TWI644925B

TWI644925B - 可結合至凝血因子ＸＩ及／或其活化型式因子ＸＩａ的抗體及其用途

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Publication number: TWI644925B
Application number: TW106143305A
Authority: TW
Inventors: 安德莉亞斯衛爾曼; 朱麗亞施特臘斯堡格; 弗蘭克迪特默; 邁克爾施特雷拉特; 安佳布赫米勒; 喬安娜古魯辛斯卡格貝爾; 莉卡達芬納恩; 瑪蒂娜謝弗爾; 克里斯多夫傑茲; 漢娜喬莉森; 板倉亞沙子; 梁蘊慧; 艾瑞克塔克
Original assignee: 德商拜耳製藥股份有限公司
Priority date: 2012-05-10
Filing date: 2013-05-09
Publication date: 2018-12-21
Also published as: SI2847228T1; HUE040580T2; KR102060376B1; JP2018148920A; AU2013258043A1; PL2847228T3; KR20150008166A; US20180112009A1; ZA201407784B; WO2013167669A1; SG10201609322QA; US20180051093A1; CN104684932B; SG11201406719UA; TW201400504A; AU2013258043B2; BR112014027952A2; HRP20181680T1; JP2015517305A; IL235238B

Abstract

本發明係關於能與凝血因子XI及/或其活化型式XIa因子結合之抗體及其用途，特別是用作抑制血小板凝集及藉此抑制血栓形成之方法。

Description

可結合至凝血因子XI及/或其活化型式因子XIa的抗體及其用途

在1964年Macfarlane和Davie & Ratnoff[Macfarlane RG.An enzyme cascade in the blood clotting mechanism,and its function as a biochemical amplifier.Nature 1964；202：498-9.；Davie EW,Ratnoff OD.Waterfall sequence for intrinsic blood clotting.Science 1964；145：1310-2.]導入其血液凝集之過程的聯集假說(cascade hypotheses)。從那時起，開啟了我們對活體內擬血功能之認知。在最近幾年，已修改二種不同路徑之理論，所謂的外部和內部途徑，以共同的路徑啟動凝血和匯集，最後導致凝血酶產生和纖維蛋白沉積。在目前的模型中，當血漿蛋白酶活化因子VII與組織因子(TF)接觸並藉此形成複合物時，啟動凝血發生。此組織因子-FVIIa複合物可活化FX酶原變成其活化形式FXa，就此部分，將凝血酶原(凝血因子II)轉變為凝血酶(IIa)。凝血酶，凝血之關鍵成員，轉而可催化纖維蛋白原轉變成纖維蛋白。此外，凝血酶活化由血小板所表現的專一受體，其導致血小板之活化。活化的血小板與纖維蛋白組合為血塊形成所必須，且因此為正常止血之基本成員。

第二增幅路徑係由凝血因子XI(FXI)所形成。FXI，如同凝血聯集之其他成員，為一血漿絲胺酸蛋白酶酶原，為活體內橋接血液凝集之起使期和增幅期之關鍵角色，已被完全確認[Davie EW,Fujikawa K,Kisiel W.The coagulation cascade：initiation,maintenance,and regulation.Biochemistry 1991；30：10363-70；Gailani D,Broze Jr GJ.Factor XI activation in a revised model of blood coagulation.Science 1991；253：909-12；Kravtsov DV,Matafonov A,Tucker EI,Sun MF,Walsh PN,Gruber A，等人Factor XI contributes to thrombin generation in the absence of factor XII.Blood 2009；114：452-8.3-5]。FXI缺乏通常不會導致自發性出血，但與帶有止血挑戰的出血風險增加有關，而出血的嚴重性與血漿FXI的量之相關性低。人類中嚴重的FXI缺乏具有特定避免血栓疾病之保護效應[Salomon O,Steinberg DM,Zucker M,Varon D,Zivelin A,Seligshon U.Patients with severe factor XI deficiency have a reduced incidence of deep-vein thrombosis.Thromb Haemost 2011；105：269-73；Salomon O,Steinberg DM,Koren-Morag N,Tanne D,Seligsohn U.Reduced incidence of ischemic stroke in patients with severe factor XI deficiency.Blood 2008；111：4113-7]。又，高量的FXI係與血栓事件有關[Meijers JC,Tekelenburg WL,Bouma BN,Bertina RM,Rosendaal FR.High levels of coagulation factor XI as a risk factor for venous thrombosis.N Engl J Med 2000；342：696-701]。抑制FXI因此已被提出為開發新的抗血栓藥，達到改善的利益-風險比例之新穎方法。因此，對於在無減弱止血作用下，有效地阻斷血管內血栓形成之抗血栓劑、抗血小板藥物仍有高度的醫療需求。

在最近幾年，開發新穎的抗血栓劑已有很大的進展；然而，由這些藥劑所造成的不欲出血事件仍為嚴重的問題。因此，尚需找出能理想上抑制血栓形成但避開止血作用之最佳的抗血栓化合物。

凝血因子XI(FXI/FXIa)與血小板受體apoER2相互作用。本發明係第一次展現在剪切流條件下，抑制FXI/FXIa活性干擾病理性血小板活化及血小板堆積之過程。在一活體外血栓模型中，在全血中於生理液流條件下在膠原蛋白上，抑制FXI/FXIa導致血小板活化標誌物如CD62P減少，以及下游微聚集體減少。因此，在一靈長類血小板依賴的動脈型血栓形成模型中，抑制FXIa，降低了血小板沉積，而無危及血小板-依賴的初級止血。儘管有所宣稱的抗血小板效應，但血小板與組織因子依賴的初級止血栓形成所需之血管外基質蛋白的最初相互作用，令人驚訝地並不受影響。因此，抑制FXI/FXIa活性代表一在無造成出血相關的副作用下，展現抗血栓活性之理想的藥理學原理。就澄清上：無危及止血作用係指，抑制凝血因子XI及/或XIa並不會導致不欲的和可測量出血事件，即使在其他抗凝血化合物及/或抗血小板化合物之存在下。如血友病C型病患所示，出血僅在密集的手術及/或嚴重受傷的情況下發生。

提供組成物和方法來顯示針對凝血因子XI其酶原形式及/或活性形式凝血酶原XIa之抗體或其抗原-結合片段或其變體，係藉由抑制或降低血小板聚集及藉此抑制和降低微聚集體及/或血栓，展現抗血小板活性。

使用這些本發明之抗凝血因子XI抗體及/或抗凝血因子XIa抗體、抗原-結合抗體片段以及抗體和片段之變體，在無危及止血下，抑制血小板聚集並藉此抑制血栓形成。

文中亦描述，投予抗凝血因子XI抗體及/或抗凝血因子XIa抗體係中和抗體，且這些本發明之抗體、抗原-結合抗體片段及抗體及片段之變體，為了作為阻凝劑，抗血栓治療並不會導致不欲的出血事件風險增加。

本發明係提供能選擇性與血漿因子XI之活化形式FXIa結合之人類單株抗體，並在無危及止血下藉此抑制血小板聚集和相關血栓形成。組成物係包括抗凝血因子XI抗體及/或抗凝血因子XIa抗體，其能與凝血因子XI重鏈及/或凝血因子XIa輕鏈之定義表位結合。這些抗體係藉由或/及阻斷凝血因子XIa之蛋白分解活性及/或藉由抑制凝血因子XI轉變為其活化形式，凝血因子XIa經由凝血因子FXIIa及/或凝血酶，展現中和活性。在一較佳的實施例中，本發明進一步係包括抗體對來自其他非人類物種，主要來自兔子之凝血因子XI及/或XIa的交叉反應性，得以進行深入的藥理學和毒理學分析。

在另外較佳的實施例中，係使用方法來最適化和降低本發明組成物之免疫原性，以降低抗-藥物抗體發生之風險。

本發明進一步係包括與一文中所述的抗體競爭之人類抗體。

此外，組成物係包括本發明之抗原-結合抗體片段及抗體和片段之變體，產生這些抗體的細胞株，及編碼這些抗體之胺基酸的分離核酸。本發明亦包括於醫藥上可接受的載體及/或溶劑中包含本發明之抗凝血因子XI及/或抗凝血因子XIa抗體，或抗原-結合抗體片段及抗體和片段之變體的醫藥組成物。

本發明之方法係包括將上述之組合物投予一需要抑制血小板凝集為目的之對象，並藉此抑制血栓形成，降低任何其他用於治療血栓之阻凝劑或抗血栓劑所需的劑量，治療急性發炎反應，或治療癌症，或治療任何其他與凝血聯集之活化有關的疾病。

亦提供產生本發明之抗凝血因子XI及/或抗-FXIa抗體，或抗原-結合抗體片段及抗體和片段之變體的方法。

本發明之詳細描述 定義

止血：術語止血分別代表阻止受傷位置之血流和在傷口癒合期間恢復血管暢通之主要機制。在正常的止血和病理性血栓形成期間，三種機制同時活化：初級止血係指活化的血小板與血管壁之交互作用，形成纖維蛋白，及稱為纖維蛋白溶解之過程[Arthur A.Sasahara,Joseph Loscalzo(2002)New Therapeutic Agents for Thrombosis and Thrombolysis(2nd Edition)Marcel Dekker Inc.New York,NY,ISBN 0-8247-0795-8]。

凝血和凝血聯集：以蛋白為基礎的系統稱為凝血聯集，係用來穩定已形成的血塊及進一步封閉傷口。凝血途徑為一蛋白分解聯集。途徑之各酵素係以酶原(非活化形式)存在血漿中，其因活化經過蛋白分解性裂解而從前驅分子釋放活性因子。凝血聯集係以一連串控制活化過程之正和負回饋環運作。此途徑最終的目標係產生凝血酶，其然後可將可溶性纖維蛋白原轉變成纖維蛋白，形成血塊。產生凝血酶之過程可分成三個階段：內源性和外源性路徑，其係提供產生活性凝固因子：FXa(活化的因子-X)之替代路徑，及使凝血酶形成之最終的共同途徑[Hoffman M.M.and Monroe D.M.(2005)Rethinking the coagulation cascade.Curr Hematol Rep.4：391-396；Johne J,Blume C,Benz PM,Pozgajová M,Ullrich M,Schuh K,Nieswandt B,Walter U,Renné T.(2006)Platelets promote caogulation XII-mediated proteolytic cascade systems in plasma.Biol Chem.387：173-178]。

血小板聚集：當血管發生破裂時，一般不會直接與血液接觸的物質暴露出。這些物質(主要為膠原蛋白和溫偉伯氏因子(von Willebrand factor))使血小板得以黏附破裂的表面。一旦血小板與表面黏附，其釋放吸引另外的血小板至損傷區域的化學物，稱為血小板凝集。這二個過程為停止出血之第一反應。

凝血因子XI及凝血因子XIa

凝血因子XI(FXI)係在肝臟中和成並以與高分子量激肽原(Kininogen)複合之雙硫鍵連接的二聚體循環於血漿中。此二聚體之各多肽鏈約為80kD。酶原XI因子，係經由血液凝固之接觸面或經由血小板表面上凝血酶媒介的活化作用，轉變成其活化形式，凝血因子XIa(FXIa)。在XI因子的活化期間，在各二鏈中的內部胜肽鍵裂開，產生活化的XIa因子，一種由二條重鏈和二條輕鏈以雙硫鍵連在一起所組成之絲胺酸蛋白酶。絲胺酸蛋白酶FXIa將凝血因子IX轉變成IXa，其隨後活化凝血因子X(Xa)。然後Xa可媒介凝血因子II/凝血酶活化。缺乏此因子導致羅森索症候群(亦稱為C型血友病)，一種血液凝固異常，特徵為因受傷而出血時間長、頻繁或重度流鼻血、尿中有血絲及女性月經出血量大。如文中所用，「凝血因子XI」，「XI因子」或「FXI」係指表現此蛋白之來自任何哺乳動物物種的任何FXI。例如，FXI可為人類、非人類靈長類(例如狒狒)、小鼠、狗、貓、牛、馬、豬、兔及任何其他物種，具有涉及調節血流、凝固及/和血栓形成之凝血因子XI。

藉由凝血因子XIIa活化凝血因子XI之裂解位置在各多肽鏈中為一介於Arg-369和Ile-370間之內胜肽鍵[Fujikawa K,Chung DW,Hendrickson LE,Davie EW.(1986)Amino acid sequence of human factor XI,a blood coagulation factor with four tandem repeats that are highly homologous with plasma prekallikrein.Biochemistry 25：2417-2424]。凝血因子XIa之各重鏈(369個胺基酸)含有四個90-91個胺基酸之銜接重複體稱為蘋果區(稱為A1-A4)加上短連接胜肽[Fujikawa K,Chung DW,Hendrickson LE,Davie EW.(1986)Amino acid sequence of human factor XI,a blood coagulation factor with four tandem repeats that are highly homologous with plasma prekallikrein.Biochemistry 25：2417-2424；Sun MF,Zhao M,Gailani D.(1999)Identification of amino acids in the factor XI apple 3 domain required for activation of factor IX.J Biol Chem.274：36373-36378]。凝血因子XIa的輕鏈(各238個胺基酸)含有酵素之催化部份，帶有絲胺酸蛋白酶之典型胰蛋白酶家族的序列[Fujikawa K,Chung DW,Hendrickson LE,Davie EW.(1986)Amino acid sequence of human factor XI,a blood coagulation factor with four tandem repeats that are highly homologous with plasma prekallikrein.Biochemistry 25：2417-2424]。活化的XIa因子藉由活化IX因子引發內源性血液凝固途徑之中期。

