BR112021002472A2 - anticorpos antifator xi - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ANTIFATOR XI. São divulgados anticorpos dos mesmos que se ligam ao fator de coagulação XI (FXI) e/ou seu fator de forma ativado XIa (FXIa), ou a fragmentos de FXI e/ou FXIa, e composições que contém os anticorpos. Também são divulgados métodos de preparação de anticorpos e uso dos anticorpos para tratar e/ou prevenir afecções associadas à coagulação, tais como trombose e complicações ou afecções associadas à trombose.

Description

ANTICORPOS ANTIFATOR XI CAMPO DA TÉCNICA

[0001] Esta divulgação se refere a anticorpos capazes de se ligar ao fator de coagulação XI (FXI) e/ou seu fator de forma ativado XIa (FXIa) e a fragmentos de FXI e/ou FXIa, e seus usos, incluindo usos como agentes de anticoagulação para o tratamento de trombose que não comprometem a hemostasia.

ANTECEDENTES

[0002] A trombose é uma afecção que envolve a coagulação do sangue em um vaso sanguíneo, que bloqueia ou obstrui o fluxo sanguíneo na área afetada. Esta afecção pode levar a complicações graves se os coágulos sanguíneos viajarem ao longo do sistema circulatório para uma parte crucial do corpo, como coração, cérebro e pulmões, causando ataque cardíaco, derrame, embolia pulmonar, etc. A trombose é a principal causa da maioria dos derrames e enfartes do miocárdio, trombose venosa profunda (TVP), embolia pulmonar e outros eventos cardiovasculares.!? A trombose pode ser tratada ou prevenida com anticoagulantes, como heparina de baixo peso molecular, varfarina e inibidores diretos do fator Xa. O efeito adverso mais comum dessas terapias atualmente disponíveis é o comprometimento da hemostasia.3* Portanto, essas terapias são limitadas pela dose e adesão do paciente, pois os pacientes devem ser monitorados de perto após o tratamento.

[0003] Há necessidade de uma terapia ou profilaxia de trombose eficaz com efeitos colaterais mínimos. Esta divulgação atende à necessidade da técnica.

SUMÁRIO

[0004] São fornecidos aqui em certas modalidades os anticorpos que se ligam ao fator de coagulação XI (FXI) e/ou seu fator de forma ativado XIa (FXIa) e a fragmentos de FXI e/ou FXla. Em algumas modalidades, os anticorpos são anticorpos monoclonais. Em algumas modalidades, os anticorpos são anticorpos recombinantes. Em algumas modalidades, os anticorpos são anticorpos humanizados. Em algumas modalidades, os anticorpos são porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, por exemplo, Fabs, Fvs ou scFvs. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam ao domínio A3 de FXI e/ou FXIla. Em algumas modalidades, os anticorpos incluem um ou mais CDRs que consistem em ou compreendem as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 11 a

16, 27 a 32, 43 a 48, 59 a 64, 75 a 80, 91 a 96, 107 a 112, 123 a 128, 139 a 144, 155 a 160, 171 a 176 e 187 a 192.

[0005] É fornecida neste documento uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção de trombose e/ou complicações ou afecções associadas à trombose. A composição farmacêutica compreende um ou mais anticorpos anti-FXI e/ou anti-FXIa como divulgado neste documento. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda um ou mais adjuvantes, carreadores, excipientes, conservantes farmaceuticamente aceitáveis ou uma combinação dos mesmos.

[0006] É fornecido neste documento um ácido nucleico que codifica um anticorpo anti- FXI e/ou anti-FXIa, conforme divulgado neste documento, ou um fragmento funcional de qualquer um dos anticorpos, bem como um vetor que compreende o ácido nucleico e uma célula hospedeira que compreende o vetor. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão que é capaz de produzir o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo codificado pelo ácido nucleico em uma célula hospedeira.

[0007] É fornecido neste documento um Kkit que compreende um ou mais anticorpos anti-FXI e/ou anti-FXIa, conforme divulgado neste documento, para uso no tratamento e/ou prevenção de trombose e/ou complicações ou afecções associadas à trombose. Alternativamente, o kit compreende uma composição farmacêutica que compreende um ou mais anticorpos anti-FXI e/ou anti-FXIa conforme divulgado neste documento para uso no tratamento e/ou prevenção de trombose e/ou complicações ou afecções associadas à trombose. Em certas modalidades, o kit compreende ainda instruções de uso.

[0008] É fornecido neste documento um método de tratamento e/ou prevenção de trombose e/ou complicações ou afecções associadas à trombose. O método inclui a administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais anticorpos anti-FXI e/ou anti-FXIa como aqui divulgado. Alternativamente, o método inclui a administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que contém um anticorpo anti- FXI, um anticorpo anti-FXIa ou um fragmento funcional de qualquer um dos anticorpos.

[0009] É fornecido neste documento um uso de um anticorpo anti-FXI e/ou anti-FXIa conforme divulgado aqui, que formula um medicamento para tratar e/ou prevenir trombose e/ou complicações ou afecções associadas à trombose.

[0010] É fornecido neste documento um método de produção de um anticorpo anti-FXI e/ou anti-FXla conforme divulgado neste documento. O método envolve as etapas de transformação de uma célula hospedeira com um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo e expressa o anticorpo na célula hospedeira. O método pode incluir ainda a purificação do anticorpo expresso da célula hospedeira. Além disso, o anticorpo purificado pode ser submetido a modificações de modo que o anticorpo recombinante modificado retenha a atividade do anticorpo humano correspondente. Alternativamente, um anticorpo divulgado neste documento pode ser produzido a partir da cultura de um hibridoma.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0011] As Figuras 1A a 1E ilustram os efeitos de cinco anticorpos anti-FXI via ensaio APTT em plasma humano. O plasma humano suplementado com cinco anticorpos diferentes em uma concentração variando de O a 400 nM foi testado em um ensaio APTT conforme descrito no Exemplo 3. Os cinco anticorpos testados incluíram 19F6 (A), 34F8 (B), 42A5 (C), 1A6 (D) e 14E11 (E). Os anticorpos 1A6 e 14E11 foram usados como controles positivos neste experimento.

[0012] As Figuras 2A a 2C ilustram os efeitos dos anticorpos 19F6 (A), 34F8 (B) e 42A5 (C) no ensaio APTT em plasma de macaco. O plasma de macaco suplementado com três anticorpos diferentes em uma concentração variando de O a 400 nM foi testado em um ensaio APTT conforme descrito no Exemplo 4.

[0013] As Figuras 3A a 3F ilustram sensogramas SPR para ligação de FXI a h-19F6 (A), h-34F8 (B) e h-42A5 (C) imobilizados, bem como sensogramas de SPR para ligação de FXIa a h-19F6 (D), h-34F8 (E) e h-42A5 (F) imobilizados. Os dados foram ajustados com o modelo de ligação 1:1 e os ajustes de curva nas concentrações de teste de FXI (0,005 a 1 ng/ml) são mostrados sobrepostos nos sensogramas. Cada curva indica uma concentração de teste diferente de FXI ou FXIa.

[0014] As Figuras 4A a 4C ilustram as curvas de resposta à concentração de anticorpos h-19F6 (A), h-34F8 (B) e h-42A5 (C), que inibe FXIa humano de hidrolisar S-2366.

[0015] As Figuras 5A a 5B ilustram os efeitos inibitórios dos anticorpos h-19F6 (A) e h-

42A5 (B) em ativação mediada por FXIa de FIX para FIXa. FIX humano (200 nM) foi incubado com FXIa (5 nM) em PBS com 5 mM de CaCl; em temperatura ambiente com 1 UM de H-19F6 ou h-42A5. Nos intervalos indicados, as amostras foram coletadas e o FIX, bem como o FIXa, foram determinados por Western blots com o uso de FIX IgG de cabra anti-humano (Affinity Biologicals). As Figuras 5C a 5D ilustram os efeitos inibitórios dos anticorpos h-19F6 (C) e h-42A5 (D) em ativação mediada por FXIIa de FXI para FXIa. FXI humano (500 nM) foi incubado com FXIIa (50 nM) na presença de 1 uM de h-19F6 ou h- 42A5. FXI, bem como a cadeia leve de FXIa, que representa a produção de FXIa, em pontos de tempo indicados foi determinada por Western blots. Uma IQgG4 humana (1 uM) foi usada como controle.

[0016] As Figuras 6A a 6C ilustram os efeitos dos anticorpos h-34F8, h-19F6 e h-42A5 em APTT em macacos cynomolgus. Os macacos foram administrados por via intravenosa com as doses indicadas de h-34F8 (A), h-19F6 (B) e h-42A5 (C). O tempo de coagulação ex vivo APTT foi determinado na pré-dose (tempo 0) e 0,5, 1, 3, 6, 12 e 24 horas após a dose.

[0017] As Figuras 7A a 7C ilustram os efeitos dos anticorpos h-34F8, h-19F6 e h-42A5 no PT em macacos cynomolgus. Os macacos foram administrados por via intravenosa com as doses indicadas de h-34F8 (A), h-19F6 (B) e h-42A5 (C). O tempo de coagulação ex vivo PT foi determinado na pré-dose (tempo 0) e 0,5, 1, 3, 6, 12 e 24 horas após a dose.

[0018] As Figuras 8A a 8C ilustram os efeitos dos anticorpos h-34F8, h-19F6 e h-42A5 na trombose de shunt AV em macacos cynomolgus. Os níveis crescentes de h-34F8 (A), h- 19F6 (B) ou h-42A5 (C) foram administrados por via intravenosa a macacos (n = 3 para h- 34F8 e h-19F6; n = 4 para h-42A5), as alterações do peso do coágulo desde a pré-dose foram determinadas no modelo de macaco de trombose de shunt AV. *P <0,05, **P <0,01 e ***P <0,001 vs. Veículo.

[0019] As Figuras 9A a 9C ilustram os efeitos de anticorpos h-34F8, h-19F6 e h-42A5 no tempo de sangramento em macacos cynomolgus. Os níveis crescentes de h-34F8 (A), h-19F6 (B) ou h-42A5 (C) foram administrados por via intravenosa a macacos (n = 3 para 34F8 e h-19F6; n = 4 para h-42A5), o tempo de sangramento foi avaliado na pré-dose e min após cada dose.

[0020] As Figuras 10A a 10B ilustram os efeitos antitrombóticos dos anticorpos h-34F8, h-19F6 e h-42A5. Quatro grupos de macacos (n = 5) foram administrados por via intravenosa com o veículo, 0,3 mg/kg de h-34F8, h-19F6 ou h-42A5, por 2 horas, e FeCl3 foi aplicado na artéria femoral esquerda de cada animal para induzir trombose. O tempo para oclusão trombótica de 80% (A) e para oclusão trombótica de 100% (B) foi determinado monitorando a velocidade do fluxo sanguíneo. *P <0,05 e **P <0,01 vs. veículo.

[0021] As Figuras 11A a 11D ilustram que o tratamento com os anticorpos h-34F8, h- 19F6 ou h-42A5 não prolongou o tempo de sangramento em macacos. Quatro grupos de macacos (n = 5) foram administrados por via intravenosa com o veículo, 0,3 mg/kg de h- 34F8, h-19F6 ou h-42A5, e o tempo de sangramento do molde foi medido antes da dose e 1 hora após a dose. O tempo de sangramento individual no grupo tratado com h-34F8, h- 19F6 e h-42A5 é mostrado em (A), (B) e (C), respectivamente. A mudança de tempo de sangria no tratamento com veículo, h-34F8, h-19F6 ou h-42A5 é mostrada em (D).

