ES2928791T3

ES2928791T3 - Anticuerpos contra Mac-1

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Publication number: ES2928791T3
Application number: ES16175382T
Authority: ES
Inventors: Andreas Zirlik; Dennis Wolf; Karlheinz Peter
Original assignee: Baker IDI Heart and Diabetes Institute Holdings Ltd; Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Current assignee: Baker IDI Heart and Diabetes Institute Holdings Ltd; Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Priority date: 2016-06-21
Filing date: 2016-06-21
Publication date: 2022-11-22
Anticipated expiration: 2036-06-21
Also published as: CN109219447A; CN109219447B; AU2017283071A1; US20190161550A1; US20210179717A1; WO2017220369A1; JP7114491B2; EP3260133B1; US10919967B2; EP3260133A1; JP2019522974A

Abstract

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una porción de unión a antígeno del mismo que a) se une a Mac-1, b) inhibe específicamente la interacción de CD40L con Mac-1 activado yc) no induce la señalización de integrina de afuera hacia adentro. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos contra Mac-1

En las últimas décadas se identificó la inflamación como fuerza motriz de muchas patologías, incluidas la aterosclerosis, la diabetes de tipo 2, la sepsis, el infarto de miocardio, las enfermedades autoinmunitarias y las enfermedades neurodegenerativas. Se ha propuesto como objetivo principal en estas patologías atacar la respuesta inflamatoria. Sin embargo, una de las principales limitaciones de estas estrategias sigue siendo que la respuesta inflamatoria es fundamental para la regeneración, la supervivencia y la defensa del huésped. Por lo tanto, una terapia antiinflamatoria segura y fiable representa una necesidad médica importante. Así lo ilustran los glucocorticoides, potentes inhibidores de la inflamación que comprometen la respuesta inmunitaria, o los inhibidores de la COX-2, que pueden inhibir la inflamación, pero presentan efectos perjudiciales para el sistema cardiovascular.

La inflamación es un proceso que implica el reclutamiento de leucocitos al lugar de la lesión mediado por integrinas leucocitarias, como la Mac-1 (aMp², CD11b/CD18). La Mac-1 es un potente factor de adhesión, susceptible de una rápida activación inflamatoria mediante un cambio conformacional que presenta una mayor afinidad con sus ligandos, lo que da lugar al rodamiento, la adhesión firme y la transmigración de los leucocitos al tejido inflamado. La Mac-1 es una potente diana en las enfermedades cardiovasculares y la inhibición terapéutica o genética de la integrina ha demostrado ser muy eficaz para prevenir la aterosclerosis, la formación de neoíntima y la glomerulonefritis trombótica. Además de su papel en la inflamación, Mac-1 se denominó inicialmente CR ("complement receptor", receptor del complemento) 3 por su capacidad de unirse a factores del complemento, como C3bi, lo que refleja su papel en la defensa del huésped, la cicatrización, la trombosis y otras funciones efectoras de las células mieloides. Este amplio repertorio de funciones efectoras se realiza mediante una amplia expresión en el linaje mieloide, incluidos los monocitos, los macrófagos y los neutrófilos, pero también en las células NK y, en menor medida, en los linfocitos activados. Su diversidad funcional se refleja, además, en la unión promiscua de ligandos a un amplio repertorio de proteínas y proteoglicanos, entre los que se encuentran ICAM-1, fibrinógeno, fibronectina, heparina, GPlba, RAGE, receptor de la proteína C endotelial (EPCR) y CD40L. Se ha propuesto que el antagonismo de la integrina es una diana prometedora en la inflamación. Sin embargo, su papel en la defensa del huésped y la trombosis puede limitar su uso clínico.

El ligando CD40 (CD40L) es una molécula transmembrana de interés crucial en la transducción de señales celular en la inmunidad innata y adaptativa. Es expresado por una diversidad de células, pero principalmente por los linfocitos T activados y las plaquetas. El CD40L puede escindirse en una forma soluble (sCD40L) que tiene una actividad similar a la de las citocinas. Ambas formas se unen a varios receptores, incluido el CD40. Esta interacción es necesaria para la respuesta inmunitaria específica de antígeno. El CD40L se une también a diferentes receptores, siendo el Mac-1 (aMp2) uno de ellos, por lo que dicha interacción desempeña un papel en la formación de la neoíntima arterial, el reclutamiento de leucocitos y la aterosclerosis, la patogénesis de la aterotrombosis, la adhesión de monocitos y la infiltración de neutrófilos y la liberación de citocinas proinflamatorias (IL-8, IL-6).

Mac-1 es un factor de adhesión clásico implicado en una diversidad de patologías inflamatorias. A pesar de su efecto estimulante del reclutamiento de leucocitos en la aterosclerosis y la inflamación peritoneal, la terapia dirigida a Mac-1 está limitada por diversos efectos secundarios, como la alteración de la cicatrización y la defensa del huésped. Esto se refleja también en la deficiencia de adhesión leucocitaria ("Leukocyte Adhesion Deficiency", LAD) humana, que se caracteriza por un defecto de la integrina Mac-1, LFA-1 y CD11c en la subunidad p que perjudica la defensa del huésped. Por lo tanto, los intentos inespecíficos de inhibir terapéuticamente la Mac-1 no parecen ser favorables. Para eludir estas limitaciones se proporcionan nuevos anticuerpos monoclonales que se dirigen específicamente a la unión de CD40L con el principal dominio I de unión al ligando de Mac-1 dentro de la subunidad aM de la integrina. El CD40L representa un agonista sesgado para el Mac-1, que media en su función proinflamatoria al actuar como factor de adhesión endotelial para el CD40L, pero no por la activación de las vías de transducción de señales desde el exterior. La unión CD40L/Mac-1 no interfiere con la unión CD40L-CD40 o Mac-1-GP1 balfa y Mac-1-ICAM-1, lo que sugiere la existencia de epítopos de unión exclusivos en cada una de las superficies de las proteínas.

Las integrinas son importantes receptores de la adhesión que transmiten señales de forma bidireccional a través de la membrana plasmática, desempeñando un papel importante en diversos procesos biológicos, incluida la respuesta inmunitaria. Las integrinas contienen dos subunidades a y p de glicoproteína transmembrana de tipo 1 asociadas de forma no covalente; cada subunidad contiene grandes dominios extracelulares, un único dominio transmembrana y un dominio citoplasmático corto. La capacidad del dominio extracelular de la integrina para unirse a los ligandos depende de una confirmación abierta-extendida de la subunidad aM ("activación") y regula la adhesión celular y la transducción de señales, tanto desde el exterior ("outside-in") como desde el interior ("inside-out"). La presente invención se refiere a una modificación específica de la interacción entre CD40L y la integrina aMp²(Mac-1).

El documento EP 2 444 101 se refiere a la búsqueda selectiva de la interacción CD40L/Mac-1. Sin embargo, los anticuerpos divulgados en esta referencia no inducen la transducción de señales desde el exterior de la integrina.

Takami et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol. (2001), C1045-C1056, se refiere a la fosforilación de la tirosina dependiente de Mac-1 durante la adhesión de los neutrófilos. Los datos divulgados en esta publicación demuestran que la transducción de señales desde el exterior es una consecuencia de la adhesión de los leucocitos y de la unión del ligando, que es un mecanismo establecido en el campo.

Se ha descubierto que la inactivación de distintas funciones de las integrinas implicadas en las vías inflamatorias, pero no en las regenerativas o inmunitarias, podría lograrse bloqueando selectivamente la interacción de Mac-1 con ligandos específicos, sin afectar a otros.