保守胺基酸變體

可製造保存如文中所述之抗體胜肽序列的整個分子結構之胜肽變體。給予的個別胺基酸之特性，某些合理的取代係由熟習技術者來辨認。可進行胺基酸取代，亦即「保守取代」，例如以涉及的殘基之極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性及/或雙親性的類似度為基礎。

例如，(a)非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和甲硫胺酸；(b)極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸及麩醯胺酸；(c)正電荷(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸和組胺酸；及(d)負電荷(酸性)胺基酸包括天門冬胺酸和麩胺酸。取代典型地係在(a)-(d)基團內進行。此外，甘胺酸和脯胺酸可以其破壞α-螺旋之能力為基礎相互取代。同樣地，特定的胺基酸，例如丙胺酸、半胱胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、組胺酸及離胺酸係更常於α-螺旋中發現，而纈胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸及蘇胺酸更常於β-摺板中發現。依次常見的有甘胺酸、絲胺酸、天門冬胺酸、天門冬醯胺和脯胺酸。某些較佳的取代可在下列基團間進行：(i)S和T；(ii)P和G；及(iii)A、V、L和I。給予已知的基因碼及重組和合成的DNA技術，熟習技術之科學家可容易地建構編碼保守胺基酸變體之DNA。

如文中所用，二個多肽序列間之「序列一致性」係指序列間相同胺基酸之百分比。「序列同源性」係指相同或代表保守胺基酸取代的胺基酸百分比。較佳的本發明之多肽序列係具有至少60%，更佳的至少70%或80%，又更佳的至少90%及最佳的至少95%之CDR區的序列一致性。較佳的抗體亦具有至少80%，更佳的至少90%及最佳的至少95%之CDR區的序列同源性。

本發明之DNA分子

本發明亦關於編碼本發明抗體之DNA分子。這些序列包括(但不限於)該等SEQ ID NO 1至18中所述之DNA分子。

本發明之DNA分子不限於文中所揭示的序列，但亦包括其變體。本發明中的DNA變體可參照其雜交中之物理性質來描述。熟習技術者應了解，因為DNA為雙股的，使用核酸雜交技術，DNA可用於辨識其補體及其同等物或同源物。又應了解，雜交可以低於100%互補性來進行。然而，給予適當的條件選擇，以其與特定探針之結構相關性為基準，雜交技術可用於辨別DNA序列。就有關此等條件之指南，請參見Sambrook等人，1989[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning：A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA)]和Ausubel等人，1995[Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,& Struhl,K.eds.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York：John Wiley and Sons]。

二種聚核苷酸序列間之結構相似性可以二種序列相互雜交之條件的「嚴格性」功能來表示。如文中所用，術語「嚴格性」係指條件不利雜交之程度。嚴格的條件強烈不利於雜交，且在此等條件下僅結構上最相關的分子可相互雜交。相反地，非嚴格條件有利於具有較低程度之結構相關性的分子雜交。雜交嚴格性，因此係直接與二個核酸序列之結構關係相關。下列關係可用於聯繫雜交和相關性之關係(其中T_m為核酸雙鏈之熔化溫度)：a. T_m=69.3+0.41(G+C)%

每增加1%錯配鹼基對數目，降低1℃之雙股DNA的T_m。

c. (T_m)_μ2-(T_m)_μ1=18.5 log₁₀μ2/μ1

其中μ1和μ2為二種溶液之離子強度。

雜交嚴格性取決於許多因素，包括整個DNA濃度、離子強度、溫度、探針大小和破壞氫鍵之試劑的存在。促進雜交的因素包括高DNA濃度、高離子強度、低溫、較長探針和無破壞氫鍵之試劑的存在。雜交典型地係以二階段來進行：「結合」階段和「沖洗」階段。

首先，在結合階段，探針係於有利於雜交的條件下與標靶結合。嚴格性通常係在此階段藉由改變溫度來控制。就高嚴格性而言，溫度通常係介於65℃至70℃，除非是使用短的(<20nt)寡核苷探針。一代表性的雜交溶液包括6x SSC、0.5% SDS、5x Denhardt's溶液和100μg非專一性載體DNA[參見15]。當然，許多不同的、功能上同等物、緩衝條件已為所知。當相關程度較低時，可選擇較低的溫度。低嚴格性結合溫度係介於約25℃和40℃間。中度嚴格性係介於至少約40℃至低於約65℃間。高嚴格性為至少65℃。

第二，藉由沖洗將過量的探針移除。在此階段通常應用較嚴格的條件。因此，此「沖洗」階段在經由雜交測定相關性為最重要的。沖洗溶液典型地係含有較低的鹽濃度。一示例的中度嚴格性溶液係含有2X SSC和0.1% SDS。高嚴格性沖洗溶液含有低於約0.2X SSC之同等物(就離子強度)，其中較佳的嚴格溶液係含有約O.1X SSC。與各種嚴格性有關的溫度係與上文就「結合」所論述的相同。沖洗溶液典型地在沖洗期間亦可置換多次。例如，典型的高嚴格性沖洗條件係包括於55℃沖洗二次歷時30分鐘和於60℃沖洗三次歷時15分鐘。

因此，本發明之主體為編碼本發明抗體及/或抗原-結合片段之分離的核酸序列。本發明另外的實施例為上述所提之編碼本發明抗體的分離核酸序列。因此，本發明包括於高嚴格性結合和沖洗條件下與所述分子雜交之核酸分子，其中此核酸分子係編碼具有如文中所述之性質的抗體或其功能性片段。較佳的分子(就mRNA觀點)為該等與其中一個文中所述的DNA分子具有至少75%或80%(較佳地至少85%，更佳地至少90%及最佳地至少95%)序列一致性。此DNA係為降低或抑制凝血因子XI轉變成其活化形式XIa因子及/或直接阻斷凝血因子XIa催化活性之分子編碼。

重組的DNA結構和表現

本發明進一步係提供包括一或多個本發明核苷酸序列之重組的DNA結構。本發明之重組的結構係與一載體，例如質體、噬粒、噬菌體或病毒載體聯合使用，將編碼本發明抗體之DNA分子插入其中。

此編碼的基因可由Sambrook等人，1989，和Ausubel等人，1989中所述的技術來製造[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning：A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA；Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,& Struhl,K.eds.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York：John Wiley and Sons]。另外，DNA序列可使用例如合成劑以化學合成。參見，例如OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS中所描述的技術[Gait,M.J.(1984)"An introduction to modern methods of DNA Synthesis" In Oligonucleotide Synthesis a Practical Approach.Ed.M.J.Gait,IRL Press Oxford UK]，其全文係以引用的方式併入本文中。本領域之專家能將編碼此可變區的DNA與編碼各種人類IgG同型或其衍生物的恆定區之基因片段(突變或非突變)融合。其能應用重組的DNA技術，使用連接子例如含三倍甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-絲胺酸之15個胺基酸長度，用以將二個可變區融合成單一鏈模式。本發明之重組的結構係包括能表現RNA及/或該編碼DNA之蛋白產物的表現載體。載體可進一步包括調節序列，包括操作上連接閱讀框(ORF)之啟動子。載體可進一步包括一可選擇的標記序列。對於有效的轉譯插入的標靶基因編碼序列，特定的開始和細菌分泌訊號可能亦為需要的。

本發明進一步係提供含有至少一種本發明DNA之宿主細胞。此宿主細胞實質上可為對表現載體為可用的任何細胞。其可為，例如，較高等的真核宿主細胞，例如哺乳動物細胞，較低等的真核宿主細胞，例如酵母細胞，且可為原核細胞，例如細菌細胞。將重組結構導入宿主細胞可以磷酸鈣轉染、DEAE、聚葡糖媒介的轉染、電穿孔或噬菌體感染來進行。

細菌表現

供細菌使用之有用的表現載體可藉由插入一編碼所欲蛋白之結構DNA與適合的轉譯起始和終結訊號共同於可操作閱讀階段，以功能性啟動子來建構。此載體將包括一或多個表型可選擇的標記和一複製源以確保此載體且，若需要，提供宿主內增幅。適合用於轉化的原核宿主包括大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)和鏈黴菌屬(Streptomyces)之菌種。

細菌載體可為，例如細菌噬菌體、質體或噬粒。這些載體可含有可選擇的標記和衍生自市售質體典型含有熟知的選殖載體pBR322(ATCC 37017)之元素的細菌複製源。在轉化適合的宿主菌株和使宿主菌株生長至適合的細胞密度後，將選擇的啟動子以適合的方法(例如溫度變換或化學引發)去阻抑/啟動，並將細胞培養一段額外的時間。典型地係以離心收取細胞，以物理和化學方法破壞細胞並將所生成粗萃取物留下供進一步純化。

在細菌系統中，依照希望用於所欲表現的蛋白，可有利地選擇許多表現載體。例如，當產生大量的此蛋白時，就產生抗體或篩選胜肽庫而言，例如針對已純化的高量融合蛋白產物之表現的載體，可能為所欲的。

因此，本發明之目標為包括編碼本發明新穎抗體之核酸序列的表現載體。

哺乳動物表現和蛋白純化

較佳的哺乳動物宿主細胞表現之調節序列包括針對哺乳動物中高量蛋白表現之病毒元素，例如衍生自下列之啟動子及/或增強子：巨病毒(CMV)(例如CMV啟動子/增強子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒。病毒調控元素及其序列之進一步的描述[參見Stinski之U.S.5,168,062；Bell等人之U.S.4,510,245；Schaffner等人之U.S.4,968,615]。重組的表現載體亦可包括複製源和可選擇標記[參見Bell等人之U.S.4,510,245；Schaffner等人之U.S.4,968,615；Axel等人之U.S.4,399,216,]。適合的可選擇標記包括給予抗藥物例如G418，潮黴素(hygromycin)或甲胺蝶呤(methotrexate)抗性之基因，於導入載體的宿主細胞上。例如，二氫葉酸還原酶(DHFR)基因給予對甲胺蝶呤之抗性而neo基因則給予對G418之抗性。

將表現載體轉染至宿主細胞可使用標準技術例如電穿孔、磷酸鈣沉澱和DEAE-聚葡糖轉染來進行。

適合用於文中所提供的表現抗體、抗原結合部分或其衍生物之哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)[包括dhfr-CHO細胞，描述於[Axel等人之U.S.4,634,665]，使用DHFR選擇性標記，例如描述於[Axel等人之U.S.5,179,017]，NSO骨髓瘤細胞，COS細胞和SP2細胞。在某些實施例中，表現載體係以表現蛋白分泌至宿主細胞生長的培養基中來設計。抗體、抗原結合部分或其衍生物可使用標準蛋白純化法從培養基中回收。

本發明之抗體或其抗原-結合片段可從藉由熟知方法，包括(但不限於)硫酸銨或乙醇沉澱、酸萃取、A蛋白層析、G蛋白層析、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性交互作用層析、親和性層析、羥磷灰石層析和凝集素層析，從重組的細胞培養回收和純化。亦可使用高效液相層析(“HPLC”)來純化[參見Urlaub G,Chasin LA.(1980)Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity.Proc Natl Acad Sci U S A.77：4216-4220；例如第1,4,6,8,9,10章，各章全文係以引用的方式併入本文中]。本發明之抗體或其抗原-結合片段包括天然純化的產物，化學合成製程之產物和以重組技術由真核宿主，包括例如酵母菌、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞所製造的產物。依照重組生產製程中所用的宿主，本發明之抗體可糖基化或可非-糖基化。此等方法係描述於許多標準的實驗室手冊中[參見Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning：A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA)；Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,& Struhl,K.eds.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York：John Wiley and Sons，第10,12,13,16,18和20章]。因此，本發明之目標亦為包括載體或核酸分子之宿主細胞，據此宿主細胞可為較高等真核宿主細胞，例如哺乳動物、較低等真核宿主細胞，例如酵母細胞，且可為原核細胞，例如細菌細胞。

本發明另外的目標為使用宿主細胞製造抗體和抗原結合片段之方法，其包括於適合的條件下培養宿主細胞及回收該抗體。

因此，本發明之目標為以本發明宿主細胞所製造的005-C04抗體並純化到至少95%重量比之同質性。

親和力

「親和力」或「結合親和力」K_D通常係以平衡結合常數(ka)和平衡解離常數(kd)所測量並計算kd對ka之商數(K_D=kd/ka)。術語「免疫專一」或「專一結合」係指抗體與凝血因子XI及/或其活化形式凝血因子XIa，以低於或等於10^-6M之K_D親和力結合(單價親和力)。術語「高親和力」係指抗體與凝血因子XI及/或其活化形式凝血因子XIa，以低於或等於10^-7M之K_D親和力結合(單價親和力)。相較於其他不相關的分子，抗體可實質上對目標抗原具有較大的親和力。相較於同源物，抗體亦可實質上對目標抗原具有較大的親和力，例如至少1.5-倍、2-倍、5-倍、10-倍、100-倍、10^-3-倍、10^-4-倍、10^-5-倍、10^-6-倍，或對目標抗原具較大的相對親和力。此親和力可容易地使用習用技術來測定，例如以平衡解析；藉由使用BIAcore 2000儀器，使用製造商所概述的通用程序；藉由免疫分析使用放射線標定的標靶抗原；或以熟習技術者已知的另外的方法。親和力數據可例如以[Kaufman RJ,Sharp PA.(1982)Amplification and expression of sequences cotransfected with a modular dihydrofolate reductase complementary and gene.J Mol Biol.159：601-621]中所述的方法來分析。

抗體

如文中所用，「抗體阻斷凝血因子FXI及/或其活化形式凝血因子XIa」係指FXI及/或FXIa被本發明之抗體阻斷，導致完全或部分抑制凝血因子FXI及/或FXIa活性。胺基酸序列包括(但不限於)該等SEQ ID NO 19至36中所述之DNA分子。