[0022] As Figuras 12A a 12B ilustram os efeitos dos anticorpos h-34F8, h-19F6 e h- 42A5 nos tempos de coagulação do plasma de macaco. Quatro grupos de macacos (n = 5) foram administrados por via intravenosa com o veículo, 0,3 mg/kg de h-34F8, h-19F6 e h-42A5, respectivamente, e o sangue foi coletado antes da dose e cerca de 3 horas após a dose para preparação de plasma e tempo de coagulação APTT e determinação de PT. As alterações de APTT e as alterações de PT são mostradas em (A) e (B), respectivamente. **P <0,01 e ***P <0,001 vs. veículo.

[0023] A Figura 13 ilustra a sequência de aminoácidos de FXI humano (SEQ ID NO: 203).

[0024] As Figuras 14A a 14B ilustram os efeitos dos anticorpos modificados h-19F6 (A) e h-42A5 (B) em APTT em macacos cynomolgus. Os macacos foram administrados por via intravenosa com as doses indicadas de h-19F6 e h-42A5 modificados. O tempo de coagulação ex vivo APTT foi determinado na pré-dose (tempo 0) e 0,5, 2, 6, 12, 24, 48, 96, 168, 240 e 336 horas após a dose.

[0025] As Figuras 15A a 15B ilustram os efeitos dos anticorpos modificados h-19F6 (A) e h-42A5 (B) no PT em macacos cynomolgus. Os macacos foram administrados por via intravenosa com as doses indicadas de h-19F6 e h-42A5 modificados. O tempo de coagulação ex vivo PT foi determinado na pré-dose (tempo 0) e 0,5, 2, 6, 12, 24, 48, 96, 168, 240 e 336 horas após a dose.

[0026] As Figuras 16A a 16B ilustram os efeitos de h-19F6 e h-42A5 em APTT e PT em plasma humano. A Figura 16A mostra os efeitos de h-19F6 e h-42A5 em APTT em plasma humano. A Figura 16B mostra os efeitos de h-19F6 e h-42A5 no PT no plasma humano.

[0027] A Figura 17 mostra a especificidade de ligação dos anticorpos de teste ao FXI humano. Em Western blotting, 10 ul de plasma humano padrão ou plasma deficiente em FXI foram servidos como controles FXI-positivos e FXI-negativos.

[0028] A Figura 18 mostra os efeitos de h-19F6 e h-42A5 em modelos de trombose de shunt AV em tempos de sangramento registrados na pré-dose e 1 hora após a dose.

[0029] As Figuras 19A a 19D mostram as propriedades de ligação de h-19F6 e h-42A5 ao FXI humano. A Figura 19A mostra sensogramas para h-19F6 capturados em um chip sensor submetido a fluxos de concentrações indicadas de FXI. A Figura 19B mostra sensogramas para h-42A5 capturados em um chip sensor sujeito a fluxos de concentrações indicadas de FXI. A Figura 19C mostra os anticorpos capturados quando os anticorpos de teste (5 pg/ml) voaram através de um chip sensor imobilizado com quantidades iguais de 4 FXIs mutantes em que o domínio Al, A2, A3 ou A4 foi substituído pelo domínio correspondente da pré-calicreína. Um anticorpo anti-FXI relatado, O1A6, também foi testado como um controle positivo. A Figura 19D mostra que FXI foi imobilizado em um chip sensor. H-19F6 e h-42A5 (5 pg/ml) foram sucessivamente injetados nas células de fluxo na superfície do sensor a uma taxa de fluxo de 30 ul/minuto e a mudança de resposta foi monitorada. O experimento foi realizado duas vezes e um resultado representativo é mostrado.

[0030] As Figuras 20A a 20B mostram as propriedades de ligação de h-19F6 e h-42A5 a FXIa humano. A Figura 20A mostra os sensogramas para h-19F6 capturados em um chip sensor sujeito a fluxos de concentrações indicadas de FXIa. A Figura 20B mostra os sensogramas para h-42A5 capturados em um chip sensor sujeito a fluxos de concentrações indicadas de FXIa.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0031] A seguinte descrição da invenção destina-se meramente a ilustrar várias modalidades da invenção. Como tal, as modificações específicas discutidas não devem ser interpretadas como limitações ao escopo da invenção. Será evidente para um versado na técnica que vários equivalentes, alterações e modificações podem ser feitos sem se afastar do escopo da invenção, e é entendido que tais modalidades equivalentes devem ser incluídas neste documento.

[0032] Tanto a via intrínseca quanto a extrínseca estão envolvidas nas cascatas de coagulação do sangue in vivo. A via intrínseca, também chamada de via de ativação por contato, é iniciada pelo contato com uma interface de superfície e resulta na ativação de FXII. A via intrínseca também envolve FXI, FIX e FVIII. A via extrínseca, também chamada de via do fator tecidual (FT), é iniciada por lesão vascular e resulta na formação de um complexo ativado de FT-FVIIa. Essas duas vias se encontram e ativam a via comum, levando à conversão da protrombina em trombina e, eventualmente, à formação de um coágulo de fibrina reticulada. Um anticoagulante ideal deve ser eficaz na prevenção da trombose sem comprometer a hemostasia. Várias linhas de evidência sugerem que a via intrínseca da coagulação é importante para a fase de amplificação da coagulação, enquanto as vias extrínsecas e comuns estão mais fortemente envolvidas nas fases de iniciação e propagação.” Essas descobertas indicam que a via intrínseca desempenha um papel menor durante a hemostasia normal e que a inibição da via intrínseca pode fornecer benefícios antitrombóticos com baixo risco de sangramento. O FXI, um componente da via intrínseca, tornou-se recentemente um alvo atraente, pois pode ter o potencial de provocar efeitos antitrombose sem afetar o sangramento.?>6

[0033] O FXI pode ser ativado pelo fator XIIa através da via intrínseca para FXIa, que por sua vez ativa o fator IX. Estudos epidemiológicos sugeriram que a deficiência de FXI em humanos está associada à diminuição do risco de tromboembolismo venoso e acidente vascular cerebral, enquanto níveis aumentados de FXI estão associados a risco aumentado.º!! Além disso, os humanos deficientes em FXI apresentam uma tendência a sangramento muito baixa.2!3 Além disso, os camundongos deficientes em FXI são protegidos contra muitos tipos de trombose sem aumento de sangramento.!* Além disso, inibidores de moléculas pequenas, anticorpos e oligonucleotídeos antissenso que inibem o

FXI demonstraram propriedades antitrombóticas sem risco de sangramento em muitos modelos animais de trombose.

[0034] Os anticorpos divulgados neste documento ligam-se a FXI e/ou FXIla e têm como alvo a via intrínseca de coagulação do sangue. A estrutura do FXI e o envolvimento do FXI na coagulação do sangue foram relatados em várias publicações.?3

[0035] Estudos clínicos e em animais sugeriram uma associação robusta entre FXI e trombose. Camundongos deficientes em FXI foram estudados por muitas equipes de pesquisa e apresentaram fenótipos antitrombóticos notáveis em diversos modelos, incluindo modelos de trombose arterial e venosa profunda induzida por FeClz, um modelo de embolia pulmonar e um modelo de oclusão da artéria cerebral.*417,2223 Em estudos epidemiológicos humanos, os pacientes com deficiência congênita de FXI são insusceptíveis ao tromboembolismo venoso (TEV) ou AVC oriscêmico, e os indivíduos com níveis mais altos de FXI correm maior risco de TEV e AVC isquêmico do que aqueles com níveis mais baixos.?*! Para hemostasia fisiológica, o papel do FXI parece dispensável. Os camundongos deficientes em FXI não apresentam sangramento excessivo, pois seus tempos de sangramento na cauda são comparáveis aos dos animais do tipo selvagem .232º Além disso, os pacientes com deficiência grave de FXI não apresentam sangramento espontâneo, embora possam exibir uma tendência variável de sangramento durante as operações cirúrgicas.!? 1? A combinação de dois ou mais antitrombóticos é amplamente utilizada clinicamente. Um estudo anterior mostrou que a aspirina causou uma tendência de sangramento semelhante em camundongos do tipo selvagem e deficientes em FXI, sugerindo que direcionar o FXI ainda pode ser seguro, mesmo na presença de outras terapias antitrombóticas.!º

[0036] Todas as descobertas mencionadas acima indicam que FXI/FXIa é um alvo de fármaco seguro para o tratamento de doenças relacionadas à trombose sem comprometer a hemostasia. Assim, muitas abordagens foram aplicadas ao FXI/FXIa alvo para o desenvolvimento de terapêuticas para o tratamento de trombose, como anticorpos, oligonucleotídeos e inibidores de moléculas pequenas. Conforme descrito neste documento, foram gerados bloqueadores do tipo anticorpo de FXI/FXIa. As vantagens dos anticorpos incluem propriedades de ação rápida e uma baixa frequência de dosagem, e um dos principais pontos fracos dos anticorpos é sua potencial imunogenicidade.?5 Pelo menos dois anticorpos de teste foram humanizados antes da realização dos estudos in vivo. Dois anticorpos humanizados, h-19F6 e h-42A5, demonstraram afinidade muito alta para FXI/FXIla humano. Curiosamente, eles ligam regiões diferentes, mas o mesmo domínio (A3) de FXI. Sem estar vinculado a nenhuma teoria, os anticorpos podem inibir a atividade do FXIa, mas não têm efeito na ativação do FXI mediada por FXIIa ou trombina.

[0037] Vários tipos de inibidores de FXI/FXIa prolongaram o APTT e exibiram efeitos antitrombóticos em diferentes modelos. O anticorpo anti-FXI 14E11 aumentou o APTT em aproximadamente 1,3 vezes e reduziu a trombose em shunts arteriovenosos femorais exteriorizados em babuínos.”? Um oligonucleotídeo antissenso que inibe a expressão de FXI reduziu os níveis plasmáticos de FXI em aproximadamente 50% e diminuiu a formação de trombo em babuínos. 2627 Além disso, um inibidor de FXIla de molécula pequena biodisponível oralmente, ONO-5450598, inibiu significativamente a formação de trombose em modelos de trombose de macaco.?8 Além disso, os efeitos antitrombóticos da terapêutica direcionada para FXI/FXIa também foram confirmados em muitos modelos de animais não primatas, como modelos de trombose de camundongo e coelho.!º.2931 Um ensaio clínico recente mostrou que um oligonucleotídeo antissenso direcionado ao FXI evitou a trombose venosa em pacientes submetidos à artroplastia de joelho.32?! Como demonstrado nos exemplos de trabalho, dois modelos distintos de trombose de primatas foram usados para avaliar os efeitos antitrombóticos de h-19F6 e h-42A5. Nos modelos de trombose de shunt AV, ambos os anticorpos diminuíram a formação de trombose de uma forma dependente da dose. Em modelos de trombose induzida por FeClz ambos os anticorpos estenderam o tempo para a oclusão do vaso causada pela trombose. Estes resultados fornecem evidências adicionais das funções antitrombóticas dos inibidores de FXI/FXIa. A redução dependente da dose da formação de trombose para h-19F6 e h-42A5 em modelos de trombose de shunt AV sugere que a formação de trombose pode se correlacionar negativamente com o grau de inibição de FXI, o que pode ser indicado pelo prolongamento APTT. Como h-42A5 é mais potente do que h-19F6 no prolongamento de APTT, a comparação dos efeitos antitrombóticos entre h-42A5 e h-19F6 em modelos de trombose induzida por FeClz também podem levar a tal indicação. Assim, uma inibição mais intensa de FXI/FXIa, conforme indicado por um APTT mais longo, por inibidores de FXI/FXIa pode resultar em melhores resultados antitrombóticos.

