JP2021534098A - 抗第xi因子抗体 - Google Patents
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Abstract
凝固第XI因子(FXI)および/またはその活性化形態第XIa因子(FXIa)、またはFXIおよび/またはFXIaのフラグメントに結合するその抗体、ならびにその抗体を含有する組成物が開示される。血栓症および血栓症に関連する合併症または状態などの凝固関連状態を治療および/または予防するための抗体を調製する方法および抗体の使用も開示される。【選択図】なし
Description
本開示は、凝固第XI因子(FXI)および/またはその活性化形態第XIa因子(FXIa)、ならびにFXIおよび/またはFXIaのフラグメントに結合することができる抗体、ならびに血栓症を治療するための、止血を損なうことのない抗凝固剤としての使用を含むそれらの使用に関する。
血栓症は、血管内の血餅を伴い、それによって患部の血流を遮断または妨害する状態である。血餅が循環器系に沿って心臓、脳、および肺などの重要な身体部分に移動する場合、この状態は深刻な合併症に繋がる可能性があり、心臓発作、脳卒中、肺塞栓症などを引き起こす。血栓症は、ほとんどの脳卒中および心筋梗塞、深部静脈血栓症(DVT)、肺塞栓症、ならびに他の心血管事象の主な原因である。1、2血栓症は、低分子量ヘパリン、ワルファリン、および第Xa因子直接阻害剤などの抗凝固剤によって治療または予防され得る。これらの現在利用可能な療法の最も一般的な副作用は、止血の障害である。3〜5したがって、これらの療法は、治療後に患者を注意深く監視する必要があるため、用量および患者のコンプライアンスによって制限される。
最小限の副作用で効果的な血栓症療法または予防が必要である。本開示は、当技術分野の必要性を満たす。
特定の実施形態において本明細書に提供されるのは、凝固第XI因子(FXI)および/またはその活性化形態第XIa因子(FXIa)、ならびにFXIおよび/またはFXIaのフラグメントに結合する抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、組換え抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、Fab、Fv、またはscFvである。いくつかの実施形態では、抗体は、FXIおよび/またはFXIaのA3ドメインに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号11〜16、27〜32、43〜48、59〜64、75〜80、91〜96、107〜112、123〜128、139〜144、155〜160、171〜176、および187〜192のアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含む1つ以上のCDRを含む。
本明細書で提供されるのは、血栓症および/または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療および/または予防するための医薬組成物である。医薬組成物は、本明細書に開示されるような1つ以上の抗FXIおよび/または抗FXIa抗体を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、1つ以上の薬学的に許容されるアジュバント、担体、賦形剤、防腐剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む。
本明細書に提供されるのは、本明細書に開示されるような抗FXIおよび/もしくは抗FXIa抗体、またはいずれかの抗体の機能的フラグメントをコードする核酸、ならびに核酸を含むベクター、ならびにベクターを含む宿主細胞である。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞において核酸によってコードされる抗体またはその機能的フラグメントを産生することができる発現ベクターである。
本明細書で提供されるのは、血栓症および/または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療および/または予防に使用するための、本明細書に開示されるような1つ以上の抗FXIおよび/または抗FXIa抗体を含むキットである。あるいは、キットは、血栓症および/または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療および/または予防に使用するための、本明細書に開示されるような1つ以上の抗FXIおよび/または抗FXIa抗体を含む医薬組成物を含む。特定の実施形態では、キットは、使用説明書をさらに含む。
本明細書で提供されるのは、血栓症および/または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療および/または予防する方法である。本方法は、それを必要とする対象に治療有効量の本明細書に開示されるような1つ以上の抗FXIおよび/または抗FXIa抗体を投与することを含む。あるいは、本方法は、それを必要とする対象に抗FXI抗体、抗FXIa抗体、またはいずれかの抗体の機能的フラグメントを含有する治療有効量の医薬組成物を投与することを含む。
本明細書で提供されるのは、血栓症および/または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療および/または予防するための医薬剤を処方する、本明細書に開示されるような抗FXIおよび/または抗FXIa抗体の使用である。
本明細書に提供されるのは、本明細書に開示されるような抗FXIおよび/または抗FXIa抗体を産生する方法である。本方法は、抗体をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換し、宿主細胞において抗体を発現させるステップを必然的に伴う。本方法は、発現された抗体を宿主細胞から精製することをさらに含み得る。さらに、精製された抗体は、修飾組換え抗体が対応するヒト抗体の活性を保持するように修飾に供され得る。あるいは、本明細書に開示される抗体は、ハイブリドーマを培養することから産生され得る。
本発明の以下の説明は、本発明の様々な実施形態を単に例示することを意図する。したがって、考察された特定の修正は、本発明の範囲の限定として解釈されるべきではない。当業者には、本発明の範囲から逸脱せずに様々な均等物、変更、および修正が実現され得ることが明らかであり、そのような均等な実施形態は本明細書に含まれることが理解される。
内因性経路および外因性経路の両方が、インビボの血液凝固カスケードに関与する。接触活性化経路とも呼ばれる内因性経路は、表面界面との接触によって開始され、FXIIの活性化をもたらす。内因性経路は、FXI、FIX、およびFVIIIも伴う。組織因子(TF)経路とも呼ばれる外因性経路は、血管損傷によって開始され、TF−FVIIaの活性化複合体の形成をもたらす。これらの2つの経路が交わり、共通の経路を活性化し、これは、プロトロンビンからトロンビンへの変換、および最終的には架橋フィブリン凝血の形成に繋がる。理想的な抗凝固剤は、止血を損なうことなく血栓症を予防するのに効果的でなければならない。いくつかの証拠は、内因性凝固経路が凝固の増幅段階にとって重要であるのに対し、外因性および一般的な経路は開始段階および増殖段階により深く関与していることを示唆する。5〜8これらの所見は、内因性経路が正常な止血中にわずかな役割を果たし、内因性経路の阻害が低出血リスクで抗血栓効果を提供し得ることを示す。内因性経路の構成要素であるFXIは、出血に影響を与えることなく抗血栓効果を誘発する可能性を有し得るため、最近注目される標的になってきた。3、5、6
FXIは、FXIaへの内因性経路を介して第XIIa因子によって活性化され、次に第IX因子を活性化する。疫学研究は、ヒトのFXI欠損症は静脈血栓塞栓症および脳卒中のリスクの低下に関連するのに対し、FXIレベルの増加はリスクの増加に関連することを示唆している。9〜11さらに、FXI欠損症のヒトは、非常に低い出血傾向を示す。12、13さらに、FXIを欠損しているマウスは、出血が増加することなく多くのタイプの血栓症から保護される。14さらに、FXIを阻害する小分子阻害剤、抗体、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、血栓症の多くの動物モデルで出血リスクのない抗血栓特性を示している。
本明細書に開示される抗体は、FXIおよび/またはFXIaに結合し、血液凝固の内因性経路を標的とする。FXIの構造および血液凝固へのFXIの関与は、様々な出版物で報告されている。33
動物および臨床研究は、FXIと血栓症との間に強い関連があることを示唆している。FXI欠損マウスは多くの研究チームによって研究されており、FeCl3誘発性の動脈および深部静脈血栓症モデル、肺塞栓症モデル、ならびに脳動脈閉塞モデルを含む、いくつかのモデルで顕著な抗血栓性表現型を示している。14、17、22、23ヒトの疫学研究では、先天性FXI欠損症を有する患者は、静脈血栓塞栓症(VTE)のオリシェミック脳卒中の影響を受けにくく、FXIのレベルがより高い対象者は、より低いレベルの対象者よりもVTEおよび虚血性脳卒中のリスクが高くなる。9〜11生理学的止血に関して、FXIの役割は不可欠であるように思われる。FXI欠損マウスは、尾部出血時間が野生型動物と同等であるため、過度の出血を示さない。23、24さらに、重度のFXI欠損患者は、外科手術中、様々な出血を示す傾向があり得るが、自然出血を示さない。12、132つ以上の抗血栓薬の組み合わせが、臨床的に広く使用される。以前の研究は、アスピリンが野生型マウスおよびFXI欠損マウスで同様の出血傾向を引き起こしたことを示し、これは、他の抗血栓療法が存在する場合でもFXIの標的化はなおも安全であるということが示唆されていた。14
上記のすべての発見は、FXI/FXIaが、止血を損なうことなく血栓症関連疾患を治療するための安全な薬物標的であることを示す。したがって、抗体、オリゴヌクレオチド、および小分子阻害剤など、血栓症を治療するための療法を開発するための標的FXI/FXIaに多くの手法が適用されてきた。5本明細書に記載されるように、FXI/FXIaの抗体タイプの遮断薬が生成された。抗体の利点には、即効特性および投薬頻度の低さが含まれ、抗体の主な弱点は、潜在的な免疫原性である。25インビボ研究を実施する前に、少なくとも2つの試験抗体をヒト化した。2つのヒト化抗体、h−19F6およびh−42A5は、ヒトFXI/FXIaに対して非常に高い親和性を示した。興味深いことに、それらは、異なる領域に結合するが、FXIの同じドメイン(A3)に結合する。理論に拘束されることなく、抗体は、両方ともFXIa活性を阻害する可能性があるが、FXIIaまたはトロンビンのいずれかによって媒介されるFXI活性化に対しては効果を有さない。