「抗體」係以其最廣泛的定義來使用並包括全組裝抗體、單株抗體、多株抗體、多專一性抗體(例如雙專一性抗體)、可與抗原結合之抗體片段(例如Fab'、F'(ab)2、Fv、單鏈抗體、雙抗體)、駱駝抗體和包括前述物只要具有所欲生物活型之重組胜肽。抗體可在其重鏈上帶有不同的恆定區(Fc區)，較佳地係衍生自IgG1、IgG2或IgG4同型(參見下文)。可導入效應子功能修飾之突變。在與補體蛋白C1q和Fc受體相互作用中扮演主要角色之Fc-區中的胺基酸殘基已鑑別出且影響效應子功能的突變已有描述[請參見Colligan,Current Protocols in Immunology,or Current Protocols in Protein Science,John Wiley & Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)]。特言之，IgG1之去糖基化可藉由在297胺基酸位置將天門冬醯胺酸突變成丙胺酸，或將天門冬醯胺酸突變成麩醯胺酸來進行，其根據報告係消除抗體衍生之細胞媒介的細胞毒性(ADCC)[Labrijn AF,Aalberse RC,Schuurman J.(2008)When binding is enough：nonactivating antibody formats.Curr Opin Immunol.20：479-485]。在位置322以丙胺酸取代離胺酸會使ADCC降低及移除補體衍生的細胞毒性(CDC)，而同時將位置234和235的二個白胺酸以丙胺酸取代，則會避開ADCC和CDC[Sazinsky SL,Ott RG,Silver NW,Tidor B,Ravetch JV,Wittrup KD.(2008)Aglycosylated immunoglobulin G1 variants productively engage activating Fc receptors.Proc Natl Acad Sci U S A.105：20167-20172]。為了在活體內應用IgG4同型作為二價治療劑，可導入一修飾，例如「核心絞鏈區」之絲胺酸-對-脯胺酸交換[Schuurman J,Van Ree R,Perdok GJ,Van Doorn HR,Tan KY,Aalberse RC.(1999)Normal human immunoglobulin G4 is bispecific：it has two different antigen-combining sites.Immunology.97：693-698]。人類IgG2分子形成異源性共價二聚體之傾向可藉由將其中一個位置127、232和233的半胱胺酸交換成絲胺酸來規避[Simmons LC,Reilly D,Klimowski L,Raju TS,Meng G,Sims P,Hong K,Shields RL,Damico LA,Rancatore P,Yansura DG.(2002)Expression of full-length immunoglobulins in Escherichia coli：rapid and efficient production of aglycosylated antibodies.J Immunol Methods.263：133-147]。一效應子功能減低之替代模式可為衍生自IgG2帶有四個IgG4-專一性胺基酸殘基改變之IgG2m4模式[Hezareh M,Hessell AJ,Jensen RC,van de Winkel JG,Parren PW.(2001)Effector function activities of a panel of mutants of a broadly neutralizing antibody against human immunodeficiency virus type 1.J Virol.75：12161-1218]。抗體片段可藉由重組的DNA技術或藉由全抗體之酵素性或化學性裂解來產生，且係進一部描述於下。單株抗體之非限定實例包括鼠科、嵌合、人源化、人類和人類工程^TM免疫球蛋白、抗體、具有衍生自免疫球蛋白之序列的嵌合融合蛋白或突變蛋白或其衍生物，其各自係進一部描述於下。亦涵蓋全分子之多聚體或聚集體及/或片段，包括化學衍生性抗體。

術語「單株抗體」如文中所用係指得自實質上同源抗體族群之抗體，例如包括族群相同(除了可能少量存在之可能的自然突變外)之個別抗體。單株抗體針對單一抗原位置具高度專一性。再則，相對於典型包括針對不同決定基(表位)之不同抗體的習知(多株)抗體製備物，各單株抗體係針對抗原的單一決定基。除了其專一性外，單株抗體就其係以同源性培養所合成而言，未被其他帶有不同專一性和特性之免疫球蛋白汙染，為有利的。

修飾劑「單株」係指抗體的特性係由實質上同源組群之抗體所得來，且不應理解為需要以任何特定方法製造此抗體。例如，所用的單株抗體可藉由Kohler等人首先描述的雜交瘤法來製造[Allen MJ,Guo A,Martinez T,Han M,Flynn GC,Wypych J,Liu YD,Shen WD,Dillon TM,Vezina C,Balland A.(2009)Interchain disulfide bonding in human IgG2 antibodies probed by site-directed mutagenesis.Biochemistry.48：3755-3766]或可藉由重組DNA法來製造[參見An Z,Forrest G,Moore R,Cukan M,Haytko P,Huang L,Vitelli S,Zhao JZ,Lu P,Hua J,Gibson CR,Harvey BR,Montgomery D,Zaller D,Wang F,Strohl W.(2009)IgG2m4,an engineered antibody isotype with reduced Fc function.MAbs.1：572-579]。「單株抗體」亦可為，例如重組的、嵌合的、人源化、人類、人類工程^TM免疫球蛋白或抗體片段。

「免疫球蛋白」或「天然抗體」為四聚糖蛋白。在一天然生成的免疫球蛋白中，各四聚體係由二對相同的多肽鏈所組成，各對具有一「輕」鏈(約25kDa)和一「重」鏈(約50-70kDa)。各鏈的胺基-端部分包括約100至110個或更多胺基酸之「可變」區，主要係負責抗原辨識。各鏈的羰基-端部分為恆定區，主要係負責效應子功能。依照其重鏈恆定區的胺基酸序列，免疫球蛋白可分為不同種類。重鏈係分類為繆(μ)、德塔(△)、伽馬(γ)、阿爾法(α)和艾蒲賽龍(ε)並定義抗體的同型分別為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。其中數種可進一步分成亞類或同型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同的同型具有不同的效應子功能；例如，IgG1和IgG3同型通常具有ADCC活性。人類輕鏈係分類成卡帕(κ)和蘭布達(λ)輕鏈。在輕鏈和重鏈內，可變和恆定區係以約12或更多個胺基酸之「J」區相連接，其中重鏈亦包括約10個或更多胺基酸之「D」區[一般係參見Köhler G,Milstein C.(1975)Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.Nature.256：495-497]。

抗體/免疫球蛋白之「功能性片段」或「抗原-結合抗體片段」在此係定義為保留抗原-結合區之抗體/免疫球蛋白的片段(例如，IgG之可變區)。抗體之「抗原-結合區」典型地可在一或多個抗體的超變區內發現，亦及CDR-1、-2，及/或-3區；然而，可變「架構」區亦可在抗原結合上扮演一重要角色，例如藉由提供骨架給CDR。較佳地，「抗原-結合區」係包括可變輕(VL)鏈之4至103的胺基酸殘基和可變重(VH)鏈之5至109的胺基酸殘基，更佳地，VL之3至107的胺基酸殘基和VH之4至111的胺基酸殘基，特佳的為完整的VL和VH鏈[VL之1至109的胺基酸位置和VH之1至113的胺基酸殘基位置，而胺基酸位置之編號係根據Kabat資料庫[美國專利號碼：4,816,567]。用於本發明之一較佳的免疫球蛋白種類為IgG。

術語「超變」區係指負責抗原結合之抗體或功能性片段可變區VH和VL的胺基酸殘基。超變區包括來自「互補決定區」或CDR之胺基酸殘基[亦即，輕鏈可變區中的24-3(LCDR1)、50-56(LCDR2)和88-97(LCDR3)殘基和重鏈可變區中的29-36(HCDR1)、48-66(HCDR2)和93-102(HCDR3)殘基，及/或該等來自超變環之殘基[亦即，輕鏈可變區中的26-32(在LCDR1內)、50-52(在LCDR2內)和91-96(在LCDR3內)殘基和重鏈可變區中的26-32(在HCDR1內)、53-55(在HCDR2內)和96-101(在HCDR3內)殘基，如描述於[Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989)]中。

抗體片段之非限定實例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、區域抗體(dAb)、互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、單鏈抗體片段、雙抗體、三抗體、四抗體、微小抗體、線性抗體[Johnson G,Wu TT.(2000)Kabat database and its applications：30 years after the first variability plot.Nucleic Acids Res.28：214-218]；螯合重組抗體、三抗體或雙抗體、內抗體、奈米抗體、小模組免疫醫藥(SMIP)、抗原-結合區免疫球蛋白融合蛋白、駱駝化抗體、含VHH之抗體或突變蛋白或其衍生物，以及含至少一部分免疫球蛋白之多肽，其足以給予該多肽專一抗原結合，例如CDR序列，只要該抗體保留所欲的生物活性；及由抗體片段所形成之多專一性抗體[Chothia C,Lesk AM.(1987)Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins.J Mol Biol.196：901-917；Zapata G,Ridgway JB,Mordenti J,Osaka G,Wong WL,Bennett GL,Carter P.(1995)Engineering linear F(ab')2 fragments for efficient production in Escherichia coli and enhanced antiproliferative activity.Protein Eng.8：1057-1062]。「雙專一性」或「雙功能性」抗體以外的抗體，請了解係具有其各自相同的結合位置。F(ab’)₂或Fab可工程化以減少或完全移除發生在C_H1和C_L區域間分子的內雙硫鍵交互作用。木瓜酵素消化抗體，產生二個相同的抗原-結合片段，稱為「Fab」片段，各自帶有單一抗原-結合位，而殘基「Fc」片段，其名稱係反應其容易結晶化之能力。胃蛋白酶處理產生一F(ab')2片段，其具有二個「Fv」片段。「Fv」片段為含有完整抗原辨識和結合位置之最小抗體片段。此區域係由一重鏈和一輕鏈可變區之二聚體以緊密、非共價結合所組成。其係以此組態，各可變區之三個CDR交互作用在VH-VL二聚體表面定義一抗原結合位置。集體上，六個CDR給予該抗體抗原-結合專一性。然而，即使一單一可變區(或僅包括三個抗原專一性之CDR之半個Fv)係具有辨識和結合抗原之能力。

「單鏈Fv」或「sFv」或「scFv」抗體片段係包括抗體之 VH和VL區，其中這些區域係存在一單一多肽鏈中。

較佳地，Fv多肽進一步係包括VH和VL區之間的多肽連接子，其能使Fv形成供抗原結合之所欲的結構。就sFv之論述請參見[C.A.K Borrebaeck,editor(1995)antibody Engineering(Breakthroughs in Molecular Biology),Oxford University Press]。

Fab片段亦含有輕鏈的恆定區和重鏈的第一恆定區(CH1)。Fab片段與Fab'片段的差異在於在重鏈CH1區的羰基端加入一些殘基，包括一或多個來自抗體絞鏈區之半胱胺酸。Fab'-SH在文中係以Fab'其中恆定區的半胱胺酸殘基帶有一游離硫醇基所命名。F(ab')2抗體片段原本係以在其間具有絞鏈半胱胺酸之成對的Fab'片段。

「架構」或FR殘基為該等超變區殘基以外的可變區殘基。

「恆定區」一詞係指給予效應子功能之抗體分子的部分。

術語「突變蛋白」或「變體」可交換使用並係指在可變區或等同可變區部分中含有至少一胺基酸取代、刪除或插入之抗體的多肽序列，其限制條件為該突變蛋白或變體保留所欲的結合親和力或生物活性。

突變蛋白可與親代抗體實質上為同源的或實質上為相同的。

術語「衍生物」係指抗體係以此等技術如泛素化、與治療劑或診斷劑接合、標定(例如以放射性核素或各種酵素)、共價聚合連接例如聚乙二醇化(以聚乙二醇衍生)及藉由非天然胺基酸之化學合成插入或取代，共價修飾。

「人類」抗體或功能性人類抗體片段在此係定義為非嵌合或「人源化」，及非來自(全部或部分)非人類物種之抗體或片段。人類抗體或功能性抗體片段可衍生自人類之抗體或可為合成的人類抗體。「合成的人類抗體」係定義為具有，部分或整體，在矽中，衍生自合成序列之序列的抗體，其係以已知的人類抗體序列分析為基準。在矽中，可進行人類抗體序列或其片段之設計，例如藉由分析人類抗體或抗體片段序列並利用從其得來的資料設計多肽序列。人類抗體或功能性人類抗體片段之另外的實例為從人類來源之抗體序列庫分離出的核酸所編碼的抗體或片段(亦即此資料庫係以取自人類天然來源之抗體為基礎)。人類抗體之實例包括n-CoDeR-之抗體，如描述於[Kontermann R.和& Duebel S.,editors(2001)antibody Engineering(Springer Laboratory Manual),Springer Verlag；Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；Carlsson R,Söderlind E.(2001)n-CoDeR concept：unique types of antibodies for diagnostic use and therapy.Expert Rev Mol Diagn.1：102-108]。

「人源化抗體」或功能性人源化抗體片段係定義為(I)衍生自非人類來源(例如，帶有異源性免疫系統之基因轉殖小鼠)。其中抗體係以人類胚原系列為基礎之抗體；或(II)CDR-嫁接，其中該可變區的CDR係來自非人類來源，而一或多個可變區之架構為人類來源及恆定區(若有)為人類來源。

「嵌合抗體」一詞，如文中所用，係指含有由二個典型地源自不同物種之不同抗體所衍生的序列之抗體。最典型地，嵌合抗體係包括人類和鼠科抗體片段，一般為人類恆定區和小鼠可變區。