[0038] O risco de sangramento é o problema mais preocupante no desenvolvimento de agentes antitrombóticos. Como mencionado anteriormente, os pacientes com deficiência de FXI podem apresentar uma tendência ao sangramento em configurações cirúrgicas. Não está claro até que ponto a inibição da atividade do FXI no plasma ainda é segura em termos de risco de sangramento. Como demonstrado nos exemplos de trabalho, o risco de sangramento de inibição intensiva de FXI/FXIa por h-19F6 e h-42A5 foi testado nos mesmos macacos usados em experimentos de trombose. Em animais com trombose de shunt AV, nenhuma tendência de sangramento foi observada conforme a dose de tratamento de h-19F6 ou h-42A5 cresceu, sugerindo que o risco de sangramento pode ser independente da extensão da inibição de FXI. Em animais com trombose induzida por FeCl3, nem o tratamento com h-19F6 nem com h-42A5 causou sangramento excessivo. O tratamento com h-42A5 resultou em uma elevação de aproximadamente 2 vezes do APTT plasmático, que indicou mais de 99% de inibição de FXI. Estudos anteriores nunca avaliaram o risco de sangramento sob tais condições de prolongamento intensivo de APTT e alta inibição de FXI. O oligonucleotídeo antissenso ISIS416856 causou apenas 30% de elevação do APTT quando seu risco de sangramento foi avaliado.º?? Em outros estudos de avaliação de risco de sangramento em primatas, um anticorpo anti-FXI de alta potência, aXIMab, causou um aumento de aproximadamente 1 vez no APTT (de 30,5 s para 65,6 s).º Assim, os resultados descritos neste documento demonstram que a inibição intensiva de FXI/FXIa não aumenta o risco de sangramento em primatas. Assim, o FXI pode ser usado como um alvo de fármaco para o tratamento de trombose. ANTICORPOS ANTI-FXI OU ANTI-FXIa

[0039] São fornecidos neste documento anticorpos que se ligam a FXI, FXIla e/ou um fragmento de FXI ou FXIa e inibem a formação de coágulo sanguíneo. Estes anticorpos são capazes de se ligar a FXI, FXIa e/ou um fragmento de FXI ou FXIa (por exemplo, um fragmento compreendendo o domínio A3) e que exibe um efeito inibidor em uma concentração que é muito inferior à dose de segurança máxima. Por exemplo, em algumas modalidades, uma dose do anticorpo entre 0,1 mg/kg i.v. e 3 mg/kg i.v. exibe um efeito inibidor na conversão de FXI em FXIla em macacos cynomolgus. Além disso, os anticorpos divulgados neste documento podem ser usados como agentes de anticoagulação com segurança superior devido ao seu risco mínimo de causar sangramento em comparação com os agentes de anticoagulação convencionais, como a heparina.

[0040] Conforme demonstrado nos exemplos de trabalho, muitos anticorpos anti-FXI humanos foram gerados imunizando ratos com FXI humano para identificar anticorpos com propriedades de anticoagulação. Uma dúzia de tais anticorpos foram identificados, e alguns dos quais foram humanizados para desenvolvimento posterior. Os anticorpos anti- FXI humano de rato humanizado, tais como anticorpos h-19F6 e h-42A5, foram caracterizados /n vitro e in vivo. Nos estudos in vitro, os anticorpos humanizados inibiram a hidrólise mediada por FXI (FXIa) ativada do fator IX, mas não a ativação de FXI induzida pelo fator XIIa. As propriedades de ligação dos anticorpos para FXI foram determinadas, e as constantes de dissociação (KD) para h-19F6 e h-42A5 foram 22 pM e 35 pM, respectivamente. Esses dois anticorpos se ligam a locais diferentes no domínio A3 de FXI. Nos estudos in vivo, dois modelos distintos de trombose de primatas foram usados para avaliar os efeitos antitrombóticos e os riscos de sangramento dos anticorpos humanizados. Em modelos de trombose de shunt arteriovenoso (AV), ambos os anticorpos diminuíram a formação de trombo de maneira dependente da dose sem causar sangramento. Em modelos de trombose induzida por FeCI3, ambos os anticorpos estenderam o tempo para a oclusão do vaso mediada pela trombose e nenhum dos anticorpos aumentou o sangramento. Os dois anticorpos mostraram eficácia antitrombótica sem comprometer a hemostasia em primatas, confirmando ainda que o alvo de FXI pode ser usado para o tratamento de trombose.

[0041] Conforme usado no presente documento, o termo “que compreende (ou que compreendem) em relação a uma composição ou método significa que a composição ou método inclui pelo menos os elementos recitados. O termo “que consiste essencialmente em” significa que a composição ou o método inclui os elementos recitados e pode ainda incluir um ou mais elementos adicionais que não afetam de modo relevante as características inovadoras e básicas da composição ou do método. Por exemplo, uma composição que consiste essencialmente em elementos recitados pode incluir os elementos recitados mais um ou mais traços de contaminantes do método de isolamento e purificação, carreadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como solução salina tamponada com fosfato, conservantes e semelhantes. O termo “que consiste em” significa que a composição ou método inclui apenas os elementos recitados. Modalidades definidas por cada um dos termos de transição estão dentro do escopo desta invenção.

[0042] O termo “anticorpo”, tal como aqui utilizado, refere-se a uma molécula de imunoglobulina ou uma porção imunologicamente ativa da mesma que se liga especificamente a, ou é imunologicamente reativa com um antígeno particular, por exemplo, FXI, FXIa ou um domínio particular ou fragmento de FXI ou FXIa, por exemplo, o domínio A3. Em certas modalidades, um anticorpo para uso nos presentes métodos, composições e kits é uma molécula de imunoglobulina de comprimento total, que compreende duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, com cada cadeia pesada e leve contendo três regiões determinantes complementares (CDRs). O termo “anticorpo”, além dos anticorpos naturais, também inclui formas geneticamente modificadas ou modificadas de imunoglobulinas, como anticorpos sintéticos, intracorpos, anticorpos quiméricos, anticorpos totalmente humanos, anticorpos humanizados, pepticorpos e anticorpos heteroconjugados (por exemplo, anticorpos biespecíficos, anticorpos multiespecíficos, anticorpos específicos duplos, anticorpos anti-idiotípicos, diacorpos, triacorpos e tetracorpos). Os anticorpos divulgados neste documento podem ser anticorpos monoclonais ou anticorpos policlonais. Nessas modalidades em que um anticorpo é uma porção imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina, o anticorpo pode ser, por exemplo, um Fab, Fab”, Fv, Fab' F(ab)», Fv ligado por dissulfeto, anticorpo Fv de cadeia simples (scFv), anticorpo de domínio único (dAb) ou diacorpo. Os anticorpos aqui divulgados, incluindo aqueles que são parte imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina, retêm a capacidade de se ligar a um antígeno específico, por exemplo FXI ou FXIa, ou para ligar um fragmento específico de FXI ou FXIa, como o domínio A3.

[0043] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-FXI e/ou anti-FXIa divulgados neste documento foram submetidos a modificações pós-tradução, como fosforilação, metilação, acetilação, ubiquitinação, nitrosilação, glicosilação ou lipidação associada à expressão em uma linha celular de mamífero, incluindo um célula hospedeira humana ou não humana. As técnicas para produção de anticorpos recombinantes e para modificações in vitro e in vivo de anticorpos recombinantes são conhecidas na técnica. Consultar, por exemplo, Liu et al., M4bs 6 (5): 1145 a 1154 (2014), cujo conteúdo é incorporado por referência.

[0044] Também são divulgados polinucleotídeos ou ácidos nucleicos que codificam os anticorpos anti-FXI e/ou anti-FXIa divulgados neste documento. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo ou ácido nucleico inclui DNA, mRNA, cDNA, DNA de plasmídeo. O ácido nucleico que codifica o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo divulgado neste documento pode ser clonado em um vetor, tal como um vetor de expressão de mamífero pTT5, que pode incluir ainda um promotor e/ou outros elementos de controle da transcrição ou tradução, de modo que o ácido nucleico pode ser expresso para produzir o anticorpo ou seu fragmento funcional.

[0045] As sequências de ácido nucleico (DNA) e/ou aminoácido (PRT), incluindo as sequências de VH e VL e CDRs, de alguns exemplos dos anticorpos divulgados neste documento estão listados na Tabela 1 abaixo. TABELA 1: SEQUÊNCIAS DE

ANTICORPOS EXE CO ACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTICTTTGGCT

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AGACACATCGAAGAATCAGTTICTICCTGCAGTTGA AGTCTGTAACTACTGAGGACACAGCCACATATTAC GTACAAGAGGATCTTATTACTATAGCGCATCGGG TACTTTGATTACTGGGGCCAAGGAGTCCTGGTCAC

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ACATAAGCAACAGTGGTGGCACTAACTACAACCC 42F4-CDR-H2 ATCACTCAAAAGT APE4-CDR-H3 | 168 | Dea | IGATCTTATTACTATAGCOGCATOGGGCTACTTTGAT IDIRMTQSPASLSASLGETVNIECLASEDIHSDLAWYQQ)| 42F4-VL PRT [KPGKSPQLLIVYNANSLQNGVPSRFSGSGSGTQYSLKIT

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IGQGVLVTVSS 42F4-CDR-L1 EIESS ASEDIHSDLA 42F4-CDR-H3 SY YYSASGYFDY

ATATCCGGATGACACAGTCTCCAGCTICCCTGTCT 'ATCTCTGGGAGAAACTGTCAACATCGGATGTCT AGCAAGTGAGGACATTTACAGTGATTTAGCATGGT

ATCAGCAGAAGCCAGGGAAGTCTCCTCAGCTCCTG asmivo | 177) pna |ATCTATAATGCAAATAACTTIGCAAAATGGGGTCCC

TCACGGTTTAGTGGCAGTGGATCTGGCACACAAT ATTCTCTAAAAATAAACAGCCTGCAATCTGAAGAT TCGCGACTTATTTCTGTCAACAATATAACAGTTAT 'CGAACACGTTTGGAGCTGGGACCAAGCTGGAAAT AAAA AGGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTTGT AA ACCCTCACAGTCACTCTCCCTCATTIGTTCIGT 'ACTGGTTACTCCATCACTACAACTTACTGGGGCTG ATCCGGAAGTTCCCAGGAAATAAAATGGAGTGGA

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ACACATCGACGAATCAGTTCTTCCTGCAGTTGAA TCTGTAACTACTGAGGACACAGCCACATATTACT TGCAAGAGGATCTTATTACTATAGCGCGTCGGGC ACTTIGATTACTGGGGCCACGGAGTCATGGTCAC

AGTCTCCTCA 45H1-CDR-L1 TAGCAAGTGAGGACATITACAGTGATTITAGCA 45HI-CDR-L2 | 150 | DNA. [ATGCAMATAACTIGCAAMAT 45H1-CDR-L3 ENMESS 'AACAATATAACAGTTATCCGAACACG 45H1-CDR-HI1 ACAACTTACTGGGGC

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45H1-CDR-L3 ENE QQYNSYPNT 45H1-CDR-H2 | 191 | PRT fusnscstTNYNPSLKS 45H1-CDR-H3 SYYYSASGYFDY 14E11-VL DIVMTQOSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWY (control). 193 | PRT |OQKPGOSPKLLIYLTSYRNTGVPDRFTGSGSGTDFTFT

SSVQAEDLAVY YCOQHYKTPYSFGGGTKLERLR

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DYWGQGTSVTVS

[0046] São fornecidos em certas modalidades neste documento anticorpos anti-FXI e/ou anti-FXla humanizados. Várias técnicas são conhecidas na arte para humanizar anticorpos de espécies não humanas, de modo que os anticorpos sejam modificados para aumentar sua similaridade com anticorpos que ocorrem naturalmente em humanos. Seis CDRs estão presentes em cada domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo natural. Esses CDRs são sequências curtas não contíguas de aminoácidos que são especificamente posicionadas para formar o domínio de ligação ao antígeno conforme o anticorpo assume sua configuração tridimensional. O restante dos aminoácidos nos domínios de ligação ao antígeno, referidos como regiões de “estrutura”, mostram menos variabilidade intermolecular e formam um arcabouço para permitir o posicionamento correto dos CDRs. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos divulgados neste documento têm sequências conservadas para regiões CDR3.

