CN109219447B - 针对mac-1的抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其a)结合Mac‑1，b)特异性抑制CD40L与活化的Mac‑1的相互作用，并且c)不诱导整联蛋白由外向内信号传导。

Description

针对MAC-1的抗体

在过去的几十年中，炎症鉴定为许多病理学的驱动力，所述病理学包括动脉粥样硬化、2型糖尿病、败血症、心肌梗塞、自身免疫疾病和神经变性性疾病。已经提出靶向炎症应答作为这些病理学中的主要目标。然而，此类策略的主要限制仍然是炎症应答对于再生、存活和宿主防御是至关重要的。因此，安全且可靠的抗炎性疗法代表主要的医疗需求。这以糖皮质激素(损害免疫应答的有力的炎症抑制剂)或COX-2抑制剂(其可以抑制炎症，但对心血管系统表现出有害影响)示例。

炎症是涉及将白细胞募集到由白细胞整联蛋白如Mac-1(α_Mβ₂，CD11b/CD18)介导的损伤部位的过程。Mac-1是一种易受通过构象变化的快速炎性活化的有力的粘附因子，所述构象变化表现出对其配体的增加的亲和力，导致白细胞滚动、牢固的粘附和白细胞向发炎组织的迁移。Mac-1是心血管疾病和整联蛋白的治疗或遗传抑制中的有力靶物，并且已经显示在预防动脉粥样硬化、新内膜形成和血栓性肾小球肾炎方面非常有效。除其在炎症中的作用外，Mac-1最初由于其结合补体因子如C3bi的能力，反映其在宿主防御、创伤愈合、血栓形成和各种其他髓样细胞效应子功能中的作用而命名为CR(补体受体)3。通过在髓样谱系上，包括在单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞上，而且还在NK细胞上，以及在较小程度上在活化的淋巴细胞上广泛表达实现此广泛一批效应子功能。此外，其功能多样性通过与一大批蛋白质和蛋白多糖，包括ICAM-1、纤维蛋白原，纤连蛋白、肝素、GPIbα、RAGE、内皮蛋白C-受体(EPCR)和CD40L结合的混杂配体来反映。已经提出整联蛋白拮抗作用是炎症中有希望的靶标。然而，其在宿主防御和血栓形成中的作用可能限制其临床应用。

CD40配体(CD40L)是先天性和适应性免疫中细胞信号传导中至关重要的跨膜分子。它由多种细胞表达，但主要由活化的T淋巴细胞和血小板表达。CD40L可以被切割成具有细胞因子样活性的可溶形式(sCD40L)。这两种形式都结合几种受体，包括CD40。此种相互作用对于抗原特异性免疫应答是必需的。CD40L也结合不同的受体，其中Mac-1(αMβ2)是所述相互作用藉此在动脉新内膜形成、白细胞募集和动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓形成的发病机理、单核细胞粘附和中性粒细胞浸润以及促炎细胞因子(IL-8，IL-6)的释放中起作用的受体。

Mac-1是涉及多种炎性病理学的经典粘附因子。尽管其对动脉粥样硬化和腹膜炎症中的白细胞募集有促进作用，但Mac-1靶向疗法受到各种副作用的限制，例如受损的创伤愈合和宿主防御。这进一步以人白细胞粘附缺陷(LAD)反映，所述人白细胞粘附缺陷的特征在于损害宿主防御的β-亚基中整联蛋白Mac-1、LFA-1和CD11c的缺陷。因此，治疗性抑制Mac-1的非特异性尝试似乎不是有利的。为了克服这些限制，提供了新的单克隆抗体，其特异性靶向CD40L与整联蛋白的α_M亚基内的Mac-1的主要配体结合I域的结合。CD40L代表Mac-1的偏向激动剂(biased agonist)，通过充当CD40L的内皮粘附因子而不通过由外向内信号传导途径(outside-in signaling pathway)的激活来介导其促炎功能。CD40L/Mac-1结合不干扰CD40L-CD40或Mac-1-GP1balpha和Mac-1-ICAM-1结合，表明每个蛋白质表面上的独特结合表位。

整联蛋白是主要的粘附受体，其在质膜上双向传递信号，在包括免疫应答在内的多种生物过程中发挥重要作用。整联蛋白含有两个非共价结合的1型跨膜糖蛋白α和β亚基；每个亚基含有大的细胞外域、单跨越的跨膜域和短的细胞质域。整联蛋白的细胞外域结合配体的能力取决于αM亚基的开放延伸确认(“活化”)并且调节细胞粘附和信号转导，由外向内和由内向外信号传导两者。本发明涉及CD40L与整联蛋白α_Mβ2(Mac-1)之间相互作用的特定修饰。

已经发现通过选择性阻断Mac-1与特定配体的相互作用而不影响其他配体，可以实现参与炎性而非再生或免疫途径的独特整联蛋白功能的失活。

已经构建了单克隆抗体，其特异性靶向Mac-1中的EQLKKSKTL(SEQ ID NO:9)结合基序，我们已证明该结合基序是结合其粘附剂，促炎性配体CD40L必需的。

因此，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其抑制白细胞的募集而没有不期望的副作用。此类抗体或其抗原结合部分

a)结合Mac-1，

b)特异性抑制CD40L与活化的Mac-1的相互作用，和

c)不诱导整合蛋白由外向内信号传导。

在本发明的过程中，已经构建了单克隆抗体，其中最优选的实施方案是下文中称为抗-M7的抗体。已经确定了抗体的序列并鉴定了CDR。利用该信息和计算和常规结合研究，可以提供合适的其他抗体或其抗原结合片段，其源自该抗体。由于抗体技术在治疗领域中引起了很大兴趣，因此存在有可以实际使用的几种工程化抗体片段。术语“单克隆抗体或其抗原结合片段”在广义上理解，因此不仅包括Fab片段而且包括单链Fv片段(scFv)、可以作为双特异性双特异性单链片段的双抗体、三抗体、四抗体或微型抗体。本文提供的序列信息也可用于产生源自camelite免疫球蛋白的纳米抗体。那些结构中许多在Holliger et al.(Nature Biotechnology,vol.23,no.9(2005),pp 1126-1136)的综述文章中进行了总结。