Se han construido anticuerpos monoclonales, dirigidos específicamente al motivo de unión EQLKKSKTL (SEQ ID NO:9) en Mac-1, que los inventores han demostrado que es necesario para la unión a su ligando adhesivo y proinflamatorio CD40L.

La presente invención proporciona, por tanto, anticuerpos monoclonales aislados, o sus porciones de unión al antígeno, tal como se define además en las reivindicaciones, que inhiben el reclutamiento de leucocitos sin efectos secundarios no deseados. Dichos anticuerpos, o sus porciones de unión al antígeno:

a) se unen a Mac-1,

b) inhiben específicamente la interacción de CD40L con Mac-1 activado, y

c) no inducen la transducción de señales desde el exterior de la integrina.

En el desarrollo de la presente invención se han construido anticuerpos monoclonales por lo que la realización más preferida es el anticuerpo que aparece a continuación denominado anti-M7. Se ha determinado la secuencia del anticuerpo y se han identificado las CDR. Con esta información y los estudios de unión computacionales y convencionales es posible proporcionar otros anticuerpos adecuados, o sus fragmentos de unión al antígeno, que se derivan de este anticuerpo. Dado que la tecnología de los anticuerpos ha cobrado mucho interés en el ámbito terapéutico, existen varios fragmentos de anticuerpos diseñados disponibles que pueden utilizarse en la práctica. La expresión "anticuerpo monoclonal, o su fragmento de unión al antígeno" se entiende en un sentido amplio e incluye, por tanto, no solo los fragmentos Fab, sino también los fragmentos Fv monocatenarios (scFv), los diacuerpos, que pueden ser biespecíficos, los fragmentos biespecíficos monocatenarios, los triacuerpos, los tetracuerpos o los minicuerpos. La información de la secuencia proporcionada en este documento también puede utilizarse para producir nanocuerpos derivados de inmunoglobulinas de camello. Muchas de esas estructuras se resumen en el artículo de análisis de Holliger et al. (Nature Biotechnology, vol. 23, n.° 9 (2005), págs. 1126-1136).

Es una propiedad preferida de los anticuerpos monoclonales aislados, o de sus porciones de unión al antígeno, que se unan a Mac-1, aunque, sin embargo, se prefiere la unión a la Mac-1 activada, mientras que las estructuras de anticuerpos de la presente invención no deben unirse a la Mac-1 no activada. La distinción entre Mac-1 activada y no activada puede realizarse cuantificando la cinética de unión como, por ejemplo, se describe en Li et al. (Journal of Immunology (2013), págs. 4371-4381).

Otra realización preferida de los anticuerpos monoclonales aislados, o de sus porciones de unión al antígeno, de la presente invención es que limitan la expresión de citocinas inflamatorias.

Otra propiedad preferida de los anticuerpos monoclonales aislados, o de sus porciones de unión al antígeno, es que bloquean el reclutamiento de leucocitos in vitro y preferiblemente in vivo. Dicho bloqueo puede ser observado y medido en microscopía intravital como se muestra en los ejemplos de la presente solicitud.

Otra realización preferida de los anticuerpos monoclonales, o de sus porciones de unión al antígeno, es que las funciones trombóticas y hemostáticas de Mac-1 no se ven afectadas. Esto puede medirse mediante experimentos in vivo adecuados.

La realización preferida divulgada en el presente documento denominada anti-M7 se produjo como un anticuerpo monoclonal en el sistema de ratón. Los expertos saben que los anticuerpos monoclonales murinos no pueden utilizarse en la terapia de seres humanos, ya que tras la administración repetida de dichos anticuerpos murinos se generan anticuerpos antimurinos en el paciente. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales, o sus porciones de unión al antígeno, son preferentemente humanizados. La humanización significa que el marco de ratón del anticuerpo se sustituye por una estructura de marco humana de un anticuerpo que tiene una gran similitud con el anticuerpo de ratón. Mediante el uso de modelos informáticos adecuados se pueden realizar más adaptaciones de la estructura de aminoácidos para reducir el carácter de ratón del anticuerpo. Sin embargo, hay que comprobar si los cambios propuestos en la secuencia de aminoácidos reducen la fuerza de unión del anticuerpo humanizado o de la construcción de unión al antígeno. Solo se realizan las sustituciones de aminoácidos que no afectan negativamente a las propiedades de unión y, en concreto, a la especificidad.

Se supone que tales anticuerpos modificados, o sus porciones de unión al antígeno, deben comprender CDR. Se divulgan las CDR y tienen las SEQ ID NO:2-4 en la cadena ligera y 6-8 en la cadena pesada, respectivamente. Los anticuerpos monoclonales, o sus porciones de unión al antígeno, según la presente invención comprenden seis CDR que tienen las secuencias de SEQ ID NO:2-4 y 6-8, respectivamente.

La cadena ligera del anticuerpo anti-M7 tiene la secuencia de aminoácidos proporcionada en la SEQ ID NO:1 y la cadena pesada corresponde a la SEQ ID NO:5. Como ya se ha explicado anteriormente, en el transcurso de la humanización se introducen cambios en la secuencia de aminoácidos. En realizaciones preferidas, los anticuerpos monoclonales aislados o las porciones de unión al antígeno de la presente invención tienen una cadena ligera que tiene una identidad de aminoácidos de al menos el 80 %, preferentemente de al menos el 85 %, más preferentemente de al menos el 90 % y preferentemente en concreto de al menos el 95 % de identidad con SEQ ID ⁿO:1.

En realizaciones preferidas, los anticuerpos monoclonales aislados o las porciones de unión al antígeno de la presente invención tienen una cadena pesada que tiene una identidad de aminoácidos de al menos el 80%, preferentemente de al menos el 85 %, más preferentemente de al menos el 90 % y preferentemente en concreto de al menos el 95 % de identidad con SEQ ID NO:5.

El término "identidad" significa que la secuencia de la secuencia murina original y la secuencia de la construcción humanizada se comparan entre sí. Una identidad del 90 %, por ejemplo, significa que el 90 % de los aminoácidos son idénticos en las posiciones de aminoácidos de la secuencia original del ratón y de la correspondiente secuencia humanizada.

Los anticuerpos monoclonales aislados, o sus porciones de unión al antígeno, de la presente invención pueden utilizarse preferentemente en composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad farmacéuticamente activa del anticuerpo, o de su porción de unión al antígeno, junto con aditivos adecuados para la aplicación a un paciente, siendo especialmente preferida la aplicación intraperitoneal. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden utilizarse preferentemente para la inhibición de la inflamación.

Resultó que los anticuerpos monoclonales, o sus porciones de unión al antígeno, según la presente invención pueden utilizarse preferentemente en el tratamiento de las complicaciones inflamatorias posteriores al infarto de miocardio. En estas complicaciones, que aparecen con frecuencia tras un infarto de miocardio, los leucocitos inflamatorios atraídos a la zona afectada por el infarto de miocardio provocan y contribuyen a una respuesta inflamatoria que agrava la cicatrización y puede inhibir la recuperación tras el infarto de miocardio. En tales realizaciones se utilizan preferentemente los anticuerpos y sus porciones de unión al antígeno según la presente invención.

La inhibición de la inflamación por el anti-M7 o sus derivados proporciona varias ventajas sobre una terapia convencional anti-Mac-1. Se ha observado que los ratones tratados con los anticuerpos anti-Mac-1 conocidos anteriormente mostraban una mayor mortalidad en comparación con los ratones de control. Estos datos confirman estudios anteriores en los que los ratones deficientes en Mac-1 no estaban protegidos frente a la sepsis bacteriana, un efecto causado probablemente por la incapacidad de unirse a los factores del complemento y estimular la eliminación de las partículas bacterianas, por ejemplo, mediante la fagocitosis mediada por C3bi.