[0047] Por exemplo, a humanização dos anticorpos divulgados neste documento pode ser realizada por enxerto de CDR de anticorpos monoclonais produzidos por imunização de camundongos ou ratos. Os CDRs de um anticorpo monoclonal de camundongo podem ser enxertados em uma estrutura humana, que é subsequentemente unida a uma região constante humana para obter um anticorpo humanizado. Em suma, o banco de dados de sequência de anticorpos da linha germinativa humana, o banco de dados de proteínas (PDB), o banco de dados INN (International Nonproprietary Names) e outros bancos de dados adequados podem ser pesquisados e as estruturas mais semelhantes aos anticorpos podem ser identificadas pela pesquisa. Além disso, algumas mutações reversas para os resíduos doadores são feitas nas estruturas aceitadoras humanas. Em algumas modalidades, as regiões variáveis estão ligadas a uma região constante de IgG humana. Por exemplo, os domínios Fc de IgG1, IgG2, IgG3 e IGgG4 humanos podem ser usados. Está dentro da competência de um versado na técnica humanizar um anticorpo monoclonal produzido por uma espécie não humana com base na tecnologia existente.

[0048] As sequências das regiões variáveis de vários exemplos de anticorpos humanizados são mostradas na Tabela 2 abaixo. TABELA 2: SEQUÊNCIAS DE ANTICORPOS HUMANIZADOS Descrição SEQID Tipo Sequência (com mutações destacadas em negrito e NO sublinhado, e CDRs destacados em itálico)

QFQLTQPSSVSASVGDRVTITCERSSGDIGDSYVSWYQQ h-19F6-VL 197 PRT |KPGQPPKNVIYADDORPSGVPDRFSGSIDGSGNSASLTI |ISSLOAEDAADYFCQSYDSNIDENPVFGGGTKLEVK

VQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSKYAMSWVR h-19E5.VH prRT RAPGKGLEWVSAINYDGSTTYYADSVKGRFTLSRDNSKN

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LVTVS |DVVLTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSOSLESRDGNTYLEW h-34F8-VL PRT QKPGQOSPQVLLYGVSNRLSGVPDRFSGSGSGTDFTLK

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QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTTYHVHWVR n QPPGKGLEWIGIMWRDGDTYYNSSLKSRVYTISRDTSKNQ h-34F8-VH | 200 | PRT | Ô 'SLKLSSVYTAADTAVYFCARGGTLTTPFTYWGQGTLVT /SS

DVVLTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSOSLESSDGNTYLEW h-42A5-VL | 201 PRT [YLQOKPGQSPQLLIYGVSNRFSGVPDRFESGSGSGTDFTLKI

ISRVEAEDLGVYYCFQATRDPFTFGQGTKLEIKRT

QVTLKESGPVYLVKPTETLTLTCTVSGFSLTSYHLHWIRQ H-42AS-VH | 202 PRT PPGKALEWMGLMWRDGDTSYNSRLKSRLTISRDTSKSQV

LTMINMDPVDTATYYCARGMTLATPFLYWGQGTLVT Ss

[0049] Os anticorpos fornecidos neste documento incluem variantes das sequências divulgadas neste documento que contêm uma ou mais mutações em suas sequências de aminoácidos enquanto retêm afinidade de ligação para FXI, FXIa e/ou um fragmento dos mesmos (por exemplo, um fragmento que compreende o domínio A3). Em algumas modalidades, os anticorpos incluem uma região variável com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 9, 10, 25, 26, 41, 42, 57, 58, 73, 74, 89, 90, 105, 106, 121, 122, 137, 138, 153, 154, 169, 170, 185, 186, e 197 a 209, ou um fragmento do mesmo que retém afinidade de ligação para FXI, FXIa e/ou um fragmento do mesmo.

[0050] Também incluídas nesta divulgação estão variantes de ácidos nucleicos que codificam anticorpos que se ligam a FXI, FXIla e/ou um fragmento dos mesmos (por exemplo, um fragmento que compreende o domínio A3). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam os anticorpos incluem uma região variável com uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 2, 17, 18, 33, 34, 49, 50, 65, 66, 81, 82, 97, 98, 113, 114, 129, 130, 145, 146, 161, 162, 177 e 178, ou um fragmento do mesmo que codifica um polipeptídeo com afinidade de ligação para FXI, FXIa e/ou um fragmento do mesmo.

[0051] Em algumas modalidades, os anticorpos são ainda submetidos a um desenvolvimento — estratégico de Química, Fabricação e Controle (Chemistry, Manufacturing, and Control em inglês, CMC), de modo que os novos anticorpos, tais como anticorpos monoclonais ou anticorpos monoclonais humanizados divulgados neste documento, avançam desde a descoberta até os testes clínicos em humanos e, em seguida, para o mercado farmacêutico. As modificações melhoram ainda mais as propriedades dos anticorpos sem comprometer as funções imunológicas dos anticorpos. Em certas modalidades, um anticorpo modificado por CMC é mais estável sob várias temperaturas (por exemplo, 4ºC, 25ºC e 37ºC) por um período de tempo prolongado (por exemplo, 3 dias, 7 dias, 14 dias e 28 dias) e sob congelamento repetido/ciclos de descongelamento (por exemplo, -40ºC/25ºC por até 5 ciclos) em comparação com o anticorpo não modificado. Além disso, os anticorpos modificados por CMC têm uma solubilidade aceitável. Por exemplo, para uma dada sequência de uma cadeia leve ou de uma cadeia pesada, certos aminoácidos podem ser locais de oxidação e glicosilação em potencial. Estes resíduos de aminoácidos nos locais de oxidação, desamidação ou glicosilação potenciais podem ser mutados e resíduos adicionais nas proximidades também podem ser mutados e/ou otimizados para manter a estrutura 3D e a função de um anticorpo específico. Em algumas modalidades, um ou mais resíduos de aminoácidos em uma região CDR com potencial de oxidação, desamidação ou glicosilação são mutados para melhorar a estabilidade do anticorpo ou de um fragmento do mesmo sem comprometer as funções imunológicas. Em algumas modalidades, um ou mais resíduos de Met em uma região CDR com potencial de oxidação são mutados. Em algumas modalidades, um ou mais resíduos de Asn em uma região CDR com potencial de desamidação são mutados.

[0052] As sequências das regiões variáveis de vários exemplos de anticorpos humanizados otimizados de CMC são mostradas na Tabela 3 abaixo. TABELA 3: SEQUÊNCIAS DE ANTICORPOS HUMANIZADOS OTIMIZADOS DE CMC SEQ ID Tipo Sequência (com mutações destacadas em negrito e NO sublinhado, e com CDRs destacados em itálico)

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQOSLESSDGNTYLEW h-42AS5-VL | 204 | PRT [YLOKPGOSPQLLIYGVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI

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IQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSISTYHVHWVRQ h-34F8-VH | 207 | pRT PPGKGLEWIGIMWRDGDTYYNPKLKSRVTISVDTSKNQV

ISLKLSSVTAADTAVYFCARGGTLTTPFTYWGQGTLVTV

SS IQFQLTQPSSVSASVGDRVTITCERSSGDIGDSYVSWYQQK) h-19F6-VL 208 PRT |PGQOPPKNVIYADDORPSGVPDRFSGSIDGSGNSASLTISS

LQAEDAADYFCQOSYDSNIDFNPVEGGGTKLTVL EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSKYAMSWVR

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ITLVTVS COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[0053] Os anticorpos divulgados neste documento podem ser formulados em composições farmacêuticas. As composições farmacêuticas podem compreender ainda um ou mais carreadores, excipientes, conservantes farmaceuticamente aceitáveis ou uma combinação dos mesmos. As composições farmacêuticas podem ter várias formulações, por exemplo, formulações injetáveis, formulações liofilizadas, formulações líquidas, etc. Dependendo da formulação e da via de administração, pode-se selecionar aditivos adequados, tais como adjuvantes, carreadores, excipientes, conservantes.?*?

[0054] A composição farmacêutica pode ser incluída em um kit com uma instrução para o uso da composição.

MÉTODOS DE TRATAMENTO

[0055] É fornecido aqui um método de tratamento e/ou prevenção de trombose em um sujeito que sofre de trombose e/ou com risco elevado de desenvolver trombose. Também é fornecido um método para inibir a formação de coágulos sanguíneos em um sujeito. Estes métodos envolvem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-FXI e/ou FXIa fornecido neste documento para intervir na via intrínseca. Em algumas modalidades, esses métodos compreendem a administração de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-FXI e/ou anti-FXIa conforme fornecido neste documento ao sujeito.

[0056] Os métodos divulgados neste documento podem ser usados para prevenir e/ou tratar complicações ou afecções associadas à trombose em um sujeito em necessidade. À trombose causa ou está associada a uma série de complicações ou afecções, como acidente vascular cerebral embólico, trombose venosa, como tromboembolismo venoso (TEV), trombose venosa profunda (TVP) e embolia pulmonar (EP), trombose arterial, como síndrome coronariana aguda (ACS), doença arterial coronariana (DAC) e doença arterial periférica (DAP). Outras afecções associadas à trombose incluem, por exemplo, alto risco de TEV em pacientes cirúrgicos, pacientes imobilizados, pacientes com câncer, pacientes com insuficiência cardíaca, pacientes grávidas ou pacientes com outras afecções médicas que podem causar trombose. Os métodos divulgados neste documento referem- se a uma terapia anticoagulante preventiva, isto é, tromboprofilaxia. Estes métodos envolvem a administração a um sujeito que sofre de uma complicação relacionada à trombose divulgada acima de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-cFXI e/ou FXla como divulgado neste documento ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo anti-FXI e/ou FXla. O anticorpo ou composição farmacêutica pode ser administrado isolado ou em combinação com qualquer outra terapia para tratar ou prevenir as complicações ou afecções relacionadas com a trombose.

[0057] Também é fornecido um método de tratamento e/ou prevenção de sepse em um sujeito em necessidade. Tentou-se administrar anticoagulantes em pacientes com sepse para melhorar a mortalidade ou morbidade. No entanto, a tentativa foi malsucedida devido ao sangramento indesejado causado pelos anticoagulantes. Os anticorpos divulgados neste documento podem ser usados como uma terapia secundária em combinação com outros agentes terapêuticos para o tratamento de sepse, como antibióticos.

[0058] Conforme usado no presente documento, o termo “sujeito” se refere a um sujeito mamífero, de preferência, um ser humano. Um “sujeito em necessidade” refere-se a um sujeito que foi diagnosticado com trombose ou complicações ou afecções associadas à trombose, ou está em risco elevado de desenvolver trombose ou complicações ou afecções associadas à trombose. As palavras “sujeito” e “paciente” podem ser usadas de forma intercambiável no presente documento.