分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的优选特性是它们与Mac-1结合，然而，优选与活化的Mac-1的结合，而本发明的抗体结构不应与非活化的MAC-1结合。活化的和非活化的Mac-1之间的区别可以通过定量结合动力学来进行，如例如Li et al.(Journal ofImmunology(2013),pp 4371-4381)描述的。

本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的另一个优选实施方案是它们限制炎性细胞因子的表达。

分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的另一个优选特性是它们在体外和优选在体内阻断白细胞募集。可以在活体显微术中观察和测量此种阻塞，如本申请的实施例中所示。

单克隆抗体或其抗原结合部分的另一个优选实施方案是未实现Mac-1的血栓和止血功能。这可以通过使用合适的体内实验来测量。

称为抗-M7的本文公开的优选实施方案作为小鼠系统中的单克隆抗体产生。本领域技术人员公知，单克隆鼠抗体不能用于人的治疗，因为在重复施用此类鼠抗体后，在患者体内产生抗小鼠抗体。因此，单克隆抗体或其抗原结合部分优选是人源化的。人源化意指抗体的小鼠框架被与小鼠抗体具有高度相似性的抗体的人框架结构替换。通过使用合适的计算模型，可以进一步调整氨基酸结构以降低抗体的小鼠特征。然而，必须检查所提出的氨基酸序列的变化是否会降低人源化抗体或抗原结合构建体的结合强度。仅进行此类氨基酸取代，其不会负面影响结合特性，特别是特异性。

假定此类修饰的抗体或其抗原结合部分应当包含至少三个CDR。公开了CDR并且分别具有SEQ ID NO:2-4和6-8。在更优选的实施方案中，根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分包含至少四个，更优选五个，特别优选六个具有SEQ ID NO:2-4和6-8序列的CDR。

抗M7抗体的轻链具有SEQ ID NO:1中提供的氨基酸序列，并且重链对应于SEQ IDNO:5。如上文已经解释，在人源化过程中，将氨基酸序列变化引入氨基酸序列中。在优选的实施方案中，本发明的分离的单克隆抗体或抗原结合部分具有轻链，其与SEQ ID NO:1具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，特别优选至少95％同一性的氨基酸同一性。

在优选的实施方案中，本发明的分离的单克隆抗体或抗原结合部分具有重链，其与SEQ ID NO:5具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，特别优选至少95％同一性的氨基酸同一性。

术语“同一性”是指将原始鼠序列的序列和人源化构建体的序列相互比较。例如90％的同一性意味着90％的氨基酸位于原始小鼠序列和人源化序列中相同的相应氨基位置。

本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以优选用于药物组合物，其包含药学活性量的抗体或其抗原结合部分以及适用于对患者应用的添加剂，由此腹膜内应用是尤其优选的。本发明的药物组合物可以优选用于抑制炎症。

证明了根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分可以优选用于治疗心肌梗塞后的炎性并发症。在心肌梗塞后频繁发生的此类并发症中，吸引到受心肌梗塞影响的区域的炎性白细胞引起并且促成炎症应答，其加剧创伤愈合并且可以抑制心肌梗塞后的恢复。在此类实施方案中，优选使用根据本发明的抗体及其抗原结合部分。

抗-M7或其衍生的衍生物对炎症的抑制相对于常规的抗-Mac-1疗法提供几个优点。已经观察到，与对照小鼠相比，用先前已知的抗Mac-1抗体处理的小鼠显示出增加的死亡率。这些数据证实了先前的研究，其中Mac-1缺陷型小鼠未得到保护而免于细菌性败血症，最可能由不能结合补体因子并促进细菌颗粒的清除(例如通过C3bi介导的吞噬作用)引起的效应。

先前的表位定位研究揭示并定位C3bi与α_M I域内残基P¹⁴⁷-R¹⁵²、P²⁰¹-K²¹⁷和K²⁴⁵-R²⁶¹的结合，证明了与CD40L所需要的结合序列(E¹⁶²-L¹⁷⁰)不同的结合表位。已经显示与抗-Mac-1和IgG对照处理的小鼠相比，用抗-M7处理的小鼠显示增加的存活，指示抗-M7不仅缺乏有害特性，而且诱导保护作用。

假设抑制腹膜中促炎性白细胞粘附有助于减缓压倒性促炎性应答，伴随除去和抵抗细菌侵入的最初尝试。认识到保护性和疾病加重性途径之间的平衡在许多状况中受到扰乱，并且可以潜在通过限制白细胞募集而转变到保护性侧。此假设得到下述实情进一步支持，即与对照动物相比，抗-M7提供保护而免于血浆中的促炎性细胞因子水平，而抗-Mac-1提高细胞因子水平。因此，细胞因子水平的降低可以继发于减少的白细胞活化和靶组织中的活化。实际上，内膜单核细胞产生促炎性细胞因子，例如TNFα、IL-1，IFNγ以及抗炎介质IL-10。在血浆中，用TNFα攻击并用抗-M7抗体处理的小鼠显示促炎细胞因子IL-6、TNFα和MCP-1的减少，而抗Mac-1诱导增强的细胞因子表达。