Estudios previos de cartografiado de epítopos han revelado y localizado la unión de C3bi a los restos P147-R152, P201-K217, y K245-R261 dentro del dominio I de aM, que demuestra un epítopo de unión que es distinto de la secuencia de unión requerida para CD40L (E162-L170). Se ha demostrado que los ratones tratados con anti-M7 muestran una mayor supervivencia en comparación con los ratones tratados con anti-Mac-1 e IgG-control, lo que indica que el anti-M7 no solo carece de propiedades perjudiciales, sino que induce efectos protectores.

Se supone que la supresión de la adhesión leucocitaria proinflamatoria en el peritoneo ayuda a frenar la abrumadora respuesta proinflamatoria que acompaña al intento inicial de eliminar y combatir la invasión bacteriana. Se reconoce que el equilibrio entre las vías de protección y las de agravamiento de la enfermedad se ve alterado en muchos trastornos y que podría desplazarse hacia el lado protector limitando el reclutamiento de leucocitos. Esta hipótesis se ve respaldada por el hecho de que el anti-M7 protegió frente a los niveles de citocinas proinflamatorias en el plasma en comparación con los animales de control, mientras que el anti-Mac-1 elevó los niveles de citocinas. Así pues, la reducción de los niveles de citocinas puede ser secundaria a la disminución de la activación de los leucocitos y la activación en los tejidos diana. De hecho, las células mononucleares de la íntima producen citocinas proinflamatorias, como TNFa, IL-1, IFNy, así como mediadores antiinflamatorios IL-10. En el plasma, los ratones expuestos a TNFa y tratados con el anticuerpo anti-M7 mostraron una reducción de las citocinas proinflamatorias IL-6, TNFa y MCP-1, mientras que el anti-Mac-1 indujo una mayor expresión de citocinas.

Sin embargo, el tratamiento con otros anticuerpos anti-Mac-1, como el clon M1/70 (que se utiliza como control), podría no reflejar completamente la inactivación genética. Cabe mencionar que M1/70 induce una fuerte respuesta proinflamatoria en las células que expresan Mac-1, en concreto en los macrófagos, y eleva la expresión de citocinas. Esto último también lo confirman los resultados de los presentes inventores, que demuestran que una sola inyección de anti-Mac-1 provoca un fuerte aumento de los niveles plasmáticos de citocinas, lo que probablemente afecta a la cicatrización. Se ha sugerido que la sobreestimulación proporcionada por M1/70 podría representar una estrategia factible para resolver la inflamación mediante la activación de las vías apoptóticas. De hecho, se ha demostrado previamente que la apoptosis de las células residentes en la cavidad peritoneal se potenciaba tras una única inyección de anti-Mac-1 clon M1/70. Esto podría respaldar el efecto del anti-Mac-1 en la disminución de la acumulación de células peritoneales. Sin embargo, una terapia que induzca la apoptosis, acompañada de una tormenta de citocinas, es probablemente desfavorable en la práctica clínica.

Mac-1 admite la interacción con múltiples moléculas distintas y es probable que haya más que no se hayan descubierto hasta ahora. Se han descrito más de 40 interacciones con proteínas diferentes, pero solo se conocen las propiedades de unión molecular de algunas de ellas. Por lo tanto, no hay que excluir que el sitio de unión de CD40L sea compartido también por otros ligandos. Sin embargo, los datos presentados en el presente documento revelan y confirman indicios anteriores de que la unión de CD40L a Mac-1 no comparte muchas características con las propiedades de unión a otros ligandos convencionales:

(1) Mientras que los epítopos de unión identificados para el fibrinógeno y otros ligandos muestran regiones solapadas, el motivo EQLKKSKTL (SEQ ID NO:9) dentro del dominio I de Mac-1 no está implicado en la unión de ligandos alternativos,

(2) El propio CD40L o anti-M7 no indujeron la transducción de señales desde el exterior de la integrina, mientras que esta característica de la fisiología de la integrina ha sido considerada hasta ahora como paradigma en la unión del ligando de la integrina,

(3) La interacción de CD40L con Mac-1 no se extiende a la función inmunitaria o hemostática, mientras que la mayoría de los ligandos de Mac-1, como el fibrinógeno, están implicados en múltiples de esas patologías.

Los datos presentados en el presente documento proponen que la interacción de CD40L con Mac-1 es ante todo necesaria para la adhesión firme de leucocitos inflamatorios, supuestamente de granulocitos en una diversidad de patologías inflamatorias. Los resultados no descartan, sino que subrayan que la función inmunitaria, los parámetros hemostáticos y la respuesta regenerativa no implican la unión de CD40L a Mac-1.

Se ha demostrado previamente que el tratamiento con el inhibidor específico de la interacción CD40L/Mac-1, cM7, atenúa el reclutamiento de leucocitos inflamatorios en un modelo de microscopía intravital en vénulas de cremáster inflamado, y en un modelo de peritonitis estéril. Se ha demostrado que el tratamiento con el anticuerpo IgG completo anti-M7 o con sus fragmentos Fab dirigidos al sitio de unión a CD40L en Mac-1 reduce significativamente la adhesión de leucocitos. Curiosamente, la eficacia inhibidora del anti-M7 es comparable a la del tratamiento con anti-Mac-1, lo que sugiere que la interacción CD40L/Mac-1 es decisiva para el reclutamiento de leucocitos. Esto no falsea los informes anteriores, sino que amplía el repertorio de ligandos de Mac-1 expresados en el endotelio, ICAM-1 y RAGE, por CD40L. En este sentido, es plausible que los patrones de contrarresto de la unión al receptor dependan de las patologías y de la carga inflamatoria. Por lo tanto, es posible que la interacción de CD40L y Mac-1 sea específica de enfermedad y esté regulada por la expresión de CD40L endotelial, por el cambio conformacional de Mac-1, o que algunas patologías sean más dependientes de la invasión leucocitaria que otras. Por ejemplo, la aterosclerosis (una enfermedad en la que es necesario el reclutamiento de células mieloides al menos en los primeros estadios de la enfermedad) fue muy susceptible al bloqueo de la interacción CD40L/Mac-1, mientras que la formación de neoíntima después de una lesión por cable no fue inhibida con el bloqueo de CD40L/Mac-1, sino con anti-Mac-1 o en ratones con inactivación de Mac-1.

Los datos obtenidos en el desarrollo de la presente invención muestran que el anti-M7 fue más eficaz en el bloqueo de la interacción con la Mac-1 activada, pero no con la Mac-1 no activada. Esto propone que la interacción puede desempeñar un papel más importante en las patologías asociadas a una mayor carga inflamatoria, más que en las condiciones basales.

También queda por responder si un anticuerpo como el anti-M7 puede modular activamente o conservar diferentes conformaciones de la integrina como se ha propuesto anteriormente. Esto podría explicar que solo la integrina permanentemente activada, pero no la integrina en estado nativo, fuera la diana, como muestran los datos. Sin embargo, para determinar las propiedades de unión exactas puede ser útil un análisis estructural más detallado.

Por último, no se puede excluir que la interacción CD40L/Mac-1 pueda ser responsable de la salida y movilización de monocitos desde la médula ósea o el bazo, como se ha sugerido previamente. Como se ha observado en este caso, la monocitosis inflamatoria durante la sepsis podría revertirse completamente con el tratamiento con anti-M7. En otros experimentos se determinará si esto se debe a una alteración de los reservorios de monocitos, por ejemplo, por una alteración de la migración al bazo.