[0059] Os termos “tratar”, “que trata (ou tratam)” e “tratamento”, conforme usados no presente documento em relação a uma afecção, se referem ao alívio parcial ou total da afecção, prevenção da afecção, diminuição da probabilidade de ocorrência ou recorrência da afecção, retardando a progressão ou o desenvolvimento da afecção, ou eliminação, redução ou retardamento do desenvolvimento de um ou mais sintomas associados à afecção. Em relação à trombose e/ou complicações ou afecções associadas à trombose, “tratar” pode referir-se a prevenir ou retardar o crescimento do coágulo de sangue existente e/ou prevenir ou retardar a formação de coágulo de sangue. Em algumas modalidades, o termo “tratar”, “tratando” ou “tratamento” significa que o sujeito tem um número ou tamanho reduzido de coágulos sanguíneos em comparação com um sujeito que não é administrado com os anticorpos ou fragmentos funcionais dos mesmos. Em algumas modalidades, o termo “tratar”, “tratando” ou “tratamento” significa que um ou mais sintomas de trombose e/ou afecções ou complicações relacionadas à trombose são atenuados em um sujeito que recebe um anticorpo ou composição farmacêutica conforme divulgado neste documento comparando a um sujeito que não recebe tal tratamento.

[0060] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de um anticorpo ou composição farmacêutica, tal como utilizado neste documento, é uma quantidade do anticorpo ou composição farmacêutica que produz um efeito terapêutico desejado em um sujeito, tal como tratamento e/ou prevenção de trombose. Em certas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade do anticorpo ou composição farmacêutica que produz efeito terapêutico máximo. Em outras modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz produz um efeito terapêutico que é menor do que o efeito terapêutico máximo. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser uma quantidade que produz um efeito terapêutico, evitando um ou mais efeitos colaterais associados a uma dosagem que produz efeito terapêutico máximo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz para uma composição específica variará com base em uma variedade de fatores, incluindo, mas sem limitação, as características da composição terapêutica “(por exemplo, atividade, farmacocinética —farmacodinâmica e biodisponibilidade), a condição fisiológica do sujeito (por exemplo, idade, peso corporal, sexo, tipo e estágio da doença, histórico médico, condição física geral, capacidade de resposta a uma dada dosagem e outros medicamentos presentes), a natureza de quaisquer carreadores, excipientes e conservantes farmaceuticamente aceitáveis na composição e a via de administração. Um indivíduo versado na técnica clínica e farmacológica será capaz de determinar uma quantidade terapeuticamente eficaz através de experimentação de rotina, a saber, monitorando-se a resposta de um sujeito à administração da composição farmacêutica e ajustando-se a dosagem em conformidade. Para informações adicionais, consultar, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22º Edição, Pharmaceutical Press, Londres, 2012, e Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12º Edição, McGraw-Hill, New York, NY, 2011, cujas divulgações completas são incorporadas ao presente documento a título de referência.

[0061] Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo divulgado neste documento está na faixa de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg.

[0062] Está dentro da competência de um versado na técnica selecionar uma via de administração adequada, tal como administração subcutânea, administração intravenosa, administração intramuscular, administração intradérmica, administração intratecal ou administração intraperitoneal. Para o tratamento de um sujeito com necessidade do mesmo, o anticorpo ou composição farmacêutica pode ser administrado continuamente ou intermitentemente, para uma liberação imediata, liberação controlada ou liberação sustentada. Além disso, o anticorpo ou composição farmacêutica pode ser administrado três vezes ao dia, duas vezes ao dia ou uma vez ao dia por um período de 3 dias, 5 dias, 7 dias, 10 dias, 2 semanas, 3 semanas ou 4 semanas. O anticorpo ou composição farmacêutica pode ser administrado ao longo de um período de tempo predeterminado. Alternativamente, o anticorpo ou composição farmacêutica pode ser administrado até que uma referência terapêutica particular seja alcançada. Em certas modalidades, os métodos fornecidos neste documento incluem uma etapa de avaliação de um ou mais referenciais terapêuticos para determinar se deve continuar a administração do anticorpo ou composição farmacêutica.

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ANTICORPOS

[0063] “Também são fornecidos neste documento métodos de produção dos anticorpos anti-FXI e/ou anti-FXIa divulgados neste documento. Em certas modalidades, esses métodos envolvem as etapas de clonagem de um ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-FXI e/ou anti-FXIa em um vetor, transformando uma célula hospedeira com o vetor e cultivando a célula hospedeira para expressar o anticorpo. O anticorpo expresso pode ser purificado a partir da célula hospedeira com o uso de qualquer técnica conhecida. Vários vetores de expressão, como o vetor pTT5 e o vetor pcDNA3, bem como várias linhas de células hospedeiras, como células CHO (por exemplo, CHO-Ki e ExpiCHO) e células HEK193T, podem ser usados.

[0064] Também abrangidos por esta divulgação estão os anticorpos produzidos pelo método divulgado acima. Os anticorpos podem ter sido submetidos a uma ou mais modificações pós-tradução.

[0065] Os exemplos a seguir são fornecidos para melhor ilustrar as modalidades e não devem ser interpretados como limitando o escopo de qualquer modalidade reivindicada. Na medida em que materiais específicos são mencionados, é apenas para fins ilustrativos e não se destina a limitar a invenção. Um indivíduo versado na técnica pode desenvolver meios ou reagentes equivalentes sem o exercício de capacidade inventiva e sem se afastar do escopo da invenção. Será entendido que muitas variações podem ser feitas nos procedimentos descritos no presente documento enquanto ainda permanecem dentro dos limites da presente invenção. É intenção dos inventores que tais variações sejam incluídas dentro do escopo da invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: MATERIAIS E MÉTODOS

[0066] Materiais. FXI humano (nº de cat. HFXI 1111), FXIa (nº de cat. HFXIa 11119), FXIIa (HFXIIa 1212a) e FIX (nº de cat. HFIX 1009) foram adquiridos do Enzyme Research Laboratory (IN, EUA).

[0067] Preparação do anticorpo. A imunização animal e a triagem de hibridoma foram realizadas na Genscript Inc. (Nanjing, China), e os procedimentos que foram aplicados a animais neste protocolo foram aprovados pelo Genscript Institutional Animal Care and Use Committee. O experimento foi realizado de acordo com as diretrizes aprovadas. Ratos wistar foram imunizados com FXI humano, e esplenócitos de animais com boa resposta imune foram coletados para a preparação de hibridomas, os quais foram submetidos à subclonagem por diluição limitante. Finalmente, vários clones de hibridoma monoclonal que expressam os anticorpos anti-FXI desejados, incluindo 19F6, h- 34F8 e 42A5, foram obtidos usando ELISA e triagem funcional. Após a determinação das sequências de aminoácidos de suas regiões variáveis, 19F6, h-34F8 e 42A5 foram submetidos à humanização, resultando em três anticorpos humanizados, h-19F6, h-34F8 e h-42A5, em uma forma de IgG4. Esses três anticorpos humanizados foram produzidos em um sistema de expressão transiente de mamíferos e purificados por cromatografia em

Proteína G.

[0068] Tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT) e tempo de protrombina (PT). O plasma humano padrão adquirido da Symens Inc. foi misturado com volume igual de vários anticorpos em várias concentrações de O a 400 nM por 5 minutos antes de ser testado em um analisador CA6O00. No ensaio APTT, 50 ul da mistura plasma-anticorpo e 25 ul do reagente APTT (SMN 10445709, Symens Inc.) foram misturados a 37 ºC durante 4 min. Em seguida, foram adicionados 25 ul de solução de CaCl2z (25 mM, SMN 10446232, Symens Inc.) e o tempo para a formação do coágulo foi determinado. No ensaio PT, 50 ul da mistura plasma-anticorpo foram misturados com um volume igual de reagente PT (SMN 10446442, Symens Inc.) a 37 ºC e o tempo para a formação do coágulo foi determinado.

[0069] Os efeitos dos anticorpos em APTT e PT em plasma de macaco também foram avaliados usando os mesmos métodos aplicados ao plasma humano. Nestes ensaios, plasma de macaco diluído com um volume igual de solução salina tamponada com fosfato (PBS) foi usado em vez da mistura de anticorpo-plasma humano acima mencionada.

[0070] Ativação de FXI por FXIIa. FXI humano (500 nM) foi pré-incubado à temperatura ambiente com 1 uM de controle IgG4 ou h-19F6 ou h-34F8 ou h-42A5 em PBS por 5 minutos. No tempo zero, FXIIa, HK e caulim foram adicionados de modo que as concentrações finais fossem FXI (250 nM), FXIIla (50 nM), HK (100 nM) e caulino (0,5 mg/ml). Em intervalos de O, 30, 60, 120 min, amostras de 50 ul foram coletadas em tampão de amostra de sulfato de dodecila. As amostras foram fracionadas por tamanho em géis não redutores de 10% e transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno. O Western blotting foi realizado para determinar o FXI, bem como os níveis da cadeia leve de FXIa, usando um IgG anti-FXI humano de camundongo (1C5, um anticorpo feito internamente que se liga ao terminal C de FXI). Os resultados da imagem foram adquiridos usando um ChemiDocMP Imaging System com Image Lab Software (Bio- Rad).

[0071] Ativação FIX mediada por FXIa. FIX humano (200 nM) foi incubado com FXIa (5 nM) em PBS contendo 5 mM de CaCl; à temperatura ambiente na presença de 1 UM de controle de IgG4, h-19F6, h-34F8, ou h-42A5. Em intervalos de O, 15, 30, 45 e 60 min, amostras de 50 ul foram coletadas em tampão de amostra de sulfato de dodecila. As amostras foram fracionadas por tamanho em géis não redutores de 10% e transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno. O Western blotting foi realizado para determinar os níveis de FIX, bem como de FIXa, usando FIX IgG de cabra anti-humano (Affinity Biologicals). Os resultados da imagem foram adquiridos usando um ChemiDocMP Imaging System com Image Lab Software (Bio-Rad).

[0072] Ressonância plasmônica superficial (SPR). A interação dos anticorpos com FXI foi determinada pelo ensaio SPR em um sistema Biacore T200 (Biacore, GE Healthcare). Em suma, o anticorpo de captura de IQG humana (Biacore, GE Healthcare) foi pré-imobilizado em um chip sensor CM5 (GE Healthcare) e os anticorpos de teste foram capturados fluindo através do chip. A quantidade final dos anticorpos de teste capturados foi ajustada para uma quantidade igual de 15 unidades de resposta (RU) ajustando o tempo de captura. Em seguida, o antígeno FXI foi permitido fluir através do chip por 180 s para associação e depois por 1.200 s para dissociação. FXI foi testado em concentrações de 0,063, 0,313, 0,625, 1,25, 3,125 e 6,25 nM. Os dados foram coletados e as afinidades entre os anticorpos de teste e FXI foram analisadas com o uso do software de avaliação Biacore.

[0073] Para determinar os locais de ligação de anticorpos de teste em FXI, quatro mutantes de FXI marcados com 6 x His no terminal C foram primeiro gerados substituindo cada domínio de maçã (Al, A2, A3 e A4) com os domínios correspondentes da pré- calicreína humana. Quantidades iguais de cada mutante foram imobilizadas em um chip sensor CM5 e os anticorpos de teste (33,3 nM) puderam fluir através do chip por 180 s para associação e depois por 1.200 s para dissociação. As quantidades de cada anticorpo capturado foram registradas em unidades de resposta (RU) usando o Software Biacore Evaluation.

[0074] Os resultados de ligação do epítopo dos anticorpos de teste também foram analisados usando o sistema Biacore T200. Em suma, FXI de tipo selvagem com etiqueta 6 x His foi pré-imobilizado em um chip sensor CM5 (GE Healthcare) e h-19F6, h-34F8 ou h-42A5 (5 pg/ml) foi sucessivamente injetado em células de fluxo na superfície do sensor a uma taxa de fluxo de 30 ul/minuto para monitorar a mudança na resposta.

[0075] Farmacodinâmica em macacos cynomolgus. Este experimento com animais e o seguinte experimento de trombose AV foram realizados na Wincon Inc. (Nanning, China), e os procedimentos aplicados a animais neste protocolo foram aprovados pelo Wincon Institutional Animal Care and Use Committee. Os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas. Os animais receberam uma injeção intravenosa em bolus de diferentes doses de h-19F6, h-34F8 ou h-42A5. Dois ml de sangue das veias superficiais do membro superior foram coletados em um tubo de coleta contendo citrato de sódio a 3,2% na pré-dose (tempo 0) e às 0,5h, 1h, 3h, 6h, 12 h e 24 h pós-dose. Em seguida, os tubos foram misturados por inversão suave dez vezes à temperatura ambiente. O plasma foi coletado em tubos marcados e armazenado a -20 ºC até a análise do tempo de coagulação. As amostras de plasma foram diluídas com volume igual de solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4) e, em seguida, submetidas à análise de APTT e PT em um analisador automático (CA660, Sysmex Inc.).

[0076] Trombose do shunt AV e teste do tempo de sangramento. Um tratamento de anticorpo pós-teste de 30 minutos foi administrado via bolus intravenoso em macacos cynomolgus. Um teste de tempo de sangramento na veia da cauda foi então realizado, seguido de indução de trombose. A trombose foi induzida pela conexão de um dispositivo de shunt entre as cânulas arterial femoral e venosa femoral contendo um fio pré-pesado de 10 cm de comprimento. O sangue foi permitido fluir pelo shunt por 10 min. O trombo formado no fio foi pesado. Imediatamente após a remoção do shunt, amostras de sangue foram coletadas e o próximo nível mais alto de anticorpo de teste foi administrado. Este processo de sangramento/trombose foi realizado quatro vezes para dosar o veículo e três níveis crescentes (0,1, 0,3, 1 mg/kg) de anticorpo de teste no mesmo animal.

[0077] Para avaliação do tempo de sangramento, uma seringa de 2 ml foi inserida na veia da cauda dos animais. Quando o volume de sangue na seringa parou de aumentar, o tempo decorrido foi registrado manualmente como o tempo de sangramento.

[0078] Trombose induzida por cloreto férrico (FeCl;) e teste do tempo de sangramento. Este experimento com animais foi realizado em Pharmalegacy Laboratories Inc. (Xangai, China), e os procedimentos que foram aplicados a animais neste protocolo foram aprovados pelo PharmaLegacy Institutional Animal Care and Use Committee. O experimento foi realizado de acordo com as diretrizes aprovadas. Macacos Cynomolgus foram pré-anestesiados com 1,5 mg/kg de Zoletil, intubados e ventilados com um respirador. A anestesia foi mantida com isoflurano. Pressão arterial, frequência cardíaca e temperatura corporal foram monitoradas durante todo o procedimento. O veículo ou 0,3 mg/kg de h-19F6, h-34F8 ou h-42A5 foi administrado através de uma veia do membro 2 horas antes da aplicação de FeCl3. A artéria femoral esquerda foi exposta e isolada por meio de dissecção romba. Uma sonda de fluxo Doppler foi instalada na artéria e o fluxo sanguíneo foi continuamente registrado. Antes de aplicar FeCI3, o fluxo sanguíneo foi medido por pelo menos 5 minutos. Em seguida, dois pedaços de papel de filtro pré-embebidos com 40% de FeCl3 foram aplicados na superfície adventícia do vaso a montante da sonda por 10 minutos. Após a remoção do papel de filtro, o local da aplicação foi lavado com solução salina. O fluxo sanguíneo foi medido continuamente até diminuir para 0. O tempo para oclusão de 80% (fluxo sanguíneo reduzido para 20% do fluxo sanguíneo de linha de base) e o tempo para oclusão de 100% (fluxo sanguíneo reduzido para 0) foram registrados. Nos mesmos animais, a hemostasia foi avaliada com o uso do dispositivo Surgicutt e o tempo de sangramento foi registrado manualmente na pré-dose e 1 hora após a dose. No final do estudo (aproximadamente 3 horas após a dose), amostras de sangue foram coletadas.

[0079] A especificidade de ligação dos anticorpos de teste ao FXI humano no plasma. Os anticorpos de teste (h-19F6, h-42A5 e 14E11) foram primeiro biotinilados com o uso do Kit EZ-Link"Y Sulfo-NHS-LC-Biotinylation (nº de cat. 21435, Thermo Fisher Inc.). Estes anticorpos (25 ug cada) foram incubados com 200 ul de plasma humano padrão (Siemens Inc.) ou plasma deficiente em FXI (Hyphen Biomed Inc.) durante 1 hora. Em seguida, 50 ul de esferas revestidas com estreptavidina (Dynabeads'” M-280 Streptavidin, Thermo Fisher Inc.) foram adicionados à mistura para extrair o complexo antígeno-anticorpo que contém biotina. Depois de lavar com PBS por 3 vezes, o complexo antígeno-anticorpo foi então eluído e submetido a Western blotting com o uso de um IgG de camundongo anti-humano FXI (1C5, um anticorpo feito internamente que se liga ao terminal C de FXI) como o anticorpo primário. Os resultados da imagem foram adquiridos usando um ChemiDocMP Imaging System com Image Lab Software (Bio-Rad). No Western blotting, 10 ul de plasma humano padrão e plasma deficiente em FXI serviram como controles FXI-positivos e FXI-negativos, respectivamente.

[0080] Análise estatística. Os dados numéricos de vários experimentos são apresentados como médias + erro padrão da média (SEM). ANOVA unilateral seguida pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett foi usado para a análise estatística do peso do trombo no experimento de shunt AV e em ambos os testes de tempo de sangramento. O teste de classificação de Kruskal-Wallis foi realizado para a análise estatística dos tempos de oclusão no experimento de trombose induzida por FeClz. Um valor de P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. EXEMPLO 2: GERAÇÃO E SEQUENCIAMENTO DE ANTICORPOS ANTI-FXI

[0081] “Camundongos BALB/c e ratos Wistar foram imunizados com FXI humano, e os esplenócitos dos animais com boa resposta imune foram coletados para a preparação de hibridomas, os quais foram submetidos à subclonagem por diluição limitante. Doze clones de hibridoma monoclonais que expressam os anticorpos anti-FXI desejados 3G12, 5B2, 7C9, 7F1, 13F4, 19F6, 21F12, 34F8, 38E4, 42A5, 42F4, e 45H1 foram obtidos com o uso de ELISA de captura e triagem funcional.

[0082] Para determinar as sequências de aminoácidos e nucleotídeos da região variável da cadeia leve (V.) e pesada (Vs) desses anticorpos, CDNAs que codificam V. e Vx foram clonados a partir das células de hibridoma correspondentes por procedimentos padrão de RT-PCR. As sequências Vi e Vu de anticorpos exemplares, incluindo as sequências de CDRs, são mostradas na Tabela 1. EXEMPLO 3: DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTICOAGULAÇÃO EM PLASMA HUMANO COM O USO DO ENSAIO DE TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADA (APTT) E ENSAIO DE TEMPO DE PROTROMBINA (PT)

[0083] O ensaio APTT mede a atividade das vias intrínsecas e comuns de coagulação; enquanto que o ensaio PT mede a atividade das vias extrínsecas e comuns de coagulação. Os anticorpos testados nestes experimentos foram 19F6, 34F8, 42A5, 1A6 e 14E11. Anticorpos 1A6 e 14E11 foram usados como controles positivos neste experimento. As sequências das regiões variáveis dos anticorpos de controle foram obtidas da Patente US

No. 8.388.959 e da Publicação do Pedido de Patente US No. 2013/0171144 e reformatadas para IgG4. Esses anticorpos foram então expressos usando o sistema de células EXxpiCHO. O ensaio APTT e o ensaio PT foram realizados como descrito acima.

[0084] “Como mostrado na Figura 1, todos os anticorpos testados aumentaram o APTT de uma maneira dependente da concentração a uma concentração relativamente baixa, por exemplo, até 100 nM (ou até 200 nM para 14E11); ao passo que nenhum desses anticorpos teve um efeito significativo no PT (dados não mostrados). Estes resultados indicam que todos os anticorpos testados inibiram a via intrínseca de coagulação, mas não a via extrínseca. EXEMPLO 4: DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTICOAGULAÇÃO EM PLASMA DE

ESPÉCIES NÃO HUMANAS COM O USO DO ENSAIO DE TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADA (APTI)

[0085] Os efeitos de vários anticorpos, incluindo 19F6, 34F8 e 42A5, sobre a coagulação foram avaliados no plasma de camundongo, rato e macaco usando o mesmo método descrito no Exemplo 3. Nenhum dos anticorpos testados teve qualquer efeito sobre o APTT no plasma do camundongo e do rato, mas todos eles, em uma concentração relativamente baixa, dependendo da concentração, aumentaram o APTT no plasma do macaco como mostrado na Figura 2, indicando que os anticorpos testados tinham atividade reticulada com FXI/FXIa de macaco, mas não com FXI/FXIa de camundongo ou rato. EXEMPLO 5: HUMANIZAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-FXI

[0086] O uso de anticorpos monoclonais de murino diretamente como terapêuticos têm sido prejudicados pela meia-vida curta e a elicitação das respostas de anticorpos humanos antimurinos. Uma solução para esse problema é humanizar os anticorpos murinos. Alguns anticorpos foram submetidos à humanização por enxerto de CDR. Estruturas aceitadoras humanas adequadas para V. e Vx de cada anticorpo murino foram identificadas e vários números de mutações reversas foram introduzidos nas estruturas humanas selecionadas para manter a estrutura e/ou função do anticorpo resultante. Se a afinidade e a função desses anticorpos humanizados não fossem substancialmente inferiores aos anticorpos não modificados correspondentes, os anticorpos modificados eram considerados humanizados com sucesso. Três sequências Vi e Vi humanizadas de 19F6, 34F8 e 42A5, descritas como h-19F6, h-34F8 e h-42A5, respectivamente, são mostradas na Tabela 2. EXEMPLO 6: DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE DE ANTICORPOS ANTI-FXI PARA FXI

HUMANO

[0087] A afinidade dos anticorpos anti-FXI/FXIa para FXI/FXIa foi determinada usando a tecnologia de ressonância plasmônica superficial (SPR) realizada no instrumento BIAcore T200. Os anticorpos humanizados foram construídos ligando as regiões variáveis dos anticorpos divulgados neste documento ao domínio Fc de IgG4 humana e os recombinantes foram expressos em células CHO. Esses anticorpos foram capturados em um chip sensor Biacore CM5 que foi pré-imobilizado com um anticorpo IgG anti-humano.

[0088] Em seguida, diferentes concentrações do antígeno FXI ou FXIa purificado (0,005 a 1 po/ml) foram deixados fluir através do chip CM5 por 180 s para associação com o anticorpo anti-FXI/FXIa, seguido por um tempo de 1.800 s para dissociação. Os dados de ligação foram coletados e a afinidade entre FXI/FXIa e os anticorpos de teste foi analisada usando o software de avaliação Biacore fornecido por GE Healthcare. Os sensogramas SPR de ligação de FXI/FXIa a h-19F6, h-34F8 e h-42A5 imobilizados são mostrados na Figura

3. Como mostrado na Figura 3, a resposta (RU) para cada anticorpo tornou-se mais alta com concentrações crescentes de FXI ou FXIa. As constantes de dissociação (Kp) de h- 19F6, h-34F8 e h-42A5 para FXI e FXIa foram calculadas e detalhadas na Tabela 4. As afinidades de cada anticorpo para FXI e FXIa são consideradas iguais, uma vez que a diferença entre eles é inferior a 10 vezes. TABELA 4: VALORES DE Ko DOS ANTICORPOS PARA FXI E FXla

A ER E EXEMPLO 7: DETERMINAÇÃO DO LOCAL DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-FXI EM FXI

[0089] Os locais de ligação de 19F6 e 42A5 em FXI foram determinados usando a tecnologia SPR. Em suma, o anticorpo de captura de IQG humana foi pré-imobilizado em um chip sensor Biacore CM5 e h-19F6 ou h-42A5 recombinante foi capturado fluindo através do chip. Uma quantidade igual (15 unidades relativas) de h-19F6 e h-42A5 foi capturada através do ajuste do tempo de fluxo do anticorpo. Em seguida, FXI de tipo selvagem ou FXI quimérico em que o domínio da maçã individual foi substituído pelo domínio correspondente da pré-calicreína humana (quimeras FXI/PK) foi permitido fluir através do chip por 180 segundos para associação com h-19F6 ou h-42A5, seguido por um período de 1.800 segundos para dissociação. Os dados de ligação foram analisados em um modo cinético de alto desempenho, pois apenas uma concentração de FXI, de tipo selvagem ou quimérico, foi testada no ensaio SPR. Os resultados mostraram que h-19F6 e h-42A5 ligam FXI, bem como quimeras FXI/PK, exceto quando o domínio A3 de FXI foi substituído pelo domínio PK correspondente, indicando que parte ou o epítopo completo de h-19F6 e h-42A5 no FXI está localizado no domínio A3. EXEMPLO 8: NEUTRALIZAÇÃO FUNCIONAL DE FXIa PELOS ANTICORPOS

[0090] A atividade do FXIla humano foi determinada medindo a clivagem de um substrato cromogênico específico, S-2366 (Diapharma Inc.). Para testar a atividade inibitória dos anticorpos, os anticorpos h-19F6, h-34F8 e h-42A5 foram pré-incubados por minutos à temperatura ambiente com uma concentração final de 5 nM de FXIa em PBS (tampão fosfato salino). Em seguida, um volume igual de 1 mM de S-2366 foi adicionado para iniciar a reação de clivagem FXIa e as alterações na absorbância a 405 nm foram monitoradas continuamente usando um leitor de placa M5º (Molecular Devices Inc.). Os dados foram analisados usando o software GraphPad Prism e são mostrados na Figura 4. O Ki aparente calculado para h-19F6, h-34F8 e h-42A5 são 0,67, 2,08 e 1,43 nM, respectivamente. Portanto, todos os três anticorpos testados exibiram efeitos inibitórios satisfatórios em FXIla em uma concentração relativamente baixa. EXEMPLO 9: INIBIÇÃO DA ATIVAÇÃO DE FIX MEDIADA POR FXIa PELOS ANTICORPOS

[0091] A ativação de FIX mediada por FXIa foi realizada conforme descrito acima. Os anticorpos anti-FXI podem modular a via intrínseca, inibindo a ativação do FXI e/ou inibindo a atividade do FXIa. Primeiro, os efeitos dos dois anticorpos h-19F6 e h-42A5 na ativação de FXI mediada por FXIIa foram testados e verificou-se que nem h-19F6 nem h- 42A5 impediram a conversão de FXI em FXIa mediada por FXIIa (Figuras 5C e 5D). Em seguida, o efeito desses dois anticorpos na atividade de FXIa foi testado usando FIX como substrato. Como mostrado nas Figuras 5A e 5B, tanto h-19F6 quanto h-42A5 reduziram à ativação de FIX de uma maneira dependente da concentração. O efeito inibitório destes dois anticorpos na atividade de FXIa foi posteriormente confirmado usando um substrato cromogênico de FXIa, S-2366. Ambos os anticorpos inibiram de forma dependente da concentração a hidrólise de S-2366 (Figura 4). EXEMPLO 10: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DOS ANTICORPOS ANTI-FXI NO TEMPO DE

COAGULAÇÃO EM MACACOS CYNOMOLGUS

[0092] Para encontrar espécies animais adequadas para experimentos in vivo, a reatividade cruzada dos anticorpos para FXI de camundongo, rato e macaco foi testada pelo ensaio APTT. Os anticorpos APTT prolongado em plasma de macaco, mas não em plasma de camundongo ou rato (dados não mostrados). Assim, os modelos de macaco foram escolhidos para avaliar os efeitos farmacodinâmicos dos três anticorpos nos tempos de coagulação antes dos estudos de eficácia na trombose /n vivo. Macacos Cynomolgus foram administrados por via intravenosa com as doses indicadas de vários anticorpos. O sangue das veias superficiais do membro superior foi coletado na pré-dose e 0,5, 1, 3, 6, 12 e 24 horas após a dose, e o plasma citratado foi preparado para determinação de APTT e PT. No teste APTT, 50 ul de amostra de plasma diluída e 25 ul de reagente APTT (SMN 10445709, Symens Inc.) foram misturados e incubados a 37 ºC por 4 min. Em seguida, foram adicionados 25 ul de solução de CaCl> (25 mM, SMN 10446232, Symens Inc.) e o tempo para a formação do coágulo foi determinado. No teste de PT, 50 ul de amostra de plasma diluída foram misturados com volume igual de reagente de PT (SMN 10446442, Symens Inc.) e incubados a 37 ºC e o tempo para a formação do coágulo foi determinado. Todos os três anticorpos testados demonstraram aumento de APTT dependente da dose, conforme mostrado na Figura 6 e nenhum deles afetou o PT, conforme mostrado na Figura 7.

[0093] Ambos h-19F6 e h-42A5 prolongaram o APTT de forma dependente da dose (Figuras 6B e 6C). Notavelmente, h-42A5 aumentou APTT mais fortemente do que h-19F6 fez nos mesmos níveis de dose (0,3 e 1 mg/kg), consistente com os efeitos /n vitro dos anticorpos no APTT humano (Figura 164). Além disso, nenhum dos anticorpos afetou o PT in vivo (Figuras 7B e 7C).

EXEMPLO 11: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DE ANTICORPOS ANTI-FXI EM MODELOS DE TROMBOSE DE SHUNT ARTERIOVENOSO (AV) E SANGRAMENTO DA VEIA DA CAUDA EM

MACACOS CYNOMOLGUS

[0094] Tanto a trombose quanto o tempo de sangramento foram avaliados no mesmo animal para doses múltiplas de cada anticorpo testado. Os anticorpos incluídos neste experimento foram h-34F8, h-19F6 e h42A5. Em suma, o tempo de sangramento e a trombose foram avaliados sequencialmente na pré-dose e 30 minutos após cada administração do anticorpo. As avaliações de sangramento/trombose foram conduzidas quatro vezes: pré-dose e pós-dose em três níveis crescentes de dose (0,1, 0,3 e 1 mg/kg).

[0095] Para trombose de shunt AV, um dispositivo de shunt que contém um fio de seda de 10 cm de comprimento pré-pesado foi aplicado para conectar as cânulas arterial femoral e venosa femoral, e o sangue foi deixado fluir através do shunt por 10 minutos. Em seguida, a linha foi removida do shunt e pesada novamente. O peso do coágulo no fio foi calculado como a diferença do peso do fio antes e depois do fluxo sanguíneo.

[0096] Para avaliação do tempo de sangramento, uma seringa de 2 ml foi inserida na veia da cauda dos animais. Quando o volume de sangue na seringa parou de aumentar, o tempo decorrido foi registrado manualmente como o tempo de sangramento.

[0097] Todos os anticorpos reduziram de maneira dependente da dose o peso do trombo, conforme mostrado na Figura 8 e nenhum deles prolongou o tempo de sangramento da veia da cauda, conforme mostrado na Figura 9. Os efeitos de h-19F6 e h- 42A5 na trombose e hemostasia foram avaliados em modelos de macacos de trombose de shunt AV e sangramento da veia da cauda. A injeção intravenosa de h-19F6 resultou em uma redução dependente da dose do peso do coágulo, e uma redução significativa foi observada com a dose de 1 mg/kg (Figura 8B). Em relação aos animais tratados com h- 42A5, o peso do coágulo foi significativamente reduzido em todos os níveis de dosagem de teste de uma maneira dependente da dose (Figura 8C). Nenhuma mudança significativa no tempo de sangramento foi observada após o tratamento com h-19F6 ou h- 42A5 (Figuras 9B e 9C). EXEMPLO 12: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO ANTICORPOS ANTI-FXI NA TROMBOSE DA

ARTÉRIA INDUZIDA POR CLORETO FÉRRICO E TEMPO DE SANGRAMENTO DO MOLDE EM MACACOS CYNOMOLGUS

[0098] Macacos Cynomolgus foram pré-anestesiados com 1,5 mg/kg de Zoletil, intubados e ventilados com um respirador. A anestesia foi mantida com isoflurano. A pressão arterial, a frequência cardíaca e a temperatura corporal foram monitoradas durante todo o procedimento. Os anticorpos testados, incluindo h-34F8, h-19F6 e h-42A5, ou o veículo de controle foram administrados através da veia do membro por injeção 2 horas antes da aplicação de FeCl3. A artéria femoral esquerda foi exposta e isolada por meio de dissecção romba. Uma sonda de fluxo Doppler foi instalada na artéria e o fluxo sanguíneo foi continuamente registrado. Antes de aplicar FeCl3, o fluxo sanguíneo foi medido por pelo menos 5 minutos. Em seguida, dois pedaços de papel de filtro pré- embebidos com FeCl; foram aplicados na superfície adventícia do vaso a montante da sonda por 10 minutos. Após a remoção do papel de filtro, o local da aplicação foi lavado com solução salina. O fluxo sanguíneo foi medido continuamente até diminuir para 0. O tempo para oclusão de 80% (fluxo sanguíneo reduzido para 20% do fluxo sanguíneo de linha de base) e o tempo para oclusão de 100% (fluxo sanguíneo reduzido para 0) foram registrados. No mesmo animal, o tempo de sangramento do molde foi avaliado na pré- dose e 1 hora após a dose.

[0099] Os efeitos de todos os três anticorpos na trombose arterial induzida por FeClz foram investigados. Quatro grupos de macacos foram tratados com o veículo de controle, h-34F8, h-19F6 ou h-42A5 por 2 horas, respectivamente, e FeCl; foi aplicado na artéria femoral esquerda de cada animal para induzir a trombose. A velocidade do fluxo sanguíneo a jusante foi monitorada. O tempo para oclusão trombótica de 80% e 100% no grupo de controle de veículo foi de 14,66 + 1,30 min e 18,50 + 1,76 min, respectivamente. O pré-tratamento com 0,3 mg/kg de h-34F8 ou h-42A5 atrasou significativamente o tempo de oclusão de 80% para 59,53 + 16,95 min e 40,80 + 7,94 min, e o tempo de oclusão de 100% para 70,40 + 20,76 min e 50,61 + 9,48 min, respectivamente, conforme mostrado na Figura 10. O prolongamento do tempo para oclusão de 80% (26,43 + 5,72 min) e para oclusão de 100% (32,78 + 5,09 min) também foi observado em macacos tratados com h-19F6, embora não tenha havido diferença estatisticamente significativa quando comparado ao grupo de controle de veículo conforme mostrado na Figura 10.

[00100] Os efeitos dos anticorpos na hemostasia foram avaliados em termos de tempo de sangramento do molde. Nenhuma diferença significativa foi observada entre a pré-dose e 1 hora após a dose para cada artigo de teste (Figura 11A, 11B e 11C). A alteração do tempo de sangramento após o tratamento com h-34F8, h-19F6 e h-42A5 não foi diferente daquela após o tratamento de controle com veículo (Figura 11D).

[00101] Os efeitos dos anticorpos h-19F6 e h-42A5 na hemostasia foram avaliados por um teste de sangramento causado por laceração da pele nos mesmos animais com trombose arterial induzida por FeCI3 (n = 5 por grupo). Os tempos de sangramento foram registrados na pré-dose e 1 hora após a dose. Nenhuma diferença significativa no tempo de sangramento foi observada entre a pré-dose e 1 hora pós-dose para qualquer um dos anticorpos ou entre os três grupos 1 hora após a dose (Figura 18).