然而，用其他抗Mac-1抗体(例如克隆M1/70(其用作对照))的处理可能不完全反映遗传敲除。值得注意的是，M1/70在Mac-1表达细胞中，特别在巨噬细胞中诱导强烈的促炎性应答，并且提高细胞因子表达。后者也得到我们的结果证实，证明单次注射抗Mac-1导致强烈上调的细胞因子血浆水平，可能影响创伤愈合。已经提出如由M1/70提供的过度刺激可以代表通过激活凋亡途径来消退炎症的可行策略。实际上，先前已经显示在单次注射抗Mac-1克隆M1/70后，驻留在腹膜腔中的细胞的凋亡增强。这可以有力支持抗Mac-1在减少腹膜细胞积累方面的作用。然而，伴随细胞因子风暴的细胞凋亡诱导治疗在临床实践中可能是不利的。

Mac-1支持与多种其他分子的相互作用，并且更多是到目前为止可能尚未发现的。已经描述了超过40种不同的蛋白质相互作用，但是这些中仅一些的分子结合特性是已知的。因此，不排除CD40L的结合位点也由其他配体共享。然而，本文提供的数据揭示并确认以前的提议，即CD40L与Mac-1的结合不与对其他常规配体的结合特性共享多种特征：

(1)虽然对纤维蛋白原和其他配体鉴定的结合表位显示重叠区域，但Mac-1的I域内的EQLKKSKTL(SEQ ID NO:9)基序不参与备选配体的结合，

(2)CD40L本身和抗-M7均未诱导整合蛋白由外向内信号传导，而整合蛋白生理学的此特征迄今为止被认为是整合蛋白配体结合的范例，

(3)CD40L与Mac-1的相互作用不会扩展免疫或止血功能，而大多数Mac-1配体如纤维蛋白原参与那些病理学中的多种。

本文呈现的数据提出CD40L与Mac-1的相互作用主要是是多种炎性病理学中炎性白细胞，可能是粒细胞的牢固粘附所需要的。结果不排除，但强调免疫功能、止血参数和再生反应不涉及CD40L与Mac-1的结合。

先前已经显示，用CD40L/Mac-1相互作用的特异性抑制剂cM7治疗在发炎的提睾肌小静脉的活体显微术模型中和无菌性腹膜炎模型中减弱炎性白细胞募集。证明用针对Mac-1上的CD40L结合位点的完整IgG抗体抗-M7或其Fab片段处理显著降低了白细胞粘附。令人感兴趣的是，抗-M7的抑制效率与抗Mac-1处理的抑制效率相当，提示CD40L/Mac-1相互作用有助于白细胞募集。这并没有反证先前的报道，但确实扩展了CD40L的在内皮细胞上表达的Mac-1配体ICAM-1和RAGE的全集。在这方面，似乎可能的是反受体结合的模式依赖于病理学和炎症负担。因此，CD40L和Mac-1的相互作用可能是疾病特异性的并且通过内皮CD40L的表达，通过Mac-1的构象变化调节，或者一些病理学比其他病理学更依赖于白细胞侵入。例如，动脉粥样硬化(一种至少在疾病的早期阶段需要髓样细胞募集的疾病)对CD40L/Mac-1相互作用的阻断强烈易感，而线损伤后的新内膜形成不受阻断CD40L/Mac-1，但是受到抗Mac-1或在Mac-1敲除小鼠中抑制。

在本发明的过程中获得的数据显示抗M7在阻断与活化的Mac-1而不是与非活化的Mac-1的相互作用方面最有效。这提出相互作用可以在与较高炎症负荷相关的病理学，而非基线下状况中发挥更重要的作用。

此外，如先前提出，抗-M7等抗体是否可以主动调节或保存整联蛋白的不同构象仍有待回答。这可以解释仅永久活化的整合蛋白，而非天然条件下的整合蛋白得到靶向，如数据显示。然而，为了确定精确的结合特性，更详细的结构分析可能是有帮助的。

最后，不能排除CD40L/Mac-1相互作用可以造成从骨髓或脾中排出和动员单核细胞，如先前提出。如本文所观察到的，败血症期间的炎性单核细胞增多可以通过抗M7治疗完全逆转。这是否由受损的单核细胞储库(例如由受损的对脾的迁移)引起应当在进一步的实验中确定。

本发明的抗体遵循通过单克隆抗体抗-M7选择性靶向EQLKKSKTL(SEQ ID NO:9)结合基序的策略，所述结合基序代表Mac-1I-域内的CD40L结合位点。该抗体对靶定的结合位点具有高选择性，不干扰备选的结合配偶体，并且与常规抗Mac-1抗体相反不影响止血、宿主防御和创伤愈合。在优选的实施方案中，本发明的抗体不干扰交替的结合配偶体，因此对靶向结合位点具有高选择性。所提出的配体靶向抗整联蛋白疗法优于非选择性方法，并且代表了改进和调整针对炎性疾病的抗整联蛋白疗法的优点。

通过本发明可获得的结果、实验和优点在附图和实施例中进行了总结。附图和实施例显示了本发明的优选实施方案，特别是最优选的抗-M7抗体，但应当理解，附图和实施例不应视为限制本发明。

在附图和实施例中显示了本发明的优选实施方案：

图1显示针对人Mac-1内CD40L结合位点产生的小鼠单克隆抗体抗-M7有效靶向人整合蛋白。CD40L结合需要的MCD-1内的肽序列M7是人(SEQ ID NO:9)和鼠(SEQ ID NO:10)整联蛋白之间的高度保守的结合基序(图1A)。

此外，图1A显示人起源的肽M1(SEQ ID NO:14)和具有SEQ ID NO:15的源自小家鼠的相应肽M1。名称为M8的人肽对应于SEQ ID NO:13，并且源自小家鼠的肽M8具有SEQ IDNO:16。

通过用与白喉类毒素偶联的结合肽VMEQLKKAKTLMQ(SEQ ID NO:11)免疫小鼠产生的抗体抗-M7在western印迹中结合过表达天然的(WT)和永久活化的Mac-1(del)的CHO细胞系，但不结合对照CHO细胞(图1B)。