Los anticuerpos de la presente invención siguen una estrategia para dirigirse selectivamente al motivo de unión EQLKKSKTL (SEQ ID N^o:9), que representa el sitio de unión de CD40L dentro del dominio I de Mac-1, mediante un anticuerpo monoclonal anti-M7. Este anticuerpo es altamente selectivo para el sitio de unión al que se dirige, no interfiere con los socios de unión alternativos y, a diferencia de los anticuerpos anti-Mac-1 convencionales, no afecta a la hemostasia, a la defensa del huésped ni a la cicatrización. En realizaciones preferidas, los anticuerpos de la presente invención no interfieren con socios de unión alternativos y, por lo tanto, son altamente selectivos para el sitio de unión al que se dirigen. La terapia antiintegrina dirigida a ligandos que se propone es superior a un enfoque no selectivo y representa una ventaja para perfeccionar y ajustar la terapia antiintegrina contra la enfermedad inflamatoria.

Los resultados, los experimentos y las ventajas obtenidas por la presente invención se resumen en las figuras y en los ejemplos. Cualquier referencia a un método de tratamiento del cuerpo humano o animal debe interpretarse como los compuestos y la sustancia para su uso en dicho tratamiento.

La figura 1 demuestra que un anticuerpo monoclonal de ratón generado contra el sitio de unión a CD40L dentro de Mac-1 humana, anti-M7, es eficaz para dirigirse a la integrina humana. La secuencia peptídica M7 dentro de la Mac-1, necesaria para la unión de CD40L, es un motivo de unión altamente conservado entre la integrina humana (SEQ ID NO:9) y la murina (SEQ ID NO:10) (figura 1A).

Además, la figura 1A muestra el péptido M1 de origen humano (SEQ ID NO:14) y el correspondiente péptido M1 derivado de Mus musculus que tiene la SEQ ID NO:15. El péptido humano que tiene la denominación M8 corresponde a la SEQ ID NO:13 y el péptido M8 derivado de Mus musculus tiene la SEQ ID NO:16.

El anticuerpo anti-M7 generado por inmunización de ratones con el péptido de unión VMEQLKKAKTLMQ (SEQ ID NO:11) acoplado al toxoide diftérico se unió a una línea celular CHO que sobreexpresaba Mac-1 nativa (WT) y permanentemente activada (del), pero no a células CHO de control en una transferencia Western (figura 1B).

Se analizó la unión específica del anticuerpo anti-M7 a los péptidos inmovilizados M7 (EQLKKSKTL) (SEQ ID NO:9), sM7 (KLSLEKQTK) (SEQ ID NO:12), y M8 (EEFRIHFT) (SEQ ID NO:13) en una unión en fase sólida con péptidos inmovilizados (figura 1C).

La unión se cuantificó mediante la unión de IgG antimurina biotinilada y la reacción de color tras la incubación con estreptavidina acoplada a HRP. La unión específica se calculó restando la unión de la IgG de ratón a los péptidos. El anti-M7 se acopló con el fluorocromo Alexa647 y se cuantificó la unión a subconjuntos de leucocitos humanos en FACS. El anticuerpo de isotipo Alexa647 actuó de control (figura 1D).

La figura 2 demuestra que el anti-M7 bloquea selectivamente la interacción de la Mac-1 permanentemente activada con CD40L, pero no de la integrina nativa o a ligandos alternativos de la Mac-1. Las células CHO que sobreexpresan el mutante de Mac-1 permanentemente activada (Mac-1-del) se adhirieron al CD40L inmovilizado en un ensayo de adhesión estática (figura 2A, 2B).

Las células se incubaron con anti-M7 o con el clon de referencia de panbloqueo del dominio I humano 2LPM19c 15 min antes de la adhesión. Como alternativa, se analizó la adhesión de la integrina Mac-1 nativa y no activada (figura 2C). Para excluir la interacción inespecífica mediada por Fc, se utilizó una preparación de fragmentos Fabde anti-M7 o anti-Mac-1 como inhibidor (figura 2D).

Para analizar si el anti-M7 es específico para el CD40L, se inmovilizó por separado un panel de ligandos clásicos de Mac-1 y se cuantificó la adhesión de células CHO con Mac-1 permanentemente activada en presencia del anti-M7 o del anti-Mac-1 panbloqueo del dominio I (figura 2E).

La figura 3 demuestra que el Anti-M7 no induce la transducción de señales desde el exterior de la integrina, mientras que los anticuerpos anti-Mac-1 convencionales inducen la activación de las MAP-cinasas y la expresión de citocinas inflamatorias in vitro e in vivo.

Se aislaron macrófagos murinos mediante inyección de tioglicolato al 4 % en el peritoneo de ratones C57BI/6 e incubación durante 72 horas. Las células peritoneales se recogieron mediante lavado peritoneal, y el análisis FACS confirmó una pureza de >90 % de macrófagos F4/80+. Los macrófagos se cultivaron en RPMI FCS al 5 % durante la noche y se estimularon con 10 pg/ml de IgG de ratón, anti-Mac-1 humana (clon 2LPM19c), anti-Mac-1 de ratón (clon M1/70) o anti-M7 durante 30min. Las células se lisaron y se visualizó la fosforilación de ERK1/2, NfkB y p38 mediante transferencia Western (figura 3A), y se calculó la proporción de fracciones fosforiladas (figura 3B). Los valores se calcularon como unidades arbitrarias (UA) relativas normalizadas con respecto a la señal de las células estimuladas solo con solución salina. Se inyectaron clones de anticuerpos Mac-1 i.p. en ratones y se midió la concentración sérica de IL-6, TNFa y MCP-1 mediante una matriz de esferas citométricas 4 horas después de la inyección (figura 3C). Como control se utilizó el anti-Mac-1 clon 1/70.

La figura 4 demuestra que el tratamiento con anti-M7 evita el reclutamiento de leucocitos inflamatorios in vitro e in vivo y disminuye la expresión de citocinas inflamatorias. Se permitió que las células RAW murinas se adhirieran a las células endoteliales murinas aisladas y cebadas con TNFa in vitro en un ensayo de cámara de flujo. El número de células adheridas se cuantificó en presencia de un anticuerpo anti-M7 o IgG antimurino (figura 4^a). Los ratones C57BI/6 fueron inyectados con 200 ng de TNFa i.p. para inducir la inflamación peritoneal y mesentérica. Simultáneamente, se inyectaron preparaciones de fragmentos Fab de control de isotipo de IgG o de anti-Mac-1 antimurino (clon M1/70). El reclutamiento de leucocitos a las vénulas mesentéricas inflamadas se controló mediante microscopía intravital 4 horas después de la inyección (figura 4B). Se cuantificó el número de leucocitos adheridos y rodantes, así como la velocidad de rodamiento de los leucocitos, mostrada como la frecuencia acumulada (figura 4C-E). Los ratones que expresan GFP en monocitos (CX3CR1-GFP) fueron sometidos a microscopía intravital en presencia de preparaciones de Fab de IgG o de anti-M7 (figura 4F). Se cuantificaron los monocitos migrados (flechas blancas) en el espacio paravascular en el campo de visión (figura 4G). Los niveles de citocinas en el plasma de los ratones sometidos a microscopía intravital tras el tratamiento con Fab de IgG o de anti-M7 se evaluaron mediante una matriz de esferas de CBA (figura 4H).