本發明之抗體可衍生自重組抗體基因庫。製作重組抗體基因之全庫的技術開發，及展示絲狀噬菌體表面上之編碼的抗體片段，係提供直接製造和選擇人類抗體之重組方法，其亦可用於人源化、嵌合、鼠科或突變蛋白抗體。由噬菌體技術所產生的抗體係如同抗原結合片段-通常為Fv或Fab片段-於細菌中所產生，且因而缺乏效應子功能。效應子功能可藉由一或二種下列方法來導入：片段可經操控置入全抗體供哺乳動物細胞之表現，或置入帶有能引發效應子功能之第二結合位置的雙專一性抗體片段。典型地，抗體之該Fd片段(VH-CH1)和輕鏈(VL-CL)係個別以PCR和隨機重組於組合的噬菌體展示庫選殖，然後其可經選擇供與特定的抗原結合。Fab片段係表現在噬菌體表面，亦即物理性與編碼彼等之基因相連接。因此，就Fab編碼序列，藉由抗原結合共選擇之Fab選擇，可隨後增幅。藉由數輪的抗原結合和再-增幅，一種稱為淘洗之程序，Fab對抗原之專一性可加強及最後分離。

對於由噬菌體展示庫衍生人類抗體之各種程序已有描述。此展示庫可建立在單一主架構上，於其中使活體內形成的各種不同(亦即人類-衍生的)CDR得以再組合，如描述於[美國專利號：6,989,250；美國專利號：4,816,567]。另外，此抗體庫可以已於矽中設計及由合成創造的核酸所編碼之胺基酸序為基礎。在矽中，藉由分析人類序列之資料庫，可進行抗體序列之設計，及利用從其所得到的數據設計出多肽序列。用於設計和獲得於矽中-創造的序列之方法已有描述；例如，參見[Carlsson R,Söderlind E.(2001)n-CoDeR concept：unique types of antibodies for diagnostic use and therapy.Expert Rev Mol Diagn.1：102-108；U.S.Patent NO：6,989,250；Knappik A,Ge L,Honegger A,Pack P,Fischer M,Wellnhofer G,Hoess A,Wölle J,Plückthun A,Virnekäs B.(2000)Fully synthetic human combinatorial antibody libraries(HuCAL)based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides.J Mol Biol.296：57-86]。就噬菌體展示技術之論述，請參見[Krebs B,Rauchenberger R,Reiffert S, Rothe C,Tesar M,Thomassen E,Cao M,Dreier T,Fischer D,Höss A,Inge L,Knappik A,Marget M,Pack P,Meng XQ,Schier R,Söhlemann P,Winter J,Wölle J,Kretzschmar T.(2001)High-throughput generation and engineering of recombinant human antibodies.J Immunol Methods.254：67-84]。

另外，本發明之抗體可來自動物。此一抗體可經人源化或人類工程化，係概述於[Krebs B,Rauchenberger R,Reiffert S,Rothe C,Tesar M,Thomassen E,Cao M,Dreier T,Fischer D,Höss A,Inge L,Knappik A,Marget M,Pack P,Meng XQ,Schier R,Söhlemann P,Winter J,Wölle J,Kretzschmar T.(2001)High-throughput generation and engineering of recombinant human antibodies.J Immunol Methods.254：67-84]；此一抗體可來自基因轉殖動物[參見Krebs B,Rauchenberger R,Reiffert S,Rothe C,Tesar M,Thomassen E,Cao M,Dreier T,Fischer D,Höss A,Inge L,Knappik A,Marget M,Pack P,Meng XQ,Schier R,Söhlemann P,Winter J,Wölle J,Kretzschmar T.(2001)High-throughput generation and engineering of recombinant human antibodies.J Immunol Methods.254：67-84]。

如文中所用，不同「形式」的抗原，例如凝血因子XI及/或凝血因子XIa，在此係定義為由不同轉譯和後轉譯修飾所造成的不同蛋白分子，例如(但不限於)初級FXI轉錄之剪接上的差異、糖基化之差異和後轉譯蛋白分解性裂解之差異。

如文中所用，術語「表位」包括任何能專一與免疫球蛋白或T-細胞受體結合之蛋白決定基。表位決定基通常係由分子之化學活性表面群族例如胺基酸或糖側鏈所組成，且通常具有特定三維結構特性，以及特定的電荷特性。若在一競爭結合分析中，藉由任何熟習本項技術者所熟知的方法，一抗體顯示與第二抗體競爭，則二種抗體被認為「與相同的表位結合」，及若較佳地，表位的所有胺基酸係與二種抗體結合。

術語「成熟抗體」或「成熟抗原-結合片段」例如成熟的Fab變體係包括對一特定的抗原，例如FXI，展現較強及/或改良的結合-亦即以增加的親和力結合。成熟為鑑別六個抗體或抗體片段之CDR內小量突變，導致此親合力增加之方法。成熟過程為將突變導入抗體和篩選供辨識此改良的結合劑之分子生物法之組合。

醫藥組成物和給藥

本發明亦關於可單獨包括FXI/FXIa抗體或與與至少一種其他試劑，例如安定化合物組合之醫藥組成物，其可溶於任何無菌、生物相容的載劑，包括(但不限於)食鹽水、緩衝食鹽水、葡萄糖和水中來給藥。任何此等分子可單獨，或與其他試劑、藥物或激素組合，以其中與賦形劑或醫藥上可接受載劑混合的醫藥組成物來投予病患。在一本發明之實施例中，此醫藥上可接受的載劑為醫藥上惰性的。

本發明亦關於醫藥組成物之給藥。此給藥係以非經腸來進行。非經腸遞送之方法包括局部、動脈內(直接遞送至腫瘤)、肌肉內、皮下、脊髓內、鞘內、腦室內、靜脈內、腹膜內、子宮內或鼻內給藥。除了活性成份外，這些醫藥組成物可含有適合的醫藥上可接受載劑，包括賦形劑和佐劑，其係幫助活性化合物加工成可作醫藥用之製備物。更詳細的調配和給藥技術可參見最新版本的Remington's Pharmaceutical Sciences(Ed.Maack Publishing Co,Easton,Pa.)。

供非經腸給藥的醫藥調配物包括活性化合物之水性溶液。就注射而言，本發明之醫藥組成物可調配於水性溶液中，較佳地生理上相容的緩衝液，例如漢克氏溶液、林格氏液或生理緩衝食鹽水。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或聚葡糖。此外，活性化合物之懸浮液可製備成適當的油性注射懸浮液。適合的親脂性溶劑或媒劑包括油脂類例如芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或三酸甘油酯或微脂體。視需要，此懸浮液亦可含有適合的安定劑或增加化合物溶解度之試劑使製備物得以為高濃縮溶液。

就局部或鼻內給藥，調配物中可使用適合穿過特定屏障之滲透劑。此等滲透劑一般已為本項技術所知。

非經腸給藥亦包括非經腸遞送之方法，其亦包括動脈內、肌肉內、皮下、脊髓內、鞘內和腦室內、靜脈內、腹膜內、子宮內、陰道內或鼻內給藥。

套組

本發明進一步係關於包括一或多個填入一或多種前述本發明組成物之容器的醫藥包裝和套組。此等容器可結合由政府機構規範醫藥品或生物產品之製造、使用或銷售所規定的通告，顯示該產品之製造、使用或銷售係經當局核准可供人類給藥。

在另外的實施例中，套組可含有編碼本發明抗體之DNA序列。較佳地，編碼這些抗體之DNA序列係以適合轉染至和由宿主細胞表現之質體來提供。質體可含有一啟動子(通常為誘導型啟動子)用以調整DNA在宿主細胞中的表現。質體亦可含有適當的限制性位點用以幫助將其他的DNA序列插入質體中，產生各種抗體。質體亦可含有許多幫助選殖和表現編碼蛋白之其他元素。此等元素已為熟習本項技術者所熟知並包括，例如可選擇標記、起始密碼子、終結密碼子等等。

製造和儲存

本發明之醫藥組成物可以本項技術已知的方式來製造，例如以習用的混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、細磨、乳化、包膠、包埋或凍乾方法之方式。

醫藥組成物可以1mM-50mM組胺酸、0.1%-2%蔗糖、2%-7%甘露醇於4.5至5.5 pH範圍之凍乾粉末在使用前與緩衝液組合來提供。

在包括本發明化合物之醫藥組成物調配於可接受的載劑中製備後，其可置於適當的容器中並標示所治療的適應症。就抗凝血因子XI及/或抗凝血因子XIa抗體之給藥，此標示應包括投予的量、次數和方法。

IC50/EC50

根據FDA，IC50係代表抑制50%特定生物過程所需之化合物濃度。本發明之抗體具有IC50值100μM，較佳地1μM，更佳地0.1μM，更佳地0.01μM，更佳地0.001μM，更佳地0.0001μM。

治療上有效劑量

適合用於本發明之醫藥組成物包括其中活性成份係包含用以達到所欲目的，亦即治療特徵為凝血因子XI及/或凝血因子XIa之特定疾病狀態之有效量的組成物。有效劑量之決定係完全在熟習本項技術者之能力內。

治療上有效劑量係指改善徵狀或症狀之蛋白、其抗體、拮抗劑或抑制劑之量。此等化合物之治療效用和毒性可以標準醫藥程序於細胞培養或實驗動物中來測定，例如ED₅₀(50%之群族的治療有效劑量)和LD₅₀(50%之族群的致死劑量)。治療和毒性效應間的劑量比為治療指數，且其可以ED₅₀/LD₅₀之比例來表示。將由細胞培養和動物研究所得到的數據用於調配供人類使用之劑量範圍。此等化合物之劑量較佳地係落在包括帶有極少或無毒性之ED₅₀的循環濃度範圍內。依照所用的劑型、病患的嚴重度和給藥路徑，劑量係在此範圍內變化。

確切的劑量係由個別的醫師考慮所欲治療的病患來選擇。劑量和給藥係經調整以提供足量的活性分子或維持所欲的效用。可考慮的另外因素包括疾病狀態的嚴重度、病患的年齡、體重和性別；飲食、給藥的時間和頻率、藥物組合、反應敏感性和對治療的耐受性/回應。長效的醫藥組成物，依照特定調配物之半衰期和清除率可每3至4天、每週給藥，或二週給藥一次，或一個月一次。

依照給藥路徑，正常的劑量可從0.1至100,000微克而不同，至高約2g的總劑量。特定劑量和遞送方法之指南係提供於文獻中[參見美專利號：6,300,064]。該等熟習技術者將應用與蛋白或其抑制劑不同的多核苷酸調配物。同樣地，遞送多核苷酸或多肽將針對特定的細胞、症狀、位置等。較佳的放射性標定的抗體之特定活性範圍可從0.1至10mCi/mg的蛋白[WO08/022295、US.4,657,760；US 5,206,344；US 5,225,212；RivaP,Franceschi G,Frattarelli M,Lazzari S,Riva N,Giuliani G,Casi M,Sarti G,Guiducci G,Giorgetti G,Gentile R,Santimaria M,Jermann E,Maeke HR.(1999)Loco-regional radioimmunotherapy of high-grade malignant gliomas using specific monoclonal antibodies labeled with 90Y：a phase I study.Clin Cancer Res.5(10 Suppl)：3275s-3280s]。

本發明進一步係以下列實例來描述。實例係獨自提供，藉由參照特定的實施例，用以說明本發明。這些示例，在說明特定的本發明樣態時，不會描述限制或限定所揭示的本發明範圍。

除非另有詳細描述，否則所有的實例係使用標準技術來進行，其已為熟習本項技術者所熟知及慣用。下列實例之慣用的分子生物技術可如標準實驗室手冊中所述來進行，例如[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning：A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA]。

測量緩衝液中凝血因子XI及/或凝血因子XIa抑制

為了測定列表於上的物質之Xa因子抑制作用，係進行一生物試驗系統，其中係使用XIa因子基質之轉化來測定人類XIa因子之酵素活性。測定係於微量滴定盤中進行。

測定抗凝血活性

試驗物質之抗凝血活性係於活體外以人類血漿及/或兔子血漿及/或大鼠血漿來測量。就此，使用0.11莫耳的檸檬酸鈉溶液作為受體，將血液抽出於1/9的檸檬酸鈉/血液之混合比例。血液抽出後，立刻將其完全混合並以約4000g離心15分鐘。將上清液吸量出。

凝血酶原時間(PT，同義詞：凝血激酶時間、快速試驗)係在各種濃度之試驗物質或對應溶劑的存在下，使用市售的試驗套組來測定(Neoplastin®來自Roche公司(前Boehringer Mannheim公司)或Hemoliance® RecombiPlastin來自Instrumentation Laboratory公司)。將試驗化合物於37℃以血漿培養3分鐘。然後加入凝血激酶開始凝血並測定凝血發生的時間。測定使凝血酶原時間加倍之試驗物質濃度。

凝血酶時間(TT)係在各種濃度之試驗物質或對應溶劑的存在下，使用市售的試驗套組來測定(凝血酶試劑係來自Roche公司)。將試驗化合物於37℃以血漿培養3分鐘。然後加入凝血酶試劑開始凝血並測定凝血發生的時間。測定使凝血酶時間加倍之試驗物質濃度。

活化部份凝血激酶時間(aPTT)係在各種濃度之試驗物質或對應溶劑的存在下，使用市售的試驗套組來測定(PTT試劑係來自Roche公司)。將試驗化合物於37℃以血漿和PTT試劑(腦磷脂，高嶺土)培養3分鐘。然後加入25mM氯化鈣開始凝血並測定凝血發生時的時間。測定使aPTT加倍之試驗物質濃度。

本發明抗體之濃度在100μM之濃度時使aPTT加倍，較佳地1μM之濃度，更佳的0.1μM之濃度，更佳的0.01μM之濃度，更佳的0.001μM，更佳的0.0001μM之濃度，更佳的0.00001μM之濃度。