与固定化肽结合的固相中测试抗体抗-M7与固定化肽M7(EQLKKSKTL)(SEQ ID NO:9)，sM7(KLSLEKQTK)(SEQ ID NO:12)和M8(EEFRIHFT)(SEQ ID NO:13)的特异性结合(图1C)。

通过与偶联有HRP的链霉抗生物素蛋白温育后生物素化的抗小鼠IgG的结合和颜色反应来定量结合。通过减去小鼠IgG与肽的结合来计算特异性结合。将抗-M7与荧光染料Alexa647偶联，并在FACS中定量与人白细胞亚组的结合。Alexa647同种型抗体充当对照(图1D)。

图2显示抗-M7选择性阻断永久活化的Mac-1与CD40L的相互作用，但不是天然整联蛋白或备选Mac-1配体的相互作用。过表达永久活化的Mac-1突变体(Mac-1-del)的CHO细胞在静态粘附测定中粘附于固定化的CD40L(图2A，2B)。

在粘附前将细胞与抗-M7或人泛-I-域阻断参照克隆2LPM19c一起温育15分钟。或者，测试天然的非活化的Mac-1整联蛋白的粘附(图2C)。为了排除非特异性Fc介导的相互作用，使用抗-M7或抗-Mac-1的Fab片段制备作为抑制剂(图2D)。

为了测试抗-M7是否对CD40L具有特异性，将一组经典的Mac-1配体分别固定，并在抗-M7或泛I-域阻断性抗Mac-1的存在下定量永久活化的Mac-1CHO细胞的粘附(图2E)。

图3显示抗-M7不诱导整联蛋白由外向内信号传导，而常规抗-Mac-1抗体在体外和体内诱导MAP-激酶的活化和炎性细胞因子表达。

通过在C57Bl/6小鼠的腹膜中注射4％巯基乙酸盐并温育72小时来分离鼠巨噬细胞。通过腹膜灌洗收集腹膜细胞，FACS分析证实纯度>90％F4/80⁺巨噬细胞。将巨噬细胞在5％FCS RPMI中培养过夜，并用10μg/ml小鼠IgG、抗人Mac-1(克隆2LPM19c)、抗小鼠Mac-1(克隆M1/70)或抗-M7刺激30分钟。裂解细胞并通过western印迹显现磷酸化的ERK1/2、NfκB和p38(图3A)，并计算磷酸化级分的比率(图3B)。将数值计算为相对于仅用盐水刺激的细胞信号标准化的相对任意单位(AU)。在小鼠中腹膜内注射Mac-1抗体克隆，并且在注射后4小时，通过细胞计数珠阵列测量IL-6、TNFα和MCP-1的血清浓度(图3C)。抗Mac-1克隆1/70用作对照。

图4显示用抗-M7处理在体外和体内防止炎性白细胞募集并且减少炎性细胞因子表达。允许鼠RAW细胞在流动室测定中体外粘附在分离的且TNFα引发的鼠内皮细胞上。在抗小鼠IgG或抗M7抗体的存在下定量粘附细胞的数量(图4A)。对C57Bl/6小鼠腹膜内注射200ng TNFα以诱导腹膜和肠系膜炎症。同时，注射IgG同种型对照或抗小鼠抗Mac-1(克隆M1/70)Fab片段制剂。注射后4小时通过活体显微术监测白细胞向发炎的肠系膜小静脉的募集(图4B)。定量粘附和滚动的白细胞的数量，以及显示为累积频率的白细胞滚动速度(图4C-E)。在IgG或抗M7Fab制剂存在下，将在单核细胞中表达GFP的小鼠(CX3CR1-GFP)进行活体显微术(图4F)。迁移的单核细胞(白色箭头)在视野中的血管旁(para-vascular)空间中定量(图4G)。通过CBA珠阵列评估在IgG或抗-M7Fab处理后经历活体显微术的小鼠中的血浆细胞因子水平(图4H)。

图5显示抗-M7不影响体内静脉血栓形成和血小板效应子功能。通过氯化铁在C57Bl/6小鼠的肠系膜小静脉中诱导静脉血栓形成。在活体显微术中通过体内罗丹明染色显现血栓形成(图5A)。监测和量化血管血栓阻塞前时间和栓塞速率(/min)(图5B，5C)。在血栓诱导前15分钟通过腹膜内注射用小鼠IgG的Fab制剂，抗-M7或抗-Mac-1(50μg)处理小鼠。在用抗Mac-1抗体克隆处理后，通过在流式细胞术中检测CD41⁺单核细胞来定量血小板-单核细胞聚集体的形成(图5D)。

图6显示Mac-1与CD40L的相互作用，而非与其他配体的相互作用的特异性抑制改善皮肤创伤愈合。注射抗Mac-1或抗M7Fab制剂后，通过4-mm活组织检查穿刺诱导无菌性皮肤创伤。6天后拍摄皮肤创伤(图6A)并计算创伤面积(图6B)。

图7显示抗-M7在细菌败血症期间改善宿主防御、细菌清除和炎症，而Mac-1的非特异性阻断加强小鼠的菌血症。为了测试阻断Mac-1或特异性阻断CD40L结合位点是否影响细菌败血症期间的宿主防御和炎症，诱导盲囊结扎(coecal-ligation)和穿刺败血症(CLP)。在CLP程序后20小时，通过流式细胞术定量在血液中循环的炎性和巡逻单核细胞(图7A)。通过流式细胞术鉴定侵入腹膜腔的粒细胞(F4/80-Gr-1⁺)(图7B)并计算总数(图7C)。在血浆中定量急性期蛋白SAA(图7D)和细菌LPS滴度(图7E)的水平。通过针对DAP和Ly6G染色来确定肾实质中粒细胞的累积(图7F)，并将其定量为粒细胞/总细胞核的比例(图7G)。