La figura 5 demuestra que el anti-M7 no afecta a la trombosis venosa ni a la función efectora de las plaquetas in vivo. Se indujo la trombosis venosa en vénulas mesentéricas de ratones C57BI/6 mediante cloruro férrico. La formación de trombos se visualizó mediante tinción de rodamina in vivo en microscopía intravital (figura 5A). Se controló y cuantificó el tiempo hasta la oclusión del trombo en el vaso y la tasa de émbolos (/min) (figura 5B, 5C). Los ratones fueron tratados con una preparación de Fab de IgG de ratón, de anti-M7 o de anti-Mac-1 (50 |jg) por inyección intraperitoneal 15 min antes de la inducción del trombo. La formación de agregados de plaquetas-monocitos se cuantificó mediante la detección de monocitos CD41 en citometría de flujo tras el tratamiento con clones de anticuerpos anti-Mac-1 (figura 5D).

La figura 6 demuestra que la inhibición específica de la interacción de Mac-1 con CD40L, pero no con otros ligandos, mejora la cicatrización de la piel. Se indujeron heridas asépticas en la piel con un punzón de biopsia de 4 mm tras la inyección de preparaciones de Fab de anti-Mac-1 o de anti-M7. Después de 6 días se fotografiaron las heridas de la piel (figura 6A) y se calculó el área de la herida (figura 6B).

La figura 7 demuestra que el anti-M7 mejora la defensa del huésped, la eliminación de bacterias y la inflamación durante la sepsis bacteriana, mientras que el bloqueo inespecífico de Mac-1 potencia la bacteriemia en ratones. Para comprobar si el bloqueo de Mac-1 o, específicamente, del sitio de unión a CD40L afecta a la defensa del huésped y a la inflamación durante la sepsis bacteriana, se indujo la sepsis por ligadura cecal y punción ("coecal-ligation and puncture", CLP). Veinte horas después del procedimiento de CLP se cuantificaron los monocitos inflamatorios y de patrulla que circulaban en la sangre mediante citometría de flujo (figura 7A). Los granulocitos (F4/80'Gr-1+) que invaden la cavidad peritoneal se identificaron mediante citometría de flujo (figura 7B) y se calculó su número total (figura 7C). Se cuantificaron los niveles de la proteína de fase aguda SAA (figura 7D) y de los títulos de LPS bacterianos (figura 7E) en el plasma. La acumulación de granulocitos en el parénquima renal se determinó mediante la tinción frente a DAP y Ly6G (figura 7F) y se cuantificó como proporción de granulocitos/núcleos celulares totales (figura 7G).

La figura 8 demuestra que el anti-M7 mejora, mientras que el anti-Mac-1 disminuye, la supervivencia durante la sepsis por CLP. Se indujo la sepsis por ligadura cecal y punción (CLP). Para evaluar si el tratamiento con clones de anticuerpos Mac-1 afecta a la supervivencia, se trató a los ratones mediante una inyección intraperitoneal con preparaciones de Fab de anti-Mac-1 o de anti-M7 a las 0, 48 y 96 horas después de la inducción de la sepsis por CLP. Se calculó la supervivencia relativa y se muestra como la curva de supervivencia de Kaplan-Maier.

La figura 9 demuestra que el tratamiento con anti-M7 bloquea la infiltración de leucocitos inflamatorios en el miocardio lesionado tras un infarto de miocardio. El infarto de miocardio fue inducido por una ligadura quirúrgica de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (DAI). Se cuantificaron los leucocitos infiltrados en el miocardio infartado mediante citometría de flujo en corazones digeridos tras un infarto de miocardio. Los anti-M7 disminuyeron la infiltración de monocitos y neutrófilos y atenuaron la insuficiencia cardíaca evaluada por ecocardiografía.

Los resultados resumidos en la figura se obtuvieron en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Ratones macho con un trasfondo de C57BL/6N recibieron una dieta de pienso convencional. Todos los ratones se mantuvieron en condiciones convencionales (ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad) y tuvieron acceso libre a comida y agua. A la edad de 8 semanas, los ratones fueron sometidos a una microscopía intravital, a la cicatrización 0 a la sepsis por CLP, según lo indicado. El tratamiento con anticuerpos se realizó por inyección intraperitoneal en la concentración indicada a un volumen de 100 j l por inyección. En algunos experimentos intravitales, se utilizaron animales con transgenes GFP bajo el control del promotor CXCR3 (CXCR3-GFP) para seguir a los leucocitos. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el comité de ética animal del Alfred Medical Research and Education Precinct (AMREP), Melbourne, Australia y el comité local de ética animal de la Universidad de Friburgo. Todos los procedimientos se llevaron a cabo según las directrices institucionales.

Se obtuvo un anticuerpo específico para un péptido correspondiente a la secuencia V160-S172 del dominio I de Mac-1 inmunizando ratones con el péptido C-Vm EQLKKSkTlFS-NH2 (SEQ ID NO:17) acoplado a toxoide diftérico (Monash Antibody Technologies Facility, Monash University, Melbourne, Australia). Se emplearon ensayos de unión en fase sólida para examinar la unión de los sueros al péptido M7 inmovilizado. Entre los diferentes clones que se unen con alta afinidad a M7, se caracterizó el clon preferido RC3 (denominado anti-M7).

Ejemplo 2

Un anticuerpo monoclonal de ratón generado contra el sitio de unión a CD40L dentro del Mac-1 humano, el anti-M7, es eficaz para dirigirse a la integrina humana.

Se ha demostrado previamente que CD40L se une selectivamente al motivo EQLKKSKTL (SEQ ID NO:9) dentro del dominio principal de unión al ligando de Mac-1. Para obtener un inhibidor específico del sitio de unión humano, se inmunizaron ratones con el péptido humano V160-S172 que contiene el péptido de unión M7. Curiosamente, la secuencia M7 estaba muy conservada entre la secuencia de la proteína humana y la murina (figura 1A). Entre varios clones de hibridoma con alta afinidad de unión del sobrenadante correspondiente al péptido M7 inmovilizado en un ensayo de unión en fase sólida, el clon RC3 (IgG2bk de ratón) mostró una inhibición específica de la unión Mac-1-CD40L, pero no de la interacción con otros ligandos. Este clon de anticuerpo, posteriormente denominado anti-M7, se unió a una línea celular CHO que sobreexpresaba Mac-1 nativa (WT) y permanentemente activada (del), pero no a las células CHO de control en una transferencia Western (figura 1B), lo que confirma la unión exitosa a la proteína diana.

Además, el anti-M7 se unió a los péptidos inmovilizados M7 (EQLKKSKTL) (SEQ ID NO:9), pero no a los péptidos de control competidores sM7 (KLSLEKQTK) (SEQ ID NO:12) o al péptido M8 (EEFRIHFT) (SEQ ID NO:13) en una unión en fase sólida (figura 1C), lo que indica que el anti-M7 se une específicamente al péptido inmunizado. Para comprobar la unión del anti-M7 a las células humanas que expresan Mac-1, se acopló el anticuerpo con el fluorocromo Alexa647 y se cuantificó la unión a subconjuntos de leucocitos humanos en citometría de flujo. Curiosamente, el anti-M7 mostró una unión dependiente de la concentración a los leucocitos humanos que expresan Mac-1, como los monocitos y los neutrófilos, pero no a los linfocitos, como se esperaba (figura 1D). La unión del clon M1/70 de anti-Mac-1 sirvió de control y mostró las mismas propiedades de unión con la mayor unión a las células mieloides. Estos resultados demuestran que la secuencia de unión M7 dentro del dominio I de Mac-1 humano es accesible a la unión con el anticuerpo monoclonal anti-M7. La secuenciación posterior del ADN reveló las CDR y la secuencia de proteína exacta de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de anti-M7. Esto se muestra en la tabla 1.

