CN113227150B - 抗凝血因子xi抗体 - Google Patents

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Abstract

本技术公开了结合凝血因子XI(FXI)和/或其活化形式因子XIa(FXIa)，或FXI和/或FXIa的片段的抗体，以及含有该抗体的组合物。还公开了制备抗体的方法，以及抗体用于制备治疗和/或预防凝血相关病症(例如血栓和与血栓相关的并发症或病症)药物的用途。

Description

抗凝血因子XI抗体
技术领域
本发明涉及能够结合凝血因子XI(FXI)和/或其活化因子XIa(FXIa)以及FXI和/或FXIa片段的抗体及其用途，包括作为制备可以治疗血栓却不影响止血功能的抗凝剂的用途。
背景
血栓是一种血液在血管中凝结后，阻塞或阻碍受影响区域中的血流通过的病症。如果血凝块沿着循环系统行进到身体关键部位，可导致严重的并发症，例如进行到心脏、脑和肺，就可能引起心脏病发作、中风和肺栓塞等疾病。血栓形成是大多数中风和心肌梗塞、深静脉血栓形成(DVT)、肺栓塞和其他心血管事件的主要原因。1，2血栓形成可以通过抗凝剂(例如低分子量肝素，华法林和Xa因子直接抑制剂)治疗或预防。这些目前可用的疗法中最常见的不良反应是止血功能受损。3-5由于受试者治疗后需要受到密切监测，这些治疗方法受剂量和患者依从性的限制。
所以需寻求一种副作用最小的有效的预防或治疗血栓形成的药物。本发明满足了本领域的这一需求。
发明内容
本发明的某些实施方案提供了结合凝血因子XI(FXI)和/或其活化形式因子XIa(FXIa)，以及FXI和/或FXIa片段的抗体。在某些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，该抗体是重组抗体。在某些实施方案中，该抗体是人源化抗体。在某些实施方案中，该抗体是免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如Fab，Fvs或scFv。在某些实施方案中，该抗体结合FXI和/或FXIa的A3结构域。在一些实施方案中，该抗体包括一个或多个CDR序列，这些CDR序列包含或由SEQ ID NOs：11-16，27-32，43-48，59-64，75-80，91-96，107-112，123-128，139-144，155-160，171-176以及187-192组成。
本发明提供了用于治疗和/或预防血栓和/或与血栓形成相关的并发症或疾病的药物组合物。该药物组合物包含本发明公开的一种或多种抗FXI和/或抗FXIa抗体。在某些实施方案中，该药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的佐剂、载体、赋形剂、防腐剂或其组合。
本发明提供了编码本发明公开的抗FXI和/或抗FXIa抗体，或任一抗体功能片段的核酸，以及包含所述核酸的载体，和包含所述载体的宿主细胞。在某些实施方案中，该载体是在宿主细胞中能产生由该核酸编码的抗体或其功能片段的表达载体。
本发明提供了一种试剂盒，其包含本说明书公开的一种或多种抗FXI和/或抗FXIa抗体，用于治疗和/或预防血栓形成和/或与血栓形成相关的并发症或病症。可替代地，该试剂盒包含药物组合物，其包含本说明书公开的一种或多种抗FXI和/或抗FXIa抗体，用于治疗和/或预防血栓和/或与血栓相关的并发症或病症。在某些实施方案中，试剂盒还包含使用说明书。
本发明提供了治疗和/或预防血栓形成和/或与血栓形成相关的并发症或病症的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效剂量的本发明公开的一种或多种抗FXI和/或抗FXIa抗体。可替代地，所述方法包括向有需要的受试者施用有效剂量的含有抗FXI抗体，抗FXIa抗体或任一抗体的功能片段的药物组合物。
提供了如本说明书公开的抗FXI和/或抗FXIa抗体用于制备治疗和/或预防血栓和/或与血栓相关的并发症或病症的药物的用途。
本发明提供了制备如本说明书公开的抗FXI和/或抗FXIa抗体的方法。该方法采取的步骤包括使用编码抗体核苷酸的载体转染宿主细胞，在宿主细胞中表达抗体。该方法还可以包括从宿主细胞中纯化表达抗体。此外，可以对纯化的抗体进行修饰，修饰后的重组抗体保留相应的人抗体的活性。可替代地，本说明书公开的抗体可以从杂交瘤培养产生。
附图说明
图1A-1E显示通过APTT检测方法测定五种抗FXI抗体在人血浆中的抗凝效果。如实施例3所述，5种不同的抗体以0至400nM分别加到人血浆中进行APTT检测。测试的五种抗体包括19F6(A)、34F8(B)、42A5(C)、1A6(D)和14E11(E)。在本实验中，抗体1A6和14E11用作阳性对照。
图2A-2C显示抗体19F6(A)、34F8(B)和42A5(C)在猴血浆中的APTT测定的抗凝效果。如实施例4所述，3种不同的抗体以0至400nM分别加到猴血浆中，进行APTT检测。
图3A-3F显示FXI与固相化的h-19F6(A)、h-34F8(B)和h-42A5(C)结合的SPR传感图，以及FXIa与固相化的h-19F6(D)、h-34F8(E)和h-42A5(F)结合的SPR传感图。数据符合和1∶1结合模型，在FXI(0.005-1ng/mL)的测试浓度范围下进行曲线拟合。每条曲线代表FXI或FXIa的不同测试浓度。
图4A-4C显示抗体h-19F6(A)、h-34F8(B)和h-42A5(C)抑制人FXIa水解S-2366的浓度-响应曲线。
图5A-5B显示抗体h-19F6(A)和h-42A5(B)对FXIa介导的FIX活化为FIXa反应的抑制作用。将人FIX(200nM)与FXIa(5nM)以及1μM h-19F6或h-42A5置于含5mM CaCl2的PBS中，室温下温育。在指定的时间间隔收集样品，使用山羊抗人FIX IgG(Affinity Biologicals)通过蛋白质印迹法对样品中的FIX以及FIXa的蛋白量进行测定。图5C-5D说明了抗体h-19F6(C)和h-42A5(D)对FXIIa介导的FXI向FXIa的活化的抑制作用。将人FXI(500nM)与FXIIa(50nM)在含有1μM h-19F6或h-42A5的溶液中孵育。通过蛋白质印迹方法检测不同时间点的FXI以及代表FXIa产生的FXIa轻链的蛋白量。人IgG4(1μM)用作对照。
图6A-6C显示抗体h-34F8，h-19F6和h-42A5在食蟹猴体内的APTT的抗凝效果。猴子静脉内施用指定剂量的h-34F8(A)、h-19F6(B)和h-42A5(C)。在给药前(时间0)和给药后0.5、1、3、6、12和24小时测定离体血浆的APTT凝血时间。
图7A-7C显示抗体h-34F8、h-19F6和h-42A5对食蟹猴PT的影响。猴子静脉内施用指定剂量的h-34F8(A)、h-19F6(B)和h-42A5(C)。在给药前(时间0)和给药后0.5、1、3、6、12和24小时测定离体血浆中的PT凝血时间T。
图8A-8C显示抗体h-34F8、h-19F6和h-42A5对食蟹猴动静脉(AV)分流血栓形成的影响。对猴子静脉内施用剂量升高的h-34F8(A)、h-19F6(B)或h-42A5(C)(对于h-34F8和h-19F6组，n＝3；对于h-42A5组，n＝4)，对AV分流血栓猴模型测定用药前、后血栓重量变化。*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.001，vs.溶媒对照组。