图8显示抗-M7改善CLP-败血症期间的存活，而抗-Mac-1降低CLP-败血症期间的存活。诱导盲囊结扎和穿刺败血症(CLP)。为了评估用Mac-1抗体克隆治疗是否影响存活，在诱导CLP败血症后0、48和96小时通过腹膜内注射抗Mac-1或抗M7Fab制剂来处理小鼠。计算相对存活率并显示为Kaplan-Maier存活治愈。

图9显示用抗-M7处理阻断心肌梗塞后受损心肌中的炎性白细胞浸润。通过左前降支冠状动脉(LAD)的手术结扎诱导心肌梗塞。在心肌梗塞后通过流式细胞术在消化的心脏中定量渗入梗塞心肌的白细胞。如通过超声心动图显象评估，抗-M7减少单核细胞和中性粒细胞的浸润并减弱心力衰竭。

图中总结的结果在以下实施例中获得：

实施例1

C57BL/6N背景上的雄性小鼠接受标准饲料。将所有小鼠维持在标准条件下(12小时光照，12小时黑暗循环)并且随意获得食物和水。在8周龄时，如指示使小鼠经受活体显微术、创伤愈合或CLP败血症。通过腹膜内注射以指定浓度以每次注射100uL的体积进行抗体处理。在一些活体实验中，在CXCR3-启动子(CXCR3-GFP)控制下的GFP-转基因动物用于追踪白细胞。所有实验方案均经澳大利亚墨尔本Alfred Medical Research and EducationPrecinct(AMREP)的动物伦理委员会和弗莱堡大学的当地动物伦理委员会批准。所有程序均按照机构准则进行。

通过用与白喉类毒素偶联的肽C-VMEQLKKSKTLFS-NH2(SEQ ID NO:17)(MonashAntibody Technologies Facility,Monash University,Melbourne,Australia)免疫小鼠获得对应于Mac-1I-域序列V160-S172的肽的特异性抗体。使用固相结合测定来筛选血清与固定化肽M7的结合。在对M7高亲和力结合的不同克隆中，进一步表征了优选的克隆RC3(称为抗-M7)。

实施例2

针对人Mac-1内的CD40L结合位点产生的小鼠单克隆抗体抗-M7在靶向人整联蛋白方面是有效的。

先前已显示CD40L选择性结合主要Mac-1配体结合域内的EQLKKSKTL(SEQ ID NO:9)基序。为了获得人结合位点的特异性抑制剂，用含有人肽V160-S172的结合肽M7免疫小鼠。令人感兴趣的是，M7序列在人和鼠蛋白质序列之间高度保守(图1A)。在固相结合测定中相应上清液对固定化肽M7具有高亲和力结合的几种杂交瘤克隆中，克隆RC3(小鼠IgG2bκ)显示出对Mac-1-CD40L结合，而非与其他配体的相互作用的特异性抑制。此抗体克隆，后来称为抗-M7能在western印迹中结合过表达天然的(WT)和永久活化的Mac-1(del)的CHO细胞系，但不结合对照CHO细胞(图1B)，证实成功地与靶蛋白结合。

此外，抗M7在固相结合中与固定化肽M7(EQLKKSKTL)(SEQ ID NO:9)结合，但不与对照肽杂乱sM7(KLSLEKQTK)(SEQ ID NO:12)或肽M8(EEFRIHFT)(SEQ ID NO:13)结合(图1C)，表明抗-M7特异性结合免疫肽。为了测试抗-M7与表达Mac-1的人细胞的结合，我们将抗体与荧光染料Alexa647偶联并在流式细胞术中定量与人白细胞亚组的结合。令人感兴趣的是，抗-M7显示出与表达Mac-1的人白细胞(例如单核细胞和嗜中性粒细胞)而不与淋巴细胞的浓度依赖性结合，如预期的(图1D)。抗Mac-1克隆M1/70的结合充当对照并显示出相同的结合特性，与髓样细胞的最高结合。这些发现证明人Mac-1 1-域内的结合序列M7可与单克隆抗体抗-M7结合。进一步的DNA测序揭示了重链和轻链的抗M7可变区的CDR和精确蛋白质序列。如表1所示:

实施例3

在96孔ELISA板(Nunc)中与固定化肽的固相结合中测试抗体抗-M7与固定化肽M7(EQLKKSKTL)(SEQ ID NO:9),sM7(KLSLEKQTK)(SEQ ID NO:12)和M8(EEFRIHFT)(SEQ IDNO:13)的特异性结合。通过添加生物素化的抗小鼠IgG并随后与偶联有HRP的链霉抗生物素蛋白和TMB底物温育后的颜色反应来检测抗M7的结合。通过减去小鼠IgG与肽的结合来计算特异性结合。为了测试抗体抗-M7与人白细胞的结合，根据制造商的方案(MonoclonalAntibody Labeling Kit,Life Technologies)用Alexa Fluor 647标记抗-M7。通过离心从健康供体分离人白细胞，并用PMA(200ng/ml)刺激红细胞裂解-白细胞，与抗-M7-Alexa 647(1μg和5μg)一起温育，并通过流式细胞术定量抗体结合。