Ejemplo 3

Se analizó la unión específica del anticuerpo anti-M7 a los péptidos inmovilizados M7 (EQLKKSKTL) (SEQ ID NO:9), sM7 (KLSLEKQTK) (SEQ ID NO:12) y M8 (EEFRIHFT) (SEQ ID NO:13) en una fase sólida de unión con péptidos inmovilizados en placas ELISA de 96 pocillos (Nunc). La unión del anti-M7 se detectó mediante la adición de IgG antimurina biotinilada y la posterior reacción de color tras la incubación con estreptavidina acoplada a HRP y sustrato TMB. La unión específica se calculó restando la unión de la IgG de ratón a los péptidos. Para analizar la unión del anticuerpo anti-M7 a los leucocitos humanos, se marcó el anti-M7 con Alexa Fluor 647 según los protocolos del fabricante (Monoclonal Antibody Labeling Kit, Life Technologies). Se aislaron leucocitos humanos de donantes sanos mediante centrifugación y lisis de glóbulos rojos. Se estimularon los leucocitos con PMA (200 ng/ml), se incubaron con anti-M7-Alexa 647 (1 ^g y 5 ^g) y se cuantificó la unión del anticuerpo mediante citometría de flujo.

Se descubrió que el anti-M7 es un inhibidor específico de ligando y de la activación de la interacción de Mac-1 con CD40L.

Para analizar si el anti-M7 es capaz de bloquear funcionalmente la interacción de Mac-1 y CD40L, se analizó la adhesión de células CHO que sobreexpresan un mutante de Mac-1 permanentemente activada (Mac-1-del) a CD40L inmovilizado en un ensayo de adhesión estática. Curiosamente, el anti-M7 bloqueó la adhesión celular en un 65,6 ± 7,2 %, un efecto casi tan fuerte como el clon de referencia de panbloqueo de dominio I antihumano 2LPM19c (inhibición en un 92,7 ± 2,0 %, figura 2A, B). En el experimento se utilizó una concentración de 10 ^g /m l. De ello se deduce que, en general, se utilizan concentraciones del anticuerpo que varían de 1 a 50 ^g/ml y, preferentemente, de 5 a 20 ^g/ml. Lo más interesante es que, a diferencia del anticuerpo anti-Mac-1 de referencia, el anti-M7 no bloqueó la adhesión de las células CHO que expresaban la integrina Mac-1 nativa y no activada (figura 2C), lo que indica que el bloqueo por el anti-M7 era específico de la conformación de alta afinidad de la integrina. Además, la inhibición por el anti-M7 no se limitó a las proteínas humanas, ya que la interacción de los macrófagos murinos y el CD40L murino fue significativamente bloqueada por el anti-M7. Además, el bloqueo por el anti-M7 no fue causado de forma inespecífica por los fragmentos Fc del anticuerpo, ya que las preparaciones de fragmentos Fab de anti-M7 o de anti-Mac-1 fueron tan eficaces como la preparación de anticuerpos completos (figura 2D). Diferentes ligandos pueden unirse a regiones de unión separadas o solapadas dentro del dominio I de Mac-1. Para comprobar si el anti-M7 es específico para el epítopo de unión a CD40L, se inmovilizó por separado un panel de ligandos clásicos de Mac-1, como fibrinógeno, ICAM-1, NIF, heparina y RAGE, y se comprobó la unión de las células Mac-1-del en presencia de anti-M7 y anti-Mac-1 (figura 2E). De modo notable, el anti-Mac-1 bloqueó cada una de las interacciones, mientras que la capacidad de bloqueo del anti-M7 se limitó a CD40L. Estos datos revelan que el anti-M7 es un inhibidor eficaz y específico de la interacción CD40L/Mac-1.

Ejemplo 4

Los macrófagos peritoneales murinos se obtuvieron como se ha descrito anteriormente. La citometría de flujo reveló que la mayoría (>90 %) de las PEC eran positivas para el marcador de macrófagos F4/80. Tras una noche de inanición, los macrófagos fueron estimulados con los anticuerpos indicados contra Mac-1 a una concentración de 10 pg/ml durante 30 minutos. Después de los puntos temporales indicados, las células se lisaron, las proteínas se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de poli(difluoruro de vinilideno). La proteína total y la fracción fosforilada de NPkB, ERK1/2 y p38 se detectaron mediante la unión de anticuerpos específicos en una transferencia Western (Cell Signaling). La proporción de las fracciones fosforiladas se calculó y se expresó como unidades arbitrarias (UA) relativas normalizadas con respecto a la señal de las células estimuladas solo con solución salina.

Los resultados de la prueba demuestran que el anti-M7 no induce la transducción de señales de la integrina desde el exterior, mientras que los anticuerpos convencionales anti-Mac-1 inducen la activación de las MAP-cinasas y la expresión de citocinas inflamatorias in vitro e in vivo.

Los anticuerpos anti-Mac-1 convencionales inducen la activación de la integrina, lo que se denomina transducción de señales desde el exterior, mediada por la activación posterior de las MAP-cinasas, como ERK y p38 tras la unión del ligando y del anticuerpo. Se ha demostrado previamente que CD40L es un agonista sesgado que no induce acontecimientos de transducción de señales desde el exterior al unirse. Para comprobar si el anti-M7 induciría la activación de las células, se recogieron macrófagos peritoneales inducidos con tioglicolato de ratones C57BI/6 macho de 8 semanas de edad. Tras una noche de inanición en RPMI con FCS al 5 %, los macrófagos se estimularon con 10 pg/ml de IgG de ratón, anti-Mac-1 humana (clon 2LPM19c), anti-Mac-1 de ratón (clon M1/70) o anti-M7 durante 30 minutos. El tratamiento con anti-Mac-1 indujo la fosforilación de ERK y p38, cuantificada por una proporción elevada de los epítopos fosforilados en una transferencia Western (figura 3A), mientras que el anti-M7 no tuvo efectos, lo que indica que el epítopo de unión al que se dirige el anti-M7 no participa en la transducción de señales desde el exterior (figura 3^b). Para evaluar si este efecto es importante para un tratamiento in vivo, se inyectaron clones de anticuerpos Mac-1 i.p. en ratones y se cuantificó la concentración sérica de IL-6, TNFa y MCP-1 4 horas después de la inyección. Sorprendentemente, el clon de referencia Mac-1 M1/70 (control) elevó muchísimo los niveles de citocinas, mientras que el anti-M7 no lo hizo (figura 3C). En consecuencia, los niveles de citocinas proinflamatorias aumentaron en el cultivo in vitro de macrófagos tras la estimulación con anticuerpos. Estos resultados indican que el anti-M7 se dirige a un epítopo que no provoca una transducción de señales desde el exterior no deseada durante el bloqueo de la integrina.

Ejemplo 5

Antes de la digestión enzimática, el anticuerpo se dializó en un tubo de diálisis SnakeSkin de 10 k de MWCO (valor de corte de peso molecular) frente a PBS durante la noche a 4 °C. Se utilizó papaína inmovilizada para preparar fragmentos Fab de anti-M7, de anti-Mac-1 (clon M1/70) y de un control de isotipo IgG como se indica según las instrucciones del fabricante (Pierce Fab Preparation Kit, Thermo Scientific). Brevemente, los fragmentos Fab se generaron en presencia de cisteína 25 mM durante 3 h a 37 °C, seguido de la purificación en columnas de centrifugado de proteína A NAb. La pureza de los fragmentos Fab se evaluó mediante SDS-PAGE.