様々なタイプのFXI/FXIa阻害剤は、APTTを延長し、異なるモデルで抗血栓効果を示した。抗FXI抗体14E11は、APTTを約1.3倍増加させ、ヒヒの露出した大腿動静脈シャントの血栓症を低減した。17FXI発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、血漿FXIレベルを約50%低減し、ヒヒの血栓形成を減少させた。26、27さらに、経口で生物学的に利用可能な小分子FXIa阻害剤であるONO−5450598は、血栓症のサルモデルにおける血栓形成を著しく阻害した。28さらに、FXI/FXIaを標的とする療法薬の抗血栓効果は、マウスおよびウサギの血栓症モデルなどの多くの非霊長類動物モデルでも確認されている。19、29〜31最近の臨床試験は、FXIを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが膝関節形成術を受けている患者の静脈血栓症を予防することを示した。32実施例に示されているように、2つの特徴的な霊長類血栓症モデルを使用して、h−19F6およびh−42A5の抗血栓症効果を評価した。AVシャント血栓症モデルでは、両方の抗体が、用量依存的な様態で血栓形成を減少させた。FeCl3誘発性血栓症モデルでは、両方の抗体が、血栓症によって引き起こされた血管閉塞の時間を引き延ばした。これらの結果は、FXI/FXIa阻害剤の抗血栓の役割のさらなる証拠を提供する。AVシャント血栓症モデルにおけるh−19F6およびh−42A5の血栓形成の用量依存的な低減は、血栓形成がFXI阻害の程度と負の相関関係にあり得ることを示唆しており、これはAPTT延長によって示され得る。h−42A5はAPTTの延長においてh−19F6よりも強力であるため、FeCl3誘発性血栓症モデルにおけるh−42A5とh−19F6との間の抗血栓効果の比較もそのような兆候につながる可能性がある。したがって、より長いAPTTによって示されるように、FXI/FXIa阻害剤によるFXI/FXIaのより強力な阻害は、より良好な抗血栓の結果をもたらし得る。
出血のリスクは、抗血栓剤の開発において最も懸念される問題である。前に言及したように、FXI欠損患者は、外科的設定の下で出血傾向を示し得る。血漿FXI活性阻害が、出血リスクの観点からなおもどの程度安全であるかは不明である。実施例に示されるように、h−19F6およびh−42A5によるFXI/FXIaの集中的阻害の出血リスクを血栓症実験で使用されたのと同じサルで試験した。AVシャント血栓症動物では、h−19F6またはh−42A5の治療用量が高まるにつれても出血傾向は観察されず、出血リスクは、FXI阻害の程度とは無関係であり得ることを示唆している。FeCl3誘発性血栓症動物では、h−19F6治療もh−42A5治療も過度の出血を引き起こさなかった。h−42A5治療は、血漿APTTの約2倍の上昇をもたらし、これは、99%を超えるFXI阻害を示した。これまでの研究では、そのような集中的なAPTT延長および高FXI阻害条件下での出血リスクを評価したことはない。アンチセンスオリゴヌクレオチドISIS416856は、出血リスクを評価したときにAPTTの30%の上昇のみを引き起こした。26霊長類における他の出血リスク評価研究では、高強力な抗FXI抗体であるaXIMabがAPTTの約1倍の増加を引き起こした(30.5秒〜65.6秒)。26したがって、本明細書に記載の結果は、FXI/FXIaの集中的な阻害が霊長類の出血リスクを増加させないことを示す。したがって、FXIは、血栓症治療の薬物標的として使用され得る。
抗FXIまたは抗FXIa抗体
本明細書で提供されるのは、FXI、FXIa、および/またはFXIもしくはFXIaのフラグメントに結合し、血餅の形成を阻害する抗体である。これらの抗体は、FXI、FXIa、および/またはFXIもしくはFXIaのフラグメント(例えば、A3ドメインを含むフラグメント)に結合し、最大安全用量よりもはるかに低い濃度で阻害効果を示すことができる。例えば、いくつかの実施形態では、0.1mg/kgの静脈注射と3mg/kgの静脈注射との間の抗体の用量は、カニクイザルにおけるFXIからFXIaへの変換に対して阻害効果を示す。さらに、本明細書に開示される抗体は、ヘパリンなどの従来の抗凝固剤に対して出血を引き起こすリスクが最小限であるため、優れた安全性を備える抗凝固剤として使用され得る。
本明細書で提供されるのは、FXI、FXIa、および/またはFXIもしくはFXIaのフラグメントに結合し、血餅の形成を阻害する抗体である。これらの抗体は、FXI、FXIa、および/またはFXIもしくはFXIaのフラグメント(例えば、A3ドメインを含むフラグメント)に結合し、最大安全用量よりもはるかに低い濃度で阻害効果を示すことができる。例えば、いくつかの実施形態では、0.1mg/kgの静脈注射と3mg/kgの静脈注射との間の抗体の用量は、カニクイザルにおけるFXIからFXIaへの変換に対して阻害効果を示す。さらに、本明細書に開示される抗体は、ヘパリンなどの従来の抗凝固剤に対して出血を引き起こすリスクが最小限であるため、優れた安全性を備える抗凝固剤として使用され得る。
実施例に示されているように、抗凝固特性を有する抗体を特定するためにヒトFXIでラットを免疫することによって、多くの抗ヒトFXI抗体を生成した。そのような抗体が12個特定され、そのうちのいくつかをさらなる開発のためにヒト化した。h−19F6およびh−42A5抗体などのヒト化ラット抗ヒトFXI抗体をインビトロおよびインビボで特徴付けた。インビトロ研究では、ヒト化抗体は、第IX因子の活性化FXI(FXIa)媒介性加水分解を阻害したが、第XIIa因子誘発性FXI活性化は阻害しなかった。FXIへの抗体の結合特性を決定し、h−19F6およびh−42A5の解離定数(KD)はそれぞれ22pMおよび35pMであった。これらの2つの抗体は、FXIのA3ドメインの異なる部位に結合する。インビボ研究では、2つの異なる霊長類血栓症モデルを使用して、ヒト化抗体の抗血栓効果および出血リスクを評価した。動静脈(AV)シャント血栓症モデルでは、両方の抗体が、出血を引き起こすことなく、血栓形成を用量依存的に減少させた。FeCl3誘発性血栓症モデルでは、両方の抗体が、血栓症媒介性血管閉塞までの時間を引き延ばし、どちらの抗体も出血を増加させなかった。2つの抗体は、霊長類の止血を損なうことなく抗血栓の有効性を示し、FXIの標的化が血栓症の治療に使用され得ることをさらに確認した。
本明細書において使用される場合、組成物または方法に関する「含む」という用語は、組成物または方法が少なくとも列挙された要素を含むことを意味する。「から本質的になる」という用語は、組成物または方法が列挙された要素を含み、組成物または方法の新規および基本的な特徴に実質的に影響を与えない1つ以上の追加の要素をさらに含み得ることを意味する。例えば、列挙された要素から本質的になる組成物は、それらの列挙された要素に加えて、単離および精製方法からの1つ以上の微量汚染物質、リン酸緩衝生理食塩水等の薬学的に許容される担体、保存剤等を含み得る。「からなる」という用語は、組成物または方法が、列挙された要素のみを含むことを意味する。これらの移行句の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、特定の抗原、例えば、FXI、FXIa、またはFXIもしくはFXIaの特定のドメインもしくはフラグメント、例えば、A3ドメインに特異的に結合するか、またはそれらと免疫学的に反応する免疫グロブリン分子またはその免疫学的に活性な部分を指す。特定の実施形態では、本方法、本組成物、および本キットで使用するための抗体は、全長免疫グロブリン分子であり、これは、2つの重鎖および2つの軽鎖を含み、各重鎖および軽鎖は、3つの相補性決定領域(CDR)を含む。天然抗体に加えて、「抗体」という用語はまた、合成抗体、イントラボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、ペプチドボディ、およびヘテロコンジュゲート抗体(例えば、二重特異性抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗イディオタイプ抗体、ダイアボディ、トライアボディ、およびテトラボディ)などの免疫グロブリンの遺伝子組み換え形態またはそうでない場合は修飾形態を含む。本明細書に開示される抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。抗体が免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分であるこれらの実施形態では、抗体は、例えば、Fab、Fab’、Fv、Fab’F(ab’)2、ジスルフィド連結Fv、一本鎖Fv抗体(scFv)、単一ドメイン抗体(dAb)、またはダイアボディであり得る。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分であるものを含む、本明細書に開示される抗体は、特定の抗原、例えば、FXIもしくはFXIaに結合する能力、またはFXIもしくはFXIaの特定のフラグメント、例えば、A3ドメインに結合する能力を保持する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗FXIおよび/または抗FXIa抗体は、リン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、ニトロシル化、グリコシル化、またはヒトもしくは非ヒト宿主細胞を含む哺乳動物細胞株における発現に関連する脂質化などの翻訳後修飾を受けている。組換え抗体を産生するための、ならびに組換え抗体のインビトロおよびインビボ修飾のための技法は、当技術分野で知られている。例えば、Liu et al.,mAbs 6(5):1145−1154(2014)を参照されたく、その内容は参照によって組み込まれる。
本明細書に開示される抗FXIおよび/または抗FXIa抗体をコードするポリヌクレオチドまたは核酸もまた開示される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、DNA、mRNA、cDNA、プラスミドDNAを含む。本明細書に開示される抗体またはその機能的フラグメントをコードする核酸は、pTT5哺乳動物発現ベクターなどのベクターにクローニングすることができ、これは、核酸が抗体またはその機能的フラグメントを産生するために発現され得るようにプロモーターおよび/または他の転写もしくは翻訳制御要素をさらに含み得る。
本明細書の特定の実施形態では、ヒト化抗FXIおよび/または抗FXIa抗体が提供される。抗体が修飾されて、ヒトにおいて天然に発生する抗体との類似性が高まるように、非ヒト種からの抗体をヒト化するための様々な技法が当技術分野で知られている。天然抗体の各抗原結合ドメインには6つのCDRが存在する。これらのCDRは、抗体が3次元構成をとるときに、抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置された短い非連続のアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる抗原結合ドメインの残りのアミノ酸は、分子間変動が少なく、CDRの正しい配置を可能にする足場を形成する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体またはフラグメントは、CDR3領域の保存された配列を有する。