图9A-9C显示抗体h-34F8、h-19F6和h-42A5对食蟹猴出血时间的影响。对猴子静脉内施用剂量升高的h-34F8(A)、h-19F6(B)或h-42A5(C)(对于34F8和h-19F6组，n＝3；对于h-42A5组，n＝4)，在给药前和每次给药后30分钟计算出血时间。
图10A-10B显示抗体h-34F8、h-19F6和h-42A5的抗血栓效应。四组猴(n＝5)静脉内分别施用溶媒对照、0.3mg/kg的h-34F8、h-19F6或h-42A5，给药后2小时，将FeCl3施用于每只动物的左股动脉，以诱导血栓形成。通过监测血流速度确定达到80％血栓闭塞(A)和100％血栓闭塞(B)的时间。*P＜0.05以及**P＜0.01vs.溶媒对照组。
图11A-11D显示使用抗体h-34F8，h-19F6或h-42A5治疗不会延长猴的出血时间。对四组猴(n＝5)静脉内施用溶媒对照、0.3mg/kg的h-34F8、h-19F6或h-42A5，并在给药前和给药后1小时测量出血时间。h-34F8，h-19F6和h-42A5治疗组各自出血时间分别见图(A)、(B)和(C)所示。溶媒对照组、h-34F8，h-19F6或h-42A5治疗组出血时间的组间变化见图(D)所示。
图12A-12B显示抗体h-34F8、h-19F6和h-42A5对猴血浆凝血时间的影响。四组猴(n＝5)分别静脉内施用溶媒对照、0.3mg/kg的h-34F8、h-19F6和h-42A5，并且在给药前和给药后约3小时进行采血，用于血浆制备以及凝血时间APTT和PT的测定。APTT变化和PT变化见图(A)和(B)所示。**P＜0.01和***P＜0.001vs.溶媒对照组。
图13为人FXI(SEQ ID NO：203)的氨基酸序列。
图14A-14B显示了修饰的抗体h-19F6(A)和h-42A5(B)对食蟹猴APTT的作用。给猴子静脉内施用指定剂量的修饰后的h-19F6和h-42A5。分别在给药前(时间0)以及给药后0.5、2、6、12、24、48、96、168、240和336小时进行离体血浆的APTT凝血时间测定。
图15A-15B显示了修饰的抗体h-19F6(A)和h-42A5(B)对食蟹猴的PT的影响。给猴子静脉注射指定剂量的修饰的h-19F6和h-42A5。分别在给药前(时间0)以及给药后0.5、2、6、12、24、48、96、168、240和336小时，进行离体血浆的PT凝血时间测定。
图16A-16B显示了h-19F6和h-42A5对人血浆中APTT和PT的影响。图16A显示了h-19F6和h-42A5对人血浆中APTT的作用。图16B显示了h-19F6和h-42A5对人血浆中PT的影响。
图17显示了受测抗体对人FXI的结合特异性。在蛋白质印迹实验中，将10μL人标准血浆、乏FXI人血浆分别作为FXI阳性和FXI阴性对照。
图18显示在AV分流血栓形成模型中h-19F6和h-42A5对给药前和给药后1小时记录的出血时间的影响。
图19A-19D显示了h-19F6和h-42A5与人FXI的结合特性。图19A显示了传感芯片上捕获特定浓度FXI的流动相中的h-19F6的传感图。图19B显示了传感芯片上捕获特定浓度FXI的流动相中的h-42A5的传感图。图19C显示了当受测抗体(5μg/mL)流过固定有等量4种突变型FXI的传感器芯片时捕获的抗体，这4种突变分别是FXI A1，A2，A3或A4结构域被前激肽释放酶相应结构域替换。实验将已知抗FXI抗体O1A6作为阳性对照。图19D显示FXI被固定在传感器芯片上。将h-19F6和h-42A5(5μg/ml)以30μl/min的流速依次注入传感器表面的流通池中，并监测响应变化。实验进行了两次，并描述了代表性的结果。
图20A-20B显示了h-19F6和h-42A5与人FXIa的结合特性。图20A显示了传芯片上捕获特定浓度FXI的流动相中的h-19F6的传感图。图20B显示了传芯片上捕获特定浓度FXI的流动相中的h-42A5的传感图。
详细说明
本说明书的以下描述仅意在说明本发明的多种实例。因此，所讨论的特定变型不应被理解为对本发明范围的限制。对于本领域技术人员，在不脱离本发明的范围的情况下可以对本发明的实体的进行的多种等同替换、改变和修饰，这是显而易见的，并且应当理解为，本发明也包括了这样的等同实例。
体内凝血级联机制包括内源性途径和外源性途径。内源性途径，也称为接触激活途径，通过表面接触引发，并导致FXII的激活。内源性途径涉及FXI、FIX和FVIII。外源性途径，也称为组织因子(TF)途径，由血管损伤引发，并导致TF-FVIIa活化复合物的形成。这两个途径可交汇并激活共同途径，导致凝血酶原转化为凝血酶，并最终形成交联的纤维蛋白凝块。理想的抗凝剂应有效预防血栓形成而不损害止血作用。有证据表明，内源性凝血途径对于凝血的扩增期很重要，而外源性途径和共同的途径更多涉及启动期和蔓延期。5-8这些发现显示内源性途径在正常止血过程中起着次要作用，而内源性途径的抑制可能提供抗血栓的益处的同时，出血风险也较低。FXI是内源性途径的组成部分，最近已成为有吸引力的靶点，因为它可能具有引发抗血栓形成作用而不影响出血的潜力。3，5，6
FXI可以通过内源性途径被XIIa因子激活为FXIa，后者进而激活IX因子。流行病学研究表明，人类缺乏FXI与静脉血栓栓塞和中风的风险降低有关，而FXI水平升高与中风风险增加有关。9-11此外，缺乏FXI的人的出血倾向非常低。12，13此外，缺乏FXI的小鼠可免受多种类型的血栓形成而不会增加出血风险。14此外，在许多血栓形成动物模型中，抑制FXI的小分子抑制剂、抗体和反义寡核苷酸均具有抗血栓形成特性，且无出血风险。
本发明公开的抗体结合FXI和/或FXIa，针对的是凝血的内源性途径。FXI的结构和FXI在凝血中的作用此前已经在多种文献中被报道过。33
动物和临床研究表明，FXI与血栓形成之间存在紧密的联系。3许多研究小组已经对FXI缺陷型小鼠进行了研究，并在几种模型中显示出了显著的抗血栓表型，包括FeCl3诱导的动脉和深静脉血栓形成模型、肺栓塞模型和脑动脉闭塞模型。14，17，22，23在人类流行病学研究中，先天性FXI缺乏症患者对静脉血栓栓塞(VTE)或缺血性卒中不敏感，并且FXI水平较高的患者比水平较低的患者发生VTE和缺血性卒中的风险更高。9-11对于生理性止血，FXI的作用似乎是可有可无的。FXI缺陷型小鼠没有显示出过多的出血现象，它们的尾巴出血时间与野生型动物相当。23，24此外，严重缺乏FXI的患者虽然在手术过程中可能表现出不同的出血趋势，但并未表现出自发性出血。12，13两种或多种抗血栓形成剂的组合在临床上被广泛使用。先前的一项研究表明，阿司匹林在野生型和FXI缺陷型小鼠中引起相似的出血倾向，这表明即使在存在其他抗血栓治疗的情况下，靶向FXI仍然可能是安全的。14
所有上述发现表明，FXI/FXIa是治疗血栓形成相关疾病而不损害止血功能的安全药物靶点。因此，已经将许多方法应用于靶点FXI/FXIa以开发用于治疗血栓形成的疗法，例如抗体，寡核苷酸和小分子抑制剂。5如本说明书所述，制备了FXI/FXIa的抗体型阻断剂。抗体的优点包括速效特性和给药频率低，抗体的主要缺点是其潜在的免疫原性。25在进行体内研究之前，至少将两种受测抗体进行了人源化。两种人源化抗体h-19F6和h-42A5对人FXI/FXIa具有很高的亲和力。有趣的是，它们结合FXI的相同的结构域(A3)的不同区域。不受任何理论的束缚，这些抗体可能都抑制FXIa活性，但对由FXIIa或凝血酶介导的FXI活化没有影响。
多种类型的FXI/FXIa抑制剂在不同模型中延长了APTT的时间并显示出抗血栓形成的作用。抗FXI抗体14E11使狒狒的股骨外动静脉分流中的APTT增加约1.3倍，并减少血栓形成。17抑制FXI表达的反义寡核苷酸可降低狒狒血浆FXI水平约50％，并减少血栓形成。26，27此外，口服生物利用的小分子FXIa抑制剂ONO-5450598在猴血栓形成模型中显著抑制了血栓形成。28此外，针对治疗靶点FXI/FXIa的抗血栓形成作用也已在许多非灵长类动物模型中得到证实，例如小鼠和兔子血栓形成模型。19，29-31最近的一项临床试验表明，针对FXI的反义寡核苷酸可防止膝关节置换术患者的静脉血栓形成。32如实施例所示，在两种不同的灵长类动物血栓形成模型中评估h-19F6和h-42A5的抗血栓形成作用。在AV分流血栓形成模型中，两种抗体均以剂量依赖性方式减少血栓形成。在FeCl3诱导的血栓形成模型中，两种抗体都延长了血栓形成导致的血管闭塞的时间。这些结果提供了FXI/FXIa抑制剂的抗血栓形成作用的进一步证据。在AV分流血栓形成模型中，h-19F6和h-42A5剂量依赖的减少血栓形成表明血栓形成可能与FXI抑制程度呈负相关，这可以通过APTT延长来显示。由于h-42A5在延长APTT方面比h-19F6更有效，因此也可以推导出，在FeCl3诱导的血栓形成模型中比较h-42A5和h-19F6的抗血栓作用，会有类似的结果。因此，FXI/FXIa抑制剂延长APTT的作用越明显，对FXI/FXIa的抑制也就更强，从而可能导致更好的抗血栓形成结果。
在开发抗血栓药中，出血风险是最相关的问题。如前所述，缺乏FXI的患者在手术环境下可能会出现出血倾向。尚不清楚在出血风险方面，血浆FXI活性抑制在多大程度上仍是安全的。如实施例所示，在血栓形成实验中使用的同一批猴子上，测试了h-19F6和h-42A5强烈抑制FXI/FXIa作用的出血风险。在AV分流血栓形成动物中，随着h-19F6或h-42A5治疗剂量的增加，未观察到出血趋势，这表明出血风险可能与FXI抑制程度无关。在FeCl3诱导的血栓形成动物中，h-19F6和h-42A5均未引起过多的出血。h-42A5治疗导致血浆APTT升高约2倍，表明FXI抑制超过99％。先前的研究从未评估过在如此强烈的APTT延长和高FXI抑制条件下的出血风险。在评估其出血风险时，反义寡核苷酸ISIS416856仅导致APTT升高30％。在灵长类动物的其他出血风险评估研究中，高效的抗FXI抗体aXIMab导致APTT增加约1倍(从30.5s到65.6s)。26因此，本文所述的结果表明，强烈抑制FXI/FXIa不会增加灵长类动物的出血风险。因此，FXI可以用作血栓形成治疗的药物靶标。
抗FXI或抗FXIa抗体
本说明书提供结合FXI、FXIa和/或FXI或FXIa的片段并抑制血块形成的抗体。这些抗体能够结合FXI、FXIa和/或FXI或FXIa的片段(例如，包含A3结构域的片段)，并且在远低于最大安全剂量的浓度下显示抑制效果。例如，在一些实施方案中，剂量在0.1mg/kg i.v.至3mg/kg i.v.之间的抗体表现出对食蟹猴FXI向FXIa转化的抑制效果。此外，本说明书公开的抗体可以用作具有优异安全性的抗凝剂，因为它们与常规抗凝剂(例如肝素)相比导致出血的风险最小。
如在实施例中所示的，通过用人FXI免疫大鼠制备许多抗人FXI抗体来确定具有抗凝特性的抗体。确定出了十几种这样的抗体，其中的一些被人源化用于进一步开发。在体外和体内表征了人源化的大鼠抗人FXI抗体，例如h-19F6和h-42A5抗体。在体外研究中，人源化抗体抑制活化FXI(FXIa)介导的水解FXI，但不抑制XIIa因子诱导的FXI活化。确定了抗体与FXI的结合特性，h-19F6和h-42A5的解离常数(KD)分别为22pM和35pM。这两种抗体结合FXI A3域中的不同位点。在体内研究中，使用了两种不同的灵长类动物血栓形成模型来评估人源化抗体的抗血栓形成作用和出血风险。在动静脉(AV)分流血栓形成模型中，两种抗体均剂量依赖性地减少血栓形成而不会引起出血。在FeCl3诱导的血栓形成模型中，两种抗体均延长了血栓形成介导的血管闭塞的时间，并且两种抗体均未增加出血。两种抗体在不损害灵长类动物止血的情况下显示出抗血栓形成的功效，进一步证实靶向FXI可用于治疗血栓形成。
本说明书中，关于组合物或方法的术语“包含”是指该组合物或方法至少包括所述的元素。术语“基本上由......组成”是指该组合物或方法包括所述的元素，并且可以进一步包括一种或多种不会实质上影响该组合物或方法的新颖性和基本特性的附加元素。例如，基本上由所述元素组成的组合物可包括所述元素加上一种或多种来自分离和纯化方法的残留物、药学上可接受的载体如磷酸盐缓冲盐水、和防腐剂等。术语“由...组成”是指组合物或方法仅包括所述的元素。由每个过渡术语定义的实例均在本发明的范围内。
本文所用的术语“抗体”是指与特定抗原特异性结合或对其具有特定免疫反应性的免疫球蛋白分子或其免疫学活性部分，例如这些抗原可以是FXI、FXIa以及FXI或FXIa的特定结构域或片段，例如A3结构域。某些实施方案中，本方法、组合物和试剂盒的抗体是全长免疫球蛋白分子，其包含两条重链和两条轻链，每条重链和轻链包含三个互补决定区(CDR)。除天然抗体外，术语“抗体”还包括基因工程或其他修饰形式的免疫球蛋白，例如合成抗体、胞内抗体、嵌合抗体、完全人源抗体、人源化抗体、肽体和异源缀合物抗体(例如双特异性抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗独特型抗体、双抗体、三链抗体和四链抗体)。本发明公开的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在抗体是免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实施方案中，抗体可以是Fab、Fab′、Fv，Fab′F(ab′)2、二硫键连接的Fv、单链Fv抗体(scFv)、单结构域抗体(dAb)或双抗体等。本说明书公开的抗体，包括作为免疫球蛋白分子的免疫活性部分，它们保留结合特异性抗原(例如FXI或FXIa)或结合FXI或FXIa的特定片段(例如A3结构域)的能力。
在一些实施方案中，本文公开的抗FXI和/或抗FXIa抗体在哺乳动物细胞系进行蛋白表达过程中发生翻译后修饰，例如磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、亚硝基化、糖基化或脂化等。用于生产重组抗体和重组抗体的体外和体内修饰的技术是本领域已知的。参考文献例如mAbs 6(5)：1145-1154(2014)，其内容通过引用并入本说明书。
说明书还公开了编码本文公开的抗FXI和/或抗FXIa抗体的多核苷酸或核酸。在一些实施方案中，该多核苷酸或核酸包括DNA、mRNA、cDNA以及质粒DNA。编码本文公开的抗体或其功能片段的核酸可以克隆到载体中，例如pTT5哺乳动物表达载体，其可以进一步包括启动子和/或其他转录或翻译控制元件，以使核酸可以被表达成抗体或其功能片段。
本说明书公开一些抗体实例的核酸(DNA)和/或氨基酸(PRT)序列见表1，其包括了VH、VL和CDR序列。
表1：抗体序列
本发明某些实施方案中提供了人源化抗FXI和/或抗FXIa抗体。本领域已知有多种对于非人源抗体进行人源化以使其接近人体天然存在抗体的技术。天然抗体的每个抗原结合结构域中存在6个CDR。这些CDR是短的、非连续的氨基酸序列，当抗体呈现其三维构型时，其被特异性定位以形成抗原结合结构域。抗原结合结构域其余部分称为“框架”区域，这些区域的分子间可变性较小并形成支架使CDR得以正确定位。在一些实施方案中，本文公开的抗体或片段具有CDR3区的保守序列。
例如，本文公开的抗体人源化可以通过移植免疫小鼠或大鼠产生的单克隆抗体CDR来完成。小鼠单克隆抗体的CDR可以移植到人框架中，随后将其连接到人恒定区以获得人源化抗体。简言之，可以搜索人种系抗体序列数据库、蛋白质数据库(PDB)、INN(International Nonproprietary Names)数据库和其他合适的数据库，并且通过搜索找到和所需抗体最近似的框架。此外，一些对供体氨基酸残基所进行的回复突变在人受体框架上进行。在一些实施方案中，可变区与人IgG恒定区连接。例如，可以使用人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc结构域。基于现有技术，将由非人物种产生的单克隆抗体人源化是本领域普通技术人员的基本能力。
表2为几个人源化抗体的可变区序列的示例。
表2：人源化抗体的序列
本发明提供的抗体包括了本说明书公开序列的变体，其氨基酸序列中含有一个或多个突变，同时保留对FXI、FXIa和/或其片段(例如包含A3结构域的片段)的结合亲和力。在一些实施方案中，抗体的可变区包括具有与以下序列至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％相同的氨基酸序列或保留对FXI、FXIa和/或其片段结合亲和力的氨基酸片段，该序列选自SEQ ID NO：9、10、25、26、41、42、57、58、73、74、89、90、105、106、121、122、137、138、153、154、169、170、160、170、185、186和197-209。
本说明书还公开了包括编码结合FXI、FXIa和/或其片段(例如，包含A3结构域片段)的抗体的核酸变体。在一些实施方案中，编码抗体可变区在内的核酸包括具有与以下序列至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％相同的核酸序列或编码对FXI，FXIa和/或其片段具有结合亲和力多肽的核酸片段，该序列选自SEQ ID NO：1、2、17、18、33、34、49、50、65、66、81、82、97、98、113、114、129、130、145、146、147、148、161、162、177和178。
在一些实施方案中，将对上述抗体进行进一步的策略性的化学，生产，和控制(CMC)开发，以使本文公开的新颖抗体(例如单克隆抗体或人源化单克隆抗体)得以从早期药物发现，到临床试验和后续药物上市。修饰将进一步改善了抗体的属性，而不损害抗体的免疫功能。在某些实施方案中，CMC修饰的抗体和未修饰的抗体相比，在多种温度(例如4℃，25℃和37℃)下，在更长的时间段(例如3天，7天，14天和28天)下，以及在反复的冷冻/解冻循环下(例如-40℃/25℃至5个循环)更稳定。另外，CMC修饰的抗体具有可接受的溶解度。例如，对于给定的轻链或重链序列，某些氨基酸可以是潜在的氧化和糖基化位点。在潜在的氧化，脱酰胺或糖基化位点的这些氨基酸残基可以被突变，并且附近的其他残基也可以被突变和/或优化以维持特定抗体的3D结构和功能。在一些实施方案中，具有氧化，脱酰胺或糖基化潜力的CDR区中的一个或多个氨基酸残基发生突变以改善抗体或其片段的稳定性而不损害免疫功能。在一些实施方案中，具有氧化潜力的CDR区中的一个或多个Met残基发生突变。在一些实施方案中，具有脱酰胺潜力的CDR区中的一个或多个Asn残基发生突变。
几种CMC优化的人源化抗体示例的可变区的序列显示在下表3中。
表3：CMC优化的人源化抗体的序列
药物组合物
本说明书公开的抗体可以配制成药物组合物。该药物组合物还可包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、防腐剂或其组合。该药物组合物可以是多种剂型，例如可以是注射制剂、冻干制剂、液体制剂等。根据剂型和给药途径，可以选择合适的佐剂、载体、赋形剂、防腐剂等作为添加剂。34
该药物组合物可以包括在具有该组合物用法说明的试剂盒中。
治疗方法
本发明对于患有血栓和/或血栓发生风险升高的受试者，提供了治疗和/或预防血栓的方法。还提供了抑制受试者血块形成的方法。这些方法需要施用有效剂量的本发明提供的抗FXI和/或FXIa抗体，以干预内源性途径。在一些实施方案中，这些方法包括向受试者施用包含本发明提供的抗FXI和/或抗FXIa抗体的药物组合物。
本说明书公开了对于有需要的受试者，预防和/或治疗血栓相关的并发症或病症的方法。血栓会导致许多并发症或病症，例如栓塞性中风、静脉血栓(例如静脉血栓栓塞(VTE)、深静脉血栓(DVT)和肺栓塞(PE))，动脉血栓(例如急性冠状动脉综合征(ACS)、冠状动脉疾病(CAD)和外周动脉疾病(PAD))。与血栓形成相关的其它病症包括：例如以下患者具有高VTE风险，他们是外科手术患者、卧床患者、癌症患者、心力衰竭患者、怀孕患者或患有可能引起血栓的其它医学病症患者。本说明书公开的方法涉及预防性抗凝血疗法，即血栓预防。这些方法需要向上文公开的患有血栓相关并发症的受试者施用有效剂量的本发明公开的抗FXI和/或FXIa抗体或有效剂量的包含抗FXI和/或FXIa抗体的药物组合物。该抗体或药物组合物可以单独施用或与用于治疗或预防血栓相关并发症或病症的任何其它疗法组合施用。
对于有需要的受试者，本发明还提供了治疗和/或预防败血症的方法。之前已经有向败血症患者施用抗凝剂以改善死亡率或发病率的尝试。然而，由于抗凝剂引起了预期外的出血，该尝试并不成功。本发明公开的抗体可以用作败血症的其它治疗剂(例如抗生素)辅助疗法。
本文所用的术语“受试者”是指哺乳动物受试者，优选人。“有需要的受试者”是指已经诊断出患有血栓或血栓相关的并发症或病症，或发生血栓或与血栓相关的并发症或病症风险增高的受试者。“受试者”和“患者”在本说明书中可互换使用。
本说明书关于病症的术语“治疗”是指部分或完全缓解病症，预防病症，降低病症发生或复发的可能性，减缓所述病症的恶化或发生，或消除、减少或减缓与所述病症相关的一种或多种症状的发生。就血栓和/或血栓相关的并发症或病症而言，“治疗”可以指预防或减缓现有血凝块增大，和/或预防或减缓血块的形成。在一些实施方案中，术语“治疗”是指与未施用抗体或其功能片段的受试者相比，受试者的血块数量或尺寸减少。在一些实施方案中，术语“治疗”是指，与未接受治疗的受试者相比，在接受如本说明书公开的抗体或药物组合物治疗后，受试者血栓和/或血栓形成相关的病症或并发症的一种或多种症状减轻。
本文所用的抗体或药物组合物的“有效剂量”是指在受试者中产生期望的治疗效果(例如治疗和/或预防血栓)的抗体或药物组合物的量。在某些实施方案中，有效剂量是产生最大治疗效果的抗体或药物组合物的量。在其它实施方案中，有效剂量的治疗效果小于最大治疗效果。例如，有效剂量可以是，既有疗效，又避免最大疗效剂量相关的一种或多种副作用的量。特定组合物的有效剂量将基于多种因素而变化，所述因素包括但不限于治疗组合物的特征(例如活性、药代动力学、药效学和生物利用度)，受试者的生理状况(例如年龄、体重、性别、疾病类型和阶段、病史、一般身体状况、对给定剂量的反应和其他使用的现有药物)，组合物中任何药学上可接受的载体，赋形剂和防腐剂的性质以及给药方式。临床和药理学领域的技术人员可通过常规实验，即通过监测受试者对施用抗体或药物组合物的反应并相应地调整剂量，来确定有效剂量。对于附加指导原则，参见例如Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第22版，Pharmaceutical Press，London，2012，和Goodman&Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第12版，McGraw-Hill，New York，2011，其全部公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本说明书公开的抗体的有效剂量在约0.01mg/kg至约30mg/kg，约0.1mg/kg至约10mg/kg，约1mg/kg至约5mg/kg。
选择合适的施用途径，例如皮下施用、静脉内施用、肌内施用、皮内施用、鞘内施用或腹膜内施用，这在本领域普通技术人员的能力范围内。为了向有需要的受试者提供治疗，可以连续或间歇地施用速释、控释或缓释的抗体或药物组合物。另外，该抗体或药物组合物可以一天三次、一天两次、或一天一次给药，持续3天、5天、7天、10天、2周、3周或4周的时间。抗体或药物组合物可以在预定的时间段内施用。可替代地，抗体或药物组合物可施用直至达到特定的治疗基准。在某些实施方案中，本发明提供的方法包括评估一种或多种治疗基准以确定是否继续施用抗体或药物组合物的步骤。
抗体的制备方法
本说明书还提供了制备本文公开的抗FXI和/或抗FXIa抗体的方法。在某些实施方案中，这些方法需要将编码抗FXI和/或抗FXIa抗体的核酸克隆到载体中，用载体转化宿主细胞，并培养宿主细胞以表达抗体。该表达的抗体可以使用任何已知的技术从宿主细胞中纯化。可以使用多种表达载体如pTT5载体和pcDNA3载体，以及多种宿主细胞系，例如CHO细胞(例如CHO-K1和ExpiCHO)和HEK193T细胞。
本说明书还涵盖通过上文公开的方法产生的抗体。该抗体可能已经发生一处或多处翻译后修饰。
提供以下实施例是为了更好地说明该技术方案，并不应理解为其限制了任何权利要求的涵盖范围。对于所提及的具体物质，其仅仅是为了说明目的，并不意在限制本发明。在本发明的范围内，无需创作性劳动，本领域技术人员可能开发出等同的手段或反应物。应当理解为，本说明书描述的步骤可以发生许多变化，这仍在本发明的范围内。发明人的意图是这些变化包括在本发明的范围内。
实施例
实施例1：材料和方法
材料。人FXI(Cat No.HFXI 1111)，FXIa(Cat No.HFXIa 1111a)，FXIIa(HFXIIa1212a)和FIX(Cat No.HFIX 1009)购自Enzyme Research Laboratory(IN，USA)。
抗体制备。在Genscript Inc.(中国，南京)进行动物免疫和杂交瘤筛查，并且该方案中应用于动物的程序已获得Genscript机构动物护理和使用委员会的批准。根据批准的指南进行实验。用人FXI对Wistar大鼠进行免疫，并收集具有良好免疫反应的动物的脾细胞以制备杂交瘤，然后通过有限稀释用于亚克隆。最后，通过使用ELISA和功能筛选获得了表达所需抗FXI抗体的几种单克隆杂交瘤细胞克隆，包括19F6，h-34F8和42A5。在确定它们的可变区的氨基酸序列后，将19F6，h-34F8和42A5进行人源化，得到IgG4形式的三种人源化抗体h-19F6，h-34F8和h-42A5。这三种人源化抗体在哺乳动物瞬时表达系统中产生，并通过蛋白G色谱法纯化。
活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)。将购自Symens Inc.的标准人血浆与等体积的浓度从0到400nM的各个抗体分别混合5分钟，然后在CA600分析仪上进行测试。在APTT分析中，将50μL血浆-抗体混合物和25μL APTT试剂(SMN 10445709，SymensInc.)在37℃下混合4分钟。然后加入25μL的CaCl2溶液(25mM，SMN 10446232，SymensInc.)，并测定凝块形成的时间。在PT分析中，将50μL血浆-抗体混合物与等体积的PT试剂(SMN 10446442，Symens Inc.)在37℃下混合，然后测定血凝块形成的时间。
还使用与人血浆相同的方法评估了抗体对猴血浆中APTT和PT的影响。在这些测定中，使用等体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释的猴血浆代替上述人血浆-抗体混合物。
FXIIa激活FXI。在室温下，将人FXI(500nM)与1μMIgG4对照或h-19F6或h-34F8或h-42A5在PBS中预孵育5分钟。在零时间，添加FXIIa，HK和kaolin，使得最终浓度为FXI(250nM)，FXIIa(50nM)，HK(100nM)和kaolin(0.5mg/mL)。每隔0、30、60、120分钟，将50μL样品收集到十二烷基硫酸盐样品缓冲液中。将样品在10％非还原性凝胶上进行大小分级，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。使用小鼠抗人FXI IgG(1C5，结合FXI C端的自制抗体)，进行蛋白质印迹法测定FXI以及FXIa轻链水平。使用具有Image Lab软件(Bio-Rad)的ChemiDocMP成像系统获取图像结果。
FXIa介导的FIX激活。在含有1μM IgG1对照，h-19F6，h-34F8，或h-42A5的环境中，在室温下将人FIX(200nM)与FXIa(5nM)在含有5mM CaCl2的PBS中孵育。每隔0、15、30、45和60分钟，将50μL样品收集到十二烷基硫酸盐样品缓冲液中。将样品在10％非还原性凝胶上进行大小分级，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。使用山羊抗人FIX IgG(AffinityBiologicals)进行蛋白质印迹以确定FIX以及FIXa水平。使用具有Image Lab软件(Bio-Rad)的ChemiDocMP成像系统获取图像结果。
表面等离子体共振(SPR)。通过Biacore T200系统(Biacore，GE Healthcare)的SPR测定法确定抗体与FXI的相互作用。简而言之，将人IgG捕获抗体(Biacore，GEHealthcare)预先固定在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上，受测抗体流过芯片被捕获。通过调整捕获时间，将捕获的受测抗体的最终量调整为相等的15个反应单位(RU)。然后，使抗原FXI流过芯片，结合时间为180秒，解离时间为1200秒。在0.063、0.313、0.625、1.25、3.125和6.25nM的浓度下测试FXI。收集数据，使用Biacore Evaluation Software分析受测抗体和FXI之间的亲和力。
为了确定受测抗体在FXI上的结合位点，首先通过用人类前激肽释放酶的相应结构域替换每个Apple结构域(A1，A2，A3和A4)来生成四个在C末端标记有6xHis的FXI突变体。将等量的每种突变体固定在CM5传感器芯片上，使受测抗体(33.3nM)流经芯片，结合时间为180s，解离时间为1200s。使用Biacore Evaluation Software记录捕获的每种抗体的量，以反应单位(RU)计量。
还使用Biacore T200系统分析了受测抗体的表位结合结果。简而言之，将具有6xHis标签的野生型FXI预固定在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上，并将h-19F6，h-34F8或h-42A5(5μg/ml)以30微升/分钟的流量依次注入传感器表面的流动池中，以监测响应的变化。
食蟹猴的药效学。该动物实验和随后的AV血栓形成实验在Wincon Inc.(中国，南宁)进行，并且该方案中应用于动物的程序已获得Wincon机构动物护理和使用委员会的批准。根据批准的指南进行实验。动物接受静脉推注不同剂量的h-19F6，h-34F8或h-42A5。在给药前(时间0)以及给药后0.5h，1h，3h，6h，12h和24h，将上肢浅静脉的2mL血液收集到装有3.2％柠檬酸钠的收集管中。然后，在室温下通过轻轻颠倒将试管混合十次。血浆收集在标记的试管中，并在-20℃下保存，直到凝血时间分析为止。用等体积的磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)稀释血浆样品，然后在自动分析仪(CA660，Sysmex Inc.)上进行APTT和PT分析。
AV分流血栓形成和出血时间测试。对食蟹猴进行静脉推注抗体，30分钟后进行测试。然后进行尾静脉出血时间测试，再诱发血栓形成。通过在股动脉和股静脉静脉插管之间连接分流装置来诱发血栓形成，该分流器包含预先称重的10厘米长的线。使血液流过分流器10分钟。称量在线上形成的血栓。取下分流器后，立即收集血液样本，并给予下一个更高水平的受测抗体。在同一只动物中进行了四次出血/血栓形成过程，以对溶媒对照和三种递增剂量水平的受测抗体(0.1、0.3、1mg/kg)进行给药。
为了评估出血时间，将2-mL注射器插入动物的尾静脉。当注射器中的血液量停止增加时，将经过的时间手动记录为出血时间。
氯化铁(FeCl3)引起的血栓形成和出血时间测试。此动物实验是在PharmaLegacyLaboratories Inc.(中国上海)进行的，并且此方案中适用于动物的程序已获PharmaLegacy机构动物护理和使用委员会批准。根据批准的指南进行实验。食蟹猴用1.5mg/kg的Zoletil进行预麻醉，插管，并用呼吸器通气。用异氟烷维持麻醉。在整个过程中都监测血压，心率和体温。在使用FeCl3之前2小时，通过肢静脉给予空白溶媒或0.3mg/kg的h-19F6，h-34F8或h-42A5。通过钝性解剖暴露并隔离左股动脉。将多普勒血流探头安装在动脉上，并连续记录血流。在使用FeCl3之前，至少要测量5分钟的血流量。然后，将两片预浸有40％FeCl3的滤纸在探测器上游的血管外膜表面上施加10分钟。除去滤纸后，将施用部位用盐水洗涤。连续测量血流直到血流减少到0。记录80％闭塞的时间(血流减少到基线血流的20％)和100％闭塞的时间(血流减少到0)。在相同的动物中，使用Surgicutt设备评估止血效果，并在给药前和给药后1小时手动记录出血时间。在研究结束时(给药后约3小时)，收集血液样本。
测试血浆中抗体对人FXI的结合特异性。首先使用EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒(Cat No.21435，Thermo Fisher Inc.)将受测抗体(h-19F6，h-42A5和14E11)生物素化。将这些抗体(每种25μg)用200μL人标准血浆(Siemens Inc.)或乏FXI人血浆(Hyphen Biomed Inc.)孵育1h。然后将50μL涂有链霉亲和素的珠子(DynabeadsTM M-280链霉亲和素，Thermo Fisher Inc.)添加到混合物中，以富集含生物素的抗原抗体复合物。用PBS洗涤3次后，将抗原-抗体复合物洗脱，并使用小鼠抗人FXI IgG(1C5，与FXI C端结合的自制抗体)作为一抗进行蛋白质印迹。使用具有Image Lab软件(Bio-Rad)的ChemiDocMP成像系统获取图像结果。在蛋白质印迹中，将10μL人标准血浆和乏FXI人血浆分别用作FXI阳性和FXI阴性对照。
统计分析。来自多个实验的数值数据表示为平均值±平均值标准误差(SEM)。在AV分流试验和两次出血时间试验中，采用单向方差分析(ANOVA)再用邓内特(Dunnett)的多重比较试验对血栓重量进行统计分析。进行Kruskal-Wallis等级检验，以统计分析FeCl3引起的血栓形成实验中的阻塞时间。P＜0.05被认为具有统计学意义。
实施例2：抗FXI抗体的生成和测序。
以人凝血因子XI(FXI)分别免疫BALB/c小鼠和Wister大鼠，取免疫反应较好动物的脾细胞用于杂交瘤细胞制备；杂交瘤细胞有限稀释后进一步亚克隆，并通过ELISA捕获法和功能学筛选，成功获得12个单克隆杂交瘤细胞系，其表达的抗FXI抗体分别为：3G12、5B2、7C9、7F1、13F4、19F6、21F12、34F8、38E4、42A5、42F4和45H1。
为确定上述抗体轻、重链可变区(VL、VH)的氨基酸和核苷酸序列，根据标准PT-PCR操作规程，从相应杂交瘤细胞中克隆编码VL和VH的cDNA。相应抗体VL、VH序列(包括CDR序列)详见表1。
实施例3：使用活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)检测指标评价本发明抗体在人血浆中的抗凝活性。
APTT检测方法测量内源性和共同途径凝血的活性；而PT检测方法测量外源性和共同途径凝血的活性。在该实验中测试的抗体是19F6、34F8、42A5、1A6和14E11。在本实验中，抗体1A6和14E11用作阳性对照。对照抗体可变区的序列出自美国专利US 8,388,959和美国专利申请2013/0171144，并重新格式化为IgG4。然后使用ExpiCHO细胞系统表达这些抗体。如上所述进行APTT测定和PT测定。
如图1所示，所有待测抗体均可增加活化部分凝血活酶时间(APTT)，并在相对低的浓度范围内呈现一定的浓度依赖性，例如随浓度增长至100nM(14E11增长至200nM)；但所有抗体对凝血酶原时间(PT)均无明显影响(未提供数据)。这些结果表明，测试的所有抗体均可抑制凝血的内源性途径，但并不抑制外源性途径。
实施例4：利用APTT检测指标评价本发明抗体在非人血浆中的抗凝活性。
按实施例3的方法检测不同抗体(包括19F6，34F8和42A5)在小鼠、大鼠、猴的血浆中的抗凝血活性。结果显示在小鼠、大鼠血浆中所有待测抗体对APTT均无影响，但在猴血浆中其APTT值增加，且在相对低浓度的范围内呈浓度依赖性(详见图2)。试验表明本发明抗体仅对猴FXI/FXIa有交叉反应，对小鼠和大鼠FXI/FXIa没有交叉反应。
实施例5：抗FXI抗体的人源化
鼠单克隆抗体由于半衰期短并且诱导人抗鼠抗体响应而无法直接用于治疗。解决该问题的一种方案是对鼠抗体进行人源化。一些抗体通过CDR移植而被人源化。确定了对每一种鼠抗体VL和VH合适的人受体框架，并将不同数量的回突变引入所选择的人框架以维持所得抗体的结构和/或功能。如果这些人源化抗体的亲和力和功能基本上不逊于相应的未修饰的抗体，则认为该修饰后的抗体人源化成功。19F6、34F8、42A5的三种人源化的VL和VH序列表示为h-19F6、h-34F8、h-42A5并示于表2。
实施例6：抗FXI抗体对人FXI的亲和力
采用BIAcore T200系统的表面等离子体共振(SPR)技术测定抗FXI抗体与FXI/FXIa的亲和力。方法如下：人源化抗体通过待测抗体可变区与人IgG4 Fc片段的连接而构建，在CHO细胞中进行重组表达；将这些抗体结合到一个已偶联抗人IgG捕获抗体的BiacoreCM5传感芯片上。
随后不同浓度(0.005-1μg/ml)的纯化抗原FXI或者FXIa流过CM5传感芯片，抗FXI/FXIa抗体结合时间为180s，解离时间为1800s。收集的结合数据采用Biacore EvaluationSoftware(提供自GE Healthcare)进行分析以确定FXI/FXIa和检测抗体的亲和力。被固定的h-9F6、h-34F8、h-42A5抗体与FXI/FXIa结合的SPR图谱详见图3。如图3所示，随着FXI或FXIa浓度的逐渐升高，每种抗体的反应(RU)也随之增强。计算h-19F6、h-34F8和h-42A5对FXI和FXIa的解离常数(KD)，结果见表4。由于差异小于10倍，每种抗体对FXI和FXIa的亲和力被认为是相同的。
表4：针对FXI和FXIa的抗体的KD值
实施例7：确定抗FXI抗体在FXI上的结合位点
采用SPR技术确定19F6、42A5在FXI上的结合位点。方法如下：将人IgG捕获抗体偶联在Biacore CM5传感芯片表面，重组样品h-19F6或h-42A5流过芯片表面而被捕获，通过调整流动时间使h-19F6或h-42A5捕获数量均达到15个相对单位。一定浓度的野生型FXI或嵌合型FXI(即FXI的单个Apple(A)功能域被人前激肽释放酶相应功能域取代的FXI/PK嵌合体)流过芯片表面，h19F6或h42A5结合时间为180s，随后的解离时间为1800s；数据采用一种高效动力学模型进行分析，仅有一个浓度的野生型FXI或嵌合型FXI在SPR测试中被检测。结果显示除了A3功能域被前激肽释放酶相应域取代的FXI/PK嵌合体，h-19F6和h-42A5均可结合FXI及FXI/PK嵌合体，提示h-19F6和h-42A5的部分或完整的抗原表位在A3功能域上。
实施例8：抗体功能性中和FXIa
人FXIa的活性主要通过测量对具有特异性且荧光标记的底物(S-2366，DiapharmaInc.)的水解来确定。为测试抗体的抑制活性，将待测抗体h-19F6、h-34F8和h-42A5与溶于PBS缓冲液中终浓度为5nM的FXIa在室温下预孵育5min，随后加入等体积的1mM S-2366即开始FXIa裂解反应，并用M5e酶标仪(Molecular Devices Inc.)在405nm下连续读取时间段内的吸光度的变化，所得数据采用GraphPad Prism软件进行分析，详见图4。人源抗体h-19F6、h-34F8及h-42A5的表观Ki值为0.67、2.08、1.43nM。因此，测试的所有三种抗体在相对低的浓度下表现出对FXIa的令人满意的抑制作用。
实施例9：抗体对FXIa介导的FIX活化的抑制作用
FXIa介导的FIX激活实验操作如上所述进行。抗FXI抗体可以通过抑制FXI活化和/或通过抑制FXIa活性来调节内源性途径。首先，测试了两种抗体h-19F6和h-42A5对FXIIa介导的FXI活化的影响，发现h-19F6和h-42A5均未阻止FXIIa介导的FXI向FXIa的转化(图5C和图5D)。然后，使用FIX作为底物测试了这两种抗体对FXIa活性的影响。如图5A和5B所示，h-19F6和h-42A5均以浓度依赖性方式降低了FIX活化。通过使用FXIa的生色底物S-2366，进一步证实了这两种抗体对FXIa的抑制作用。两种抗体均浓度依赖性地抑制S-2366的水解(图4)
实施例10：评估抗FXI抗体对食蟹猴凝血时间的影响
为了找到适合体内实验的动物物种，通过APTT分析测试了小鼠，大鼠和猴子FXI抗体的交叉反应性。抗体在猴血浆中延长了APTT，但在小鼠或大鼠血浆中未延长(数据未显示)。因此，在体内血栓形成药效研究之前，选择了猴子模型来评估三种抗体对凝血时间的药效学作用。对食蟹猴静脉注射指定剂量的不同待测抗体，于给药前及给药后0.5、1、3、6、12、24小时收集上肢浅静脉血，并制备柠檬酸抗凝的血浆用于测定APTT、PT。在APTT实验中，取50μl稀释后的血浆样品，加入25μl APTT试剂(SMN 10445709，Symens Inc.)，混匀，37℃孵育4min，加入CaCl2溶液(25mM，SMN 10446232，Symens Inc.)25μL混匀，记录血栓形成时间。在PT实验中，取50μl稀释后的血浆样品，加入等体积的PT试剂(SMN 10446442，SymensInc)，混匀，37℃下孵育测血栓形成时间。结果显示，3个待测抗体均可剂量依赖性延长APTT(详见图6)，却不影响PT(详见图7)。
h-19F6和h-42A5均剂量依赖性地延长了APTT(图6B和6C)。值得注意的是，在相同剂量水平(0.3和1mg/kg)下，h-42A5比h-19F6延长APTT的效果更明显，这与抗体对人APTT的体外作用一致(图16A)。另外，两种抗体均不影响体内PT(图7B和7C)。
实施例11：抗FXI抗体对食蟹猴动静脉分流血栓形成及尾静脉出血模型的影响
在同一动物体内给予不同剂量的待测抗体评估血栓形成及出血时间。该实验中检测的抗体是h-34F8、h-19F6和h42A5。在每次施用抗体之前和给药后30分钟，依次评价出血时间和血栓形成。针对给药前和给药后三个递增剂量(0.1、0.3和1mg/kg)，对于出血/血栓形成进行4次评估。
AV分流血栓测定：在管内放入一根已称重的长为10cm的丝线，插管连接股动脉和股静脉，放开血流10min后，迅速取出丝线称湿重，计算血栓重量。血栓重量由血流前后的丝线称重差值决定。
出血时间测定：取2ml注射器插入动物的尾静脉，开始计时。当注射器内血不再增加时停止计时。该段时间即为出血时间。
结果表明本发明所有抗体可剂量依赖地抑制血栓形成(见图8))，且不延长尾部出血时间(见图9)。在AV分流血栓形成和尾静脉出血的猴子模型中，评估了h-19F6和h-42A5对血栓形成和止血的作用。静脉内注射h-19F6导致血块重量的剂量依赖性降低，并且在1mg/kg剂量下观察到显著降低(图8B)。对于h-42A5治疗的动物，在所有测试剂量水平下，血栓重量均以剂量依赖性方式显著降低(图8C)。用h-19F6或h-42A5治疗后，出血时间没有显著变化(图9B和9C)。
实施例12：抗FXI抗体对FeCl3诱导的食蟹猴股动脉血栓形成的影响和对标准出血时间的影响
将食蟹猴用1.5mg/kg Zoletil麻醉，气管插管，通呼吸机，用异氟烷维持麻醉效果，全程监测血压、心率和体温。在施用FeCl3前2小时肢静脉给予待测抗体h-34F8、h-19F6、h-42A5或空白溶媒(对照)。使用钝性分离方法暴露并分离左股动脉。用Doppler流量探头持续探测并记录动脉血流情况。在施用FeCl3前，至少已经检测血流5分钟。随后取2片用FeCl3浸润的滤纸包裹位于Doppler流量探头上方的动脉管表面，10min后移除滤纸，用生理盐水冲洗创面，将残留FeCl3溶液冲洗干净。血流会全程监测直到数值降为0，记录阻塞80％(血流量减少到基线血流20％)时间及100％(血流量为0)的时间。对于同一动物，出血时间于给药前及给药后1小时用标准出血时间测定法测定。
以FeCl3引起的动脉血栓评价h-34F8、h-19F6、h-42A5抗体，即4组猴子分别给予空白溶媒、h-34F8、h-19F6、h-42A5，2小时后在左股动脉处敷FeCl3，引起血栓，监测其下方的血流速度。结果显示：空白对照组80％、100％阻塞的时间分别为14.66±1.30min和18.5±1.76min；0.3mg/kg h-34F8、h-42A5预防治疗组80％阻塞时间分别为59.53±16.95min和40.80±7.94min，100％阻塞时间分别为70.40±20.76min和50.61±9.48min，与空白对照组比较有显著性差异(见图10)；h-19F6组虽与空白组比较无显著性差异，但其亦适当延长了80％阻塞(26.43±5.72min)及100％阻塞时间(32.78±5.09min)(见图10)。
(Figure11D).以标准出血时间法，评估h-34F8、h-19F6、h-42A5抗体对于止血的影响，结果显示各组给药前及给药后1小时出血状况无明显差异(见图11A、11B、11C)，h-34F8、h-19F6及h-42A5各治疗组出血时间与空白对照组比较亦无显著差异(见图11D)。
h-19F6和h-42A5抗体对止血的作用通过皮肤撕裂伤引起的出血试验评估，受试对象为相同的FeCl3诱导的动脉血栓形成的动物(每组n＝5)。在给药前和给药后1小时记录出血时间。抗体给药前和给药后1小时之间或在给药后1小时的三组之间没有观察到出血时间的显著差异(图18)。
同时测定了抗体对猴血浆的体外凝血时间的影响，结果显示，与空白对照组(不引起APTT延长)相比较，给予0.3mg/ml h-34F8、h-19F6和h-42A5抗体可显著延长活化部分凝血活酶时间(APTT)至给药前的3.29±0.20、1.67±0.09以及2.87±0.10倍(图12A)，但不影响凝血酶原时间(PT)(图12B)。
因此，本发明公开的抗体在能有效抑制凝血的内源性途径的同时，又出乎意料地不会延长出血时间。
实施例13：评估修饰的抗FXI抗体对食蟹猴延长时间段的凝血时间的影响
通过如实施例10中所述的APTT和PT分析方法，评估了另外两种CMC优化的人源化抗FXI抗体(如图14和15所示，分别为“修饰的h-19F6”和“修饰的h-42A5”)对食蟹猴在延长时间段(长达14天)凝血时间的影响，这两种抗体的重链和轻链序列列于表3。食蟹猴静脉注射0.6mg/kg或2.0mg/kg的受测抗体。在给药前以及给药后0.5小时，2小时，6小时，12小时，24小时，48小时，96小时，168小时，240小时，336小时，从上肢浅静脉采血。如图14所示，测试的两种修饰抗体均显示剂量依赖性延长APTT，如图15所示，它们均不影响PT。两种抗体均在长时间段显示疗效延长，可长达7天，长达10天，或长达14天。
因此，出乎意料地发现，本文公开的修饰的抗体在延长的时间段内(长达14天)有效抑制内源的凝血途径，而没有显示出延长出血的任何不利影响。
实施例14：对标准人血浆的凝血时间的影响
将抗体h-19F6和h-42A5加入正常人血浆中，然后确定APTT(图16A)和PT(图16B)(N＝3)。h-19F6和h-42A5抗体均以浓度依赖性方式延长了标准人血浆的活化部分凝血活酶时间(APTT)(图16A)。基于血浆FXI水平与APTT之间已建立的相关性曲线(数据未显示)，h-19F6和h-42A5在血浆中对FXI活性的最大抑制水平分别为约97％和99.5％。两种抗体均不影响人血浆的PT(图16B)。
实施例15：h-19F6和h-42A5与FXI的结合特性
首先当h-19F6和h-42A5与FXI在标准人血浆中反应时，验证了它们的结合特异性，并且在人乏FXI血浆中未检测到反应(图17)。将生物素化的受测抗体与人正常血浆或乏FXI的人血浆孵育。洗脱血浆中的FXI抗体复合物，并使用小鼠抗人FXI IgG作为第一抗体进行蛋白质印迹。在蛋白质印迹中，将10μL人标准血浆或乏FXI血浆用作FXI阳性和FXI阴性对照。先前报道的抗FXI抗体14E1117显示出与两种抗体相同的结合谱(图17)。
使用表面等离子体共振(SPR)技术确定h-19F6和h-42A5对FXI的亲和力。将受测抗体捕获在传感器芯片上，然后使指定浓度的FXI流过芯片。获得了h-19F6(图19A)和h-42A5(图19B)的传感图。h-19F6和h-42A5的解离常数分别为22和36pM(图19A和19B)。
然后确定这两种抗体在FXI上的结合位点。FXI是由4个串联Apple结构域(A1-4)和催化结构域组成的同型二聚体。通过用人类前激肽释放酶的相应结构域替换每个Apple结构域来生成FXI的四个突变体，并使用SPR测试了h-19F6或h-42A5与FXI的四个突变体的结合特性。将等量的4个突变FXI(其中A1，A2，A3或A4结构域替换为前激肽释放酶的相应结构域)固定在传感器芯片上，并让受测抗体(5μg/mL)流过芯片进行结合。记录捕获的每种抗体的量。实验进行了两次，并描述了代表性的结果。出乎意料的是，两种抗体主要结合FXI的A3结构域，因为与其他3个Apple结构域的取代相比，A3结构域的取代导致任一抗体的结合降低更多(图19C)。与之前的研究一致，另一种抗体O1A6是一种已知的抗FXI抗体，用作阳性对照，也特异性结合到FXI的A3结构域。21然而，据推测，h-19F6和h-42A5结合了FXI的不同位点，因为它们具有与FXI相当的亲和力，但对FXI活性的抑制力却大不相同(图16)。使用Biacore T200系统通过表位结合测试了该假设。实际上，h-19F6与FXI的结合并未阻止h-42A5与FXI进一步的结合，表明这两种抗体结合了FXI的A3结构域中的不同位点(图19D)。然后，改变这两种抗体的流动顺序，发现h-42A5与FXI的结合并不能阻止h-19F6与FXI的进一步结合(数据未显示)。
实施例16：h-19F6和h-42A5与FXIa的结合特性
抗体通过与FXI的良好亲和力与FXIa结合(图20A和20B)。使用表面等离子体共振(SPR)技术确定h-19F6和h-42A5对FXIa的亲和力。h-19F6和h-42A5的解离常数分别为26和81pM(图20A和20B)。将受测抗体捕获在传感器芯片上，然后使指定浓度的FXIa流过芯片。获得了h-19F6(图20A)和h-42A5(图20B)的传感图。
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下面列出的参考文献，专利和公开的专利申请以及以上说明书中引用的所有参考文献均通过引用全文并入本文，如同在此完整阐述一样。
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Claims (16)

1.一种分离的抗FXI或抗FXIa抗体，或其Fab，Fab'，或Fv，其特异性结合人FXI或FXIa，其中，所述抗体包含：
免疫球蛋白轻链可变结构域SEQ ID NO：206和免疫球蛋白重链可变结构域SEQ ID NO：207。
2.根据权利要求1所述的抗体，或其Fab，Fab'，或Fv，其中，所述抗体是双抗体。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，或其Fab，Fab'，或Fv，其中所述Fv是二硫键连接的Fv，或单链Fv(scFv)。
4.一种药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的抗体，或其Fab，Fab'，或Fv。
5.权利要求1-3中任一项的抗体，或其Fab，Fab'，或Fv在制备用于在受试者中抑制血凝块形成的药剂中的用途。
6.权利要求4的药物组合物在制备用于在受试者中抑制血凝块形成的药剂中的用途。
7.权利要求1-3中任一项的抗体在制备用于治疗或预防血栓形成或与血栓形成有关的并发症或病症的药剂中的用途，其中所述抗体的量不损害受试者的止血功能。
8.权利要求4的药物组合物在制备用于治疗或预防血栓形成或与血栓形成有关的并发症或病症的药剂中的用途，其中所述组合物的量不损害受试者的止血功能。
9.一种制备权利要求1-3中任一项的抗体或其Fab，Fab'，或Fv的方法，包括在宿主细胞中表达在表达载体中被克隆的编码权利要求1-3中任一项的抗体或其Fab，Fab'，或Fv的核酸。
10.根据权利要求9的方法，还包括从宿主细胞中纯化被表达的抗体或其Fab，Fab'，或Fv。
11.根据权利要求9的方法，其中所述表达载体是pTT5载体或pcDNA3载体。
12.根据权利要求9的方法，其中所述宿主细胞是CHO细胞或HEK193T细胞。
13.通过权利要求9-12中任一项的方法制备的抗体，或其Fab，Fab'，或Fv。
14.根据权利要求13的抗体，或其Fab，Fab'，或Fv，其中所述抗体已经被翻译后修饰。
15.根据权利要求13的抗体，或其Fab，Fab'，或Fv，其中所述Fv是二硫键连接的Fv，或单链Fv(scFv)。
16.根据权利要求13所述的抗体，或其Fab，Fab'，或Fv，其中，所述抗体是双抗体。
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