Se recubrieron placas de 96 pocillos (Nunc) con sCD40L (10 pg/ml) y se incubaron con células CHO que expresaban Mac-1 activada constitutivamente. Las células se preincubaron con anticuerpos de bloqueo (10 pg/mL) como se indica y se dejaron adherir durante 50 minutos. Se contaron las células adheridas tras repetidos lavados con PBS. Para los ensayos de adhesión dinámica, se cultivaron células endoteliales umbilicales humanas ("human umbilical endothelial cells", HUVEC) hasta la confluencia en placas de cultivo celular de 35 mm, se estimularon con TNFa durante la noche y se colocaron en un sistema de cámara de flujo paralelo (Glycotech). El número de células adheridas se cuantificó a la velocidad de cizallamiento indicada en presencia de los anticuerpos indicados (10 pg/mL).

Para la microscopía intravital los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 100 pg de anticuerpos o 50 pg de fragmentos Fab i.p. Después de 15 minutos los ratones recibieron una inyección i.p. de 200 ng de TNFa murino (R&D Systems). La cirugía se inició 4 horas después de la administración del TNFa. Brevemente, los ratones fueron anestesiados mediante una inyección intraperitoneal de clorhidrato de ketamina (Essex) y xilacina (Bayer, Leverkusen, Alemania). El mesenterio fue exteriorizado y colocado bajo un microscopio intravital vertical (AxioVision, Carl Zeiss). Se tomaron vídeos del rodamiento y la adhesión en vénulas mesentéricas tras la inyección retroorbital de rodamina.

El flujo de leucocitos rodantes se definió como el número de leucocitos que se desplazan a una velocidad inferior a la de los eritrocitos. Los leucocitos adherentes se definieron como células que permanecieron inmóviles durante al menos 30 segundos.

Citometría de flujo: Las células del exudado peritoneal ("peritoneal exudate cells", PEC) y los leucocitos de la sangre se obtuvieron como se describe a continuación. Los glóbulos rojos restantes se eliminaron por incubación con un tampón de lisado de glóbulos rojos (NH4CI 155 mM, K2HPO45,7 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,3). Las células se lavaron con PBS y se bloquearon los receptores Fc con anti-CD16/CD32 (eBioscience) durante 10 minutos en hielo. A continuación, las células se marcaron con los anticuerpos indicados antes de la cuantificación con un citómetro de flujo (FACS Calibur, BD Biosciences). Todos los anticuerpos se obtuvieron en eBioscience. Se identificaron distintas poblaciones de leucocitos en función de la expresión en la superficie celular de los antígenos indicados: granulocitos (Gr-1+F4/80"CD11b+CD115"), macrófagos (F4/80+CD11b+CD115‘), monocitos inflamatorios (CD11b+CD115+Gr-1+F4/80-), monocitos no inflamatorios (CD11b+CD115+Gr-1- F4/80-).

Aislamiento y cultivo de macrófagos peritoneales murinos: Los anticuerpos se inyectaron i.p. 30 minutos antes de que los ratones WT recibieran una inyección de 2 mL de caldo de tioglicolato al 4 % (Sigma). Se realizó un lavado peritoneal a las 72 horas. Las células del exudado peritoneal (PEC) se cuantificaron y caracterizaron mediante FACS como se ha descrito anteriormente. En los experimentos de CLP se realizó un lavado peritoneal 20 horas después de la cirugía.

Se pudo demostrar que el tratamiento con anti-M7 previene el reclutamiento de leucocitos inflamatorios in vitro e in vivo y disminuye la expresión de citocinas inflamatorias.

Mac-1 es un potente factor de adhesión, que probablemente media su función adhesiva a través de la interacción con diferentes ligandos expresados en el endotelio, incluidos ICAM-1, RAGE y CD40L. Para comprobar si el anti-M7 bloquea la adhesión celular, se permitió que células RAW similares a monocitos murinas se adhirieran a células endoteliales murinas aisladas y cebadas con TNFa in vitro en un ensayo de cámara de flujo. El número de células adheridas disminuyó tras la incubación con anti-M7, lo que indica que la interacción CD40L/Mac-1 es necesaria para la detención de los leucocitos (figura 3A). Para analizar la importancia de estos hallazgos in vivo, se inyectó i.p. una preparación de fragmentos Fab de anti-M7 y de un isotipo acorde antes de la microscopía intravital (figura 4^b). El reclutamiento de leucocitos a las vénulas mesentéricas inflamadas se controló tras la estimulación simultánea con TNFa durante 4 horas para inducir el reclutamiento de leucocitos inflamatorios. En consonancia con los resultados in vitro de los inventores, se observó que el número de leucocitos adheridos (figura 4C), pero no de leucocitos rodantes (figura 4D), se redujo tras la inyección de anti-M7. En cambio, la velocidad de rodamiento de los leucocitos, mostrada como frecuencia acumulada, no se modificó (figura 4E), lo que indica que la adhesión firme, pero no las propiedades de rodamiento de los leucocitos, es bloqueada por el anti-M7. Para excluir que el anti-M7 induzca una merma de leucocitos, se inyectó i.p. anti-M7 o un control de isotipo acorde, y se cuantificaron las poblaciones de leucocitos. Cabe destacar que no se observaron cambios en ambos grupos. Para analizar si la alteración de la detención de monocitos afectaría a los efectos posteriores, como la transmigración, ratones que expresan GFP en monocitos (CX3CR1-GFP) fueron sometidos a microscopía intravital en presencia de preparaciones de Fab de IgG o de anti-M7 después de una exposición a TNFa durante 4 horas (figura 4F). Conforme a ello, se observó que los animales tratados con anti-M7 mostraron un menor número de monocitos migrados al espacio perivascular (figura 4G). Por último, se observó que los niveles plasmáticos de las citocinas proinflamatorias TNFa, IL-6 y MCP-1 se redujeron significativamente en los ratones sometidos a microscopía intravital tras el tratamiento con Fab de anti-M7 en comparación con los animales de control tratados con Fab de IgG (figura 4H). Estos resultados indican claramente que la adhesión de los leucocitos se produce por la interacción de CD40L y Mac-1 y que esta interacción puede ser bloqueada funcionalmente por el anticuerpo anti-M7.

Ejemplo 6

También se ha demostrado que el anti-M7 no afecta a la trombosis venosa ni a la función efectora de las plaquetas in vivo.

Mac-1 participa en la hemostasia y la formación de trombos, supuestamente por su interacción con la glicoproteína plaquetaria GP1ba. Además, el CD40L estabiliza los trombos y su inhibición terapéutica aumenta las complicaciones tromboembólicas. Para excluir que un anticuerpo según la invención induzca una desestabilización no deseada de los trombos, se indujo la trombosis venosa en vénulas mesentéricas de ratones C57BI/6 mediante cloruro férrico. La formación de trombos se visualizó mediante tinción de rodamina in vivo en microscopía intravital (figura 5A). Como se ha descrito anteriormente, la inhibición de Mac-1 por unfragmento Fabinyectado i.p. prolongó el tiempo de oclusión del vaso y aumentó la liberación de émbolos trombóticos (figura 5B, C), confirmando que Mac-1 es necesaria para estabilizar los trombos. Sin embargo, la inhibición con anti-M7 no provocó cambios significativos en el tiempo de oclusión de los vasos ni en la liberación de émbolos trombóticos, lo que plantea que las vías participantes no se vieron afectadas. En consecuencia, la formación de agregados leucocitarios-plaquetarios disminuyó con el bloqueo inespecífico de Mac-1, pero no con la inhibición específica de la interacción CD40L/Mac-1 (figura 5D). Estos datos plantean que es probable que anti-M7 no induzca efectos no deseados en el sistema hemostático.