治療用途

本發明之抗凝血因子XI抗體及/或抗凝血因子XIa抗體可投予任何其中抑制凝血聯集和抑制血小板聚集和抑制血栓形成應為有利的對象。

因此，本發明之抗凝血因子XI抗體及/或抗凝血因子XIa抗體係適合用於治療及/或預防人類和動物中與凝血相關的疾病。

術語「血栓栓塞性疾病」包括如ECG上有和無ST上升之心肌梗塞(MI)或急性心肌梗塞(AMI)(STEMI和非-STEMI)、穩定型心絞痛以及不穩定型心絞痛、冠狀動脈介入治療術，例如血管形成數或冠狀動脈繞道術(CABG)後之再閉塞和再狹窄、周動脈阻塞性疾病(PAOD)、肺栓塞(PE)、深部靜脈栓塞(DVT)以及短暫性腦缺血發作(TIA)、血栓性中風和血栓栓塞性中風之疾病。

這些抗體亦可用於治療和預防心因性血栓栓塞症，如腦缺血中風發作以及全身性血栓栓塞，用於治療患有心律不整或心律異常之病患，例如患有心房顫動之病患，患有具有人工心瓣膜之瓣膜性心臟疾病之病患。再者，這些抗體應有助於治療患有瀰漫性血管內凝血(DIC)之病患。

血栓栓塞併發症可因血管壁之動脈硬化病灶所造成，特別是擾亂內皮功能，其可能導致急性血栓性閉塞。動脈硬化為一多因性病症，其係依許多的心血管危險因子而定。臨床研究已顯示以抗凝血劑預防無法明確地影響動脈血管病症的過程。以危險因子為目標之治療結合抗血栓療法因此為有利的。冠狀動脈、周邊和腦血管病症之危險因子有，例如：血清膽固醇量升高、動脈性高血壓、抽菸和糖尿病。預防性藥物之原理係以消除這些危險因子為基礎。除了改變生活型態外，亦包括藥理性方法例如，如降血壓療法、降血脂藥或預防血栓。此外，與冠狀動脈治療劑之組合係適用於有預先存在的冠心病之治療。

血栓栓塞併發症係涉及微血管病變溶血性貧血(MAHA)、體外血液循環如血液透析和主動脈瓣置換。

此外，本發明之抗體可用於治療或預防發炎性疾病如類風濕性關節炎(RA)，或如神經疾病如阿茲海默症(AD)。再者，這些抗體可用於治療癌症和轉移、血栓性微血管病變(TMA)、老化有關的黃斑部退化、糖尿病腎病變以及其他微血管疾病。

本發明之抗體亦可用於癌症病患手術後或經歷化學及/或放射線治療的癌症病患，供治療血栓栓塞併發症。

本發明之抗體亦可用於治療及/或預防透析病患，特別是血液透析中分流血栓之廔管預防。血液透析可使用天然的動靜脈廔管、合成的環移植物、大口徑中央靜脈導管或其他由人工表面所組成的裝置。投予本發明抗體將可預防透析期間和之後廔管內血塊形成(及肺動脈內栓塞血塊擴增)。

本發明之抗體亦可用於治療和預防心肺繞道手術後患有心內和肺內血栓症之病患(例如ECMO：體外膜性氧合術)。

在全身性抗凝血、機械穩定和裝置持續時間之需求下，主要的心室輔助裝置之限制為血栓栓塞事件的高發生率。因此，本發明之抗體亦可用於治療及/或預防裝有左心室輔助裝置之病患。

於透析的病患中在無增加不欲的出血事件風險下，對於抗凝血有高度需求，且其中靜脈血栓栓塞(VTE)和心房顫動發生率在此族群中為高的(例如末期腎疾病之血液透析病患)。本發明之抗體亦可用於治療及/或預防這些類型的病患。

本發明之抗體亦可用於治療及/或預防患有特發性血小板低下紫斑症(IPT)之病患。相較於一般人，這些病患具有升高的血栓形成風險。相較於對照組，在ITP病患中凝血因子FXI之濃度明顯較高，且ITP病患中aPTT明顯較高。

本發明之抗體亦可用於治療及/或預防肺高血壓。

術語「肺高血壓」係遵照世界衛生組織WHO所定義之指南(肺高血壓之臨床酚類，威尼斯2003)，例如肺動脈高血壓、由左心室疾病所造成的肺高血壓、由肺疾病及/或缺氧、由血塊、動脈收縮和其他疾病所造成的肺高血壓，如慢性血栓栓塞性肺高血壓(CTEPH)。

術語「肺高血壓」亦包括如特發性肺動脈高血壓IPAH、家族性肺動脈高血壓(FPAH)、相關的肺動脈高血壓(APAH)之疾病，其可能與膠原性疾病、先天全身性肺分流疾病、HIV感染或投予特定藥物結合疾病如甲狀腺疾病、肝醣儲積症(GSD)、克羅恩症(Morbus Gaucher)、遺傳性出血性血管擴張症、血紅素病變及/或骨髓增生性病症有關。

本發明之抗體可用於治療及/或預防如肺靜脈阻塞性疾病、肺毛細血管血管瘤(PCH)以及新生兒之持續的肺高血壓之疾病。

術語「肺高血壓」亦包括如慢性阻塞性肺疾病(CODP)、間質性肺疾病(ILD)、睡眠呼吸中止症、肺泡換氣過度、高山症以及結構性發育不全之疾病。

由慢性血栓栓塞肺高血壓(CTEPH)所造成的疾病可能與近端及/或末端肺動脈阻塞，或與非血栓性肺栓塞如癌症、寄生蟲或汙染物有關。

再者，本發明之抗體可用於治療及/或預防由類肉瘤病、組織細胞增生症X和淋巴管瘤病所造成的肺高血壓。

此外，本發明之抗體可用於治療及/或預防肺及/或肝纖維化。

本發明之抗體亦可用於治療及/或預防敗血症、全身性發炎症候群(SIRS)、器官功能障礙、多重器官功能障礙症候群(MODS)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、急性肺損傷(ALI)、彌散性血管內凝血(DIC)。

術語「敗血症」係定義感染發生或全身性發炎反應症候群(SIRS)發生。SIRS主要係由感染所引起，但亦可在病灶、灼傷、休克、手術、缺血、胰臟炎、復活或腫瘤影響後發生。在敗血症期間，凝血聯集可被活化，一種稱為彌散性血管內凝血之過程或短暫DIC。此可導致微血栓形成和續發性併發症。

此外，敗血症或SIRS可能導致內皮功能障礙，使血管滲透性增加。在敗血症或SIRS期間，可能發生數種器官混和性衰竭，例如腎衰竭、肝衰竭、肺衰竭、心血管系統衰竭。

引發敗血症或SIRS之致病性病原為革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌、真菌、病毒及/或真核病原。

DIC及/或SIRS可能和敗血症同時發生，但亦可能係由於手術、腫瘤疾病、灼傷或其他類型的損傷而發生。

在DIC期間，在受損的血管表面或其他類型的組織，發生凝血聯集活化。此可能導致微血栓形成，就此部分導致小血管閉塞。

在一實施例中，抗凝血因子XI抗體及/或抗凝血因子XIa抗體係與其他用於治療及/或預防已提及之疾病的藥物組合使用。

在下文中，係列出適用於組合之實例及因此較佳可提及的有：

-與降脂化合物組合，特別是3-羥基-3-甲基-戊二醯基-CoA5抑制劑如洛伐他汀(Lovastatin)(Mevacor；US 4,231,938)、辛伐他汀(Simvastatin)(Zocor；US 4,444,784)、普伐他汀(Pravastatin)(Pravachol；US 4,346,227)、氟伐他汀(Fluvastatin)(Lescol；US 5,354,772)、和阿伐他汀(Atorvastatin)(Lipitor；US 5,273,995)

-與適合治療冠心病之化合物及/或具有血管擴張活性之化合物組合，特別是血管收縮素轉化酵素之抑制劑，如卡托普利(Captopril)、賴諾普利(Lisinopril)、依那普利(Enalapril)、雷米普利(Ramipril)、西拉普利(Cilazapril)、貝那普利(Benazepril)、福辛普利(Fosinopril)、喹那普利(Quinapril)和培哚普利(Perindopril)，或血管收縮素II受體之拮抗劑如依布沙坦(Embusartan)(US 5,863,930)、氯沙坦(Loaartan)、纈沙坦(Valsartan)、依貝沙坦(Irbesartan)、坎地沙坦(Candesartan)、埃普沙坦(Eprosartan)和替米沙坦(Temisarta)，或β-腎上腺素受體之拮抗劑如卡維地洛(Carvedilol、阿普洛爾(Alprenolol、比索洛爾(Bisoprolol、醋丁洛爾(Acebutolol、阿替洛爾(Atenolol)、倍他洛爾(Betaxolol)、卡替洛爾(Carteolol)、美托洛爾(Metoprolol)、納多洛爾(Nadolol)、噴布洛爾(Penbutolol)、吲哚洛爾(Pindolol)、普萘洛爾(Propanolol)和噻嗎洛爾(Timolol)，或與α1腎上腺素受體之拮抗劑組合，如哌唑嗪(Prazosin)、布那唑嗪(Bunazosin)、多沙唑嗪(Doxazosin)和特拉唑嗪(Terazosin)

-與利尿劑氫氯噻嗪(Hydrochlorothiazide)、呋塞米(Furosemide)、布美他尼(Bumetanide)、吡咯他尼(Piretanide)、托拉塞米(Torasemide)、阿米洛利(Amiloride)和雙肼酞嗪(Dihydralazine)組合.

-與鈣通道之抑制劑組合如維拉帕米(Verapamil)和地爾硫卓(Diltiazem)，二氫呲啶衍生物如硝苯地平(Nifedipin)(Adalat)、尼群地平(Nitrendipin)(Bayotensin)、5-單硝酸異山梨醇酯(Isosorbid-5-mononitrat)、I硝酸異山梨酯(sosorbid-dinitrat)和硝酸甘油(Glyceroltrinitrat)。

-與使環鳥苷單磷酸(cGMP)濃度增加之化合物組合，如可溶性鳥苷酸環化酶之刺激劑(WO 98/16223、WO 98/16507、WO 98/23619、WO 00/06567、WO 00/06568、WO 00/06569、WO 00/21954、WO 00/66582、WO 01/17998、WO 01/19776、WO 01/19355、WO 01/19780、WO 01/19778、WO 07/045366、WO 07/045367、WO 07/045369、WO 07/045370、WO 07/045433).

-與其他凝血聯集之抑制劑組合，如胞漿素原活化劑(血栓溶解劑/纖維蛋白溶解劑)以及增加血栓溶解及/或纖維蛋白溶解之化合物或胞漿素原活化劑之抑制劑或凝血酶-活化的纖維蛋白溶解抑制劑，如組織胞漿素原活化劑(t-PA)、鏈激酶(Streptokinase)、瑞替普酶(Reteplase)和尿激酶(Urokinase).

-與抗凝血劑組合，如非分組肝素、低分子量肝素、類肝素、水蛭素(Hirudin)、二價蛭素(Bivalirudin)及/或阿加曲班(Argatroban)。

另外的組合治療為抗凝血因子XI抗體及/或抗凝血因子XIa抗體與抗生素治療、抗真菌治療劑和抗病毒治療劑之共投予。

另外，抗凝血因子XI抗體及/或抗凝血因子XIa抗體

-與血管加壓劑如正腎上腺素(Norepinephrine)、多巴胺(Dopamine)和血管加壓素(Vasopressin)

-增強肌肉治療，例如多巴酚丁胺(dobutamine)

-皮質類固醇，如氫化可的松(hydrocortison)或氟氫可的松(fludrocortisone)

-重組的表現活化蛋白C

-血液產品，如新鮮冷凍血漿、紅血球濃縮液及/或-血小板濃縮液組合。

本發明另外的實施例為抗凝血因子XI抗體及/或抗凝血因子XIa抗體作為抗凝血劑，用於含有凝血因子XI及/或凝血因子XIa之血液探針、血液保存，其他血漿產物或生物樣本之用途。這些樣本係以加入有效濃度的抗體來避免在試管內凝結之方式來定性。

本發明之抗凝血因子XI抗體及/或抗凝血因子XIa抗體亦可用於活體外抑制凝血，如製備含有凝血因子XI及/或凝血因子XIa之血液導管或其他醫藥添加物或裝置，供塗覆活體外人工表面以及用於活體外使用之添加物、裝置或其他生物樣本。

圖1：抑制人類FXIa，包括SEQ ID NO：19之可變輕鏈區的胺基酸序列及SEQ ID NO：20之可變重鏈區的胺基酸序列之抗-FXIa抗體076D-M007-H04的劑量反應曲線(EC50與IC50相同)。此抗體包括如SEQ ID NO：21之CDRH1，如SEQ ID NO：22之CDRH2及如SEQ ID NO：23之CDRH3。此抗體進一步係包括如SEQ ID NO：24之CDRL1，如SEQ ID NO：25之CDRL2及如SEQ ID NO：26之CDRL3。於淘洗/篩選分析中所鑑別的抗體係以所指的濃度就其抑制人類FXIa之蛋白分解活性的能力進行試驗。相關的DNA序列係如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8所示。

圖2：抗-FXIa抗體076D-M007-H04抑制兔子FXIa之劑量反應曲線。於淘洗/篩選分析中所鑑別的該抗體係以所指的濃度就其抑制兔子FXIa之蛋白分解活性的能力進行試驗。

圖3：抗-FXIa抗體076D-M007-H04-CDRL3-N110D抑制人類FXIa之劑量反應曲線，其中該抗體係包括SEQ ID NO：27之可變輕鏈區的胺基酸序列及SEQ ID NO：28之可變重鏈區的胺基酸序列。於淘洗/篩選分析中所鑑別的該抗體係以所指的濃度就其抑制人類FXIa之蛋白分解活性的能力進行試驗。

圖4：抗-FXIa抗體076D-M007-H04-CDRL3-N110D之劑量反應曲線。於淘洗/篩選分析中所鑑別的該抗體係以所指的濃度就其抑制兔子FXIa之蛋白分解活性的能力進行試驗。

圖5：抗-FXI抗體076D-M028-H17抑制人類FXI藉由凝血因子XIIa轉變為FXIa之劑量反應曲線，其中該抗體係包括SEQ ID NO：29之可變輕鏈區的胺基酸序列及SEQ ID NO：30之可變重鏈區的胺基酸序列。此抗體包括如SEQ ID NO：31之CDRH1，如SEQ ID NO：32之CDRH2及如SEQ ID NO：33之CDRH3。此抗體進一步係包括如SEQ ID NO：34之CDRL1，如SEQ ID NO：35之CDRL2及如SEQ ID NO：36之CDRL3。於淘洗/篩選分析中所鑑別的該抗體係以所指的濃度就其抑制酶原FXI轉變成其活化形式FXIa之能力進行試驗。相關的DNA序列係如SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：18所示。

圖6：抗-FXI抗體076D-M028-H17抑制人類FXI藉由凝血因子XIIa轉變為FXIa之劑量反應曲線。於淘洗/篩選分析中所鑑別的該抗體係以所指的濃度就其抑制酶原FXI轉變成其活化形式FXIa之能力進行試驗。

圖7：抗-FXI抗體076D-M028-H17抑制兔子FXI藉由凝血因子XIIa轉變為FXIa之劑量反應曲線。於淘洗/篩選分析中所鑑別的該抗體係以所指的濃度就其抑制酶原FXI轉變成其活化形式FXIa之能力進行試驗。

圖8：抗-FXI抗體076D-M028-H17抑制兔子FXI藉由凝血因子XIIa轉變為FXIa之劑量反應曲線。於淘洗/篩選分析中所鑑別的該抗體係以所指的濃度就其抑制酶原FXI轉變成其活化形式FXIa之能力進行試驗。

圖9：076D-M007-H04對人類FXIa催化區之結合和阻斷活性。076D-M007-H04係抑制人類FXIa之蛋白分解活性，然而076D-M028-H17未展現此活性，其顯示076D-M007-H04係與FXIa的催化區結合。

圖10：使用萊恩威佛-伯克線作圖，076D-M007-H04之結合模式的定性顯示此抗體具有競爭型抑制活性。

圖11：CD62P表現和血小板微聚集體形成之流式細胞分析。單一血小板係藉由光散射和FITC-CD41/CD61(GPIIbIIIa)螢光之組合來偵測。(A)藉由點狀圖以FITC-CD41和PE-CD62P螢光測定CD62P表現。顯示灌注前(左)和灌注後(右)之門控血小板。(B)血小板微聚集體形成係以大小增加(前向散射)來定義，如圓圈中所示。顯示在灌注前(左)和灌注後所收集之樣本的點狀圖。

圖12：因FXI(a)抗體，血小板CD62P表現降低。將全血以(A)076D-M007-H04和(B)076D-M028-H17處理並於再鈣化後立即灌注於塗覆膠原蛋白的表面上。同時，在以媒劑或抑制劑處理後收集全血樣本，並在有或無TRAP6(10μg/ml)下培養5分鐘。以如圖11中所示之流式細胞儀分析血小板CD62P表現。數據係記錄為至少5個實驗之門控族群的平均值±SEM CD62P-陽性血小板之百分比。在5分鐘灌注期間，各處理之最大的CD62P表現量係如圖中所示。

圖13：以FXI(a)抗體抑制血小板微聚體形成。將全血以(A)076D-M007-H04和(B)076D-M028-H17處理並於再鈣化後立即灌注於塗覆膠原蛋白的表面上。以如圖13中所示及所代表之流式細胞儀分析血小板微聚體。數據係記錄為至少5個實驗的平均±SEM聚集體個數對10⁴門控單一血小板。在5分鐘灌注期間，各處理之最大的聚集體數係如圖中所示。

圖14：活體內076D-M007-H04對氯化鐵所引發的血栓形成(a)及對耳多出血時間(b)的效應。其可驗證076D-M007-H04在無增加耳朵出血時間下，劑量依賴地減少血栓重。

圖15：活體內076D-M007-H04-CDRL3-N110D對氯化鐵所引發的血栓形成(a)及對耳多出血時間(b)的效應(描述於樣本xxx中)。其可驗證 076D-M007-H04-CDRL3-N110D在無增加耳朵出血時間下，劑量依賴地減少血栓重。

圖16：活體內076D-M028-H17對氯化鐵所引發的血栓形成(a)及對耳多出血時間(b)的效應(描述於樣本xxx中)。其可驗證076D-M028-H17在無增加耳朵出血時間下，劑量依賴地減少血栓重。

圖17：此圖係描繪Fab 076D-M007-H04(下方)與FXIa(上方)複合之動畫表示法。

圖18a：此圖係描繪-Fab 076D-M007-H04之表位(動畫)與FXIa C500S結合之詳觀圖。FXIa C500S係以表面表示法來顯示。

圖18b：此圖係顯示Fab 076D-M007-H04與以表面表示法所示之FXIa C500S的疊加胜肽x-光結構。活性位置裂口係以紅色橢圓體標出。

圖19a：此圖係描繪酶原FXI(odb進入2F83)與疊加的Fab 076D-M007-H04之晶體結構。

圖19b：此圖係描繪相同的圖，但酶原之FXI的催化區係以Fab 076D-M007-H04：FXIa C500S複合結構之FXIa C500S的催化區取代。FXI和FXIa C500S的催化區係以表面表示法表示，所有其他的區係如動畫所表。在076D-M007-H04介面之非井然有序的環係於圖19中標出。

圖20：在投予076D-M007-H04後，於從狒狒收集到的血漿樣本中所測定的活體外aPTT血塊形成時間增加。

圖21：在投予2.5mg/kg 076D-M007-H04後(靜脈內團注)，從給劑後5分鐘至給劑後504小時之ACT測量值。

圖22：在投予2.5mg/kg 076D-M007-H04後(靜脈內團注)，前24小時之ACT測量值。

圖23：在投予2.5mg/kg 076D-M007-H04後(靜脈內團注)，從給劑後5分鐘至給劑後504小時之aPTT測量值。

圖24：在投予2.5mg/kg 076D-M007-H04後(靜脈內團注)，前24小時之aPTT測量值。

圖25：血小板沉積在2mm i.d.塗覆膠原蛋白的ePTFE血管移植物。

圖26：血小板沉積在塗覆膠原蛋白的ePTFE血管移植物，如實例12所述。

圖27：血小板沉積在靜脈延伸室(及塗覆膠原蛋白的移植物和矽室間的連接部分)，如實例12部分中所描述。

圖28：在給予076D-M007-H04後，於狒狒血漿中所測量的TAT量。

圖29：單獨以0.5mg/kg 076D-M007-H04和2mg/kg 076D-M007-H04治療(24小時後)或給予濃度32mg/kg之可嚼式阿斯匹靈後，狒狒之出血時間。

實例1：鑑別抗體 用於噬菌體選擇之工具：

用於分離本發明人類抗體之蛋白係由表1所列之不同來源所得來。使用約2-倍莫耳過量的生物素-LC-NHS(Pierce；型號：21347)，根據製造商的說明將蛋白生物素化並使用Zeba脫鹽管柱(Pierce；型號： 89889)脫鹽。

噬菌體選擇：

分離本發明之人類抗體或其抗源結合片段係藉由噬菌體表現技術使用DYAX公司的人類Fab抗體庫FAB-310(DYAX Corp.,Cambridge,MA；描述於Hoet等人，Nat.Biotech.2005,23：344-8中)來進行，該抗體庫為一結合天然和合成各種類之Fab庫。表2至6係概括用於選擇涵蓋多重表位之抗體的不同策略。

表5：選擇策略IV：如策略III所述，在各輪選擇之前，包括一生物素化激肽釋放酶/前激肽釋放酶(500nM)之消除步驟。此外，選擇係在複合物

用於此實例之標準緩衝液有：

1x PBS：來自Sigma(D5652-501)

PBST：1x PBS添加0.05% Tween20(Sigma,P7949)

阻斷緩衝液：PBST添加3% BSA(Sigma A4503)

沉澱緩衝液：20% PEG6000(Calbiochem,528877)溶於2.5M NaCl

細胞淘洗緩衝液：PBS添加3% FBS(GIBCO,10082)和0.01% NaN₃(Sigma,71289)

用於抗體庫選擇之通用方法，Hoet等人已有描述(Hoet RM,Cohen EH,Kent RB,Rookey K,Schoonbroodt S,Hogan S,Rem L,Frans N, Daukandt M,Pieters H,van Hegelsom R,Neer NC,Nastri HG,Rondon IJ,Leeds JA,Hufton SE,Huang L,Kashin I,Devlin M,Kuang G,Steukers M,Viswanathan M,Nixon AE,Sexton DJ,Hoogenboom HR,Ladner RC.(2005)Generation of high-affinity human antibodies by combining donor-derived and synthetic complementarity-determining-region diversity.Nat Biotechnol.23：344-348)。簡言之，藉著加入1/5體積之沉澱緩衝液將Fab抗體庫沉澱，接著於冰上培養1小時及離心步驟(5500rpm計1h)。將沉澱的抗體庫隨後再懸浮於1ml阻斷緩衝液中並於r.t.培養30min。

在此期間，藉由以PBST沖洗3次，準備塗覆鏈黴親和素之Dynabeads M280(Invitrogen,11206D)的等份。之後，將某些等份與生物素化激肽釋放酶/前激肽釋放酶(500nM)或生物素化hFXI(500nM)混合，而將剩餘的與如表2至6所示之生物素化標靶蛋白混合。將混合物於端-對-端旋轉器上以4℃培養ON及隨後以1ml PBST沖洗5次。最後將經塗膜的微珠以1ml阻斷緩衝液之懸浮液阻斷，以5支試管等分，接著收集微珠並移除上清液。

如所示藉由添加阻斷庫進行5個連續消除步驟(如上述)，阻斷塗覆生物素化激肽釋放酶/前激肽釋放酶(500nM)或生物素化hFXI(500nM)之Dynabead，並於r.t.培養10min同時旋轉。將微珠收集至磁道上後，藉由離心使上清液澄清並與塗覆標靶蛋白之阻斷的Dynabead混合。於端-對-端旋轉器中培養30min後，將樣本以阻斷緩衝液清洗3次，界，接著以PBST清洗9次。然後將一半含有富集噬菌體的再懸浮微珠用於感染成倍生長中的大腸桿菌TG1(來自Stratagene)供製備用於下一輪選擇之新的噬菌體儲液，根據表2-6中所述的策略。更詳細地，將6ml的TG1-培養物以500μl的dynabead/噬菌體懸浮液以37℃無震盪下感染30 min。之後，取等份供輸出滴定。將剩餘的培養物以5000rpm離心15min並將生成的團塊再懸浮於2ml 2xYT中並置入洋菜盤上(2xYT,100μg/ml安比西林(ampicillin),2%葡萄糖)。於37℃培養至隔夜後，刮下細胞置於5ml 2xYT中並用於接種20ml 2xYT新鮮的培養(100μg/ml Amp)以0.05之OD600，並供製備甘油儲液。將新鮮的培養液於37℃震盪約2h，直到OD600 0.5達到0.8，然後將5ml培養液與M13 helperphage M123K07(Invitogen 420311)以約20的感染複數(MOI)混合。於37℃緩慢震盪30min後，加入30ml預加溫的2xYT(100μg/ml安比西林，20μg/ml卡那黴素(kanamycin),f.c.)並於30℃震盪培養。隔天早上，以6000rpm離心收取上清液並藉由以Steriflip(0,22μm；Milipore SCGP00525)過濾使其澄清。隨後，如上述沉澱噬菌體並再懸浮於1ml阻斷緩衝液(或細胞淘洗緩衝液)供用於下一輪的篩選。將等份用於測定輸入滴度。

酵素-連接之免疫吸附分析(ELISA)： 噬菌體ELISA：

在不同選擇輪次後，就特定結合劑之豐度，藉由ELISA於生物素化標靶蛋白上分析噬菌體儲池。簡言之，將甘油儲液之等份於37℃置入2xYT(100mg/ml安比西林，1%葡糖糖)ON。選取單一菌落置入含100μl培養基(2xYT,100μg/ml安比西林，1%葡糖糖)的MTP孔槽中並於37℃震盪至隔夜。藉由將10μl的隔夜培養物加至含輔助噬菌體M123K07(Invitogen 420311)之190μl新鮮培養基(2xYT添加100μg/ml安比西林)進行噬菌體表現並以200rpm和37℃在96-孔MTP中培養，直到達到~0.5之OD600。

將預先塗上鏈黴親和素(Pierce,15500)之96-孔ELISA-盤以1μg/ml生物素化標靶蛋白塗覆於4℃至隔夜。隔天將測定盤以PBST清洗7次，以阻斷試劑處理並再次以PBST清洗3次。在此期間，將ON噬菌體培養物與100μl阻斷緩衝液混合。將100μl的阻斷噬菌體轉置於各孔並於r.t.培養1h。以PBST清洗7次後，加入與HRP偶合之抗M13抗體(GE Healthcare,27-9421-01；1：2500稀釋於PBST中)，於r.t.培養1h並再次將孔槽清洗7次。藉由加入100μl TMB(Invitrogen,2023)展開顏色反應，及在加入100μl H₂SO₄(Merck,1120801000)後5-15min，停止。於盤式判讀儀(Tecan)中以450nM記錄比色反應。