发现抗-M7是Mac-1与CD40L相互作用的配体和活化特异性抑制剂。

为了测试抗M7是否能够在功能上阻断Mac-1和CD40L的相互作用，在静态粘附测定中测试过表达永久活化的Mac-1突变体(Mac-1-del)的CHO细胞与固定化的CD40L的粘附。令人感兴趣的是，抗M7阻断细胞粘附65.6±7.2％，此效应与抗人泛-I域阻断参照克隆2LPM19c几乎一样强(抑制92.7±2.0％，图2A，B)。在实验中，使用10μg/ml的浓度。由此可以得出结论，通常使用范围为1至50μg/ml，优选5至20μg/ml的抗体浓度。最令人感兴趣的是，与参考抗Mac-1抗体相反，抗-M7不阻断表达天然非活化的Mac-1整合蛋白的CHO细胞的粘附(图2C)，表明抗-M7的阻断对整联蛋白的高亲和力构象是特异性的。此外，抗-M7的抑制不限于人蛋白质，因为抗M7显著阻断鼠巨噬细胞和鼠CD40L的相互作用。此外，抗-M7的阻断并非由抗体的Fc片段非特异性地引起，因为抗-M7或抗-Mac-1的Fab片段制剂与整个抗体制剂一样有效(图2D)。不同配体可以结合Mac-1I-域内的分开或重叠的结合区。为了测试抗M7是否对CD40L结合表位具有特异性，分别固定一组经典的Mac-1配体，如纤维蛋白原、ICAM-1、NIF、肝素和RAGE，并且在抗-M7和抗-Mac-1存在下测试Mac-1-del细胞的结合(图2E)。值得注意的是，抗Mac-1阻断每种相互作用，而抗-M7的阻断能力仅限于CD40L。这些数据揭示了抗M7是CD40L/Mac-1相互作用的有效且特异性的抑制剂。

实施例4

如上所述获得鼠腹膜巨噬细胞。流式细胞术揭示了大多数(>90％)PEC对巨噬细胞标志物F4/80呈阳性。过夜饥饿后，用指定的针对Mac-1的抗体以10μg/ml的浓度刺激巨噬细胞30分钟。在指定的时间点后，裂解细胞，通过SDS-PAGE分离蛋白质并印迹到聚偏二氟乙烯膜上。通过western印迹(Cell Signaling)中的特异性抗体结合检测总蛋白质和NFκB、ERK1/2和p38的磷酸化部分。计算磷酸化级分的比率并表示为相对于仅用盐水刺激的细胞信号标准化的相对任意单位(AU)。

测试结果显示抗M7不诱导整联蛋白由外向内信号传导，而常规抗Mac-1抗体在体外和体内诱导MAP激酶的活化和炎性细胞因子表达。

常规的抗Mac-1抗体诱导整联蛋白的活化，称为由外向内信号传导，其由配体和抗体结合时MAP-激酶(例如ERK和p38)的下游激活介导。先前已经显示CD40L是一种偏向的激动剂，在结合时不诱导由外向内信号传导事件。为了测试抗M7是否会诱导细胞活化，收集来自雄性8周龄C57Bl/6小鼠的巯基乙酸盐诱发的腹膜巨噬细胞。在含有5％FCS的RPMI中过夜饥饿后，用10μg/ml小鼠IgG、抗人Mac-1(克隆2LPM19c)、抗小鼠Mac-1(克隆M1/70)或抗M7刺激巨噬细胞30分钟。抗Mac-1处理诱导ERK和p38的磷酸化，如通过western印迹中磷酸化表位的比率升高所定量的(图3A)，而抗-M7没有效果，指示抗-M7靶向的结合表位是不参与由外向内信号传导(图3B)。为了评估此种效果对于体内处理是否是相关的，在小鼠中腹膜内注射Mac-1抗体克隆，并且在注射后4小时定量IL-6、TNFα和MCP-1的血清浓度。令人惊讶的是，Mac-1参考克隆M1/70(对照)强烈升高细胞因子水平，而抗-M7则没有(图3C)。相应地，抗体刺激后巨噬细胞的体外培养中促炎细胞因子的水平增加。这些发现指示抗-M7靶向在整联蛋白阻断期间不引起不希望的由外向内信号传导的表位。

实施例5

在酶促消化之前，于4℃将抗体在SnakeSkin Dialysis Tubing 10k MWCO中针对PBS透析过夜。如根据制造商的说明书(Pierce Fab Preparation Kit，ThermoScientific)所示，使用固定化木瓜蛋白酶从抗M7，抗Mac-1(克隆M1/70)和IgG同种型对照制备Fab片段。简言之，在25mM半胱氨酸存在下于37℃产生Fab片段3小时，然后在NAb蛋白A旋转柱上纯化。在SDS-PAGE上评估Fab片段的纯度。

用sCD40L(10μg/ml)包被96孔板(Nunc)，并与表达组成型活化的Mac-1的CHO细胞一起温育。如所示将细胞与阻断抗体(10μg/mL)预温育并使其粘附50分钟。在用PBS重复清洗后计数粘附细胞。对于动态粘附测定，人脐带内皮细胞(HUVEC)在35mm细胞培养皿中培养至汇合，用TNFα刺激过夜并置于平行流动室系统(Glycotech)中。在指定的抗体(10μg/mL)存在下，在指定的剪切速率下定量粘附细胞的数量。

对于活体显微术，小鼠在腹膜内接受100μg抗体或50μg Fab-片段的腹膜内注射。15分钟后，给小鼠腹膜内注射200ng鼠TNFα(R&D Systems)。在TNFα施用后4小时开始手术。简言之，通过腹膜内注射盐酸氯胺酮(Essex)和xylazin(Bayer，Leverkusen，Germany)麻醉小鼠。将肠系膜由腹取出并置于直立活体显微镜(AxioVision，Carl Zeiss)下。在眶后注射罗丹明后拍摄在肠系膜小静脉中滚动和粘附的视频。滚动白细胞通量定义为以小于红细胞的速度移动的白细胞数。粘附的白细胞定义为保持静止至少30秒的细胞。