例えば、本明細書に開示される抗体のヒト化は、マウスまたはラットを免疫化することによって産生されるモノクローナル抗体のCDRグラフトによって達成され得る。マウスモノクローナル抗体のCDRは、ヒトフレームワークにグラフトすることができ、その後、ヒト定常領域に結合して、ヒト化抗体を得る。簡単に説明すると、ヒト生殖系列抗体配列データベース、タンパク質データバンク(PDB)、INN(国際一般名)データベース、および他の好適なデータベースを検索することが可能であり、抗体に最も類似したフレームワークを検索によって特定することができる。さらに、ドナー残基へのいくつかの逆突然変異は、ヒトアクセプターフレームワークで行われる。いくつかの実施形態では、可変領域は、ヒトIgG定常領域に連結している。例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4Fcドメインが使用され得る。既存の技術に基づいて非ヒト種によって産生されたモノクローナル抗体をヒト化することは、当業者の範囲内である。
本明細書で提供される抗体は、FXI、FXIa、および/またはそれらのフラグメント(例えば、A3ドメインを含むフラグメント)に対する結合親和性を保持しながら、アミノ酸配列に1つ以上の突然変異を含む本明細書に開示される配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号9、10、25、26、41、42、57、58、73、74、89、90、105、106、121、122、137、138、153、154、169、170、185、186、および197〜209、からなる群から選択される配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一であるアミノ酸配列、またはFXI、FXIa、および/もしくはそれらのフラグメントに対する結合親和性を保持するそれらのフラグメントを有する可変領域を含む。
また、本開示には、FXI、FXIa、および/またはそれらのフラグメント(例えば、A3ドメインを含むフラグメント)に結合する抗体をコードする核酸のバリアントが含まれる。いくつかの実施形態では、抗体をコードする核酸は、配列番号1、2、17、18、33、34、49、50、65、66、81、82、97、98、113、114、129、130、145、146、161、162、177、および178、からなる群から選択される配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である核酸配列、またはFXI、FXIa、および/もしくはそれらのフラグメントに対して結合親和性を有するポリペプチドをコードするそれらのフラグメントを有する可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に開示されるモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体などの新規抗体が発見からヒト臨床試験へ、次に医薬品市場に進んでいくように、戦略的化学、製造、および品質管理(CMC)開発にさらに供される。修飾は、抗体の免疫学的機能を損なうことなく、抗体の特性をさらに改善する。特定の実施形態では、CMC修飾抗体は、未修飾抗体と比較して、様々な温度(例えば、4℃、25℃、および37℃)下で長期間(例えば、3日、7日、14日、および28日)および反復的な凍結/解凍サイクル下(例えば、−40℃/25℃で最大5サイクル)でより安定する。さらに、CMC修飾抗体は、許容できる溶解度を有する。例えば、軽鎖または重鎖の所与の配列について、特定のアミノ酸は、潜在的な酸化およびグリコシル化部位であり得る。潜在的な酸化、脱アミド化、またはグリコシル化部位のこれらのアミノ酸残基は突然変異する可能性があり、特定の抗体の3D構造および機能を維持するために、近接する追加の残基も突然変異および/または最適化され得る。いくつかの実施形態では、酸化、脱アミド化、またはグリコシル化の可能性を有するCDR領域の1つ以上のアミノ酸残基は、免疫学的機能を損なうことなく抗体またはそのフラグメントの安定性を改善するために突然変異される。いくつかの実施形態では、酸化の可能性を有するCDR領域内の1つ以上のMet残基が突然変異される。いくつかの実施形態では、脱アミド化の可能性を有するCDR領域内の1つ以上のAsn残基が突然変異される。
医薬組成物
本明細書に開示される抗体は、医薬組成物に処方され得る。医薬組成物は、1つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、防腐剤、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。医薬組成物は、様々な製剤、例えば、注射可能な製剤、凍結乾燥製剤、液体製剤などを有し得る。製剤および投与経路に応じて、アジュバント、担体、賦形剤、防腐剤などの好適な添加剤を選択する。34
本明細書に開示される抗体は、医薬組成物に処方され得る。医薬組成物は、1つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、防腐剤、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。医薬組成物は、様々な製剤、例えば、注射可能な製剤、凍結乾燥製剤、液体製剤などを有し得る。製剤および投与経路に応じて、アジュバント、担体、賦形剤、防腐剤などの好適な添加剤を選択する。34
医薬組成物は、本組成物を使用するための説明書と共にキットに含まれ得る。
治療方法
本明細書で提供されるのは、血栓症を患っている対象、および/または血栓症を発症するリスクが高い対象における血栓症を治療および/または予防する方法である。対象における血餅の形成を阻害する方法も提供される。これらの方法は、内因性経路に介入するために、本明細書で提供される治療有効量の抗FXIおよび/またはFXIa抗体を投与することを必然的に伴う。いくつかの実施形態では、これらの方法は、本明細書で提供されるような抗FXIおよび/または抗FXIa抗体を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
本明細書で提供されるのは、血栓症を患っている対象、および/または血栓症を発症するリスクが高い対象における血栓症を治療および/または予防する方法である。対象における血餅の形成を阻害する方法も提供される。これらの方法は、内因性経路に介入するために、本明細書で提供される治療有効量の抗FXIおよび/またはFXIa抗体を投与することを必然的に伴う。いくつかの実施形態では、これらの方法は、本明細書で提供されるような抗FXIおよび/または抗FXIa抗体を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
本明細書に開示される方法は、それを必要とする対象における血栓症に関連する合併症または状態を予防および/または治療するために使用され得る。血栓症は、塞栓性脳卒中、静脈血栓塞栓症(VTE)、深部静脈血栓症(DVT)、および肺塞栓症(PE)などの静脈血栓症、急性冠症候群、冠状動脈疾患(CAD)、および末梢動脈疾患(PAD)などの動脈血栓症(ACS)などのいくつかの合併症または状態を引き起こすか、またはそれらに関連する。血栓症に関連する他の状態には、例えば、外科患者、身体の不自由な患者、癌患者、心不全患者、妊娠中の患者、または血栓症を引き起こし得る他の病状を有する患者におけるVTEの高リスクが含まれる。本明細書に開示される方法は、予防的抗凝固療法、すなわち血栓予防に関する。これらの方法は、本明細書に開示されるような治療有効量の抗FXIおよび/もしくはFXIa抗体、または抗FXIおよび/もしくはFXIa抗体を含む治療有効量の医薬組成物を、上に開示される血栓症関連合併症を患う対象に投与することを必然的に伴う。抗体または医薬組成物は、単独で、または血栓症関連合併症もしくは状態を治療または予防するための任意の他の療法と組み合わせて投与され得る。
治療および/または予防を必要とする対象における敗血症を治療および/または予防する方法も提供される。死亡率または罹患率を改善するために、敗血症患者に抗凝固剤を投与することが試みられた。しかし、抗凝固剤によって引き起こされた望ましくない出血のため、試みは失敗した。本明細書に開示される抗体は、抗生物質などの敗血症を治療するための他の療法剤と組み合わせた二次療法として使用され得る。
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物対象、好ましくはヒトを指す。「それを必要とする対象」は、血栓症または血栓症に関連する合併症もしくは状態と診断された対象か、あるいは血栓症または血栓症に関連する合併症もしくは状態を発症するリスクが高い対象を指す。「対象」および「患者」という語句は、本明細書では互換的に使用され得る。
「治療する(treat)」、「治療する(treating)」、および「治療(treatment)」という用語は、状態に関して本明細書において使用される場合、状態を部分的または完全に緩和する、状態を防止する、状態の発生もしくは再発の可能性を低下させる、状態の進行もしくは発達を遅延させる、または病状に関連する1つ以上の症状の発達を排除、軽減もしくは遅延させることを指す。血栓症および/または血栓症に関連する合併症もしくは状態に関して、「治療する」は、既存の血餅が大きくなるのを防止もしくは遅らせること、および/または血餅の形成を防止もしくは遅らせることを指す場合がある。いくつかの実施形態では、「治療する(treat)」、「治療する(treating)」、または「治療(treatment)」という用語は、抗体またはその機能的フラグメントを投与されない対象と比較して、対象の血餅の数またはサイズが低減していることを意味する。いくつかの実施形態では、「治療する(treat)」、「治療する(treating)」、または「治療(treatment)」という用語は、血栓症および/または血栓症関連の状態もしくは合併症の1つ以上の症状が、本明細書に開示されるような抗体または医薬組成物を受ける対象において、そのような治療を受けていない対象と比較して軽減されることを意味する。