Ejemplo 7

La interacción de Mac-1 con CD40L, pero no con otros ligandos, mejora la cicatrización de la piel. El compromiso de los leucocitos es una etapa crítica en la cicatrización y se ha informado de un retraso en la cicatrización en ratones sin Mac-1. Para comprobar si estos efectos están mediados por la interacción de Mac-1 con CD40L, se trató a ratones C57BI/6 con inyecciones i.p. de fragmentos Fab de anti-M7, de anti-Mac-1 o de un control de isotipo acorde directamente después de la inducción de heridas en la piel dorsal de 4 mm. Curiosamente, durante el transcurso del experimento no se detectó un retraso en la cicatrización en los ratones tratados con anti-Mac-1. Sin embargo, las heridas de la piel tienden a cerrarse más rápidamente en el análisis de cierre de heridas de Kaplan-Maier en los ratones tratados con anti-M7 y demostraron una menor superficie de la herida 6 días después de la inducción de la misma (figura 6A,B). Esto indica que la inhibición específica de la interacción CD40L/Mac-1 no afecta, sino que parece mostrar efectos protectores en la cicatrización de la piel.

Ejemplo 8

La inhibición no selectiva de Mac-1 agrava, mientras que el bloqueo específico de su interacción con CD40L mejora la eliminación de bacterias, la inflamación y la supervivencia durante la sepsis bacteriana.

Recientemente se ha demostrado que los ratones con una deficiencia genética de Mac-1 mostraron una menor supervivencia durante la sepsis bacteriana, destacando el papel potencial de la integrina leucocitaria en la defensa del huésped y la eliminación de las bacterias. Para dilucidar si el bloqueo específico de ligando de Mac-1 y CD40L es más bien beneficioso durante la sepsis bacteriana, se realizó un modelo de sepsis por ligadura cecal y punción (CLP). Veinte horas después del procedimiento de CLP se cuantificaron los monocitos inflamatorios y de patrulla que circulaban en la sangre y los parámetros inflamatorios básicos. Curiosamente, el CLP indujo una fuerte movilización de monocitos inflamatorios Gr-1 hacia la circulación, que alcanza un porcentaje del subconjunto inflamatorio de aproximadamente el 82,4 ± 4,6 % de todos los monocitos en los ratones tratados con el fragmento Fab de IgG. Esta respuesta no se vio afectada por el tratamiento con Fab de anti-Mac-1 (77,4 ± 6,0 %), pero casi se invirtió con el tratamiento con Fab de anti-M7 (56,8 ± 3,7 %, figura 7A). Durante la CLP, las células mieloides pueblan la cavidad peritoneal. Los granulocitos (F4/80'Gr-1+) que invaden la cavidad peritoneal fueron identificados por citometría de flujo (figura 7B). Ambos, anti-Mac-1 y anti-M7, redujeron muchísimo la acumulación de granulocitos en un 59,9 ± 12,2 % y 73,8 ± 7,1 % para anti-Mac-1 y anti-M7, respectivamente (figura 7C). El efecto antiinflamatorio del tratamiento anti-M7 se reflejó además en una fuerte disminución de la proteína de fase aguda SAA en un 63,4 ± 19,7 % (figura 7D). De modo notable, el anti-M7 mejoró la eliminación bacteriana en el plasma, mientras que el anti-Mac-1 empeoró la carga bacteriana tanto en el plasma como en la cavidad peritoneal (figura 7E). Durante la CLP, se observa una acumulación de neutrófilos en la periferia, como el riñón y el pulmón. Para cuantificar el tráfico de granulocitos hacia el bazo, se realizó una ICH contra el marcador de granulocitos Ly6G en secciones de riñón (figura 7F). De modo notable, ambas terapias antiintegrina impidieron la acumulación de neutrófilos, con un efecto mayor en los animales tratados con anti-Mac-1 (figura 7F). Por último, se evaluó si el nuevo enfoque específico de ligando según la invención es beneficioso para sobrevivir a la sepsis. Por lo tanto, se indujo la CLP y los animales fueron tratados posteriormente con preparaciones de Fab de IgG, de anti-Mac-1 y de anti-M7 a las 0, 48 y 96 horas después de la inducción de la operación de CLP. La tasa de supervivencia se calculó mediante el análisis de Kaplan-Maier y la prueba del orden logarítmico. Los animales tratados con anti-Mac-1 mostraron una supervivencia media significativamente menor en comparación con los animales tratados con IgG control (el 0 % frente al 6,7 % después de 169 horas de la inducción de CLP para anti-Mac-1 e IgG, respectivamente). De modo notable, el tratamiento con anti-M7 mostró una tasa de supervivencia del 40,0 % al final del estudio (figura 8), lo que demuestra que la terapia dirigida por ligando es superior a la inhibición inespecífica.

Ejemplo 9

El tratamiento con anti-M7 mejora la infiltración con leucocitos inflamatorios en el miocardio lesionado tras un infarto de miocardio. La acumulación de leucocitos inflamatorios se produce tras un infarto de miocardio en cuestión de días. Los leucocitos inflamatorios reclutados al corazón infartado provocan una respuesta inflamatoria que agrava la cicatrización e impulsa la insuficiencia cardíaca tras el infarto de miocardio. Se ha propuesto la inhibición de la infiltración leucocitaria como estrategia terapéutica, pero no se dispone de ella. Tras la inducción de un infarto de miocardio en ratones mediante la ligadura quirúrgica de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) y el tratamiento con anti-M7 se descubrieron menos monocitos y neutrófilos infiltrados, una subclase de leucocitos inflamatorios que expresan Mac-1, en el miocardio lesionado. Como resultado, el anti-M7 atenuó la insuficiencia cardíaca.

Claims

REIVINDICACIONES

1. - Un anticuerpo monoclonal aislado, o su porción de unión al antígeno, que:

a) se une al antígeno del macrófago-1 (Mac-1),

b) inhibe específicamente la interacción de CD40L con Mac-1 activado,

c) no se une a Mac-1 no activado, y

d) no induce la transducción de señales desde el exterior de la integrina,

caracterizado porque se une específicamente a un péptido que tiene la secuencia EQLKKSKTL y que comprende las CDR de las SEQ ID NO:2-4 en la cadena ligera y las SEQ ID NO:6-8 en la cadena pesada.

2. - Un anticuerpo monoclonal aislado, o su porción de unión al antígeno, según la reivindicación 1, caracterizado porque la cadena ligera tiene una identidad de al menos el 80 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID n O:1 y porque la cadena pesada tiene una identidad de al menos el 80 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No :5.

3. - Un anticuerpo monoclonal aislado, o su porción de unión al antígeno, según la reivindicación 1, caracterizado porque la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

4. - Un anticuerpo monoclonal aislado, o su porción de unión al antígeno, según la reivindicación 1, caracterizado porque la cadena pesada tiene la secuencia amino de SEQ ID NO:5

5. - Un anticuerpo monoclonal aislado, o su porción de unión al antígeno, según la reivindicación 4, caracterizado porque se selecciona del grupo que comprende fragmentos Fab, anticuerpos monocatenarios y/o diacuerpos.

6. - Un anticuerpo monoclonal aislado, o su porción de unión al antígeno, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los anticuerpos monoclonales, o sus porciones de unión al antígeno, están humanizados.

7. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una cantidad farmacéuticamente activa de un anticuerpo, o su porción de unión al antígeno, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. - Una composición farmacéutica según la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias.