrombina (PT, sinónimos: tempo de tromboplastina, teste rápido) é determinado na presença de concentrações variáveis da substância de teste ou do solvente correspondente, utilizando um estojo de teste comercial (Neoplastin® da Roche (anteriormente Boehringer Mannheim) ou Hemoliance® RecombiPlastin da Instrumentation Laboratory). Os compostos de teste são mantidos a incubar com o plasma 37 °C durante 3 minutos. Dá-se então início à coagulação por meio da adição de tromboplastina e determina-se o tempo para o qual ocorre a coagulação. Determina- se a concentração da substância de teste que alcançou o dobro do tempo de protrombina.

[123] O tempo de trombina (TT) é determinado na presença de concentrações variáveis de substância de teste ou do solvente correspondente, utilizando um estojo de teste comercial (reagente trombina da Roche). Os compostos de teste são mantidos a incubar com o plasma a 37 °C durante 3 minutos. Dá-se então início à coagulação por meio da adição do reagente trombina e determina-se o tempo para o qual ocorre a coagulação. Determina-se a concentração da substância de teste que alcançou o dobro do tempo de trombina.

[124] O tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) é determinado na presença de concentrações variáveis de substância de teste ou do solvente correspondente, utilizando um estojo de teste comercial (reagente PTT da Roche). Os compostos de teste são mantidos a incubar com o plasma e com o reagente PTT (cefalina, caolina) a 37 °C durante 3 minutos. Dá-se então início à coagulação por meio da adição de cloreto de cálcio 25 mM e determina-se o tempo para o qual ocorre a coagulação. Determina-se a concentração da substância de teste que alcançou o dobro do tempo de aPTT.

[125] As concentrações dos anticorpos da presente invenção dão origem ao dobro do aPTT a uma concentração de 100 μM, de preferência, a uma concentração de 1 μM, mais preferencialmente, a uma concentração de 0,1 μM, ainda mais preferencialmente, a uma concentração de 0,01 μM, muito mais preferencialmente, a uma concentração de 0,001 μM, ainda muito mais preferencialmente, a uma concentração de 0,0001 μM e, muito mais preferencialmente, a uma concentração de 0,00001 μM.

Utilização terapêutica

[126] Os anticorpos anti-fator de coagulação XI e/ou os anticorpos anti-fator de coagulação XIa da invenção podem ser administrados a qualquer sujeito para o qual a inibição da cascata de coagulação e a inibição de agregação de plaquetas e a inibição de trombose seja benéfica.

[127] Assim sendo, os anticorpos anti-fator de coagulação XI e/ou os anticorpos anti-fator de coagulação XIa da invenção são adequados para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças associadas à coagulação em seres humanos, bem como em animais.

[128] A expressão “doenças tromboembólicas” inclui doenças tais como enfarte do miocárdio (MI) ou enfarte do miocárdio agudo (AMI) com e sem elevação de ST no ECG (STEMI e não STEMI), angina de peito estável, bem com angina de peito instável, re-oclusão e restenose após intervenção coronária, tal como angioplastia ou enxerto de bypass arterial coronário (CABG), doença oclusiva arterial periférica (PAOD), embolismo pulmonar (PE), trombose das veias profundas (DVT), bem como trombose das veias renais, ataque isquémico transiente (TIA), apoplexia trombótica e apoplexia tromboembólica.

[129] Estes anticorpos também são úteis para o tratamento e para a prevenção de tromboembolismo cardiogénico, tal como isquemia cerebral, apoplexia apoplética, bem como tromboembolismo sistémico, para o tratamento de pacientes com batimentos cardíacos irregulares ou ritmo cardíaco anormal, v.g., para pacientes com fibrilação auricular, para pacientes com doença cardíaca valvular ou com válvulas cardíacas artificiais. Além disso, estes anticorpos podem ser úteis para o tratamento de pacientes com coagulação intravascular disseminada (DIC).

[130] As complicações tromboembólicas podem ser causadas por lesões ateroscleróticas da parede dos vasos, em particular, perturbações da função endotelial, as quais podem dar origem a oclusões trombóticas agudas. A aterosclerose é um distúrbio multifatorial que depende de diversos fatores de risco cardiovasculares. Estudos clínicos demonstraram que a profilaxia com anticoagulantes não influência definitivamente o curso do distúrbios vascular arterial. Assim sendo, é vantajoso o tratamento dirigido dos fatores de risco em conjunto com uma terapia antitrombótica. Como fatores de risco para distúrbios vasculares coronários, periféricos e cerebrais refere-se, por exemplo: níveis elevados de colesterol no soro, hipertensão arterial, consumo de cigarros e diabetes mellitus. Os princípios da medicina preventiva são baseados na eliminação destes fatores de risco. Para além de uma alteração no estilo de vida, são também incluídas medidas farmacológicas, tais como, por exemplo, terapia anti-hipertensiva, medicamentos para a diminuição dos lípidos ou profilaxia de trombose. Além disso, a combinação com agentes terapêuticos coronários é adequada para o tratamento quando existe uma doença cardíaca coronária pré-existente.

[131] As complicações tromboembólicas estão envolvidas em anemia hemolítica microangiopática (MAHA), circulação sanguínea extracorporal, tal com hemodiálise e substituição da válvula aórtica.

[132] Além do mais, os anticorpos da presente invenção são úteis para o tratamento ou para a profilaxia de doenças inflamatórias, tais como artrite reumatoide (RA), ou doenças neurológicas, tais como doença de Alzheimer (AD). Além disso, estes anticorpos podem ser úteis para o tratamento de cancro e de metástases, de microangiopatia trombótica (TMA), de degeneração macular associada à idade, de retinopatias diabéticas, de nefropatias diabéticas, bem como de outras doenças microvasculares.

[133] Os anticorpos da presente invenção também são úteis para o tratamento de complicações tromboembólicas após cirurgia de pacientes com tumores ou de pacientes com tumores que sejam submetidos a quimioterapia e/ou radioterapia.

[134] Os anticorpos da presente invenção também são úteis para o tratamento e/ou para a profilaxia de pacientes de diálise, em particular, para a prevenção de cimino-fístulas de trombose na derivação em hemodiálise. A hemodiálise pode ser realizada utilizando fistúlas arteriovenosas naturais, enxertos de arcos sintéticos, cateteres venosos centrais de grande diâmetro ou outros dispositivos constituídos por superfícies artificiais. A administração dos anticorpos da presente invenção irá prevenir a formação de coágulos na fístula (e a propagação do coágulo embolizado nas artérias pulmonares), tanto durante a diálise como depois de um período de tempo curto após esta.

[135] Os anticorpos da presente invenção são também úteis para o tratamento e/ou para a profilaxia de pacientes que padecem de tromboses intracardíacas e intrapulmonares após cirurgias de bypass cardiopulmonar (v.g., ECMO: oxigenação de membrana extracorporal).

[136] Para além dos requisitos de anticoagulação sistémica, bem como estabilidade mecânica e duração do dispositivo, as limitações principais dos dispositivos de assistência ventricular são a elevada incidência de eventos trombóticos. Assim sendo, os anticorpos da presente invenção também são úteis para o tratamento e/ou para a profilaxia de pacientes que irão ter um dispositivo de assistência do ventrículo esquerdo.

[137] Existe uma grande necessidade de anticoagulação em pacientes de diálise sem aumentar o risco de eventos de hemorragia indesejados e onde a incidência de tromboembolismo venoso (VTE) e fibrilação auricular (v.g., doença renal em estádio final em pacientes de hemodiálise) nesta população é elevada. Os anticorpos da presente invenção também são úteis para o tratamento e/ou para a profilaxia deste tipo de pacientes.

[138] Os anticorpos da presente invenção também são úteis para o tratamento e/ou para a profilaxia de pacientes afectados com púrpura trombocitopénica idiopática (IPT). Estes pacientes apresentam um risco trombótico aumentado em comparação com a população geral. A concentração do fator de coagulação FXI é significativamente superior em pacientes com ITP em comparação com controlos e o aPTT é significativamente mais longo em pacientes com ITP.

[139] Os anticorpos da presente invenção também são úteis para o tratamento e/ou para a profilaxia de hipertensão pulmonar.

[140] A expressão “hipertensão pulmonar” está de acordo com as linhas gerais definidas pela ‘World Health Organization’ WHO (‘Clinical Classification of Pulmonary Hypertension’, Venice 2003), v.g., hipertensão arterial pulmonar, hipertensão pulmonar provocada por doença do ventrículo esquerdo, hipertensão pulmonar provocada por doenças do pulmão e/ou hipoxia, por coágulos sanguíneos, por constrição de artérias, e outras doenças, tais como hipertensão pulmonar tromboembólica crónica (CTEPH).

[141] A expressão “hipertensão pulmonar” também compreende doenças tais como hipertensão arterial pulmonar idiopática IPAH, hipertensão arterial pulmonar familiar (FPAH), hipertensão arterial pulmonar associada (APAH), a qual pode estar associada a colagenose, derivação circulatória pulmonar sistémica congénita, infecções com VIH ou administração de determinados fármacos em combinação com doenças, tais como doenças da tiróide, doença de armazenamento de glicogénio (GSD), Morbus Gaucher, telangiectasia hemorrágica hereditária, hemoglobinopatia e/ou distúrbios mieloproliferativos.

[142] Os anticorpos da presente invenção são úteis para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças tais como doença oclusiva venosa pulmonar, hemangiomatose capilar pulmonar (PCH), bem como hipertensão pulmonar persistente em recém-nascidos.

[143] A expressão “hipertensão pulmonar” também compreende doenças tais como a doença pulmonar obstrutiva crónica (CODP), doença do pulmão intersticial (ILD), apneia do sono, hiperventilação alveolar, enjoo devido a altitude, bem como displasia constitucional.

[144] As doenças provocadas por hipertensão pulmonar tromboembólica crónica (CTEPH) podem estar associadas a obstrução arterial pulmonar proximal e/ou distal ou a embolia do pulmão não trombótica, tal como cancro, parasitas ou contaminantes.

[145] Além do mais, os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados para o tratamento e/ou para a profilaxia de hipertensão pulmonar provocada por sarcoidose, histiocitose X e linfangiomatose.

[146] Além disso, os anticorpos da presente invenção podem ser úteis para o tratamento e/ou para a profilaxia de fibrose pulmonar e/ou hepática.

[147] Os anticorpos da presente invenção também são úteis para o tratamento e/ou para a profilaxia de septicemia, síndrome inflamatória sistémica (SIRS), disfunção de órgãos, síndrome de disfunção de múltiplos órgãos (MODS), síndrome de stress respiratório agudo (ARDS), lesão aguda do pulmão (ALI), coagulação intravascular disseminada (DIC).

[148] O termo “septicemia” define a ocorrência de uma infecção ou da síndrome de resposta inflamatória sistémica (SIRS). A SIRS é principalmente induzida por infecções, embora também possa ter lugar após lesão, queimadura, choque, operações, isquemia, pancreatite, reanimação ou afeção de tumor. No curso de uma septicemia, a cascata de coagulação pode ser ativada, um processo designado por coagulação intravascular disseminada ou, resumidamente, DIC. Tal pode dar origem à formação de microtrombos e a complicações secundárias.

[149] Além disso, septicemia ou SIRS podem dar origem a disfunção endotelial, o qua pode provocar um aumento na permeabilidade dos vasos. No curso de septicemia ou SIRS, pode ocorrer a paragem de diversos órgãos, v.g., paragem dos rins, paragem do fígado, paragem do pulmão, paragem do sistema cardiovascular.

[150] Os organismos patogénicos que induzem a septicemia ou a SIRS são bactérias gram-positivas e gram-negativas, fungos, vírus e/ou patogénios eucarióticos.

[151] A DIC e/ou a SIRS pode ocorrer em conjunto com uma septicemia, mas também pode ocorrer devido a uma operação, doenças tumorais ou outros tipos de lesão.

[152] Durante a DIC, tem lugar uma activação da cascata de coagulação na superfície dos vasos danificados ou de outros tipos de tecidos. Tal pode dar origem à formação de microtrombos, os quais, por sua vez, dão origem à oclusão de vasos pequenos.

[153] De acordo com uma variante, os anticorpos anti-fator de coagulação Xi e/ou os anticorpos anti-fator de coagulação XIa são utilizados em combinação com outros fármacos para o tratamento e/ou para a profilaxia das doenças já mencionadas.

[154] Seguidamente, são a seguir apresentados exemplos de combinações adequados, sendo assim referidas com preferência: - combinação com compostos para diminuir os lípidos, em particular, inibidores de 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA-reductase, tais como Lovastatin (Mevacor; US 4 231 938), Simvastatin (Zocor; US 4 444 784), Pravastatin (Pravachol; US 4 346 227), Fluvastatin (Lescol; US 5 354 772) e Atorvastatin (Lipitor; US 5 273 995); - combinação com compostos adequados para o tratamento de doenças coronárias e/ou compostos que exibem actividades vasodilatadoras, em particular, inibidores da enzima de conversão de angiotensina, tais como Captopril, Lisinopril, Enalapril, Ramipril, Cilazapril, Benazepril, Fosinopril, Quinapril e Perindopril, ou antagonistas do receptor de angiotensina II, tais como Embusartan (US 5 863 930), Losartan, Valsartan, Irbesartan, Candesartan, Eprosartan e Temisarta, ou antagonistas do receptor β-adrenérgico, tais como Carvedilol, Alprenolol, Bisoprolol, Acebutolol, Atenolol, Betaxolol, Carteolol, Metoprolol, Nadolol, Penbutolol, Pindolol, Propanolol e Timolol, ou a combinação com antagonistas do receptor alfa1-adrenérgico, tais como Prazosin, Bunazosin, Doxazosin e Terazosin; - combinação com diuréticos, Hidroclorotiazida, Furosemida, Bumetanida, Piretanida, Torasemida, Amilorida e Di-hidralazina; - combinação com inibidores dos canais de cálcio, tais como Verapamil e Diltiazem, derivados de di-hidropiridina, tais como Nifedipin (Adalat), Nitrendipin (Bayotensin), Isosorbido-5-mononitrato, Isosorbido-dinitrato e Gliceroltrinitrato; - combinação com compostos que provocam um aumento na concentração em monofosfato de guanosina cíclico (cGMP), tais como estimuladores de guanilatciclase solúvel (WO 98/16223, WO 98/16507, WO 98/23619, WO 00/06567, WO 00/06568, WO 00/06569, WO 00/21954, WO 00/66582, WO 01/17998, WO 01/19776, WO 01/19355, WO 01/19780, WO 01/19778, WO 07/045366, WO 07/045367, WO 07/045369, WO 07/045370, WO 07/045433); - combinação com outros inibidores da cascata de coagulação, tais como activadores de plasminogénio (trombolíticos/fibrinolíticos), bem como compostos que aumentam a trombólise e/ou a fibrinólise ou inibidores do activador de plasminogénio ou inibidores fibrinólise activadora de trombina (inibidores TAFI), tais coo o activador de plasminogénio de tecido (t- PA), estreptocinase, reteplase e urocinase; - combinação com anticoagulantes, tais como heparinas não fraccionadas, heparinas de baixo peso molecular, heparinóides, hirudina, bivalirudina e/ou argatrobano.

[155] Como outras terapias de combinação refere-se a co- administração dos anticorpos anti-fator de coagulação XI e/ou dos anticorpos anti-fator de coagulação XIa com uma terapia antibiótica, terapêuticos antifúngicos e terapêuticos antivirais.

[156] Adicionalmente, combinações dos anticorpos anti-fator de coagulação XI e/ou dos anticorpos anti-fator de coagulação XIa - com vaso-pressores, tais como norepinafrina, dopamina e vasopressina; - terapias inotrópicas, v.g., dobutamina; - corticosteróides, tais como hidrocortisona ou fludrocortisona; - proteína C ativada expressa recombinantemente; - produtos sanguíneos, tais como plasma fresco congelado , concentrados de eritrócitos e/ou concentrados de trombócitos.