藉由sFab篩選之GenIII-移除再選殖sFab

對於產生可溶性Fab片段(sFabs)，係將從第2、3和4輪選擇之質粒DNA分離並以限制酶MluI(New England Biloabs,R0198L)根據供應商說明進行消化。為了移除含基因III之片段，係將載體以明膠萃取並以NdeI(New England Biolabs,R0111S)進行殺-切。EtOH-沉澱後，將產生的片段再結紮並使用標準方法將建構轉變為化學上能勝任的大腸桿菌Top10。

實例2：抗凝血因子XI抗體及/或抗凝血因子XIa抗體

本發明之抗體、抗原-結合抗體片段及抗體和片段之變體係由輕鏈可變區和重鏈可變區所組成。涵蓋在本發明中之抗體或抗原-結合片段之變體為其中保持抗體或抗原-結合抗體片段對凝血因子XI及/或凝血因子XIa之結合活性的分子。

本發明係提供抗體或抗原-結合片段-據此可變重鏈和輕鏈區之胺基酸序列有至少60%，更佳的70%，更佳的80%或90%，或甚至更佳的95%與SEQ ID NO：1之DNA序列和SEQ ID NO：19之可變輕鏈區的胺基酸序列相同，及與SEQ ID NO：2之DNA序列和20之可變種鏈區的胺基酸序列相同，或-據此就這些抗體的成熟形式，可變重鏈和輕鏈區之胺基酸序有至少60%，更佳的70%，更佳的80%或90%，或甚至更佳的95%與其相同-藉此CDR的胺基酸序列有至少60%，更佳的70%，更佳的80%，更佳的90%，或甚至更佳的95%與SEQ ID NO：3、4和5之DNA序列和SEQ ID NO：21、22和23之可變重鏈區的胺基酸序列相同，及與SEQ ID NO：6、7和8之DNA序列，SEQ ID NO：24、25和26之可變輕鏈區的胺基酸序列相同。

本發明進一步係提供抗體或抗原-結合片段-據此可變重鏈和輕鏈區之胺基酸序列有至少60%，更佳的70%，更佳的80%或90%，甚至更佳的95%與SEQ ID NO：9之DNA序列和SEQ ID NO： 27之可變輕鏈的胺基酸序列相同及，與SEQ ID NO：2之DNA序列，和20之可變重鏈區的胺基酸序列相同，或r-據此就這些抗體的成熟形式，可變重鏈和輕鏈區之胺基酸序有至少60%，更佳的70%，更佳的80%或90%，或甚至更佳的95%與其相同-藉此CDR的胺基酸序列有至少60%，更佳的70%，更佳的80%，更佳的90%，或甚至更佳的95%與SEQ ID NO：10之DNA序列和SEQ ID NO：28之可變輕鏈區的胺基酸序列相同。

本發明係提亦供抗體或抗原-結合片段-據此可變重鏈和輕鏈區之胺基酸序列有至少60%，更佳的70%，更佳的80%或90%，或甚至更佳的95%與SEQ ID NO：11之DNA序列和SEQ ID NO：29之可變輕鏈區的胺基酸序列相同及，與SEQ ID NO：12之DNA序列和30之可變重鏈區的胺基酸序列相同，或-據此就這些抗體的成熟形式，可變重鏈和輕鏈區之胺基酸序有至少60%，更佳的70%，更佳的80%或90%，或甚至更佳的95%與其相同-藉此CDR的胺基酸序列有至少60%，更佳的70%，更佳的80%，更佳的90%，或甚至更佳的95%與SEQ ID NO：13、14和15之DNA序列及SEQ ID NO：31、32和33之可變重鏈區的胺基酸序列相同，及與SEQ ID NO：16、17和18之DNA序列，SEQ ID NO：34、35和36之可變輕鏈區的胺基酸序列相同。

實例3：使用活化部份凝血激酶時間(aPTT)分析測定抗凝血活性

抗體076D-M007-H04、076D-M007-H04-CDRL3-N110D和076D-M028-H17之抗凝血活性係使用活化部份凝血激酶時間(aPTT)分析來試驗。

使人類和兔子血漿中aPTT加倍所需的濃度之數值係提供於表8中：

實例4：測定FXIa抗體之抗-凝集活性

就於流動條件下測量血小板活化，係將載玻片(Menzel-Gläser SUPERFROST 76 x 26mm；Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig,Germany)塗覆上膠原蛋白(150μg/ml)於4℃至隔夜，接著以SA(5mg/ml)阻斷，之後組合置入Zeiss Axiovert 135顯微鏡之載物台上。(Carl Zeiss,Göttingen,Germany)。將檸檬酸鹽的全血以GPRP(最終3mM)和媒劑或FXI抗體於37℃培養10min。加入CaCl₂(5mM)後，將血液以1000s^-1最初的剪切速率立即灌注於塗覆膠原蛋白的載玻片上5min。如上述灌注全血後，每1min將後室全血收集至檸檬酸鈉(1：10 vol/vol)中。前室血液亦同樣取樣並在有或無TRAP6作為正性對照(10μg/ml)下處理5min。

將前室-和後室血液樣本以細胞沖洗液(BD Biosciences,Heidelberg,Germany)稀釋並於4℃以抗體培養20min。加入冰冷的細胞沖洗液停止抗體反應並將所有的樣本置於冰上直到測量。10000個單一血小板係以FITC-接合血小板標記(CD41a或CD61a)陽性來測定而特徵光散射模式係以流式細胞儀(FACSCalibur；BD Biosciences,Heidelberg,Germany)來測定。就CD62P表現，單一血小板係以PE-CD62P螢光閥值為門控做成一個別的散射圖，其係以未標定的對照樣本來查驗。在閥值以上的血小板群族係視為活化的並加以量化。血小板微聚集係以前散射(FSC)和FITC-螢光之任意閥值來定義。

實例5：FeCl ₂ 引發兔子之血栓和耳朵出血時間

以動脈血栓模型測定076D-M007-H04、076D-M007-H04-CDRL3-N110D和076D-M028-H17之抗血栓活性。以大量靜脈注射投予076D-M007-H04(0.5mg/kg,1mg/kg,2mg/kg)、076D-M007-H04-CDRL3-N110D(0.1mg/kg,0.3mg/kg,1mg/kg)或076D-M028-H17(0.075mg/kg,0.15mg/kg,0.3mg/kg)後15分鐘，藉由氯化鐵以頸動脈之化學性損傷引發兔子之血栓。將雄兔(Crl：KBL(NZW)BR,Charles River)以肌肉內注射給予甲苯噻井(xylazine)和K他命(ketamine)(Rompun,Bayer 5mg/kg和Ketavet Pharmacia & Upjohn GmbH,40mg/kg體重)之混合物麻醉。於右耳的邊緣靜脈以麻醉混合物之輸液追加麻醉。在露出右總頸動脈後，藉由將一片Parafilm®(25mm x 12mm)上的吸墨紙(10mm x 10mm)以不會影響血流的方式，放置在右總頸動脈下，造成血管損傷。吸墨紙係以100μl FeCl₂(氯化鐵(II)四水合物)，13%於A.dest中，Sigma)使其飽和。5分鐘後，將濾紙移除並將容器以0.9% NaCl沖洗二次。受傷30分鐘後，移出頸動脈，抽出血栓並立即秤重。各組係使用5-7隻動物。FeCl₂-受傷後2分鐘，測定耳朵出血時間。將左耳的毛刮除並以手術刀(編號10-150-10,Martin,Tuttlingen,Germany)造一與耳朵長軸平行之標準化切口(3mm長)。提供照護以避免可視血管之損傷。將切口處以濾紙篩塞住30秒時間間隔，小心避免與傷口接觸。藉由測量從切開至血液不再將濾紙染色的時間，來測定出血時間。

實例6：測定FeCl ₂ 引發的兔子之血栓和耳朵出血時間

如圖中所述，14076D-M007-H04劑量依賴的降低血栓重量且不會延長耳多出血時間。圖15係顯示076D-M007-H04-CDRL3-N110D在無增加耳朵出血時間下之抗血栓效應。在圖16中，係顯示076D-M028-H17之抗血栓效應和無延長出血時間。

實例7：Fab 076D-M007-H04：FXIa複合物之複合物形成、結晶和X-光結構測定 複合物形成和結晶

FXIa C500S(胺基酸388-625)係購自Proteros Biostructures。將純化的Fab 076D-M007-H04以1：1比例與FXIa C500S混合。將溶液儲存於冰上18小時，讓複合物形成。將複合物溶液裝入Superdex 200 HR 16/60管柱並進一步濃縮成最終濃度20mg/ml於20mM Tris/HCl，pH 7.5和75mM NaCl中。包括Fab 076D-M007-H04和FXIa C500S之蛋白複合物的晶體係於20℃使用坐滴法長出，並藉由混合等體積之蛋白複合物溶液和孔槽溶液(100mM TRIS pH 8.25,0.05% PEG20000，和2.4M NH4SO4作為沉澱劑。大約五天後，出現一蓮座狀之結晶。

數據收集和處理

將結晶以液態氮快速冷凍而無使用冷凍-緩衝液。以光束BL14.1,BESSY同步加速器(Berlin)於MAR CCD偵測器上收集晶體之數據。將數據編入索引並以XDS整合(Kabsch,W.(2010)Acta Cryst.D66,125-132)，以POINTLESS準備換算並以SCALA換算(P.R.Evans,(2005)Acta Cryst.D62,72-82)。晶體衍射至高2.7Å及具有正交晶空間群P2(1)22(1)，其中細胞常數a=61.9、b=70.7c=185.9和一Fab 076D-M007-H04：不對稱單元中FXIa C500S複合物。

結構測定和精修

FXIa和單株抗體Fab 076D-M007-H04之複合物結構係以不同步驟藉由分子取代來解析。首先使用BALBES(F.Long,A.Vagin,P.Young和G.N.Murshudov(2008)Acta Cryst.D64,125-132)定位出H-鏈，以pdb碼3GJE作為搜尋模型。然後使用MolRep程式，以內部FXIa晶體結構作為搜尋模型，加入FXIa C500S。以REFMAC5.5(G.N.Murshudov 等人(1997)Acta Cryst.D53,240-255)之最初的精修產生R1=39.4%和Rfree=44.1%。最後，使用pdb進入3IDX之L-鏈作為搜尋模型，定位出H-鏈，及固定最初精修的H-鏈和FXIa C500S溶液的座標。以COOT(P.Emsley等人(2010)Acta Cryst.D66：486-501)建立之迭代轉及使用REFMAC5.5之最大可能精修，完成此模型。數據組和精修統計係概述於表10。

a 括號內的值為高解析層

b R_merge=Σhk1｜I_hk1-<I_hk1>/Σhk1<I_hk1>，其中I_hk1為反射強度，hk1和<I_hk1>為多次觀察值之平均強度

c R_cyst=Σ｜F_obs-F_calc｜/ΣFobs，其中F_obs和F_calc分別為觀察和理論結構因子振幅

d 5%試驗組

e RMSD，來自理想立體化學之參數組之均方根誤差

實例8：以X-光結構為基礎之表位定位

Fab 076D-M007-H04和FXIa C500S(圖17)之複合物每一不對稱單元係結晶為一複合物之複本。測定與FXIa C500S(表位)接觸之Fab 076D-M007-H04(補位)的殘基並列於表Xa和Xb中。以CCP4程式AREAIMOL(P.J.Briggs(2000)CCP4 Newsletter No.38)分析隱藏的表面且當分別以結合和無結合Fab 076D-M007-H04(表11a)和FXIa C500S(表11b)計算時，殘基顯示總面積差。

總言之，FXIa C500S表位係由下列殘基所形成：HIS A 406、PRO A 410、THR A 411、GLN A 412.ARG A 413、HIS A 414、ASN A 450、GLN A 451、SER A 452、ILE A 454、LYS A 455、ARG A 522、LYS A 523、LEU A 524、ARG A 525、ASP A 526、LYS A 527、ILE A 528、GLN A 529、ASN A 530、THR A 531

Fab 076D-M007-H04作為異位競爭抑制劑。其並未直接阻斷FXIa的活性位置但與其相鄰者結合。此相鄰的結合觸發FXIa之活性位置的部分重排，阻礙了天然物質與活化的FXIa結合(圖18)。

反之，Fab 076D-M007-H04不會與酶原FXI結合。在提出的酶原FXI之x-光結構中(pdb進入2F83)各種建構活性位置之環以及Fab 076D-M007-H04之表位並非井然有序。特別是，表位區域在Fab 076D-M007-H04：FXIa C500S複合物中為建構完全的。

實例9：以氫/氘-交換質譜為基礎之表位定位

由契約研究機構ExSAR[ExSAR公司；11 Deer Park Drive,Suite 103；Monmouth Junction,NJ 08852；USA]進行一不同的表位定位分析。在此案例中，FXIa C500S(胺基酸388-625；購自Proteros Biostructures)分別和純化的076D-M007-H04和076D-M049-O15之Fab的交互作用，已以不同的氫/氘交換質譜法來分析[瀏覽請參見Percy AJ,Rey M,Burns KM,Schriemer DC.(2012)Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry-a review.Anal Chim Acta.721：7-21]。就此，大於10%氘化量之差異係顯示被對應抗原之Fab強力保護。介於5和10%之值係顯示結合力弱，低於5%氘化量之差異係顯示無任何保護。

表12a和表12b係概述分別與FXIa接觸的Fab 076D-M007-H04和Fab 076D-M049-O15之殘基。

表12a：與FXIa接觸之Fab 076D-M007-H04殘基

表12b：與FXIa接觸之Fab 076D-M049-O15殘基

這些數據清楚地顯示覆蓋FXIa內200個胺基酸之表位(FXIa C500S之408-609胺基酸)使得FXIa蛋白解離活性受到抑制。

實例10：以本發明之抗體功能性中和FXIa

人類FXIa(Haematologic Technologies,Inc.，型號HCXIA-0160)活性係藉由測量專一性、經螢光標定的基質(I-1575,Bachem，最終濃度25μM)之裂解來測定，且螢光係使用SpectraFluorplus判讀儀(Tecan)於360/465nm連續監看。就試驗此抑制活性，係將抗體於37℃以最終濃度10nM的FXIa之含50mM Tris/HCl,100mM NaCl,5mM CaCl2和0.1% BSA的緩衝液，預培養60分鐘。在培養步驟後，加入基質I-1575，並測量反應之訊號。使用GraphPadPrism軟體分析數據，如圖1、圖2、圖3和圖4中所示。數據係以平均值±SEM來表示，n=4。

對於某些實驗，係使用分離的FXIa C500S催化區(胺基酸388-625；購自Proteros Biostructures)取代全長的人類FXIa(Haematologic Technologies,Inc.，型號HCXIA-0160)。所有的其他條件係如上所述。

實例11：以本發明抗體功能性中和FXI轉化為其活性形式FXIa

就試驗抑制FXI(Haematologic Technologies,Inc.，型號HCXIA-0150)藉由FXIIa或凝血酶(凝血酶為IIa)轉變成其活性形式FXIa，係將10nM的人類FXI於50mM Tris/HCl,100mM NaCl,5mM CaCl2和0.1% BSA中以不同濃度之抗體在37℃培養1小時。在下個步驟，將10nM最終濃度的人類FXIIa(Enzyme Research，型號HFXIIa 1212a)加入最終濃度1unit/mg之凝血酶(Enzyme Research，型號HT 1002a)並於37℃培養24小時。接著加入最終濃度200nM之玉米胰蛋白酶抑制劑(Enzyme Research,CTI)和經螢光標定的基質(I-1575,Bachem，最終濃度25μM)。使用SpectraFluorplus判讀儀(Tecan)於360/465nm連續監看螢光。使用 GraphPadPrism軟體分析數據，FXIIa媒介的FXI轉化係如圖5和圖7所示，而凝血酶引發的FXI轉變成其活化形式FXIa係如圖6和圖8所式。數據係以平均值±SEM來表示，n=4。

實例12：於實驗性血栓形成之靈長類活體模型中評估抗-FXIa抗體076D-M007-H04之抗血栓活性 實驗程序

實驗係於體重9-11kg之非凝血清醒少年狒狒中進行。這些動物具有置於股動脈和靜脈間之慢性外置動靜脈(AV)分流，如他處所述(Hanson等人(1993)Journal of Clinical Investigation 92：2003-2012)。在所有的研究動物中，基線分流血流超過250ml/min。以低劑量的K他命(<2mg/kg/hr)管理焦慮。在實驗前後，每日測量全血細胞數。在任何實驗日，計算的失血不超過4%的總血量。

藉由插入人工血管移植物之凝血酶原段片(ePTFE,WL Gore & Co.,Flagstaff,Ariz.)於狒狒AV分流內引起血栓性成，如前面所述(Hanson等人[1993]J.Clin.Invest.92：2003-2012)。將臨床移植物段片塗覆上固定的膠原蛋白，以便一致地觸發血小板-依賴的血栓形成。將具有2或4mm內徑(i.d.)之20mm長的移植物填入馬第I型膠原蛋白(1mg/ml；Nycomed Arzenmittel,Munich,Germany)計15min，及於無菌空氣流下乾燥至隔夜。如掃描電子顯微鏡所測，此方法於移植物內腔中產生均勻的膠原蛋白塗層。此外，在某些實驗中，以9mm i.d.之20mm長的胺室接著4mm i.d.之20mm長移植物分別作為平均靜脈和動脈剪切速率之模型。然後將此塗覆凝血酶原膠原蛋白之移植物併入矽橡膠管段片間，並調動進入AV 分流。將移植物暴露於血液至高60min。在各實驗期間，通過移植物之血流速率係藉由夾住基部矽橡膠管分流段片，限制至100ml/min，藉此於4mm移植物中產生265/秒之平均壁面剪切速率(MWSR)，而在2mm移植物中最初的MWSR為2120/秒。使用超音波流量計(Transonics Systems,Ithaca,N.Y.)持續監測流速。4mm移植物無阻塞且脈動血流仍為100ml/min直到凝血酶原移植物段片於60min時移除。每次實驗後，基線血流恢復通過永久分流。在2mm直徑的移植物中，由於血栓形成血流速率逐漸下降。當血流速率從100ml/min降至20ml/min，訊號顯示即將阻塞時，將移植物從AV分流中移除。將從血流開始至移植物移除(<20ml/min血流)的時間定為阻塞時間。

就血小板沉積之造影，將自體狒狒血小板以1mCi的111In-oxin如前述標定(Hanson等人[1993]J.Clin.Invest.92：2003-2012)。輸入經標定的血小板並使其循環至少1小時，之後進行研究。使用γ閃爍攝影機以5-min之間隔測量堆積在凝血酶原移植物和矽室上之經標定的血小板。在每次研究前10min，將同源經125I-標定的狒狒纖維蛋白原(4μCi,>90%可凝結)輸入，及>30後使用γ計數器評估血栓內併入之標定的纖維蛋白，使111In衰減。將所沉積的放射活性除以最初研究時所取的樣本之可凝結纖維蛋白(原)放射活性(cpm/mg)。

阻塞研究係使用產生高的初始內壁剪切速率(2120/sec以100ml/min夾住的血流)之20mm長，2mm i.d.塗覆膠原蛋白的裝置來進行。使用γ閃爍攝影機以3-min之間隔測量堆積在2mm凝血酶原移植物上之經標定的血小板。盡可能以夾住基部將流速維持在100ml/min，及然後當擴增的血栓開始阻塞此裝置時，使其減低。使用20ml/min之最終血流速率作為阻塞之截斷點，因為完全阻塞的血栓和缺乏血流通過此裝置可能導致分流阻塞和動物明顯的失血。

血液樣本分析。使用micro-60自動細胞計數器(Horiba-ABX Diagnostics)測定血球數。收集血液樣本置入最終濃度0.32%之檸檬酸鈉中。將所有的樣本以12,900g離心5min並收集血漿及儲存於零下80℃。使用交叉反應性ELISA分析測定凝血酶-抗凝血酶複合物(TAT,Enzygnost-TAT,Dade-Behring；LOD：2ng/mL)。用於這些研究之所有的ELISA試驗套組先前已顯示對狒狒標記具敏感性。

在中斷研究中(僅4mm id.塗覆膠原蛋白之移植物)，076D-M007-H04係在進入此研究30分鐘時，以大劑量投予(0.5mg/kg,10秒內大劑量靜脈注射)用以測定此抗體是否可中斷急性血栓擴增。在阻塞研究中(僅2mm i.d.塗覆膠原蛋白之移植物)，076D-M007-H04係在實驗前3小時以大劑量投予(0.5mg/kg或2mg/kg，靜脈注射0.5mg/kg劑量後24小時)。在預防研究中(4mm i.d.塗覆膠原蛋白之移植物，接著9mm i.d.矽室)，076-M007-H04係在實驗前1小時以大劑量投予(0.5mg/kg或2mg/kg，靜脈注射0.5mg/kg劑量後24小時)。

止血評估。在狒狒中FXIa對初級止血之抑制效應係使用標準的模板皮膚出血時間試驗(Surgicutt®,International Technidyne Corp)來評估。實驗上，此試驗和類似試驗(例如Simplate出血時間)在人類和非人類靈長類中，已顯示對治療抗凝血劑、抗血小板劑和凝血異常之效應具敏感性(Gruber等人[2007]Blood 109：3733-3740；Smith等人[1985]Am.J.Clin.Pathol.83：211-215；Payne等人[2002]J.Vasc.Surg.35：1204-1209)。所有的出血時間係由相同的專業技師來進行。就直接的止血評估，aPTT(活化部份凝血激酶時間；SynthASil,HemosIL；Instrumentation Laboratory Company,Bedford,MA)和ACT(活化凝血時間，LupoTek KCT；r2 Diagnostics,South Bend,IN)測量亦於實驗前、實驗期間和實驗後的不同時間點進行。

活體外aPTT。在開始aPTT分析之前，將各種濃度的076D-M007-H04於血漿中培養10分鐘。如圖20所示，於從狒狒收集來的血漿樣本中，在「前」時間點，，亦即在給予任何治療前，測量aPTT凝結時間。結果顯示，在血栓研究中從所有6個實驗所用的狒狒，076D-M007-H04為血漿之抗凝血劑。

活體內凝血研究。這些實驗係使用三隻狒狒：將二隻狒狒在給予32m/kg可嚼式阿斯匹靈後，給劑076D-M007-H04(2.5mg/kg H04，大量靜脈注射)，而1隻狒狒係給劑0.5mg/kg 076D-M007-H04(大量靜脈注射)接著24小時後2mg/kg劑量(大量靜脈注射)。在給藥後不同的時間點測量ACT(圖21和圖22)和aPTT(圖23和圖24)。

分流實驗期間之血小板沉積

血栓阻塞實驗。用於評估076D-M007-H04治療是否可預防小血管阻塞或延長阻塞時間之凝血酶源裝置係由2mm i.d.,20mm長塗覆膠原蛋白之移植物所組成。

如圖25所示，血小板沉積顯示達60分鐘或直到移植物阻塞時(當有時)。12/14的對照裝置在60分鐘內阻塞，而2/5的076D-M007-H04(0.5mg/kg)和2/5的076D-M007-H04(0.5mg/kg+2mg/kg)裝置阻塞。數據為平均值±SEM。

血栓預防實驗。用於評估076D-M007-H04對血栓啟動和擴增之效應的凝血酶原裝置係由4mm i.d.,20mm長塗覆膠原蛋白之ePTFE移植物，接著9mm i.d.,20mm長塗覆膠原蛋白之矽橡膠室所組成。如圖26所示之血小板沉積的斜率代表抗血小板活性。如從血栓形成開始在不同的時間，血小板沉積率下降所證明，二種劑量的076D-M007-H04(0.5mg/kg和0.5mg/kg接著2mg/kg 24小時後)顯現功效。數據已正常化，以說明各實驗間之血小板數變異。數據為平均值±SEM。

如圖27所示，從血栓形成開始在不同的時間，於矽室中血小板沉積率大幅下降所證明，二種劑量之076D-M007-H04(0.5mg/kg和0.5mg/kg接著2mg/kg 24小時後)顯現功效。數據為平均值±SEM。

凝血酶抗-凝血酶複合物。因為抑制FXI，藉由限制凝血酶媒介的血小板活化和纖維蛋白形成及/或藉由增加血栓溶解在活體內，可能降低血栓形成，所以使用市售的ELISA套組測量凝血酶抗-凝血酶(TAT)的量。如圖28所示，以076D-M007-H04(0.5mg/kg和0.5mg/kg接著2mg/kg 24小時後)預治療之狒狒防止了TAT量增加，其意味著在缺乏FXIa活性下大幅降低凝血酶產生。

出血時間。初級止血係使用經FDA核准供用於小孩和成人之成人Surgicutt裝置(http：//www.itcmed/com/products/surgicutt-bleeding-time-device)來評估。出血時間(BT)係以人工記錄。觀察傷口之再出血30分鐘，及隔天評估皮膚的挫傷、瘀點、血腫和瀰漫。一或多項這些止血評估已顯示實際上所有的市售抗血栓劑(抗血小板藥物、抗凝血劑、血栓溶解劑)之敏感和預期的止血效用。

將狒狒單獨或在給予可嚼式阿斯匹靈(ASA,32mg/kg)後，施予076D-M007-H04(0.5mg/kg和2mg/kg 24小時後)。如圖29所示，就任何的076D-M007-H04治療，相較於基線，出血時間並未增加。施予076D-M007-H04於經阿斯匹靈治療的動物，相較於單獨阿斯匹靈治療，似乎不會進一步增加出血時間。

<110> 拜耳製藥股份有限公司

<120> 可結合至凝血因子XI及/或其活化型式因子XIa的抗體及其用途

<130> BHC121014

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<170> PatentIn version 3.5

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Claims

一種能與凝血因子XIa(FXIa)結合之人類單株抗體及其抗原-結合片段，其特徵在於其係抑制血小板聚集，並藉此在無危及止血下抑制血栓形成，其係包括SEQ ID NO：21之CDRH1，SEQ ID NO：22之CDRH2和SEQ ID NO：23之CDRH3和SEQ ID NO：24之CDRL1，SEQ ID NO：25之CDRL2和SEQ ID NO：26之CDRL3。
一種能與FXIa結合之人類單株抗體及其抗原-結合片段，其特徵在於其係抑制血小板聚集，並藉此在無危及止血下抑制血栓形成，其係包括SEQ ID NO：21之CDRH1，SEQ ID NO：22之CDRH2和SEQ ID NO：23之CDRH3和SEQ ID NO：24之CDRL1，SEQ ID NO：25之CDRL2和SEQ ID NO：28之CDRL3。
一種醫藥組成物，包括如申請專利範圍第1或2項的抗體或其抗原-結合片段。
一種醫藥品，包括如申請專利範圍第1或2項的抗體或其抗原-結合片段。
一種核酸，編碼如申請專利範圍第1或2項的抗體或其抗原-結合片段。
一種載體，包括如申請專利範圍第5項的核酸。
一種宿主細胞，包括如申請專利範圍第6項的載體。