流式细胞术：如下文所述获得腹膜渗出细胞(PEC)和血液白细胞。通过与红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl,5.7mM K2HPO4,0.1mM EDTA,pH7.3)一起温育除去剩余的红细胞。在PBS中清洗细胞，并在冰上用抗CD16/CD32(eBioscience)阻断Fc-受体10分钟。然后用指定的抗体标记细胞，之后用流式细胞仪(FACS Calibur，BD Biosciences)定量。所有抗体均获自eBioscience。在指定抗原的细胞表面表达后鉴定出不同的白细胞群：粒细胞(Gr-1⁺F4/80-CD11b⁺CD115-)，巨噬细胞(F4/80⁺CD11b⁺CD115-)，炎性单核细胞(CD11b⁺CD115⁺Gr-1⁺F4/80-)，非炎性单核细胞(CD11b⁺CD115⁺Gr-1-F4/80^-)。

小鼠腹腔巨噬细胞的分离和培养：腹膜内注射抗体，30分钟后WT小鼠接受注射2mL4％巯基乙酸盐肉汤(Sigma)。72小时后进行腹膜灌洗。如上所述，通过FACS定量和表征腹膜渗出细胞(PEC)。在CLP实验中，在手术后20小时进行腹膜灌洗。

可以显示用抗-M7处理在体外和体内防止炎性白细胞募集并且减少炎性细胞因子表达。

Mac-1是一种有力的粘附因子，可能通过与内皮细胞表达的不同配体(包括ICAM-1、RAGE和CD40L)相互作用来介导其粘附功能。为了测试抗M7是否阻断细胞粘附，使鼠单核细胞样RAW细胞在流动室测定中体外粘附在分离的且TNFα引发的鼠内皮细胞上。与抗-M7温育后，粘附细胞的数量减少，指示白细胞停滞需要CD40L/Mac-1相互作用(图3A)。为了测试体内这些发现的相关性，腹膜内注射抗-M7的Fab片段制剂和相应的同种型，之后进行活体显微术(图4B)。在用TNFα同时刺激4小时后监测白细胞向发炎的肠系膜小静脉的募集，以诱导炎性白细胞募集。与我们的体外结果一致，我们观察到抗-M7注射后粘附白细胞(图4C)而非滚动白细胞(图4D)的数量减少。相应地，显示为累积频率的白细胞滚动速度没有改变(图4E)，指示抗-M7阻断白细胞的牢固粘附而非滚动性质。为了排除抗-M7诱导白细胞耗竭，我们i.p.注射抗-M7或相应的同种型对照，并定量白细胞群。值得注意的是，两组均未观察到任何变化。为了测试受损的单核细胞阻滞是否会影响下游效应如迁移，在TNFα攻击4小时后在IgG或抗-M7Fab制剂存在下对单核细胞中表达GFP的小鼠(CX3CR1-GFP)进行活体显微术(图4F)。相应地，我们观察到经抗-M7处理的动物显示迁移至血管周围空间的较少数量的单核细胞(图4G)。最后，我们观察到，与IgG Fab处理的对照动物相比，在抗M7Fab处理后经受活体显微术的小鼠中促炎细胞因子TNFα、IL-6和MCP-1的血浆水平显著降低(图4H)。这些结果清楚指示白细胞粘附通过CD40L和Mac-1的相互作用进行，并且该相互作用可以被抗-M7抗体功能性阻断。

实施例6

还已显示抗-M7不影响体内静脉血栓形成和血小板效应子功能。

Mac-1参与止血和血栓形成，可能是由于它与血小板糖蛋白GP1bα的相互作用。此外，CD40L稳定血栓，并且其治疗抑制引起血栓栓塞并发症。为了排除根据本发明的抗体会诱导不需要的血栓脱稳定化，通过氯化铁在C57Bl/6小鼠的肠系膜小静脉中诱导静脉血栓形成。在活体显微术中通过体内罗丹明染色显现血栓形成(图5A)。如前所述，通过腹膜内注射Fab片段抑制Mac-1延长血管阻塞时间并增加血栓栓塞的释放(图5B，C)，证实需要Mac-1来稳定血栓。然而，抗-M7的抑制不引起血管阻塞时间的显著变化或血栓栓塞的释放，提出参与途径不受影响。因此，通过非特异性阻断Mac-1，但不是通过CD40L/Mac-1相互作用的特异性抑制来减少白细胞-血小板聚集体的形成(图5D)。这些数据提出抗M7可能不诱导对止血系统的不想要的效应。

实施例7

Mac-1与CD40L的相互作用而非与其他配体的相互作用改善皮肤创伤愈合。白细胞接合是创伤愈合中的关键步骤，并且在Mac-1无效小鼠中已经报道了创伤愈合的延迟。为了测试这些效应是否由Mac-1与CD40L的相互作用介导，我们在诱导4mm背部皮肤创伤后直接i.p.注射抗M7、抗Mac-1或相应同种型对照的Fab片段处理C57Bl/6小鼠。令人感兴趣的是，在实验的时间过程中，没有检测到抗Mac-1处理的小鼠的延迟创伤愈合。然而，在抗-M7处理的小鼠中，在Kaplan-Maier创伤闭合分析中皮肤创伤趋于更快地闭合，并且在创伤诱导后6天显示较小的创伤表面(图6A，B)。这指示CD40L/Mac-1相互作用的特异性抑制不影响皮肤创伤愈合，而是看起来对皮肤创伤愈合表现出保护作用。