[157] Uma outras variante da presente invenção diz respeito à utilização dos anticorpos anti-fator de coagulação XI e/ou dos anticorpos anti-fator de coagulação XIa como anticoagulante para sondas sanguíneas, conservação de sangue, outros produtos de plasma ou amostras biológicas, que contenham o fator de coagulação XI e/ou o fator de coagulação XIa. Estas amostras são caracterizadas de um modo tal que é adicionada uma concentração eficaz dos anticorpos de modo a evitar coagulação in vitro.

[158] Os anticorpos anti-fator de coagulação XI e/ou dos anticorpos anti-fator de coagulação XIa da presente invenção também podem ser utilizados para a inibição de coagulação ex vivo, tal como na preparação de cateteres sanguíneos ou de outros aditivos ou dispositivos médicos, para o revestimento de superfícies artificiais de aditivos ou de dispositivos médicos utilizados in vivo bem como ex vivo ou outras amostras biológicas, que contenham o fator de coagulação XI e/ou o fator de coagulação XIa.

Exemplo 1: identificação de anticorpos Ferramentas utilizadas para a selecção de fagos

[159] As proteínas utilizadas para o isolamento de anticorpos humanos da presente invenção foram obtidas a partir de diferentes fontes, conforme apresentado no quadro 1. As proteínas foram biotiniladas utilizando um excesso aproximadamente 2 vezes molar de biotina-LC-NHS (Pierce; n° de cat.: 21347), de acordo com as instruções do fabricante, e dessalinizadas utilizando colunas de dessalinização Zeba (Pierce; n° de cat.: 89889).

[160] Quadro 1: listagem de proteínas utilizadas na selecção e pesquisa de fagos

Selecção de fagos

[161] O isolamento de anticorpos humanos da presente invenção ou de seus fragmentos de ligação a antigénio foi efectuado por tecnologia de apresentação de fagos, utilizando o banco de dados de Fab de anticorpos humanos DYAX, FAB-310 (DYAX Corp., Cambridge, MA; descrito por Hoet et al., Nat. Biotech. 2005, 23: 3448), que é um banco de dados de Fab que combina uma diversidade natural e sintética. Os quadros 2 a 6 apresentam resumidamente as diferentes estratégias que foram utilizadas para a selecção de anticorpos que abrangessem múltiplos epítopos.

[162] Quadro 2: estratégia de selecção I: antes de cada ciclo de selecção, foi incluído um passo de depleção em calicreína/pré- calicreína biotinilada (500 nM).

[163] Quadro 3: estratégia de selecção II: tal como descrito para a estratégia I, antes de cada ciclo de selecção foi incluído um passo de depleção em calicreína/pré-calicreína biotinilada (500 nM). Além disso, as selecções foram efectuadas na presença do complexo hFXIa (500 nM) / aprotinina (25 μM).

[164] Quadro 4: estratégia de selecção III: antes de cada ciclo de selecção foi incluído um passo de depleção em calicreína/pré- calicreína biotinilada (500 nM).

[165] Quadro 5: estratégia de selecção IV: tal como descrito para a estratégia III, antes de cada ciclo de selecção foi incluído um passo de depleção em calicreína/pré-calicreína biotinilada (500 nM). Além disso, as selecções foram efectuadas na presença do complexo hFXIa (500 nM) / aprotinina (25 μM).

[166] Quadro 6: estratégia de selecção V: antes de cada ciclo de selecção foram incluídos passos de depleção em calicreína/pré- calicreína biotinilada (500 nM) e em hFXI biotinilado (500 nM).

[167] Os tampões padrão utilizados neste exemplo foram: 1x PBS: da Sigma (D5652-50l) PBST: 1x PBS suplementado com 0,05% de Tween20 (Sigma, P7949) Tampão de bloqueio: PBST suplementado com 3% de BSA (Sigma A4503) Tampão de precipitação: 20% de PEG6000 (Calbiochem, 528877) em NaCl 2,5 M Tampão de panorâmica de células: PBS suplementado com 3% de FBS (GIBCO, 10082) e 0,01% de NaN3 (Sigma, 71289).

[168] O método geral utilizado para a selecção do banco de dados foi descrito por Hoet et al. (Hoet RM, Cohen EH, Kent RB, Rookey K, Schoonbroodt S, Hogan S, Rem L, Frans N, Daukandt M, Pieters H, van Hegelsom R, Neer NC, Nastri HG, Rondon IJ, Leeds JA, Hufton SE, Huang L, Kashin I, Devlin M, Kuang G, Steukers M, Viswanathan M, Nixon AE, Sexton DJ, Hoogenboom HR, Ladner RC. (2005) Generation of high-affinity human antibodies by combining donor-derived and synthetic complementarity-determining-region diversity. Nat Biotechnol. 23: 344-348). Resumidamente, faz-se precipitar o banco de dados do Fab de anticorpo por adição de 1/5 de volume de tampão de precipitação, seguida por um passo de incubação em gelo durante 1 hora e um passo de centrifugação (1 hora a 5500 r.p.m.). Subsequentemente, coloca-se novamente em suspensão o banco de dados precipitado em 1 mL de tampão de bloqueio e mantém-se a incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos.

[169] Entretanto, preparam-se aliquotas de Dynabeads M280 revestidas com estreptavidina (Invitrogen, 11206D) por lavagem 3 vezes com PBST. Depois, algumas aliquotas são misturadas com calicreína/pré-calicreína biotinilada (500 nM) ou com hFXI biotinilado (500 nM), ao passo que as restantes são misturadas com a proteína alvo biotinilada, conforme indicado nos quadros 2 a 6. As misturas são mantidas a incubar a 0 °C num rotor de ponta a ponta e são subsequentemente lavadas 5 vezes em 1 mL de PBST. As esférulas revestidas são finalmente bloqueadas por ressuspensão em 1 mL de tampão de bloqueio, separadas em aliquotas em 5 tubos, seguindo-se a recolha das esférulas e remoção do sobrenadante.

[170] Foram efetuados 4 passo de depleção sequenciais, conforme indicado, por adição do banco de dados bloqueado (descrito antes) aos Dynabeads bloqueados revestidos com calicreína/pré- calicreína biotinilada (500 nM) ou com hFXI biotinilado (500 nM) e manteve-se a incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos, sob rotação. Depois de se recolher as esférulas num suporte magnético, o sobrenadante foi limpo por centrifugação e foi misturado com Dynabeads bloqueados revestidos com a proteína alvo. Após incubação durante 30 minutos num rotor de ponta a ponta, as amostras foram lavadas 3 vezes com tampão de bloqueio e depois forma lavadas 9 vezes com PBST. Metade das esférulas ressuspensas que continham fagos enriquecidos foram então utilizadas para infectar E. coli TG1 com crescimento exponencial (da Stratagene) para a preparação de novas soluções de reserva de fagos, utilizadas no próximo ciclo de selecção, de acordo com as estratégias apresentadas nos quadros 2 a 6. Mais minuciosamente, infectou-se 6 mL de cultura de TG1 com 500 μL de suspensão de dynabead/fago durante 30 minutos a 37 °C, sem agitação. Depois, retirou-se aliquotas para titulação do resultado. Centrifugou-se a cultura restante durante 15 minutos a 5000 r.p.m. e colocou-se novamente em suspensão os aglomerados resultantes em 2 mL de 2xYT e colocou-se em placas de ágar-ágar (2xYT, ampicilina 100 μg/mL, glicose a 2%). Após incubação de um dia para o outro a 37 °C, removeu-se as células por raspagem em 5 mL de 2xYT e utilizou-se para inocular uma cultura fresca de 20 mL de 2xYT (Amp 100 μg/mL) a uma OD600 de 0,05 e para a preparação de soluções de reserva de glicerol. Agitou-se a cultura líquida fresca durante cerca de 2 horas a 37 °C, até se atingir uma OD600 de 0,5 a 0,8, depois misturou-se 5 mL de cultura com fagos auxiliadores M13, M123K07 (Invitrogen 420311), a uma multiplicidade de infecção (MOI) de cerca de 20. Após agitação lenta durante 30 minutos a 37 °C, adicionou-se 30 mL de 2xYT pré- aquecido (ampicilina 100 μg/mL, canamicina 20 μg/mL, f.c.) e agitou- se a cultura a 30 °C. Na manhã seguinte, colheu-se o sobrenadante por centrifugação a 6000 r.p.m. e limpou-se por filtração através de Steriflip (0,22 μm; Milipore SCGP00525). Subsequentemente, fez-se precipitar os fagos, conforme descrito antes, e colocou-se novamente em suspensão em 1 mL de tampão de bloqueio (ou tampão de panorâmica de células) para utilização no ciclo seguinte de selecção. Utilizou-se aliquotas para a determinação do título de entrada.