[00102] Os efeitos dos anticorpos nos tempos de coagulação ex vivo do plasma do macaco também foram avaliados. Como esperado, os tratamentos com 0,3 mg/kg de h- 34F8, h-19F6 e h-42A5 prolongaram significativamente o APTT em 3,29 + 0,20, 1,67 + 0,09 e 2,87 + 0,10 vezes, respectivamente, enquanto nenhum aumento no APTT foi observado após tratamento de controle de veículo, como mostrado na Figura 12A. Além disso, os tratamentos com h-34F8, h-19F6 ou h-42A5 não tiveram efeito sobre o PT, como mostrado na Figura 12B.

[00103] Assim, foi descoberto inesperadamente que os anticorpos divulgados neste documento não tinham quaisquer efeitos adversos de sangramento prolongado enquanto inibiam efetivamente a via intrínseca de coagulação. EXEMPLO 13: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DOS ANTICORPOS ANTI-FXI MODIFICADOS NO

TEMPO DE COAGULAÇÃO EM MACACOS CYNOMOLGUS POR UM PERÍODO DE TEMPO PROLONGADO

[00104] Dois anticorpos anti-FXI humanizados otimizados para CMC adicionais, mostrados nas Figuras 14 e 15 como “h-19F6 modificado” e “h-42A5 modificado”, foram avaliados por seus efeitos no tempo de coagulação em macacos cynomolgus por um período de tempo prolongado, por exemplo, por até 14 dias, por ensaios de APTT e PT conforme descrito no Exemplo 10. As sequências da cadeia pesada e da cadeia leve destes dois anticorpos são mostradas na Tabela 3. Macacos Cynomolgus foram administrados por via intravenosa com 0,6 mg/kg ou 2,0 mg/kg dos anticorpos testados. O sangue das veias superficiais do membro superior foi coletado na pré-dose e 0,5 hora, 2 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 96 horas, 168 horas, 240 horas, 336 horas após a dose. Ambos os anticorpos modificados testados demonstraram aumento de APTT dependente da dose, conforme mostrado na Figura 14, e nenhum deles afetou o PT, conforme mostrado na Figura 15. Ambos os anticorpos modificados demonstraram eficácia por um período prolongado, até 7 dias, até 10 dias ou até 14 dias.

[00105] Assim, foi inesperadamente descoberto que os anticorpos modificados aqui divulgados não mostraram quaisquer efeitos adversos de sangramento prolongado, embora inibindo efetivamente a via intrínseca de coagulação por um período de tempo prolongado, até 14 dias. EXEMPLO 14: EFEITOS NOS TEMPOS DE COAGULAÇÃO DO PLASMA HUMANO PADRÃO

[00106] Os anticorpos h-19F6 e h-42A5 foram adicionados ao plasma humano normal, após o que o APTT (Figura 16A) e o PT (Figura 16B) foram determinados (N = 3). Ambos os anticorpos h-19F6 e h-42A5 prolongaram o tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT) do plasma humano padrão de uma maneira dependente da concentração (Figura 16A). Os níveis máximos de inibição da atividade de FXI no plasma para h-19F6 e h-42A5 foram de aproximadamente 97% e 99,5%, respectivamente, com base na curva de correlação entre o nível de FXI no plasma e APTT estabelecido (dados não mostrados). Nenhum dos anticorpos afetou o PT do plasma humano (Figura 16B). EXEMPLO 15: PROPRIEDADES DE LIGAÇÃO DE H-19F6 E H-42A5 A FXI

[00107] A especificidade de ligação de h-19F6 e h-42A5 a FXI foi primeiro verificada à medida que reagiam com FXI em plasma humano padrão e nenhuma reação foi detectada em plasma humano deficiente em FXI (Figura 17). Os anticorpos de teste biotinilados foram incubados com plasma humano normal ou plasma deficiente em FXI. O complexo FXI-anticorpo no plasma foi eluído e sujeito a Western blotting usando um IgG de camundongo anti-humano FXI como o anticorpo primário. Em Western blotting, 10 ul de plasma humano padrão ou plasma deficiente em FXI foram servidos como controles FXI- positivos e FXI-negativos. Um anticorpo anti-FXI relatado anteriormente, 14E1117,

mostrou o mesmo perfil de ligação que os dois anticorpos (Figura 17).

[00108] As afinidades de h-19F6 e h-42A5 para FXI foram determinadas usando a tecnologia de ressonância plasmônica superficial (SPR). Os anticorpos de teste foram capturados em um chip sensor e, em seguida, as concentrações indicadas de FXI puderam fluir pelo chip. Sensogramas para h-19F6 (Figura 19A) e h-42A5 (Figura 19B) foram obtidos. As constantes de dissociação para h-19F6 e h-42A5 foram 22 e 36 pM, respectivamente (Figuras 19A e 19B).

[00109] Os locais de ligação destes dois anticorpos em FXI foram então determinados. FXI é um homodímero que consiste em 4 domínios de maçã em tandem (Al-4) e um domínio catalítico. Quatro mutantes de FXI foram gerados substituindo cada domínio de maçã com domínios correspondentes de pré-calicreina humana e testaram as propriedades de ligação de h-19F6 ou h-42A5 aos 4 mutantes de FXI usando SPR. Quantidades iguais dos 4 FXIs mutantes em que o domínio Al, A2, A3 ou A4 foi substituído pelo domínio correspondente da pré-calicreína foram imobilizados em um chip sensor, e os anticorpos de teste (5 pg/ml) foram autorizados a fluir através do chip para associação. As quantidades de cada anticorpo capturado foram registradas. O experimento foi realizado duas vezes e um resultado representativo é mostrado. Inesperadamente, ambos os anticorpos se ligaram predominantemente ao domínio A3 de FXI, pois a substituição do domínio A3 resultou em muito menos ligação de qualquer um dos anticorpos em comparação com a substituição dos outros 3 domínios da maçã (Figura 19C). Outro anticorpo, O1A6, um anticorpo anti-FXI relatado usado como um controle positivo, também se ligou especificamente ao domínio A3 de FXI, consistente com um estudo anterior.2! No entanto, foi levantada a hipótese de que h-19F6 e h-42A5 ligam diferentes locais de FXI porque eles têm afinidades comparáveis a FXI, mas potências inibitórias bastante diferentes em relação à atividade de FXI, como indicado na Figura 16. Esta hipótese foi testada por ligação de epítopo com o uso de um sistema Biacore T200. De fato, a ligação de h-19F6 a FXI não evitou a seguinte ligação de h-42A5 a FXI, indicando que os dois anticorpos se ligam a locais diferentes no domínio A3 de FXI (Figura 19D). Em seguida, a ordem de fluxo desses dois anticorpos foi alterada e verificou-se que a ligação de h-42A5 a FXI não evitou a seguinte ligação de h-19F6 a FXI (dados não mostrados). EXEMPLO 16: PROPRIEDADES DE LIGAÇÃO DE h-19F6 E h-42A5 A FXIa

[00110] Os anticorpos ligaram-se a FXIa com as boas afinidades com as quais se ligaram a FXI (Figuras 20A e 20B). As afinidades de h-19F6 e h-42A5 para FXI foram determinadas usando a tecnologia de ressonância plasmônica superficial (SPR). As constantes de dissociação para h-19F6 e h-42A5 foram 26 e 81 pM, respectivamente (Figuras 20A e 20B). Os anticorpos de teste foram capturados em um chip sensor e, em seguida, as concentrações indicadas de FXIa puderam fluir através do chip. Sensogramas para h-19F6 (Figura 20A) e h-42A5 (Figura 20B) foram obtidos.

REFERÊNCIAS

[00111] As referências, patentes e pedidos de patentes publicados listados abaixo, e todas as referências citadas no relatório descritivo acima são incorporados por meio deste por referência em sua totalidade, como se estivessem totalmente estabelecidos neste documento. 1 Raskob, G. E. et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arterioscler Thromb VascBiol 34, 2363 a 2371 (2014). 2 Gomez-Outes, A., Garcia-Fuentes, M. & Suarez-Gea, M. L. Discovery methods of coagulation-inhibiting drugs. Expert Opin Drug Discov 12, 1195 a 1205 (2017). 3 Weitz, J. 1. & Fredenburgh, J. C. Factors XI and XII as Targets for New Anticoagulants. Front Med (Lausanne) 4, 19 (2017). 4 Muller, F., Gailani, D. &Renne, T. Factor XI and XII as antithrombotic targets. Curr Opin Hematol 18, 349 a 355 (2011). Al-Horani, R. A. & Desai, U. R. Factor XIa inhibitors: A review of the patent literature. Expert Opin Ther Pat 26, 323 a 345 (2016). 6 Chen, Z,, Seiffert, D. & Hawes, B. Inhibition of Factor XI activity as a promising antithrombotic strategy. Drug Discov Today 19, 1435 a 1439 (2014). 7 Gailani, D. & Gruber, A. Factor XI as a Therapeutic Target. Arterioscler Thromb Vasc Biol 36, 1316 a 1322 (2016). 8 Puy, C., Rigg, R. A. & McCarty, O. J. The hemostatic role of factor XI. Thromb Res 141 Suppl 2, S8 a S11 (2016).

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Claims (17)

Reivindicações

1. Anticorpo anti-FXI ou anti-FXIa isolado que se liga especificamente a FXI ou FXIa humano, em que o anticorpo é caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende três CDRs selecionados a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 11 a 13, 27 a 29, 43 a 45, 59 a 61, 75 a 77, 91 a 93, 107 a 109, 123 a 125, 139 a 141, 155 a 157, 171 a 173, 187 a 189, 197, 199, 201, 204, 206, e 208, e sequências que compartilham pelo menos 90% de identidade, ou um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende três CDRs selecionados a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 14 a 16, 30 a 32, 46 a 48, 62 a 64, 78 a 80, 94 a 96, 110 a 112, 126 a 128, 142 a 144, 158 a 160, 174 a 176, 190 a 192, 198, 200, 202, 205, 207 e 209, e sequências que compartilha pelo menos 90% de identidade, ou uma porção imunologicamente ativa da mesma.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo é caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao domínio A3 do FXI ou FXIa humano.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo é caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO; 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206 e SEQ ID NO: 208 e sequências que compartilham pelo menos 90% de identidade.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo é caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO; 202, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, e SEQ ID NO: 209 e sequências que compartilham pelo menos 90% de identidade.

5. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Método para inibir a formação de coágulos sanguíneos em um sujeito caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

7. Método para inibir a formação de coágulos sanguíneos em um sujeito caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5.

8. Método para tratar ou prevenir trombose ou uma complicação ou afecção associada à trombose caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a administração não compromete a hemostasia do sujeito.

9. Método para tratar ou prevenir trombose ou uma complicação ou afecção associada à trombose, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, em que a administração não compromete a hemostasia do sujeito.

10. Método para tratar ou prevenir sepse caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a administração não compromete a hemostasia do sujeito.

11. Método para tratar ou prevenir sepse caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, em que a administração não compromete a hemostasia do sujeito.

12. Método para produzir o anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 à 4, caracterizado pelo fato de que compreende a expressão de um ácido nucleico que codifica o anticorpo clonado em um vetor de expressão em uma célula hospedeira.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda purificar o anticorpo expresso a partir da célula hospedeira.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão é um vetor pTT5 ou vetor pcDNA3.

15. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula CHO ou uma célula HEK193T.

16. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, ou uma porção imunologicamente ativa do mesmo.

17. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 16, em que o anticorpo é caracterizado pelo fato de que foi modificado pós-tradução.