实施例8

对Mac-1的非选择性抑制加重细菌败血症期间的细菌清除，炎症和存活，而其与CD40L的相互作用的特异性阻断改善细菌败血症期间的细菌清除、炎症和存活。

最近已经显示了具有Mac-1遗传缺陷的小鼠在细菌败血症期间表明降低的存活率，突出显示白细胞整联蛋白在宿主防御和细菌清除中的潜在作用。为了阐明在细菌性败血症期间Mac-1和CD40L的配体特异性阻断是否相当有益，进行了盲囊结扎和穿刺败血症(CLP)的模型。在CLP程序后20小时，定量在血液中循环的炎性和巡逻的单核细胞和基本炎症参数。令人感兴趣的是，CLP诱导炎性Gr-1⁺单核细胞向循环的强烈动员，达到IgG Fab片段处理的小鼠中所有单核细胞的约82.4±4.6％的炎性子集的百分比。该应答不受Fab抗Mac-1处理的影响(77.4±6.0％)，但几乎被Fab抗-M7处理逆转(56.8±3.7％，图7A)。在CLP期间，髓样细胞填充腹膜腔。通过流式细胞术鉴定侵入腹膜腔的粒细胞(F4/80-Gr-1⁺)(图7B)。抗Mac-1和抗-M7两者将粒细胞积累强烈减少59.9±12.2％和73.8±7.1％(分别对于抗Mac-1和抗-M7)(图7C)。抗M7治疗的抗炎作用进一步通过急性期蛋白SAA的强烈降低63.4±19.7％进一步反映(图7D)。值得注意的是，抗M7改善血浆中的细菌清除率，而抗Mac-1使血浆和腹膜腔两者中的细菌负荷恶化(图7E)。在CLP期间，在外周，例如肾和肺中观察到嗜中性粒细胞的积累。为了量化粒细胞向脾脏的运输，对肾脏切片中的粒细胞标志物Ly6G进行ICH(图7F)。值得注意的是，这两种抗整联蛋白疗法均防止嗜中性粒细胞聚集，在抗Mac-1处理的动物中具有更强的作用(图7F)。最后，评估了根据本发明的新配体特异性方法在幸免于败血症中是否有益。因此，诱导CLP并随后在诱导CLP操作后0、48和96小时用IgG，抗Mac-1和抗-M7的Fab制剂处理动物。使用Kaplan-Maier分析和时序检验计算存活率。与IgG对照处理的动物相比，用抗Mac-1处理的动物显示出显著降低的平均存活率(对于抗-Mac-1和IgG分别为CLP诱导后169小时后0％对6.7％)。值得注意的是，在研究结束时，抗-M7处理显示存活率40.0％(图8)，证明配体指导的治疗优于非特异性抑制。

实施例9

用抗-M7治疗改善心肌梗塞后受损心肌中炎性白细胞的浸润。在几天内心肌梗塞后发生炎性白细胞的累积。募集到梗塞心脏的炎性白细胞引起炎性应答，其加剧创伤愈合并在心肌梗塞后驱动心力衰竭。已经提出白细胞浸润的抑制代表治疗策略，但是不能获得此类策略。通过左前降支冠状动脉(LAD)手术结扎诱导小鼠心肌梗死并用抗M7处理后，在损伤的心肌中发现了较少的浸润性单核细胞和中性粒细胞，表达Mac-1的炎性白细胞的亚类。结果，抗M7减轻心力衰竭。

序列表

<110> 艾伯特-路德维格斯-弗赖堡大学

贝克IDI心脏和糖尿病研究院控股有限公司

<120> 针对MAC-1的抗体

<130> PWO00288ALB

<150> EP16175382.7

<151> 2016-06-21

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp His Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Leu

35 40 45

Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Ser Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR 1

<400> 2

Gln Glu Ile Ser Gly Tyr

1 5

<210> 3

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR 2

<400> 3

Ser Thr Ser

1

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR 3

<400> 4

Leu Gln Tyr Ala Ile Ser Pro Pro Thr

1 5

<210> 5

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链

<400> 5

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Thr Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Thr Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Leu Asn Tyr Tyr Asn Ser Thr Tyr Asn Phe Asp Phe Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1

<400> 6

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR 2

<400> 7

Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR 3

<400> 8

Ala Leu Asn Tyr Tyr Asn Ser Thr Tyr Asn Phe Asp Phe

1 5 10

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> peptide

<400> 9

Glu Gln Leu Lys Lys Ser Lys Thr Leu

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽M7

<400> 10

Glu Gln Phe Lys Lys Ser Lys Thr Leu

1 5

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 11

Val Met Glu Gln Leu Lys Lys Ala Lys Thr Leu Met Gln

1 5 10

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> peptide

<400> 12

Lys Leu Ser Leu Glu Lys Gln Thr Lys

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> peptide

<400> 13

Glu Glu Phe Arg Ile His Phe Thr

1 5

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽M1

<400> 14

Pro His Asp Phe Arg Arg Met Lys Glu Phe Val Ser Thr

1 5 10

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽M1

<400> 15

Asn Ile Asp Phe Gln Lys Met Lys Glu Phe Val Ser Thr

1 5 10

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽M8

<400> 16

Asp Glu Phe Arg Ile His Phe Thr

1 5

<210> 17

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> peptide

<400> 17

Val Met Glu Gln Leu Lys Lys Ser Lys Thr Leu Phe Ser

1 5 10

Claims (11)

1.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其

a) 结合Mac-1，

b) 特异性抑制CD40L与活化的Mac-1的相互作用，和

c) 不诱导整联蛋白由外向内信号传导，

其特征在于：它包含氨基酸序列分别为SEQ ID NO:2-4的LCDR 1-3和氨基酸序列分别为SEQ ID NO:6-8的HCDR 1-3。

2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于它不结合非活化的Mac-1。

3.根据权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于它限制炎性细胞因子的表达。

4.根据权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于它在活体显微术中在体外和在体内阻断白细胞募集。

5.根据权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于它不影响Mac-1的血栓和止血功能。

6.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于轻链的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1。

7.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于重链的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:5。

8.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于它选自下组：Fab片段、单链抗体、双抗体和/或纳米抗体。

9.药物组合物，其特征在于它包含药学活性量的根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其用于治疗炎症。

11.根据权利要求9所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗炎症。

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