Ensaio de imunossorção ligado a enzimas (ELISA) ELISA de fagos

[171] Analisou-se conjuntos de fagos, após diferentes ciclos de selecção, quando ao enriquecimento do ligador específico por ELISA em proteínas alvo biotiniladas. Resumidamente, colocou-se em placas aliquotas provenientes das soluções de reserva de glicerol em 2xYT (ampicilina 100 mg/mL, 1% de glicose), a 37 °C. Seleccionou-se colónias individuais para cavidades de MTP que continham 100 μL de meio (2xYT, ampicilina 100 μg/mL, 1% de glicose) e agitou-se de um dia para o outro a 37 °C. Efectuou-se a expressão de fagos por adição de 10 μL da cultura de um dia para o outro a 190 μL de meio fresco (2xYT suplementado com ampicilina 100 μg/mL) que continha fagos auxiliadores M123K07 (Invitogen 420311) e manteve-se a incubar a 200 r.p.m. e 37 °C em MTP com 96 cavidades, até se atingir uma OD600 de ~0,5.

[172] Revestiu-se placas para ELISA com 96 cavidades pré- revestidas com estreptavidina (Pierce, 15500) de um dia para o outro a 4 °C com a proteína alvo biotinilada 1 μg/mL. No dia seguinte, lavou-se as placas 7 vezes com PBST, tratou-se com reagente de bloqueio e lavou-se novamente 3 vezes com PBST. Entretanto, misturou-se culturas de fagos com 100 μL de tampão de bloqueio. Depois, transferiu-se 100 μL dos fagos bloqueados por cavidade e manteve-se a incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de se lavar 7 vezes com PBST, adicionou-se anticorpo anti-M13 acoplado a HRP (GE Healthcare, 27-9421-01; diluição 1:2500 em PBST), manteve-se a incubar durante 1 hora à temperatura ambiente e lavou-se novamente as cavidades 7 vezes. Desenvolveu-se uma reacção colorimétrica por adição de 100 μL de TMB (Invitrogen, 2023) e interrompeu-se decorridos 5 a 15 minutos por adição de 100 μL de H2SO4 (Merck, 1120801000). Registou-se a reacção colorimétrica a 450 nM num leitos de placas (Tecan).

[173] Quadro 7: taxas de acertos de conjuntos provenientes de diferentes estratégias em ELISA de Fab/fagos: os números dizem respeito à percentagem (%) de taxa de acertos em alvos humanos/de coelho/ambos (interreactividade), respectivamente; n.a.: não aplicável.

Reclonagem de sFabs por remoção de GenIII para pesquisa de sFab

[174] Para a geração de fragmentos Fab solúveis (sFabs), isolou se ADN fagemídeo obtido nos ciclos de selecção 2, 3 e 4 e digeriu-se com enzimas de restrição MluI (New England Biloabs, R0198L), de acordo com as instruções dos fornecedores. Para se remover o gene III que contém o fragmento, extraiu-se em gel o vector e submeteu-se a um corte de eliminação com NdeI (New England Biolabs, R0111S). Após precipitação em EtOH, ligou-se novamente o fragmentos resultante e transformou-se as construções em E. coli Top10 quimicamente competentes utilizando métodos convencionais.

Exemplo 2: anticorpos anti-fator de coagulação XI e/ou anticorpos anti-fator de coagulação XIa

[175] Os anticorpos, fragmentos de anticorpo de ligação a antigénio e variantes dos anticorpos e fragmentos da invenção são constituídos por uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada. As variantes dos anticorpos ou dos fragmentos de ligação a antigénio contempladas na invenção são moléculas em que a actividade de ligação do anticorpo ou do fragmento de anticorpo de ligação a antigénio para o fator de coagulação XI e/ou para o fator de coagulação XIa é mantida.

[176] A presente invenção proporciona anticorpos ou fragmentos de ligação a antigénio - em que as sequências de aminoácidos das regiões variáveis pesada e leve são pelo menos 60%, mais preferencialmente, 70%, ainda mais preferencialmente, 80% ou 90% ou, muito mais preferencialmente, 95% idênticas à sequência SEQ ID NO: 1 para a sequência de ADN e à SEQ ID NO: 19 para a sequência de aminoácidos para o domínio de cadeia leve variável e idênticas à SEQ ID NO: 2 para a sequência de ADN e 20 para a sequência de aminoácidos para o domínio de cadeia pesada variável ou - em que, para as formas maduras destes anticorpos, as sequências de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada e da cadeia leve são pelo menos 60%, mais preferencialmente, 70%, ainda mais preferencialmente, 80% ou 90% ou, muito mais preferencialmente, 95% idênticas a estas - em que as sequências de aminoácidos das CDR são pelo menos 60%, mais preferencialmente, 70%, ainda mais preferencialmente, 80%, muito mais preferencialmente, 90% ou, ainda muito mais preferencialmente, 95% idênticas às SEQ ID NO: 3, 4 e 5 para a sequência de ADN e às SEQ ID NO: 21, 22 e 23 para a sequência de aminoácidos para o domínio da cadeia pesada e às sequências SEQ ID NO: 6, 7 e 8 para a sequência de ADN e às SEQ ID NO: 24, 25 e 26 para a sequência de aminoácidos para o domínio variável da cadeia leve.

[177] A presente invenção proporciona ainda anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno - em que as sequências de aminoácidos das regiões variáveis pesada e leve são pelo menos 60%, mais preferencialmente, 70%, ainda mais preferencialmente, 80% ou 90% ou, muito mais preferencialmente, 95% idênticas à sequência SEQ ID NO: 9 para a sequência de ADN e à SEQ ID NO: 27 para a sequência de aminoácidos para a cadeia leve variável e idênticas à SEQ ID NO: 2 para a sequência de ADN e SEQ ID NO: 20 para a sequência de aminoácidos para o domínio de cadeia pesada variável ou - em que, para as formas maduras destes anticorpos, as sequências de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada e da cadeia leve são pelo menos 60%, mais preferencialmente, 70%, ainda mais preferencialmente, 80% ou 90% ou, muito mais preferencialmente, 95% idênticas a estas - em que as sequências de aminoácidos das CDR são pelo menos 60%, mais preferencialmente, 70%, ainda mais preferencialmente, 80%, muito mais preferencialmente, 90% ou, ainda muito mais preferencialmente, 95% idênticas à SEQ ID NO: 10 para a sequência de ADN e à SEQ ID NO: 28 para a sequência de aminoácidos para o domínio variável da cadeia leve.

[178] A presente invenção também proporciona anticorpos ou fragmentos de ligação a antigénio - em que as sequências de aminoácidos das regiões variáveis pesada e leve são pelo menos 60%, mais preferencialmente, 70%, ainda mais preferencialmente, 80% ou 90% ou, muito mais preferencialmente, 95% idênticas à sequência SEQ ID NO: 11 para a sequência de ADN e à SEQ ID NO: 29 para a sequência de aminoácidos para a cadeia leve variável e idênticas à SEQ ID NO: 12 para a sequência de ADN e 20 para a sequência de aminoácidos para o domínio de cadeia pesada variável ou - em que, para as formas maduras destes anticorpos, as sequências de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada e da cadeia leve são pelo menos 60%, mais preferencialmente, 70%, ainda mais preferencialmente, 80% ou 90% ou, muito mais preferencialmente, 95% idênticas a estas - em que as sequências de aminoácidos das CDR são pelo menos 60%, mais preferencialmente, 70%, ainda mais preferencialmente, 80%, muito mais preferencialmente, 90% ou, ainda muito mais preferencialmente, 95% idênticas às SEQ ID NO: 13, 14 e 15 para a sequência de ADN e às SEQ ID NO: 31, 32 e 33 para a sequência de aminoácidos para o domínio da cadeia pesada e às sequências SEQ ID NO: 16, 17 e 18 para a sequência de ADN e às SEQ ID NO: 34, 35 e 36 para a sequência de aminoácidos para o domínio variável da cadeia leve.

Exemplo 3: determinação da actividade anticoagulante utilizando o ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT)

[179] A actividade anticoagulante dos anticorpos 076D-M007- H04, 076D-M007-H04-CDRL3-N110D e 076D-M028-H17 foi testada por meio da utilização do ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT).

[180] Os valores para as concentrações necessárias para dobrar o valor de aPTT em plasma humano e de coelho são apresentados no quadro 8.

[181] Quadro 8: concentrações de anticorpo necessárias para dobrar o valor de aPTT de plasma humano e de coelho.

[182] Quadro 9: mostra de exemplos e sequências de anticorpos da invenção.

Exemplo 4: determinação da actividade anti-agregatória do anticorpo de FXIa

[183] Para a medição da activação de plaquetas sob condições de fluxo, revestiu-se lâminas de vidro (Menzel-Glaser SUPERFROST 76 x 26 mm; Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig, Alemanha) com colagénio (150 μg/mL), de um dia para o outro a 4 °C, e depois bloqueou-se com BSA (5 mg/mL), antes de se montar num sistema de fluxo num microscópio Zeiss Axiovert 135 (Carl Zeiss, Gottingen, Alemanha). Manteve-se a incubar sangue total citrado com GPRP (3 mM, final) e veículo ou anticorpos de FXI, durante 10 minutos a 37 °C. Depois de se adicionar CaCl2 (5 mM), borrifou-se imediatamente o sangue sobre a lâmina revestida com colagénio a uma velocidade de corte inicial de 1000 s-1 durante 5 minutos. Após a perfusão do sangue total conforme descrito antes, recolheu-se o sangue total da câmara posterior em citrato de sódio (1:10 vol/vol), a cada 1 minuto. O sangue da pré-câmara também foi amostrado e tratado na presença ou ausência de TRAP6, como controlo positivo (10 μg/mL), durante 5 minutos.

[184] Diluiu-se as amostras de sangue de pré- e pós-câmara em ‘Cell Wash’ (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) e manteve-se a incubar com os anticorpos durante 20 minutos a 4 °C. A reacção com anticorpo foi interrompida por adição de Cell Wash arrefecida em gelo e manteve-se as amostras em gelo até às medições. Determinou-se 10000 plaquetas individuais com a positividade do marcador de plaquetas conjugado com FITC (CD41a ou CD61a) e s padrões de difusão de luz característicos por citrometria de fluxo (FACSCalibur; BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). Para a expressão de CD62P, controlou-se plaquetas individuais num gráfico de difusão em separado com um limite de fluorescência de PE-CD62P, o qual foi verificado com amostras de controlo não marcadas. A população de plaquetas acima do limite foi considerada ativada e quantificada. Os microagregados de plaquetas foram definidos com os limites arbitrários para a difusão anterior (FSC) e fluorescência FITC.

Exemplo 5: trombose e do tempo de hemorragia dos ouvidos, induzidos por FeCl2, em coelhos.

[185] A actividade antitrombótica de 076D-M007-H04, 076D- M007-H04-CDRL3-N110D e 076D-M028-H17 foi determinada num modelo de trombose arterial. Decorridos 15 minutos após a administração de ampola por via i.v. de 076D-M007-H04 (0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg), de 076D-M007-H04-CDRL3-N110D (0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg) ou de 076D-M028-H17 (0,075 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0.3 mg/kg), a trombose foi induzida por danos químicos da artéria carótida por cloreto férrico em coelhos. Os coelhos macho (Crl:KBL (NZW)BR, Charles River) foram anestesiados com uma mistura de xilazina e cetamina (Rompun, Bayer 5 mg/kg e Ketavet Pharmacia & Upjohn GmbH, 40 mg/kg de peso corporal), administrados por injecção por via i.m.. Foi administrada anestesia suplementar por infusão da mistura anestésica na veia marginal do ouvido direito. Após exposição da artéria carótida comum direita, produziu-se danos vasculares através da colocação de uma peça de papel mata-borrão (10 mm x 10 mm) numa faixa de Parafilm ® (25 mm x 12 mm), sob a artéria carótida comum direita, de um modo que o fluxo de sangue não fosse afectado. O papel mata-borrão foi saturado com 100 μL de FeCl2 (tetra-hidrato de cloreto de ferro(II)), 13% em A. dest, Sigma). Decorridos 5 minutos, o papel de filtro foi removido e o vaso foi enxaguado duas vezes com NaCl a 0,9%. Decorridos 30 minutos após a lesão, a artéria carótida foi removida, o trombo foi recolhido e pesado imediatamente. Utilizou-se 5 a 7 animais em cada grupo. O tempo de hemorragia do ouvido foi determinado 2 minutos após a lesão com FeCl2. Rapou-se o ouvido esquerdo e efectuou-se uma incisão padrão (com comprimento de 3 mm) com uma lâmina cirúrgica (número 10-150-10, Martin, Tuttlingen, Alemanha), paralela ao eixo longitudinal do ouvido. Deverá ser tomado cuidado para evitar danos de vasos sanguíneos visíveis. Os locais de incisão foram manchados a intervalos de 30 segundos com papel de filtro, evitando cuidadosamente o contacto com a ferida. O tempo de hemorragia foi determinado por meio da medição do tempo desde a incisão até o sangue deixar de manchar o papel de filtro.

Exemplo 6: determinação de trombose e do tempo de hemorragia dos ouvidos, induzidos por FeCl2, em coelhos.

[186] O 076D-M007-H04 reduz de um modo dependente da dose o peso do trombo e não prolonga o tempo de hemorragia no ouvido, conforme apresentado na figura 14. A figura 15 demonstra o efeito antitrombótico de 076D-M007-H04-CDRL3-N110D sem um aumento no tempo de hemorragia no ouvido. Na figura 16, é apresentado o efeito antitrombótico e a ausência de prolongamento do tempo de hemorragia de 076D-M028-H17.

Exemplo 7: formação de complexo, cristalização e determinação da estrutura por raio-X do complexo Fab 076D-M007-H04:FXIa. Formação de complexo e cristalização.

[187] O FXIa C500S (aminoácidos 388 - 625) foi adquirido a Proteros Biostructures. O Fab 076D-M007-H04 purificado foi misturado numa proporção de 1:1 com FXIa C500S. Para permitir a formação do complexo, armazenou-se a solução durante 18 horas em gelo. Carregou-se a solução de complexo numa coluna Superdex 200 HR 16/60 e concentrou-se ainda até uma concentração final de 20 mg/mL em Tris/HCl 20 mM a pH 7,5 e NaCl 75 mM. Deixou-se desenvolver, a 20 °C, os cristais do complexo de proteína constituído por Fab 076D- M007-H04 e FXIa C500S, utilizando o método de gotas em repouso e deixou-se cristalizar por mistura de volumes iguais de solução de complexo de proteína e solução de cavidade (TRIS 100 mM, pH 8,25, 0,05% de PEG20000 e NH4SO4 2,4 M como precipitante). Decorridos aproximadamente cinco dias, surgiu um cristal de tipo roseta.

Recolha e processamento de dados.

[188] Congelou-se o cristal em azoto líquido sem se utilizar um crio-tampão. Recolheu-se os dados do cristal na linha de luz BL14.1, sincrotrão BESSY (Berlin) num detector MAR CCD. Indexou-se os dados e integrou-se com XDS (Kabsch, W. (2010) Acta Cryst. D66, 125-132), preparou-se para escalonamento com POINTLESS e submeteu-se a escala com SCALA (P.R. Evans, (2005) Acta Cryst. D62, 72-82). Observou-se difracção do cristal até 2,7 Â, em que este apresentou um grupo espacial ortorrômbico P2(1)22(1) com constantes de célula a = 61,9, b = 70,7, c = 185,9 e um complexo Fab 076D-M007-H04:FXIa C500S na unidade assimétrica.

Determinação da estrutura e refinamento.

[189] A estrutura do complexo de FXIa e do Fab de anticorpo monoclonal 076D-M007-H04 foi resolvida por substituição molecular em diferentes passos. Em primeiro lugar, localizou-se a cadeia H utilizando BALBES (F.Long, A.Vagin, P.Young e G.N.Murshudov (2008) Acta Cryst. D64, 125-132), com o código pdb 3GJE, como modelo de pesquisa. Depois, adicionou-se FXIa C500S utilizando o programa MolRep com uma estrutura interna de cristal de FXIa, como modelo de pesquisa. O refinamento inicial com REFMAC5.5 (G.N. Murshudov et al. (1997) Acta Cryst. D53, 240-255) resultou em R1 = 39,4% e Rlivre = 44,1%. Por último, localizou-se a cadeia H utilizando a cadeia L da entrada pdb de 3IDX, como modelo de pesquisa e coordenadas fixas da cadeia H e da solução de FXIa C500S inicialmente refinadas. Ciclos interativos do modelo de construção com COOT (P. Emsley et al. (2010) Acta Cryst. D66:486-501) e refinamento de semelhança máximo utilizando REFMAC5.5, completou o modelo. O conjunto de dados e as estatísticas de refinamento são apresentados resumidamente no quadro 10.

[190] Quadro 10: conjunto de dados e as estatísticas de refinamento para o complexo de Fab 076D-M007-H04:FXIa.

Exemplo 8: mapeamento de epítopos com base na estrutura de raio-X.

[191] O complexo de Fab 076D-M007-H04 e FXIa C500S (Fig. 17) cristalizado possui uma cópia do complexo por unidade assimétrica. Os resíduos de Fab 076D-M007-H04 (parátopo) em contacto FXIa C500S (epítopo) foram determinados e encontram-se listados nos quadros Xa e Xb. Analisou-se a superfície enterrada com programa CCP4 AREAIMOL (P.J. Briggs (2000) CCP4 Newsletter No. 38) e os resíduos que apresentam uma diferença na área total quando calculados com ligação e sem ligação a Fab 076D-M007-H04 (quadro 11a) e a FXIa C500S (quadro 11b) li, respectivamente.

[192] Quadro 11a: resíduos de FXIa em contacto com Fab 076D- M007-H04 Epítopo

[193] Quadro 11b: resíduos de Fab 076D-M007-H04 em contacto com FXIa Parátopo

[194] Em resumo, o epítopo FXIa C500S é formado pelos seguintes resíduos: HIS A 406, PRO A 410, THR A 411, GLN A 412. ARG A 413, HIS A 414, ASN A 450, GLN A 451, SER A 452, ILE A 454, LYS A 455, ARG A 522, LYS A 523, LEU A 524, ARG A 525, ASP A 526, LYS A 527, ILE A 528, GLN A 529, ASN A 530, THR A 531.

[195] O Fab 076D-M007-H04 actua como inibidor competitivo alostérico. Não está a bloquear directamente o local activo de FXIa, mas liga-se adjacente a este. Esta ligação adjacente desencadeia um rearranjo de partes do local activo de FXIa constituindo uma obstrução à ligação de substratos naturais ao FXIa activado (figura 18).

[196] Pelo contrário, o Fab 076D-M007-H04 não liga o zimogénio FXI. Na estrutura de raio-X apresentada do zimogénio FXI (entrada pdb 2F83), há diversos arcos que montam o local activo, bem como o epítopo para Fab 076D-M007-H04, que não estão ordenados adequadamente. Em particular, a região do epítopo é bem estruturada no complexo de Fab 076D-M007-H04:FXIa C500S.

Exemplo 9: mapeamento de epítopos com base em espectrometria de massa de permuta de hidrogénio/deutério.

[197] Foi efectuada uma análise diferente do mapeamento de epítopos pela organização de pesquisa contractada ExSAR [ExSAR Corporation; 11 Deer Park Drive, Suite 103; Monmouth Junction, NJ 08852; USA]. Neste caso, as interacções de FXIa C500S (aminoácidos 388 - 625; adquirido a Proteros Biostructures) e de Fabs purificados de 076D-M007-H04 e 076D-M049-O15, respectivamente, foram analisadas pelo método diferencial de espectrometria de massa de permuta de hidrogénio/deutério [para uma descrição, ver Percy AJ, Rey M, Burns KM, Schriemer DC. (2012) Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry-a review. Anal Chim Acta. 721: 7-21]. Assim, diferenças no nível de deuteração superiores a 10% indicam uma protecção elevada pelo Fab do antigénio correspondente. Valores compreendidos entre 5% e 10% indicam uma ligação fraca e diferenças no nível de deuteração inferiores a 5% indicam a ausência de qualquer protecção.

[198] No quadro 12a e no quadro 12b são apresentados resumidamente os resíduos de Fab 076D-M007-H04 e de Fab 076D- M049-O15 em contacto com FXIa, respectivamente.

[199] Quadro 12a: resíduos de Fab 076D-M007-H04 em contacto com FXIa

[200] Quadro 12b: resíduos de Fab 076D-M049-O15 em contacto com FXIa

[201] Estes dados mostram claramente cobrindo um epítopo de 200 aminoácidos no FXIa (aminoácidos 408 - 609 de FXIa C500S) dá origem a uma inibição da actividade proteolítica de FXIa.

Exemplo 10: neutralização funcional de FXIa pelos anticorpos da presente invenção

[202] A actividade de FXIa humano (Haematologic Technologies, Inc., número de catálogo HCXIA-0160) é determinada pela medição da clivagem de um substrato específico marcado fluorogenicamente (I1575, Bachem, concentração final de 25 μM) e a fluorescência é monitorizada continuamente a 360/465 nm utilizando um leitor SpectraFluorplus (Tecan). Para se testar a actividade inibitória, os anticorpos são pré-incubados durante 60 minutos a 37 °C com uma concentração final de FXIa 10 nM num tampão que contém Tris/HCl 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM e 0,1% de BSA. Após este passo de incubação, adiciona-se o substrato I-1575 e mede-se os sinais da mistura de reacção. Analisa-se os dados utilizando a aplicação informática GraphPadPrism, tal como apresentado na figura 1, figura 2, figura 3 e figura 4. Os dados são apresentados como média ± EPM, n= 4.

[203] Para algumas experiências, em vez do FXIa humano de comprimento completo (Haematologic Technologies, Inc., número de catálogo HCXIA-0160), utiliza-se o domínio catalítico isolado de FXIa C500S (aminoácidos 388 - 625; adquirido a Proteros Biostructures). Todas as outras condições são idênticas às descritas antes.

Exemplo 11: neutralização funcional da conversão de FXI na sua forma activa, FXIa, pelos anticorpos da presente invenção.

[204] Para se testar a inibição da conversão de FXI (Haematologic Technologies, Inc., número de catálogo HCXIA-0150) na sua forma activa FXIa, por FXIIa ou por trombina (trombina é IIa), mantém-se a incubar FXI humano 10 nM em Tris/HCl 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM e 0,1% de BSA, com concentrações diferentes dos anticorpos, durante 1 hora a 37 °C. Num passo subsequente, adiciona-se FXIIa numa concentração final de 10 nM (Enzyme Research, número de catálogo HFXIIa 1212a) ou trombina (Enzyme Research, número de catálogo HT 1002a) numa concentração final de 1 unidade/mg e mantém-se a incubar durante 24 horas a 37 °C. A seguir, adiciona-se o inibidor de tripsina Corn (Enzyme Research, CTI) numa concentração final de 200 nM e o substrato marcado fluorogenicamente (I-1575, Bachem, concentração final de 25 μM). Monitoriza-se continuamente a fluorescência a 360/465 nm utilizando um leito SpectraFluorplus Reader (Tecan). Analisa-se os dados utilizando a aplicação informática GraphPadPrism, tal com apresentado na figura 5 e figura 7 para a conversão de FXI mediada por FXIIa e na figura 6 e figura 8 para a conversão de FXI induzida por trombina na sua forma ativada, FXIa. Os dados são apresentados como média ± EPM, n= 4.