本明細書において使用される場合、抗体または医薬組成物の「治療有効量」は、血栓症の治療および/または予防など、対象において所望の治療効果を生み出す抗体または医薬組成物の量である。特定の実施形態では、治療有効量は、最大の治療効果をもたらす抗体または医薬組成物の量である。他の実施形態では、治療有効量は、最大治療効果よりも少ない治療効果をもたらす。例えば、治療有効量は、最大の治療効果をもたらす投薬量に関連する1つ以上の副作用を回避しながら治療効果を生み出す量であってもよい。特定の組成物の治療有効量は、治療組成物の特徴(例えば、活性、薬物動態、薬力学、および生物学的利用能)、対象の生理学的状態(例えば、年齢、体重、性別、疾患のタイプおよび病期、病歴、一般的な体調、所定の投薬量に対する反応性、ならびにその他の現在の投薬)、組成物中の任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、および保存剤の性質、ならびに投与経路を含むがそれらに限定されない、様々な因子に基づいて変動する。臨床および薬理学分野の当業者は、日常的な実験によって、すなわち、抗体または医薬組成物の投与に対する対象の応答を監視し、それに応じて投薬量を調整することによって、治療有効量を決定することができる。追加のガイダンスについては、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22nd Edition,Pharmaceutical Press,London,2012、およびGoodman &Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,12th Edition,McGraw−Hill,New York,NY,2011を参照されたく、その開示全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体の治療有効量は、約0.01mg/kg〜約30mg/kg、約0.1mg/kg〜約10mg/kg、約1mg/kg〜約5mg/kgの範囲である。
皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、髄腔内投与、または腹腔内投与などの好適な投与経路を選択することは、当業者の範囲内である。治療を必要とする対象を治療するために、抗体または医薬組成物は、即時放出、制御放出、または持続放出のために、連続的または断続的に投与され得る。さらに、抗体または医薬組成物は、1日3回、1日2回、または1日1回で、3日間、5日間、7日間、10日間、2週間、3週間、または4週間の期間投与され得る。抗体または医薬組成物は、所定の期間にわたって投与され得る。あるいは、抗体または医薬組成物は、特定の治療ベンチマークが達成されるまで投与され得る。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、抗体または医薬組成物の投与を継続するかどうかを決定するために、1つ以上の治療ベンチマークを評価するステップを含む。
抗体の産生方法
本明細書に開示される抗FXIおよび/または抗FXIa抗体を産生する方法も本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらの方法は、抗FXIおよび/または抗FXIa抗体をコードする核酸をベクターにクローニングし、ベクターで宿主細胞を形質転換し、抗体を発現するように宿主細胞を培養するステップを必然的に伴う。発現された抗体は、任意の既知の技法を使用して宿主細胞から精製され得る。pTT5ベクター、およびpcDNA3ベクターなどの様々な発現ベクター、ならびにCHO細胞(例えば、CHO−K1およびExpiCHO)およびHEK193T細胞などの様々な宿主細胞株が使用され得る。
本明細書に開示される抗FXIおよび/または抗FXIa抗体を産生する方法も本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらの方法は、抗FXIおよび/または抗FXIa抗体をコードする核酸をベクターにクローニングし、ベクターで宿主細胞を形質転換し、抗体を発現するように宿主細胞を培養するステップを必然的に伴う。発現された抗体は、任意の既知の技法を使用して宿主細胞から精製され得る。pTT5ベクター、およびpcDNA3ベクターなどの様々な発現ベクター、ならびにCHO細胞(例えば、CHO−K1およびExpiCHO)およびHEK193T細胞などの様々な宿主細胞株が使用され得る。
上に開示された方法によって産生された抗体もまた、本開示に含有される。抗体は、1つ以上の翻訳後修飾に供されている可能性がある。
以下の実施例は、実施形態をより良く例示するために提供されるものであり、いかなる特許請求される実施形態の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。特定の材料が言及される場合、それは単に例示を目的としており、本発明を限定することを意図しない。当業者は、発明の法的能力を行使することなく、また本発明の範囲から逸脱することなく、均等の手段または反応物質を開発することができる。本発明の境界内であることを維持しながら、本明細書に記載の手順に多くの変更を行うことができることが理解される。本発明者らは、そのような変更が本発明の範囲内に含まれることを意図する。
実施例1:材料および方法
材料。ヒトFXI(カタログ番号HFXI1111)、FXIa(カタログ番号HFXIa1111a)、FXIIa(HFXIIa1212a)、およびFIX(カタログ番号HFIX1009)をEnzyme Research Laboratory(IN,USA)から購入した。
材料。ヒトFXI(カタログ番号HFXI1111)、FXIa(カタログ番号HFXIa1111a)、FXIIa(HFXIIa1212a)、およびFIX(カタログ番号HFIX1009)をEnzyme Research Laboratory(IN,USA)から購入した。
抗体の調製。動物の免疫化およびハイブリドーマのスクリーニングをGenscript Inc_(中国、南京)で実施し、このプロトコルで動物に適用した手順は、Genscript Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。承認されたガイドラインに従って、実験を実施した。WistarラットをヒトFXIで免疫化し、免疫応答が良好な動物の脾細胞をハイブリドーマの調製のために収集し、これを限界希釈によるサブクローニングに供した。最後に、19F6、h−34F8、および42A5を含む、所望の抗FXI抗体を発現するいくつかのモノクローナルハイブリドーマクローンが、ELISAおよび機能的スクリーニングを使用することによって得られた。それらの可変領域のアミノ酸配列を決定した後、19F6、h−34F8、および42A5をヒト化に供し、IgG4形態の3つのヒト化抗体、h−19F6、h−34F8、およびh−42A5をもたらした。これらの3つのヒト化抗体を一過性の哺乳動物発現システムで産生し、タンパク質Gクロマトグラフィーによって精製した。
活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)およびプロトロンビン時間(PT)。Symens Inc.から購入した標準的なヒト血漿を、0〜400nMの様々な濃度の等量の様々な抗体と5分間混合した後、CA600分析装置で試験した。APTTアッセイでは、50μLの血漿−抗体混合物と25μLのAPTT試薬(SMN10445709、Symens Inc.)とを37℃で4分間混合した。次に、25μLのCaCl2溶液(25mM、SMN10446232、Symens Inc.)を添加し、凝血形成までの時間を決定した。PTアッセイでは、50μLの血漿−抗体混合物を等量のPT試薬(SMN10446442、Symens Inc.)と37℃で混合し、凝血形成までの時間を決定した。
サル血漿中のAPTTおよびPTに対する抗体の効果も、ヒト血漿に適用されたのと同じ方法を使用して評価した。これらのアッセイでは、上記のヒト血漿−抗体混合物の代わりに、等量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈したサル血漿を使用した。
FXIIaによるFXI活性化。ヒトFXI(500nM)を、PBS中の1μMの対照IgG4またはh−19F6またはh−34F8またはh−42A5と共に室温で5分間事前インキュベートした。時間ゼロで、FXIIa、HK、およびカオリンを添加して、最終濃度がFXI(250nM)、FXIIa(50nM)、HK(100nM)、およびカオリン(0.5mg/mL)になるようにした。0、30、60、120分間隔で、50μLのサンプルを硫酸ドデシルサンプルバッファーに収集した。サンプルを10%非還元ゲルでサイズ分画し、ポリフッ化ビニリデン膜に転写した。ウエスタンブロッティングを実施して、マウス抗ヒトFXI IgG(1C5、FXIのC末端に結合する自社製抗体)を使用し、FXI、ならびにFXIa−軽鎖レベルを決定した。画像の結果は、Image Lab Software(Bio−Rad)を備えるChemiDocMP Imaging Systemを使用して取得した。
FXIa媒介性FIX活性化。ヒトFIX(200nM)を、1μMの対照lgG4、h−19F6、h−34F8、またはh−42A5の存在下で、室温で5mMのCaCl2を含有するPBS中のFXIa(5nM)と共にインキュベートした。0、15、30、45、および60分間隔で、50μLのサンプルを硫酸ドデシルサンプルバッファーに収集した。サンプルを10%非還元ゲルでサイズ分画し、ポリフッ化ビニリデン膜に転写した。ウエスタンブロッティングを実施して、ヤギ抗ヒトFIX IgG(Affinity Biologicals)を使用し、FIX、ならびにFIXaレベルを決定した。画像の結果は、Image Lab Software(Bio−Rad)を備えるChemiDocMP Imaging Systemを使用して取得した。
表面プラズモン共鳴(SPR)。抗体とFXIとの相互作用をBiacore T200システム(Biacore、GE Healthcare)でのSPRアッセイによって決定した。簡単に説明すると、ヒトIgG捕捉抗体(Biacore、GE Healthcare)をCM5センサーチップ(GE Healthcare)に事前に固定化し、チップに流すことによって試験抗体を捕捉した。捕捉された試験抗体の最終量を、捕捉時間を調整することによって等量の15応答単位(RU)に調整した。次に、抗原FXIを、会合のために180秒間、次に解離のために1200秒間チップに流した。FXIを0.063、0.313、0.625、1.25、3.125、および6.25nMの濃度で試験した。データを収集し、Biacore Evaluation Softwareを使用して試験抗体とFXIとの間の親和性を分析した。
FXI上の試験抗体の結合部位を決定するために、C末端に6×Hisでタグ付けされたFXIの4つの突然変異体を、各アップルドメイン(A1、A2、A3、およびA4)をヒトプレカリクレインの対応するドメインで置き換えることによって最初に生成した。等量の各突然変異体をCM5センサーチップに固定化し、試験抗体(33.3nM)を会合のために180秒間、次に解離のために1200秒間チップに流した。捕捉された各抗体の量を、Biacore Evaluation Softwareを使用して応答ユニット(RU)で記録した。
試験抗体のエピトープ結合結果も、BiacoreT200システムを使用して分析した。簡単に説明すると、6×Hisタグ付きの野生型FXIをCM5センサーチップ(GE Healthcare)に事前に固定化し、h−19F6、h−34F8、またはh−42A5(5μg/ml)をセンサー表面のフローセルに30μl/分の流速で連続して注入して、応答の変化を監視した。
カニクイザルにおける薬力学。この動物実験およびそれに続くAV血栓症実験をWincon Inc.(中国、南寧市)で実施し、このプロトコルで動物に適用した手順は、Wincon Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。承認されたガイドラインに従って、実験を実施した。動物は、異なる用量のh−19F6、h−34F8、またはh−42A5の静脈内ボーラス注射を受けた。上肢の表在静脈からの2mLの血液を、投薬前(時間0)、ならびに投薬後0.5時間、1時間、3時間、6時間、12時間、および24時間に3.2%クエン酸ナトリウムを含有する収集チューブに収集した。次に、チューブを室温で10回穏やかに反転させて混合した。血漿を標識チューブに収集し、凝血時間分析まで−20℃で保存した。血漿サンプルを等量のリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)で希釈し、次に自動分析装置(CA660、Sysmex Inc.)でAPTTおよびPT分析に供した。
AVシャント血栓症および出血時間試験。カニクイザルに、試験後30分の抗体治療を静脈内ボーラス投与した。次に、尾静脈出血時間試験を実施し、続いて血栓症を誘発した。血栓症は、大腿動脈カニューレと大腿静脈カニューレとの間に事前に計量した長さ10cmの糸を含むシャントデバイスを接続することによって誘発した。血液をシャントに10分間流した。糸に形成された血栓の重さを計量した。シャントを取り除いた直後に血液サンプルを収集し、次により高レベルの試験抗体を投与した。この出血/血栓症プロセスを4回実行して、同じ動物にビヒクルおよび3つの漸増レベル(0.1、0.3、1mg/kg)の試験抗体を投薬した。
出血時間の評価のために、2mLの注射器を動物の尾静脈に挿入した。注射器内の血液量の増加が止まったとき、経過時間を出血時間として手動で記録した。
塩化第二鉄(FeCl3)誘発性血栓症および出血時間の試験。この動物実験をPharmaLegacy Laboratories Inc.(上海、中国)で実施し、このプロトコルで動物に適用した手順は、PharmaLegacy Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。承認されたガイドラインに従って、実験を実施した。カニクイザルに1.5mg/kgのゾレチルで事前に麻酔し、挿管し、人工呼吸器で人工呼吸を行った。麻酔をイソフルランで維持した。手順全体を通して、血圧、心拍数、および体温を監視した。ビヒクル、または0.3mg/kgのh−19F6、h−34F8、もしくはh−42A5を、FeCl3適用の2時間前に四肢静脈から投与した。左大腿動脈を露出させ、鈍的切開によって隔離した。ドップラーフロープローブを動脈に設置し、血流を継続的に記録した。FeCl3を適用する前に、血流を少なくとも5分間測定した。次に、40%のFeCl3をあらかじめ浸した2枚の濾紙を、プローブの上流の血管の外膜表面に10分間適用した。濾紙を取り除いた後、適用部位を生理食塩水で洗浄した。血流が0に減少するまで継続的に測定した。80%閉塞までの時間(血流がベースライン血流の20%まで低減)および100%閉塞までの時間(血流が0まで低減)を記録した。同じ動物において、サージカットデバイスを使用して止血を評価し、出血時間を投薬前および投薬後1時間において手動で記録した。研究の終わり(投薬後約3時間)に、血液サンプルを収集した。
血漿中のヒトFXIに対する試験抗体の結合特異性。試験抗体(h−19F6、h−42A5、および14E11)を、EZ−Link(商標)Sulfo−NHS−LC−ビオチン化キット(カタログ番号21435、Thermo Fisher Inc.)を使用して最初にビオチン化した。これらの抗体(各25μg)を200μLのヒト標準血漿(Siemens Inc.)またはFXI欠損血漿(Hyphen Biomed Inc.)と共に1時間インキュベートした。次に、50μLのストレプトアビジンでコーティングされたビーズ(Dynabeads(商標)M−280ストレプトアビジン、Thermo Fisher Inc.)を混合物に添加して、ビオチン含有抗原−抗体複合体を抽出した。PBSで3回洗浄した後、次に抗原−抗体複合体を溶出し、マウス抗ヒトFXI IgG(1C5、FXIのC末端に結合する自社製抗体)を一次抗体としてウエスタンブロッティングに供した。画像の結果は、Image Lab Software(Bio−Rad)を備えたChemiDocMP Imaging Systemを使用して取得した。ウエスタンブロッティングでは、10μLのヒト標準血漿およびFXI欠損血漿がそれぞれ、FXI陽性およびFXI陰性対照として機能した。
統計分析複数の実験からの数値データは、平均±平均の標準誤差(SEM)として表される。AVシャント実験および両方の出血時間試験における血栓重量の統計分析のために、一元配置分散分析およびそれに続くダネットの多重比較試験を使用した。FeCl3誘発性血栓症実験における閉塞時間の統計分析のために、クラスカル・ワリス順位試験を実施した。P<0.05の値を統計的に有意であると見なした。
実施例2:抗FXI抗体の生成および配列決定
BALB/cマウスおよびWistarラットをヒトFXIで免疫化し、免疫応答が良好な動物の脾細胞をハイブリドーマの調製のために収集し、これを限界希釈によるサブクローニングに供した。捕捉ELISAおよび機能的スクリーニングを使用することによって、所望の抗FXI抗体3G12、5B2、7C9、7F1、13F4、19F6、21F12、34F8、38E4、42A5、42F4、および45H1を発現する12のモノクローナルハイブリドーマクローンを得た。
BALB/cマウスおよびWistarラットをヒトFXIで免疫化し、免疫応答が良好な動物の脾細胞をハイブリドーマの調製のために収集し、これを限界希釈によるサブクローニングに供した。捕捉ELISAおよび機能的スクリーニングを使用することによって、所望の抗FXI抗体3G12、5B2、7C9、7F1、13F4、19F6、21F12、34F8、38E4、42A5、42F4、および45H1を発現する12のモノクローナルハイブリドーマクローンを得た。
これらの抗体のアミノ酸、ならびに軽鎖(VL)の可変領域および重鎖(VH)の可変領域のヌクレオチド配列を決定するために、VLおよびVHをコードするcDNAを標準的なRT−PCR手順によって、対応するハイブリドーマ細胞からクローニングした。CDRの配列を含む代表的な抗体のVLおよびVH配列を表1に示す。
実施例3:活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)アッセイおよびプロトロンビン時間(PT)アッセイを使用したヒト血漿中の抗凝固活性の決定。
APTTアッセイは、凝固の内因性および一般的な経路の活性を測定し、PTアッセイは、凝固の外因性および一般的な経路の活性を測定する。これらの実験で試験された抗体は、19F6、34F8、42A5、1A6、および14E11であった。この実験では、抗体1A6および14E11を陽性対照として使用した。対照抗体の可変領域の配列を米国特許第8,388,959号および米国特許出願公開第2013/0171144号から得て、IgG4に再フォーマットした。次に、これらの抗体をExpiCHO細胞システムを使用して発現させた。APTTアッセイおよびPTアッセイを上記のように実施した。
APTTアッセイは、凝固の内因性および一般的な経路の活性を測定し、PTアッセイは、凝固の外因性および一般的な経路の活性を測定する。これらの実験で試験された抗体は、19F6、34F8、42A5、1A6、および14E11であった。この実験では、抗体1A6および14E11を陽性対照として使用した。対照抗体の可変領域の配列を米国特許第8,388,959号および米国特許出願公開第2013/0171144号から得て、IgG4に再フォーマットした。次に、これらの抗体をExpiCHO細胞システムを使用して発現させた。APTTアッセイおよびPTアッセイを上記のように実施した。
図1に示すように、試験したすべての抗体は、比較的低濃度、例えば、最大100nM(または、14E11の場合は最大200nM)で濃度依存的な様態でAPTTを増加させたが、これらの抗体はいずれも、PTに対して有意な効果を有さなかった(データの提示無し)。これらの結果は、試験した抗体のすべてが凝固の内因性経路を阻害したが、外因性経路は阻害しなかったことを示す。
実施例4:活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)アッセイを使用した非ヒト種の血漿中の抗凝固活性の決定
凝固に対する19F6、34F8、および42A5を含む様々な抗体の効果を、実施例3に記載されたのと同じ方法を使用して、マウス、ラット、およびサルの血漿で評価した。試験した抗体はいずれもマウスおよびラット血漿のAPTTに対して一切の効果を有さなかったが、それらのすべては、図2に示すように、比較的低濃度で濃度依存的にサル血漿中のAPTTを増加させ、これは、試験した抗体がサルFXI/FXIaとの交差活性を有したが、マウスまたはラットFXI/FXIaとの交差活性を有さなかったことを示した。
凝固に対する19F6、34F8、および42A5を含む様々な抗体の効果を、実施例3に記載されたのと同じ方法を使用して、マウス、ラット、およびサルの血漿で評価した。試験した抗体はいずれもマウスおよびラット血漿のAPTTに対して一切の効果を有さなかったが、それらのすべては、図2に示すように、比較的低濃度で濃度依存的にサル血漿中のAPTTを増加させ、これは、試験した抗体がサルFXI/FXIaとの交差活性を有したが、マウスまたはラットFXI/FXIaとの交差活性を有さなかったことを示した。
実施例5:抗FXI抗体のヒト化
療法薬としてのマウスモノクローナル抗体の直接使用は、短い半減期およびヒト抗マウス抗体応答の誘因によって妨げられてきた。この問題の1つの解決策は、マウス抗体をヒト化することである。一部の抗体をCDRグラフト化によるヒト化に供した。各マウス抗体のVLおよびVHの両方のための好適なヒトアクセプターフレームワークを特定し、様々な数の逆突然変異を、得られた抗体の構造および/または機能を維持するように選択されたヒトフレームワークに導入した。これらのヒト化抗体の親和性および機能が対応する非修飾抗体よりも実質的に劣っていない場合、修飾抗体は正常にヒト化されたと見なした。それぞれh−19F6、h−34F8、およびh−42A5として記載される19F6、34F8、および42A5の3つのヒト化VHおよびVL配列を表2に示す。
療法薬としてのマウスモノクローナル抗体の直接使用は、短い半減期およびヒト抗マウス抗体応答の誘因によって妨げられてきた。この問題の1つの解決策は、マウス抗体をヒト化することである。一部の抗体をCDRグラフト化によるヒト化に供した。各マウス抗体のVLおよびVHの両方のための好適なヒトアクセプターフレームワークを特定し、様々な数の逆突然変異を、得られた抗体の構造および/または機能を維持するように選択されたヒトフレームワークに導入した。これらのヒト化抗体の親和性および機能が対応する非修飾抗体よりも実質的に劣っていない場合、修飾抗体は正常にヒト化されたと見なした。それぞれh−19F6、h−34F8、およびh−42A5として記載される19F6、34F8、および42A5の3つのヒト化VHおよびVL配列を表2に示す。
実施例6:ヒトFXIに対する抗FXI抗体の親和性の決定。
FXI/FXIaに対する抗FXI/FXIa抗体の親和性を、BIAcore T200機器で実施した表面プラズモン共鳴(SPR)技術を使用して決定した。ヒト化抗体を、本明細書に開示される抗体の可変領域をヒトIgG4Fcドメインに連結することによって構築し、組換え体をCHO細胞で発現した。これらの抗体を、抗ヒトIgG抗体で事前に固定化したBiacore CM5センサーチップに捕捉した。
FXI/FXIaに対する抗FXI/FXIa抗体の親和性を、BIAcore T200機器で実施した表面プラズモン共鳴(SPR)技術を使用して決定した。ヒト化抗体を、本明細書に開示される抗体の可変領域をヒトIgG4Fcドメインに連結することによって構築し、組換え体をCHO細胞で発現した。これらの抗体を、抗ヒトIgG抗体で事前に固定化したBiacore CM5センサーチップに捕捉した。
次に、異なる濃度の精製抗原FXIまたはFXIa(0.005〜1μg/mL)を、抗FXI/FXIa抗体との会合のために180秒間、その後解離のために1800秒間CM5チップに流した。結合データを収集し、GE Healthcareによって提供されるBiacore Evaluation Softwareを使用して、FXI/FXIaと試験抗体との間の親和性を分析した。固定化されたh−19F6、h−34F8、およびh−42A5に結合するFXI/FXIaのSPRセンサーグラムを図3に示す。図3に示すように、各抗体の応答(RU)は、FXIまたはFXIaの濃度が高くなるにつれて高くなった。FXIおよびFXIaに対するh−19F6、h−34F8、およびh−42A5の解離定数(KD)を計算し、表4に詳細を示した。FXIとFXIaに対する各抗体の親和性は、それらの差が10倍未満であるため、同じであると見なされる。
実施例7:FXI上の抗FXI抗体の結合部位の決定
FXI上の19F6および42A5の結合部位を、SPR技術を使用して決定した。簡単に説明すると、ヒトIgG捕捉抗体をBiacore CM5センサーチップに事前に固定化し、チップに流すことによって組換えh−19F6またはh−42A5を捕捉した。抗体の流動時間を調整することによって、等量(15相対単位)のh−19F6およびh−42A5を捕捉した。次に、個々のアップルドメインがヒトプレカリクレイン(FXI/PKキメラ)からの対応するドメインで置き換えられた野生型FXIまたはキメラFXIを、h−19F6またはh−42A5と会合のために180秒間、その後解離のために1800秒間チップに流した。1つの濃度の野生型またはキメラのFXIのみをSPRアッセイで試験したため、結合データを高性能速度論モードで分析した。結果は、FXIのA3ドメインが対応するPKドメインで置き換えられた場合を除いて、h−19F6およびh−42A5の両方がFXI、ならびにFXI/PKキメラに結合することを示し、これは、FXI上のh−19F6およびh−42A5の部分的または完全なエピトープがA3ドメインにあることを示した。
FXI上の19F6および42A5の結合部位を、SPR技術を使用して決定した。簡単に説明すると、ヒトIgG捕捉抗体をBiacore CM5センサーチップに事前に固定化し、チップに流すことによって組換えh−19F6またはh−42A5を捕捉した。抗体の流動時間を調整することによって、等量(15相対単位)のh−19F6およびh−42A5を捕捉した。次に、個々のアップルドメインがヒトプレカリクレイン(FXI/PKキメラ)からの対応するドメインで置き換えられた野生型FXIまたはキメラFXIを、h−19F6またはh−42A5と会合のために180秒間、その後解離のために1800秒間チップに流した。1つの濃度の野生型またはキメラのFXIのみをSPRアッセイで試験したため、結合データを高性能速度論モードで分析した。結果は、FXIのA3ドメインが対応するPKドメインで置き換えられた場合を除いて、h−19F6およびh−42A5の両方がFXI、ならびにFXI/PKキメラに結合することを示し、これは、FXI上のh−19F6およびh−42A5の部分的または完全なエピトープがA3ドメインにあることを示した。
実施例8:抗体によるFXIaの機能的中和
ヒトFXIa活性を、特定の発色基質であるS−2366(Diapharma Inc.)の切断を測定することによって決定した。抗体の阻害活性を試験するために、抗体h−19F6、h−34F8、およびh−42A5を、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)中の5nMのFXIaの最終濃度において室温で5分間事前インキュベートした。次に、等量の1mMのS−2366を添加して、FXIa切断反応を開始し、M5eプレートリーダー(Molecular Devices Inc.)を使用して405nmでの吸光度の変化を継続的に監視した。GraphPad Prismソフトウェアを使用してデータを分析し、図4に示す。h−19F6、h−34F8、およびh−42A5の計算された見かけのKiは、それぞれ0.67、2.08、および1.43nMである。したがって、試験した3つの抗体はすべて、比較的低濃度でFXIaに対して満足のいく阻害効果を示した。
ヒトFXIa活性を、特定の発色基質であるS−2366(Diapharma Inc.)の切断を測定することによって決定した。抗体の阻害活性を試験するために、抗体h−19F6、h−34F8、およびh−42A5を、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)中の5nMのFXIaの最終濃度において室温で5分間事前インキュベートした。次に、等量の1mMのS−2366を添加して、FXIa切断反応を開始し、M5eプレートリーダー(Molecular Devices Inc.)を使用して405nmでの吸光度の変化を継続的に監視した。GraphPad Prismソフトウェアを使用してデータを分析し、図4に示す。h−19F6、h−34F8、およびh−42A5の計算された見かけのKiは、それぞれ0.67、2.08、および1.43nMである。したがって、試験した3つの抗体はすべて、比較的低濃度でFXIaに対して満足のいく阻害効果を示した。
実施例9:抗体によるFXIa媒介性FIX活性化の阻害
FXIa媒介性FIX活性化を上記のように実施した。抗FXI抗体は、FXI活性化を阻害することによって、および/またはFXIa活性を阻害することによって、内因性経路を調節し得る。最初に、FXIIa媒介性FXIの活性化に対する2つの抗体h−19F6およびh−42A5の効果を試験すると、h−19F6もh−42A5もFXIIaによって媒介されたFXIからFXIaへの変換を妨げないことがわかった(図5Cおよび5D)。次に、FXIa活性に対するこれらの2つの抗体の効果を、FIXを基質として使用して試験した。図5Aおよび5Bに示すように、h−19F6およびh−42A5の両方が濃度依存的な様態でFIX活性化を低減した。FXIa活性に対するこれらの2つの抗体の阻害効果は、FXIaの発色基質であるS−2366を使用してさらに確認された。両方の抗体は、S−2366の加水分解を濃度依存的に阻害した(図4)。
FXIa媒介性FIX活性化を上記のように実施した。抗FXI抗体は、FXI活性化を阻害することによって、および/またはFXIa活性を阻害することによって、内因性経路を調節し得る。最初に、FXIIa媒介性FXIの活性化に対する2つの抗体h−19F6およびh−42A5の効果を試験すると、h−19F6もh−42A5もFXIIaによって媒介されたFXIからFXIaへの変換を妨げないことがわかった(図5Cおよび5D)。次に、FXIa活性に対するこれらの2つの抗体の効果を、FIXを基質として使用して試験した。図5Aおよび5Bに示すように、h−19F6およびh−42A5の両方が濃度依存的な様態でFIX活性化を低減した。FXIa活性に対するこれらの2つの抗体の阻害効果は、FXIaの発色基質であるS−2366を使用してさらに確認された。両方の抗体は、S−2366の加水分解を濃度依存的に阻害した(図4)。
実施例10:カニクイザルにおける凝血時間に対する抗FXI抗体の効果の評価
インビボ実験に適切な動物種を見つけるために、マウス、ラット、およびサルのFXIに対する抗体の交差反応性をAPTTアッセイによって試験した。抗体はサル血漿ではAPTTを延長したが、マウスまたはラット血漿では延長しなかった(データの提示無し)。したがって、インビボでの血栓症に関する有効性研究の前に、凝血時間に対する3つの抗体の薬力学的効果を評価するために、サルモデルを選択した。カニクイザルに、指示された用量の様々な抗体を静脈内投与した。上肢の表在静脈からの血液を投薬前、ならびに投薬後0.5、1、3、6、12、および24時間に収集し、クエン酸血漿をAPTTおよびPT決定のために調製した。APTT試験では、50μLの希釈血漿サンプルと25μLのAPTT試薬(SMN10445709、Symens Inc.)とを混合し、37℃で4分間インキュベートした。次に、25μLのCaCl2溶液(25mM、SMN10446232、Symens Inc.)を添加し、凝血形成までの時間を決定した。PT試験では、50μLの希釈血漿サンプルを等量のPT試薬(SMN10446442、Symens Inc.)と混合し、37℃でインキュベートし、凝血形成までの時間を決定した。試験した3つの抗体はすべて、図6に示すようにAPTTを用量依存的に増加させ、図7に示すようにPTに影響を与えなかったことを示した。
インビボ実験に適切な動物種を見つけるために、マウス、ラット、およびサルのFXIに対する抗体の交差反応性をAPTTアッセイによって試験した。抗体はサル血漿ではAPTTを延長したが、マウスまたはラット血漿では延長しなかった(データの提示無し)。したがって、インビボでの血栓症に関する有効性研究の前に、凝血時間に対する3つの抗体の薬力学的効果を評価するために、サルモデルを選択した。カニクイザルに、指示された用量の様々な抗体を静脈内投与した。上肢の表在静脈からの血液を投薬前、ならびに投薬後0.5、1、3、6、12、および24時間に収集し、クエン酸血漿をAPTTおよびPT決定のために調製した。APTT試験では、50μLの希釈血漿サンプルと25μLのAPTT試薬(SMN10445709、Symens Inc.)とを混合し、37℃で4分間インキュベートした。次に、25μLのCaCl2溶液(25mM、SMN10446232、Symens Inc.)を添加し、凝血形成までの時間を決定した。PT試験では、50μLの希釈血漿サンプルを等量のPT試薬(SMN10446442、Symens Inc.)と混合し、37℃でインキュベートし、凝血形成までの時間を決定した。試験した3つの抗体はすべて、図6に示すようにAPTTを用量依存的に増加させ、図7に示すようにPTに影響を与えなかったことを示した。
h−19F6およびh−42A5の両方が、APTTを用量依存的に延長した(図6Bおよび6C)。特に、h−42A5は同じ用量レベル(0.3および1mg/kg)でAPTTをh−19F6よりも強力に増加させ、ヒトAPTTに対する抗体のインビトロ効果と一致した(図16A)。さらに、どちらの抗体も、インビボでPTに影響を与えなかった(図7Bおよび7C)。
実施例11:カニクイザルの動静脈(AV)シャント血栓症および尾静脈出血モデルにおける抗FXI抗体の効果の評価
試験した各抗体の複数回投薬について、同じ動物で血栓症および出血時間の両方を評価した。この実験に含まれる抗体は、h−34F8、h−19F6、およびh42A5であった。簡単に説明すると、出血時間および血栓症を投薬前および抗体の各投薬後30分で連続的に評価した。出血/血栓症の評価を4回実施した:3つの漸増用量レベル(0.1、0.3、および1mg/kg)での投薬前および投薬後。
試験した各抗体の複数回投薬について、同じ動物で血栓症および出血時間の両方を評価した。この実験に含まれる抗体は、h−34F8、h−19F6、およびh42A5であった。簡単に説明すると、出血時間および血栓症を投薬前および抗体の各投薬後30分で連続的に評価した。出血/血栓症の評価を4回実施した:3つの漸増用量レベル(0.1、0.3、および1mg/kg)での投薬前および投薬後。
AVシャント血栓症の場合、大腿動脈および大腿静脈のカニューレの接続に、あらかじめ計量した長さ10cmの絹糸を含むシャントデバイスを適用し、血液をシャントに10分間流した。次に糸をシャントから取り外し、再度計量した。糸の凝血重量を血流前後の糸重量の差として計算した。
出血時間の評価のために、2mLの注射器を動物の尾静脈に挿入した。注射器内の血液量の増加が止まったとき、経過時間を出血時間として手動で記録した。
図8に示すように、すべての抗体は血栓重量を用量依存的に低減し、それらのいずれも、図9に示すように尾静脈出血時間を延長しなかった。血栓症および止血に対するh−19F6およびh−42A5の効果を、AVシャント血栓症および尾静脈出血のサルモデルで評価した。h−19F6の静脈内注射は、凝血重量の用量依存的な低減をもたらし、1mg/kgの用量で有意な低減が観察された(図8B)。h−42A5で治療した動物に関しては、凝血重量はすべての試験用量レベルで用量依存的な様態で有意に低減した(図8C)。h−19F6またはh−42A5による治療後、出血時間に有意な変化は認められなかった(図9Bおよび9C)。
実施例12:カニクイザルにおける塩化第二鉄-誘発性動脈血栓症およびテンプレート出血時間に対する抗FXI抗体の効果の評価
カニクイザルに1.5mg/kgのゾレチルで事前に麻酔し、挿管し、人工呼吸器で人工呼吸を行った。麻酔をイソフルランで維持した。手順全体を通して、血圧、心拍数、および体温を監視した。h−34F8、h−19F6、およびh−42A5を含む試験された抗体、またはビヒクル対照を、FeCl3適用の2時間前に注射によって四肢静脈を通して投与した。左大腿動脈を露出させ、鈍的切開によって隔離した。ドップラーフロープローブを動脈に設置し、血流を継続的に記録した。FeCl3を適用する前に、血流を少なくとも5分間測定した。次に、FeCl3をあらかじめ浸した2枚の濾紙を、プローブの上流の血管の外膜表面に10分間適用した。濾紙を取り除いた後、適用部位を生理食塩水で洗浄した。血流が0に減少するまで継続的に測定した。80%閉塞までの時間(血流がベースライン血流の20%まで低減)および100%閉塞までの時間(血流が0まで低減)を記録した。同じ動物で、テンプレートの出血時間を投薬前および投薬後1時間で評価した。
カニクイザルに1.5mg/kgのゾレチルで事前に麻酔し、挿管し、人工呼吸器で人工呼吸を行った。麻酔をイソフルランで維持した。手順全体を通して、血圧、心拍数、および体温を監視した。h−34F8、h−19F6、およびh−42A5を含む試験された抗体、またはビヒクル対照を、FeCl3適用の2時間前に注射によって四肢静脈を通して投与した。左大腿動脈を露出させ、鈍的切開によって隔離した。ドップラーフロープローブを動脈に設置し、血流を継続的に記録した。FeCl3を適用する前に、血流を少なくとも5分間測定した。次に、FeCl3をあらかじめ浸した2枚の濾紙を、プローブの上流の血管の外膜表面に10分間適用した。濾紙を取り除いた後、適用部位を生理食塩水で洗浄した。血流が0に減少するまで継続的に測定した。80%閉塞までの時間(血流がベースライン血流の20%まで低減)および100%閉塞までの時間(血流が0まで低減)を記録した。同じ動物で、テンプレートの出血時間を投薬前および投薬後1時間で評価した。
FeCl3誘発性動脈血栓症に対するすべての3つの抗体の効果を調べた。サルの4つの群を、2時間、それぞれビヒクル対照、h−34F8、h−19F6、またはh−42A5で治療し、FeCl3を各動物の左大腿動脈に適用して、血栓症を誘発した。下流の血流速度を監視した。ビヒクル対照群における80%および100%の血栓性閉塞までの時間は、それぞれ14.66±1.30分および18.50±1.76分であった。図10に示すように、0.3mg/kgのh−34F8またはh−42A5による前治療は、それぞれ、80%閉塞までの時間を59.53±16.95分および40.80±7.94分に、100%閉塞までの時間を70.40±20.76分および50.61±9.48分に大幅に遅らせた。図10に示すように、ビヒクル対照群と比較した場合、統計的に有意な差はなかったが、80%閉塞(26.43±5.72分)および100%閉塞(32.78±5.09分)までの時間の延長もh−19F6で治療されたサルで観察された。
止血に対する抗体の効果を、テンプレートの出血時間の観点から評価した。各試験品について、投薬前および投薬後1時間の間に有意差は認められなかった(図11A、11B、および11C)。h−34F8、h−19F6、およびh−42A5治療後の出血時間の変化は、ビヒクル対照治療後の出血時間の変化と異ならなかった(図11D)。
止血に対するh−19F6およびh−42A5抗体の効果を、FeCl3誘発性動脈血栓症を有する同じ動物での皮膚裂傷による出血試験によって評価した(群あたりn=5)。出血時間を投薬前および投薬後1時間で記録した。いずれの抗体についても、投薬前および投薬後1時間の間、または投薬後1時間の3つの群の間で、出血時間に有意差は観察されなかった(図18)。
サル血漿のエクスビボ凝血時間に対する抗体の効果も評価した。予想通り、図12Aに示すように、0.3mg/kgのh−34F8、h−19F6、およびh−42A5による治療は、APTTをそれぞれ3.29±0.20、1.67±0.09、および2.87±0.10倍有意に延長したが、ビヒクル対照治療においては、APTTの増加は観察されなかった。さらに、図12Bに示すように、h−34F8、h−19F6、またはh−42A5による治療は、PTに対する効果を有さなかった。
したがって、本明細書に開示される抗体は、凝固の内因性経路を効果的に阻害しながら、長期の出血の悪影響を一切有さないことが予期せず発見された。
実施例13:長期間にわたるカニクイザルの凝血時間に対する修飾抗FXI抗体の効果の評価
図14および15に「修飾h−19F6」および「修飾h−42A5」として示される2つの追加のCMC最適化ヒト化抗FXI抗体を、実施例10に記載されるようなAPTTおよびPTアッセイによって、長期間(例えば、最大14日間)にわたってカニクイザルの凝血時間に対するそれらの効果について評価した。これらの2つの抗体の重鎖および軽鎖配列を表3に示す。カニクイザルに、0.6mg/kgまたは2.0mg/kgの試験抗体を静脈内投与した。上肢の表在静脈からの血液を投薬前および投薬後0.5時間、2時間、6時間、12時間、24時間、48時間、96時間、168時間、240時間、336時間に収集した。試験した両方の修飾抗体は、図14に示すようにAPTTを用量依存的に増加させ、図15に示すようにPTに影響を与えなかったことを示した。両方の修飾抗体は、最大7日、最大10日、または最大14日の長期間にわたって有効性を示した。
図14および15に「修飾h−19F6」および「修飾h−42A5」として示される2つの追加のCMC最適化ヒト化抗FXI抗体を、実施例10に記載されるようなAPTTおよびPTアッセイによって、長期間(例えば、最大14日間)にわたってカニクイザルの凝血時間に対するそれらの効果について評価した。これらの2つの抗体の重鎖および軽鎖配列を表3に示す。カニクイザルに、0.6mg/kgまたは2.0mg/kgの試験抗体を静脈内投与した。上肢の表在静脈からの血液を投薬前および投薬後0.5時間、2時間、6時間、12時間、24時間、48時間、96時間、168時間、240時間、336時間に収集した。試験した両方の修飾抗体は、図14に示すようにAPTTを用量依存的に増加させ、図15に示すようにPTに影響を与えなかったことを示した。両方の修飾抗体は、最大7日、最大10日、または最大14日の長期間にわたって有効性を示した。
したがって、本明細書に開示される修飾抗体は、長期間(最大14日)にわたって凝固の内因性経路を効果的に阻害しながら、長期の出血の悪影響を一切示さないことが予期せず発見された。
実施例14:標準的なヒト血漿の凝血時間に対する効果
抗体h−19F6およびh−42A5を正常なヒト血漿に添加した後、APTT(図16A)およびPT(図16B)を測定した(N=3)。h−19F6抗体およびh−42A5抗体の両方は、標準的なヒト血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)を濃度依存的な様態で延長した(図16A)。h−19F6およびh−42A5の血漿中のFXI活性の阻害の最大レベルは、血漿FXIレベルと確立されたAPTTとの間の相関曲線に基づいて、それぞれ約97%および99.5%であった(データの提示無し)。どちらの抗体も、ヒト血漿のPTに影響を与えなかった(図16B)。
抗体h−19F6およびh−42A5を正常なヒト血漿に添加した後、APTT(図16A)およびPT(図16B)を測定した(N=3)。h−19F6抗体およびh−42A5抗体の両方は、標準的なヒト血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)を濃度依存的な様態で延長した(図16A)。h−19F6およびh−42A5の血漿中のFXI活性の阻害の最大レベルは、血漿FXIレベルと確立されたAPTTとの間の相関曲線に基づいて、それぞれ約97%および99.5%であった(データの提示無し)。どちらの抗体も、ヒト血漿のPTに影響を与えなかった(図16B)。
実施例15:FXIへのh−19F6およびh−42A5の結合特性
FXIへのh−19F6およびh−42A5の結合特異性は、標準的なヒト血漿中でFXIと反応し、ヒトFXI欠損血漿中では反応が検出されなかったため、最初に検証された(図17)。ビオチン化試験抗体をヒト正常血漿またはFXI欠損血漿と共にインキュベートした。血漿中のFXI−抗体複合体を溶出し、一次抗体としてマウス抗ヒトFXI IgGを使用したウエスタンブロッティングに供した。ウエスタンブロッティングでは、10μLのヒト標準血漿またはFXI欠損血漿がFXI陽性およびFXI陰性対照として機能した。以前に報告された抗FXI抗体である14E1117は、2つの抗体と同じ結合プロファイルを示した(図17)。
FXIへのh−19F6およびh−42A5の結合特異性は、標準的なヒト血漿中でFXIと反応し、ヒトFXI欠損血漿中では反応が検出されなかったため、最初に検証された(図17)。ビオチン化試験抗体をヒト正常血漿またはFXI欠損血漿と共にインキュベートした。血漿中のFXI−抗体複合体を溶出し、一次抗体としてマウス抗ヒトFXI IgGを使用したウエスタンブロッティングに供した。ウエスタンブロッティングでは、10μLのヒト標準血漿またはFXI欠損血漿がFXI陽性およびFXI陰性対照として機能した。以前に報告された抗FXI抗体である14E1117は、2つの抗体と同じ結合プロファイルを示した(図17)。
FXIに対するh−19F6およびh−42A5の親和性を、表面プラズモン共鳴(SPR)技術を使用して決定した。試験抗体をセンサーチップ上で捕捉し、次に示された濃度のFXIをチップに流した。h−19F6(図19A)およびh−42A5(図19B)のセンサーグラムが得られた。h−19F6およびh−42A5の解離定数は、それぞれ22および36pMであった(図19Aおよび19B)。
次に、FXI上のこれらの2つの抗体の結合部位を決定した。FXIは、4つのタンデムアップルドメイン(A1〜4)および触媒ドメインからなるホモダイマーである。FXIの4つの突然変異体を、各アップルドメインをヒトプレカリクレインの対応するドメインで置き換えることによって生成し、SPRを使用してFXIの4つの突然変異体に対するh−19F6またはh−42A5の結合特性を試験した。A1、A2、A3、またはA4ドメインがプレカリクレインの対応するドメインで置き換えられた等量の4つの突然変異体FXIをセンサーチップに固定化し、試験抗体(5μg/mL)を会合のためにチップに流した。捕捉した各抗体の量を記録した。実験を2回実施し、代表的な結果を示す。予期せぬことに、A3ドメインの置換によって、他の3つのアップルドメインの置換と比較していずれかの抗体の結合がはるかに少なくなったため、両方の抗体が主にFXIのA3ドメインに結合した(図19C)。別の抗体であるO1A6は、陽性対照として使用されたと報告されている抗FXI抗体であり、これも、以前の研究と一致して、FXIのA3ドメインに特異的に結合した。21しかしながら、h−19F6およびh−42A5はFXIの異なる部位に結合すると仮定されたが、それは、図16に示すように、それらがFXIと同等の親和性を有するが、FXI活性に関してはまったく異なる阻害効力を有するためである。この仮説を、Biacore T200システムを使用したエピトープ結合によって試験した。実際、FXIへのh−19F6の結合は、次のFXIへのh−42A5の結合を妨げず、これは、2つの抗体がFXIのA3ドメインの異なる部位に結合することを示す(図19D)。次に、これらの2つの抗体が流れる順序を変更すると、FXIへのh−42A5の結合が次のFXIへのh−19F6の結合を妨げないことがわかった(データの提示無し)。
実施例16:FXIaへのh−19F6およびh−42A5の結合特性
抗体は、FXIに結合した良好な親和性でFXIaに結合した(図20Aおよび20B)。FXIに対するh−19F6およびh−42A5の親和性を、表面プラズモン共鳴(SPR)技術を使用して決定した。h−19F6およびh−42A5の解離定数は、それぞれ26および81pMであった(図20Aおよび20B)。試験抗体をセンサーチップ上で捕捉し、次に示された濃度のFXIaをチップに流した。h−19F6(図20A)およびh−42A5(図20B)のセンサーグラムが得られた。
抗体は、FXIに結合した良好な親和性でFXIaに結合した(図20Aおよび20B)。FXIに対するh−19F6およびh−42A5の親和性を、表面プラズモン共鳴(SPR)技術を使用して決定した。h−19F6およびh−42A5の解離定数は、それぞれ26および81pMであった(図20Aおよび20B)。試験抗体をセンサーチップ上で捕捉し、次に示された濃度のFXIaをチップに流した。h−19F6(図20A)およびh−42A5(図20B)のセンサーグラムが得られた。
参考文献
以下に列挙される参考文献、特許、および公開特許出願、ならびに上の明細書に引用されているすべての参考文献は、本明細書に完全に記載されているかのように、参照によってそれらの全体が組み込まれる。
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以下に列挙される参考文献、特許、および公開特許出願、ならびに上の明細書に引用されているすべての参考文献は、本明細書に完全に記載されているかのように、参照によってそれらの全体が組み込まれる。
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Claims (17)
- ヒトFXIまたはFXIaに特異的に結合する単離された抗FXIまたは抗FXIa抗体であって、前記抗体が、配列番号11〜13、27〜29、43〜45、59〜61、75〜77、91〜93、107〜109、123〜125、139〜141、155〜157、171〜173、187〜189、197、199、201、204、206、および208、ならびに少なくとも90%の同一性を共有する配列からなる群から選択される3つのCDRを含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン、または配列番号14〜16、30〜32、46〜48、62〜64、78〜80、94〜96、110〜112、126〜128、142〜144、158〜160、174〜176、190〜192、198、200、202、205、207、および209、ならびに少なくとも90%の同一性を共有する配列からなる群から選択される3つのCDRを含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、またはその免疫学的に活性な部分を含む、抗体。
- 前記抗体が、前記ヒトFXIまたはFXIaのA3ドメインに特異的に結合する、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体が、配列番号9、配列番号25、配列番号41、配列番号57、配列番号73、配列番号89、配列番号105、配列番号121、配列番号137、配列番号153、配列番号169、配列番号185、配列番号197、配列番号199、配列番号201、配列番号204、配列番号206、および配列番号208、ならびに少なくとも90%の同一性を共有する配列からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体が、配列番号10、配列番号26、配列番号42、配列番号58、配列番号74、配列番号90、配列番号106、配列番号122、配列番号138、配列番号154、配列番号170、配列番号186、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号205、配列番号207、および配列番号209、ならびに少なくとも90%の同一性を共有する配列からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む、請求項1に記載の抗体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
- 対象における血餅の形成を阻害する方法であって、治療有効量の請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
- 対象における血餅の形成を阻害する方法であって、治療有効量の請求項5に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
- 血栓症または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療または予防する方法であって、治療有効量の請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体を対象に投与することを含み、前記投与が、前記対象の止血を損なうことのない、方法。
- 血栓症または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療または予防する方法であって、治療有効量の請求項5に記載の医薬組成物を対象に投与することを含み、前記投与が、前記対象の止血を損なうことのない、方法。
- 敗血症を治療または予防する方法であって、治療有効量の請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体を対象に投与することを含み、前記投与が、前記対象の止血を損なうことのない、方法。
- 敗血症を治療または予防する方法であって、治療有効量の請求項5に記載の医薬組成物を対象に投与することを含み、前記投与が、前記対象の止血を損なうことのない、方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、宿主細胞において発現ベクターにクローニングされた前記抗体をコードする核酸を発現させることを含む、方法。
- 前記宿主細胞からの、発現された抗体を精製することをさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 前記発現ベクターが、pTT5ベクターまたはpcDNA3ベクターである、請求項12に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、CHO細胞またはHEK193T細胞である、請求項12に記載の方法。
- 請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法によって産生された抗体もしくはその機能的フラグメント、またはその免疫学的に活性な部分。
- 前記抗体が、翻訳後修飾されている、請求項16に記載の抗体。
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