[205] Exemplo 12: avaliação da actividade anti-trombótica do anticorpo anti-FXIa 076D-M007-H04 num modelo de trombose experimental in vivo em primatas.

Procedimentos experimentais

[206] As experiências foram conduzidas em babuínos juvenis acordados não anticoagulados com um peso de 9 - 11 kg. Estes animais tinham desvios arteriovenosos (AV) exteriorizados crónicos colocados entre a artéria e a veia femorais, tal como descrito por (Hanson et al. (1993) Journal of Clinical Investigation 92: 2003-2012). O fluxo sanguíneo do desvio na linha de base excedia 250 mL/minuto em todos os animais do estudo. A ansiedade foi controlada por meio de uma dose reduzida de cetamina (< 2 mg/kg/hora). As contagens de células de sangue total foram medidas diariamente, antes e depois das experiências. A perda de sangue calculada não excedeu 4% do volume total de sangue em qualquer dia da experiência.

[207] A formação de trombos foi iniciada no desvio AV dos babuínos por interposição de um segmento trombogénico de enxerto vascular prostético (ePTFE, WL Gore & Co., Flagstaff, Ariz.), conforme descrito anteriormente (Hanson et al. [1993] J. Clin. Invest. 92: 20032012). Para desencadear de um modo consistente a formação de trombos dependentes de plaquetas, os segmentos de enxerto clínico foram revestidos com colagénio imobilizado. Enxertos com um comprimento de 20 mm e diâmetros internos (d.i.) de 2 ou 4 mm foram carregados com colagénio de tipo I de equídeo (1 mg/mL; Nycomed Arzenmittel, Munich, Alemanha) durante 15 minutos, e depois foram secos de um dia para o outro sob um fluxo de ar estéril. Este método produziu um revestimento de colagénio uniforme no lúmen do enxerto, tal como determinado por microscopia de electrões de varrimento. Além disso, em algumas experiências, é colocada uma câmara com um comprimento de 20 mm e um d.i. de 9 mm a jusante do enxerto com um comprimento de 20 mm e um d.i. de 4 mm, para modelar as velocidades de corte venosas e arteriais médias, respectivamente. Os enxertos revestidos com colagénio trombogénicos foram então incorporados entre segmentos da tubagem de borracha de silicone e posicionados nos desvios AV. Os enxertos foram expostos a sangue até 60 minutos. Durante cada experiência, o caudal sanguíneo através do enxerto foi restringido a 100 mL/minuto por aperto do segmento do desvio de borracha de silicone proximal, produzindo assim uma taxa de corte na parede média (MWSR) nos enxertos de 4 mm de 265/segundo, ao passo que nos enxertos de 2 mm a MWSR inicial foi de 2120/segundo. Os caudais foram monitorizados continuamente utilizando um fluxímetro ultrassónico (Transonics Systems, Ithaca, N.Y.). Os enxertos de 4 mm não ficaram obstruídos e os caudais pulsáveis permaneceram a 100 ml/minuto até os segmentos do enxerto trombogénico serem removidos ao fim de 60 minutos. O fluxo sanguíneo do nível de base foi restaurado através do desvio permanente, após cada experiência. Nos enxertos com um diâmetro de 2 mm os caudais sanguíneos diminuíram progressivamente devido à formação de trombos. Os enxertos foram removidos dos desvios AV quando o caudal desceu desde 100 ml/minuto até um valor inferior a 20 ml/minuto, o que sinaliza uma oclusão iminente. O tempo decorrido desde o início do fluxo sanguíneo até à remoção do enxerto (fluxo sanguíneo < 20 mL/minuto) foi considerado como o tempo de oclusão.

[208] Para a obtenção de imagens da deposição de plaquetas, marcou-se plaquetas autólogas de babuíno com 1 mCi de 111In-oxina, tal como descrito anteriormente (Hanson et al. [1993] J. Clin. Invest. 92: 2003-2012). Efectuou-se a infusão das plaquetas marcadas e deixou-se circular durante pelo menos 1 hora, antes de se realizarem os estudos. Mediu-se a acumulação de plaquetas marcadas nos enxertos trombogénicos e nas câmaras de silicone em intervalos de 5 minutos, utilizando uma câmara de cintilação gama. Efectuou-se a infusão de fibrinogénio de babuíno marcado com 125I (4 μCi, > 90% coagulável), 10 minutos antes de cada estudo, e avaliou-se a incorporação da fibrina marcada no trombo utilizando um contador gama >30 dias depois para permitir que o decaimento do 111In. Dividiu-se a radioactividade depositada (cpm) pela radioactividade de fibrina(ogénio) coagulável das amostras recolhidas no período de tempo do estudo original (cpm/mg).

[209] Os estudos de oclusão foram efectuados utilizando dispositivos revestidos com colagénio com um comprimento de 20 mm e um d.i. de 2 mm que produziam taxas de corte da parede iniciais elevadas (2120/segundos para um fluxo sanguíneo 100 mL/minuto por aperto). Mediu-se a acumulação de plaquetas marcadas nos enxertos trombogénicos de 2 mm em intervalos de 3 minutos, utilizando uma camara de cintilação gama. Manteve-se o fluxo a 100 mL/minuto por aperto proximal durante um período de tempo tão longo quanto possível e depois deixou-se diminuir à medida que os trombos propagantes começavam a obstruir o dispositivo. Utilizou-se um caudal sanguíneo 20 mL/minuto como corte da oclusão, uma vez que um trombo totalmente oclusivo e a ausência de fluxo sanguíneo através do dispositivo poderia provocar a oclusão do desvio e uma perda significativa de sangue para os animais.

[210] Análise de amostras de sangue. As contagens de células sanguíneas foram determinadas utilizando um contador de células automatizado micro-60 (Horiba-ABX Diagnostics). As amostras de sangue foram recolhidas numa concentração final de 0,2% de citrato de sódio. Todas as amostras foram submetidas a centrifugação durante 5 minutos a 12900 g e os plasmas foram recolhidos e armazenados a -80 °C. Foram utilizados ensaios ELISA de inerreactrividade para se determinar os complexos trombina- antitrombina (TAT, Enzygnost-TAT, Dade-Behring; LOD: 2 ng/mL). Todos os estojos de teste ELISA utilizados para estes estudos demonstraram anteriormente sensibilidade para marcadores de babuíno.

[211] Em estudos de interrupção (apenas enxerto revestido com colagénio com d.i. de 4 mm), administrou-se o 076D-M007-H04 sob a forma de uma ampola, decorridos 30 minutos do estudo (0,5 mg/kg, ampola i.v. ao longo de 10 segundos) para se determinar se este anticorpo pode interromper a propagação aguda de trombos. Em estudos de oclusão (apenas enxerto revestido com colagénio com um d.i. de 2 mm), administrou-se o 076D-M007-H04 sob a forma de uma ampola, 3 horas antes da experiência (0,5 mg/kg ou 2 mg/kg, 24 horas após uma dose de 0,5 mg/kg dose, i.v.). Em estudos de prevenção (enxerto revestido por colagénio com um d.i. de 4 mm seguido por uma câmara de silicone com d.i. de 9 mm), administrou-se o 076- M007-H04 sob a forma de uma ampola, 1 hora antes da experiência (0,5 mg/kg ou 2mg/kg, 24 horas após uma dose de 0,5 mg/kg dose, i.v.).

[212] Avaliação hemostática. Avaliou-se os efeitos da inibição de FXIa em hemóstase primária em babuínos, utilizando o teste de tempo de hemorragia de pele de matriz padrão (Surgicutt®, International Technidyne Corp). Sob o ponto de vista experimental, este teste e testes semelhantes (v.g., tempos de hemorragia Simplate) têm demonstrado ser sensíveis aos efeitos de anticoagulantes terapêuticos, agentes anti-plaquetas e a anormalidades na coagulação em seres humanos e em primatas não humanos (Gruber et al. [2007] Blood 109: 3733-3740; Smith et al. [1985] Am. J. Clin. Pathol. 83: 211215; Payne et al. [2002] J. Vasc. Surg. 35: 1204-1209). Todas as medições dos tempos de hemorragia foram efectuadas pelo menos técnico especialista. Para a avaliação indirecta de hemóstase, também foram efectuadas medições de aPTT (tempo de tromboplastina parcial ativada; SynthASil, HemosIL; Instrumentation Laboratory Company, Bedford, MA) e de ACT (tempo de coagulação ativada, LupoTek KCT; r2 Diagnostics, South Bend, IN) em diversos instantes, antes, durante e após as experiências.

[213] aPTT in vitro. Manteve-se a incubar diversas concentrações de 076D-M007-H04 em plasma durante 10 minutos, antes do início do ensaio de aPTT. Tal como apresentado na figura 20, os tempos de coagulação de aPTT foram determinados em amostras de plasma colhidas a partir de babuínos no pré-instante, isto é, antes de ser administrado qualquer tratamento. Os resultados mostram que o 076D-M007-H04 foi anticoagulante em plasma em todos os 6 babuínos da experiência, utilizados nos estudos de trombose.

[214] Estudos de coagulação in vivo. Foram utilizados três babuínos nestes estudos: a dois babuínos foi administrado uma dose de 076D-M007-H04 (2,5 mg/kg H04, ampola i.v.), após terem recebido uma aspirina mastigável de 32 mg/kg e a 1 babuíno foi administrada uma dose de 0,5 mg/kg de 076D-M007-H04 (ampola i.v.) seguida por uma dose de 2 mg/kg, decorridas 24 horas (ampola i.v.). Mediu-se o ACT (figura 21 e figura 22) e o aPTT (figura 23 e figura 24) em diversos instantes após a administração.

Deposição de plaquetas durante experiências com desvios

[215] Experiências de oclusão por trombos. O dispositivo trombogénico utilizado para avaliar se o tratamento com 076D-M007- H04 pode prevenir a oclusão de vasos sanguíneos pequenos ou prolongar o tempo de oclusão consistia num enxerto revestido com colagénio com um comprimento de 20 mm e um d.i. de 2 mm.

[216] Tal como apresentado na figura 25, a deposição de plaquetas é apresentada durante 60 minutos ou até ao instante de oclusão do enxerto, quando aplicável. 12/14 dos dispositivos de controlo sofreram oclusão nos 60 minutos, ao passo que 2/5 dos dispositivos com 076D-M007-H04 (0,5 mg/kg) e 2/5 dos dispositivos com 076D-M007-H04 (0,5 mg/kg + 2 mg/kg) sofreram oclusão. Os dados são apresentados como média ± EPM.

[217] Experiências de prevenção de trombose. O dispositivo trombogénico utilizado para avaliar o efeito de 076D-M007-H04 sobre o início e a propagação de trombos consistia num enxerto ePTFE revestido com colagénio com um comprimento de 20 mm e um d.i. de 4 mm seguido por uma câmara de borracha de silicone com um comprimento de 20 mm e um d.i. de 9 mm. O declive da deposição de plaquetas, tal como apresentado na figura 26, constitui uma indicação da actividade antiplaquetas. Ambas as doses de 076D-M007-H04 (0,5 mg/kg e 0,5 mg/kg seguida por 2 mg/kg, 24 horas mais tarde) demonstraram eficácia, conforme evidenciado pela redução nas taxas de deposição de plaquetas nos diversos instantes desde o início da formação de trombos. Os dados foram normalizados para contabilizar as variações de contagens de plaquetas entre experiências. Os dados são apresentados como média ± EPM.

[218] Tal como apresentado na figura 27, ambas as doses de 076D-M007-H04 (0,5 mg/kg e 0,5 mg/kg seguida por 2 mg/kg, 24 horas mais tarde) demonstraram eficácia, conforme evidenciado pela redução acentuada nas taxas de deposição de plaquetas na câmara de silicone nos diversos instantes desde o início da formação de trombos. Os dados são apresentados como média ± EPM.

[219] Complexos de trombina/anti-trombina. Visto que a inibição de FXI pode reduzir a formação de trombos in vivo tanto por limitação da activação de plaquetas mediada por trombina e formação de fibrina como por aumento da trombólise, mediu-se os níveis de trombina/anti- trombina (TAT) utilizando um estojo ELISA comercialmente disponível. Tal com apresentado na figura 28, o pré-tratamento de babuínos com 076D-M007-H04 (0,5 mg/kg e 0,5 mg/kg seguida por 2 mg/kg, 24 horas mais tarde) preveniu o aumento nos níveis de TAT, o que implica uma redução acentuada na geração de trombina na ausência de actividade de FXIa.

[220] Tempos de hemorragia. Avaliou-se a hemóstase primária utilizando o dispositivo Surgicutt para adultos (http://www.itcmed/com/products/surgicutt-bleeding-time-device), o qual foi aprovado pelo FDA para utilização em crianças e em adultos. Registou-se manualmente o tempo de hemorragia (BT). Observou-se a ferida quando a uma nova hemorragia durante 30 minutos e avaliou- se a pela quando a contusões, petéquias, hematomas e derrames, no dia seguinte. Uma ou mais destas avaliações de hemostase demonstraram ser sensíveis e capazes de prever os efeitos anti- hemostáticos de praticamente todos os agentes antitrombóticos comercializados (fármacos antiplaquetas, anticoagulantes, trombolíticos).

[221] Aos babuínos administrou-se 076D-M007-H04 (0,5 mg/kg e 0,5 mg/kg seguida por 2 mg/kg, 24 horas mais tarde) por si só ou após terem recebido uma aspira mastigável (ASA, 32 mg/kg). Tal como apresentado na figura 29, não se observou um aumento no tempo de hemorragia com qualquer um dos tratamentos com 076D-M007-H04 em comparação com o nível de base. A administração de 076D-M007- H04 a animais tratados com aspirina não pareceu aumentar mais o tempo de hemorragia em comparação com o tratamento com aspirina por si só.

Claims (9)

1. Anticorpo monoclonal humano capaz de se ligar ao Fator XIa e seu fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO: 19 para a sequência de aminoácidos para o domínio variável da cadeia leve e a SEQ ID NO: 20 para a sequência de aminoácidos para o domínio variável da cadeia pesada.

2. Anticorpo monoclonal humano capaz de se ligar ao Fator XIa e seu fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende como CDRH1 a SEQ ID NO: 21, como CDRH2 a SEQ ID NO: 22 e como CDRH3 a SEQ ID NO: 23 e como CDRL1 a SEQ ID NO: 24, como CDRL2 a SEQ ID NO: 25 e como CDRL3 a SEQ ID NO: 26.

3. Anticorpo monoclonal humano capaz de se ligar ao Fator XIa e seu fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO: 27 para a sequência de aminoácidos para o domínio variável da cadeia leve e a SEQ ID NO: 20 para a sequência de aminoácidos para o domínio variável da cadeia pesada.

4. Anticorpo monoclonal humano capaz de se ligar ao Fator XIa e seu fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende como CDRH1 a SEQ ID NO: 21, como CDRH2 a SEQ ID NO: 22 e como CDRH3 a SEQ ID NO: 23 e como CDRL1 a SEQ ID NO: 24, como CDRL2 a SEQ ID NO: 25 e como CDRL3 a SEQ ID NO: 28

5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Medicamento, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

7. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

8. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 7.

9. Uso de anticorpos monoclonais humanos capazes de se ligarem ao fator de coagulação XIa, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição farmacêutica para inibir a agregação de plaquetas e, por tal motivo, inibir tromboses sem comprometer a hemostase.

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